Функционирование, механизм регуляции активности и

На правах рукописи
Шлеев Сергей Валерьевич
Функционирование, механизм регуляции активности
и возможное практическое использование
голубых медьсодержащих оксидаз
Специальность 03.01.04 – «биохимия»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
Москва
2010
Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Учреждения Российской академии
наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН
Научный консультант:
доктор химических наук, профессор
Ярополов Александр Иванович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Звягильская Рената Александровна
доктор химических наук, профессор
Карякин Аркадий Аркадьевич
доктор химических наук, профессор
Решетилов Анатолий Николаевич
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
Защита состоится «25» ноября 2010 г. в 15 час. на заседании диссертационного совета
(Д 002.247.01) при Учреждении Российской Академии Наук Институте биохимии им. А.Н. Баха
РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр. 33, строение 2, конференц-зал
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу:
119071 Москва, Ленинский пр. 33, корп. 1.
Автореферат разослан «22» октября 2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат биологических наук
А.Ф. Орловский
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Голубые медьсодержащие оксидазы (МСО), к которым относятся
лакказа (Lc), билирубиноксидаза (BOx) и аскорбатоксидаза (AOx), а также церулоплазмин (Cp),
занимают особое место среди окислительно-восстановительных ферментов. Они обладают
высокой удельной активностью и способностью к прямому восстановлению О2 до Н2О без
образования промежуточных высоко реакционно-способных токсичных интермедиатов
кислорода. Большой интерес, как в фундаментальном, так и прикладном плане, представляет
субстратная специфичность этих ферментов, способных окислять широкий круг органических и
неорганических соединений. Окисление органических соединений протекает по свободнорадикальному механизму, который в настоящее время до конца не изучен. Таким образом, МСО
представляют большой интерес с точки зрения фундаментальных исследований их структуры и
механизма катализа. Это обусловлено строением активного центра медьсодержащих оксидаз, в
который входят ионы меди трех различных типов, координированное взаимодействие которых в
процессе каталитического акта одноэлектронного окисления субстратов доноров электронов или
атома водорода, позволяет осуществлять восстановление О2 непосредственно до Н2О. Помимо
этого, каталитические свойства MCO делают возможным их широкое использование в
целлюлозно-бумажной, текстильной, пищевой и косметической промышленностях, а таже
медицине. MCO используются для детоксикации и обесцвечивания сточных вод, биодеградации
ксенобиотиков, создания антимикробных композиций, получения древесноволокнистых плит,
древесных блоков и картона без применения токсичных связующих, при производстве моющих
средств и в клиническом анализе.
Интерес к практическому использованию MCO еще более возрос в середине 90-х годов ХХ
века, после открытия возможности усиления действия этих ферментов с использованием
различных редокс-медиаторов, что позволило существенно расширить область их практического
применения. Медиаторы MCO представляют собой субстраты этих ферментов, в процессе
окисления которых образуются высоко редокс-потенциальные и химически активные продукты.
Последние могут вступать в реакцию с соединениями, которые не подвергаются окислению
одними лишь оксидазами, или участвовать в переносе электронов в электрохимических
реакциях, ускоряя электрохимические процессы с участием данных ферментов. Кроме того, в
процессе окисления органических субстратов образуются свободные радикалы, которые могут
модифицировать другие соединения. Значительный интерес представляет собой использование
MCO в органическом синтезе. Показана возможность использования MCO для окисления
первичных гидроксильных групп производных сахаров, для синтеза винбластина и
бензальдегидов.
Важным направлением практического использования данных ферментов является их
применение в биоэлектронике – новой области биотехнологии, сформировавшейся на стыке
биологии и электроники и имеющей большое прикладное значение для медицины,
высокотехнологичных производств и биокомпьютерных технологий. Основой для создания
биосенсоров и биотопливных элементов может быть субстратная специфичность MCO, их
высокая активность и стабильность, а также возможность протекания реакции прямого
биоэлектрокатализа.
Однако, до сих пор остается неясным детальный механизм функционирования и принципы
регуляции активности данного класса ферментов.
Цель работы – установление механизма функционирования и регуляции активности MCO в
гомогенных и гетерогенных биокаталитических системах с целью их обоснованного и
рационального использования в биокаталитическом синтезе и системах биодеградации
ксенобиотиков, для разработки устройств трансформации химической энергии в электрическую, а
также для оптимизации электроаналитических сенсоров.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:
3
1. Детально изучить биохимические и каталитические характеристики грибных, древесной и
бактериальной Lc с целью выбора наиболее перспективных ферментов для использования в
различных биотехнологических процессах и биоэлектронных устройствах.
2. Разработать метод экологически чистого синтеза электропроводящего полианилина с
участием высоко редокс-потенциальных Lc.
3. Предложить стратегию отбора и исследования потенциальных редокс-медиаторов Lc и
провести апробацию лакказа-медиаторных систем (LMS) на практически значимых объектах.
4. Провести комплексное сравнительное спектральное и электрохимическое изучение MCO,
включающее, в том числе, и разработку методов и подходов редокс-титрования микроколичеств
белков с целью определения редокс-потенциалов их активных центров.
5. Предложить подходы для практического использования MCO в биосенсорах и биотопливных
элементах.
6. Выяснить закономерности регуляции активности МСО на молекулярном уровне с
использованием биохимических и электрохимических методов. Экспериментально показать
“диод-“ и “триод-подобные” свойства биоэлектрохимических устройств.
Научная новизна работы. На основании комплексного исследования основных биохимических и
физико-химических свойств, субстратной специфичности и каталитических параметров грибных,
бактериальной и древесной Lc выявлены основные критерии отбора Lc из различных
таксономических групп
для использования в биотехнологии. Детально изучены и
систематизированы биоэлектрохимические свойства Lc, BOx и Cp. Предложены новые
экспериментальные подходы для исследования активных центров MCO, в том числе
разработаны уникальные макро и микро спектроэлектрохимические ячейки. С их использованием
были определены значения редокс-потенциалов Т1 центров MCO, а также впервые установлены
возможные значения потенциалов некоторых интермедиатов трехъядерного медного кластера
ферментов. Сформулированы и экспериментально исследованы пути сопряжения
ферментативных реакций MCO и электрохимических процессов с их участием. Комплексные
физико-химические и биохимические исследования показали, что механизм и эффективность
электронного переноса (ЭП) зависит от ориентации молекул фермента на поверхности
электрода. Результаты исследования биохимических, физико-химических, спектральных и
электрохимических свойств MCO, субстратной специфичности и механизма действия этих
ферментов вносят свой вклад в понимание механизма гомогенного и гетерогенного катализа
многоядерными медьсодержащими оксидазами. Теоретически обоснованы и экспериментально
доказаны “диод-“ и “триод-подобные” свойства высоко редокс-потенциальной грибной Trametes
hirsuta Lc. Высказано предположение о регуляторном значении открытых и исследованых
“полупроводниковых” свойств MCO при функционировании данных ферментов в природе.
Обнаружен новый класс редокс-медиаторов Lc (усилителей действия фермента) с общим
названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5 (PP). Подобраны и экпериментально подтверждены
научно-обоснованные критерии отбора редокс-медиаторов Lc для создания эффективных систем
для обесчвечивания лигноцеллюлозы.
Впервые с участием высоко редокс-потенциальной грибной Lc осуществлен синтез
электропроводящего полианилина и изучены его физико-химические свойства.
Практическая значимость. Решение поставленных задач позволило выяснить возможности,
ограничения и перспективы использования голубых MCO в различных областях биотехнологии.
На основе различных Lc разработаны амперометрические биосенсоры для определения
соединений фенольной структуры и водорастворимого лигнина. Сконструированы и
охарактеризованы модели безмедиаторных, безмембранных биотопливных элементов,
использующих в качестве топлива глюкозу, а в качестве окислителя – растворенный кислород.
Предложена схема отбора потенциальных редокс-медиаторов Lc и экспериментальные методы
их тестирования, что значительно облегчает поиск новых медиаторов фермента. Ряд соединений
класса PP отвечают многим требованиям, предъявляемым к усилителям действия ферментов, а
именно высокая эффективность, низкая стоимость и экологическая чистота. Показана
возможность использования этих соединений для отбеливания лигноцеллюлозы. В частности,
4
проведены лабораторные испытания LMS для делигнификации бумажной пульпы. Разработаны
методы ферментативного синтеза электропроводного полианилина с различными свойствами,
отвечающие требованиям «зеленой» химии.
Положения, выдвигаемые на защиту:
• особенности механизмов гомогенного и гетерогенного катализа с участием высоко и низко
редокс-потенциальных голубых MCO;
• биоэлектрохимические свойства голубых MCO, адсорбированных на электродах из различных
материалов;
• обоснование “диод-“ и “триод-подобных” свойств Lc;
• амперометрические биосенсоры на основе голубых MCO для определения соединений
фенольной структуры и лигнина;
• модели безмедиаторных, безмембранных биотопливных элементов, использующих углеводы в
качестве топлива и растворенный кислород в качестве окислителя;
• схема отбора потенциальных редокс-медиаторов Lc и методы их тестирования;
• разработка методов синтеза электропроводящего псевдоводорастворимого, а также оптически
активного полианилина.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 42 научных статьи, получено 4
российских патента. Данные диссертации суммированы в 4 обзорных статьях, а также включены
в книгу “Электрохимия белков и нуклеиновых кислот”, выпущенную издательством «Elsevier».
Апробация работы. Материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на 17
российских и международных конференциях, конгрессах, симпозиумах, в том числе: на
Международной конференции “Биокатализ-2002” (Москва, Россия, 2002), на Международной
конференции “Биотехнология – состояние и перспективы развития” (Москва, Россия, 2002), на
XVII и XVIII Международных симпозиумах “Биоэлектрохимия и биоэнергетика” (Флоренция,
Италия, 2003 и Коимбра, Португалия, 2005), на 8-ой Международной Пущинской ШколеКонференции “Биология - наука XXI века” (Пущино, Россия, 2004), на VI Всероссийской
конференции по электрохимическим методам анализа (Уфа, Россия, 2004), на Международных
конгрессах электрохимического общества (Квебек, Канада, 2005, Бусан, Корея, 2005, Денвер,
США, 2006), на IV Балтийской электрохимической конференции (Грейфсвальд, Германия, 2005),
на II Международном Симпозиуме ”Модификация поверхности для химического и биохимического
распознавания” (Казимеш Долны, Польша, 2005), на Международной конференции
“Электроанализ” (Бордо, Франция, 2006).
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и
методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения,
выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 322 страницах. Список
цитируемой литературы включает 461 наименование. Иллюстративный материал содержит 110
рисунков и 26 таблиц.
Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления
исследований, в развитии и проверке экспериментальных подходов, предложенных в работе, а
также в обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов. Экспериментальная
работа выполнена самим автором, а также сотрудниками, аспирантами и студентами под
руководством автора. В исследованиях, проведенных в соавторстве с зарубежными коллегами,
личный вклад автора заключался в постановке задачи, непосредственном участии в
экспериментальной работе, в обсуждении полученных результатов и в оформлении их в виде
публикаций.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность
темы, сформулированы цели и задачи исследования.
Первая глава содержит обзор литературы, состоящий из шести частей. В первой части
описываются строение, свойства и каталитический механизм действия ферментов, относящихся
5
к MCO. Во второй части – основные факторы, определяющие окислительно-восстановительный
потенциал этих ферментов. Третья, четвертая и пятая части обзора литературы посвящены
описанию AOx, BOx и Cp, соответственно. В шестой части рассматривается строение, свойства и
каталитический механизм действия Lc, а также представлено описание основных усилителей
действия фермента и LMS. Помимо этого, рассмотрены возможности использования Lc и LMS в
биотехнологии.
Во второй главе представлены материалы и методы исследования, включая некоторые
оригинальные методики автора с соавторами [Шлеев с соавт., 2000; Горшина с соавт., 2006а,
2006б].
В работе использовали Lc, выделенные из культуральных жидкостей грибов Trametes hirsuta,
Trametes ochracea, Trametes pubescens, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrena maxima, а также
частично очищенную Myceliophthora termophila Lc - коммерческий препарат фермента фирмы
«Novozymes A/S» (Дания). В рамках совместных исследований были любезно предоставлены
гомогенный препарат рекомбинантной Lc M. thermophila (LT2), мутантные формы фермента
2B10, 7H9, 3D1, 2E9, и R2 (Др. Мигуэлем Алкаде, Испания), а также гомогенный препарат Cerrena
unicolor Lc (Проф. Дж. Рогальски, Польша). В работе были использованы частично очищенные
препараты BOx Myrothecium verrucaria (Amano 2) и Trachyderma tsunnodae (Amano 3), фирмы
Amano Enzyme Ltd. (Япония). Дополнительная очистка препаратов до гомогенного состояния
проводилась Др. Николасом Мано (Франция) в рамках совместных исследований. Частично
очищенный препарат Rhus vernicifera Lc, который был любезно предоставлен проф. Бенгтом
Рейнхаммером (Швеция), был дополнительно очищен до гомогенного по данным
SDS-электрофореза состояния методом HPLC. Рекомбинантный бактериальный фермент
Bacillus halodurans, а также Lc аскомицета Lamprospora wrigthii были любезно предоставлены
проф. Диетмаром Халтрихом и Др. Роландом Людвигом (Австрия) в рамках выполнения
совместных исследований. Помимо этого, в работе использовали Cp, выделенный из крови
человека, – высокоочищенный препарат компании Sigma-Aldrich (США). Определение
молекулярной массы Lc проводили методом градиентного электрофореза в денатурирующих
условиях. Содержание ионов меди определяли бихинолиновым методом [Broman et. al., 1962], а
также методом лазерной масс-спектрометрии [Maganadze & Shutyaev, 1993]. Спектральные
исследования Lc проводили с использованием спектрофотометра Coulter DU-650 («Beckman»,
Германия), спектрофлуофотометра RF-5301 PC («Shimadzu», Япония), ЭПР-спектрометра ESC106 («Bruker», Германия). Определение редокс-потенциала Т1 центра Lc осуществляли методом
окислительно-восстановительного титрования, используя в качестве медиаторной пары
октоцианомолибдат (IV) и (V) калия [Dutton, 1978; Xu et al., 1996b]. Определение редокспотенциала Т1 центра BOx осуществляли методом спектроэлектрохимического титрования в
присутствии комплексов переходных металлов в качестве медиаторов [Christenson et al., 2006].
Определение рН-оптимума и каталитических констант ферментативных реакций,
катализируемых Lc, проводили на кислородном электроде типа Кларка. Спектральные
исследования интермедиатов, образующихся при окислении усилителей (медиаторов) Lc,
проводили на спектрофотометре «Hitachi-557» (Япония). Спектры кругового дихроизма были
записаны с использованием КД дихрографа FKD-2 (Россия). Круговой дихроизм Lc и образцов
полианилина измеряли в единицах ∆A, как разность в поглощении лучей с левой и правой
круговой поляризацией.
Для анализа продуктов окисления вератрового спирта (VA) LMS использовали метод
гидрофобной обратнофазовой жидкостной хроматографии высокого давления. Идентификацию
продуктов окисления VA проводили по времени удерживания на колонке, их количество в
элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы “Мультихром”
(Россия).
Электрохимические исследования осуществляли с использованием анализаторов CV 50W
или CV 100W (BAS, США) работающих в трехэлектродном режиме (рабочий электроды –
модифицированные и немодифицированные электроды на основе стеклоуглерода,
6
спектрального графита или золота; электроды сравнения – хлорсеребряный или каломельный
электроды; вспомогательные электроды – платиновая проволока или золотая пластина).
Спектроэлектрохимические исследования MCO проводили с использованием макро [Шлеев с
соавт., 2000] и микро [Larsson et al., 2001] ячеек объемом 1000 мкл и 1 мкл, соответственно.
Масс-спектроскопические исследования проводили с использованием лазер десорбционноионизирующей (MALDI) масс-спектрометрии на масс-спектрометрическом анализаторе “Applied
Biosystems 4700 Proteomics Analyzer” MALDI time-of-flight (TOF) (США). Гидролизаты белков также
анализировали с использованием четырехполюсной ионной ловушки Bruker Esquire (Германия) в
сочетании с нанораспылителем для их ионизации (ESI-QIT-MS анализ).
В третьей главе представлены результаты диссертационного исследования.
Выделение и основные физико-химические свойства лакказ из различных источников
[Королева с соавт., 2001; Шлеев с соавт., 2003; Shleev et al., 2004b; Shleev et al., 2005b;
Никитина с соавт., 2005; Shleev et al., 2006c; Shleev et al., 2007a; Горбачева с соавт., 2008;
Морозова с соавт., 2007а; Горишна соавт., 2009а, 2009b]
Были выделены в гомогенном состоянии Lc из культуральной жидкости базидиальных грибов
T. hirsuta, T. ochracea, T. pubescens, C. fulvocinerea и C. maxima, основные биохимические
характеристики которых представлены в Таблице 1. Как видно из таблицы, все изученные Lc
являются гликопротеинами, характеризуются оптимумом рН в интервале 3,5-5,2 (при
использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина), значения их изоэлектрических точек
(pI) находятся в кислой области рН. Как и большинство описаных в литературе Lc, эти ферменты
содержат 4 иона меди на 1 молекулу белка. Необходимо отметить, что все ферменты обладают
высокой стабильностью (сохраняют до 50% первоначальной активности через 52-65 часов
инкубации при 50°С), что является важным условием для их использования в
биотехнологических процессах, биосенсорах и биотопливных элементах.
