ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ МОСКОВСКИЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ На правах рукописи Чвартацкая Оксана Викторовна Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на свойства мезенхимальных стволовых клеток человека Специальность 03.01.04 биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Севастьянова Г.А. Москва – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 Принятые сокращения и аббревиатуры………………………… 5 ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………….. 7 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Биологические свойства и функции внеклеточной ДНК человека……………………………………………………………… 12 1.1.1 Концентрация внеклеточной ДНК в биожидкостях………………. 13 1.1.2 Размеры фрагментов внеклеточной ДНК…………………………. 14 1.1.3 Модификация оснований внеклеточной ДНК……………………. 16 1.2 Происхождение фрагментов внеклеточной ДНК в организме….. 17 1.3 Микроокружение внеклеточной ДНК………………………………... 20 1.4 Взаимодействие внеклеточной ДНК с клетками…………………………………………………………….... 22 1.4.1 Белки семейства «toll-like» рецепторов (TLR)…………………….. 23 1.4.1.1 Лиганды для белков TLR9.……………………………………………… 25 1.5 TLR9-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-cигнальные пути.……………………………………..…………. 27 1.6 Роль цитокинов в организме………………………...…………….... 1.6.1 Провоспалительные цитокины……………………………………… 37 1.6.2 Противовоспалительные цитокины…………………………….…... 39 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ……………………………………… 2.1 Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых 36 42 клеток.………. ……………………………………………………..… 42 2.1.2 Исследование экспрессии клетками поверхностных белков.………………………………………………………………... 2.2 Определение концентрации повторяющейся последовательности 2 45 ДНК человека в крови………………………………….…………… 46 2.3 Конструирование плазмиды п(рДНК).…………………………... 48 2.4 Выделение РНК из мезенхимальных стволовых клеток………………………………………………………………... 49 2.4.1 Обработка выделенной РНК ДНКазой ……………………….……. 50 2.4.2 Определение концентрации РНК……………………...……………. 50 2.5 Выделение ДНК из мезенхимальных стволовых клеток…………………………………………………………………. 50 2.5.1 Определение концентрации ДНК……………………………….….. 2.6 Постановка полимеразцой цепной реакции………………….……. 2.6.1 Проведение реакции обратной транскрипции.……………………. 51 51 51 2.6.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени……… 52 2.7 Иммуногистохимия………………………………………………… 54 2.7.1 Связывание антител с NF-kB………………………………………. 54 2.7.2 Связывание антител с TLR9………………………………………... 54 2.8 Иммуноферментный анализ секреции цитокинов………………… 55 2.8.1 Иммуноферментный анализ секреции цитокина IL-10…………… 2.8.2 Иммуноферментный анализ секреции цитокина TNFα…………… 58 2.9 Определение активности каспазы 3……………………..………….. 61 2.10 Статистическая обработка результатов…………………………….. 61 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ ……………………………… 62 3.1 Рецепторы, отвечающие на действие CG-богатой внеклеточной ДНК……………………………………….…………………………………. 3.1.1 Определение экспрессии мРНК TLR9 в 55 62 мезенхимальных стволовых клетках, при действии на них вкДНК, модельной п(рДНК) и ДНК Е.coli.…………………………………………. 3 66 3.2 Исследование сигнальных путей, активирующихся в мезенхимальных стволовых клетках в ответ на действие фрагментов п(рДНК).……………………………………..………….. 3.2.1 73 Кинетика изменения во времени экспрессии мРНК TLR9 и адаптера TLR-сигнального пути – MyD88 в ответ на стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК).…………………………………………………………………… 73 3.2.2 Aктивация NF-kB -, JNK/p38-, IRF- сигнальных путей в ответ на стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК).……………………………………………………..……… 76 3.2.3 Транслокация NF-kB в ядро мезенхимальных стволовых клеток при действии фрагментов п(рДНК).…………………………….…….. 84 3.2.4 П(рДНК) стимулирует увеличение количества мРНК цитокинов IL10 и TNFα…………………………………………..……………... 87 3.3 Снижение ферментативной активности каспазы 3 в мезенхимальных стволовых клетках при действии модельных фрагментов внеклеточной ДНК…………………………………….. 89 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ……………………………….. 90 ВЫВОДЫ…………………………………………………………… 94 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………... 95 4 Принятые сокращения и аббревиатуры CpG-ОДН – CpG-содержащие олигонуклеотидные аналоги; GAPDH – глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназа; IL – интерлейкин; IRAK – (от англ. interleukin-1 receptor-associated kinase ) – интерлейкин-1 рецептор - связанная киназа; IRF3/7 – фактор, регулирующий транскрипционную активность гена интерферона; JNK (англ. c-Jun N-terminal kinase; c-Jun N-концевые киназы) - стрессактивируемые протеинкиназы MAPК – митоген активируемая протеинкиназа; MyD88 – (от англ. мyeloid differentiation primary response gene) – ген миелоидной дифференцировки первичного ответа; NF-kB (ядерный фактор «каппа-би»; англ. nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells, NF-kB) — универсальный фактор транскрипции PAMP – (от англ. pathogen-associated molecular pattern) –патогенсвязывающий молекулярный паттерн; real-time PCR – полимеразная цепная реакция в реальном времени; SDS – додецилсульфат натрия; SSC – стандартный солевой раствор; TBP – TATA-связывающий белок; TCR – Т-клеточный рецептор; TIR – (от англ. toll-interleukin-1 receptor) – толл-интерлейкин-1 рецептор; TLR – (от англ. toll-like receptor) – семейство толл-подобных рецепторов; TNF – фактор некроза опухоли; АПК – антигенпредставляющие клетки; вкДНК – внеклеточная ДНК; гДНК – геномная ДНК; ГКГ – главный комплекс гистосовместимости; 5 инг-ОДН – ингибирующие олигодезоксинуклеотиды; ИФА – иммуноферментный анализ; ИФН – интерферон; КД – контрольные доноры; МСК – мезенхимальные стволовые клетки; НК-клетки – клетки нормальных киллеров; ОДН – олигодезоксинуклеотиды; ОНП – однонуклеотидный полиморфизм; п(рДНК) – фрагменты рибосомной ДНК, встроенные в плазмиду ПЦР – полимеразная цепная реакция; РАИЛ – рецептор антагонистов интерлейкинов; СатIII – клонированный фрагмент субфракции сателлита 3; ТАТА – короткий А-Т-обогащенный участок (типичная последовательность — ...ТАТААА...) гена эукариот; ТКР – Т-клеточный антигенраспознающий рецептор; ТОрДНК – транскрибируемая область рибосомного повтора человека; ТФРβ – трансформирующий фактор роста бета; ФНОα – фактор некроза опухоли α; ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота; яДНК – ядерная ДНК; 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Внеклеточная ДНК (вкДНК) в норме присутствует в плазме крови человека и в межклеточном веществе. До сих пор остаются невыясненными вопросы ее происхождения, однако в литературе обсуждаются две главных модели. Первая из них предполагает, что появление вкДНК связано с гибелью клеток в организме, то есть циркулирующая вкДНК в кровотоке – это фрагменты ДНК клеток, подвергшихся апоптозу. В рамках второй модели вкДНК появляется в межклеточном веществе в результате секреции клетками фрагментов ДНК. Показано, что в крови пациентов с различными патологиями концентрации вкДНК существенно возрастают. Поэтому на данный момент наибольший интерес научного сообщества вызывает ее применение в диагностике различных заболеваний. До недавнего времени предполагалось, что вкДНК не оказывает влияния на клетки организма. Известно, что геномная ДНК млекопитающих не обладает иммуностимулирующим действием, так как содержит незначительное количество неметилированных CpG–мотивов в своем составе, а также включает иммуносупрессорные последовательности. Однако вкДНК существенно отличается от ядерной ДНК (яДНК) по ряду свойств. Установлено, что вкДНК в отличие от яДНК обогащена повторяющейся последовательностью - транскрибируемой областью рибосомного повтора (ТОрДНК) [Калашникова и соавт., 2006; Костюк и соавт., 2006; Вейко и соавт., 2007], которая аналогично бактериальной ДНК является потенциальным иммуномодулятором, также было показано, что вкДНК и фрагмент ТОрДНК обладает стимулирующим действием на лимфоциты человека [Вейко и соавт., 2006]. Кроме того, отмечено, что активирующее действие ТОрДНК на клетки иммунной системы опосредуется через рецепторы семейства Toll-like, или TLR – (от англ. toll-like receptor) [Вейко и соавт., 2006]. 7 Однако остается не известным, оказывают ли воздействие фрагменты вкДНК на свойства мезенхимальных стволовых клеток. За последнее время достигнуты большие успехи в изучении биологии стволовых клеток, но остается еще много вопросов, связанных с их взаимодействием с клетками микроокружения, а также ролью различных сигнальных путей в регуляции стволовых клеток. Стволовые клетки обладают уникальными свойствами: они представляют собой неспециализированные клетки, не имеют тканеспецифических маркеров и поддерживают статус недифференцированных определенных биологических сигналов клеток. стволовые При действии клетки способны дифференцироваться в специализированные клетки [Morrison et al., 2006]. Применение эмбриональных стволовых клеток открывает широкие возможности для клинической практики, но вызывает большое количество этических проблем. Поэтому в настоящее время все больше внимания уделяется изучению свойств стволовых клеток из других источников. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются предшественниками клеток мезенхимальной линии, это хрящи, кости, сухожилия, жир, мышцы. МСК достаточно легко выделяются из костной и жировой тканей, а также из других источников, и быстро растут в лабораторных условиях. Кроме того, мезенхимальные стволовые клетки способны оказывать иммуносупрессорное действие посредством индукции регуляторных Т-лимфоцитов и дендритных клеток [Stagg, 2007]. Эти свойства способствуют применению мезенхимальных стволовых клеток в практической медицине. В то же время не полностью изучена регуляция этих клеток и сигнальные пути, активирующиеся при их взаимодействии с клетками организма, поскольку эти сигнальные пути образуют сложную сеть. Известно, что стволовые клетки локализованы и функционируют в определенном микроокружении, называемом “нишей” [Morrison et al., 2008]. Нишу образуют клетки микроокружения, продуцирующие факторы роста и другие регуляторные молекулы, и внеклеточный матрикс, представленный 8 базальными мембранами на границе эпителиальных и мезенхимных тканей. «Ниша» обеспечивает жизнеспособность, самоподдержание и самовоспроизведение стволовых клеток, а также длительное их пребывание в состоянии покоя и дифференциацию дочерних транзиторных клеток, тем самым она защищает стволовые клетки от внешних воздействий [Morrison et al., 2008]. При определенных условиях стволовые клетки могут покидать ниши (процесс мобилизации стволовых клеток), сохраняя жизнеспособность и возвращаться в свои ниши («хоуминг» СК) [Lapidot et al., 2005]. Повреждение ткани стимулирует переход стволовых клеток к пролиферации, поскольку стволовые клетки являются пролиферативным резервом при регенерации ткани [Lehrer et al., 1998]. Свойство стволовых клеток способствовать репарации поврежденных тканей активно используется в практической медицине. В очаг повреждения либо вводятся аутологичные стволовые клетки, либо стимулируются к пролиферации эндогенные стволовые клетки, либо активируется мобилизация стволовых клеток из других источников с помощью ряда цитокинов с их последующей миграцией в зоны повреждения [Daniels, 2007]. Однако процессы, происходящие со стволовыми клетками в очаге повреждения, также остаются малоизученными. Целью настоящей работы является изучение влияния внеклеточной ДНК и ее фрагментов на мезенхимальные стволовые клетки, посредством моделирования in vitro ситуации, когда эндогенные мезенхимальные стволовые клетки, мигрирующие из ниши в очаги повреждения, или мезенхимальные стволовые клетки, введенные в организм с целью терапии, контактируют с ГЦ-богатой вкДНК, которая в норме и при патологии содержится в плазме крови. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Отработать адекватные условия культивирования МСК, полученных из жировой ткани; 9 2. Выявить рецепторы в МСК, которые активируются в ответ на действие вкДНК; 3. Изучить сигнальные пути, участвующие в ответе МСК на действие модельного ГЦ-богатого фрагмента вкДНК; 4. Проследить, какие механизмы выживаемости активируются в МСК при контакте с ГЦ-богатыми фрагментами вкДНК; Научная новизна. Впервые было показано активирующее действие вкДНК и ГЦ-богатого фрагмента (ТОрДНК) на мезенхимальные стволовые клетки человека, сопровождающееся усилением синтеза РНК и высокой продукцией цитокинов IL10 и TNFα. Стимулирующее действие вкДНК и ТОрДНК на мезенхимальные стволовые клетки человека реализуется посредством активации рецепторов семейства «toll-like» (в частности TLR9), которые узнают ГЦ-богатые последовательности ДНК. Установлено, что плазмида (п(рДНК)), содержащая в своем составе фрагменты ТОрДНК, активирует в мезенхимальных стволовых клетках TLR9-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-cигнальные пути. Научно-практическая значимость работы. В последнее время терапия стволовыми клетками приобретает все более актуальное значение для лечения заболеваний, сопровождающихся дегенерацией тканей. Массовая гибель клеток, пересаженных в очаг поражения тканей, остается серьезной проблемой в транспланталогии. Для того, чтобы повысить жизнеспособность пересаживаемых мезенхимальных стволовых клеток, проводят предварительную обработку клеток, в частности, TNFα [Yao et al., 2009] или синтетическими олигонуклеотидами (ГЦ-ОДН) [Tomchuck et al., 2008]. Эффективность этой предварительной обработки в значительной степени зависит от активации NF-kB и его транслокации в ядро [Yao et al., 2009]. Полученные данные указывают на то, что культивирование мезенхимальных стволовых клеток с ГЦ-богатой плазмидой п(рДНК) в низких концентрациях (50 нг/мл) в течение короткого времени вызывает стимуляцию TLR9, что 10 приводит к активации и транслокации NF-kB в ядро. П(рДНК) может быть использована для предварительной обработки культуры пересаживаемых мезенхимальных стволовых клеток, наряду с предлагаемой обработкой стволовых клеток синтетическими ГЦ-ОДН для стимуляции TLR9. 11 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Биологические свойства и функции внеклеточной ДНК человека История изучения биологии циркулирующих нуклеиновых кислот ведет свое начало с 1948 года, когда исследователи Мендель и Метаис впервые обнаружили их в плазме крови человека. С тех пор нуклеиновые кислоты были обнаружены как в различных циркулирующих жидкостях в организме животных, так и в межклеточном веществе в тканях, а также в средах культивирования различных клеток растений [Gahan et al., 2008]. Этот факт был подтвержден также на бактериях и клетках растений [Peters and Pretorius, 2011]. Фрагменты ДНК, которые были выделены из жидкостей организма, принято называть внеклеточной ДНК (вкДНК), экстрацеллюлярной ДНК, внехромосомной ДНК, ДНК плазмы, cell-free DNA, circulating DNA [Gahan et al., 2008; Peters and Pretorius, 2011]. Особое внимание уделяется вкДНК после того, как современные методы позволили провести анализ первичной структуры очень маленьких фрагментов ДНК. Отдельное внимание уделяется совершенствованию методов анализа фрагментов измененной ДНК опухоли, которые циркулируют в крови пациента, или ДНК плода, частицы которой можно обнаружить в крови матери. ВкДНК используется как маркер патологии при аутоиммунных заболеваниях, диабете, травмах, инсультах, инфарктах миокарда и т.д. Вопросу использования феномена вкДНК в диагностике различных заболеваний посвящено много работ и обзоров (обзор [Tong et al., 2006]). Для того, чтобы понять влияние вкДНК на жизненноважные процессы организма, необходимо изучить свойства вкДНК и характер взаимодействия фрагментов вкДНК с клетками организма. К свойствам вкДНК относят следующие характеристики: концентрация фрагментов в биожидкости, наличие однонитевых разрывов цепи и длина фрагментов, изменение последовательностей во вкДНК по сравнению с геномной ДНК, модификация функциональных групп ДНК. 12 1.1.1 Концентрация внеклеточной ДНК в биожидкостях Внеклеточная ДНК является нормальной составляющей крови и может быть обнаружена в плазме крови любого человека. Однако уровень ДНК в образцах плазмы крови здоровых людей довольно низкий. Его оценки сильно различаются в зависимости от способа измерения и выборки доноров. Обычно значения нижней границы диапазона близки – около 3,6-5 нг/мл [Suzuki et al., 2008], однако в некоторых исследованиях наблюдается существенный разброс данных, например, 1,8-36 нг/мл [Gahan and Stroun, 2010]. На данный момент считается перспективным направлением исследований изучение диагностического значения концентраций вкДНК. При патологических состояниях концентрация вкДНК, как правило, значительно увеличивается [Umetani et al., 2006; Zhong et al., 2006]. Отмечены колебания концентрации вкДНК при инфарктах. При остром инфаркте концентрация вкДНК значительно растет по сравнению с нормой (от 36,3±23,8 нг/мл до 511±398 нг/мл), и изменение ее концентрации коррелирует с изменениями количества традиционных маркеров инфаркта, например, тропонина. Впрочем, в этом исследовании не учитывался размер поврежденной области, что может объяснить широкий разброс данных. Концентрация вкДНК может служить хорошим критерием для прогноза отдаленных последствий инфаркта миокарда. По сравнению с контрольной группой (пациенты, не имевшие осложнений), где концентрация составила 475-530 пг/мкл, в группах, где развились осложнения, она была больше: 1060 пг/мкл у пациентов с развившейся позднее сердечной недостаточностью; 1000 пг/мкл у пациентов, у которых позже повторился инфаркт; 1350 пг/мкл у пациентов с последующей остановкой сердца и 725 пг/мкл у пациентов, повторно поступивших через 6 месяцев после первой госпитализации [Butt and Swaminathan, 2008]. Что касается онкологических заболеваний, на данный момент измерение концентрации вкДНК в крови не позволяет отличить рак от 13 других заболеваний; однако увеличение ее концентрации однозначно свидетельствует о развитии болезни, а снижение – о выздоровлении или ремиссии [Gahan and Swaminathan, 2008]. Помимо этого, изучалось участие вкДНК в развитии асептического воспаления, например, при интенсивной физической нагрузке. В группе покоя концентрация вкДНК составила 18,01 пг/мкл, после бега на длинную дистанцию она возросла до 334,4 пг/мкл, но уже через два часа упала практически до исходного значения – 30,44 пг/мкл [Butt and Swaminathan, 2008]. Таким образом, даже у здорового человека концентрация вкДНК в крови может существенно колебаться. Показано также нахождение фетальной вкДНК в плазме материнской крови; однако она меньше по размерам (<300 п.н., в то время как материнская > 300 п.н.). В настоящее время делаются попытки диагностировать по вкДНК, выделенной из материнской крови, как материнские заболевания (преэклампсия, замедление внутриматочного развития), так и болезни плода (резус-несовместимость, β-талассемия). Производятся попытки с помощью метилированных специфических маркеров фетальной ДНК диагностировать анеуплоидию. Параллельно налаживается технология ранней диагностики пола [Gahan and Swaminathan, 2008]. Таким образом, поиск применения вкДНК крови в диагностике является активно развивающимся направлением. И несмотря на то, что на данный момент большинство оценок носит количественный характер, уже найдены некоторые основные корреляции и делаются попытки качественной диагностики конкретных заболеваний [Gahan and Swaminathan, 2008]. 1.1.2 Размеры фрагментов внеклеточной ДНК С самого момента открытия циркулирующей ДНК исследователей интересовал вопрос: насколько она похожа на геномную ДНК по структуре и составу? Ожидалось, что обнаружение 14 каких-либо структурных особенностей вкДНК позволит судить о ее происхождении и роли в организме, а также будет способствовать развитию диагностических технологий. Было установлено, что вкДНК двухцепочечная и представляет собой фрагменты длиной от 180 до 10 000 н.п. [Anker et al., 1975]. При этом короткие фрагменты преобладают, средняя их длина в образцах крови здоровых людей составляет 176 н.п. [Suzuki et al., 2008]. ГЦ-состав вкДНК также отличает ее от геномной ДНК. ВкДНК значительно обогащена ГЦ-парами, аналогично бактериальной ДНК [Malinovskaya et al., 2010], в особенности 5' и 3'-концы фрагментов [Suzuki et al., 2008]. При этом содержание АТ-богатых последовательностей снижено [Malinovskaya et al., 2010], процент ГЦ-пар составляет примерно 53,7% [Suzuki et al., 2008]. Показано, что при сердечно-сосудистой патологии, при аутоиммунных заболеваниях и при действии внешних источников излучения содержание маркерных ГЦ-последовательностей в составе вкДНК плазмы крови может увеличиваться в несколько раз [Malinovskaya et al., 2010]. Вероятно, это происходит благодаря высокой устойчивости ГЦ-богатых фрагментов к двунитевой фрагментации при накоплении однонитевых разрывов, вносимых нуклеазами крови [Veiko et al., 2010]. В том, что касается сравнения смыслового состава геномной ДНК и вкДНК, мнения авторов расходятся. Исследование вкДНК из крови 50 здоровых людей, проведенное в 2009 году, показало, что соотношение количества всех функциональных элементов генома в вкДНК и геномной ДНК было примерно 1. Это указывает на то, что нуклеом по набору последовательностей в целом отражает геном; наибольший разброс в соотношениях между индивидуальными донорами наблюдался для белоккодирующих последовательностей, нетранслируемых областей и псевдогенов [Beck et al., 2009]. В то же время, секвенирование и RQ-PCR недостоверно показали равную встречаемость в нуклеоме всех частей генома. Это может быть связано как с индивидуальными особенностями транскрипции, так и с 15 различиями в транспорте и выведении отдельных фрагментов вкДНК. Однако это может свидетельствовать и о целенаправленном характере выделения ДНК в кровь. Также существует множество данных о том, что онкогенные мутации и амплификации отдельных генов, изменения в области микросателлитов, а также эпигенетические модификации, как, например, метилирование ДНК, могут быть обнаружены в циркулирующей вкДНК. При этом утверждается, что они схожи с таковыми, обнаруживаемыми в опухолевой ткани раковых больных. Это сходство позволяет некоторым авторам предположить, что циркулирующая вкДНК, вероятно, происходит из клеток первичной опухоли [Van der Vaart and Pretorius, 2008]. 