ВИТРИФИКАЦИЯ ПОБЕГОВ IN VITRO: АНАТОМИЧЕСКОЕ

НТП: ЗЕМЛЕДЕЛИЕ И РАСТЕНИЕВОДСТВО
УДК 634.11+634.13:581.16:581.144.3
ВИТРИФИКАЦИЯ ПОБЕГОВ IN VITRO: АНАТОМИЧЕСКОЕ
СТРОЕНИЕ И ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ
О.В. МАТУШКИНА, кандидат сельскохозяйственных
наук, старший научный сотрудник
И.Н. ПРОНИНА, кандидат сельскохозяйственных
наук, старший научный сотрудник
Е.Н. ТКАЧЁВ, кандидат сельскохозяйственных наук,
старший научный сотрудник
ВНИИС им. И.В. Мичурина Россельхозакадемии
E-mail: invitro82@yandex.ru
Резюме. В статье рассмотрено влияние основных факторов
культивирования in vitro на витрификацию побегов яблони
и груши, а также особенности их анатомического строения.
Наиболее подвержены гипергидрации подвои яблони ПБ 9
и груши ПГ 12 (до 100 %). У витрифицированных растений
наблюдаются утолщение стебля, удлинение и искривление листьев из-за морфологического изменения тканей и
увеличения размера клеток, изменения в строении устиц.
Регенерационная способность таких побегов на этапе собственно микроразмножения ниже, чем у нормально развитых,
в 2-3 раза, а на этапе укоренения – в 1,6-2,1 раза. Однако они
лучше адаптировались и развивались в нестерильных условиях. Для решения проблемы
витрификации в зависимости
от генотипа целесообразно снижать концентрацию БАП в среде
до 0,5 мг/л, либо использовать
более слабый цитокинин – кинетин или безгормональные питательные среды, разбавленные
по минеральному составу.
Ключевые слова: яблоня, груша, витрификация, in vitro, побег, лист, устьица.
говорят о наличии связи между аномалиями в развитии
побегов с регуляторами роста в питательной среде,
другие [2] о влиянии на устойчивость к витрификации
различных форм углеводов.
В связи с этим цель наших исследований – не
только изучение основных факторов, влияющих на
витрификацию побегов и оптимизация условий культивирования, но и определение особенностей их
анатомического строения.
Условия, материалы и методы. Объекты исследований: клоновые подвои яблони – 54-118, 62-396,
57-545, Р 60, 76-6-13, 76-6-6, 76-8-13, ПБ 9, груши –
ПГ 12 и сорт яблони Лобо. Основной средой служила
среда Кворина-Лепуавра. Растения культивировали
при температуре воздуха 24±2 оC, освещенности
2…3 тыс. люкса и 16-часовом фотопериоде. Гистологические исследования проводили с использованием
Во многих лабораториях
при культивировании растений in vitro сталкиваются
с проблемой сильного обводнения растительного
материала, известного как
витрификация (гипергидрация, стекловидность). Такое
состояние характеризуется
как морфологическое отклонение микрорастений,
которые теряют способность
размножаться и акклиматизироваться. У витрифицированных побегов наблюдается утолщение стебля,
увеличение размера клеток,
удлинение и искривление
листьев. При этом из-за
сильного обводнения и изменения структуры листья и
стебли кажутся прозрачными, меняют форму.
Исследователи по-разному объясняют механизм
образования витрифицированных побегов и предлагают разные пути решения
Рис. 1. Анатомическое строение нормально развитых и витрифицированных побегов
этого физиологического подвоя груши ПГ 12 (слева направо): внешнее различие А и Б; устьица листьев В и Г; стебель
отклонения. Некоторые [1] Д и Е.
58
Достижения науки и техники АПК, №9-2012
НТП: ЗЕМЛЕДЕЛИЕ И РАСТЕНИЕВОДСТВО
Таблица 1. Размеры устьиц нормальных и витрифицированных листьев
подвоя груши ПГ 12, мкм
Ширина
Лист
Диаметр
Длина
Ширина
устьичной щели
Нормальный
31,5±0,18 31,2±0,15 26,1±0,35
7,6±0,16
Витрифицированный
28,2±0,13 29,4±0,47 23,2±0,18
5,2±0,22
ются вытянутой формой и
менее развитой сосудистой
системой. Структура тканей
витрифицированных листьев
более однородна, отсутствует четкая дифференциация
программно-аппаратного комплекса «ВидиоТест
палисадного и губчатого мезофилла. Помимо этого отмастер-морфология 4.0».
мечена меньшая толщина кутикулярного слоя листьев.