Таблица 1. Некоторые биохимические характеристики лакказ
Мм, кДа
pI
pH-оптимум*
Углеводы, %
T. hirsuta
3,5-4,5
12
70 ± 2
4,2 ± 0.1
T. ochracea
3,7-4,9
10
64 ± 2
4,7 ± 0.1
T. pubescens
13
67 ± 2
5,2 ± 0.1
≈ 4,0
3,5-4,5
13
C. maxima
67 ± 2
3,5 ± 0.1
C. fulvocinerea
3,9-5,2
32
65 ± 2
3,5 ± 0.1
* При использовании в качестве субстрата-восстановителя пирокатехина
** Время полуинактивации при 50оС
Т1/2**, ч
65
56
> 65
52
64
В таблице 2 представлены кинетические параметры реакций, катализируемых четырьмя Lc
для некоторых органических субстратов и ферроцианида калия. Как видно из таблицы, T. hirsuta
Lc обладала наиболее высокими значениями каталитических констант по отношению к
органическим субстратам. В то же время, Lc C. maxima показала наибольшее значение k cat при
окислении K4Fe(CN)6.
Сравнение кинетических параметров реакций, катализируемых грибной T. hirsuta и древесной
Rhus vernicifera Lc (Табл. 3) выявило высокое сродство и эффективность катализа для обеих Lc
по отношению к кислороду – природному акцептору электронов данных ферментов. Более того,
показана линейная зависимость эффективности катализа, выраженная величиной lg(kкат/KM), от
разности между редокс-потенциалами ионов меди Т1 центров ферментов и потенциалами
субстратов. Последняя величина – разность потенциалов − является движущей силой реакции
7
переноса электронов от субстратов-доноров на фермент. Линейная зависимость эффективности
ферментативного катализа от ΔE(фермент-субстрат) указывает на внешнесферный механизм
переноса электронов от субстратов на ион меди Т1 центра Lc.
Оптимум рН для всех изученных грибных Lc был приблизительно одинаков и находился в
интервале рН 3,5–5,0 при использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина (Табл. 1;
Рис. 1А), а кривая зависимости активности ферментов от рН раствора имела колоколообразную
форму. При использовании K4Fe(CN)6 активность ферментов монотонно падала при изменении
рН раствора от 2,5 до 5,5 (Рис. 1Б). рН-профили активности всех изученных Lc при
использовании в качестве субстратов как органического, так и неорганического соединений не
отличались от таковых для других Lc, описанных в литературе.
Таблица 2. Кинетические параметры реакций, катализируемых лакказами
T. hirsuta
T. ochracea
C. maxima
C. fulvocinerea
Субстрат
kcat, Kм, kcat/Kм, kcat, Kм, kcat/Kм, kcat, Kм, kcat/Kм, kcat, Kм, kcat/Kм,
c-1 мкM мкM-1·c-1 c-1 мкM мкM-1·c-1 c-1 мкM мкM-1·c-1 c-1 мкM мкM-1·c-1
пирокатехин
390 142 2,75
80 110 0,73
320 120
2,67
90 85
1,06
гваякол
430 63
90 90
1,00
300 160
1,88
95 70
1,36
170 11 15,45
330 24
13,75 140 21
6,67
6,83
синаповая кислота 580 24 24,17
K4Fe(CN)6
400 180 2,22 150 96 1,56
450 115 3,91 130 170 0,76
* кинетические константы были рассчитаны как средние значения по пяти экспериментам
Таблица 3.
Сравнение кинетических и термодинамических параметров реакций,
катализируемых грибной и растительной лакказами
T. hirsuta
Rhus vernicifera
Потенциал,
Субстрат
kcat,
Kм,
kcat/Kм,
kcat,
Kм,
kcat/Kм,
мВ
c-1
мкM
мкM-1·c-1
c-1
мкM
мкM-1·c-1
O2
940
13000*
150
86,67
1300*
200
6,50
K4[Mo(CN)8]
780
78
670
0,12
0
0
0
K4[Fe(CN)6]
430
400
180
2,22
64
460
0,14
* литературные значения (Andreasson et. al., 1979; Cole et al., 1991; Matijosyte et al., 2008);
кинетические константы были рассчитаны как средние значения по пяти экспериментам
С точки зрения фундаментальных исследований большой интерес представляют структура
MCO и механизм катализа. Активный центр Lc содержит 4 иона меди, которые подразделяют на
три типа по их спектральным характеристикам: Т1 центр, характеризующийся полосой
оптического поглощения в области 600 нм и слабым сверхтонким расщеплениям в спектрах ЭПР;
Т2 центр, невидимый на спектрах поглощения, но характеризующийся на спектрах ЭПР
сверхтонким расщеплением; Т3 центр – биядерный диамагнитный медный центр, который может
быть идентифицирован на спектрах оптического поглощения по плечу в области 330 нм.
Cпектры поглощения всех изученных в настоящей работе ферментов были типичными для
MCO. В них присутствовали сигналы меди Т1 центра – пик поглощения на 610 нм и биядерного
комплекса меди Т3 – плечо в области 330 нм (например, Рис. 2).
Спектры ЭПР, характеризующие ионы меди Т1 и Т2 центров изученных грибных Lc имели
сходные характеристики (Рис. 3). На Рис. 4 представлены спектры возбуждения (I) и излучения
(II) флуоресценции некоторых исследованных Lc, записанные при комнатной температуре.
8
V0 (ммоль О2 /(мин·мг)
Возбуждение в области биядерного медного центра (330 нм) приводит к эмиссии при 432, 438,
436 и 443 нм для T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima Lc, соответственно.
Необходимо отметить, что эти спектры не сильно различаются между собой и хорошо
согласуются с литературными данными [Wynn et al., 1983; Shin et al., 2000].
Изучение вторичной структуры ферментов проводили с помощью спектроскопии кругового
дихроизма. Показано, что грибные Lc имели незначительные отличия во вторичной структуре
белка. На Рис. 5 представлены типичные КД-спекры двух форм T. pubescens Lc (Lc1 и Lc2).
40
4
30
2
20
1
10
3
А
Рисунок 1. Зависимость начальной
скорости восстановления кислорода от
рН реакционной смеси, при
использовании в качестве субстрата
пирокатехина (A) и K4[Fe(CN)6] (Б).
1 – T. hirsuta; 2 – T. ochracea;
3 – C. fulvocinerea; 4 – C. maxima.
0
2.5
3.5
120
4.5
5.5
6.5
3
100
Б
4
2
1
80
60
Условия: 0,1 М цитратно-фосфатный буфер,
пирокатехин - 2 мМ, K4[Fe(CN)6] - 10 мМ.
40
20
0
2
3
4
5
6
рН
1.6
0.1
4
1
1
1.4
3
4
Рисунок 2. Спектры оптического
поглощения лакказ.
1 – T. hirsuta; 2 – T. ochracea;
3 – C. maxima; 4 – C. fulvocinerea.
Поглощение, о.е.
1.2
2
0.05
2
1
3
0.8
0.6
Условия: 0,1 М фосфатный буфер, pH 6,0;
концентрация ферментов около 1 мг/мл.
0
500
0.4
550
600
650
700
750
800
850
2
4
0.2
3
1
0
250
350
450
λ, нм
550
650
750
850
9
T1 Cu
20 мT
Рисунок 3. ЭПР-спектры лакказ.
1 – T. hirsuta; 2 – T. ochracea;
3 – C. maxima; 4 – C. fulvocinerea.
2
3
Условия: 0,1 М фосфатный буфер, pH 6,0;
концентрация ферментов около 1 мг/мл.
1
4
T2 Cu
II
I
1000
Интенсивность флуоресценции
4
4
Рисунок 4. Спектры возбуждения (I) и
излучения флуоресценции (II) лакказ.
1 – T. hirsuta; 2 – T. ochracea;
3 – C. maxima; 4 – C. fulvocinerea.
3
3
750
2
1
2
1
500
Условия: 0,1 М фосфатный буфер, pH 6,0;
концентрация ферментов около 1 мг/мл.
250
0
300
350
400
450
500
λ, нм
КД-спектры Lc были математически обработаны в области длин волн от 190 до 250 нм.
Параметры вторичной структуры белков были рассчитаны с использованием компьютерной
программы «Protein-CD», версия 1,5. Программа сравнивает КД-спектры интересующих нас
ферментов с КД-спектрами имеющихся в базе данных белков. Результаты расчетов показали,
что молекулы грибных Lc (T. hirsuta, T. ochracea, C. maxima, and C. fulvocinerea) содержат около
5% α-спиральных участков, 45% β-структуры, 20% изгибов и 35% представлено нерегулярной
структурой.
6
Δε
Lc1
Lc2
4
Рисунок 5. КД-спекры двух
множественных форм лакказы T.
pubescens, Lc1 и Lc2.
2
0
190
200
210
λ, нм
220
230
240
250
-2
-4
10
Условия: 0,1 М фосфатный буфер (рН 6.0)
t = 20°C
концентрация ферментов ~ 0,1 мг/мл
Были проведены сравнительные исследования двух форм Lc базидиомицета T. pubescens и
сделан вывод о значительном сходстве биохимических, физико-химических и кинетических
свойств обеих форм Lc. Для выяснения вопроса о том, являются ли выделенные ферменты
продуктами одного гена, были проведены масс-спектроскопические исследования Lc1 и Lc2.
Анализ гидролизатов Lc1 и Lc2 методом MALDI в области масса/заряд (m/z) 500–5000
показал практически полное сходство аминокислотных последовательностей данных белков
(Рис. 6). Исходя из этого, можно предположить, что выделенные ферменты Lс1 и Lс2 являются,
скорее всего, продуктами одного гена, т.е. множественными формами одного и того же
фермента. Следует отметить, что пять полученных пептидов Lc1 и Lc2 совпадали с описанными
в литературе основными пептидами Trametes versicolor Lc. При этом аминокислотная
последовательность Lc1 и Lc2 отличалась от данных, имеющихся в литературе по первичной
структуре двух изоформ T. pubescens Lc (база данных NCBI, AAM18408 и AAM18407). Таким
образом, выделенные нами ферменты являются новыми, ранее не описанными
множественными формами Lc T. pubescens. Для сравнения был проведен аналогичный анализ
Lc T. hirsuta. Продукты гидролиза этого фермента сильно отличались от таковых для Lс1 и Lс2
базидиомицета T. pubescens Lc.
Рисунок 6. Суммарный масс-спектрометрический анализ продуктов
гидролитического расщепления Lс1 and Lс2.
В результате проведенных исследований были определены основные физико-химические
характеристики ферментов и спектральные характеристики ионов меди, входящих в состав
активного центра Lc, выделенных из различных источников. Показано сходство биохимических и
спектральных параметров исследованных ферментов.
Поиск новых медиаторов лакказ и возможности их использования
[Shleev et al., 2003; Шлеев с соавт., 2004a; Shleev et al., 2006b; Shumakovich et al., 2006;
Морозова с соавт., 2007б]
Первоначально медиаторами называли соединения – субстраты фермента, в результате
окисления которых образовывались устойчивые высокопотенциальные продукты, способные
вступать в химические неферментативные реакции с другими соединениями. При этом
окисленный медиатор восстанавливался до первоначальной формы и таким образом
формировался замкнутый цикл. Простейшая схема функционирования LMS представлена на
Рис. 7.
О2
лакказа
медиаторок
субстрат
Рисунок 7. Принцип
функционирования LMS.
Н2 О
лакказаок
медиатор
субстраток
11
Оптимальный редокс-медиатор должен быть хорошим субстратом Lc, его окисленная и
восстановленная формы должны быть стабильны и не должны ингибировать ферментативную
реакцию или инактивировать фермент, процесс его редокс-превращения должен быть
циклическим. Соединения, которые в литературе называют медиаторами, на самом деле ими
вообще не являются или их можно отнести к медиаторам с большой натяжкой. В первую очередь
это связано с низкой стабильностью образующихся интермедиатов и, как следствие, низким
числом редокс-циклов. В связи с этим в литературе появился термин «enhancer», т.е. усилитель
действия фермента.
Принимая во внимание требования к редокс-медиаторам, была предложена схема отбора
органических соединений – потенциальных медиаторов Lc и экспериментальные методы их
тестирования, включающая 4 стадии:
1. Отбор соединений на основе анализа структурной формулы с учетом необходимости
наличия сопряженных связей и гетероциклических атомов, а также –OH и –NH2 групп.
2. Определение каталитических характеристик отобранных соединений в гомогенных
ферментативных реакциях, катализируемых Lc.
3. Анализ циклических вольтамперограмм растворов отобранных соединений в отсутствие и в
присутствии модельных соединений лигнина.
4. Прямой эксперимент по анализу продуктов окисления модельного соединения лигнина LMS.
Первичный отбор соединений на основе их структуры
Реакционная способность ароматических и гетероциклических соединений часто зависит от
природы и положения заместителей. Влияние заместителей на окисление этих соединений
определяется как электронными эффектами, так и стерическими факторами. Наша задача
состояла в том, чтобы выбрать соединения для использования в LMS с наилучшими
каталитическими параметрами в гомогенной ферментативной реакции и оптимальными
характеристиками
электрохимической реакции на электроде (значение редокс-потенциала,
обратимость реакции). При первичном отборе усилителей необходимо учитывать, что введение в
структуру соединения тех или иных заместителей должно приводить к увеличению стабильности
образующихся в результате реакции радикалов. Окисление соединений, в структуре которых
присутствует гидроксильная группа, приводит к образованию нестабильных фенокси-радикалов,
способных
к
реакции
конденсации,
а
наличие
аминогруппы
вызывает
димеризацию/полимеризацию промежуточных форм соединения. Электрон-донорные
заместители (алкильная, фенильная и аминогруппы), увеличивая скорость окисления
соединения и обеспечивая при этом стабильность образующихся радикалов, уменьшают его
окислительно-восстановительный потенциал соединения. Электрон-акцепторные группы
(например, карбоксильная или сульфо- группы), увеличивают окислительно-восстановительный
потенциал соединения [Xu et al., 2001] и улучшают его растворимость в водных растворах. При
отборе соединений в качестве усилителей действия Lc необходимо принимать во внимание, что
их редокс-потенциал должен быть выше 450 мВ [Bourbonnais et al., 2000], в противном случае
они не могут принимать участие в окислении нефенольных подструктур лигнина.
В силу возможного масштабного коммерческого использования медиаторов, эти соединения
должны быть доступны и иметь при этом низкую стоимость. Поиск нетоксичных
гетероциклических соединений показал, что одним из наиболее перспективных классов
органических соединений, которые могли бы использоваться в качестве медиаторов Lc,
являются соединения с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5, которые производятся
в промышленных масштабах и имеют низкую себестоимость (Рис. 8). Одним из наиболее
известных соединений данного класса является метамизол натрия или анальгин (PPA-Na),
который используется в медицинской практике в качестве обезболивающего средства.
1-фенил-3-метил-пиразолоны-5 относятся к гетероциклическим соединениям, содержащим в
своем составе два заместителя электрон-донорной природы – метильную и фенильную группы и
присутствуют в растворе в виде двух таутомерных форм (Рис. 8).
12
H3C
H3C
C
CH2
N
C
C
O
N
CH
N
C
N
Рисунок 8. Таутомерные превращения
фенилметилпиразолонов
OH
Субстратная специфичность
Были исследованы около двадцати соединений различной структуры, в том числе
гетероциклических, >N-OH соединений и производных бензойной кислоты. Исследования
гомогенных реакций с участием T. hirsuta Lc позволили отобрать соединения, которые могут
являться усилителями фермента. Среди этих соединений выраженные субстратные свойства по
отношению к Lc обнаружены у 1-фенил-3-метилпиразолона-5 (РР), его сульфо- (mSPP и pSPP) и
аминопроизводных (PPA и PPA-Na), а также у N-гидроксифталеимида (HPI) и 3-амино-(6гидрокси)-бензойной кислоты (HABA). Структурные формулы этих соединений представлены на
Рис. 9.
H3C
H3C
H3C
N
N
OH
N
N
N
OH
N
OH
SO3H
SO3H
mSPP
pSPP
РР
1-(4’-сульфофенил)- 1-(3’-сульфофенил)1-фенил-3метилпиразолон-5 3-метил-пиразолон-5 3-метил-пиразолон-5
NH2
H3C
CH3
H3C
N
H3C
N
CH2SO3Na
N
N
O
OH
N
PPA-Na
PPA
Рисунок 9.
Структурные
формулы
органических веществ
– потенциальных
медиаторов лакказ.
1-фенил-3-метил-4-метиламино1-фенил-2,3-диметил4-аминопиразолон-5 пиразолон-5-N(4)-метансульфонат натрия
O
NH2
C
N OH
HO
C
O
HPI
N-гидроксифталеимид
HO
C
O
HABA
3-амино-(6-гидрокси)-бензойная кислота
Исследование зависимости начальной скорости гомогенных ферментативных реакций от
концентрации исследуемых соединений показало, что кинетика реакций описывается
уравнением Михаэлиса-Ментен. Для оценки эффективности взаимодействия Lc с этими
соединениями было проведено их сравнение с одним из лучших субстратов Lc – гидрохиноном
(HQ). Результаты представлены в Таблице 4. Как видно из Таблицы, производные PP с
сульфогруппой в фенильном кольце (pSPP и mSPP), либо аминогруппой в гетероцикле (PPA),
являются субстратами, сравнимыми по своим каталитическим константам с HQ. Эффективность
процесса ферментативного окисления РР намного ниже, что, возможно, связано с его
гидрофобностью.