1.1.3 Модификация оснований внеклеточной ДНК В литературе практически нет информации относительно содержания модифицированных фрагментов в составе вкДНК. Ожидаемо, что в составе вкДНК содержатся окисленные основания ДНК, так как окислительный стресс – явление, часто встречающееся в организме, особенно при патологических состояниях. Наличие фрагментов, содержащих окисленные основания во вкДНК, было показано иммуноферментными методами. Оказалось, что при ревматоидном артрите в синовиальной жидкости и сыворотке определяются основания окисленной ДНК. Модифицированные основания в составе вкДНК были обнаружены и у здоровых доноров в следовых количествах. Показано, что под действием вкДНК в клетках эндотелия развивается окислительный стресс, образуются двунитевые разрывы ДНК [Ermakov et al., 2011], активируются системы репарации (похожие результаты также получены на лимфоцитах – [Ermakov et al., 2009]), увеличиваются экспрессия эндотелиальной и индуцибельной NOcинтаз и синтез оксида азота (аналогичные данные получены для первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крысы – [Efremova et al., 2010]), снижаются активность каталазы и каспазы-3 [Костюк и др., 2010]. Было 16 также обнаружено, что добавление интактной ДНК клеток в среду культивирования эндотелиоцитов в условиях окислительного стресса, вызванного увеличивало экзогенным действием окислительный перекиси стресс. Этот водорода, эффект можно значительно объяснить окислительной модификацией ДНК активными формами кислорода и азота в процессе культивирования клеток в присутствии перекиси водорода и вторичным действием на клетки этой окисленной ДНК, усиливающей окислительный стресс [Veiko et al., 2010]. 1.2 Происхождение фрагментов внеклеточной ДНК в организме Происхождение вкДНК является на данный момент одним из самых спорных аспектов ее биологии. До сих пор не существует общепринятой точки зрения по этому вопросу. Отчасти это может быть объяснено противоречивостью получаемых результатов, отчасти – недостаточным количеством исследований в этом направлении. Многие гипотезы происхождения вкДНК были отметены довольно быстро. Так, предполагалось, что ее источниками могли быть вирусы (вирусы Эпштейна-Барра, гепатита В и т.д.), однако это не объясняло появления вкДНК в крови здоровых людей. В качестве альтернативной гипотезы предлагалась секреция ДНК клетками в ходе терминальной дифференцировки. Но при росте опухоли так же сильно растет концентрация вкДНК, в то время как терминальной дифференцировки не наблюдается [Van der Vaart and Pretorius, 2008]. На данный момент обсуждаются две основные гипотезы: клеточная гибель и целенаправленная секреция. Гипотеза клеточной гибели предполагает, что вкДНК, обнаруживаемая в крови, образуется в результате распада клеток, погибших в результате некроза или апоптоза [Malinovskaya et al., 2010]. Большая часть авторов склоняются к тому, что источником вкДНК являются именно апоптотические клетки. Это связано с тем, что, как было сказано выше, вкДНК представляет собой фрагменты, аналогичные тем, 17 которые появляются при расщеплении геномной ДНК в ходе апоптоза (т.н. «нуклеосомная ДНК) [Choi et al., 2005]. Расщепление происходит сначала на большие (50-300 т.н.п.) фрагменты, а затем на олиго- или мононуклеосомы (180-200 н.п.) с помощью эндогенных Ca2+-, Mg2+-зависимых ядерных эндонуклеаз. Сами нуклеосомы устойчивы к расщеплению, предположительно, благодаря прочным электростатическим ДНК-гистонным взаимодействиям. На электрофореграмме они выглядят как «нуклеосомная лесенка» («ladder pattern»), и аналогичная картина наблюдается при электрофорезе фракции вкДНК [Butt et al., 2008]. В отличие от апоптоза, при некрозе осуществляется спонтанное, неспецифическое и неполное расщепление ДНК. Показано, что в результате некроза образуются фрагменты размером более 10 т.п.н. [Van der Vaart et al., 2008]. Также апоптотическую ДНК последовательностям, можно что определить объясняется по типичным специфичностью концевым ДНКазы II, действующей при апоптозе. Однако существуют и аргументы в пользу некротического происхождения вкДНК. Так, например, известно, что большая часть апоптотических тел поглощается соседними клетками и фагоцитами, и ДНК, таким образом, полностью расщепляется на нуклеотиды лизосомальной ДНКазой II. Поэтому существует вероятность, что фрагменты ДНК, высвобожденные из клеток в результате апоптоза, полностью удаляются из межклеточной среды еще до выхода в кровоток. Также показано, что совместное культивирование макрофагов с некротическими клетками приводит к высвобождению ДНК в среду, и этот процесс носит дозозависимый характер. В то же время, кокультивирование с апоптотическими клетками приводит к уменьшению количества вкДНК [Choi et al., 2005]. В рамках второй гипотезы предполагается, что вкДНК может выделяться живыми клетками как нормальная составляющая их метаболизма [Malinovskaya et al., 2010]. Термин «метаболическая ДНК» был введен Stephen Pelc в 1968 году. Используя метод авторадиографии с Н3-тимидином, 18 он показал наличие синтеза ДНК в неделящихся клеточных популяциях (так, например в кардиомиоцитах). Он предположил, что новосинтезированная ДНК играет метаболическую роль, используется для транскрипции, но быстро изнашивается и заменяется новой [Gahan et al., 2008]. Это согласуется что с данными других авторов, которые утверждают, человеческие лимфоциты выделяют ДНК-содержащий комплекс in vitro при стимуляции фитогемаглютинином. Отмечается также, что процесс высвобождения ДНК не связан с клеточной смертью и регулируется гомеостатическими механизмами [Anker et al., 1975; Rogers et al., 1972]. Даже при отсутствии гибели клеток в культуре, вкДНК обнаруживается в среде культивирования. Также отмечено, что лимфоциты в культуре выделяют вкДНК до тех пор, пока ее концентрация не достигнет некоторого порога, вне зависимости от длительности инкубации. Эта ДНК преимущественно новосинтезированная. Также было показано, что электрофореграмма этой секретируемой вкДНК похожа на апоптотическую ДНК [Van der Vaart et al., 2008]. Целенаправленная секреция характерна для делящихся и покоящихся клеток, но не для мертвых или умирающих. Она была показана для нормальных и патологических клеток бактерий, растений, амфибий, птиц, приматов и даже человека [Gahan et al., 2008]. Более того, на многочисленных объектах (растения, сперматозоиды животных, клетки млекопитающих) был показан следующий эффект: при длительном охлаждении часть ДНК теряется, однако она восстанавливается при возвращении к оптимальной температуре. Полагают, что эта лабильная фракция ДНК и является истинной метаболической ДНК [Gahan et al., 2008]. Таким образом, для лабильной фракции ДНК характерны следующие признаки: а) она синтезируется как в пролиферирующих, так и в дифференцированных клеточных популяциях; б) в обоих типах популяций ее количество изменчиво; в) она имеет меньший молекулярный вес, чем стабильная фракция (3-5 х 105 дальтон); г) ее синтез сопряжен с различными 19 метаболическими процессами, характерными для данной ткани [Gahan et al., 2008]. На данный момент остается вероятным, что оба процесса (как гибель клеток, так и целенаправленная секреция) вносят определенный вклад в формирование общего пула вкДНК. 1.3 Микроокружение внеклеточной ДНК ДНК может присутствовать в крови как в растворе, так и в связанном виде. Структуры, с которыми она связана, относятся к гистоновым, везикулярным или ассоциированным с другими макромолекулярными комплексами. Фрагментированная на нуклеосомы ДНК часто присутствует в ядрах нормальных клеток. В последнее время растет количество данных о том, что гистоны могут проходить сквозь плазматические мембраны и могут быть обнаружены в обусловлена различных клеточных нековалентными и органеллах. Эта способность неспецифичными ионными взаимодействиями; она может быть по-разному выражена у разных гистонов. Следовательно, гистоны можно рассматривать как комплексы, участвующие в транспорте ДНК. Помимо этого, обнаружены корреляции между концентрацией некоторых определенных раковых гистонов в заболеваний, крови что и степенью развития подтверждает теорию транспортировки ДНК с помощью гистонов. Везикулярные ДНК-содержащие структуры можно разделить на три группы: апоптотические тельца, микрочастицы и экзосомы. Микрочастицы отделяются в ходе апоптоза, в процессе формирования апоптотических телец. Экзосомы образуются в результате слияния плазматической мембраны с внутриклеточными везикулами. Была прослежена их миграция в кровотоке на длительные расстояния; они были также обнаружены и в других жидкостях, как моча и спинномозговая жидкость. Сигнализация через экзосомы осуществляется посредством их слияния с другими клетками и 20 передачи таким образом их содержимого. Показано нахождение в них мРНК и микроРНК, некоторые авторы также утверждают, что в них может находиться и ДНК. Однако существует мнение, кто вклад экзосомной ДНК в общее количество вкДНК незначителен по сравнению с некротической и апоптотической. В последнее время удалось обнаружить вкДНК в составе макромолекулярных комплексов. Так, многими авторами было показано регулируемое высвобождение новосинтезированного ДНК-РНК- липопротеинового комплекса, содержащего также ДНК-зависимые ДНК- и РНК-полимеразы [Gahan et al., 2008]. Этот комплекс назвали виртосомой. Также было показано, что этот комплекс выделяется целиком как делящимися, так и дифференцированными клетками. ДНК в составе виртосом двухцепочечная и схожа с геномной ДНК. Ее размеры – 450-700 п.н. На культуре лимфоцитов было показано, что виртосомы выделяются до достижения некоторой культивирования; пороговой дальше концентрации выделение вкДНК прекращается. в среде Предполагают существование двух механизмов поддержания постоянной концентрации: а) наличие обратной связи, с помощью которой клетка «узнает» о концентрации виртосомной ДНК в среде; б) существование баланса между секрецией виртосом клетками и их поглощением соседями [Gahan et al., 2010]. Таким образом, ассоциация вкДНК с макромолекулярными комплексами предполагает также ассоциацию с определенными ферментами (полимеразами). Это делает вероятным существование внеклеточного синтеза ДНК. Однако на данный момент не высказано никаких конкретных предположений о его механизмах и функциях. Тем не менее, некоторые данные подтверждают его наличие, например, с помощью включения во вкДНК меченых нуклеотидов [Anker et al., 1975]. И, наконец, вкДНК была обнаружена связанной с поверхностью клеток крови; полагают, что она находится в процессе проникновения внутрь. Однако учитывая гипотезу активной секреции, можно предположить, что 21 ДНК на поверхности клеток является их секретом [Gahan and Swaminathan, 2008]. Однако существует гипотеза о том, что эндогенная ДНК на поверхности клеток защищает их от действия экзогенной ДНК, блокируя большую часть сайтов связывания. ДНК связывается с большим количеством белков, однако аффинность этих взаимодействий низкая; никакой специфичности в последовательностях до сих пор выявить не удалось [Mal’shakova et al., 2008]. Таким образом, вкДНК может присутствовать в крови в разных формах. До сих пор неизвестно, какая из форм преобладает и как это соотношение регулируется. Однако наличие большого количества вкДНКсвязанных частиц и комплексов затрудняет процесс определения истинной концентрации вкДНК в крови. Помимо этого, усложняются методики выделения вкДНК в связи с необходимостью очищать ее от примесей или, напротив, сохранять исходную конформацию. И, наконец, неизвестно, какая из форм является актуально действующей и насколько примеси во фракции вкДНК модулируют ее эффект. Все эти вопросы требуют дальнейшего решения и новых исследований. 1.4 Взаимодействие внеклеточной ДНК с клетками В начале 70-х годов прошлого века выяснено, что фрагменты ДНК взаимодействуют с поверхностью клеток и способны проникать внутрь клетки. Позднее было показано, что вкДНК практически полностью связывается с поверхностью клетки и возможно ее десорбировать путем обработки растворами трипсина или ЭДТА. Обнаружено, что при онкологической патологии значительно увеличивается концентрация вкДНК в плазме крови. При изучении в опытах in vitro взаимодействия вкДНК, десорбированной с клеточной поверхности, и меченой ДНК фага лямбда с клетками крови выявлено, что вкДНК и ДНК фага образуют прочные комплексы с клеточной мембраной (константа диссоциации для ДНК фага 10-9М, для вкДНК - 10-8М). Способствуют 22 комплексообразованию присутствие ионов кальция, магния и сульфат - ионов. Фрагменты ДНК попадают внутрь клетки и распадаются до олигонуклеотидов, ингибитором данного процесса является циклогексимид. Впервые высказано предположение, что на клеточной поверхности присутствуют рецепторы, которые способны к образованию комплексов с вкДНК и способствуют ее эндоцитозу и авторами был выделен ДНК-связывающий белок с молекулярной массой 30 кДа. Ученые предположили, что вкДНК, десорбированная с клеточной поверхности, содержит в своем составе гораздо больше ГЦ – пар, чем ядерная ДНК [Siess et al., 2004]. За последнее время были идентифицированы и выделены многие белки, которые могли бы связываться с вкДНК. В большинстве случаев это уже ранее известные белки, обладающие способностью к комплексообразованию с ДНК на клеточной поверхности. В качестве лигандов для ДНК-связывающихся белков клеточной мембраны во многих работах использовались олигонуклеотиды с разной последовательностью и их активированные производные. Большой интерес вызывает работа [Siess et al., 2004], авторы которой идентифицировали новый белок массой 130 кДа, находящийся на поверхности клеточной мембраны и способный связывать вкДНК (MNAB - membrane-associated nucleic acid-binding protein). Ген данного белка находится на 9 хромосоме и экспрессируется как в здоровых, так и в раковых клетках. 1.4.1 Белки семейства «toll-like» рецепторов (TLR) Существенные изменения свойств вкДНК в сравнении с яДНК, прежде всего, накопление в составе вкДНК ГЦ – богатых последовательностей, в частности, ТОрДНК, способствует предположению, что в эндоцитозе и в связывании фрагментов вкДНК принимают участие белки, которые входят в семейство «toll-like» рецепторов (TLR). Белки данного семейства играют важную роль в запуске ответа врожденной и приобретенной иммунной системы организма на патогены. Первой на вторжение патогенов реагирует 23 врожденная иммунная система. Сигнал опасности исходит от молекул патогенов - «молекулярные паттерны» - PAMP (pathogen-associated molecular pattern). Способность организма бороться с опасными патогенными микроорганизмами и вирусами заключается в активации TLR при контакте с PAMP различного происхождения. Сбои в системе регуляции активации TLR могут приводить к развитию многих заболеваний, включая рак, астму и атеросклероз. У человека гены TLR локализованы на хромосомах 1,3,4,9 и Х (рис.1). Рисунок 1. Схема локализации рецепторов TLR на клеточной мембране и внутри клетки (Majewska M. et al., 2006). 24 Рецепторы TLR можно условно разделить на три класса: 1 - распознающие липиды (TLR 1,2,4,6 и 10); 2 - распознающие белковые лиганды (TLR5 и TLR11); 3 – распознающие лиганды вирусной природы TLR (TLR3,7,8, и 9). TLR3 распознает двунитевые РНК, которые продуцируют многие вирусы при репликации. Однонитевую РНК вируса, а также синтетический аналог гуанозина распознают TLR7 и TLR8. TLR9 взаимодействует с ДНК бактериальной и неметилированными вирусной природы, ГЦ-мотивами. которые Большинство обогащены TLR находятся на поверхности клеточной мембраны (TLR 1, 2, 4, 5, 6). Рецепторы, распознающие нуклеиновые происхождения, кислоты располагаются вирусного внутри и клеток, бактериального где происходит идентификация лигандов и активация соответствующих сигнальных путей [Tobias et al., 2005]. Анализируя природу PAMP, активирующих рецепторы TLR, мы пришли к выводу, что ГЦ - богатые фрагменты вкДНК, которые накапливаются в биожидкости человека в норме и, особенно, при патологии, могут распознаваться белком TLR9, в связи с этим, данному рецептору мы уделили пристальное внимание. В основном TLR9 экспрессируется тканями, принимающими участие в иммунном ответе организма, такими как: лимфоузлы, костный мозг, селезенка и лейкоциты экспрессируются клетками периферической эндотелия крови. Данные [Martin-Armas et рецепторы al., 2006], кератиноцитами [Andersen et al., 2006; Lebre et al., 2006], клетками бронхиального эпителия [Mayer et al., 2007], кардиомиоцитами [Boyd et al., 2006] и стволовыми клетками. Также, линией клеток 3T3-F442A было доказано, что TLR9 экспрессируется и адипоцитами [Khazen et al., 2007]. 1.4.1.1 Лиганды для белков TLR9 В 1990-х годах американскими исследователями во главе с A. Krieg, обнаружена взаимосвязь между иммуностимулирующим действием ДНК на 25 B - клетки и присутствием в ДНК мотивов, содержащих неметилированные ГЦ-динуклеотиды [Krieg et al., 1995]. Иммуностимулирующую активность бактериальной ДНК обусловливает присутствие в ее составе неметилированных ГЦ-мотивов, в отличие от геномной ДНК позвоночных, которая содержит значительно меньше неметилированных ГЦ- динуклеотидов. ДНК или синтетические олигонуклеотиды, обогащенные неметилированными ГЦ-мотивами, и обладающие выраженным стимулирующим действием на иммунную систему, принято называть иммуностимулирующими ГЦ-ДНК. Также, несомненно, в роли лигандов для TLR9 могут выступать отдельные фрагменты вкДНК человека. При анализе последовательностей ТОрДНК выяснилось, что встречаемость ГЦ - повторов близка к бактериальной ДНК, тогда как количество ГЦ - повторов в геномной ДНК млекопитающих в 20 раз ниже, чем в последовательности ТОрДНК. Большинство ГЦ-повторов в ТОрДНК человека не метилировано. В пределах фрагмента ТОрДНК рибосомного повтора, содержащего 13 314 п.н., приходятся суммарно более ста мотивов TCGTCG и GTCGTT [Krieg et al., 1995], которые обеспечивают связывание ДНК с TLR9. Например, при анализе последовательностей ДНК в области нетранскрибируемого спейсера, которые по ГЦ-составу похожи на геномную ДНК, на 30 т.п.н. встречается около 30 аналогичных мотивов. Следовательно, ТОрДНК по составу повторяющихся последовательностей напоминает бактериальную ДНК, она обогащена ГЦ – повторами, способными взаимодействовать с TLR9. Кроме транскрибируемой области рДНК в составе геномной ДНК человека встречаются еще ГЦ – обогащенные неметилированные последовательности. К примеру, промоторная область многих генов включает неметилированные «ГЦ – островки» (они состоят в среднем из 1 т.п.о.), свойства которых сходны с ТОрДНК и они, возможно, накапливаются во вкДНК. 