Результаты и обсуждение. По нашему мнению,
Значительные различия выявлены в строении устьиц. У
растения in vitro часто испытывают стресс, который
нормально развитых листьев они были широко открыты
создается условиями культивирования и зависит от
(рис. 1 В), в то время, как у витрифицированных – искривсостава питательной среды, размера сосудов, пролены и имели узкие устьичные щели (рис. 1 Г; табл. 1). В
должительности и частоты пассажей, температурного
клетках тканей листьев с признаками обводенности оти светового режимов и др.
мечено очень малое количество хлорофильных зерен.
Так, в наших исследованиях витрификация побегов
Как правило, стебли гипергидрированных побенередко проявлялась уже во 2 пассаже и варьировала
гов были короче и толще, чем у нормальных (рис. 2).
в зависимости от генотипа от 7,6 % у подвоя яблони
Кроме того, отмечены изменения в строении тканей:
62-396 до 53,0 % у сорта яблони Лобо, достигнув у
клетки паренхимы тканей коры крупнее с более тонТаблица 2. Последействие витрификации на укореняемость микропобегов кими клеточными стенками
и большими межклетниками,
Витри- Укореняемость через … недель, % Число кор- Длина корПодвой фикация
а клетки эпидермиса у норней, шт.
ней, см
1
2
3
4
мальных тканей имели меньПГ 12
–
31,4
84,9
90,7
94,1 а*
3,6
1,6
шие размеры, по сравне+
0,0
29,8
55,8
58,9 в
2,2
3,4
Р 60
–
10,0
10,0
20,0
20,0 с
2,3
2,7
нию с витрифицированными
+
0,0
9,5
9,5
9,5 с
1,3
1,5
(рис. 1 Д, Е).
НСР05
1,0
1,2
По данным [3], различия
* – t-критерий Дункана (наличие одинаковых букв при цифровых показателях указывает в размерах клеток между
на отсутствие различий при Р=0,05).
витрифицированными и норотдельных генотипов яблони (ПБ 9) и груши (ПГ 12)
мальными тканями может быть связано с вызванным
при последующих субкультивированиях 100 %. Кульвысоким давлением ускорением диффузии воды в клеттивирование подвоев яблони 54-118, 76-6-13, ПБ 9 на
ках. Помимо этого, согласно нашим исследованиям,
средах с концентрацией БАП в среде повышенной до
одной из причин индукции изменений может выступать
3,0 мг/л, не только увеличивало гипергидрацию понизкая транспирация, обусловленная деформацией
бегов (у 54-118 на 24,3 %, у ПБ 9 на 60,3 %), но и сниустьиц и строением покровных тканей.
жало количество побегов пригодных для укоренения в
Поэтому для снижения уровня обводненности тканей
2-5 раз в зависимости от генотипа.
мы вводили в состав среды более слабый цитокинин –
При этом следует заметить, что даже в одном и том
кинетин. Результаты исследований свидетельствуют,
же культуральном сосуде можно наблюдать обводнечто «выпрямление» побегов у подвоев 54-118, 76-6-13 и
ние как всех пролифирирующих побегов, так и отдель76-8-13 наблюдается при культивировании эксплантов
ных, наряду с нормально развитыми. Регенерационная
на средах с БАП 1,0 мг/л и кинетин 5,0 мг/л (рис. 3).
способность побегов без признаков гипергидрации в
Увеличение концентрации кинетина до 10,0 мг/л, а
2-3 раза выше, чем у витрифицированных, вне зависитакже совместное введение в состав среды БАП и кинемости от гормонального состава питательной среды.
тина повышает уровень витрификации у всех изученных
Изучение особенностей анатомического строения
форм. Наиболее подверженных гипергидрации тканей
витрифицированных побегов яблони и груши показало,
был подвой яблони ПБ 9, у которого стекловидность
что визуально их листья в значительной мере отличаются
проявлялась во всех вариантах опыта, в том числе на
от нормально развитых, они мелкие и искривленные.
среде с кинетином 5,0 мг/л, где формировалось на
В ходе гистологических исследований установлено,
20,0 % витрифицированных побегов больше, чем в
что клетки эпидермиса таких побегов характеризуконтроле. Снизить их количество и получить до 25 %
нормально развитых микрорастений удалось только при
использовании безгормональных питательных сред,
разбавленные по минеральному составу.
Наименьшее обводнение тканей отемеченно у
подвоя яблони 76-6-13, у
которого только на среде
с кинетином 10,0 мг/л наблюдалась незначительная
гипергидрация.
Стекловидность побегов
существенно влияла и на
Рис. 2. Размеры тканей нормальных и витрифицированных побегов подвоев яблони и корнеобразование. Укорегруши: – общая толщина листа, мкм; – диаметр стебля, мкм; – диаметр сердцевины, няемость «выпрямленных»
после витрификации микромкм
Достижения науки и техники АПК, №9-2012
59
НТП: ЗЕМЛЕДЕЛИЕ И РАСТЕНИЕВОДСТВО
Рис. 3. Влияние цитокининов на витрификацию побегов
яблони:
– БАП 1,0 мг/л;
– БАП 1,0 мг/л + Кин 2,5 мг/л;
– Кин 5,0 мг/л;
– Кин 10,0 мг/л.