13
Введение в гетероцикл фенилметилпиразолона электрон-донорных групп (аминогруппы в
положение 4 и метильной группы в положение 2) увеличивает значение kкат/Kм в случае PPA
более чем в 18 раз по сравнению с PP. Однако, это значение в несколько раз меньше, чем для
сульфо-производных фенилметилпиразолона. В случае PPA-Na, введение заместителей
(метильной и метан-сульфоновой групп) в аминогруппу мало отражается на скорости
ферментативной реакции, но значение Км увеличивается более чем в 10 раз. Возможно, более
слабое взаимодействие Lc с PPA-Na объясняется проявлением стерического фактора.
Взаимодействие Lc с HPI характеризуется низким сродством этого субстрата к ферменту и
низкой скоростью реакции, а HABA является субстратом Lc, сравнимым по своим кинетическим
параметрам с HQ.
В отличие от производных фенилметилпиразолона, при высоких скоростях развертки
потенциала система с HPI квазиобратима, что подтверждается наличием катодного пика на
вольтамперограммах. Потенциал средней точки между катодным и анодным пиками равен 870
мВ, и его условно можно принять за редокс-потенциал этой пары. По-видимому, при низких
скоростях развертки потенциала продукт, образующийся при окислении, недостаточно стабилен
и не успевает восстановиться на электроде. Таким промежуточным продуктом может быть >NO•
радикал, как это было показано для таких медиаторов, как HBT и TEMPO [Bourbonnais et al.,
1998; Xu et al., 2000; Fabbrini et al., 2002].
Описанные выше интермедиаты субстратов Lc образуются за счет их неферментативного
окисления на электродах. Зависимость максимального анодного тока от квадратного корня из
скорости развертки потенциала имеет линейный характер, что свидетельствует о том, что для
всех исследованных соединений электродный процесс протекает в диффузионноконтролируемом режиме.
Таблица 4. Кинетические и электрохимические параметры субстратов лакказ
Соединение
kкат, с-1
Kм, мМ
(kкат/ Kм)·10-4, М-1с-1
E1/2, мВ
∆I/Iдиф**
HQ
52,0
0,3
17,3
-20
---
PP*
9,7
2,1
0,46
430
0,2
mSPP
51,5
0,22
23,4
660
1,0
pSPP
43,9
0,29
15,0
570
0,8
PPA
35,1
0,41
8,66
PPA-Na
36,5
5,0
0,73
HPI*
3,6
6,0
0,06
870
2,5
HABA
43,4
0,28
15,5
390
---
410
550
490
830
0,7
---
E1/2 – потенциал полуволны окисления субстрата (скорость развертки потенциала 5 мВ/с);
Iдиф – анодный ток окисления медиатора;
∆I – прирост анодного тока при окислении медиатора (0,2 мМ) в присутствии VA (2 мМ).
Примечания:
∗
Рабочие растворы содержали 2% этилового спирта
** Определение ∆I и I
диф проводили при потенциале 1000 мВ
Потенциалы полувысоты анодного пика для всех изученных производных
фенилметилпиразолона, а также для HPI и HABA, представлены в Таблице 4. Как и следовало
14
ожидать, потенциал полувысоты анодного пика зависел от природы заместителя в структуре
фенилметилпиразолонов.
4
4
Рисунок 10. Циклические
mSPP
HPI
вольтамперные кривые mSPP и HPI.
2
0
Ток, мкА
1
-4
0
2
1
-2
-8
3
2
-4
3
-12
-6
4
4
-16
-8
0
200
400
600
800
1000 1200
Е, мВ отн. Ag/AgCl
0
200
400
600
800
1000 120
Условия: 0,1 М цитратно-фосфатный
буфер, pH 5,0;
концентрация медиаторов – 0,2 мМ;
скорость развертки потенциала:
1 - 5 мВ/c, 2 - 25 мВ/c,
3 - 100 мВ/c, 4 – 200 мВ/c
Е, мВ отн. Ag/AgCl
Он увеличивался при введении электрон-акцепторной сульфогруппы в фенильное кольцо
(mSPP и pSPP) и уменьшался при введении в гетероцикл электрон-донорной аминогруппы
(РРА).
Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при окислении усилителей, в
присутствии лакказы Trametes hirsuta
Были проведены дополнительные спектральные исследования продуктов гомогенного
окисления двух соединений класса фенилметилпиразолонов – PPA-Na и mSPP в присутствии T.
hirsuta Lc.
В случае PPA-Na спектры поглощения интермедиатов, образующихся в результате
ферментативного окисления, зависели от соотношения концентраций медиатора и фермента в
растворе (Рис. 11), что указывало на возможное образование нескольких промежуточных
продуктов окисления медиатора.
Основываясь на электрохимических данных по гетерогенному окислению PPA-Na, можно
предположить существование как минимум трех основных промежуточных продуктов
ферментативного окисления данного субстрата (с потенциалами максимумов анодных пиков 290,
570, и 770 мВ).
При ферментативном окислении mSPP, по-видимому, образуются два интермедиата
(Рис. 12). При этом продукт с максимумом поглощения при 340 нм является более высоко
редокс-потенциальным, т.к. его формирование протекает на более поздней стадии
ферментативной реакции. Можно предположить образование двух основных интермедиатов
mSPP со значениями потенциалов 660 и 850 мВ, соответствующими максимумам поглощения
при 270 и 340 нм, соответственно. При этом образование первого продукта при ферментативном
окислении является быстрым процессом, в то время как образование второго продукта процесс
более медленный. Похожее двухступенчатое поведение при ферментативном окислении было
показано для ABTS, что позволяет предположить сходство механизмов ферментативного
окисления обоих субстратов Lc [Bourbonnais & Paice, 1990; Solís-Oba et al., 2005].
Электрохимическое окисление вератрового спирта в присутствии медиаторов
Методом циклической вольтамперометрии было изучено взаимодействие отобранных
соединений с модельным соединением лигнина – вератровым спиртом (VA). Этот метод
позволяет исследовать не только электродные процессы, но и сопряженные с ними химические
реакции.
В качестве примера на Рис. 13 представлены циклические вольтамперограммы, записанные
в растворах VA, медиаторов (mSPP, PPA-Na, HPI), а также смеси VA-медиатор. Необходимо
отметить, что VA электрохимически не активен до потенциала 1000 мВ.
В присутствии mSPP (Рис. 13), а также pSPP и РРА, окисление VA происходит с меньшим
перенапряжением, чем при прямой электродной реакции. На анодной ветви кривой наблюдается
увеличение тока окисления в области потенциала 1000 мВ. В то же время, добавление VA к
раствору PPA-Na не приводило к увеличению токов окисления (Рис. 13).
15
В присутствии VA в растворах HPI наблюдалось значительное увеличение анодного тока в
области потенциалов окисления HPI и полное исчезновение тока восстановления на катодной
ветви кривой (Рис. 13). Отсутствие катодного тока можно объяснить включением интермедиата
электродного окисления HPI в процесс химического окисления VA вблизи поверхности электрода.
Химически восстановленный интермедиат вновь окислялся на электроде, давая увеличение
анодного тока. При потенциале 910 мВ и скорости развертки потенциала 5 мВ/с анодный ток в
присутствии VA увеличивался в 2,5 раза по сравнению с током в отсутствие VA (Рис. 13), что
указывает на регенерацию восстановленной формы медиатора в результате каталитического
окисления VA, и на повторное окисление HPI на электроде.
0.8
5
0.6
4
0.4
3
2
0.2
Оптическая плотность
PPA-Na – 10-3 M
Лакказа – 10-7 М
1
0
300
350
400
450
500
PPA-Na – 10-3 M
Лакказа – 2•10-6 М
1.2
0.9
5
0.6
4
0.3
1
350
450
Условия: 0,1 М цитратно-фосфатный буфер,
рН 5.0.
3
2
0
550
Рисунок 11. Изменение во времени
спектров поглощения продуктов
реакции, образующихся в процессе
ферментативного окисления PPA-Na,
с участием лакказы T. hirsuta при
различных концентрациях медиатора
и фермента.
1 – исходный спектр; 2 – 1 мин;
3 – 10 мин; 4 – 30 мин; 5 – 60 мин.
650
750
850
Оптическая плотность
λ, нм
1
0.8
mSPP – 10-4 M
Лакказа – 10-6 М
3
0.6
Рисунок 12. Изменение во времени
спектров поглощения продуктов
реакции, образующихся в процессе
ферментативного окисления mSPP с
участием лакказы T.hirsuta:
1 – исходный спектр;
2 – 10 мин; 3 – 30 мин.
1
0.4 2
0.2
0
230
3
280
330
380
430
λ, нм
Условия: 0,1 М цитратно-фосфатный буфер,
рН 5.0.
До потенциала 1000 мВ не наблюдалось ускорения электроокисления VA в присутствии
низкопотенциального продукта электродного окисления HABA, редокс-потенциал которого
составляет 390 мВ.
В Таблице 4 представлены соотношения прироста анодного тока в растворе, содержащем VA
и медиатор, к диффузионному току окисления самого медиатора при потенциале 1000 мВ. Как
видно из таблицы, эффективность электрокаталитического окисления VA возрастала с
увеличением потенциала полуволны окисления усилителя. При взаимодействии с VA
эффективными являлись соединения, имеющие потенциал полувысоты волны окисления выше
500 мВ.
16
mSPP
Ток, мкА
0
0
1
-2
HPI
PPA-Na
-3
-4
2
-9
3
200
500
800
1100
1
-15
-18
200
-8
-12
-12
-6
1
-4
-6
2
2
0
3
500
800
1100
3
-16
-20
250
550
85 0
1150
Е, мВ (отн. Ag/AgCl)
Рисунок 13. Циклические вольтамперные кривые, зарегистрированные в
растворах (1) медиатора (0.2 мМ); (2) вератрового спирта (2 мМ) и (3) смеси
медиатора и вератрового спирта в тех же концентрациях
Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, рН 5.0; скорость развертки потенциала 5 мВ/с
Окисление вератрового спирта в системе лакказа/редокс усилитель фермента
Для выяснения эффективности исследуемых медиаторов при деградации модельного
соединения лигнина – VA, были проведены прямые эксперименты по окислению VA LMS в
гомогенном растворе. Продукты окисления разделяли методом HPLC. Идентификацию продуктов
окисления VA проводили по времени их удерживания на колонке. В качестве маркеров
использовали VA, вератровый альдегид и вератровую кислоту, количество которых в элюате
рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы “Мультихром”
(Россия). Для оценки эффективности аналогичный эксперимент проводили с использованием
ABTS в качестве медиатора.
При использовании системы Lc/HPI была достигнута высокая степень превращения VA,
сравнимая со степенью окисления спирта в присутствии ABTS. Взаимодействие Lc с
гидроксифталеимидом характеризуется низкой скоростью реакции. Однако,
как показали
электрохимические исследования, образующийся при окислении катион-радикал, способен с
довольно высокой скоростью окислять VA. Благодаря этому общая эффективность процесса
деградации спирта системой Lc/HPI высока и составляет 70% превращения VA за 48 часов
реакции. Иначе обстоит дело с системами Lc/PP. Как показали кинетические исследования (Табл.
4), Lc с высокой скоростью катализирует окисление сульфопроизводных данного класса.
Электрохимическими экспериментами было показано, что продукты окисления этих соединений
нестабильны. Однако потенциал и время жизни продуктов окисления оказываются достаточными
для того, чтобы окислить VA. Благодаря высокой скорости ферментативного окисления этих
производных общая эффективность окисления VA системами Lc/mSPP или Lc/pSPP достаточно
высока, в результате чего процент превращения спирта достигает, соответственно, 35% и 30% за
48 часов реакции. Более низкий по сравнению с ABTS процент деградации VA объясняется, повидимому, слабой обратимостью процесса окисления этих производных фенилметилпиразолона.
Как и следовало ожидать на основании электрохимических исследований, в системе Lc/PPANa скорость окисления VA оказалась значительно ниже, чем при использовании
сульфопроизводных PP. В то же время, при использовании PPA-Na окисление VA идет до
соответствующей кислоты, в то время как большинство известных к настоящему времени
медиаторов окисляют VA до вератрового альдегида [Bourbonnais, Paice, 1990]. По-видимому,
несмотря на низкую скорость реакции окисления VA, высокопотенциальные интермедиаты PPANa, образующиеся в присутствии Lc, способны к дальнейшему окислению вератрового альдегида
до вератровой кислоты. Это хорошо согласуется с электрохимическими и спектральными
результатами, полученными для PPA-Na.
Контрольные эксперименты показали, что в отсутствие Lc исследуемые нами медиаторы
практически не способны к окислению VA, также как и Lc в отсутствие медиаторов окисляет
менее 2% VA. Таким образом, производные PP могут использоваться в качестве усилителей
действия Lc.
17
Ферментативный синтез полианилина
[Ярополов c соавт., 2007, 2008; Karamyshev et al., 2003; Vasil'eva et al., 2007]
Полианилин является одним из наиболее важных электропроводящих полимеров в силу
своей высокой химической стабильности, относительно высокой электропроводности, простоты
получения и возможности изменять свои физико-химические характеристики при изменении
температуры, рН раствора, электрического потенциала. Это обуславливает возможность
использования электропроводящего полианилина в различных областях, таких как создание
хемо- и биосенсоров, антистатических и антикоррозионных покрытий, в микроэлектронике и
светоизлучающих устройствах, для разделения изомеров оптически активных соединений. В
настоящей работе описываются ферментативный способ получения водной дисперсии
наночастиц электропроводящего полианилина и полисульфокислоты, а также безматричный
способ получения оптически активного полианилина.
В качестве катализатора реакции окислительной полимеризации мономера использовали
высокоочищенные препараты Lc из культурального фильтрата базидиального гриба T. hirsuta.
Использованная в работе Lc является кислотостабильным ферментом, что важно при
проведении ферментативного синтеза, осуществляемого при кислых значенях рН.
Матричный синтез интерполимерного комплекса наночастиц электропроводящего
полианилина и сульфополистирола
Полимеризацию анилина проводили при комнатной температуре в присутствии
сульфонированного полистирола как матрицы для синтеза полимера. Формирование продуктов
реакции контролировали спектрофотометрически (Рис. 14). Варьировали следующие параметры
синтеза: рН раствора, начальные концентрации фермента, анилина и сульфополистирола.
Исследовались следующие параметры полученных образцов: строение полианилинов с
использованием различных видов спектроскопии (Рис. 14), электрохимическая активность с
использованием циклической вольтамперометрии, а также электропроводность синтезированных
образцов.
Показана возможность ферментативного получения водорастворимого
электропроводящего полианилина, различающегося по основным свойствам в зависимости от
условий синтеза.
Безматричный синтез оптически активного электропроводящего полианилина
Использование оптически активного полианилина для создания HPLC сорбентов с целью
разделения энантиомеров физиологически активных соединений представляет большой
интерес. Поскольку дедопированный полианилин не имеет ассиметричных атомов углерода,
оптическая активность полимера (спиралевидная конформация) индуцируется хиральными
допантами, среди которых наиболее часто используют энантиомеры сульфокамфорной кислоты
(CKK).
Одной из практических задач настоящей работы являлась разработка простого, экологически
чистого способа получения оптически активного полианилина. Поставленная задача была
решена следующим способом: окислительную полимеризацию анилина проводили в присутствии
хирального допанта (R- или S-сульфокамфорной кислот (CKK)) с использованием T. hirsuta Lc.
Ферментативный способ получения хирального полианилина протекает в одну стадию,
является экологически чистым и позволяет получать полианилин не загрязненный продуктами
восстановления окислителя. При значении рН около 2,8, которое было выбрано оптимальным
для получения допированного полианилина, Lc сохраняет ~38% своей первоначальной
активности после инкубации в течение 4 суток при температуре 20°С.
Были оптимизированы условия ферментативного синтеза путем варьирования концентраций
реагентов (CKK и анилина от 0,025 М до 0,4 М) и их соотношений (от 1:5 до 5:1); концентрации
дикислорода (0,025 mM и 1 mM), рН раствора (2,6÷6,0); температуры (4°С и 20°С) и
концентрации фермента (6•10-8 М и 1,6•10-7 М). Наилучшие результаты были получены при
соотношении реагентов анилин:сульфокамфорная кислота=1:1 и их концентраций в интервале
0,1÷0,2 М.
18
При увеличении концентрации О2 в реакционной смеси по сравнению с раствором насыщенным
воздухом, скорость полимеризации возрастает, но при этом несколько усложняется методика
эксперимента. Поэтому все эксперименты, приведенные в настоящей работе, проводили на
воздухе.
2
А
Поглощение
pH
pH 2.9
pH 3.4
1
pH 3.8
pH 4.3
pH 6.2
pH 7.5
pH 8.8
pH 9.5
pH
pH 10.1
λ, нм
0
200
300
400
500
600
700
800
900
Поглощение
Б
λ, см-1
Рисунок 14. УФ-видимые (А) и ИК (Б) спекры комплекса
сульфополистирол-полианилин
На рисунке 15 приведены УФ-видимые спектры полианилина, допированного S-CKK,
синтезированного in situ, при различных температурах. Видны четко выраженные полосы
поглощения в области 750-800 нм, относящиеся к допированной форме полианилина и
указывающие на наличие локализованного полярона в структуре полимера.
Методом спектроскопии кругового дихроизма показана оптическая активность ферментативно
синтезированного полимера (Рис. 16). Установлено, что спиралевидная конформация основной
цепи полианилина является достаточно лабильной и знак оптической активности полимера
можно изменить передопированием полученного образца другим энантиомером СКК.