26 1.5 TLR9-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRFсигнальные пути TLR9 – это гликопротеидный трансмембранный рецептор I типа. У человека TLR9 включает в себя 1 032 аминокислоты. На N–конце полипептидной цепи содержится сигнальный пептид (остатки 1-25), это внеклеточный высоковариабельный фрагмент, который содержит повторы, обогащенные лейцином (LRR, leucine-rich repeat domain), также полипептидная цепь включает трансмембранный домен (остатки 819-836) и фрагмент, находящийся внутри клетки и содержащий высококонсервативную TIR (Toll-Interleukin (IL)-1 resistance) область. Именно TIR фрагмент отвечает на действие молекул сигнальных путей. Данный участок содержит сто пятьдесят аминокислот и включает три высококонсервативных домена. Инициация передачи сигнала через TLR9 происходит только при образовании комплекса белка TLR9 с ГЦ - ДНК. Одним из важных моментов в активации рецепторов, находящихся в эндосомах клетки (такие как TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9), является перемещение лигандов из внеклеточного пространства в эндосомы посредством эндоцитоза, либо совместно с вирусной инфекцией [Wagner et al., 2006]. К примеру, обработка in vitro ГЦ - олигонуклеотидами активирует TLR9-позитивные макрофаги и дендритные клетки. Стимулирующая активность теряется, когда цитозиновые остатки в олигонуклеотидах метилируются, либо инвертирован внутренний динуклеотид с CG на GC [Krieg, 2002]. Однако если данные олигонуклеотиды заключить внутрь липосом, которые способствуют сохранению комплекса лиганда с TLR9 и стимулируют эндосомальную транслокацию, то снова наблюдается индукция синтеза цитокинов, опосредуемая TLR9 [Yasuda et al., 2005; Wagner et al., 2006]. Во время образования комплекса внешнего фрагмента TLR, имеющего вид подковы, с лигандом, остальная часть молекулы белка подвергается изменениям, которые ведут к активации пути передачи сигнала от периферии 27 клетки к ядру. Домены белков TLR, локализованные внутри клетки, взаимодействуют только со свойственными именно им адаптерными белками. Сигнал к ядру клетки от периферии, передающийся посредством TLR, осуществляется при участии четырех адаптеров. Они включают последовательности, подобные TIR домену [Vogel et al., 2003] (рис. 2). Рисунок 2. Адаптеры, содержащие TIR область у млекопитающих Death, Мyr, Sam - терминальные домены адаптерных молекул. (Vogel et al., 2003). На схеме перечислены адаптерные молекулы в порядке их открытия: MyD88 (myeloid differentiation factor 88) - миелоидный фактор дифференцировки 88; TIRAP (TIR domain-containing adapter protein) – адаптерный белок, включающий TIR домен, иначе называемый Mal (MyD88 adapter-like) - MyD88-адаптер подобный белок; TRIF (TIR domain-containing adapter inducing interferon (IFN)-I) - адаптерный белок, включающий TIR домен, индуцирующий синтез интерферона I, или TICAM-1 (TIR domaincontaining adapter molecule-1) и TIRP (TIR-containing protein), или TRAM (TRIF-related adapter molecule), или TICAM-2 [Vogel et al., 2003]. Активируется MyD88 после взаимодействия рецептора с C-концевым TIR доменом и способствует передаче сигнала через DD домен (death domain) киназам семейства IRAK (IL-1R-associated kinase) на N-конце (рис.3). Многие TLR-зависимые ответы клеток врожденного иммунитета зависят от MyD88. Однако нокаутные мыши по MyD88 (MyD88 knockout mice) демонстрируют 28 сохранение эффекта активации TLR3 и TLR4, что говорит о существовании не зависимых от MyD88 путей передачи сигнала, несмотря на то, что у данных мышей клеточный ответ на CpG -ДНК через TLR9 остался полностью зависимым от MyD88 [Vogel et al., 2003]. Предположение о существовании как MyD88-зависимого, так и MyD88-независимого путей передачи сигнала подтвердили последующие работы. TIRAP/Mal обладает C-терминальным TIR доменом, однако у него отсутствует N-терминальный домен DD. Обнаружено, что при передаче сигнала TIRAP/Mal и MyD88 взаимодействуют друг с другом [Fitzgerald et al., 2001; Majewska et al., 2006], но в то же время, показано, что при передаче сигнала посредством рецепторов TLR5, 7, 8 и 9 TIRAP/Mal участия не принимает. Активация TRIF/TICAM-1, имеет место при передаче сигналов при участии рецепторов TLR3 и TLR4 [Hoebe et al., 2003; Oshiumi et al., 2003; Yamamoto et al., 2002]. TRIF/TICAM-1 – является более крупным белком в сравнении с MyD88 и TIRAP/Mal, он включает в состав 712 аминокислот, тогда как MyD88 - 296, и TIRAP/Mal включает в себя 235 аминокислот. TRIF/TICAM-1 приводит к активации NF-kB, но только активация TRIF/TICAM-1, в отличие от MyD88 или TIRAP/Mal, заканчивается экспрессией генов рецепторов ИФН типа I [Barchet et al., 2005; Li et al., 2005; Seya et al., 2005]. Обнаружено, что TRIF является обязательным для активации независимых от MyD88 путей передачи сигнала посредством TLR3 и TLR4 [Yamamoto et al., 2002; Basu et al., 2003; Jiang et al., 2003]. TRAM/TIRP/TICAM-2 обладают последовательностью, наиболее гомологичной TRIF/TICAM-1. TRAM/TIRP/TICAM-2 взаимодействует c TLR4, TIRAP и TRIF, однако не способен связываться с TLR3 [Bin et al., 2003; Fitzgerald et al., 2003; Oshium et al., 2003]. Среди разных TLR используются вариации перечисленных адаптеров [Vogel et al., 2003; Akira et al., 2004; Palsson-McDermott et al., 2004]. После активации рецепторов внутриклеточная передача сигнала ведет за собой 29 комплексообразование TIR домена с несколькими внутриклеточными адаптерами передачи сигнала [Tobias et al., 2005] (рис. 3). Рисунок 3. Путь передачи сигналов определенный для каждого TLR, ассоциированный между человеческими TLR и соответствующими адаптерами [Seya et al., 2005; Tobias et al., 2005]. Вероятно, что три адаптера используются не всеми TLR: TRIF, TRAM и Mal/ TIRAP/ TICAM-2. MyD88, четвертый, используется всеми TLR, исключая TLR3. Комбинация взаимодействия различных TLR с различными адаптерными молекулами активирует каскад киназ, что в конечном счете, ведет к активации комплекса определенных генов [Vogel et al., 2003]. MyD88 играет ключевую роль при прохождении сигнала через TLR9 при действии ГЦ- ДНК [Janssens et al., 2002; Tobias et al., 2005; Seya et al., 2005] (рис. 4). При активации TLR9 лигандом, MyD88 в комплексе с остальными адаптерами, типа Маl, действует на киназы семейства IRAK (IL1R-ассоциированных серин/треониновых протеинкиназ). В комплексе IRAK 1 ассоциирован с Toll-интерактивным белком (Tollip), MyD88, и TRAF6 (фактор некроза опухоли фактор 6). Фосфорилирование IRAK 4 инициирует 30 Рисунок 4. Сигнальные пути, активирующиеся при проведении сигнала через TLR9. MyD88 (myeloid differentiation factor 88 - миелоидный фактор дифференцировки 88) – адаптерная молекула, которая используется TLR9 для проведения сигнала; IRAK (IL-1R-associated kinase) и TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6) – киназный комплекс; (IRF-7 – interferon regulatory factor7) – регулирующий фактор транскрипционную активность гена интерферона; IKK-комплекс – IкB киназный комплекс, состоящий из трех субъединиц, включая киназы IKK-α, IKK-β, IKK-γ. Неактивная форма NF-kB локализована в цитоплазме, протеинкиназами - ингибиторы взаимодействует с гетеродимерами kB связанная (IkB): IkBα, с регуляторными IkBβ, IkBγ. IkBα р50 и р65. При активации NF-kB происходит отщепление ингибитора и перемещение из цитоплазмы в ядро гетеродимера, состоящего из субъединиц р50 и р65 [Tobias et al., 2005; Seya et al., 2005]. 31 фосфорилирование IRAK 1 с последующей диссоциацией киназного комплекса, но в тоже время с сохранением его связи с TRAF6 [Miggin1 et al., 2006]. Это приводит к активации TRAF6, сопровождаемой активацией и формированием сложного комплекса TAK1/TAB1/TAB2/TAB3 (TGF betaActivated Kinase 1/TAK1-binding protein 1/2/3). Активный комплекс TAK1/TAB, запускает последующую активацию IKK комплекса, который состоит из IKK-α, IKK-β, IKK-γ (регуляторных субъединиц - модуляторов, катализирующих фосфорилирование) [Fitzgerald et al., 2003]. Далее следует разделение в димерном комплексе IKK-α/ IKK-β с участием протеосомного пути (рис. 4), с последующей активацией IkB и транслокация NF-κВ в ядро, далее и активируется каскад MAPК (mitogenactivated protein kinase) – митоген-активированные протеинкиназы [Sharma et al., 2003; Li et al., 2013]. NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) – ядерный фактор «каппа-би», это универсальный фактор транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла. Он получил свое название из-за участия в регуляции экспрессии гена легкой цепи иммуноглобулина κ в В-клетках. В семействе NF-κB находятся пять видов белков: NF-κB1 (p50), NF-κB2 (p52), RelA (p65), RelB и c-Rel, которые образуют 15 комбинаций димеров. У всех белков семейства есть общий домен гомологии Rel, необходимый для образования белковых димеров, связывания ДНК с NF-κB, а также для связывания с IkB цитозольный ингибиторный белок. Активная форма NF-κB проявляется только в форме димера, наиболее распространённой формой является димер субъединиц p50 или p52 с субъединицей p65 [Fusco et al., 2009; Wier et al., 2012]. В цитоплазме субъединицы NF-κB находятся в неактивном состоянии в комплексе с ингибиторным белком IkB. Активация NF-κB обусловлена различными стимулами, включающими B- и T-клеточные митогены, цитокины (например TNF и IL1), продукты бактериальной и вирусной природы (лиганды рецепторов семейства TLR, например двухцепочечная 32 РНК вируса или липополисахарид) и факторы стресса (активная форма кислорода или ультрафиолет). Стимулирующий фактор запускает фосфорилирование IkB при действии киназы IKK (IkB-киназа), что ведет к деградации IkB под действием протеосомы 26S. Вследствие чего NF-kB освобождается из ингибирующего комплекса, перемещается в ядро и активирует транскрипцию контролируемых генов. NF-kB – это важная составляющая большинства сигнальных путей, активация которых ведет к быстрой индукции цитокинов, являющихся основными участниками регуляции воспалительного процесса, неспецифических и специфических механизмов защиты [Akira et al, 2003; Bonizzi et al, 2004]. Блокировать способность NF-κB связываться с ДНК и запускать транскрипцию генов может GR (англ. Glutathione reductase; глутатионредуктаза), взаимодействуя субъединицами NF-κB. Также в подавлении активности NF-κB может участвовать негативная регуляция посредством МАР-киназного сигнального пути, который ингибирует IKK-киназы, принимающие участие в активации NF-κB [Hayashi et al, 2001; Hayden et al, 2008]. Помимо этого глюкокортикоиды вызывают увеличение экспрессии белка IkBα, являющегося ингибитором NF-κB, что ведет к стабилизации, тем самым препятсвуя перемещению NF-κB в ядро. Классический NF-κB сигнальный путь является важной составляющей системы координирования экспрессии множества генов врожденной иммунной системы и воспаления, способствуя выживаемости клеток иммунитета при различных инфекциях или при острых воспалительных процессах [Palmer et al, 2008]. Активность MAPK обеспечивается киназами MAPK, MAP2K и MAP3K, посредством последовательного фосфорилирования белка, что ведет к активации p38 MAPK и киназы JNK (c-Jun N-terminal kinase) [Guillot et al., 2006], которые индуцируют представителей других классов факторов транскрипции – АР -1 (активирующий протеин 1) и Elk-1В [Beutler et al., 2002] (рис. 5). 33 Рисунок 5. Молекулярный каскад, запускаемый с рецепторов TLR в ходе иммунного ответа. IKK - IкB киназа; IRAK - IL-1 рецептор-ассоциированная киназа интерлейкина 1; MKK - митоген-активированная киназа; P фосфат. JNK (c-Jun N-концевые киназы) - стресс-активируемые протеинкиназы (SAPK), которые принимают участие в ответ на действие цитокинов, ультрафиолетового дифференцировке облучения, и апоптозе теплового и Т-лимфоцитов. осмотического Впервые JNK шока, в киназы идентифицированы по связыванию и фосфорилированию серина 63 и серина 73 траскрипционно-активационного домена белка c-Jun, входящего в состав транскрипционного фактора AP-1(активирующий протеин 1). JNK относится к семейству митоген - активируемых серин/треониновых протеинкиназ (поэтому JNK также называются MAPK8, MAPK9, MAPK10). 34 JNK киназы происходят из 3 генов JNK1, JNK2 и JNK3 и имеют 10 изоформ. JNK1 и JNK2 встречаются во всех клетках и тканях, тогда как JNK3 находится в основном в мозге, и в небольших количествах в сердце. JNK посредством фосфорилирования модифицируют активность некоторых белков, находящихся в митохондриях или в ядре. Таким образом JNK участвуют в регуляции различных функций клетки. JNK киназы могут регулировать воспаление, уровень активных форм кислорода (АФК) и различные стрессовые факторы. В результате активации p38 MAPK и киназы JNK транскрипционный фактор NF-κB освобождается из ингибирующего комплекса и перемещается в ядро, что ведет к экспрессии NO-синтазы, генов цитокинов и других регуляторных факторов воспаления [Kawai et al., 2006]. Вместе с тем, при активации TRAF и IRAK может быть инициирован выброс ИФН-альфа как следствие активации IRF-7 [Kawai et al., 2006]. В результате активируются все основные клеточные функции, связанные с представлением антигенов и развитием фагоцитоза, продукция активных форм кислорода, синтезируются NO, низкомолекулярные медиаторы воспаления и провоспалительные цитокины, включающие интерлейкины: IL-1, IL-6, IL-8, интерфероны I типа, фактор некроза опухоли, хемокины [Kawai et al., 2006; Windheim et al., 2008; Papantonis et al., 2012]. Также активируются цитокины, стимулирующие дифференцировку Тh1 лимфоцитов – интерлейкины: IL-12, IL-23, IL-27 [Akira et al., 2004; Kawai et al., 2006], что представляет собой своеобразный мостик к развитию специфической иммунной системы, которая распознает антигенные структуры микроорганизмов. Адаптер TIRAP/Mal в отличие MyD88 связывается с другими областями TIR, но действует как MyD88, вступая во взаимодействия с IRAK1, IRAK4 и TRAF6 [McGettrick et al., 2004]. Участие адаптера TIRAP/Mal обуславливает активацию факторов транскрипции NF-κB, но 35 которая блокируется экспрессией TIR MyD88, IκB суперрепрессором NF-κB и IRF (интерферон-регулирующими факторами) [Vogel et al., 2003]. В передаче сигнала, связанного с адаптерной молекулой TRIF/TICAM1, участвует TANK (TRAF-ассоциированный с активатором NF-κB)связанная киназа-1 (TBK1), мишенью которой являются факторы транскрипции IRF [Hemmi et al., 2004; Sun et al., 2004], поэтому экспрессия TRIF/TICAM-1 приводит к обычной активации ядерного фактора NF-κB и к экспрессии IRF-3, IRF-7 [Hardy et al., 2004]. В результате передачи возбуждения связанным с молекулярным адаптером по сигнальными путями, TRAM, происходит быстрая активация фактора транскрипции IRF-3 и отсроченная индукция NF-κB [Yamamoto et al., 2003]. Молекулярные адаптеры TRAM, TRIF, активируя фактор транскрипции IRF-3, вызывают продукцию интерферона-β, хемокинов (регулятора активации нормальной Т-клеточной экспрессии и секреции - RANTES) [Vogel et al., 2003]. MyD88 - независимый путь передачи сигнала, также активирует фактор транскрипции IRF-7 [Meylan et al., 2004]. 1.6 Роль цитокинов в организме Конечным событием активации TLR –зависимых сигнальных путей в клетке является продукция цитокинов [Veiko et al., 2000; Yao et al., 2009]. Цитокины - это белково-пептидные факторы, продуцируемые клетками, осуществляющие регуляцию взаимодействий на клеточном и межсистемном уровнях. Они стимулируют или ингибируют рост клеток, их дифференцировку, влияют на выживаемость клеток, действуют на функциональную активность и апоптоз клеток. Цитокины играют важную роль в развитии иммунного ответа в организме, обеспечивая взаимодействие между разными иммунокомпетентными клетками, также могут выступать в роли эффекторных молекул иммунных реакций. К цитокинам относятся: 36 интерлейкины, интерфероны, монокины, факторы некроза опухоли (ФНО), хемокины. Впервые цитокины были обнаружены в середине 1960-х годов в супернатанте культуры лимфоцитов. Выяснилось, что добавление супернатанта из одной культуры лимфоцитов в другую способно оказывать влияние на процессы метаболизма, созревания, пролиферации, и дифференцировки клеток. Цитокины обладают невысокой молекулярной массой 30 кД, в крови содержатся в незначительных концентрациях. Они вместе с клеткамипродуцентами и клетками-акцепторами формируют единую сеть, которая регулирует и контролирует взаимодействия между клетками как лимфомиелоидного комплекса, так и клетками других систем организма. Главные реакции цитокинов среди множества биологических эффектов, являются иммунные реакции, воспалительный ответ, регуляция гемопоэза, репаративные процессы в тканях. Их действие на клетки организма является антиген-неспецифическим, они способны воздействовать на любые клетки, содержащие соответствующие рецепторы. По механизму действия все цитокины можно разделить на следующие группы: - провоспалительные, отвечающие за мобилизацию воспалительного ответа (интерлейкины 1,2,6,8, ФНОα, интерферон γ); - противовоспалительные, сдерживающие развитие воспаления (интерлейкины 4,10, ТФРβ); - регуляторы гуморального и клеточного иммунитета — обладают собственными эффекторными функциями (противовирусными, цитотоксическими) [Симбирцев, 2004]. 1.6.1 Провоспалительные цитокины Продукция провоспалительных цитокинов приводит к формированию очага острого воспаления. Основными продуцентами провоспалительных 37 цитокинов выступают лимфоциты, моноциты, макрофаги, основными индукторами обычно липополисахарид выступают бактерий), а инфекционные также факторы агенты (например, воспаления (сами провоспалительные цитокины). Все эффекты, опосредуемые цитокинами, реализуются посредством связывания их со специфическими рецепторами, представленными на многих типах клеток. Опыты с рекомбинантными провоспалительными цитокинами показали, что их мишенями могут служить практически все органы и ткани, и они способны индуцировать не менее 50 различных биологических эффектов. При внедрении патогена продукция ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОα начинается в месте первого контакта клеток-продуцентов с микроорганизмами, таким образом первые проявления биологического действия цитокинов сводятся к активации местных защитных механизмов. За счет экспрессии своих собственных рецепторов в локальный воспалительный процесс быстро вовлекаются многие типы клеток, включая эндотелиоциты, фибробласты, все типы лейкоцитов. Цитокины повышают проницаемость кровеносных сосудов и обеспечивают направленную миграцию клеток в зону проникновения патогенов. Это происходит в результате повышения экспрессии на эндотелиальных клетках адгезинов под влиянием ИЛ-1, ФНОα, а также этих молекул на лейкоцитах крови. Одной из важных функций цитокинов в очаге воспаления является усиление фагоцитарной активности клеток и их микробицидных свойств. ИЛ-1, ФНОα, ИНФγ способны существенно повышать активность макрофагов, нейтрофилов. ФНОα, ИНФγ – индуцируют образование в нейтрофилах и макрофагах супероксидных форм кислорода, оксида азота и гипохлорной кислоты, которые обладают сильными антимикробными свойствами. Одна из ролей цитокинов в очаге воспаления связана с их возможностью продливать срок жизни клеток. Установлено, что ИЛ-1, ИНФγ, ИЛ-2 способны предотвращать апоптоз нейтрофилов и макрофагов, а будучи добавлены в культуральную среду этих клеток, удлиняют их жизнь в 38 2-3 раза. ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОα являются индукторами лимфоцитов, они способны активировать созреванию в Т-, эффекторные В-, НК-лимфоциты, клетки иммунного способствовать ответа их (Т-киллеры, плазматические клетки), стимулировать синтез специфических ростовых факторов для иммунокомпетентных клеток. ФНОα синтезируется преимущественно моноцитами, макрофагами и тучными клетками. Благодаря способности этого белка вызывать быструю некротическую регрессию некоторых опухолей, он получил название фактора некроза опухоли. Основным индуктором выработки ФНОα являются грамотрицательные бактерии, компонент их клеточной стенки ЛПС. Усиливается секреция ФНОα под влиянием ИНФ-гамма, продуцируемого Тнклетками. ФНОα способен стимулировать активность лейкоцитов, участвующих в воспалении, стимулирует продукцию цитокинов – ИЛ-1, ИЛ6, повышать экспрессию молекул адгезии на эндотелиальных клетках сосудов, что способствует повышенному прилипанию нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов к поверхности этих клеток, усиливает экспрессию молекул ГКГ на клетках, что способствует развитию клеточного иммунитета и цитолиза пораженных клеток [Wang et al., 2013]. ФНОα активирует систему свертывания крови, увеличивая синтез сывороточных белков в печени, способен подавлять деление стволовых клеток костного мозга. 1.6.2 Противовоспалительные цитокины Контроль над эффектами провоспалительных цитокинов осуществляют противовоспалительные цитокины – ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, ТФРβ. Они способны индуцировать синтез рецепторных антагонистов интерлейкинов (РАИЛ), подавлять транскрипцию генов провоспалительных цитокинов в клетках-продуцентах, усиливать образование растворимых рецепторов и посредством down-регуляции снижать плотность провоспалительных рецепторов на клетках. Так, ИЛ-4 и ИЛ-10 в моноцитах и макрофагах блокирует образование ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, подавляют продукцию ПГЕ2, 39 супероксидных и нитроксидных радикалов. ФНОα в лимфоцитах ингибирует синтез ИЛ-2, ИНФγ. Кроме того, ИЛ-10 угнетает антигенпредставляющую функцию АПК, активирует продукцию РАИЛ, снижает экспрессию на Тлимфоцитах ТКР и ИЛ-2Р, реакцию гиперчувствительности замедленного типа. ТФРβ обладает способностью подавлять пролиферативную и функциональную активность Т-лимфоцитов и НК-клеток. Интерлейкин 10 (ИЛ-10) относится к многофункциональным цитокинам и вырабатывается Тн2 и Тн3-клетками. ИЛ-10 способен угнетать активацию и эффекторные функции Т-клеток, НК-клеток, моноцитов и макрофагов и продукцию этими клетками ряда цитокинов, в частности ИЛ12, ФНОβ, в том числе и провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ФНОα, ИНФγ [Sun et al., 2012]. Все вышеизложенное говорит о том, что баланс между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами является важным моментом в регуляции иммунного ответа организма, и от него во многом зависит характер течения болезни и ее исход. Цитокиновый дисбаланс является основой для развития хронических воспалительных заболеваний, кроме того, баланс цитокинов в воспалительный период определяет форму иммунного ответа, будет ли это преимущественно клеточный или гуморальный иммунный ответ. Анализ литературных данных показал, что свойства вкДНК, выделенной из биожидкостей организма, значительно отличаются от свойств геномной ДНК. Показано, что в составе вкДНК накапливаются ГЦ-богатые последовательности генома. Отмечено, что концентрация вкДНК значительно повышается при патологических состояниях и может быть использована в качестве количественного маркера гибели клеток в организме. Но как изменение свойств, в частности накопление ГЦ-богатых последовательностей в составе вкДНК, может повлиять на клетки организма. ГЦ-богатая вкДНК обладает стимулирующим 40 действием на клетки организма, реализуемое посредством взаимодействия с рецепторами TLR9. Однако, эксперименты проводились с использованием вирусной и бактериальной ДНК, а также синтетических олигонуклеотидов. Геномная ДНК не оказывает стимулирующее или подавляющее действие на клетки организма, но данный вывод был сделан при исследовании ДНК, которая была выделенна из клеточных ядер. Анализ литературы показал, что на данный момент нет работ, анализировавших действие вкДНК или отдельных ее фрагментов, выделенных из организма, на клетки. Таким образом, на данный момент накоплено большое количество данных о структуре, методах обнаружения и происхождении внеклеточной ДНК. В то же время, многие вопросы до сих пор остаются нерешенными, в том числе и механизмы ее влияния на клетки и возможные последствия такого воздействия. Дальнейшие исследования эффектов, производимых действием вкДНК на клетки, позволит приблизиться к решению вопроса о ее функциях в организме, что не только даст представление о новом способе взаимодействия между клетками, но и поможет грамотнее подходить к проблеме диагностического и, возможно, терапевтического ее применения. 