побегов была в 1,6 (ПГ 12)-2,1 (Р 60) раза меньше, чем
у изначально нормальных растений (табл. 2). У таких
побегов наблюдалась низкая скорость корнеобразования, а у растений-регенерантов хуже развивалась
корневая система. В то же время необходимо отметить, что они лучше адаптировались и развивались в
нестерильных условиях.
Выводы. Таким образом, при витрификации у
растений наблюдается утолщение стебля, удлинение
и искривление листьев из-за морфологического изменения тканей и увеличения размера клеток, что, прежде
всего, связано с нарушением водного обмена. Одной
из причин индукции таких изменений может быть низкая транспирация, вызванная аномальным развитием
устьиц и строением покровных тканей.
Для решения проблемы витрификации, в зависимости от генотипа, целесообразно снижать концентрацию БАП в среде до 0,5 мг/л, либо использовать
более слабый цитокинин – кинетин или безгормональные питательные среды, разбавленные по минеральному составу.
Литература.
1. Masuda T., Yoshida Y., Bessho H. Studies on cell tissue and shooptip culture in apple // 1 Relation ship between abnormal shoot
formation and plant hormones: Bull Fruit Tree Res Stat Ser, Morioka, Iwate. – 1988. – № 15. – P. 21-28.
2. Druart P. C-source and growth response of Prunus glandulosa «Sinensis» Thund and Malus pumila Mill M 26 and M9 Clone 29
during in vitro propagation // Bull Rech agron. Gembloux. – 1995.-V. 30, № 1/2. – P. 29-37.
3. Bornman C.H., Vogelman T.C. Effect of rigidity of gel medium on benzyl-inducedadventitious bud formation and vitrification in
vitro in picea abies. // Physiol. Plant., – 1984. – V. 61. – Р. 505-512.
SHOOT VITRIFICATION IN VITRO: ANATOMIC STRUCTURE AND POSSIBLE WAYS
OF THE PROBLEM SOLUTION
O.V. Matushkina, I.N. Pronina, Ev.N. Tkachyov
Summary. The effect of main factors of cultivation on apple and pear shoot vitrification and the characteristics of their anatomic structure
are under consideration. PB 9 apple rootstocks and PG 12 pear rootstocks show the highest level of hyperhydration (up to 100 %). It has
been established that morphological changes of tissue and enlargement of cell size, stomata structure changes result in stem thickening,
leaf elongation and distortion in, vitrified plants. At the stages of proliferation and rooting a regenerative ability in such shoots is 2-3
fold and 1,6-2,1 fold lower than in normally developed ones correspondingly. However these plants have more high lever of adaptivity
and develop in non-sterile conditions. Reduction of concentration of BAP in the medium up to 0,5 mg/l or cytokinin – kinetin or lack of
hormones in nutrient media with diluted concentration of macroelements promote solution of the vitrification problem.
Key words: apple, pear, vitrification, in vitro, shoot, leaf, stomata.
УДК 58.00:502.75
ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИДА
КАК ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ФАКТОРЫ УСПЕШНОГО
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РАСТЕНИЙ В ОЗЕЛЕНЕНИИ
В.М. СТАРЧЕНКО, доктор биологических наук, зав.
лабораторией
Амурский филиал Ботанического сада-институда
Дальневосточного отделения РАН
Н.А. ТИМЧЕНКО, зав. кафедрой
Дальневосточный ГАУ
E-mail: starchenkoamur@mail.ru
Резюме. В статье на примере 39 адвентивных представителей дендрофлоры Амурской области рассматриваются особенности растений (эколого-ценотическая приуроченность,
зимостойкость, общий ареал), определяющие успешность их
использования в озеленении населенных пунктов области.
Ключевые слова: озеленение, адвентивные виды, экологоценотическая приуроченность, ареал, Амурская область,
Дальний Восток России.
60
В последние годы использование представителей дендрофлоры в озеленении населенных пунктов
развивается в двух направлениях. Для мест общего
пользования и придомовых территорий в период заселения решающее значение имеет экономический
фактор, поэтому при их благоустройстве используют
преимущественно дешевые (низкие по себестоимости) растения. В результате в озеленении наблюдается преобладание 1…3 наиболее доступных видов и
биоразнообразие дендрофлоры населенных пунктов
заметно снижается [1...3]. Второе направление связано с озеленением частных владений и территорий
крупных организаций, обладающих финансовой самостоятельностью. В этом случае заказчик обычно
руководствуется своими желаниями (амбициями) и
Достижения науки и техники АПК, №9-2012