19
Поглощение
Рисунок 15. УФ-видимые спектры
пленок ПАНИ / S-СКК,
синтезированные in situ на стеклах.
(1) – при 40С и (2) при 200С
λ, нм
Рисунок 16. КД-спектры дисперсии
ферментативно синтезированного
оптически активного (хирального)
полианилина в растворе
диметилсульфоксида в присутствии:
(1) – S-СКК и (2) – R-СКК.
λ, нм
Комплексное сравнительное изучение медьсодержащих оксидаз
[Шлеев с соавт., 2003; Shleev et al., 2004a, 2005b, 2005c, 2006d, 2007a, 2007b, 2008a, 2008b;
Ferapontova et al., 2005; Pita et al., 2006; Christenson et al., 2004, 2006; Yaropolov et al., 2007;
Nazaruk et al., 2007; Haghighi et al., 2007; Zumarraga et al., 2007, 2008a, 2008b; Горбачева с
соавт., 2008; Vaz-Dominguez et al., 2008; Ramírez et al., 2008; Haberska et al., 2009;
Ressine et al., 2010]
Определение окислительно-восстановительных потенциалов Т1 центров MCO
Одной из основных характеристик MCO является стандартный окислительновосстановительный потенциал Т1 центров ферментов. Значения этого потенциала варьируются
у различных MCO от 430 до 1000 мВ отн. NHE [Solomon et al., 1996; Shleev et al., 2005b]. T1 центр
фермента является первичным акцептором электронов, поступающих от субстратоввосстановителей. Непосредственно MCO окисляют только те соединения, окислительновосстановительный потенциал которых незначительно превышает редокс-потенциал иона меди
Т1 центра фермента [Xu, 1997]. Кроме того, от редокс-потенциала Т1 центра зависит
эффективность катализа для большинства субстратов Lc, что делает MCO с высокими
потенциалами Т1 центра весьма перспективными объектами для биотехнологических целей,
например, для обесцвечивания бумажной пульпы, биоремедиации и деградации различных
ксенобиотиков. Определение редокс-потенциалов ионов меди первого типа было необходимо
для выявления наиболее высокопотенциальных ферментов, которые, участвуя в реакциях
окисления субстратов, приводят к образованию высокопотенциальных интермедиатов, что
весьма важно при проведении биотехнологических процессов. Более того, именно применение
20
высоко редокс-потенциальных MCO перспективно с точки зрения создания высокоэффективного
биокатода топливных элементов.
Определение редокс-потенциалов Т1 центров MCO осуществляли методом
потенциометрическoго титрования в присутствии редокс-медиатора(ов) с использованием
разработанных микро и макро спектроэлектрохимических ячеек (Рис. 17).
На рисунке 18 представлены спектры поглощения растворов T. hirsuta Lc, записанных в
процессе окислительно-восстановительного титрования с использованием редокс-пары
[Mo(CN)8]3-/[Mo(CN)8]4-. Аналогичные данные были получены при окислительновосстановительном титровании T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima Lc. Восстановление Т1
медного центра сопровождалось уменьшением пика поглощения в области 610 нм. Следует
отметить, что редокс-потенциал системы в данном случае определялся соотношением
окисленной и восстановленной форм медиатора.
Другим вариантом потенциометрического титрования в присутствии одного или нескольких
редокс-медиаторов является метод электролиза смеси фермента и редокс-медиаторов. Для этой
цели использовалась микро спектроэлектрохимическая ячейка с рабочим объемом около 7 мкл
(Рис. 17А). Редокс-потенциал системы в данном случае определяется потенциалом,
накладываемым на рабочий электрод, а медиатор служит лишь для ускорения достижения
редокс-равновесия в системе. Данный метод позволяет значительно уменьшить количество
медиатора, а также расширить возможную область потенциалов в процессе редокс-титрования.
А
Микро (рабочий объем 7 микролитров)
Б
Макро (рабочий объем 2000 микролитров)
Т1 и Т3 центры (УФ-видимая спектроскопия)
Т1 и Т2 центры (УФ-видимая и ЭПР спектроскопия)
Рисунок 17. Спектроэлектрохимические ячейки
(А: 1 - вывод рабочего раствора; 2 и 3 - вспомогательные электроды; 4 - керамическая втулка; 5 пластмассовая завинчивающаяся крышка; 6 - коническая муфта; 7 - пластиковое крестообразное основание;
8 - золотой рабочий электрод (капилляр); 9 - электрод сравнения; 10 – оптическое волокно.
Б: 1 - кварцевая кювета; 2 - плоский шлиф; 3 - зажим; 4 - ячейка для проведения электрохимических
измерений; 5 - трубка ввода газа; 6 - кран; 7 - мешалка; 8 - платиновые электроды; 9 - трубка вывода газа и
ввода веществ; 10 - простой шлиф; 11 - водяной затвор; 12 - капилляр;
13 - трубка для соединения рабочего раствора с электродом сравнения; 14 - трубка для шланга)
На рисунке 19 представлен пример использования данной методики при редокс-титровании
двух множественных форм T. pubescens Lc с использованием редокс-пары [Mo(CN)8]3/[Mo(CN)8]4-. С помощью данной методики были определены окислительно-восстановительные
потенциалы Т1 центров Cerrena unicolor Lc, рекомбинантной M. thermophila Lc (LT2), мутантов
21
фермента 2B10, 7H9, 3D1, 2E9, и R2, M. verrucaria и T. tsunodae BOx, а также Bacillus halodurans
MCO.
1.5
1
Поглощение, опт. ед.
0.035
lg[(A/(A0-A)]
0.040
2
3
1.0
0.5
Рисунок 18. Изменение спектров
лакказы T. hirsuta в процессе
потенциометрического титрования с
использованием редокс-пары
[Mo(CN)8]3-/[Mo(CN)8]4-.
0.0
-0.5
4
-1.0
760
5
0.030
780
800
820
840
860
E, mV
6
Условия: 0,1 М фосфатный буфер (рН 6.0)
t = 20°C
1 – 7 мкМ лакказы и 2 мМ [Mo(CN)8]32-6 – добавление [Mo(CN)8]4- до конечной
концентрации 2 мМ
0.025
0.020
0.015
500
600
700
800
λ, нм
1
0.16
log[(A/(A0-A)]
Lc1
LАС1
Поглощение, отн. ед.
0.14
1
0.5
LAC1
Lc1
LAC2
Lc2
0
-0.5
2
0.12
-1
675
3
700
725
750
0.1
4
5
0.08
A
0.06
450
500
550
600
650
700
750
λ, нм
0.13
Поглощение, отн. ед. (614 нм)
775
800
825
E / мВ (vs. NHE)
0.12
LAC1
Lc1
0.11
Lc2
LAC2
0.1
0.09
Рисунок 19. Спектроэлектрохимическое
окислительно-восстановительное
титрование лакказ Trametes pubescens
(A) Изменение спектра поглощения Lс1 в
процессе редокс-титрования. 1 – 5 спектры
поглощения фермента при потенциалах
800
раствора 900, 800, 750, 700, и 600 мВ
соответственно. Вставка: Кривые
титрования Нернста Lc1 и Lc2 в
логарифмических координатах.
(Б) Спектроэлектрохимические кривые
титрования, показывающие зависимость
поглощения растворов Lc при 614 нм
(отражающее окислительновосстановительное состояние меди Т1),
относительно редокс-потенциала среды.
Условия: 0,022 мM Lc1 и 0,018 мM Lc2;
0,2 мM K4Mo(CN)6;
0,1 M фосфатный буфер, pH 6,5.
Б
0.08
0.07
0.06
550
600
650
700
750
800
850
E/мВ (отн. НВЭ)
22
900
Полученные данные о значении окислительно-восстановительных потенциалов Т1 центров
MCO представлены в Таблице 5. Все изученные MCO относятся к высоко редокс-потенциальным
ферментам и являются высокоактивными в гомогенных реакциях окисления субстратов-доноров.
Дальнейшие электрохимические исследования Lc, проведенные в настоящей работе,
представляют интерес для понимания механизма катализа и возможности использования этих
ферментов в гетерогенных биоэлектрокаталитических системах.
Таблица 5. Редокс-потенциалы Т1 центра голубых медьсодержащих оксидаз
MCO
Потенциал Т1 центра, мВ отн. NHE
Trametes ochracea Lc
Trametes hirsuta Lc
Trametes pubescens LAC1
Trametes pubescens LAC2
Coriolopsis fulvocinerea Lc
Cerrena maxima Lc
Cerrena unicolor Lc
Myceliophthora thermophila LT2
Myceliophthora thermophila 2B10
Myceliophthora thermophila 7H9
Myceliophthora thermophila 3D1
Myceliophthora thermophila 2E9
Myceliophthora thermophila R2
Myrothecium verrucaria BOx
Trachyderma tsunodae BOx
Bacillus halodurans бактериальная MCO
790 ± 10
780 ± 10
746 ± 5
738 ± 5
780 ± 20
750 ± 5
750 ± 10
∼ 690
∼ 700
∼ 700
∼ 680
∼ 630
∼ 700
670 ± 10
> 650
325 ± 10
Редокс-титрование T. hirsuta Lc c одновременной детекцией сигнала Т1 центра посредством
видимой и ЭПР спектроскопии, а также специфического сигнала Т2 центра в ЭПР спектре Lc
(Рис. 20) показало, что одно из возможных значений редокс-потенциала Т2/T3 кластера
значительно ниже окислительно-восстановительного потенциала Т1 центра Lc равного 780 мВ
отн. NHE. При проведении данных экспериментов использовалась разработанная автором
биоэлектрохимическая ячейка с параллельным спектрометрическим контролем исследуемого
вещества (Рис. 17Б).
Редокс-титрование MCO в отсутствие медиаторов
Уникальная конструкция микро-спектроэлектрохимической ячейки с общим объемом около
7 мкл (Рис. 17А) позволила провести окислительно-восстановительные титрования MCO, таких
как T. hirsuta Lc, M. verrucaria BOx, и T. tsunodae BOx, в отсутствие редокс-медиаторов. В данных
экспериментах кривые титрования значительно отличались от кривых, представленных выше.
Наличие четко выраженного гистерезиса в электрохимическом процессе показано для всех
изученных MCO. Как видно из рисунков 21 и 22, ход окислительного титрования ферментов
отличается от восстановительной ветви кривой титрования.
Используя модельный редокс-белок, азурин, который содержит в своей структуре лишь один
ион меди типа 1, было показано, что данное явление связано не столько с отсутствием полного
окислительно-восстановительного равновесия в системе, сколько с особыми свойствами MCO,
имеющих в своем составе многоядерный медьсодержащий активный центр. Высказано
предположение, что электронное поведение MCO, сходное с поведением диодов, а именно
значительно различающаяся скорость электронного переноса в ходе окислительного и
23
восстановительного процессов, является внутренним свойством, присущим многим высоко
редокс-потенциальным MCO. По-видимому, данное явление связано со специфической
ориентацией белка на поверхности золотого рабочего электрода, а именно возможностью
электронного контакта Т2/T3 центра ферментов и электрода (Рис. 22Б). Был сделан вывод о том,
что одним из возможных редокс-потенциалов Т2/T3 центра высоко редокс-потенциальных MCO
является значение близкое к 400 мВ отн. NHE. Анализ литературных данных, а также
собственные результаты по электрохимическому поведению MCO на золотых и угольных
электродах (см. ниже), подтвердили данное предположение.
0.16
Поглощение, опт. ед.
А
Рисунок 20. Изменение спектров
поглощения (А) и ЭПР-спектров (Б)
лакказы T. hirsuta в процессе
окислительно-восстановительное
титрования с использованием различных
редокс-медиаторов.
Е – начальный спектр фермента
1 – 770 мВ ([Mo(CN)8]3-/[Mo(CN)8]4-)
2 – 450 мВ ([Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-)
0.12
0.08
0.04
450
500
550
600
650
700
750
800
λ, нм
T1
Б
1
2
E
T2
Т2
[mT]
24
Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,5.
0.16
0.22
Поглощение, опт. ед.
Поглощение, опт. ед.
А
0.20
0.18
E'm7 = 980 мВ
0.16
2
1
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
Б
0.14
0.12
1
0.10
0.08
2
0.06
0.04
0.02
E'm7 = 805 мВ
0.00
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Е, В
0.20
В
850 мВ
0.15
350 мВ
0.10
50 мВ
0.05
0.00
450
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0.30
Поглощение, опт. ед.
Поглощение, опт. ед.
0.25
0.5
Е, В
500
550
600
650
700
750
800
Е, В
0.25
Г
0.20
980 мВ
0.15
550 мВ
0.10
0.05
0.00
-0.05
450
100 мВ
500
550
600
650
700
750
800
Е, В
Рисунок 21. Спектроэлектрохимическое редокс-титрование
билирубин оксидаз Myrothecium verrucaria и Trachyderma tsunodae
с использованием микро спектроэлектрохимической ячейки.
А и Б – кривые титрования отражающие зависимость поглощения раствора
ферментов M. verrucaria и T. tsunodae от приложенного потенциала,
соответсвенно.
В и Г – спектры поглощения ферментов M. verrucaria и T. tsunodae в процессе
титрования, соответственно.
Поглощение, опт. ед.
Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0.
А
Рисунок 22. Спектроэлектрохимическое
редокс-титрование лакказы T. hirsuta с
использованием микро
спектроэлектрохимической ячейки.
(А) Спектры поглощения лакказы в
процессе титрования. Е – спектр нативного
фермента, 1-5 – спектры при потенциалах
20, 530, 830 и 1030 мВ отн. НВЭ.
(В) Кривые титрования, отражающие
зависимость поглощения раствора фермента
от приложенного потенциала.
1 – окислительная кривая титрования и
2 – восстановительная кривая титрования.
Поглощение, опт. ед.
λ, нм
Б
Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,5.
золотой электрод
Е, мВ
25
Электрохимическое поведение MCO на золотых электродах
Исследовано электрохимическое поведение T. hirsuta, T. ochracea и C. maxima Lc, а также
T. tsunodae BOx и человеческого Cp, адсорбированных на модифицированных и
немодифицированных золотых электродах. Cp, адсорбированный на немодифицированных
золотых электродах, также как электродах, модифицированных отрицательно и положительно
заряженными тиолами, не обладал электрохимической активностью. Циклические
вольтамперограммы золотых электродов, модифицированных 4-аминотиофенолом, с
иммобилизованным Cp в отсутствие редокс-медиаторов представлены на Рис. 23.
Иммобилизация Cp на нейтральном слое аминофенола приводила к появлению
электрохимической активности фермента, а именно неярко выраженного анодного пика со
значением потенциала около 750 мВ отн. NHE. Рассчитанная для одноэлектронного переноса
концентрация белка составляла около 8 пмоль/см2 с учетом реальной поверхности золота,
имеющей фактор шероховатости около 2. Высота анодного пика слабо зависела от концентрации
растворенного О2. Важно отметить полное отсутствие ускорения электрокаталитического
процесса восстановления О2 церулоплазмином, иммобилизованным на модифицированных и
немодифицированных золотых электродах.
0.6
0.4
Ток, мкА
0.2
monolayer,
монослой,
air воздух
monolayer,
N2 азот
монослой,
ceruloplasmin, air воздух
церулоплазмин,
ceruloplasmin,
N2 азот
церулоплазмин,
0.0
-0.2
-0.4
-0.6
100
200
300
400
500
600
700
800
900 1000
Е, мВ
Рисунок 23. Циклические вольтамперограммы золотого электрода,
модифицированного 4-аминотиофенолом,
с иммобилизованным церулоплазмином
Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4; стартовый потенциал – 1000 мВ;
скорость развертки потенциала – 100 мВ/сек.
Дополнительные элипсометрические исследования адсорбции белка на тиол-модифицированной
поверхности позволили расчитать реальную концентрацию Cp при его иммобилизации на 4аминотиольном монослое (Рис. 24). С учетом молекулярного веса целовеческого Cp, 132 кДа, эта
концентрация не превышала 2 пмоль/см2. Сходная ситуация, а именно проявление
электрохимической активности без ускорения электровосстановления О2 в отсутствие редоксмедиаторов, наблюдалась и при электрохимическом изучении другой MCO – T. tsunodae BOx,
иммобилизованной на золотых электродах, модифицированных отрицательно заряженным
монослоем тиола (Рис. 25А). При этом фермент, адсорбированный на немодифицированных
золотых электродах, также как и на электродах, модифицированных положительно заряженным
и нейтральным тиолами, не обладал электрохимической активностью. Широкие катодный и
анодный пики (Рис. 25А) отражают электрохимическое восстановление и окисление BOx,
ковалентно связанной с поверхностью электрода. Потенциал средней точки фарадеевского
процесса равен 360 мВ (отн. NHE), интервал между катодным и анодным пиком соответствует
квазиобратимому электрохимическому процессу (56 мВ), рассчитанная поверхностная
26
концентрация фермента – около 10 пмоль/см2. Рассчитанная с использованием Marcus-DOS
теории вольтамперометрическая кривая достаточно хорошо описывает Фарадеевский процесс
при значениях энергии реогранизации Т1 центра ( λТ 1 ) 0,4-0,8 эВ и стандартной константы
скорости гетерогенного ЭП ( k 0 ) 0,3 с-1.
2
50
1
40
30
1
2
20
толщина (Å)
количество (mg/m2)
1,5
0,5
10
0
0
0
10
20
30
40
50
60
Время, мин
Рисунок 24. Адсорбция церулоплазмина на поверхности золота,
модифицированной 4-аминотиофенолом
1 – количество адсорбированного фермента на единицу поверхности,
2 – толщина адсорбированного слоя.
Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4.
Введение в буферный раствор кислорода, также как и ингибирование фторид-ионами
адсорбированного фермента, не приводило к появлению значительной разницы в плотностях
тока по сравнению с анаэробными условиями для электрода, поляризованного при потенциале
+500 мВ (Рис. 25А, вставка). При этом, добавление K3[Fe(CN)6], эффективного медиатора,
осуществляющего ЭП независимо от ориентации фермента на поверхности электрода,
приводило к появлению ярко выраженного процесса ускорения электрокаталитического
восстановления О2 (Рис. 25Б). Аналогичные результаты были получены и для золотых
электродов, модифицированных T. hirsuta Lc.
На рис. 26 представлена циклическая вольтамперограмма фермента, адсорбированного на
немодифицированном золотом электроде. Потенциал средней точки фарадеевского процесса
равен 480 мВ (отн. NHE), интервал между катодным и анодным пиком соответствует
квазиобратимому электрохимическому процессу (100 мВ), поверхностная концентрация
фермента, рассчитанная с учетом одноэлектронного переноса, – около 4 пмоль/см2. Данная
концентрация фермента незначительно превышает количество Lc на единицу поверхности,
рассчитанную с учетом элипсометрических исследований (Рис. 27). Следует отметить
практически полное отсутствие ускорения электровосстановления О2 Lc, адсорбированной на
немодифицированных золотых электродах в отсутствие редокс-медиаторов.
Введение в раствор ABTS приводило к ярко выраженному биоэлектрокаталитическому
восстановлению О2 Lc, адсорбированной на золотых электродах. Процесс контролировался как
электрохимически (Рис. 28), так и спектрофотометрически с использованием микро
спектроэлектрохимической ячейки (Рис. 29).
27
8
0,2
A
А
O2
-
F
0
БB
-2
j (μAcm )
Ток, мкА
6
N2
O2
N2
0,0
4
-0,2
-20
-0,4
-0,6
2
0
200
1
0
400
600
800
-40
Time (s)
-60
3
-2
1
3
2
2
-4
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
-80
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Е, мВ
Е, мВ
Рисунок 25. Электрохимическое поведение BOx иммобилизованной на
золотом электроде, модифицированном монослоем
меркаптопропионовой кислоты.
(А) Циклические вольтамперограммы модифицированного золотого
электрода в анаэробных условиях. 1 и 2 – в отсутствии и присутствии
фермента, соответственно, 3 – вольтамперограмма, теоретические
расчитанная полученная с использованием Marcus-DOS теории
электронного транспорта. Вставка: хроноамерометрическая кривая
электрода, поляризованного при потенциале 500 мВ отн. NHE в
анаеробных и аеробных условиях, а также при добавлении 10 мМ F-.
(Б) Вольтамперограммы BOx-модифицированного золотого электрода в
присутствии 2 мМ K3[Fe(CN)6].
1 – буфер, насыщенный N2, 2 – буфер насыщенный O2,
3 – буфер, насыщенный O2, с добавлением 10 мМ F-.
Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0.
Следует отметить, что активность адсорбированного фермента зависела от потенциала,
приложенного к золотому электроду. Данное поведение фермента напоминает поведение
полупроводниковых транзисторов, в которых скорость ЭП (плотность тока) между вводом и
выводом устройства зависит от потенциала, приложенного к контрольному электроду (Рис. 30).
По-видимому, низко редокс-потенциальный процесс, наблюдаемый при использовании золотых
материалов, соответствует редокс-трансформации Т2/Т3 кластера MCO за счет специфической
ориентации белка на поверхности электрода. Важно также отметить, что активность Lc
составляла около 50% при отсутствии потенциала (Рис. 30).
Ток, мкA/см2
20
Рисунок 26. Циклическая
вольтамперограмма золотого капилярного
электрода с адсорбированной лакказой
Trametes hirsuta.
10
Условия: 0,1 М фосфатный буфер рН 5,3;
0,25 мМ О2,
скорость развертки потенциала – 10 мВ/с,
второе сканирование).
0
-10
-20
-50
150
350
550
750
950
1150
Е, мВ
28
100
1
2
80
60
40
1
2
толщина (Å)
количество (мг/м2)
3
20
0
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Время (мин)
Рисунок 27. Адсорбция лакказы T. hirsuta на немодифицированной
золотой поверхности
1 – количество адсорбированного фермента на единицу поверхности,
2 – толщина адсорбированного слоя.
Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 5,3.
А
0
550 mV
-5
500 mV
Ток, нА
-10
450 mV
-15
-20
активность
-25
ABTS
-30
-35
-40
-45
50
70
Время,
сек110
90
130
150
-10
Б
Ток, нА
-15
-20
Условия: 0,2 М фосфатный буфер, рН 5,2;
0,25 мМ О2.
-25
-30
-35
-40
300
Рисунок 28. Амперометрические
исследования окисления ABTS с участием
лакказы Trametes hirsuta, адсорбированной
на поверхности золотого капилярного
электрода.
А) Хроноамперометрические кривые
плоского золотого электрода с
адсорбированным ферментом, записанные
при потенциале 550 мВ, 500 мВ, и 450 мВ.
Б) Зависимость скорости ферментативного
окисления ABTS (выраженное в виде
катодного тока) от приложенного
потенциала.
350
400
450
500
550
Е, мВ
29
2.8
4
24 сек
А
Б
S
N
2
18 сек
1.6
1.2
12 сек
0.8
6 сек
0.4
Поглощение, отн. ед.
ΔА (419 нм)
HO3S
3.5
2.4
0
N
3
H3C
SO3H
S
N
N
CH2
H2C
2.5
CH3
ABTS
2
6
1.5
5
4
1
3
2
0.5
1
0
-100
100
300
500
700
900
375
400
425
Е, мВ (отн. NHE)
450
475
500
λ, нм
525
550
575
600
Рисунок 29. Спектроэлектрохимичесике исследования окисления ABTS с
участием лакказы Trametes hirsuta,
адсорбированной на поверхности золотого капилярного электрода.
А) Зависимость скорости ферментативного окисления ABTS (выраженная в
виде разностей оптического поглощения при длине волны 419 нм) от
приложенного потенциала.
Б) Изменение спектров поглощения раствора ABTS во времени при
окислении субстрата кислородом в присутствии фермента.
Условия: 0,2 М фосфатный буфер, рН 5,2; 0,25 мМ О2.
А
-
O3 S
S
N N
N
C2H5
S
S
N N
N
C2H5
Рисунок 30. A Схема переноса электрона
между ионами меди лакказы Trametes и
поверхностью золотого электрода.
Трехмерная структура фермента
смоделирована с использованием программы
PyMol v. 0.99 на основе струтуры Trametes
versicolor Lc (PDB 1GYC). Белковая глобула
выделена зеленым цетом, ионы меди –
синим, углеводная часть фермента – черным
(ВЭП – внутримолекулярный электронный
перенос).
Б) Изменение активности лакказы T. hirsuta
при окислении ABTS в зависимости от
приложенного потенциала.
SO3-
N
C2H5
SO3-
S
e-
N
C2H5
вход
T1
ВЭП
-
e
e-
выход
T3
O2 + 4H
T3
+
T2
конроль
2H2O
Б
120
e-
золотой электрод
Активность (%)
-
O3S
100
E′T2/T3 ≈ 680 mV
80
60
E′T2/T3 ≈ 400 mV
40
20
0
100
e-
золотой электрод
30
200
300 Е,400
500 NHE)
600 700
мВ (отн.
800
900
Для иммобилизации MCO также использовали свежесинтезированные золотые наночастицы
различного размера, от 40 до 110 нм. В этом случае, в отличие от золотых макроэлектродов,
удалось добиться ПЭП между золотой поверхностью и Т1 центром некоторых ферментов, в
частности T. hirsuta Lc, что выражалось в биоэлектрокаталитической активности
адсорбированных MCO, проявляющейся уже при высоких потенциалах близких к редокспотенциалу Т1 центра. Рассчитанная k 0 в случае использования T. hirsuta Lc составляла около
0.5 с-1. Плотность тока биоэлектрокаталитического восстановления О2 варьировали (в
зависимости от размера наночастиц, рН буферного раствора, и т.д.) в диапазоне от 5 до 30
мкА/см2.
Электрохимическое поведение MCO на электродах из углеродных материалов
Методом циклической вольтамперометрии исследованы прямые (безмедиаторные)
электрохимические реакции восстановления O2 с участием T. hirsuta, T. ochracea, T. pubescens,
C. fulvocinerea и C. maxima Lc, нативной L. wrigthii Lc, рекомбинантной M. thermophila (LT2) Lc и
мутантов фермента 2B10, 7H9, 3D1, 2E9, и R2, а также M. verrucaria BOx, T. tsunodae Box,
человеческого Cp и бактериальной MCO Bacillus halodurans, адсорбированных на электродах из
спектрального графита. В аэробных условиях на электродах из спектрального графита для всех
исследованных ферментов показана возможность ПЭП с электрода на фермент. Для T. hirsuta,
T. ochracea, C. fulvocinerea, T. pubescens, C. maxima Lc, а также бактериальной MCO B.
halodurans, ПЭП сопровождался ускорением электрокаталитического восстановления О2. На Рис.
31 представлены типичные циклические вольтамперограммы немодифицированных и
модифицированных Lc электродов из спектрального графита в насыщенных кислородом
буферных растворах. При адсорбции на электродах, все Lc сильно уменьшали перенапряжение
реакции электровосстановления молекулярного О2 до Н2О.
15
15
10
10
1
5
1
0
Ток, мкА
Ток, мкА
5
-5
-10
2
-15
-20
0
-5
-10
2
-15
T. hirsuta
-20
T. ochreacea
-25
-25
-50
150
350
550
750
950
-50
1150
150
350
550
750
950
1150
Е, мВ (отн. NHE)
Е, мВ (отн. NHE)
15
15
10
10
5
1
1
5
0
Ток, мкА
Ток, мкА
Рисунок 31.
Биоэлектрохимическое
восстановление О2 на
графитовых электродах
немодифицированных и
модифицированных лакказами
базидиомицетов.
-5
2.
-10
0
-5
-10
2
-15
-15
C. fulvocinerea
-20
Условия:
0,1 М цитратно-фосфатный
буфер, рН 3,0;
скорость развертки потенциала –
0 мВ/сек;
стартовый потенциал – 1100 мВ.
-20
C.maxima
-25
-25
-50
150
350
550
750
950
Е, мВ (отн. NHE)
1150
-50
150
350
550
750
950
1150
Е, мВ (отн. NHE)
Необходимо отметить, что
для C. fulvocinerea Lc наблюдалась более низкая
электрокаталитическая активность по сравнению с другими изученными ферментами
базидиомицетов, в то время как ее активность в гомогенном растворе сравнима с активностью
других Lc. Возможно, это объясняется высоким (32%) содержанием углеводов в C. fulvocinerea Lc
31
(Таблица 1), что может оказывать влияние на ориентацию молекул фермента на поверхности
электрода, а также затруднять ЭП с электрода на Т1 центр фермента.
Как видно из рисунка 31, начало электровосстановления O2 на электродах,
модифицированных Lc, находится в области 800 мВ, т.е. существует корреляция между
потенциалом Т1 центра ферментов и началом реакции электровосстановления O2 на электроде.
Такая же корреляция получена и для низко редокс-потенциальных растительной Lc и
бактериальной MCO. При этом оптимум рН биокаталитической реакции восстановления O2
находится в сильно кислой области для Lc базидиомицетов и слабощелочной области для
растительного и бактериального ферментов, что совпадает с оптимумами рН гомогенных
реакций данных биокатализаторов.
Lc аскомицетов, например, дикого типа L. wrigthii и рекомбинантная M. thermophila, не
катализировали ускорение реакции электровосстановления О2. При этом, на циклических
вольтамперограммах ферментов регистрировались достаточно ярко выраженные редокспроцессы в области потенциалов 400 мВ отн. NHE.
Электрохимическое
изучение
Cp
проводилось
на
модифицированных
и
немодифицированных электродах из спектрального графита. В качестве примера, на Рис. 32
представлены циклические вольтамперограммы электродов из спектрального графита с
иммобилизованной смесью многостенных углеродных нанотрубок с Cp. На электродах из
спектрального графита, модифицированных и немодифицированных многостенными и
одностенными нанотрубками, всегда присутствовал фарадеевский процесс со значением
потенциала средней точки около 380 мВ отн. NHE. Поверхностная концентрация фермента,
рассчитанная с учетом одноэлектронного переноса, достигала 8 и 14 пмоль/см2 для катодного и
анодного пика, соответственно, с учетом факторов шероховатости элетродов.
Наряду с квазиобратимым процессом, наблюдался катодный пик со значением потенциала
около 580 мВ и рассчитанной поверхностной концентрацией Cp около 3 пмоль/см2.
Использование многостенных карбоновых нанотрубок в качестве матрицы для иммобилизации
фермента приводило к обнаружению высоко редокс-потенциального квазиобратимого процесса
со значением потенциала средней точки около 690 мВ отн. NHE. Показана чувствительность
обоих редокс-процессов к О2, а именно исчезновение редокс-активности Cp в анаэробных
условиях (Рис. 32). Однако, как и при использовании золотых электродов, ускорения реакции
электровосстановления О2 адсорбированным Cp не наблюдалось.
8.0
1.0
6.0
0.8
А
Б
air
N2
0.6
4.0
bare
nanotubes
нанотрубки
церулоплазмин, воздух
ceruloplasmin,
air
церулоплазмин, NN
2
ceruloplasmin,
2
0.0
-2.0
I (μA)
Ток,
мкА
I (μA)
Ток,
мкА
0.4
2.0
0.2
0.0
-0.2
-0.4
-4.0
-0.6
-6.0
-0.8
-8.0
0
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
мВ
EЕ,(mV)
-1.0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
EЕ,
(mV)
мВ
Рисунок 32. Циклические вольтамперограммы электродов из спектрального графита,
модифицированных многостеночными карбоновыми нанотрубками
с адсорбированным церулоплазмином
(скорость развертки потенциала – 100 мВ/сек; стартовый потенциал – 1000 мВ)
А – исходные вольтамперные сигналы, Б – кривые за вычетом фона.
На циклических вольтамперограммах T. tsunodae Box, адсорбированной на электроде из
спектрального графита, в анаэробных условиях наблюдались низко и высоко редокс-
32
потенциальные симметричные пики с потенциалами средней точки фарадеевских процессов
равными 390 мВ и 690 мВ отн. NHE, соотвественно (Рис. 33А). Интервалы значений потенциалов
между катодными и анодными пиками соответствовали квазиобратимым электрохимическим
процессам, 73 мВ и 155 мВ. Рассчитанная поверхностная концентрация фермента – около 5 и 8
пмоль/см2 для низко и высоко редокс-потенциальных процессов, соотвественно.
Смоделированная с использованием Marcus-DOS теории вольтамперометрическая кривая
достаточно хорошо описывает оба фарадеевских процесса при значениях энергии
реорганизации 0,4 – 0,8 эВ и стандартной константы скорости гетерогенного процесса 1,3 с-1 и 0,4
с-1, соответственно.
80
60
А
1
Ток, мкА
40
20
2
0
-20
-40
-60
-80
-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3
0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
0.9 1.0
Е, мВvs. NHE (V)
Applied potential
Рисунок 33.
А) Циклические вольтамперограммы T.
tsunodae BОx, адсорбированной на
спектральном графите в анаэробных
условиях.
Скорость развертки потенциала –
100 мВ/сек, 1 – исходная
вольтамперограмма, 2 –
вольтамперограммы за вычетом
фоновых реакций без адсорбированного
фермента
(о – экспериментальные данные,
--- – рассчитанная теоретически
1.1
вольтамперограмма).
Б) Влияние скорости развертки
потенциала электрода на
вольтамперные кривые (за вычетом
фона графитового электрода).
1 – 10 мВ/сек, 2 – 100 мВ/cек.
10
Б
Ток, мкА
0
-10
Условия:
0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0;
стартовый потенциал – 1000 мВ.
-20
1
-30
2
-40
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
Е, мВ
Введение в буферный раствор кислорода приводило к появлению ярко выраженного
каталитического процесса, ингибирующегося фторид-ионами. Добавление K3[Fe(CN)6],
эффективного медиатора, осуществляющего МЭП независимо от ориентации фермента на
поверхности электрода, не приводило к значительному изменению плотностей тока. При
относительно высоких скоростях развертки потенциала проявлялась вторая полуволна
электровосстановления О2 (Рис. 33Б). Начало первой и второй полуволн электровосстановления
О2 находилось в четкой корреляции с редокс-потенциалами фарадеевских процессов,
зарегистрированных в анаэробных условиях (Рис. 32А).
Разработка амперометрических биосенсоров первого и второго рода для определения
лигнинов и фенольных соединений
(Шлеев с соавт., 2004б; Ярополов с соавт., 2005; Shleev et al., 2006a; Haghighi et al., 2007)
33
А) Биосенсор первого рода для определения полифенольного комплекса вин
Проведено определение общего содержания фенольных соединений по значению
максимального тока кислородного электрода методом хроноамперометрии с использованием
T. hirsutа Lc и тирозиназы. Показано, что в случае применения отдельных препаратов
тирозиназы и Lc наблюдалась прямая зависимость между предельным током электрода Кларка
(величина, прямо пропорциональная содержанию кислорода) и содержанием фенолов,
определенных методом Фолина-Чокальтеу. Однако максимальная разница ответов ячейки на
количество окисляемых соединений составляла лишь около 8 нА (6,5% шкалы прибора). При
этом разница в количестве фенольных соединений в образцах достаточно значительна.