41 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток Мультипотентные стволовые клетки могут быть обнаружены во многих тканях, в том числе и в любой мезенхимальной ткани [Azzam et al., 2003]. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обладают способностью под действием специфических индукторов давать начало мезодермальным клеточным линиям, поддерживать и регулировать гемопоэз, поддерживать гомеостаз в пределах ниши стволовых клеток, а также участвовать в репарации поврежденных тканей [Pevsner-Fischer et al., 2007]. Легко доступными для выделения МСК являются три ткани: строма костного мозга, мезенхима пуповинного канатика и строма жировой ткани. Существуют литературные данные о том, что МСК, полученные из этих тканей, одинаковы по следующим характеристикам: фибробластоподобная морфология, иммунный фенотип, успешность выделения, частота образования колоний и дифференцировочный потенциал. В то же время, процедура получения МСК из жировой ткани гораздо проще и менее болезненна, чем из костного мозга. Помимо этого, количество МСК в 1г жировой ткани в 500 раз больше, чем в 1г стромы костного мозга [Mizuno, 2009]. Процедура получения и выделения клеток из пуповины также вызывает определенные затруднения; к тому же, есть данные о том, что дифференцировочный потенциал таких клеток ниже, чем у мезенхимных стволовых клеток жировой ткани (МСКЖТ). К тому же, некоторые авторы полагают, что МСКЖТ быстрее пролиферируют и медленнее стареют, чем другие типы МСК [Locke et al., 2009]. Поэтому на данный момент именно на МСКЖТ возлагаются основные надежды в плане использования их в регенеративной медицине. Стандартная процедура выделения МСКЖТ из липоаспирата выглядит следующим образом: ткань отмывается от клеток крови, обрабатывается коллагеназой, фильтруется и центрифугируется. 42 Осадок после центрифугирования представляет собой стромально-васкулярную фракцию. Однако в такой фракции, помимо собственно МСКЖТ, находятся эндотелиоциты, гладкомышечные клетки, перициты, фибробласты, а также циркулирующие клетки крови, такие как лейкоциты, гемопоэтические стволовые клетки или предшественники эндотелия. Некоторые авторы полагают, что из всех этих типов клеток только МСКЖТ адгезивны к пластику, поэтому в конечном счете культура очищается. Об этом можно судить по уменьшению в популяции экспрессии гемопоэтических маркеров (таких как CD34). Однако подобными свойствами обладают и фибробласты, поэтому некоторые авторы высказывают сомнения по поводу того, можно ли полученную таким образом культуру считать чистой. Для очищения культуры обычно используют иммуномагнитную сепарацию с антителами к CD45 (удаляется лейкоцитарно-гемопоэтическая фракция клеток) и CD31 (удаляются эндотелиальные предшественники) [Locke et al., 2009]. В культуре МСКЖТ отличаются высоким уровнем пролиферации. Обычно популяция МСКЖТ удваивается за 2-4 дня в зависимости от возраста донора, типа жировой ткани, локализации жировой ткани в организме, условий операции, плотности культуры и условий культивирования [Mizuno, 2009]. Пролиферация может быть стимулирована с помощью различных факторов, включая FGF-2 (действует через активацию JNK-киназы), PDGF (также через JNK-киназу) или онкостатин М (через активацию MEK – microtubule-associated protein kinase, ERK – extracellular signal-regulated kinase и JAK/STAT1-сигнального пути) [Mizuno, 2009]. Для МСКЖТ также характерна активная секреция. Они выделяют ростовые, анти-апоптотические и ангиогенные факторы, такие как VEGF (vascular endothelial growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), FGF-2, IGF1 (insulin-like growth factor), а также М-КСФ и ГМ-КСФ [Locke et al., 2009]. Уровень секреции может регулироваться гипоксией, другими ростовыми факторами, факторами дифференцировки или ФНО-α [Mizuno, 2009]. Стимуляция ангиогенеза происходит скорее за счет индукции пролиферации 43 в эндотелии, чем за счет дифференцировки в эндотелиоциты самих МСКЖТ [Locke et al., 2009]. МСКЖТ экспрессируют характерные маркеры: CD29, CD90 и CD105 [Ishimura et al., 2008], а также CD44, CD49d и Oct-4 [Zhang et al., 2010]. Помимо этого, постоянно на высоком уровне детектируются CD49d, CD63, CD73. CD34 экспрессируется в начале существования первичной культуры, однако, теряется впоследствии [Locke et al., 2009]. Поскольку содержание МСК в тканях составляет доли процента, работа с ними подразумевает необходимость выделения и размножения клеток in vitro. Получение МСК из жировой ткани связано с необходимостью ферментативной обработки, поскольку популяция МСК заключена в плотный межклеточный матрикс. Методическая проблема состоит также в необходимости элиминации клеток других тканей, контактирующих с МСК. Однако при подборе оптимальных условий культивирования сопутствующие клетки элиминируются в ходе последующих пассажей. Используемые нами мезенхимальные стволовые клетки были получены из жировой ткани операционного материала больных с аденокарциномой молочной железы, доставленного из РОНЦ РАМН в течение часа после резекции опухоли. Образец был механически измельчен в среде ДМЕМ (“ПанЭко”, Москва), содержавшей 250 мкг/мл гентамицина, 60 Ед/мл пенициллина и 60 Ед/мл стрептомицина (“ПанЭко”). Ферментативную диссоциацию проводили в среде ДМЕМ, инкубируя препарат в присутствии 10%-ой эмбриональной телячьей сыворотки (“PAA”, Австрия), 0.04%-ой коллагеназы (“Sigma”) и тех же антибиотиков в течение 16 часов при 370C. Затем клетки центрифугировали (10 мин, 200g), перенесли в слайд-флаконы и культивировали при 370С в среде AmnioMax С-100 Basal Medium (“Gibco”), содержавшей AmnioMax Supplement C-100, 20 мкмоль/л HEPES (“Пан/Эко”) и антибиотики. Визуально оценивали морфологию клеток с использованием фазовоконтрастного микроскопа (рис. 6а). Кроме того, культуры мезенхимальных 44 стволовых клеток при достижении субконфлюэнтности (70% монослоя) фиксировали изопропанолом и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Клетки культуры МСК имели характерную фибробластоподобную морфологию (рис. 6б). Рисунок 6. а - культура мезенхимальных клеток жировой ткани. Фотография сделана с использованием фазово-контрастного микроскопа, увеличение Х 250, б – культура мезенхимальных клеток жировой ткани после окрашивания кристаллическим фиолетовым. Фотография получена с использованием светового микроскопа, увеличение Х 100. Чтобы подтвердить корректность используемого способа получения МСК, для одной из культур проведен анализ экспрессии поверхностных белков. 2.1.2 Исследование экспрессии клетками поверхностных белков Экспрессию клетками поверхностных белков проводили методом проточной цитофлуориметрии. Монослой клеток переводили в суспензию при помощи раствора Версена и промывали буферным раствором для окрашивания: фосфатно-солевой буфер (ФСБ), содержащий 1% фетальной сыворотки и 0,1% азида натрия. Окрашивание клеток проводили в том же буферном растворе с использованием антител, меченных флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (РЕ) (“Becton Dickinson”, США) в 45 течение 1 ч при 4°С. В качестве негативного контроля были использованы изотипические антитела, меченные определенными флуоресцентными красителями того же производителя. После инкубации клетки отмывали 2 раза в 1 мл буферного раствора для окрашивания и фиксировали 2%-ным раствором параформальдегида. Анализ проводили на проточном цитофлюориметре “FACSAria” (“Becton Dickinson”); данные обрабатывали с использованием программы “WinMDI”. 2.2 Определение концентрации повторяющейся последовательности ДНК человека в крови Концентрацию повторяющейся последовательности генома человека определяли методом количественной дот-гибридизации с биотинилированными зондами. Перед нанесением проб фильтры Hybond C («Amerscham») смачивали буфером А (0,15 М цитрат натрия, 1,5 М NaCl, рН 7,0) и высушивали на воздухе. К 10 мкл пробы вкДНК приливали 1,5 мкл 1 М раствора NaOH. Пробы тщательно перемешивали и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. После чего к пробе добавляли 8,5 мкл 4 М раствора ацетата аммония. По 1,5 мкл каждой пробы наносили на фильтры Hybond C («Amersham»). При учете возможной неоднородности гибридизации по поверхности фильтра, каждый образец ДНК наносили в 3-5 точках от края фильтра к центру. Иммобилизовали ДНК путем прожаривания 1,5-2 ч при 80°С. Это производилось для предотвращения смывания образца ДНК с фильтра во время гибридизации и при последующих операциях. После прожарки фильтр смачивали в растворе 2×SSC (3,0 М хлорид натрия, 1,5 М лимоннокислый натрий, рН 7,0). Переносили фильтр на стекло, покрытое гидрофобной пленкой, и наслаивали сверху тонкий слой буфера Б (2,5- ти кратный раствор Денхарда: 2,5 нг/мл BSA; 2,5 нг/мл фикол; 2,5 нг/мл ПВП; 0,05 М фосфат натрия, рН 7,4; 0,65М NaCl; 50% формамид). Фильтры, покрытые блокирующим буфером, помещали в термостат на 1-1,5 ч. при 42°С. 46 Для определения количества ТОрДНК использовали зонд pHRGВВ-28S (порядковый номер нуклеотидов 9346-10783, HSU 13369, GeneBank) [Вейко и соавт., 1996]. В параллельных пробах для сравнения определяли количество СатIII (субфрагмента сателлита III человека, локализованого в прицентромерном районе 1q12) с помощью зонда pRt301[Томилин и соавт., 1984]. Отбирали в полипропиленовые пробирки на 2 мл по 20 мкл ДНКзонда, каждый зонд – в свою пробирку. Добавляли в каждую пробирку по 1 мкл 1 М раствора NaOH. Тщательно перемешивали. Помещали пробирки на 4 мин в кипящую водяную баню, добавляли 2 мл буфера Б, содержащем 5% декстрансульфата, после чего пробирки сразу же охлаждали. Фильтры доставали из термостата, удаляли остатки буфера Б, осторожно переносили на другое стекло, покрытое гидрофобной пленкой. Сверху на фильтр осторожно наносился слой буфера, содержащий ДНК-зонд. Каждый зонд наносился на свой фильтр. Биотинилирование зондов осуществляли с использованием фотореагента N-(4-азидо-2-гидроксибензоил)-1,7- диаминогептан (уксуснокислая соль). Гибридизацию с денатурированными (0,05M NaОН при 99оС в течение 4мин.) биотинилированными зондами (50 нг/мл) проводили в буфере Б, содержащем 5% декстрансульфата при 420С в течение 20 часов. Отмывка фильтров производилась в 2 смены по 10 мин в растворе, содержащем 2×SSC и 0,1×SDS, при комнатной температуре. Затем фильтры помещали в раствор для отмывки фильтров 2, содержащий 0,2×SSC и 0,1%SDS. Отмывка производилась при 60°С в течение 10 мин. После этого фильтры 15 мин выдерживают в блокирующем буфере для нитроцеллюлозы (0,1% обезжиренного молока, 0,1% желатина, 0,05 М Трис-НСl, рН 7,5, 0,1 М NaCl). В 10 мл раствор АР (0,05 М Трис-НСl, рН 7,5, 0,1 М NaCl, 0,005М MgCl2) добавляли 7 мкл конъюгата стрептавидин - щелочная фосфатаза («Sigma», США) для выявления биотина. Фильтры размещали на стекле, покрытом гидрофобной пленкой, и наслаивали приготовленный раствор. Фильтры выдерживали при комнатной температуре в течение 10 мин. Отмывка фильтров производилась в две смены по 10 мин в растворе АР (рН 47 7,5). Пока готовился раствор субстратов, фильтры на короткое время помещали в раствор АР (0,05 М Трис-НСl, рН 9,5, 0,1 М NaCl, 0,005М MgCl2) для выравнивания рН. Для приготовления субстратов в 10 мл буфера АР (рН 9,5) добавляли 33 мкл BCIP в присутствии 44 мкл NBT, который образует нерастворимый осадок («Sigma», США). Фильтры размещали на гидрофобной поверхности и сверху аккуратно наносили раствор субстрата. Оставляли до проявления гибридизационного сигнала при комнатной температуре (2-3 ч). Фильтры промывали деионизированной водой и слегка подсушивали на фильтровальной бумаге. Интенсивность окраски пятен (гибридизационный сигнал) определяли при помощи компьютерного анализа изображения фильтра программой «Images» (ИнтерЭВМ, Москва). Стандартным образцом при построении калибровочной зависимости, которая связывает количество последовательности в пробе и уровень гибридизационного сигнала, выступала ДНК донора, для которой ранее было определено содержание анализируемой последовательности в геноме [Вейко Н.Н. и соавт., 2003]. Стандартная ошибка вычислялась по формуле, которая учитывает погрешность измерения гибридизационного сигнала данного образца ДНК и погрешность построения калибровочной кривой [Дерффель, 1994]. Средняя ошибка метода во всех опытах составляет (5±2)% от измеряемой величины. 2.3 Конструирование плазмиды п(рДНК) В качестве модельных фрагментов CpG–ДНК генома человека использовали CpG – богатый фрагмент транскрибируемой области рибосомного повтора ДНК - фрагмент с 515 по 5321 в соответствии с HSU13369, GeneBank, встроенный в плазмиду pBR322 (п(ТОрДНК)). В качестве АТ – обогащенной ДНК использовали фрагмент 1,77 сателлита III (СатIII) - участок 1q12, хромосомы 1, также встроенный в вектор pBR322 (p(satIII)). ДНК E. coli выделяли из штамма MG 1655 методом фенольной экстракции, затем добавили 100 мкл лизирующего буфера (10%-ый 48 лаурилсаркозилат натрия, 0,1 М ЭДТА) и 10 мкл РНКазы А (75 мкг/мл), полученную смесь инкубировали при 37°С 1 час, после чего добавляли к каждому образцу 20 мкл раствора протеиназы К (200мкг/мл) и инкубировали препараты в течение 24 часов при 37°С. Добавляли к каждому образцу равный объем насыщенного фенола. Центрифугировали образцы при 8000 g в течение 5 мин. В новую пробирку отбирали супернатант, добавляли равный объем насыщенного фенола и вновь центрифугировали образцы при 8000 g в течение 5 мин, после чего добавляли ацетат аммония (2 М) и осаждали ДНК 0,8 объемами изопропанола при -20°С. ДНК отделяли центрифугированием, промывали 75%-ым водным раствором спирта, затем ДНК растворяли в 30 мкл воды. Все пробы ДНК дополнительно очищали от липополисахаридов: поочередно обрабатывали тритоном Х-114 и проводили гельфильтрацию на носителе HW-85. МСК культивировали в присутствии п(ТОрДНК) (50 нг/мл), п(СатIII) (50 нг/мл), ДНК Е.coli (50 нг/мл) в течение 3 часов при 37°С. Результаты были подтверждены в трех независимых экспериментах и на трех различных культурах МСК человека. 2.4 Выделение РНК из мезенхимальных стволовых клеток Выделение РНК из МСК проводили с помощью стандартной методики с использованием наборов YellowSolve (Клоноген, Санкт - Петербург). К 3-5 млн. клеток добавляли 1 мл лизирующего раствора YellowSolve, перемешивали, далее добавляли 200 мкл хлороформа («Химмед», Россия, 6766-1) и изоамилового спирта (“Sigma-Aldrich”, Германия, W205702) (25:1), перемешивали и выдерживали 20 мин при -200С, затем центрифугировали (10 мин, 14 тыс. об/мин). К супернатанту, содержащему РНК, добавили одинаковый объем смеси GгееnСlеаn («Клоноген», Россия, K0800), энергично встряхивали смесь 2-3 минуты и центрифугировали (10 мин, 14 тыс. об/мин). РНК осаждали 2,5 объемами изопропанола (-200С, 12ч) с добавлением 1/5 части насыщенного раствора ацетата аммония, осадок промывали 75%-ым водным раствором этанола и растворяли в 50 мкл 49 стерильной воды, обработанной DEPC («Силекс», Россия, DW0202). Выделенную РНК хранили при температуре -70°С. 2.4.1 Обработка выделенной РНК ДНКазой Для дополнительной очистки выделенной РНК проводили ДНКазный гидролиз с помощью реагентов фирмы “Силекс” (Россия). К пробе РНК объемом 45 мкл добавляли 5 ед ДНКазы (без РНКазной активности) и 5 мкл ДНКазного буфера (x10): 100 mM Трис-HCl, pH 7.5 / 25oC, 100 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 и оставляли на 20 минут при температуре 22 °С. Реакцию останавливали кратковременным прогреванием при температуре 95ºС. Для удаления ДНКазы после обработки препарата использовали сорбент BlueSorb (“Силекс” (Россия)). Качество выделенной РНК оценивали с помощью гель-электрофореза в 1%-ом агарозном геле. В результате была выделена стабильная РНК без примесей продуктов гидролиза РНК. 2.4.2 Определение концентрации РНК Определение люминесцентном концентрации спектрометре полученной «LS 55» РНК проводили («PerkinElmer», на Англия). Концентрацию РНК измеряли, используя РНК-связывающий краситель Quant-iTTM RiboGreen RNA reagent (MoBiTec), возб487 нм, флу524 нм. Развели 1:2000 краситель в буфере ТЕ (0,01 М Tris HCl, pH=7,5; 0,001 M ЭДТА), отобрали 2 мл полученного раствора, добавили 5 мкл раствора РНК, измерение флуоресценции проводили в течение одной минуты. Нормировали полученные значения по числу клеток, из которых была выделена РНК. Наиболее точным методом оценки количества клеток в культуре является измерение концентрации ДНК. 2.5 Выделение ДНК из мезенхимальных стволовых клеток Выделение ДНК мезенхимальных стволовых клеток проводили из интерфазы, образующейся на первом этапе при выделении РНК. К интерфазе 50 (на границе раздела водной и органической фазы), добавили 100 мкл лизирующего буфера (10%-ый лаурилсаркозилат натрия, 0,1 М ЭДТА) и 10 мкл РНКазы А (75 мкг/мл), полученную смесь инкубировали при 37°С 1 час, после чего добавляли к каждому образцу 20 мкл раствора протеиназы К (200мкг/мл) и инкубировали препараты в течение 24 часов при 37°С. Добавляли к каждому образцу равный объем насыщенного фенола. Центрифугировали образцы при 8000 g в течение 5 мин. В новую пробирку отбирали супернатант, добавляли равный объем насыщенного фенола и вновь центрифугировали образцы при 8000 g в течение 5 мин, после чего добавляли ацетат аммония (2 М) и осаждали ДНК 0,8 объемами изопропанола при -20°С. ДНК отделяли центрифугированием, промывали 75%-ым водным раствором спирта, затем ДНК растворяли в 30 мкл воды. 2.5.1 Определение концентрации ДНК Определение флуориметрически концентрации на приборе полученной Hitachi MPF-2A, ДНК проводили используя ДНК- связывающий краситель Hoechst 33258 (возб 350 нм, флу450 нм). Приготовили раствор красителя Hoechst 33528 (0,2 мкг/мл) в буфере (0,05 М Tris HCl, pH 7,4, 0,5 М NaCl, 1мМ ЭДТА), отобрали 2 мл полученного раствора, добавили 5 мкл раствора ДНК, измерение флуоресценции проводили в течение одной минуты. За основу фоновых значений сигнала использовали флуоресценцию образца ДНК, подвергшегося исчерпывающему гидролизу ДНКазой 1. Ошибка метода измерения концентрации ДНК составляет 2±5%. 2.6 Постановка полимеразцой цепной реакции 2.6.1 Проведение реакции обратной транскрипции Получали кДНК путем проведения обратной транскрипции, используя реактивы фирмы «Силекс» (РФ), стандартным методом. К РНК (0,2–1 мкг) добавили случайные гексапраймеры («Силекс», Россия, D0300) 1 мкл (0,5 51 нг), доводили до объема 20 мкл водой, свободной от РНКаз. После кратковременного центрифугирования смесь инкубировали при температуре 70°С в течение 5 минут. После охлаждения добавили 2,5 мкл 10-кратного по концентрации буфера (700 мМ Tris-HCl pH 8,3, 166 мМ (NH4)2SO4, (“SigmaAldrich”, Германия, А4418), 75 мМ MgCl2)), 4 мкл 1,5 мМ раствора дезоксирибонуклеотидов («Силекс», Россия, N1101) и 2 мкл раствора MMLV обратной транскриптазы («Силекс», Россия, Е1211), доводили водой, свободной от РНКаз, до объема 20 мкл, затем смесь инкубировали при температуре 25°С в течение 10 мин и следующие 60 мин при температуре 37°С в амплификаторе ДНК МС2 («ДНК-технология», Россия). Прекращали течение реакции при помощи прогревания 70°С в течение 10 мин. Визуализацию результата обратной транскрипции проводили, используя агарозный гель-электрофорез ДНК в 1%-ом агарозном геле. Выделенную кДНК хранили при температуре -70°С. Контролировали концентрацию кДНК, измеряя ее флуориметрически. 2.6.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени Использовали метод ПЦР в реальном времени по принципу TaqMan, прибор Rotor Gene 300 ("Corbett Research”, Австралия). Готовили реакционную смесь объемом 25 мкл, включающую: 1,5 мкл кДНК, 4 мкл 1,5 мМ раствора нуклеотидов; 2,5 мкл буфера (700 мМ Tris-HCl, pH 8,6; 166 мМ сульфата аммония, 35 мМ MgCl2); 0,3 мкл раствора F-праймеров и 0,3 мкл раствора R-праймеров («Синтол», Россия) (таб. 1); 0,3 мкл 2 ед Taqполимеразы («Силекс», Россия, Е0121), 0,2 мкл Х100 раствора SyBR Green. Отжиг праймеров при температуре 58°С. Постановка ПЦР-реакции при следующих условиях: после денатурации (при температуре 95°С в течение 5 мин) следовали 45 циклов амплификации в режиме: 20 сек – при 95°С, 30 сек – 58°С, 30 сек – 72°С, далее 5 мин при 72°С. Количество мРНК оценивали, используя программное обеспечение 52 прибора. Для подтверждения результатов проводили несколько независимых опытов на трех культурах клеток, ошибка метода составляла 2%. В качестве гена внутреннего стандарта использовали ТВР (TATAA-box binding protein) и GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). Для первичного скрининга TLR-сигнального пути использовали наборы «TollLike Receptor Signaling Pathway PCR Array» (SA Biosciences, PAHS-018). В последующих экспериментах использовали праймеры «IDT» (США), «Синтол» (Россия). Таблица 1. Список используемых праймеров. TBP GAPDH TLR1 TLR2 TLR3 TLR5 TLR6 TLR7 TLR9 Ifng TNFα IL8 IL10 F GCC-CGA-AAC-GCC-GAA-TAT R CCG-TGG-TTC-GTG-GCT-CTC-T F GAA-GGT-GAA-GGT-CGG-AGT-C R GAA-GAT-GGT-GAT-GGG-ATT-TC F ATT-TCA-AAC-GTG-AAG-CTA-CAG-GG R CCG-AAC-ACA-TCG-CTG-ACA-ACT F GGC-CAG-CAA-ATT-ACC-TGT-GTG R AGG-CGG-ACA-TCC-TGA-ACC-T F AAG-AGT-TTT-CTC-CAG-GGT-GTT-TT R CAG-ATT-CCG-AAT-GCT-TGT-GTT-TG F TGC-CTT-GAA-GCC-TTC-AGT-TAT-G R CCA-ACC-ACC-ACC-ATG-ATG-AG F GAA-GAA-GAA-CAA-CCC-TTT-AGG-ATA-GC R AGG-CAA-ACA-AAA-TGG-AAG-CTT F TTA-CCT-GGA-TGG-AAA-CCA-GCT-ACT R TCA-AGG-CTG-AGA-AGC-TGT-AAG-CTA F TGA-AGA-CTT-CAG-GCC-CAA-CTG R TGC-ACG-GTC-ACC-AGG-TTG-T F GGC-ATT-TTG-AAG-AAT-TGG-AAA-G R TTT-GGA-TGC-TCT-GGT-CAT-CTT F CAG-CCT-CTT-CTC-CTT-CCT-GAT R GCC-AGA-GGG-CTG-ATT-AGA-GA F ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC R AACCCTCTGCACCCAGTTTTC F AAG-GCG-CAT-GTG-AAC-TCC-C 53 M4K4 TIR Myd88F JNK (MAPK8) JUN R ACG-GCC-TTG-CTC-TTG-TTT-TC F GAG-CCA-CAG-GTA-CAG-TGG-TC R AAG-CCT-TTT-GGG-TAG-GGT-CAG F ATG-GTG-GCT-TTC-GTC-AAG-TCA R TCA-GAT-ACT-GTA-GCT-GAA-TCC-CG F GGC-TGC-TCT-CAA-CAT-GCG-A R TGT-CCG-CAC-GTT-CAA-GAA-CA F AGA-AGC-TAA-GCC-GAC-CAT-TTC R TCT-AGG-GAT-TTC-TGT-GGT-GTG-A F TCC-AAG-TGC-CGA-AAA-AGG-AAG R CGA-GTT-CTG-AGC-TTT-CAA-GGT 2.7 Иммуногистохимия Клетки фиксировали в 3%-ом растворе формальдегида 20 минут при комнатной температуре, промывали в PBS и затем пермеабилизировали в растворе 0,1% тритона X-100 («Sigma») в буфере PBS 15 минут при комнатной температуре. 2.7.1 Связывание антител с NF-kB Клетки блокировали с 0,5% BSA в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали в течение ночи при 4°С с антителами к p65 NFkB (3038-100, «BioVision»). После промывания в растворе PBS – 0,1% Triton, клетки инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с вторичными антителами к мышиному IgG, меченными FITC. 2.7.2 Связывание антител с TLR9 Связывание антител с TLR9 анализировали с помощью антител к TLR9, меченных флуоресцирующим красителем фикоэритрином – PE-antiTLR9 (eB72-1665, «eBioscience», США). Клетки после фиксации и пермеабилизации (описанным выше способом) обрабатывали антителами к TLR9 30 мин в темноте. 54 Клеточные препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. Количество антиген-позитивных клеток определяли как % флуоресцирующих клеток при просматривании, по крайней мере, 30 полей каждого клеточного препарата за вычетом % флуоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. 2.8 Иммуноферментный анализ секреции цитокинов Клетки культивировали с п(рДНК) (50 нг/мл), супернатант собирали через 3 и 24 ч. Секрецию цитокинов – интерлейкина 10 (ИЛ-10) и фактора некроза опухоли (ФНО или TNF) определяли с помощью наборов для иммуноферментного анализа (ИФА) («Cytokine», С.-Петербург, Россия). 2.8.1 Иммуноферментный анализ секреции цитокина IL-10 Набор реактивов “ИФА-IL-10” предназначен для количественного определения интерлейкина-10 человека в исследуемых образцах методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Интерлейкин-10 это провоспалительный продуцируется цитокин с молекулярной SAC-активируемыми массой В-клетками, 18 кДа. Он LPS-активируемыми моноцитами, и активированными Т-клетками. In vitro интерлейкин-10 угнетает продукцию цитокинов IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, GM-CSF, M-CSF, IL12. Определение интерлейкина-10 имеет особое значение при исследовании механизмов воспалительного процесса. В наборе «IL-10» используется «сэндвич» вариант иммуноферментного анализа. Для этого используется два моноклональных антитела с разной эпитопной специфичностью к IL-10. Одно из которых находится на твердой фазе – внутренняя сторона лунок, второе – конъюгировано с биотином. Первая стадия анализа – IL-10, который содержится в исследуемых и калибровочных образцах, взаимодействует с антителами, находящимися на твердой фазе - внутренняя поверхность лунок. Вторая стадия – IL-10 взаимодействует с антителами, меченными биотином. Количество IL-10 в 55 исследуемых образцах прямо пропорционально количеству связанного коньюгата. На завершающей стадии в лунки вносим авидин-пероксидазу. В течении инкубации в субстратной смеси раствор в лунках окрашивается. Насыщенность окраски раствора прямо пропорциональна количеству связанных меченых антител. Измеряя оптическую плотность раствора в лунках, можно рассчитать концентрацию IL-10 в анализируемых образцах, на основании калибровочной кривой. Подготовка реагентов: При подготовке калибровочных проб, во флаконы добавили дистиллированную воду по 100 мкл, выдержали 20 мин, далее хорошо перемешали до растворения содержимого полностью. Для подготовки промывочного буфера в 480 мл дистиллированной воды добавили содержимое флакона с маркировкой «Буфер Р», тщательно перемешали. Приготовили необходимый объем одноразового раствора антител анти IL-10 -биотин на нужное количество стрипов. Из расчета на один стрип смешивали концентрированный раствор антител 40 мкл с промывочным буфером 1 мл. Раствор должен быть использован в течение часа. Также в зависимости от количества анализируемых образцов приготовили необходимый объем однократного раствора коньюгата авидин-пероксидаза, для этого смешивали концентрированный раствор коньюгата 40 мкл с промывочным буфером 1 мл из расчета для одного стрипа. Раствор также должен быть использован в течение часа. Проведение анализа: Сначала вносили во все лунки по 100 мкл «буфера А», далее в течение 15 мин внесли по 100 мкл калибровочных и исследуемых образцов. Инкубировали стрипы в течение 2 часов при температуре 37°С, периодически встряхивая. После завершения инкубации удалили содержимое лунок, после промыли их три раза, используя 250 мкл промывочного буфера, приготовленного ранее. При каждом промывании тщательно удаляли остатки жидкости. Далее добавляли во все лунки по 0,1 мл раствора антител, 56 приготовленного, как описано выше. Инкубировали стрипы при температуре 37°С в течение 1 часа, периодически встряхивая. По окончании инкубации лунки промыли три раза, используя 250 мкл промывочного буфера. Далее внесли во все лунки раствор коньюгата авидин-пероксидазы по 100 мкл, приготовленного ранее. Инкубировали стрипы в течение 30 мин при температуре 37оС, периодически встряхивая. После завершения инкубации лунки промыли три раза, используя по 250 мкл промывочного буфера. Перед окраской, для того, чтобы удалить не связавший конъюгат, ополоснули стрипы дистиллированной водой. За несколько минут до окончания последнего инкубирования, приготовили субстратную смесь: в субстратный буфер из флакона с маркировкой «буфер С», внесли необходимый объем раствора тетраметилбензидина из флакона с маркировкой “ТМБ”. Тщательно перемешали и держали в темном месте перед использованием. Далее добавили во все лунки субстратную смесь 100 мкл и в течение 20 мин выдерживали стрипы в темноте. Затем внесли во все лунки «стоп-реагент» 50 мкл для того, чтобы остановить ферментную реакцию, встряхивая на шейкере в течение 10 мин. Анализировали уровень секреции цитокинов на спектрофлуориметре («EnSpire reader», Финляндия) при длине волны 450 нм. Коэффициент вариации результатов десяти измерений IL-10 одного и того же образца при использовании набора не более 10%. Минимальная концентрация IL-10 в анализируемых образцах, которую набор определяет достоверно, составляет 5 пг\мл (рис. 7). Все образцы и стандарты были измерены дважды. После сбора супернатанта, подсчитывали количество оставшихся клеток с использованием цитометрии. Значения экспрессии цитокинов нормированы на число клеток и представлены как среднее значение ± SD. 57 1,8 1,6 1,56 1,4 ОD 450 1,2 1 0,82 0,8 0,6 0,44 0,4 0,2 0 0,2 0,11 0,04 0 200 400 600 pg/ml Рисунок 7. Характерный вид графика определения содержание IL-10 в пробах по калибровочным данным. 2.8.2 Иммуноферментный анализ секреции цитокина TNFα Набор реактивов «TNFα» предназначен для количественного определения фактора некроза опухоли человека в исследуемых образцах методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В наборе TNFα используется «сэндвич» вариант иммуноферментного анализа. Для этого используется два моноклональных антитела с разной эпитопной специфичностью к TNFα. Одно из которых находится на внутренней стороне лунок – твердая фаза, второе – конъюгировано с биотином. Первая стадия анализа – TNFα, который содержится в исследуемых и калибровочных образцах, взаимодействует с антителами, находящимися на твердой фазе – внутренняя поверхность лунок. Вторая стадия – TNFα взаимодействует с антителами, меченными биотином. Количество TNFα в исследуемых образцах прямо пропорционально количеству связавшегося коньюгата. На завершающей стадии в лунки вносили коньюгат стрептавидин-пероксидазу. Во время инкубации с субстратной смесью раствор в лунках окрашивается. Насыщенность окраски раствора прямо пропорциональна количеству связанных меченных антител. Измеряя оптическую плотность раствора в лунках, рассчитывали концентрацию TNFα в анализируемых образцах, на основании калибровочной кривой. 58 Подготовка реагентов: При подготовке калибровочных проб, во флаконы добавили дистиллированную воду по 100 мкл, выдержали 20 мин, далее хорошо перемешали до растворения содержимого полностью. Для подготовки промывочного буфера в 480 мл дистиллированной воды добавили содержимое флакона с маркировкой «Буфер Р», тщательно перемешали. Приготовили необходимый объем одноразового раствора антител антиTNFαбиотин в зависимости от количества используемых стрипов. Из расчета на один стрип смешивали концентрированный раствор антител 40 мкл с промывочным буфером 1 мл. Раствор должен быть использован в течение часа. Также в зависимости от количества анализируемых образцов приготовили необходимый объем стрептавидин-пероксидазы, для однократного раствора коньюгата этого смешивали концентрированный раствор коньюгата 40 мкл с промывочным буфером 1 мл из расчета для одного стрипа. Раствор также должен быть использован в течение часа. Проведение анализа: Сначала вносили во все лунки по 100 мкл «буфера А», далее в течение 15 мин внесли в лунки по 100 мкл калибровочных и исследуемых образцов. Инкубировали стрипы в течение 2 часов при температуре 37оС, периодически встряхивая. После завершения инкубации удалили содержимое лунок, после промыли их три раза, используя по 0,3 мл промывочного буфера, приготовленного ранее. При каждом промывании тщательно удаляли остатки жидкости. Далее добавляли во все лунки по 0,1 мл раствора антител, приготовленного, как описано выше. Инкубировали стрипы при температуре 37оС в течение 1 часа, периодически встряхивая. По окончании инкубации лунки промыли три раза, используя 300 мкл промывочного буфера. Далее внесли во все лунки раствор коньюгата стрептавидин-пероксидазы 100 мкл, приготовленного ранее. Инкубировали стрипы в течение 30 мин при температуре 37оС, периодически встряхивая. После завершения инкубации лунки промыли три раза, используя по 300 мкл промывочного буфера. Перед 59 окраской, для того, чтобы удалить не связавший конъюгат, ополоснули стрипы дистиллированной водой. За несколько минут до окончания последнего инкубирования, приготовили субстратную смесь: в субстратный буфер из флакона с маркировкой «буфер С», внесли необходимый объем раствора тетраметилбензидина из флакона с маркировкой “ТМБ”. Тщательно перемешали и держали в темном месте перед использованием. Далее добавили во все лунки субстратную смесь 100 мкл и в течение 20 мин выдерживали стрипы в темноте. Затем внесли во все лунки «стоп-реагент» 50 мкл для того, чтобы остановить ферментную реакцию, встряхивая на шейкере в течение 10 мин. Анализировали уровень секреции цитокинов на спектрофлуориметре («EnSpire reader», Финляндия) при длине волны 450 нм. Коэффициент вариации результатов десяти измерений TNFα одного и того же образца при использовании набора не более 10%. Минимальная концентрация TNFα в анализируемых образцах, которую набор определяет достоверно, составляет 1 пг\мл (рис. 9). 3,5 3 2,9 ОD 450 2,5 2 1,55 1,5 1 0,839 0,5 0,394 0,204 0,086 0 0 100 200 300 pg/ml Рисунок 8. Характерный вид графика определения содержание TNFα в пробах по калибровочным данным. Все образцы и стандарты были измерены дважды. После сбора супернатанта, подсчитывали количество оставшихся клеток с использованием цитометрии. Значения экспрессии цитокинов нормированы на число клеток и представлены как среднее значение ± SD. 60 2.9 Определение активности каспазы 3 Активность каспазы 3 определяли с помощью флуоресцирующего субстрата Z-DEVD-AFC (Molecular Probes Europe BV, Netherlands). Реакцию проводили при 33°С в течение 1 часа в буфере: 50мМ НЕРЕS 7,5, 10% сахарозы, 10мМ ДТТ, 0,1% CHAPS, 25мкМ Z-DEVD-AFC. Флуоресценцию измеряли на приборе «Perkin Elmer LS55» (США), при λвозб =400нм, с λ эм =490 нм. Активность относили к количеству ДНК в анализируемой пробе. 2.10 Статистическая обработка результатов Полученные результаты были подтверждены в трех независимых экспериментах на трех культурах клеток. На рисунках показаны усредненные значения и стандартное отклонение (SD). Достоверность различий анализировали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. 61 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 3.1 Рецепторы, отвечающие на действие ГЦ-богатой внеклеточной ДНК Ранее предполагалось, что геномная внеклеточная ДНК не оказывает влияние на клетки организма. Из-за малого содержания неметилированных CpG– повторов в геноме и наличия последовательностей иммуносупрессоров, был сделан вывод, что геномная ДНК не обладает иммуностимулирующим действием. Данные выводы были сделаны при действии ДНК, выделенной из клеток организма, на клетки животных и клеточные культуры человека [Stacey et al., 2003]. Однако показано, что вкДНК организма значительно отличается от геномной ДНК по ряду свойств: вкДНК сильно обогащена CpG -повторами [Suzuki et al., 2008; Ermakov et al., 2008], аналогично бактериальной ДНК. Так, содержание ГЦ – богатой последовательности генома - транскрибируемой области рибосомного повтора (ТОрДНК) в составе вкДНК в несколько раз превышает содержание этого повтора в геномной ДНК [Костюк и др., 2008]. Но в то же время в составе внеклеточной ДНК отмечается снижение содержания АТ – богатых последовательностей [Fan et al., 2008]. Возможная схема их накопления выглядит следующим образом: из здоровых или поврежденных клеток организма при апоптозе и некрозе или в составе фракции метаболической ДНК высвобождаются фрагменты ДНК и поступают в кровоток. Там они подвергаются гидролизу до моно- и олигонуклеосомных фрагментов под действием ДНКазы1. Элиминация этих фрагментов осуществляется в основном с помощью двух механизмов: почечной фильтрации и захвата клетками. Известно, что ГЦ-богатые последовательности более устойчивы к ДНКазному гидролизу, чем АТбогатые. Данная устойчивость к гидролизу может быть объяснена тем, что ГЦ-богатые последовательности значительно более устойчивы к двойным разрывам цепи, которые возникают вследствие накопления однонитевых разрывов в ДНК при нуклеазном гидролизе или химическом воздействии, по 62 сравнению с АТ-богатыми последовательностями. Что способствует выявлению ГЦ-богатых фрагментов в биожидкости, даже при активном нуклеазном гидролизе. [Вейко Н. Н., Спитковский Д.М., 2000]. Возможная причина такого явления – ГЦ-богатая рДНК, содержащая однонитевые разрывы и обладающая повышенной температурой плавления. По этой причине ГЦ-богатые последовательности остаются более длинными и хуже выводятся почками, и, следовательно, накапливаются в кровотоке. Основную часть этой ГЦ-богатой ДНК составляют повторы рибосомного гена ТОрДНК (рис. 9). Рисунок 9. Гипотетическая схема, объясняющая накопление фрагментов CpG-ДНК в составе вкДНК. Фрагменты вкДНК, как известно, присутствуют в плазме крови человека в норме. При патологических состояниях их концентрация значительно повышается. Показано, что происходит накопление вкДНК в 63 плазме крови пациентов с различными заболеваниями, такими как инфаркт миокарда, атеросклероз, коронарная сердечная недостаточность. Была выявлена повторяющаяся последовательность генома в плазме – транскрибируемая область рибосомного повтора (ТОрДНК) человека (хромосомы 13, 14, 15, 21 и 22), она представлена в геноме в количестве 300– 700 копий [Вейко Н.Н. и соавт., 2003]. Последовательность ТОрДНК устойчива к двунитевым разрывам и накапливается в плазме больных ревматоидным артритом [Вейко и соавт., 2006]. Измерение количества рДНК во вкДНК проводили методом количественной дот-гибридизации. Использовали зонд для ТОрДНК pHRGRR-28S, содержащий клонированный фрагмент гена 28S рРНК. Содержание рДНК в геномной ДНК равно 1,8 ± 0,2 пг/нг, что было принято за единицу, далее брали выборку пациентов с различными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, инфаркт миокарда, артериальная гипертензия, атеросклероз, коронарная сердечная недостаточность и выборка здоровых доноров (где N – количество исследованных образцов). Было выявлено, что при патологических состояниях содержание в плазме крови вкДНК значительно увеличивается: при ревматоидном артрите содержание рДНК во вкДНК в среднем составляет 4,5 ± 0,2 пг/нг, N=14; при инфаркте миокарда содержание рДНК во вкДНК в среднем составляет – 9,9 ± 0,1 пг/нг, N=7; при артериальной гипертензии содержание рДНК во вкДНК в среднем составляет – 10,1 ± 0,2 пг/нг, N=64; при атеросклерозе содержание рДНК во вкДНК в среднем составляет – 16,2 ± 0,2 пг/нг, N=30; при коронарной сердечной недостаточности содержание рДНК во вкДНК в среднем составляет – 18,2 ± 0,1 пг/нг, N=18 (рис. 10). 64 Рисунок 10. Содержание генов рибосомных повторов (рДНК) во вкДНК по сравнению с содержанием рДНК в геномной ДНК (гДНК) здоровых людей и при различных заболеваниях. Измерение количества рДНК во вкДНК проводилось методом нерадиоактивной количественной дот-гибридизации, относительные единицы - содержание рДНК в гДНК (1,8 ± 0,2 пг / нг). N – количество исследованных образцов крови. По критерию Манна-Уитни различия между содержанием рДНК во всех образцах вкДНК и гДНК статистически достоверны (р <0,05). Увеличение содержания во вкДНК фрагментов СрG-ДНК оказывает влияние на клетки организма. Определено, что ТОрДНК в составе внеклеточной ДНК обладает сильным стимулирующим действием на лимфоциты периферической крови человека [Костюк и др., 2008] и на кардиомиоциты крыс [Bulicheva et al., 2007]. Обнаружено, что активирующее действие ТОрДНК на клетки иммунной системы опосредуется через белки семейства «Toll-like» рецепторов, обозначаемые как TLR9 [Ermakov et al., 2011; Veiko et al., 2006]. Известно, что данные белки крайне важны в координации врожденной и приобретенной иммунной системы [He et al., 2009]. TLR активируются при контакте с молекулами патогенов различного происхождения, что является основным этапом в возможности организма 65 противостоять патогенам и вирусам. TLR могут узнавать не только экзогенныe патогены, но и патогены эндогенной природы, появляющиеся при повреждении тканей, дегенерации и асептическом воспалении [Takagi et al., 2011; Ermakov et al., 2009]. К эндогенным лигандам TLR9 также относят фрагменты ДНК погибших в процессе апоптоза и некроза клеток [Goulopoulou et al., 2012; Ii et al., 2012]. Стимуляция TLR9 приводит к передаче сигнала через эти рецепторы, активации адаптерных молекул, регуляции экспрессии каскада костимуляторных молекул и активации транскрипции генов, что сопровождается выбросом провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1 β, IL-6, IL-12, IL-18 [Chi et al., 2006] и хемокинов. Мы предполагаем, что мезенхимальные стволовые клетки, попадая в очаг повреждения, могут контактировать с фрагментами вкДНК и могут быть вовлечены, в частности, в регуляцию иммунных ответов посредством активации TLR9 эндогенными лигандами [Malinovskaya et al., 2010; Raicevic et al., 2010]. В связи с этим необходимо определить характер воздействия фрагментов вкДНК на физиологическую активность МСК. Для этого мы смоделировали in vitro ситуацию, когда эндогенные МСК, мигрирующие из ниши в очаги повреждения, или мезенхимальные стволовые клетки, введенные в организм с целью терапии, «встречаются» с ГЦ-богатой вкДНК, которая содержит сайты – лиганды TLR9. Нами была исследована активация TLR9 сигнального пути и связанных с ним NFkВ-, JNK/p38-, IRF- cигнальных путей в МСК при взаимодействии с ГЦ-богатыми ДНК. 3.1.1 Определение экспрессии мРНК TLR9 в мезенхимальных стволовых клетках, при действии на них вкДНК, модельной п(рДНК) и ДНК Е.coli Поскольку содержание МСК в тканях составляет доли процента, работа с ними подразумевает необходимость выделения и размножения клеток in vitro. Получение МСК из жировой ткани связано с необходимостью 66 ферментативной обработки, поскольку популяция МСК заключена в плотный межклеточный матрикс. Методическая проблема состоит также в необходимости элиминации клеток других тканей, контактирующих с МСК. Однако при подборе оптимальных условий культивирования сопутствующие клетки элиминируются в ходе последующих пассажей. Используемые нами мезенхимальные стволовые клетки были получены из жировой ткани операционного материала больных с аденокарциномой молочной железы, доставленного из РОНЦ РАМН в течение часа после резекции опухоли. Чтобы подтвердить корректность используемого нами способа выделения МСК, для одной из культур проведен анализ экспрессии поверхностных белков (табл. №2, рис. 11). Таблица 2. Маркеры гемопоэтических стволовых клеток, определенные методом проточной цитофлюориметрии. Маркеры Гемопоэтических клеток Gp105-120 Leukocyte antigen CD34 common CD45 HLA-DR HLA-ABC + CD44 + ICAM-1 CD54 VCAM CD106 +/- (low) +/- (low) Молекулы ГКГ (главного комплекса гистосовместимости) Молекулы адгезии HCAM Рецепторы к факторам роста endoglin Интегрины и другие маркеры - CD105 c-kit CD117 β1 integrin CD29 + α2β1 integrin CD49b +/- (low) Thy-1 CD90 + 67 Рисунок 11. Уровень экспрессии клетками 2289-С интегрина β1 (СD29). По оси ординат – количество регистрируемых событий (клеток). По оси абсцисс уровень – интенсивность флюоресценции. Красный профиль – флюоресценции опытного образца. Черный профиль – изотипический контроль. Цифры – геометрическое среднее специфической флюоресценции. Было показано, что на поверхности МСК присутствуют молекулы ГКГ (главного комплекса гистосовместимости) (табл. 2): HLA-ABC +, молекулы адгезии:CD44 +, CD54 (low), CD106 + , интегрины CD29 +, CD49b (low), CD90 +, рецепторы к факторам роста: CD105 (low), но отсутствуют маркеры гемопоэтических клеток CD34 -, CD45 -, HLA-DR – и маркер к CD117 -. Полученный профиль характерен для МСК. Кроме того, клетки в присутствии соответствующего индуктора дифференцировались в адипоциты. В поисках рецептора, способного связывать внеклеточную ДНК, мы остановились на TLR9. Известно, что он экспрессируется в различных клетках организма и связывает бактериальную СрG-ДНК внутри эндосом. Нами исследовано влияние образцов вкДНК (50 нг/мл, 3 часа), полученных из плазмы крови больных и здоровых доноров, на экспрессию мРНК в мезенхимальных стволовых клетках (рис. 12). 