Совместное использование двух ферментов приводило к получению максимальной разницы тока
до 20 нА (18,5% шкалы прибора), а также к значительно более четкой корреляции между
значениями токов окисления и общего содержания полифенолов в образце. Это объясняется
расширением субстратной специфичности окисляемых фенольных соединений при
использовании двух ферментов что, соответственно, приводит к увеличению точности анализа.
Построена калибровочная кривая зависимости концентрации кислорода в ячейке Кларка (при
совместном использовании тирозиназы и Lc) от общего содержания фенолов в красных винах.
На основании полученных данных сделан вывод о принципиальной возможности использования
биосенсора первого рода для определения полифенольного комплекса вин.
Б) Биосенсоры первого и второго родов для определения лигнинов
на основе лакказы T. hirsuta
В отличие от биосенсора первого рода для определения полифенольного комплекса вин, в
котором производилось прямое введение ферментов в исследуемые растворы, для определения
концентрации лигнинов в структуру биосенсора был добавлен реактор с иммобилизованной Lc
(Рис. 34).
1
3
Рисунок 34. Схема биосенсора первого
рода на основе кислородного электрода.
1 – ячейка,
2 – магнитный мешальник,
3 – мембрана,
4 – реактор с иммобилизованными
ферментами,
5 – тефлоновое кольцо,
6 – электрод типа Кларка.
2
4
5
6
Показано, что иммобилизация фермента с использованием глутарового альдегида
приводила к сохранению 90% от первоначальной активности фермента. На Рис. 35
представлены калибровочные кривые биосенсора при определении Крафт и хвойного лигнинов.
Зависимость ответа электрода Кларка имела линейный характер в диапазоне концентраций
лигнина 0,01-0,15 мг/мл. Чувствительность биосенсора составляла 0,49 и 0,21 нА/мкг по
отношению к Крафт и хвойному лигнинам, соответственно. Была исследована операционная и
долговременная стабильности биосенсора с иммобилизованной Lc. Показана стабильность
34
сигнала устройства при проведении 20 анализов за день. Необходимо отметить, что биосенсор
сохранял до 85% активности при проведении 70 анализов в течение 7 дней.
Основу биосенсора второго рода составлял электрод из спектрального графита с
иммобилизованной путем физической адсорбции T. hirsute Lc. Было исследовано поведение
биосенсора в двух режимах: в замкнутой системе с перемешиванием и проточно-инжекционной
системе. рН-оптимум обоих биосенсоров – около 5, оптимальный потенциал – около +150 мВ. В
проточно-инжекционном режиме оптимум потока буфера составлял 0,6 мл/мин. При этом
наблюдалось плавное увеличение отклика биосенсора при увеличении скорости потока от 0 до
0,6 мл/мин, что указывало на быструю кинетику реакций на поверхности электрода. В диапазоне
0,6 – 1,5 мл/мин отклик биосенсора оставался постоянным. В качестве рабочего режима была
выбрана скорость потока буфера 1,4 мл/мин для предотвращения возможного засорения
системы нерастворимыми частицами препаратов лигнина. На Рис. 35Б представлены
калибровочные кривые биосенсоров в замкнутой системе с перемешиванием и проточноинжекционной системе при определении Крафт и хвойного лигнинов. Зависимость ответа
электрода Кларка имела линейный характер в диапазоне концентраций 0,01-0,50 мг/мл для
Крафт и 0,01-0,25 мг/мл для хвойного лигнинов. Чувствительность биосенсора составляла 3,31 и
0,75 нА/мкг для Крафт и хвойного лигнинов, соответственно. Была исследована операционная и
долговременная стабильности биосенсора c иммобилизованной Lc. В обоих режимах показано
сохранение ответа устройства при проведении 100 анализов в день. Биосенсор сохранял до 70%
активности при проведении 30 анализов в течение 7 дней.
2000
А
1
0.06
Ответ биосенсора (нА)
Ответ биосенсора (мкА)
0.09
2
0.03
I
Б
1
1
1500
II
1000
2
I
500
0
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0
0.25
0.5
0.75
1
Концентрация лигнина (мг/мл)
Рисунок 35. Калибровочные кривые определения Крафт и хвойного лигнинов.
А) на основе электрода Кларка с использованием реактора с иммобилизованной
лакказой T. hirsuta.
Б) на основе спектрального графита с иммобилизованным ферментом
в системе с перемешиванием (I) и в проточно-инжекционном режиме (II).
1 – Крафт лигнин, 2 – хвойный сульфатный лигнин.
Условия: 0,1 М цитратно-фосфатный буфер, рН 5,0.
В) Биосенсор второго рода для определения фенольных соединений
на основе лакказы T. hirsuta
Был разработан амперометрический ферментный электрод на основе лакказы T. hirsuta для
определения фенольных соединений. Для иммобилизации фермента на поверхности
стеклоуглеродного электрода использованы три вида полимерных материалов: положительно
заряженный цетилэтилполиэтиленимин и отрицательно заряженные коммерческие препараты
Nafion и Eastman AQ 29D. Нижний предел обнаружения модельных фенольных соединений,
гидрохинона и пирокатехина, при соотношении сигнал/шум равном 3 в буферном растворе при
35
иммобилизации Lc в мембране Nafion составлял 3,5х10-8 М и 5,0х10-8 М, соответственно.
Наименьшим временем отклика обладали электроды с Lc, иммобилизованной в мембранах
Nafion и Eastman AQ 29. Было показано, что операционную стабильность и стабильность при
хранении (долговременную стабильность) можно значительно увеличить дополнительным
включением в матрицы полимеров желатина, предотвращающего инактивацию фермента в
результате модификации последнего свободно-радикальными продуктами окисления фенольных
соединений. Разработанный биосенсор позволяет детектировать фенольные соединения в
водных растворах при концентрациях ниже 1 мкМ.
Г) Биосенсор второго рода для определения фенольных соединений на основе частично
очищенного ферментного препарата базидиомицета T. pubescens
При создании биосенсора использовали частично очищенный ферментный препарат T.
pubescens Lc. Оптимизацию амперометрического биосенсора для определения фенольных
соединений на основе ферментного препарата проводили с использованием пирокатехина в
качестве модельного субстрата. В качестве рабочего электрода использовали спектральный
графит с нанесенным на его поверхность ферментным препаратом. Детекцию осуществляли при
потенциале рабочего электрода, соответствующем электровосстановлению продукта
ферментативной реакции. Показано, что оптимальная концентрация ферментного препарата для
адсорбции составляла около 100 мкг/мл. Воспроизводимость результатов для шести
изготовленных ферментных электродов составляла приблизительно 88%, что хорошо
согласуется с литературными данными для биосенсоров на основе Lc-модифицированных
электродов.
Исследована зависимость отклика биосенсора от приложенного потенциала. Показано, что
для потенциалов ниже +385 мВ величина тока не зависит от приложенного потенциала. В
дальнейших экспериментах электровосстановление окисленных фенольных соединений
проводили при потенциале +160 мВ, т.к. этот потенциал удобен для практического
использования и оказывает наименьшее влияние на превращение различных соединений в
комплексных системах. Наиболее интенсивный ответ биосенсора наблюдался при скорости
потока 0,5 мл/мин. Изучение влияния рН буферного раствора на отклик биосенсора показало, что
оптимальное значение рН для детекции пирокатехина составляло 5,0.
В оптимизированных условиях были определены амперометрические отклики биосенсоров
на основе ферментного препарата из гриба T. pubescens с использованием проточноинжекционной системы для ряда фенольных соединений. Чувствительность, предел детекции,
линейный динамический диапазон, а также коэффициент корреляции рассчитывали, используя
уравнение Михаэлиса-Ментен для электрохимических систем. Результаты расчетов для
некоторых соединений представлены в Таблице 6. Сравнивая полученные нами данные для
электродов, модифицированных ферментными препаратами из базидиомицета T. pubescens, с
данными для электродов, модифицированных гомогенными препаратами T. versicolor и T. hirsuta
Lc, можно сделать вывод, что разработанный биосенсор обладал более широким линейным
диапазоном детекции для большинства использованных фенольных соединений.
Таблица 6. Характеристики амперометрического биосенсора на основе ферментного препарата
базидиомицета Trametes pubescens по отношению к фенольным соединениям
Фенольное
cоединение
Фенол
Допамин
Гваякол
Пирокатехин
HQ
Линейный диапазон
детекции (μM)
1-25
1-25
10-100
1-25
1-10
Предел детекции
(μM)
17,1
20,6
7,3
26,0
23,1
36
Коэффициент корреляции
(r)
0,991
0,987
0,998
0,980
0,984
Разработка безмедиаторных биокатодов и биотопливных элементов
(Vaz-Dominguez et al., 2008; Coman et al., 2008, 2010)
Принципиальная возможность создания достаточно стабильных и эффективных биокатодов
на основе ПЭП показана выше. Прямая физическая адсорбция Lc базидиомицетов, а также
грибных BOx на графитовых электродах, приводит к созданию простейших биокатодов с
плотностью тока до 100 мкА/см2, работающих в диапазоне рН 3,0-8,0. Дальнейшее увеличение
плотности тока, наряду со значительным улучшением долговременной и операционной
стабильностей биокатода, было достигнуто ковалентной иммобилизацией T. hirsuta Lc на
модифицированных поверхностях электродов для специфической ориентации молекул
фермента. Для этой цели графитовые электроды модифицировались фенольными
производными различной структуры, например 2-аминофенолом и аминофенилом (Рис. 36), с
последующей ковалентной пришивкой Lc за счет карбоксильных групп фермента. Данные
биокатоды отличались повышенной операционной стабильностью (до 1 месяца работы при
сохранении практически первоначальных параметров), отсутствием ингибирования фермента
хлорид-ионами, а также плотностями тока до 650 мкА/см2.
Была разработана модель простого биотопливного элемента, основанного на явлении ПЭП в
катодной и анодной реакциях (Рис. 37). Как описано выше, в нашем распоряжении имелись
несколько биокатодов, активных в широком диапазоне рН. Принципиальной задачей настоящей
работы была разработка простой, безмембранной, безмедиаторной модели глюкоза/O2
утилизирующей биотопливной ячейки. Глюкозооксидаза – фермент, широко использующийся в
биотопливных элементах в настоящее время. Однако, из-за отсутствия ярко выраженного ПЭП
для фермента на немодифицированных поверхностях, большинство разработанных биоанодов
включали в себя растворимые редокс-медиаторы или редокс-полимеры. Лишь в последнее
время появились работы, описывающие эффективный ПЭП между глюкозооксидазой и
модифицированными электродами с использованием достижений нанотехнологии. В связи с
этим был использован другой биокатализатор – целлобиозодегидрогеназа (CDH), фермент,
обладающий ферментативной активностью по отношению к широкому кругу углеводов, включая
глюкозу. В состав фермента входят две простетические группы – флавинадениндинуклеотид и
гем-группа. Последняя обеспечивает наличие ПЭП между активным центром фермента и анодом
биотопливного элемента (Рис. 37).
лакказа
А
лакказа
лакказа
Б
лакказа
Рисунок 36. Схема модификации электрода лакказой с использованием карбоновых
электродов, модифицированных (А) аминофенилом и (Б) 2-аминофенолом.
37
V
Icell
биоанод
A
биокатод
Rload
4e-
2 Глюкоза
(целлобиоза,
галактоза)
4e-
BMCO
4H+ + O2
-
4e
ФАД
гем
T2/T3
2 глюконолактон
2
+ 4H+
T1
4e-
H2O
целлобиозодегидрогеназа
Рисунок 37. Схема безмембранной глюкоза/O2 биотопливной ячейки на основе голубой
медьсодержащей оксидазы и целлобиозодегидрогеназы,
иммобилизованных на спектральном графите.
Использование CDH и MCO из различных источников позволило создать модели
биотопливных ячеек, работающих как в кислых, так и нейтральных растворах, использующих
различные углеводы, включая глюкозу, в качестве биотоплива. Основные параметры
разработанных устройств представлены в Таблице 7.
Таблица 7. Основные характеристики моделей безмедиаторных безмембранных углевод/О2
биотопливных ячеек работающих в слабощелочных и кислых растворах
Субстрат
(5 мM)
Строение биотопливного элемента
Глюкоза
Целлобиоза
Галактоза
Глюкоза
Плазма крови
D. saubinetii CDH/T. hirsuta Lc (pH 4,5)
C. thermophila CDH/T. tsunodae BOx (pH 7,4)
38
Мощность
(мкВт/см2)
5,0
11,5
15,1
4,0
3,0
Напряжени
е (В)
0,50
0,55
0,55
0,40
0,17
В четвертой главе представлено обсуждение результатов автора, а также анализ последних
литературных данных по теме диссертации.
Широкое использование окислительно-восстановительных белков, редокс-ферментов и
клеток, для создания чувствительных и селективных биосенсоров, высокоэффективных
биотопливных элементов, а также открытие “полупроводниковых” свойств сложных
оксилительно-восстановительных ферментов, привело к возникновению нового термина в
биоэлектрохимии, “биоэлектроника” (Katz, 2006) - раздела, охватывающего фундаментальные и
прикладные исследования различных биоэлектронных устройств. По принципу действия
биоэлектронные устройства можно разделить на три типа, а именно устройства первого, второго,
и третьего родов или, другими словами, поколений (Рис. 38).
Первого рода
[Fe(CN)6 ]4-
Второго рода
[Fe(CN)6]3 -
H2O
O2
O2
O2
H2O
Биокаталитический
процесс
Третьего рода
H2O
O2
[Fe(CN) 6]4- [Fe(CN) 6]3 -
Биоэлектрохимический
процесс
e-
Биоэлектрокатализ
Рисунок 38. Классификация биоэлектронных устройств
на основе голубых медьсодержащих оксидаз
Уникальность голубых MCO состоит в возможности создания на их основе всех трех видов
(родов или поколений) устройств, таких как биосенсоры, биокатоды топливных элементов,
“биодиоды” и “биотриоды”. В настоящей работе на основе различных голубых MCO разработаны
биосенсоры первого и второго рода для детекции различных фенольных соединений,
высокоэффективные биокатоды третьего рода, работающие в средах различного состава и рН, а
также показаны “полупроводниковые” свойства высоко редокс-потенциальных MCO.
Определение редокс-потенциалов Lc аскомицетов, а также двух BOx, позволило сделать
вывод о возможном отсутствии класса средне редокс-потенциальных MCO. Показано, что вне
зависимости от аксиального лиганда (метионин – M. verrucaria BOx, лейцин – M. thermophila Lc,
фенилаланин – T. tsunodae BOx), редокс-потенциал Т1 центра грибных MCO находится в
диапазоне 630-790 мВ отн. NHE (Таблица 5). Таким образом, грибные Lc (как аскомицетов, так и
базидиомицетов), а также грибные BOx, являются высоко редокс-потенциальными белками. При
этом, древесные и бактериальные голубые MCO относятся к классу низко редокс-потенциальных
ферментов, имеющих значения окислительно-восстановительного потенциала Т1 центров в
диапазоне 325-450 мВ. По-видимому, широкая вариация редокс-потенциалов MCO обусловлена
строением Т1 центра, прежде всего вариацией расстояний между ионом меди первого типа и
соответствующими лигандами, а также сольватационным эффектом, и в гораздо меньшей
степени, природой аксиального лиганда.
Большинство изученных в настоящей работе MCO (Lc рода Trametes, Coriolopsis, Cerrena, и
Myceliophthora, M. verrucaria и T. tsunnodae BOx), относятся к высоко редокс-потенциальным
ферментам, и благодаря высокому редокс-потенциалу Т1 центра являются высокоактивными в
гомогенных реакциях окисления различных субстратов. Высокая активность и стабильность MCO
39
является основой для практического использования голубых высоко редокс-потенциальных MCO
в органическом синтезе, например, ферментативном синтезе электропроводящего полианилина
с различными свойствами, а также процессах биодеградации ксенобиотиков, например,
обесчвечивания лигноцеллюлозы.
Детальный анализ биохимических, спектральных и кинетических характеристик ферментов, а
также элетрохимического поведения голубых MCO из различных источников, позволил
предложить каталитические и молекулярные механизмы восстановления О2 высоко и низко
редокс-потенциальными ферментами при гомогенном и гетерогенном катализе, схематически
представленные на Рис. 39 и 40, соотвественно. В гомогенном растворе MCO катализируют
окисление широкого круга субстратов, и их специфичность связана с особым строением Т1
центра фермента (Quintanar et al., 2007). В условиях равновесия скорость биокаталитической
реакции восстановления О2 ( v ) описывается уравнением 1:
1 / v = 1 / v1 + 1 / v2 + 1 / v3
(1)
В большинстве случаев лимитирующей стадией биокаталитического процесса является стадия
окисления природного субстрата ( v1 ), органической (субстраты фенольной структуры – грибные
и древесные Lc, билирубин – BOx) или неорганической природы (ионы марганца (II) – грибные
Lc, ионы железа (II) – Cp), Т1 центром фермента ( k1 = до 500 с-1 и выше), в то время как
v2 ) с Т1 центра на трехъядерный медный
кластер ( k2 >1000 с-1) и восстановление дикислорода ( v3 ) Т2/Т3 кластером ( k3 >500 с-1)
внутримолеклярный
перенос электрона (ВЭП,
происходит достаточно быстро (Рис. 39).
Sox
Sred
v1
T1
e-
Биологические
эффекторы
v2
T2/T3
v3
O2 + 4H+
2H2O
Рисунок 39. Схема функционирования
голубых медьсодержащих оксидаз в растворе.