68 Рисунок 12. Уровень экспрессии гена TLR9 при культивировании МСК в присутствии гДНК, вкДНК больных и здоровых доноров, модельных фрагментов (п(рДНК) и п(СатIII)) и ДНК E. сoli (концентрации добавляемых фрагментов 50 нг/мл, время воздействия 3 часа). Количественное измерение кДНК TLR9 проводился методом ПЦР в реальном времени на приборе StepOnePlusTM Real-Time PCR System ("Applied Biosystems"). Приводятся средние значения для N образцов добавляемой ДНК (гДНК и вкДНК) и для трех независимых экспериментов с модельной ДНК. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). ВкДНК больных раком молочной железы, инфарктом миокарда и ревматоидным артритом повышает экспрессию TLR9 в 2-3 раза (p < 0.05). ВкДНК здоровых доноров статистически значимо не влияла на экспрессию TLR9 (рис 12). Активация TLR9 обусловлена наличием в составе вкДНК лигандов TLR9 - ГЦ-богатых неметилированных последовательностей, накапливающихся во вкДНК. Одна из таких последовательностей транскрибируемая область рибосомного повтора (ТОрДНК). 69 В дальнейшем нами было исследовано действие на МСК ГЦобогащенной ДНК, которая моделирует ТОрДНК (50нг/мл, 3 часа). Плазмида п(рДНК), содержит CpG – богатый фрагмент транскрибируемой области рибосомного повтора ДНК в векторе pBR322. Исследованы свойства полученной модельной конструкции – плазмида CpG – рДНК обогащена неметилированными ГЦ-богатыми последовательностями, которые накапливаются во вкДНК, при нуклеазном гидролизе устойчива к двунитевым разрывам. Она включает сайты связывания с рецепторами TLR9 и может выступать в качестве лиганда этого рецептора. Вектор pBR322 содержит помимо сайтов связывания с рецепторами TLR9 [Tomchuck et al., 2008] и последовательности - супрессоры TLR9 ((G)n), которые могут конкурентно ингибировать действие лигандов. Для сравнения использовали плазмиду п(СатIII). Вставка п(СатIII) обогащена АТ–ДНК (область 1q12 1-й хромосомы человека), которая не содержит ни лигандов, ни супрессоров TLR9. В п(СатIII) использовался такой же вектор pBR322, чтобы исключить его влияние на МСК в составе п(рДНК). В качестве положительного контроля использовали ДНК Е.coli в концентрации 50 нг/мл, которая является известным лигандом, взаимодействующим с рецепторами TLR9 [Malinovskaya et al., 2010]. При действии фрагментов п(рДНК) и ДНК Е.coli на МСК наблюдается увеличение количества мРНК TLR9 в 3,0 и в 2,9 раза соответственно по отношению к контролю (p < 0.05), п(СатIII) не оказывает влияния на экспрессию гена TLR9 (рис. 12). Таким образом, влияние вектора pBR322 в составе п(рДНК) на активацию TLR9 минимально. Изменения в транскрипционной активности генома мы оценивали, измеряя общее количество клеточной РНК в присутствии фрагментов ДНК. Обнаружилось, что наибольшее возрастание транскрипционной активности генома происходит при действии п(ТОрДНК) и п(СатIII) – соответственно в 1,6 (P=0,99; t=14,9>2,4) и в 1,5 (P=0,99; t=12,5>2,4) раза. ДНК E.coli стимулирует синтез РНК в МСК, но несколько в меньшей степени, чем 70 фрагменты, присутствующие в эндогенной вкДНК – в 1, 3 раза (P=0,99; t=8,5>2,4) (рис. 13а). Полученные результаты были подтверждены с помощью метода нерадиоактивной количественной гибридизации суммарной РНК с зондами, содержащими фрагменты 18SрРНК и 28рSРНК. Считается, что из двух основных рРНК (28S и 18S) 28SрРНК лучше всего отражает целостность пула мРНК. Отмечается ее высокое содержание в пробе суммарной РНК (в 10 мкг пробы суммарной РНК в среднем содержится 6 мкг 28SрРНК и 2 мкг 18SрРНК). Экспрессия генов рРНК менее подвержена воздействиям, влияющим на степень представленности мРНК. Было показано, что в случае стимуляции МСК п(ТОрДНК) и п(СатIII) статистически значимо повышается концентрация 28рРНК – соответственно в 1,55 (P=0,99; t=13,6>2,4) и в 1,76 (P=0,99; t=17,8>2,4) раза. ДНК E.coli также повышает уровень 28РНК в 1,3 раза (P=0,99; t=8,5>2,4) (рис. 13б). Также для подтверждения корректности метода была проверена целостность выделенной РНК (рис. 14). Рисунок 13. а - Концентрация РНК (отн. ед.) в МСК при действии фрагментов вкДНК (ТОрДНК и СатIII) и ДНК E.coli. б - Количество 28SрРНК (отн. ед.), полученное методом нерадиоактивной количественной 71 гибридизации. * – средние значения достоверно различаются по t-критерию (P=0,99; t>2,4). Рисунок 14. Анализ целостности РНК. Фотография выделенных фрагментов РНК МСК в 1% агарозном геле. 1 – РНК, полученная из интактных МСК, 2 - после действия ДНК E.coli, 3 и 4 - после культивирования МСК с фрагментами вкДНК – п(СатIII) и п(ТОрДНК) соответственно. Таким образом, на модельной системе мы показали, что при контакте МСК как с CG-ДНК, так и с АТ-ДНК значительно повышается транскрипционная активность генома. При воздействии на МСК фрагментов экзогенной ДНК E.coli уровень транскрипции возрастает не столь значительно (в 1,3 раза, а для ряда культур остается неизменным, либо статистически недостоверно снижается). Возможно, это связано с тем, что фрагменты экзогенной бактериальной ДНК и эндогенной вкДНК вызывают экспрессию разных генов и активируют различные сигнальные пути в МСК. 72 3.2 ИССЛЕДОВАНИЕ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ, АКТИВИРУЮЩИХСЯ В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ В ОТВЕТ НА ДЕЙСТВИЕ ФРАГМЕНТОВ п(рДНК) 3.2.1 Кинетика изменения во времени экспрессии мРНК TLR9 и адаптера TLR-сигнального пути – MyD88 в ответ на стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК) МСК экспрессируют все известные рецепторы семейства TLR. Поэтому мы предположили, что изменения в функциональной активности МСК в присутствии проб ДНК происходят с участием TLR9 - сигнального пути. Для того чтобы ответить на вопрос, активируется ли TLR9-сигнальный путь при действии фрагментов вкДНК, мы исследовали количество мРНК TLR9 и адаптера TLR-сигнального пути – MyD88 в ответ на стимуляцию МСК фрагментами п(ТОрДНК) и п(СатIII) и ДНК Е.coli (50 нг/мл, 3часа) методом ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) в варианте TaqMan. Мы исследовали кинетику изменения количества мРНК TLR9 и адаптера TLRсигнального пути – MyD88 в ответ на стимуляцию МСК фрагментами п(рДНК). Экспрессия TLR9 возрастает через 20 мин после добавления в среду п(рДНК), достигает максимума через 1 час (4,2 раза) а к 3 суткам падает до контрольных значений (рис. 15). Полученные для мРНК TLR9 данные подтвердились при исследовании динамики накопления белка TLR9 в МСК методом проточной цитофлуориметрии (рис. 16 А,Б,В). Для визуализации TLR9 использованы антитела, меченные фикоэритрином - PE-anti-TLR9 (рис. 16 Б). Нестимулированные МСК включают три типа клеток. Большинство клеток не содержит белка TLR9 (TLR9-). Примерно 20% клеток экспрессируют очень низкие количества TLR9 (TLR9low). И только около 6% клеток экспрессируют большие количества белка (TLR9+). Содержание субпопуляции клеток с высоким уровнем экспрессии TLR9 возрастает в 4,2 раза после 1,5 часов культивирования МСК в присутствии п(рДНК) и 73 Рисунок 15. Динамика накопления мРНК TLR9 и MyD88 во времени при инкубации МСК в присутствии GC-богатых фрагментов - п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. падало через 3,5 часа воздействия (рис. 16 В). Таким образом, при действии п(рДНК) (50 нг/мл, 1 час) мы обнаружили синхронное увеличение количества клеток TLR9+ и увеличение количества мРНК TLR9. Первичный ответ МСК на действие CpG-ДНК, обусловленный стимуляцией TLR9, реализуется благодаря субпопуляции клеток TLR9+, которая составляет примерно 25% от всей клеточной популяции МСК, стимулированных п(рДНК). Геномная ДНК, в отличие от CpG-ДНК, снижала количество TLR9+ клеток. Экспрессия адаптера MyD88 в МСК при действии п(рДНК) повторяет динамику роста экспрессии TLR9, однако, смещена во времени. Количество мРНК MyD88 повышается и достигает максимума к 3 часам (4,6 раза), сохраняется на максимальном уровне в течение 24 часов и снижается через 3 дня (рис. 15). 74 Рисунок 16. Определение уровня белка TLR9 в МСК с помощью антител к TLR9, меченных флуоресцентным фикоэритрином. А – Данные флуоресцентной микроскопии (увеличение 100). Б – Данные проточной цитофлуориметрии. Область R – фракция клеток, экспрессирующих TLR9. В – Динамика накопления во времени (в области R) МСК, экспрессирующих TLR9 при добавлении п(рДНК) и гДНК (50 нг/мл). 75 Таким образом, ГЦ-обогащенная вкДНК больных людей и модельный фрагмент - п(рДНК) стимулируют увеличение экспрессии TLR9 в той же степени, что и природный лиганд ДНК Е.coli. Поскольку экспрессия адаптера MyD88 повышается позже, чем TLR9, 24 часа является оптимальным временем воздействия п(рДНК) на МСК для изучения молекул TLR-сигнального пути и путей, связанных с активацией TLR. Были использованы “SABiosciences' Pathway-Focused Arrays” для первичного скрининга экспрессии генов TLR - пути, активирующихся в МСК в ответ на добавление п(рДНК). Выявлены гены, отвечающие повышением количества мРНК в МСК при действии п(рДНК), экспрессия этих генов была исследована в серии отдельных экспериментов на трех культурах МСК, экспрессирующих одинаковые поверхностные маркеры. 3.2.2 Aктивация NFkB -, JNK/p38-, IRF- сигнальных путей в ответ на стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК) После связывания лиганда TLR образуют гомо- и гетеродимеры и передают сигнал внутрь клетки посредством гомотопического связывания TIR-TIR с одним из TIR-содержащих адаптерных белков (MyD88, TRIF/TICAM-1, TIRAP/MAL и TRAM/TICAM-2/TIRP) или с комбинацией этих белков. Все TLR, за исключением TLR3, который передает сигнал через TRIF, используют один и тот же сигнальный путь и MyD88 в качестве адаптера [Akira et al., 2003]. Передача сигнала через TLR осуществляется посредством ряда процессов, главный из которых - обратимая ковалентная модификация путем фосфорилирования и убиквитинирования. Для всех TLR сигнальный путь начинается с IRAK и белков семейства TRAF. Далее сигнал передается на киназы промежуточного уровня, такие как ТAK-1 и TBK1/IKKi, что приводит к активации сигнальных путей через МAР-киназы (JNK, р38 и ERK), IRF (а именно, IRF-3, IRF-5, и IRF-7) и NFkB [Suzuki et al., 76 2008; Akira et al., 2003] (рис. 17), что сопровождается повышением экспрессии генов и синтезом цитокинов и хемокинов. Рисунок 17. Схема проведения сигнала по TLR-сигнальным путям. Мы обнаружили изменение экспрессии генов адаптеров TLRсигнального пути в МСК в ответ на добавление п(рДНК). Количество мРНК MYD88, TIRAP, HSPD1, MAP2K возрастает в 5-9 раз, количество мРНК TICAM2, SARM1, TOLLIP, HRAS, HSPA1A и MAPK8IP3 повышается в 2-3,5 раза. Незначительно, в 1,4 раза увеличивается экспрессия генов PELI1 и RIPK2 (табл. №3, рис. 18). 77 Таблица №3. Стимуляция TLR -сигнального пути в МСК при добавлении в среду культивирования п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. TLR-сигнальный путь (50 нг/мл п(рДНК) 24 ч) Адаптеры Эффекторы MYD88 5.20 ± 0.26 TRAF6 2.62 ± 0.13 TIRAP 8.06 ± 0.40 FADD 1.90 ± 0.10 SARM1 1.90 ± 0.10 IRAK1 1.90 ± 0.10 TICAM2 1.90 ± 0.10 IRAK2 1.38 ± 0.07 TOLLIP 1.90 ± 0.10 UBE2N 2.62 ± 0.13 HRAS 3.61 ± 0.18 UBE2V1 1.90 ± 0.10 HSPA1A 2.62 ± 0.13 EIF2AK2 3.61 ± 0.18 HSPD1 9.06 ± 0.45 NR2C2 1.38 ± 0.07 MAPK8IP3 1.90 ± 0.10 PPARA 4.98 ± 0.25 CD14 1.90 ± 0.10 MAP3K7 1.38 ± 0.07 HMGB1 1.90 ± 0.10 MAP3K7IP1 1.90 ± 0.10 PELI1 1.38 ± 0.07 RIPK2 1.38 ± 0.07 Рисунок 18. Динамика накопления мРНК адаптеров TLR-сигнального пути во времени при инкубации МСК в присутствии ГЦ-богатых фрагментов 78 п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. На рисунке указаны гены, показавшие наибольшее изменение экспрессии по сравнению с необработанным контролем (р <0,05). Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на разных культурах МСК. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения. Повышается также экспрессия генов эффекторов TLR-сигнального пути. Мы обнаружили увеличение количества мРНК генов EIF2AK2, PPARA в 3,5 – 5 раз. Экспрессия генов TRAF6, UBE2N повышается в 2 раза. В 1,5-2 раза возрастало количество мРНК FADD, IRAK1, MAP3K7IP1, IRAK2 и IRAK1 (табл. №3, рис. 19). Рисунок 19. Динамика накопления мРНК эффекторов TLR-сигнального пути во времени при инкубации МСК в присутствии GC-богатых фрагментов п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. На рисунке указаны гены, показавшие наибольшее изменение экспрессии по сравнению с необработанным контролем (р <0,05). Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на разных культурах МСК. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения. 79 При действии п(рДНК) на МСК мы наблюдали активацию генов NFkB - сигнального пути. Количество мРНК MAP3K1, MAP4K4, NFKB1A, REL возрастало в 3,5 – 5,5 раз, мРНК IKBKB, RelA (p65), NFRKB в 2 – 3 раза, мРНК NFKB1 и NFKB2 в 1,4 раза (табл. №4, рис. 20). Таблица №4. Стимуляция NF-kB -сигнального пути в МСК при добавлении в среду культивирования п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. NF-kB-сигнальный путь (50 нг/мл п(рДНК) 24 часа) NFKBIA 3.61 ± 0.18 NFRKB 1.90 ± 0.10 REL 4.98 ± 0.25 RELA 2.62 ± 0.13 MAP3K1 3.61 ± 0.18 MAP4K4 5.47 ± 0.05 IKBKB 1.90 ±0.10 TNFα 1.90 ± 0.06 TNFRSF1A 2.62 ± 0.13 IL1B 1.90 ±0.10 IL8 2.62 ± 0.13 IL10 9.06 ±0.05 80 Рисунок 20. Динамика накопления мРНК NF-kB - сигнального пути во времени при инкубации МСК в присутствии ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. На рисунке указаны гены, показавшие наибольшее изменение экспрессии по сравнению с необработанным контролем (р <0,05). Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на разных культурах МСК. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения. Таким образом, ГЦ-богатые последовательности ДНК, накапливающиеся в составе вкДНК, повышают экспрессию большинства генов молекул, участвующих в проведении сигнала через TLR-сигнальный путь, что сопровождается транслокацией в ядро фактора транскрипции NFkB, повышая экспрессию генов NF-kB- сигнального пути. Последовательное фосфорилирование киназ активировало в МСК JNK/p38- сигнальный путь. Количество мРНК FOS, MAP2K3, MAP3K1, MAPK8 возрастало в 2,6-5 раз, мРНК ELK1 и MAP2K4 - в 1,4-1,9 раза (табл. №5, рис. 21). 81 Таблица№5. Стимуляция JNK/p38 - сигнального пути в МСК при добавлении в среду культивирования п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. JNK/p38-сигнальный путь (50 нг/мл п(рДНК) 24 ч) MAP2K3 4.98 ± 0.25 MAP2K4 1.68 ± 0.08 MAPK8 3.57 ± 0.10 ELK1 1.91 ± 0.09 FOS 2.62 ± 0.13 Рисунок 21. Динамика накопления мРНК JNK/p38 - сигнального пути во времени при инкубации МСК в присутствии GC-богатых фрагментов п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. На рисунке указаны гены, показавшие наибольшее изменение экспрессии по сравнению с необработанным контролем (р <0,05). Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на разных культурах МСК. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения. Активация генов IRAK и TRAF может вызывать стимуляцию синтеза интерферона (IFN) в результате активации IRF-7. Действительно, в МСК при действии на них п(рДНК) возрастало количество мРНК IFNα1 (в 5 раз), 82 IFNβ1 (в 2 раза), IRF3 (в 2.6 раза), IRF1 (в 1.4 раза), IFNγ (в 5раз) (табл.№6, рис. 22). Для IFNα и IFN-γ существуют разные пути активации экспрессии генов. Однако известны молекулярные механизмы, ведущие к перекрыванию функций IFNα и IFNγ и перекрестной активации их экспрессии [Levy et al., 1995; Moore et al., 2001]. Таблица №6. Стимуляция IRF-сигнального пути в МСК при добавлении в среду культивирования п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. IRF-сигнальный путь (50 нг/мл п(рДНК) 24 ч) IRF1 1,38 ± 0.07 IRF3 2,62 ± 0.13 IFNA1 4.98 ± 0.25 IFNB1 1.90 ±0.10 IFNG 4.98 ±0.05 Рисунок 22. Динамика накопления мРНК IRF - сигнального пути во времени при инкубации МСК в присутствии GC-богатых фрагментов - п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. На рисунке указаны гены, показавшие наибольшее изменение экспрессии по сравнению с необработанным контролем (р <0,05). Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на разных 83 культурах МСК. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения. 3.2.3 Транслокация NF-kB в ядро мезенхимальных стволовых клеток при действии фрагментов п(рДНК) NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) существует в цитоплазме клеток в виде неактивного комплекса, состоящего из Rel-родственных белков, включая р65 (RelА) и р50 (NF-kB1), связанных с одним из членов семейства ингибиторных белков IkB [Veiko et al., 2000]. При активации NF-kB-сигнального пути ингибитор IkB фосфорилируется под действием IkB-киназы и деградирует, фактор NF-kB освобождается и перемещается в ядро, где взаимодействует со специфическими последовательностями в регуляторных участках генов и активирует транскрипцию определенных групп генов, в частности, цитокинов (TNF-a, IL-1 и др.). Транслокация NF-kB в ядро является центральным событием активации NF-kB - сигнального каскада, поэтому мы проанализировали количество NF-kB компонента Rel А (p65) в МСК (рис. 23), используя метод флуоресцентной микроскопии (FACS). Рисунок 23. Накопление в МСК компонента р65 NFkB при инкубации клеток в присутствии п(рДНК) и гДНК в концентрации 50 нг/мл в течение 3 часов. Данные проточной цитофлуориметрии. 84 * Отличия от контроля статистически значимы (р <0,05). Эксперимент был независимо выполнен на двух культурах МСК. После инкубации с п(рДНК), средняя интенсивность флуоресценции МСК увеличилась в 4 раза, что указывает на увеличение содержания p65 в клетке, которое коррелирует с усилением экспрессии гена Rel А (рис. 23). Для сравнения использовали геномную ДНК (гДНК). При действии гДНК количество p65в МСК увеличивалось в меньшей степени, чем при действии ГЦ-богатой ДНК (п(рДНК)) - в 1,6 раза по сравнению с исходным уровнем. Основным доказательством NF-kB активации в присутствии ГЦ-ДНК была его транслокация из цитоплазмы в ядро МСК, выявленная с помощью флуоресцентной микроскопии на фиксированных МСК, обработанных первичными антителами к NF-kB (р65) и вторичными, меченными FITC. В контрольных образцах МСК около 65 ± 10% общего количества клеток содержат очень низкое количество NF-kB в цитоплазме, в 20 ± 5% клеток NFkB присутствует в цитоплазме, но не в ядре, в оставшихся 15 ± 5% клеток NF-kB локализуется в ядре. Воздействие п(рДНК), 50 нг/мл, на МСК в течение 30 минут приводит к увеличению доли клеток с NF-kB, светящимся в цитоплазме, в то время как число клеток с NF-kB в ядре остается таким же, как в контроле (Р> 0,05). От 1 часа и до трех часов после начала воздействия на МСК 50 нг/мл п(рДНК), произошла транслокация NF-kB в ядро из цитоплазмы – NF-kB светился в ядре почти во всех клетках популяции МСК, однако через 24 часа процент активированных клеток снизился в 2 раза, одновременно с уменьшением средней интенсивности флуоресценции. гДНК существенно не изменяла процент клеток с локализацией NF-kB в ядре по сравнению с контролем (рис. 24). 85 Рисунок 24. Данные флуоресцентной микроскопии (увеличение 40): п(рДНК) вызывает транслокацию в ядро NF-kB через 1-3 часа после начала воздействия. Несмотря на то, что п(рДНК) активирует экспрессию TLR9 не более чем в 25% клеток, транслокации NF-kB в ядро наблюдается во всех клетках исследованной популяции МСК. Одним из возможных объяснений наблюдаемого факта является то, что активированные ГЦ-ДНК TLR9 + клетки секретируют растворимые факторы, которые активируют NF-kBсигнальный путь в TLR9-клеток. В МСК одним из вероятных кандидатов на роль растворимого активирующего агента является TNFα (tumor necrosis factor α), продукция которого возрастает в ответ на стимуляцию NF-kB в МСК [Pine et al., 1994; Sano et al., 1989; Schwarzenbach et al., 2011]. Таким образом, ГЦ-богатые последовательности ДНК, накапливающиеся в составе вкДНК, повышают экспрессию большинства генов молекул, участвующих в проведении сигнала через TLR-сигнальный путь, что сопровождается транслокацией в ядро фактора транскрипции NFkB, повышая экспрессию генов NF-kB - сигнального пути. 86 3.2.4 П(рДНК) стимулирует увеличение количества мРНК цитокинов IL10 и TNFα Конечным событием активации TLR –зависимых сигнальных путей в клетке является продукция цитокинов [Veiko et al., 2000; Yao et al., 2009]. Мы провели анализ секреции цитокинов TNFα и IL-10, которые, как было показано в ряде работ [Veiko et al., 2000; Yao et al., 2009], модулируют терапевтическую активность стволовых клеток. При действии п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл на МСК через 3 часа возрастало количество мРНК TNFα в 4 раза, через 24 часа – в 1,9 раз по сравнению с контролем (рис. 25 В). Через 3 часа культивирования МСК в присутствии п(рДНК) экспрессия иммуносупрессора IL10 возрастала в 1,7 раз, через 24 часа - в 9 раз (рис. 25 В). Кроме того, методом иммуноферментного анализа (ИФА) показано, что секреция цитокинов TNFα и IL-10 в среде культивирования МСК при действии п(рДНК) также повышается по сравнению с контролем. Концентрация TNFα повышается через 3 часа в 1,5 раза и через 24 часа в 2 раза, концентрация IL-10 через 3 часа повышается в 3 раза, и в 1,6 раза повышается через 24 часа культивирования МСК в присутствии п(рДНК) (рис. 26). Геномная ДНК не вызывала ни повышения экспрессии генов TNFa и IL-10, ни усиления продукции белка TNFα и IL-10. 87 Рисунок 25. А - Схема проведения сигнала по TLR-сигнальным путям. В – Динамика накопления мРНК TNFa и IL-10 в МСК во времени при культивировании с п(рДНК). (50 нг/мл). Рисунок 26. Изменение концентрации IL-10 (А) и TNFα (В) во времени при культивировании МСК в присутствии п(рДНК) (50 нг/мл) Отличия от контроля статистически значимы (р <0,05). 88 3.3 Снижение ферментативной активности каспазы 3 в мезенхимальных стволовых клетках при действии модельных фрагментов внеклеточной ДНК В норме апоптоз является частью регуляторного механизма, контролирующего численность популяции клеток в нормальной ткани. Апоптоз поврежденных клеток может служить механизмом защиты генетической информации в организме [Potten et al., 1997]. Имплантированые МСК могут подвергаться апоптозу , что влияет на эффективность терапии, поэтому важно исследовать влияние фрагментов вкДНК на апоптоз МСК. Мы проследили изменения активности одного из ферментов апоптоза – каспазы 3 при действии модельных фрагментов вкДНК: п(ТОрДНК) и п(СатIII) и ДНК Е.coli (50 нг/мкл, 3 часа) с помощью флуоресцирующего субстрата QAc-DEVD-AFC. Суммируя результат двух независимых экспериментов на двух различных культурах МСК, выявили, что действие всех проб ГЦ-ДНК снижало активность каспазы 3 в клеточных лизатах: п(ТОрДНК) - на (12 ± 3)% (P=0,95; t=5,7>2,1), п(СатIII) – на (40 ± 17)% (P=0,95; t=9,9>2,1), а ДНК Е.coli –на (31 ± 7)% (P=0,95; t=16,3>2,1) (рис. 27). Рисунок 27. Изменение активности каспазы 3 в клеточных белковых лизатах при культивировании МСК в присутствии п(ТОрДНК), п(СатIII), ДНК E.coli относительно контроля, отн ед . 89 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Проведенное впервые в рамках данной работы исследование позволило выявить новые данные о влиянии вкДНК на свойства МСК. Нами были отработаны адекватные методы выделения и культивирования МСК человека из жировой ткани. Чтобы подтвердить корректность используемого способа получения МСК, для одной из культур проведен полный анализ маркеров мезенхимальных стволовых клеток. Мы показали, что фрагменты вкДНК – ТОрДНК оказывают активирующее воздействие на МСК. Ранее предполагалось, что ДНК не оказывает влияния на клетки организма, но эксперименты проводились с использованием геномной ДНК, которая по своим свойствам существенно отличается от внеклеточной ДНК. ГЦ-богатые последовательности в составе вкДНК играют существенную роль в функционировании мезенхимальных стволовых клеток. Нами было показано, что ГЦ-вкДНК воздействует на мезенхимальные столовые клетки через рецепторы семейства TLR, посредством увеличения количества мРНК и белка TLR9 в клетках. Поскольку мы обнаружили, что ГЦ-обогащенные фрагменты вкДНК активируют TLR9-зависимый сигнальный путь: увеличивается экспрессия генов TLR9 и проанализировали сигнальным – MyD88 адаптера экспрессию генов, связанных путем, при действии пути, TLR-сигнального фрагментов с TLRДНК мы зависимым с различной последовательностью. Провели сравнительный анализ профиля экспрессии 86 генов, задействованных в TLR-сигнальных путях, в контроле (культивируемых МСК) и в МСК, обработанных фрагментами ГЦ-вкДНК. Было показано, что плазмида (п(рДНК)), содержащая в своем составе фрагменты ГЦ-вкДНК, активирует в МСК TLR9-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-cигнальные пути: увеличивается экспрессия генов адаптеров (MYD88, TIRAP, HSPD1, MAP2K3, TICAM2, SARM1, TOLLIP, HRAS, HSPA1A, MAPK8IP3 PELI1, RIPK2) и эффекторов 90 (EIF2AK2, PPARA, TRAF6, UBE2N, FADD, IRAK1, MAP3K7IP1, IRAK2, IRAK1) TLR-сигнального пути; генов NF-kB- (MAP3K1, MAP4K4, NF-KB1A, REL, IKBKB, RelA (p65), NFRKB, NF-KB1, NF-KB2); JNK/p38- (FOS, MAP2K3, MAPK8, ELK1, MAP2K4); IRF- (IFNα1, IFNβ1, IRF3, IRF1, IFNγ) сигнальных путей. Высказываются предположения, что активация TLR-сигнального пути играет существенную роль в защите МСК от апоптоза [Wang et al., 2009]. При действии всех трех проб ДНК мы наблюдали повышение экспрессии MyD88 – ключевого адаптера большинства «Toll-like» рецепторов, что ведет к активации MAPК (mitogen-activated protein kinase) - митоген-активируемых протеинкиназ, и трансактивирующих факторов, вследствие чего транскрипционный фактор NF-kB перемещается в ядро. Известно, что каскад МАРК задействован в передаче сигналов МСК от интегрина бета1 [Moro et al., 1998]. Интегрины и факторы роста обеспечивают жизнеспособность МСК за счет усиления экспрессии антиапоптотических [Zhang et al., 1995] генов и подавления экспрессии проапоптотических [Reginato et al., 2003]. Кроме того, в подавлении апоптоза МСК может быть задействован PI3K/Akt сигнальный путь, поскольку показано, что Akt регулирует активацию NF-kB, и его активация повышает выживаемость МСК [Armstrong et al., 2006]. Поскольку из трех проб ДНК п(СатIII) вызывала наибольшее снижение активности каспазы 3, и при этом не столь значительно стимулировала экспрессию MyD88 и TLR9, можно предположить, что в устойчивости МСК к апоптозу играют роль и другие сигнальные пути. В мезенхимальных стволовых клетках в присутствии п(рДНК) увеличивается количество мРНК, как про- так и антивоспалительных цитокинов. Кроме того, оказалось, что в МСК реализуется модель временного регулирования процесса продукции обнаруженная в макрофагах [Chi et al., 2006; цитокинов, ранее Lee et al., 2013]. Активация молекул TLR9-сигнального пути, в частности MAPK, индуцирует быстрый синтез провоспалительных цитокинов (TNFα) [Dong et al., 2001; Lee et al., 91 2013]. Вторая стадия активации TLR9-пути приводит к продукции иммуносупрессорного IL-10, которая также зависит от активности MAPK, и, в частности, p38 MAPK. Экспрессия многих IFN-индуцируемых генов стимулируется цитокинами в том числе, IL-10 [Harada et al., 1994; Seya et al., 2005] , TNFα [Harada et al., 1994; Wang et al., 2013] и др. Однако высокие уровни IL-10 приводят к уменьшению секреции IFNα [Harada et al., 1994; Wang et al., 2013]. Хотя IL-10 обладает в основном иммуносупрессивными и противовоспалительными свойствами [Moore et al., 2001], он также может служить провоспалительным цитокином в реализации ответа на воспаление [Sharif et al., 2004], поэтому его функция очень сложна. Баланс между про- и противовоспалительными свойствами IL-10 может регулироваться IFN типа 1, что подчеркивает взаимное влияние IFN и IL-10 [Sharif et al., 2004]. Таким образом, на различных уровнях передачи сигналов TLR9 существуют механизмы контроля, регулирующие чрезмерные ответы клеток на приводит к стимуляцию TLR9. Поскольку культивирование МСК с п(рДНК) значительному повышению экспрессии гена IL-10 и его секреции, можно предположить, что МСК, предварительно обработанные ГЦ-богатой п(рДНК), способны снижать аутоиммунные реакции при трансплантации. В последнее время терапия стволовыми клетками приобретает все более актуальное значение для лечения заболеваний, сопровождающихся дегенерацией тканей. Массовая гибель клеток, пересаженных в очаг поражения тканей, остается серьезной проблемой в транспланталогии. Для того, чтобы повысить жизнеспособность пересаживаемых МСК, проводят предварительную обработку клеток, в частности, TNFα [Yao et al., 2009] или синтетическими олигонуклеотидами (ГЦ-ОДН) [Tomchuck et al., 2008]. Эффективность этой предварительной обработки в значительной степени зависит от активации NF-kB и его транслокации в ядро [Yao et al., 2009]. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что культивирование МСК 92 с ГЦ-богатой плазмидой п(рДНК) в низких концентрациях (50 нг/мл) в течение короткого времени вызывает стимуляцию TLR9, что приводит к активации и транслокации в ядро NF-kB почти во всех клетках, включая клетки, не экспрессирующие TLR9. П(рДНК) может использоваться для предобработки культуры пересаживаемых МСК, наряду с предлагаемой обработкой ствололвых клеток синтетическими ГЦ-ОДН для стимуляции TLR9 [Tomchuck et al., 2008]. Преимущества использования плазмиды п(рДНК) – в низкой действующей концентрации, потому как обычно используемая концентрация синтетических ГЦ-ОДН – более 1000 нг/мл [Tomchuck et al., 2008]. Помимо этого, обогащение вкДНК фрагментами ГЦ-богатых последовательностей может играть существенную роль для стимуляции эндогенных МСК и повышения их жизнеспособности при неблагоприятных воздействиях на организм. 93 ВЫВОДЫ 1. Показано, что ГЦ-вкДНК воздействует на мезенхимальные столовые клетки через рецепторы семейства TLR. 2. Выявлено, что плазмида (п(рДНК)), содержащая в своем составе фрагменты ГЦ-вкДНК, активирует в МСК TLR9-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-cигнальные пути. 3. Обнаружено, что в результате активации МСК фрагментами ГЦвкДНК транскрипционный фактор NF-kB освобождается и перемещается в ядро, что ведет к усилению экспрессии антиапоптотических генов и подавлению экспрессии проапоптотических генов, что повышает выживаемость МСК. 4. Установлено, что в результате активации МСК фрагментами ГЦвкДНК усиливается синтез TNFα, который важен для выживаемости МСК в условиях стресса, и IL-10, который имеет большое значение в снижении интенсивности аутоиммунных реакций организма, что может играть существенную роль для стимуляции и повышения жизнеспособности при неблагоприятных воздействиях на организм как эндогенных МСК так и МСК, введенных в организм с целью терапии. 94 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Вейко Н.Н, Калашникова Е.А., Кокаровцева С.Н., Костюк С.Н., Ермаков А.В., Иванова С.М., Рязанцева Т.А., Еголина Н.А., Ляпунова Н.А., Спитковский Д.М.. Стимулирующее действие фрагментов транскрибируемой области рибосомного повтора на лимфоциты периферической крови человека.// БЭБиМ. – 2006. №10. – C.409-413. 2. Вейко Н.Н., Иванова С.М., Костюк C.В., Шубаева Н.О., Ермаков А.И., Еголина Н.Ф., Рязанцева Т.Ф., Сперанский А.И. Изменение свойств внеклеточной ДНК периферической крови при ревматоидном артрите. // Иммунология.- 2007.- Т28, №3. – С.147-151. 3. Вейко Н.Н., Костюк С.В., Ермаков А.В., Калашникова Е.А., Купавцева О.А., Рязанцева Т.А., Сперанский А.И.. Сыворотка периферической крови здоровых людей содержит антитела к фрагменту транскрибируемой области рибосомного повтора. // БЭБиМ. – 2007. – №9 – С.277-281. 4. Ермаков А.В., Костюк С.В., Еголина Н.А. и др. Фрагменты ДНК, обнаруживаемые в среде после воздействия ионизирующей радиации в в адаптирующих дозах, являются факторами стресс-сигнализации между лимфоцитами и клетками-свидетелями. // Радиоэкология. – 2007. – Т. 47, № 2. – С. 133-140. 5. Калашникова Е.А., Вейко Н.Н. , Кокаровцева С.Н. , Костюк С.В, Ермаков А.В., Еголина Н.А., Ляпунова Н.А., Спитковский Д.М. Активация мононуклеаров периферической крови фрагментами транскрибируемой области рибосомного гена человека in vitro.//Тез. докл. Х международной конференции «Дни иммунологии в СанктПетербурге» 29 мая - 1 июня 2006 г., СПб, Медицинская иммунология. – 2006. – Т. 8, № 2-3. – С. 143-144. 6. Костюк С.В., Алексеева А.Ю., Конькова М.С., Смирнова Т.Д., Ермаков А.В., Ефремова Л.В., Конорова И.Л., Вейко Н.Н. Внеклеточная ДНК 95 влияет на функциональную активность клеток эндотелия. // Медицинская генетика. 2010. №1. С. 38-46. 7. Костюк С.В., Вейко Н.Н., Калашникова Е.А, Кокаровцева С.Н., Иванова С.М., Рязанцева Т.А., Сперанский А.И. Периферическая кровь здоровых доноров содержит антитела к фрагментам ДНК рибосомного повтора человека (ТОрДНК).// Материалы 6 съезда аллергологов и иммунологов СНГ. Аллергология и иммунология. – 2006. – Т.7.№3. – С.254. 8. Костюк С.В., Замулаева И.А., Агапова Р.К., Ермаков А.В., Саенко А.С., Орлова Н.В., Смирнова С.Г., Вейко Н.Н., Спитковский Д.М. Изменение свойств внеклеточной ДНК периферической крови и частоты TCRмутантных клеток при действии на организм человека ионизирующей радиации.// Радиац. биология. Радиоэкология.- 2008.- Т.48, № 1. – С. 513. 9. Олишевский С.В., Козак В.В., Яниш Ю.В., Рыбалко С. Л., Шляховенко В. А. Иммуностимулирующая CpG-ДНК: перспективы клинического применения в онкологии. // Онкология. – 2006.– Т.8, №22 10.Симбирцев А.С. Цитокины:классификация и биологические функции. Цитокины и воспаление. 2004; 3(2): 16-21. 11.Ahmad-Nejad P., Hacker H., Rutz M., et al. Bacterial CpG-DNA and lipopolysaccharides activate Toll-like receptors at distinct cellular compartments. // Eur. J. Immunol. – 2002. – V. 32. – P. 1958–1968. 12.Akira S, Sato S. Toll-like receptors and their signaling mechanisms. // Scand J Infect Dis. – 2003. – V.35, №9. – P.555-562. 13.Akira, S., and K. Takeda. 2004. Toll-like receptor signaling. // Nat. Rev. Immunol. – V.4., №7. – P.499–511. 14.Andersen J.M., Al-Khairy D., Ingalls R.R. Innate immunity at the mucosal surface: role of toll-like receptor 3 and toll-like receptor 9 in cervical epithelial cell responses to microbial pathogens. // Biol. Reprod. – 2006. V.74., №5. – P.824-31. 96 15.Anker P., Stroun M., Maurice P.A. Spontaneous release of DNA by human blood lymphocytes as shown in an in vitro system. // Cancer Res. – 1975. – V.35. – P.2375-2382. 16.Antonatos D., Patsilinakos S.,Spanodimos S., Korkonikitas P.,Tsigas D. Cell-free DNA levels as a prognostic marker in acute myocardial infarction. // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2006. – V.1075, № 9. – P.278-81. 17.Armstrong L, Hughes O, Yung S, Hyslop L, Stewart R, Wappler I, et al. The role of PI3K/AKT, MAPK/ERK and NFkappabeta signalling in the maintenance of human embryonic stem cell pluripotency and viability highlighted by transcriptional profiling and functional analysis. Hum Mol Genet; - 2006.- 15(11):1894e913. 18.Atamaniuk J., Ruzicka K., Stuhlmeier K.M., et al. Cell-free plasma DNA: a marker for apoptosis during hemodialysis. // Clin. Chem. – 2006. – V.52, №3. – P. 523-526. 19. Atamaniuk J., Vidotto C., Tschan H., et al. Increased Concentrations of Cell-Free Plasma DNA after Exhaustive Exercise. // Clinical Chemistry. – 2004. – V.50. – P.1668-1670. 20.Azzam E.I., de Toledo S.M. and Little J.B. Oxidative metabolism, gap junctions and the ionizing radiation-induced bystander effect. // Oncogene. 2003. V. 22. P. 7050–7057. 21.Barchet W., Cella M., Colonna M. Plasmacytoid dendritic cells—virus experts of innate immunity. // Semin Immunol. – 2005. – V.17. – P.253–61. 22.Basu S., Fenton M.J. Toll-like receptors: function and roles in lung disease. // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. – 2004. – V. 286. – P. 887-L892. 23.Beck J., Urnovitz H.B., Riggert J., Clerici M., Schutz E. Profile of the circulating DNA in apparently healthy individuals. // Clin. Chem. 2009. V. 55. P. 730–738. 24.Beutler B. TLR4 as the mammalian endotoxin sensor// Curr. Top. Microbiol. Immunol. – 2002. – Vol. 270. – P. 109–120. 97 25.Bin, L. H., Xu, L. G., Shu, H. B. TIRP, a novel Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain-containing adapter protein involved in TIR signaling. // J. Biol. Chem. – 2003. – V.278. – P.24526–24532. 26.Bonizzi G., Karin, M. The two NF-κB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity// Trends Immunol. - 2004. – Vol. 25. – P. 280-288. 27.Boyd J.H., Mathur S., Wang Y., Bateman R.M., Walley K.R. Toll-like receptor stimulation in cardiomyoctes decreases contractility and initiates an NF-kappaB dependent inflammatory response. // Cardiovasc Res. – 2006. – V. 72, № 3. – P.384-93. 28.Brikos C, O'Neill LA. Signalling of toll-like receptors. //Handb Exp Pharmacol (183) – 2008 - 21–50. 29.Bulicheva N., Veiko N., Fidelina O., Mkrtumova N., Neverova M. Cell-free DNA of patients with cardiomyopathy and ribosomal repeat alone plays a role in cardiomyocyte contractility. Clinical Chemistry, Abstracts for CNAPS.- 2007. - V 53, № 10. 30.Butt A.N., Swaminathan R. Overview of Circulating Nucleic Acids in Plasma/Serum. Update on Potential Prognostic and Diagnostic Value in Diseases Excluding Fetal Medicine and Oncology. // Ann. NY. Acad. Sci. 2008. V. 1137 P. 236–242. 31.Chem. Sept. 30 [Epub ahead of print] PMID: 14519765 (2003). 32.Chi H, Barry SP, Roth RJ, Wu JJ, Jones EA, Bennett AM, Flavell RA. Dynamic regulation of pro- and anti-inflammatory cytokines by MAPK phosphatase 1 (MKP-1) in innate immune responses. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2006. V.103, №7. – P.2274-2279. 33.Choi J.J., Reich C.F., Pisetsky D.S. The role of macrophages in the in vitro generation of extracellular DNA from apoptotic and necrotic cells. // Immunology. 2005. V. 115. №. 1. P. 55-62. 98 34.Cortez-Gonzalez X., Pellicciotta I., Gerloni M., et al. TLR9-independent activation of B lymphocytes by bacterial DNA. // DNA Cell Biol. – 2006. – V. 25, № 5. – P. 253-261. 35.Daniels JT. Stem cells: moving the biology towards the clinic. Regen Med. – 2007.- May;2(3):313-5. 36.Dong C, Davis RJ, Flavell RA. Signaling by the JNK group of MAP kinases. c-jun N-terminal Kinase. // J Clin Immunol. – 2001. – V.21, №4. – P.253-257. 37.English K, Mahon BP. Allogeneic mesenchymal stem cells: agents of immune modulation. // J Cell Biochem. – 2011. – V.112, №8. – P.19631968. 38.Efremova L.V., Kostyuk S.V., Konorova I.L., Khaspekov G.P., Veiko N.N.. Accumulating fragments of extracellular DNA (ecDNA) influence rat primary cerebellum granule cell culture. // In Book “Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum”. Springer Science+Business Media B.V.: 2010. 39.Ermakov AV, Kon'kova MS, Kostiuk SV, Ershova ES, Smirnova TD, Kameneva LV, Efremova LV, Liubchenko LN, Veĭko NN. The response of human cancer stem cells on low-dose X-ray exposure. // Radiats Biol Radioecol. – 2009. – V.49, №5. – P.528-537. 40.Ermakov AV, Konkova MS, Kostyuk SV, Smirnova TD, Malinovskaya EM, Efremova LV, Veiko NN. An extracellular DNA mediated bystander effect produced from low dose irradiated endothelial cells. // Mutat Res. – 2011. – V.712, №1-2. – P.1-10. 41.Ermakov AV, Kostyuk SV, Konkova MS, Egolina NA, Malinovskaya EM, Veiko NN. Extracellular DNA Fragments Factors of Stress Signaling between X-Irradiated and Nonirradiated Human Lymphocytes // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2008. – №1137. – P.41–46. 42.Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, Hudgins L, Quake SR. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc Natl Acad Sci U S A. – 2008. - Oct 21;105(42):16266-71. 99 43.Fitzgerald K.A, Palsson-McDermott E.M., Bowie A.G., et al. Mal (MyD88adapter-like) is required for Toll-like receptor-4 signal transduction. // Nature – 2001. – V.413. – P.78-83. 44.Fitzgerald K.A., McWhirter S.M., Faia K.L., et al. IKK and TBK1 are essential components of the IRF3 signaling pathway. // Nat. Immunol. – 2003. – V.4. – P.491–496. 45.Fusco A.J., Huang D.B., Miller D., Wang V.Y., Vu D., Ghosh G. 2009. NFkappaB p52:RelB heterodimer recognizes two classes of kappaB sites with two distinct modes. EMBORep.lQ, 152-159. 46.Gahan P.B., Anker P., Stroun M. Metabolic DNA as the origin of spontaneously released DNA // Ann. NY. Acad. Sci. 2008. V. 1137. P. 7–17. 47.Gahan P.B., Stroun M. The virtosome – a novel cytosolic informative entity and intercellular messenger. // Cell. Biochem. Funct. 2010. V. 28. P. 529– 538. 48.Gahan P.B., Swaminathan R. Circulating nucleic acids in plasma and serum. Recent developments. // Ann. NY. Acad. Sci. 2008. V. 1137. P. 1–6. 