При адсорбции большинства MCO на угольных материалах, на поверхности которых
присутствуют различные функциональные группы, похожие по структуре на природные
органические субстраты ферментов, происходит специфическая ориентация голубых MCO с
возможностью ПЭП на Т1 центр ферментов на растояние менее 20 Å (Рис. 40). В результате
реализуется ВЭП с Т1 центра при участии цистеин-гистидинового моста (∼13 Å) на Т2/Т3 кластер,
где происходит восстановление О2 до Н2О. В условиях равновесия скорость реакции
электровосстановления О2, а именно величина тока в электрохимической системе ( i ),
описывается уравнением 2:
1 / i = 1 / iDET + 1 / icat + 1 / idiff
(2)
40
где
iDET = nFAΓk DET
icat = nFAΓkcat CO2 /(CO2 + K M )
(3)
(4)
idiff = 0,62nFAD 2 / 3CO2 v −1 / 6ω 1 / 2
(5)
где F - постоянная Фарадея, A - площать электрода, Γ - поверхностная концентрация
белка, v - вязкость раствора, D -коэффициент диффузии, ω - скорость вращения электрода.
электрод
e-
idet
kDET
T1
Рисунок 40. Схематическое
изображение электроннотранспортных путей при
биоэлектрокаталитическом
восстановлении O2 до H2 O.
ВЭП
icat
k'cat
e-
ek''cat
O2 + 4H+
T3
T3
2H2O
T2
idiff
O2
Особенность гетерогенной системы в режиме ПЭП состоит в возможности регуляции скорости
ЭП от донора электронов (электрода) на Т1 центр белка (регуляции
iDET , который
v1 при гомогенном катализе) за счет наложения более низкого потенциала
(увеличения перенапряжения). При значительном перенапряжении и достаточно высокой k 0
соответствует
скорость данного процесса может превышать скорость окисления субстратов при гомогенном
катализе в тех же условиях. Таким образом, за счет высокой скорости восстановления
дикислорода Т2/Т3 кластером ( k "cat >500 с-1) появляется возможность изучения ВЭП, который
может становиться лимитирующей стадией биоэлектрокаталитического восстановления О2 ( k 2 ).
При отсутствии диффузионных ограничений скорость ВЭП может быть рассчитана по уравнению
4, с использованием параметров, определенных в наших исследованиях, а также данных других
авторов. При смешанной кинетике рассчитанное k 2 будет ниже реальной скорости ВЭП.
Предполагаемая возможность ПЭП между электродной поверхностью и Т2/T3 кластером
некоторых MCO позволяет объяснить “полупроводниковые”
свойства высоко редокс-
41
потенциальных MCO. Установлено, что в определенных условиях скорость ВЭП высоко редокспотенциальных MCO становится ниже скорости ЭП от субстрата при гомогенном катализе или от
электрода при гетерогенном катализе, лимитируя био(электро)каталитическое восстановление
О2. Это происходит, например, при взаимодействии Т2/Т3 кластера с ОН- (близкие к
нейтральным значения рН для Lc и щелочные растворы для BOx), F-, и, возможно, некоторыми
биологическими эффекторами, например NO, а также при одноэлектронном восстановлении
кластера с образованием “отдыхающей” формы фермента. Возможность ПЭП между электродом
и Т2/Т3 медным кластером фермента позволяет изменять редокс-статус и строение кластера,
тем самым регулируя скорость ВЭП, а значит и активность MCO. На Рис. 41 показана типичная
ступенчатая зависимость количества окисленного субстрата от потенциала, приложенного к
электроду с адсорбированной Lc, в широком диапазне потенциалов, от 0 мВ до 1100 мВ отн. NHE
(кривые 3 и 4).
110
90
Активность, %
1
2
3
4
70
50
30
10
-10
0
200
400
600
800
1000
1200
E, мВ
Рисунок 41. Зависимость активности лакказы Trametes адсорбированной на поверхности
углеродных (кривые 1 и 2) и золотых (кривые 3 и 4) материалов от потенциала.
1 – рН 5,3; 2 – рН 3,0; 3 – рН 5,3 ABTS; 4 – рН 5,3 серингалдазин.
Таким образом, по-видимому, может осуществляться регуляция активности некоторых MCO в
природе (Рис. 39). Снижение скорости ВЭП может происходить за счет понижения редокспотенциала Т2/Т3 кластера, что в случае высоко редокс-потенциальных MCO приводит к
термодинамически невыгодному эндоэнергетическому (uphill) транспорту электрона от высоко
редокс-потенциального Т1 центра к Т2/Т3 кластеру.
В электрохимических исследованиях показано, что один из интермедиатов ферментов имеет,
по-видимому, значение окислительно-восстановительного потенциала около 400 мВ отн. NHE.
Принимая во внимание потенциалы Т1 центра высоко редокс-потенциальных MCO, величина
свободной энергии процесса ВЭП может достигать значения +0,38 эВ. Расчет возможной
скорости ВЭП с использованием теории Маркуса (уравнение 6) с учетом дистанции переноса ∼13
Å и энергий реорганизации процесса, варьирующих от 0,92 до 1,13 эВ, приводит к широкому
диапазону значений, которые коррелируют с экспериментальными данными о специфической
активности высоко редокс-потенциальных MCO ( k cat ).
42
log(k 2 ) = 15 − 0.6 R − 3.1
где
(ΔG + λ ) 2
(6)
λ
k 2 - скорость ВЭП, R - расстояние между Т1 центром и Т2/T3 кластером (13 Å), ΔG -
изменение свободной энергии при ВЭП ( ΔG
реорганизации ( λ
= −nF ( ET 2 / T 3 − ET 1 ) ), λ - полная энергия
≈ λT 1 + λT 2 / T 3 ). Значения полной энергии реорганизации процесса ВЭП в
наших исследованиях были получены с использованием квантово- и молекулярно-механических
расчетов
λТ 1 и λT 2T 3 .
При ориентации фермента Т1 центром к поверхности электрода, например, при
использовании углеродных материалов, каталитическая активность MCO не изменяется под
воздействием приложенного потенциала. Наблюдаемое ускорение электрокаталитического
восстановления О2 с уменьшением потенциала, в данном случае, обусловлено увеличением
перенапряжения, а значит увеличением скорости ЭП от электрода к ферменту. Этот процесс
наиболее ярко выражен на начальном участке кривой активности (600-850 мВ; Рис. 41, кривые 1
и 2), и в меньшей степени при значительном перенапряжении, т.е. потенциалах намного более
отрицательных по сравнению с редокс-потенциалом Т1 центра – первичного акцептора
электронов. Важно отметить практически полное отсутствие обратной реакции
(биоэлектрокаталитического разложения Н2О) несмотря на сильно положительные значения
потенциала, приложенного к электроду с адсорбированной Lc, до +1100 мВ отн. NHE, т.е. 320 мВ
положительнее редокс-потенциала Т1 центра фермента. Данное явление, а именно “диодподобное” свойство Lc, является внутренним свойством фермента и, возможно, связано с
механизмом
его
действия.
Очевидно,
что
редокс-ферменты
не
обладают
твердофазными/структурными характеристиками полупроводников. Их “полупроводниковые
свойства” являются следствием сопряженных электронно-транспортных реакций в нанометровом
диапазоне на вытянутых орбиталях внутри каждой белковой молекулы.
Таким образом, “триод-подобное” поведение высоко редокс-потенциальной Lc связанно с
молекулярным механизмом действия фермента, т.е. последовательной трансформацией Т2/Т3
медного кластера с образованием электронно и структурно различных интермедиатов. В
настоящее время детально охарактеризованы несколько интермедиатов Lc, а именно пероксо
интермедиат ( k 2 >1000 с-1), нативные интермедиаты, полностью окисленная “отдыхающая”
форма фермента ( k 2 ~1 с-1), и полностью восстановленная форма ( k 2 =0). Экспериментально
показано, что по крайней мере один из шагов в трансформации кластера, а именно связывание
полностью восстановленной Lc с О2 с образованием перокси интермедиата (Рис. 42), является
протон независимым, практически необратимым и очень быстрым процессом ( k 2 >1000 с-1). Эта
необратимая трансформация трехъядерного кластера приводит, возможно, к появлению “диодподобных” свойств MCO, наблюдаемых в экспериментах по биоэлектрокаталитическому
восстановлению O2 адсорбированными на графитовых электродах ферментами. В литературе
имеются два объяснения “диод-подобных” свойств других окислительно-восстановительных
ферментов сложного строения, а именно, кинетическая модель (Sucheta et al., 1992) и модель,
описывающая возможность образования различных редокс-состояний ферментов в процессе
биоэлектрокатализа (Cammack, 1992). Оба этих подхода могут быть использованы для
объяснения полупроводниковых свойств высоко редокс-потенциальных Lc. По-видимому, “диодподобные” свойства MCO имеют важное значение в поддержании необходимой концентрации
высокоактивных форм кислорода, которые могут образовываться в процессе ферментативного
био-окисления Н2О. Известно, например, что супероксид анион-радикал и Н2О2 вовлечены в
43
процесс биодеградации лигнина, осуществляемый при участии лигнинолитического ферментного
комплекса грибов, в который входит и высоко редокс-потенциальные MCO. Однако
неконтролируемое увеличение концентрации высокоактивных форм кислорода может быть очень
токсичным для живых организмов.
“Отдыхающая форма”
“Полностью восстановленная” “Перокси интермедиат”
“Нативный интермедиат 2” “Нативный интермедиат 1”
Рисунок 42. Схема молекулярного механизма трансформации Т2/Т3 кластера
голубых медьсодержащих оксидаз (Rulisek et al., 2005).
Интересно отметить, что одним из немногих свойств, объединяющих столь различные по
строению и функционированию ферменты, для которых показаны “полупроводниковые”
свойства, является наличие в их структуре многоядерного многовалентного кластера, такого как
мульти-гемовый кластер в структуре цитохром с нитритредуктазы, железосерных кластеров
гидрогеназ, а также трехъядерного медного кластера MCO. По-видимому, наличие такого
компонента сложной структуры является определяющим фактором в проявлении “диод-“ и
“триод-подобных” свойств ферментов. Недавно опубликованные работы по изучению
полупроводниковых свойств комплексов переходных металлов подтверждают данное
предположение (Raebiger et al., 2008).
Основные фундаментальные результаты работы схематически представлены на рисунке 43,
суммирующем данные о возможных электрон-транспортных путях в процессе гомогенного и
гетерогенного катализа с участием MCO. При гомогенном катализе, реализуемом в процессе
окисления доноров электронов или атомов водорода Т1 центром фермента, имеется две
возможных лимитирующих стадии ЭП,
v1 или v2 , в то время как скорость связывания О2
восстановленным Т2/Т3 кластером ( v3 ) в растворах насыщенных воздухом (∼0.25 мМ О2)
достаточно высока. Константа скорости второго порядка ( k O2 ) данного процесса составляет при
v1 или v2 могут варьировать в достаточно широком диапазоне.
'
Так, в зависимости от донора электрона или атома водорода, k1 может принимать значения от 0
25°С около 107 М-1 с-1. При этом
(вещество не является субстратом данного фермента) до 580 с-1 (синаповая кислота в качестве
44
субстрата высоко редокс-потенциальных Lc), а k 2 может варьировать от 0 (заингибированный
фермент, образующийся при связывании различных эффекторов с Т2/T3 кластером) до 1000 с-1
и более (MCO в кислых растворах в отсутствие ингибиторов фермента).
Механизм ЭП при гетерогенном катализе зависит от наличия ПЭП между активным центром
MCO и электродной поверхностью, ориентации фермента на поверхности электрода, а также
присутствия или отсутствия субстратов (медиаторов) MCO в растворе (Рис. 43).
Sox
Sred
v1
e-
ek'1
k''1
T1
Вход
ВЭП
IET
v2
ek O2 ~ 107 M-1 s-1
+
v3
O2 + 4H
Sox
T3
k2
-
e
Выход
T3
T2
ek''' 1Контроль
Рисунок 43. Схематическое
изображение электронтранспортных путей при
гомогенном и гетерогенном
процессах восстановления О2
с участием голубых
медьсодержащих оксидаз.
2H2O
Биологические эффекторы
S red
При отсутствии прямого электронного контакта между активным центром фермента и электродом
биоэлектрохимическое восстановление О2 до Н2О возможно за счет сопряжения
биокаталитической реакции с электрохимическим процессом востановления редокс-медиатора
на поверхности электрода (Рис. 38, центральная часть и Рис. 43). При ориентации белков Т1
центром к электродной поверхности, в отсутствие редокс-медиатора(ов), электрон по тунельному
механизму переносится на Т1 ион меди и далее механизм ЭП идентичен таковому при
гомогенном биокаталитическом процессе восстановления О2. Скорость первой стадии
биоэлектрокаталитической реакции ( v1 ) в данном случае прямо пропорциональна
k1'' и может
быть рассчитана из iDET , используя уравнение 3, как описано выше. В присутсвии редоксмедиаторов может наблюдаться протекание двух параллельных процессов, а именно,
одновременное биоэлектрокаталитическое и биоэлектрохимическое восстановление O2 до H2O.
Эффективность каждого процесса, а значит и его вклад в суммарное значение v1 , зависит от
многих параметров, но одними из главных факторов являются доступность Т1 центра для
медиатора, а также процент фермента находящегося в непосредственном электронном контакте
с электродной поверхностью. Ориентация MCO с возможностью ЭП от электрода
'''
непосредственно на Т2/Т3 кластер фермента ( k1 ) позволяет осуществлять прямой контроль его
45
редокс-статуса, приводя к проявлению “полупроводниковых” свойств MCO. В данном случае Т1,
Т3 и Т2 центры фермента выполняют роль, соответственно, ввода, вывода и контрольного
электродов триода или транзистора (Рис. 43).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Систематическое изучение биохимических и электрохимических свойств широкого набора
окислительно-восстановительных ферментов, относящихся к классу голубых MCO (Lc, BOx и
Cp), позволило установить общность и различие в протекании биокаталитических,
биоэлектрокаталитических и биоэлектрохимических реакций восстановления О2 до Н2О с их
участием, в том числе наличие нескольких электронно-транспортных путей при гомогенном и
гетерогенном катализе. Основные фундаментальные результаты работы представлены на
рисунке 44, обобщающим термодинамические и кинетические закономерности биокатализа, а
именно возможного присутствия эндергонической стадии в процессе ВЭП с Т1 центра на Т2/Т3
медный кластер высоко редокс-потенциальных голубых MCO.
Результаты данной работы важны для понимания механизма функционирования и регуляции
МСО в природе. Трансформация активного центра оксидаз, осуществляемая за счет наложения
внешнего электрического потенциала, приводит к модуляции скорости ВЭП и обратимому
изменению каталитической активности ферментов. По-видимому, сходный механизм может быть
реализован в природе за счет равновесия реакции обратимого связывания гидроксид аниона с
ионами меди Т2/Т3 кластера (регуляция активности ферментов за счет изменения рН среды), а
также взаимодействия фермента с биологическими эффекторами.
С практической точки зрения результаты данной работы являются основой для
использования голубых MCO в органическом синтезе, процессах биодеградации ксенобиотиков,
а также для создания различных биоэлектрохимических устройств. Показана возможность
функционирования МСО в режиме диодов и триодов, что позволяет управлять скоростью
ферментативной реакции внешним электрическим полем. Разработаны модели
высокочувствительных биосенсоров для анализа различных соединений и биокатоды топливных
элементов третьего поколения.
2
1
E
3
0'
Интермедиаты
Т2/Т3
кластера
pH 9.4
перенапряжение
pH 7.4
Субстрат
или
электрод
(донор
электрона)
ΔG
0 - 500 s-1
Т1
центр
pH 4.0
>0
~107 M-1 s-1
ΔG ~ 0
ΔG
<0
pH 9.4
О2/Н2О
акцептор
pH 4.0
МСО
Рисунок 44. Термодинамическая и кинетическая диаграмма биокатализа
голубыми медьсодержащими оксидазами .
46
ВЫВОДЫ
1. На основании комплексного изучения биохимических, спектральных и электрохимических
характеристик голубых медьсодержащих оксидаз, имеющих различные значения редокспотенциала Т1 центров, (i) установлена четкая корреляция между редокс-потенциалом субстрата
и эффективностью гомогенного катализа, (ii) предположено наличие эндергонической стадии в
процессе внутримолекулярного переноса электронов с Т1 центра на Т2/Т3 медный кластер
высоко редокс-потенциальных медьсодержащих оксидаз, (iii) выбраны объекты для
обоснованного использования ферментов данного класса в различных биотехнологических
процессах.
2. Исследование возможных путей сопряжения ферментативных реакций голубых
медьсодержащих оксидаз и электрохимических процессов с их участием позволило предложить
каталитические и молекулярные механизмы функционирования высоко и низко редокспотенциальных голубых медьсодержащих оксидаз при гетерогенном катализе. Согласно
предложенной модели, механизм и эффективность биоэлектрокатализа зависят от ориентации
молекул фермента на поверхности электрода. Ориентация ферментов Т1 центром к электродной
поверхности обуславливает эффективное биоэлектрокаталитическое восстановление
молекулярного кислорода по механизму прямого электронного переноса. При электронном
контакте активного центра фермента также наблюдалось изменение удельной активности
гетерогенных биокатализаторов при различных потенциалах электрода.
3. Впервые показаны “полупроводниковые” свойства высоко редокс-потенциальных голубых
медьсодержащих оксидаз в процессе гетерогенного катализа. Высказано предположение о
важности данных свойств для регуляции биокаталитической активности ферментов в природе.
4. Созданы модели углевод-кислород утилизирующих безмембранных биотопливных элементов,
основанных на явлении прямого электронного переноса, являющиеся базовыми для разработки
имплантируемых биоэлектронных устройств третьего поколения.
5. Созданы лабораторные образцы амперометрических биосенсоров первого, второго и третьего
рода на основе голубых медьсодержащих оксидаз для определения соединений фенольной
структуры и лигнинов.
6. Найден новый класс медиаторов ферментов с общим названием 1-фенил-3-метилпиразолоны-5. Показано, что сульфо- и аминопроизводные этого класса соединений могут
эффективно использоваться в качестве усилителей действия лакказ для деградации
ксенобиотиков и делигнинофикации бумажной пульпы.
7. Разработаны методы экологически чистого синтеза электропроводящего полианилина,
включая его псевдоводорастворимую и оптически активную формы, с использованием высоко
редокс-потенциальных лакказ. Изучены физико-химические свойства полученных образцов.
8. Выяснение биохимических и электрохимических свойств голубых медьсодержащих оксидаз
позволило установить общность и различия в протекании биокаталитических,
биоэлектрокаталитических и биоэлектрохимических реакций восстановления кислорода до воды
с их участием.
47
СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
ОБЗОРЫ И ГЛАВЫ В КНИГАХ:
1. Christenson A., Dimcheva, N., Ferapontova E.E., Gorton L., Ruzgas T., Stoica L., Shleev S.,
Yaropolov A.I., Haltrich D., Thorneley R.N.F., Aust S.D. Direct electron transfer between ligninolytic
redox enzymes and electrodes. Electroanalysis, 2004, 16(13-14), 1074-1092.
2. Shleev S., Tkac J., Christenson A., Ruzgas T., Yaropolov A., Whittaker J., Gorton L. Direct electron
transfer between copper containing proteins and electrodes. Biosensors and Bioelectronics, 2005a,
20(12), 2517-2554.
3. Ferapontova E.E., Shleev S., Ruzgas T., Stoica L., Christenson A., Tkac J., Yaropolov A.I., Gorton L.
Direct electrochemistry of proteins and enzymes. In: Electrochemistry of Nucleic Acid and Proteins:
Towards Electrochemical Sensors for Genomic and Proteomics, Eds. E. Palecek, F. Scheller, and J.
Wang (2005) Elsevier, Amsterdam, pp. 517-598.
4. Морозова О.В., Шумакович Г.П., Горбачева М.А., Шлеев С.В., Ярополов А.И. “Голубые”
лакказы. Биохимия, 2007а, 72(10), 1396-1412.
5. Морозова О.В., Шумакович Г.П., Шлеев С.В., Ярополов А.И. Лакказо-медиаторные системы и
их применение. Прикладная биохимия и микробиология, 2007б, 43(5), 583-597.
СТАТЬИ:
1. Шлеев С.В., Кузнецов С.В., Топунов А.Ф. Ячейка для биоэлектрохимических исследований с
параллельным спектрофотометрическим контролем исследуемого вещества. Прикладная
биохимия и микробиология, 2000, 36(3), 354-358.
2. Королева О.В., Явметдинов И.С., Шлеев С.В., Степанова Е.В., Гаврилова В.П. Выделение и
изучение некоторых свойств лакказы из базидиомицета Cerrena maxima. Биохимия, 2001,
66(6), 762-767.
3. Шлеев С.В., Зайцева Е.А., Горшина Е.С., Морозова О.В., Сереженков В.А., Бурбаев Д.Ш.,
Кузнецов Б.А., Ярополов А.И. Спектральное и электрохимическое изучение активных сайтов
лакказ базидиомицетов. Вестник Московского Университета, Серия 2 Химия 2003, 44(1), 35-39.
4. Karamyshev A.V., Shleev S.V., Koroleva O.V., Yaropolov A.I., Sakharov I.Yu. Laccase-catalyzed
synthesis of conducting polyaniline. Enzyme and Microbial Technology, 2003, 33(5), 556-564.
5. Shleev S.V., Khan Ir Gvon, Gazaryan I.G., Morozova O.V., Yaropolov A.I. Novel laccase redox
mediators: spectral, electrochemical and kinetic properties. Applied Biochemistry and
Biothechnology, 2003, 111(3), 167-183.
6. Шлеев С.В., Хан И.Г., Морозова О.В., Мажуго Ю.М., Халунина А.С., Ярополов А.И. Фенилпиразолоны – новый класс редокс-медиаторов оксидоредуктаз для деградации ксенобиотиков.
Прикладная биохимия и микробиология, 2004а, 40(2), 165-172.
7. Шлеев С.В., Чеканова С.А., Королева О.В., Степанова Е.В., Телегин Ю.А., Сенькина З.Е.
Определение полифенольного комплекса вин электрохимическими методами, в том числе с
использованием ферментов тирозиназы и лакказы. Прикладная биохимия и микробиология,
2004б, 40(3), 359-365.
8. Shleev S., Kasmi A.E., Ruzgas T., Gorton L. Direct heterogeneous electron transfer reactions of
bilirubin oxidase at a spectrographic graphite electrode. Electrochemistry Communications, 2004a,
6(9), 934-939.
9. Shleev S.V., Morozova O.V., Nikitina O.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V., Serezhenkov V.A.,
Burbaev D.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I. Comparison of physico-chemical characteristics of four
laccases from different basidiomycetes. Biochimie, 2004b, 86 (9-10), 693-703.
10. Shleev S., Christenson A., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A., Gorton L., Ruzgas T.
Electrochemical redox transformations of T1 and T2 copper sites in native Trametes hirsuta laccase
at gold electrode. Biochemical Journal, 2005b, 385(3), 745-754.
11. Ярополов А.И., Шлеев С.В., Морозова О.В., Зайцева Е.С., Марко-Варга Г., Эмнеус Гортон Л.
Амперометрический биосенсор для определения фенольных соединений на основе лакказы,
иммобилизованной в полимерные матрицы. Журнал Аналитической Химии, 2005, 60(6), 624628.
48
12. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Среженков В.А., Бурбаев Д.Ш.,
Беловолова Л.В., Ярополов А.И. Выделение и очистка ферментов лигнолитического
комплекса базидиального гриба Trametes pubescence (Schumach.) Pilát и исследование их
свойств. Биохимия, 2005, 70(11), 1548-1555.
13. Shleev S., Jarosz-Wilkolazka A., Khalunina A., Morozova O., Yaropolov A., Ruzgas T., Gorton L.
Direct heterogeneous electron transfer reactions of laccases from different origins on carbon
electrodes. Bioelectrochemistry, 2005c, 67(1), 115-124.
14. Pita M., Shleev S., Ruzgas T., Fernandez V.M., Yaropolov A.I., Gorton L. Direct heterogeneous
electron transfer reactions of fungal laccases at bare and thiol-modified gold electrodes,
Electrochemistry Communication, 2006, 8(5), 747-753.
15. Shleev S., Persson P., Shumakovich G., Mazhugo Y., Yaropolov A., Ruzgas T., Gorton L. Laccase
based biosensors for monitoring lignin. Enzyme and Microbial Technology, 2006a, 39(4), 835-840.
16. Shleev S., Persson P., Shumakovich G., Mazhugo Y., Yaropolov A., Ruzgas T., Gorton L. Interaction
of fungal laccases and laccase-mediator systems with lignin. Enzyme and Microbial Technology,
2006b, 39(4), 841-847.
17.Shumakovich G.P., Shleev S.V., Morozova O.V., Khohlov P.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I.
Electrochemistry and kinetics of fungal laccase mediators. Bioelectrochemistry, 2006, 69(1), 16-24.
18. Shleev S., Reimann C.T., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A.I., Gorton L., Ruzgas T.
Autoreduction and aggregation of fungal laccase in solution phase: possible correlation with a resting
form of laccase. Biochimie, 2006c, 88(9), 1275-1285.
19. Shleev S., Pita M., Yaropolov A.I., Ruzgas T., Gorton L. Direct heterogeneous electron transfer
reactions of Trametes hirsuta laccase at bare and thiol-modified gold electrodes. Electroanalysis,
2006d, 18(19-20), 1901-1908.
20. Christenson A., Shleev S., Mano N., Heller A., Gorton L. Redox potentials of the blue copper sites of
bilirubin oxidases. Biochimica et Biophysica Acta, 2006, 1757(12), 1634-1641.
21. Горшина Е.С., Русинова Т.В., Бирюков В.В., Морозова О.В., Шлеев С.В., Ярополов А.И.
Динамика оксидазной активности в процессе культивирования базидиальных грибов рода
Trametes Fr. Прикладная биохимия и микробиология, 2006а, 42(6), 638-644.
22. Горшина Е.С., Русинова Т.В., Марьина Н.С., Шкурина Н.А., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н.,
Горбачева М.А., Морозова О.В., Шлеев С.В., Ярополов А.И. Биосинтез грибной лакказы фермента для экологически безопасных производств. Труды МГУИЭ, 2006б, 116-123.
23. Shleev S., Nikitina O., Christenson A., Reimann C.T., Yaropolov A.I., Ruzgas T., Gorton L.
Characterization of two new multiforms of Trametes pubescens laccase. Bioorganic Chemistry,
2007a, 35(1), 35-49.
24. Yaropolov A., Shleev S., Zaitseva E., Emnéus J., Marko-Varga G., Gorton L. Electroenzymatic
reactions with oxygen on laccase-modified electrodes in anhydrous (pure) organic solvent.
Bioelectrochemistry, 2007, 70(2), 199-204.
25. Nazaruk E., Michota A., Bukowska J., Shleev S., Gorton L., Bilewicz R. Properties of native and
hydrophobic laccases immobilized in the liquid-crystalline cubic phase on electrodes. Journal of
Biological and Inorganic Chemistry, 2007, 13(3), 335-344.
26. Haghighi B., Rahmati-Panah A., Shleev S., Gorton L. Carbon ceramic electrodes modified with
laccase from Trametes hirsuta: fabrication, characterization and their use for phenolic compounds
detection. Electroanalysis, 2007, 19(9), 907-917.
27. Shleev S., Klis M., Wang M., Rogalski J., Bilewicz R., Gorton L. Comparative spectroelectrochemical
studies of lyophilised and non-lyophilised laccases from Cerrena unicolor basidiomycete.
Electroanalysis, 2007b, 19(10), 1039-1047.
28. Zumarraga M., Bulter T., Shleev S., Polaina J., Martinez-Arias A., Plou F.J., Ballesteros A., Alcalde
M. In vitro evolution of a fungal laccase in high concentrations of organic cosolvents, Chemistry and
Biology, 2007, 14(9), 1052-1064.
29. Vasil'eva I.S., Morozova O.V., Shumakovich G.P., Shleev S.V., Sakharov, I.Y., Yaropolov A.I.
Laccase-catalyzed synthesis of optically active polyaniline. Synthetic Metals, 2007, 157(18-20), 684689.
49
30. Zumarraga M., Camarero S., Shleev S., Martinez-Arias A., Ballesteros A., Plou F., Alcalde M.
Altering the laccase functionality by in vivo assembly of mutant libraries with different mutational
spectra. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2008a, 71(1), 250-260.
31. Shleev S., Wang Y., Gorbacheva M., Christenson A., Haltrich D., Ludwig R., Ruzgas T., Gorton L.
Direct heterogeneous electron transfer reactions of Bacillus halodurans bacterial blue multicopper
oxidase. Electroanalysis, 2008a, 20(9), 963-969.
32. Горбачева М., Шумакович Г., Морозова О., Стрельцов А., Зайцева Е., Шлеев С.В.
Сравнительное изучение биокаталитических реакций с участием высоко- и
низкопотенциальных грибных и древесных лакказ в гомогенных и гетерогенных реакциях.
Вестник Московского Университета, Серия 2 Химия 2008, 9(2), 117-121.
33. Shleev S. and Ruzgas T. Transistor-like behaviour of a fungal laccase. Angewandte Chemie
International Edition, 2008b, 47(38), 7270-7274.
34. Zumarraga M., Vaz Domínguez C., Camarero S., Shleev S., Polainac J., Martínez-Ariasa A., Ferrera
M., De Lacey A., Fernández V., Ballesteros A., Plou F., Alcalde M. Combinatorial saturation
mutagenesis of the Myceliophthora thermophila laccase T2 mutant: the connection between the Cterminal plug and the conserved 509VSG511tripeptide. Combinatorial Chemistry & High Throughput
Screening, 2008b, 11(10), 807-816.
35. Vaz-Dominguez C., Campuzano S., Rüdiger O., Pita M., Gorbacheva M., Shleev S., Fernandez V.,
De Lacey A. Laccase electrode for direct electrocatalytic reduction of O2 to H2O with high operational
stability and resistance to chloride inhibition. Biosensors and Bioelectronics, 2008, 24(4), 531-537.
36. Ramírez P., Mano N., Andreu R., Ruzgas T., Heller A., Gorton L., Shleev S. Direct electron transfer
from graphite and functionalized gold electrodes to T1 and T2/T3 copper centers of bilirubin oxidase.
Biochimica Biophysica Acta, 2008, 1777(10), 1364-1369.
37. Coman V., Vaz-Domínguez C., Ludwig R., Harreither W., Haltrich D., De Lacey A., Ruzgas T.,
Gorton L., Shleev S. A membrane-, mediator-, cofactor-less glucose/oxygen biofuel cell. Physical
Chemistry Chemical Physics, 2008, 10(40) 6093-6096.
38. Gorbacheva M., Morozova O., Shumakovich G., Streltsov A., Shleev S., Yaropolov A. Enzymatic
oxidation of manganese ions catalysed by laccase. Bioorganic Chemistry, 2009, 37(1) 35-49.
39. Haberska K., Vaz-Domínguez C., De Lacey A.L., Dagys M., Reimann C.T., Shleev S. Direct electron
transfer reactions between human ceruloplasmin and electrodes. Bioelectrochemistry, 2009, 76(1-2),
34-41.
40. Coman V., Ludwig R., Harreither W., Haltrich D., Gorton L., Ruzgas T., Shleev S. A direct electron
transfer-based glucose/oxygen biofuel cell operating in human serum. Fuel Cells, 2010, 10(1), 9-16.
41.Ressine A., Vaz-Dominguez C., Fernandez V.M., De Lacey A.L., Laurell T., Ruzgas T., Shleev S.
Bioelectrochemical studies of azurin and laccase confined in three-dimensional chips based on goldmodified nano-/microstructured silicon. Biosensors and Bioelectronics, 2010, 25(5), 1001-1007.
42.Dagys M., Haberska K., Shleev S., Arnebrant T., Kulys J., Ruzgas T. Gold nanoparticle assisted
bioelectrocatalytic reduction of oxygen by Trametes hirsuta laccase. Electrochemistry
Communication, 2010, 12(7), 933-935.
ПАТЕНТЫ:
1. Ярополов А., Синякова А., Морозова О., Шлеев С., Староверов С., Сахаров И., Кузнецов М.
Метод получения оптически активного полианилина. 2007, Патент РФ RUXXE7 RU 2301262 C1
20070620, 4 стр.
2. Ярополов А., Васильева И., Морозова О., Шумакович Г., Шлеев С. Способ получения водной
дисперсии
интерполимерного
комплекса
электропроводящего
полианилина
и
полисульфокислот. 2008, Патент РФ RUXXE7 RU 2318020 C1 20080227, 5 стр.
3. Горшина Е., Бирюков В., Русинова Т., Шкурина Н., Ярополов А., Морозова О., Шлеев С.,
Шеблыкин И. Штамм базидиального гриба Trametes hirsuta (Wulfen) pilat – продуцент голубой
лакказы. 2009a, Патент РФ RUXXE7 RU 2345135 C2 20090127, 6 стр.
4. Горшина Е., Бирюков В., Русинова Т., Ярополов А., Морозова О., Шлеев С., Шеблыкин И.
Способ получения ферментного препарата лакказы. 2009b, Патент РФ RU 2349644 C2
20090320, 5 стр.
50
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:
ВЭП – внутримолекулярный электронный перенос; МЭП – медиаторный электронный перенос;
ПЭП – прямой электронный перенос; ЭП – электронный перенос; ABTS – диаммониевая соль
2,2’-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоната); Ag/AgCl – хлор-серебрянный электрод; AOх
– аскорбат оксидаза; BOx – билирубиноксидаза; CDH – целлобиозодегидрогеназа; CKK –
сульфокамфорная кислота; Cp – церулоплазмин; HABA – 3-(6-гидрокси)-аминобензойная
кислота; HBT – 1-гидроксибензотриазол; HPI – N-гидроксифталеимид; HPLC –
высокоэффективная жидкостная хроматография; HQ – гидрохинон; MCO – медьсодержащие
оксидазы; Lc – лакказа; LMS – лакказа-медиаторная система; mSPP – 1-(3′-сульфофенил-3метил-пиразолон-5; pI – изоэлектрическая точка; NHE – нормальный водородный электрод; PP –
1-фенил-3-метил-пиразолон-5; PPA – 1-фенил-2,3-диметил-4-амино-пиразолон-5; PPA-Na – 1фенил-2,3–диметил–4–аминопиразолон–5n– метансульфонат натрия; pSPP – 1-(4′сульфофенил-3-метил-пиразолон-5); SDS - додецилсульфат натрия; TEMPO – 2,2,6,6тетраметил-1- пиперидинилоксил; VA – вератровый спирт (3,4-диметоксибензиловый спирт).
51