49.Goulopoulou S, Matsumoto T, Bomfim GF, Webb RC. Toll-like receptor 9 activation: a novel mechanism linking placenta-derived mitochondrial DNA and vascular dysfunction in pre-eclampsia. // Clin Sci (Lond). – 2012. – V.123, №7. – P.429-435. 50.Guillot, S. Medjane, K. Le-Barillec, V. Balloy, C. Danel, M. Chignard, M. Si-Tahar. Response of Human Pulmonary Epithelial Cells to Lipopolysaccharide Involves Toll-like Receptor 4 (TLR4)-dependent Signaling Pathways. Evidence for an intracellular compartmentalization of TLR4/ // J. Biol. Chem. – 2004. - Vol. 279, Issue 4. – P. 2712-2718. 51.Hahn S, Rusterholz C, Hösli I, Lapaire O. Cell-free nucleic acids as potential markers for preeclampsia. // Placenta. – 2011. – Suppl:S17-20. 52.Harada H, Takahashi E, Itoh S, Harada K, Hori TA, Taniguchi T. Structure and regulation of the human interferon regulatory factor 1 (IRF-1) and IRF-2 100 genes: implications for a gene network in the interferon system. // Mol Cell Biol. – 1994. – V.14, №2. – P.1500-1509. 53.Hardy M. P., McGettrick A. F., O'Neill L. A. Transcriptional regulation of the human TRIF (TIR domain-containing adaptor protein inducing interferon β) gene// Biochem. J. - 2004. – Vol. 380. – P. 83-93. 54.Hayashi, F.; Smith, K. D.; Ozinsky, A., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. // Nature – 2001. – V.410 – P.1099-1103. 55.Hayden M.S., Ghosh S. 2008. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132, 344362. 56.He XX, Bai H, Yang GR, Xue YJ, Su YN. Expression of Toll-like receptors in human bone marrow mesenchymal stem cells. // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. – 2009. – V.17, №3. – P.695-699. 57.Hemmi Н., O. Takeuchi, S. Sato, M. Yamamoto, T. Kaisho, H. Sanjo, T. Kawai, K. Hoshino, K. Takeda, S. Akira. The roles of two IκB kinaserelated kinases in lipopolysaccharide and double stranded RNA signaling and viral infection// J. Exp. Med. - 2004. – Vol. 199. – P. 1641-1650. 58.Hoebe K., Du X., Georgel P., Janssen E., et al. Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88-independent TIR signalling. // Nature – 2003 – V.424 – P.743-748. 59.Honda K., Yanai H., Mizutani T., et al. Role of a transductionaltranscriptional processor complex involving MyD88 and IRF-7 in Toll-like receptor signaling. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2004. – V. 101. – P. 15416–15421. 60.Honda K.; Ohba Y.; Yanai H., et al. Spatiotemporal regulation of MyD88IRF-7 signalling for robust type-I interferon induction. // Nature. – 2005. – V. 434. – P. 1035-1040. 61.Ii WA, Sakamoto K, Leifer CA. TLR9 is important for protection against intestinal damage and for intestinal repair. // Sci Rep. – 2012;2:574. Epub 2012 Aug 14. 101 62.Ishimura D., Yamamoto N., Tajima K., Ohno A., Yamamoto Y., Washimi O., Yamada H. Differentiation of adipose-derived stromal vascular cell fraction culture cells into chondrocytes using the method of cell sorting with a mesenchymal stem cell marker. // Tohoku. J. Exp. Med. 2008. № 216. P. 149-156. 63.Janssens S., Beyaert R. A universal role for MyD88 in TLR/IL-1 receptormediated signaling. // Trends Biochem. Sci. – 2002. – V.27. – P.474-482. 64.Jiang Z., Zamanian-Daryoush M., Nie H., et al. Poly(I-C)-induced Toll-like receptor 3-mediated activation of NF-kB and MAP kinase is through an interleukin-1 receptor-associated kinase-independent pathway employing the signaling components TLR3-TRAF6-TAK1-TAB2-PKR. // J. Biol. Chem. – 2003. – V.278. – P.16713-16719. 65.Kato H., Sato S., Yoneyama M., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. // Immunity. – 2005. – V. 23. – P. 19–28. 66.Kawai T., Akira S. TLR signaling. // Cell Death Differ. – 2006. – V.13. – P.816–825. 67.Kawai Y., Yoshida M., Arakawa K., et al. Diagnostic Use of Serum Deoxyribonuclease I Activity as a Novel Early-Phase Marker in Acute Myocardial Infarction. // Circulation. – 2004. – V. 109. – P. 2398-2400. 68.Khazen W., M'bika J.P., Collinet M., et al. Differentiation-dependent expression of interferon gamma and toll-like receptor 9 in 3T3-F442A adipocytes. // Biochimie. – 2007. – V. 89, № 5. – P. 669-675. 69.Konorova IL, Veiko NN, Novikov VE. Influence of plasma DNA on acidbase balance, blood gas measurement, and oxygen transport in health and stroke. // Ann N Y Acad Sci. –2008. – V.1137. – P.278-282. 70.Krieg A., Yi A., Matson S., Waldschmidt T., et al. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. // Nature. – 1995. – V. 374. – P. 546549. 71.Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. // Ann. Rev. Immunol. – 2002. – V. 20. – P. 709–60. 102 72.Lapidot T, Dar A, Kollet O. How do stem cells find their way home Blood. 2005 Sep 15;106(6):1901-10. Epub May 12. Review. 73.Lebre M.C., van der Aar A.M., van Baarsen L., et al. Human keratinocytes express functional Toll-like receptor 3, 4, 5, and 9. // J. Inves. Dermatol. – 2007. – V. 127, № 2. – P. 331-41. 74.Lee N, Wong CK, Hui DS, Lee SK, Wong RY, Ngai KL, Chan MC, Chu YJ, Ho AW, Lui GC, Wong BC, Wong SH, Yip SP, Chan PK.Role of human Toll-like receptors in naturally occurring influenza A infections// Influenza Other Respi Viruses. 2013 Apr 1. doi: 10.1111/irv.12109. [Epub ahead of print]. 75.Lehrer MS, Sun TT, Lavker RM. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci.- 1998.Oct;111 ( Pt 19):2867-75. 76.Lenert P., Goeken J.A., Ashman R.F. Extended sequence preferences for oligodeoxyribonucleotide activity. // Immunology. – 2006. – V. 117, № 4, – P. 474-481. 77.Lenert P., Yi A.K., Krieg A.M., Stunz L., Ashman R.F. Inhibitory oligonucleotides block the induction of AP-1 transcription factor by stimulatory CpG oligonucleotides in B cells. // Antisense Nucl. Acid. Drug. Dev. – 2003. – V. 13. – P. 143–150. 78.Lenert P.S. Targeting Toll-like receptor signaling in plasmacytoid dendritic cells and autoreactive B cells as a therapy for lupus. // Arthritis Res. Ther. – 2006. – V. 8, № 1. – P. 203. 79.Levy DE, Raz R, Durbin JE, Bluyssen H, Muzaffar R, Pisharody S. Cytoplasmic transcription factors: mediators of cytokine signaling. //Agents Actions Suppl. – 1995. –V.47. – P.79-85. 80.Li K., Foy E., Ferreon J.C., et al. Immune evasion by hepatitis C virus NS3/4A protease-mediated cleavage of the Toll-like receptor 3 adaptor protein TRIF. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2005. – V. 102. – P. 2992– 2997. 103 81.Li K.; Chen Z.; Kato N., et al. Distinct poly(I-C) and virus-activated signaling pathways leading to interferon-beta production in hepatocytes. // J. Biol. Chem. – 2005. – V. 280. – P. 16739-16747. 82.Li T, Sun M, Yin X, Wu C, Wu Q, Feng S, Li H, Luan Y, Wen J, Yan L, Zhao B, Xu C, Sun Y. Expression of the calcium sensing receptor in human peripheral blood T lymphocyte and its contribution to cytokine secretion through MAPKs or NF-κB pathways// Mol Immunol. 2013 Apr;53(4):41420. 83.Locke M., Windsor J. and Dunbar P.R. Human adipose-derived stem cells: isolation, characterization and applications in surgery. // ANZ. J. Surg. 2009. V. 79. P. 235–244. 84.Majewska M., Szczepanik M. The role of Toll-like receptors (TLR) in innate and adaptive immune responses and their function in immune response regulation. // Postepy Hig. Med. Dosw. (Online). – 2006. – V. 60. – P. 5263. 85.Malinovskaya E.M., Kostyuk S.V., Ermakov A.V., Kon'kova M.S., Smirnova T.D., Kameneva L.V., Efremova L.V., Alekseeva A.Yu., Lyubchenko L.N., Veiko N.N. Fragments of Cell-free DNA (cfDNA) Enhance Transcription Activity in Human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) and Inhibit Their in vitro Differentiation. // In Book “Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum”. P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V. 2010, chapter №30. 86.Malinovskaya EM, Kostyuk SV, Ermakov AV, Kon'kova MS, Smirnova TD, Kameneva LV, Efremova LV, Alekseeva AYu, Lyubchenko LN, Veiko NN. Fragments of сell-free DNA (cfDNA) enhance transcription activity in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and inhibit their in vitro differentiation. In Book “Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum”. P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V. – 2010. – chapter №30. – P.199-205. 104 87.Mal'shakova V.S., Pyshnyi D.V., Bondar A.A., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Isolation and sequencing of short cell-surface-bound DNA. // Ann. NY. Acad. Sci. 2008. V. 1137. P. 47–50. 88.Martin-Armas M., Simon-Santamaria J., Pettersen I., Sveinbjornsson B. Toll-like receptor 9 (TLR9) is present in murine liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) and mediates the effect of CpG-oligonucleotides. // J. Hepatol. – 2006. – V. 44, № 5. – P. 939-946. 89.Mayer A.K., Muehmer M., Mages J., et al. Differential recognition of TLRdependent microbial ligands in human bronchial epithelial cells. // J. Immunol. – 2007. – V. 178, № 5. – P. 3134-3142. 90.McCoy S.L., Kurtz S.E., Hausman F.A., et al. Activation of RAW264.7 Macrophages by Bacterial DNA and Lipopolysaccharide Increases Cell Surface DNA Binding and Internalization. // J. Biol. Chem. – 2004. – V. 279. – P. 17217-17223. 91.McGettrick A. F., O'Neill L. A. The expanding family of MyD88-like adaptors in Toll-like receptor signal transduction// Mol. Immunol. - 2004. – Vol. 41. – P. 577-582. 92.Meylan E., Curran J., Hofmann K., et al. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. // Nature. – 2005. – V. 437. – P. 1167–1172. 93.Meylan E., K. Burns, K. Hofmann, V. Blancheteau, F. Martinon, M. Kelliher, J. Tschopp. RIP1 is an essential mediator of Toll-like receptor 3induced NF-κB activation// Nat. Immunol. - 2004. – Vol. 5. – P. 503-507. 94.Miggin S.M.. O’Neill L.A.J. New insights into the regulation of TLR signaling. // J. Leukoc. Biol. – 2006. – V. 80. – P. 220-226. 95.Mizuno H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. // J. Nippon. Med. Sch. 2009. V. 76. № 2. P. 56-6 96.Moore KW, de Waal MR, Coffman RL, O’Garra A. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. // Annu Rev Immunol. – 2001. – V.19. – P.683–765. 105 97.Moro L, Venturino M, Bozzo C, Silengo L, Altruda F, Beguinot L, Tarone G, Defilippi P. Integrins induce activation of EGF receptor: role in MAP kinase induction and adhesion-dependent cell survival. EMBO J. – 1998.Nov 16;17(22):6622-32 98.Morrison SJ, Kimble J. Asymmetric and symmetric stem-cell divisions in development and cancer. Nature. – 2006 - Jun 29;441(7097):1068-74. 99.Morrison SJ, Spradling AC. Stem cells and niches: mechanisms that promote stem cell maintenance throughout life// Cell. – 2008. - Feb 22;132(4):598-611 100. Oshiumi, H., Sasai, M., Shida, K., Fujita, T., Matsumoto, M., and Seya, T., TICAM-2: A bridging adapter recruiting to Toll-like receptor 4 TICAM-1 that induces interferon-ß. J. Biol. 101. Palmer S., Chen Y.H. 2008. Bcl-З, a multifaceted modulator of NF- kappaB-mediated gene transcription Immunol Res. 42, 210-218. 102. Palsson-McDermott E.M., O'Neill L.A. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. // Immunology. – 2004. – V. 113. – P. 153–162. 103. Papantonis A, Kohro T, Baboo S, Larkin JD, Deng B, Short P, Tsutsumi S, Taylor S, Kanki Y, Kobayashi M, Li G, Poh HM, Ruan X, Aburatani H, Ruan Y, Kodama T, Wada Y, Cook PR. TNFα signals through specialized factories where responsive coding and miRNA genes are transcribed//EMBO J. 2012 Nov 28;31(23):4404-14. 104. Peters DL, Pretorius PJ. Origin, translocation and destination of extracellular occurring DNA — a new paradigm in genetic behaviour. // Clin Chim Acta. – 2011. – V.412, №12. – P.806-811. 105. Pevsner-Fischer M., Morad V., Cohen-Sfady M., Rousso-Noori L., Zanin-Zhorov A., Cohen S., Cohen I.R. and Zipori D. Toll-like receptors and their ligands control mesenchymal stem cell functions. // Blood. 2007. V. 109. № 4. P. 1422-1432. 106 106. Pine R, Canova A, Schindler C. Tyrosine phosphorylated p91 binds to a single element in the ISGF2/IRF-1 promoter to mediate induction by IFN alpha and IFN gamma, and is likely to autoregulate the p91 gene. // EMBO J. – 1994. – V.13, №1. – P.158-167 107. Potten CS, Wilson JW, Booth C. Regulation and significance of apoptosis in the stem cells of the gastrointestinal epithelium. Stem Cells. – 1997. - 15(2):82-93 108. Puszyk W.M., Crea F., Old R.W. Unequal representation of different unique genomic DNA sequences in the cell-free plasma DNA of individual donors. // Clin. Biochem. 2009. V. 42. P. 736–738. 109. Raicevic G, Rouas R, Najar M, Stordeur P, Boufker HI, Bron D, Martiat P, Goldman M, Nevessignsky MT, Lagneaux L. Inflammation modifies the pattern and the function of Toll-like receptors expressed by human mesenchymal stromal cells. // Hum Immunol. – 2010. – V.71, №3. – P.235-244. 110. Reginato MJ, Mills KR, Paulus JK, Lynch DK, Sgroi DC, Debnath J, Muthuswamy SK, Brugge JS. Integrins and EGFR coordinately regulate the pro-apoptotic protein Bim to prevent anoikis.: Nat Cell Biol. – 2003.Aug;5(8):733-40 111. of Rogers J.C., Boldt D., Kornfeld S., Skinner A., Valeri C.R. Excretion deoxyribonucleic acid by lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin or antigen. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. P. 1685–1689. 112. Rutz M., Metzger J., Gellert T., et al. Toll-like receptor 9 binds single- stranded CpG-DNA in a sequence- and pH-dependent manner. // Eur. J. Immunol. – 2004. – V. 34. – P. 2541–2550. 113. Sano H, Takai O, Harata N, Yoshinaga K, Kodama-Kamada I, Sasaki T. Binding properties of human anti-DNA antibodies to cloned human DNA fragments. // Scand. J. Immunol. – 1989. – V. 30. – P. 51-63. 107 114. Schwarzenbach H, Hoon DS, Pantel K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. // Nat Rev Cancer. – 2011. – V.11, №6. – P.426-437. 115. Seth R.B., Sun L., Chen Z.J. Antiviral innate immunity pathways. // Cell Res. – 2006. – V. 16. – P. 141–147. 116. Seya T., Oshiumi H., Sasai M., Akazawa T., Matsumoto M. TICAM-1 and TICAM-2: toll-like receptor adapters that participate in induction of type 1 interferons. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2005. – V. 37. – P. 524–529. 117. Sharif MN, Tassiulas I, Hu Y, Mecklenbräuker I, Tarakhovsky A, Ivashkiv LB. IFN-alpha priming results in a gain of proinflammatory function by IL-10: implications for systemic lupus erythematosus pathogenesis. // J Immunol. – 2004. – V.172. – P.6476–6481. 118. Sharma S., tenOever B.R., Grandvaux N., et al. Triggering the interferon antiviral response through an IKK-related pathway. // Science. – 2003. – V. 300. – P. 1148-1151. 119. Siess D.C., Vedder C.T,. Merkens L.S., et al. A human gene coding for a membrane-associated nucleic acid-binding protein. // Stem Cells. 2004. –V.22, № 5. – P. 725-40. 120. Simeonidis S, Stauber D, Chen G, Hendrickson WA, Thanos D. Mechanisms by which IkappaB proteins control NF-kappaB activity. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1999. – V.96, №1. – P.49-54. 121. Singer NG, Caplan AI. Mesenchymal stem cells: mechanisms of inflammation. // Annu Rev Pathol. – 2011. – V.6. – P.457-478. 122. Stagg J. Immune regulation by mesenchymal stem cells: two sides to the coin. Tissue Antigens. - 2007 - Jan;69(1):1-9. Review. 123. Sun L., L. Deng, C. K. Ea, Z. P. Xia, Z. J. Chen. The TRAF6 ubiquitin ligase and TBK1 kinase mediate IKK activation by BCL10 and MALT1 in T lymphocytes// Mol. Cell. - 2004. – Vol. 14. – P. 289-301. 124. Sun Z, Zhang R, Wang H, Jiang P, Zhang J, Zhang M, Gu L, Yang X, Zhang M, Ji X. Serum IL-10 from systemic lupus erythematosus patients 108 suppresses the differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells//J Biomed Res. 2012 Nov;26(6):456-66. 125. Suzuki N, Kamataki A, Yamaki J, Homma Y. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma. // Clin Chim Acta. – 2008. – V.387. – P.55–58. 126. Suzuki N, Kamataki A, Yamaki J, Homma Y. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma. // Clin Chim Acta. – 2008. – V.387. – P.55–58. 127. Suzuki N., Kamataki A., Yamaki J., Homma Y. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma. // Clin. Chim. Acta. 2008. V. 387. P. 55–58. 128. Takagi M. Toll-like Receptor. // J Clin Exp Hematop. – 2011. – V.51, №2. – P.77-92. 129. Tobias P., Curtiss L.K. Thematic review series: The Immune System and Atherogenesis. Paying the price for pathogen protection: toll receptors in atherogenesis. // Journal of Lipid Research. – 2005. – V. 46. – P. 404-411. 130. Tomchuck SL, Zwezdaryk KJ, Coffelt SB, et al. Toll-like receptors on human mesenchymal stem cells drive their migration and immunomodulating responses. // Stem Cells. – 2008. – V.26, №1. – P.99107. 131. Tong Y.K., Lo YM. Diagnostic developments involving cell-free (circulating) nucleic acids.// Clin Chim Acta. – 2006. –V.363, №1-2. – P.187-196. 132. Umetani N., Giuliano A.E., Hiramatsu S.H., et al. Prediction of breast tumor progression by integrity of free circulating DNA in serum. // J. Clin. Oncol. – 2006. – V. 24. – P. 4270-4276. 133. Van der Vaart M., Pretorius P.J. Circulating DNA. Its origin and fluctuation. // Ann. NY. Acad. Sci. 2008. V. 1137. P. 18–26. 134. Veiko NN, Kalashnikova EA, Kokarovtseva SN, Kostyuk SV, Ermakov AV, Ivanova SM, Ryazantseva TA, Egolina NA, Lyapunova NA, 109 Spitkovskii DM. Stimulatory effect of fragments from transcribed region of ribosomal repeat on human peripheral blood lymphocytes. // Bull Exp Biol Med. – 2006. – V.142, №4. – P.428-432 135. Veiko NN, Shubaeva NO, Ivanova SM, Speranskii AI, Lyapunova NA, Spitkovskii DM. Blood serum DNA in patients with rheumatoid arthritis is considerably enriched with fragments of ribosomal repeats containing immunostimulatory CpG-motifs. // Bull Exp Biol Med. – 2006. – V.142, №3. – P.313-316. 136. Veiko NN, Spitkovskiĭ DM. The accumulation of single-stranded breaks does not lead to paired DNA damage--the characteristic of the transcribing fragment of the human ribosomal operon that allows its being detected in biological fluids at the death of different body cells. // Radiats Biol Radioecol. – 2000. – V.40, №4. – P.396-404. 137. Vogel S.N., Fitzgerald K.A., Fenton M.J. TLRs: differential adapter utilization by toll-like receptors mediates TLR-specific patterns of gene expression. // Mol. Interv. – 2003. – V. 3. – P. 466–477. 138. Wagner H., Bauer S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. // JEM – V.203, № 2, – P. 265-268 139. Wang B.G., Huang H.Y.,Chen Y.C., et al. Increased plasma DNA integrity in cancer patients. // Cancer Res. – 2003. – V. 63. – P. 3966-3968. 140. Wang C., Deng L., Hong M., et al. TAK1 is a ubiquitin-dependent kinase of MKK and IKK. // Nature. – 2001. – V. 412. –P. 346–351. 141. Wang H., Rayburn E., Zhang R. Synthetic oligodeoxynucleotides containing deoxycytidyl-deoxyguanosine dinucleotides (CpG ODNs) and modified analogs as novel anticancer therapeutics. // Curr. Pharm. Des. – 2005. – V. 11. – P. 2889–2907. 142. Wang L, Zhao Y, Liu Y, Akiyama K, Chen C, Qu C, Jin Y, Shi S. IFN-γ and TNF-α Synergistically Induce Mesenchymal Stem Cell Impairment and Tumorigenesis via NFκB Signaling// Stem Cells. 2013 Apr 4. doi: 10.1002/stem.1388. [Epub ahead of print]. 110 143. Wang ZJ, Zhang FM, Wang LS, Yao YW, Zhao Q, Gao X. Lipopolysaccharides can protect mesenchymal stem cells from oxidative stress-induced apoptosis and enhance proliferation of MSCs via Toll-like receptor(TLR)-4 and PI3K/Akt. Cell Biol Int. – 2009. - Apr 17. 144. Wier EM, Neighoff J, Sun X, Fu K, Wan F. Identification of an N- terminal truncation of the NF-κB p65 subunit that specifically modulates ribosomal protein S3-dependent NF-κB gene expression//J Biol Chem. 2012 Dec 14;287(51):43019-29. 145. Windheim M., Stafford M., Peggie M., Cohen P. 2008. Interleukin-1 (IL-1) induces the Lys63-linkedpolyubiquitinationofIL-l receptor-associated kinase 1 to facilitate NEMO binding and the activation of IkappaBalpha kinase. Mol Cell Biol. 28, 1783-1791. 146. Yamamoto M., S. Sato, H. Hemmi, S. Uematsu, K. Hoshino, T. Kaisho, O. Takeuchi, K. Takeda, S. Akira TRAM is specifically involved in the Toll-like receptor 4-mediated MyD88-independent signaling pathway// Nat. Immunol. – 2003. – Vol. 4. – P. 1144-1150. 147. Yamamoto M., Sato S., Hemmi H., et al. Essential role for TIRAP in activation of the signalling cascade shared by TLR2 and TLR4. // Nature. – 2002. – V. 420. – P. 324-329. 148. Yao Y, Zhang F, Wang L, et al. Lipopolysaccharide preconditioning enhances the efficacy of mesenchymal stem cells transplantation in a rat model of acute myocardial infarction. // J Biomed Sci. – 2009. – V.16, №1. – P.74-85. 149. Yasuda K., Yu P., Kirschning C.J., et al. Endosomal translocation of vertebrate DNA activates dendritic cells via TLR9-dependent and independent pathways. // J. Immunol. – 2005. – V. 174. – P. 6129–6136. 150. Yasuda, K., Ogawa Y., Yamane I., Nishikawa M., Takakura Y. Macrophage activation by a DNA/cationic liposome complex requires endosomal acidification and TLR9-dependent and -independent pathways. // J. Leukoc. Biol. – 2005. – V. 77. – P. 71–79. 111 151. Yoneyama M., Kikuchi M., Natsukawa T., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. // Nat. Immunol. – 2004. – V. 5. – P. 730–737. 152. Zhang X., Wu M., Zhang W., Shen J., Liu H. Differentiation of human adipose-derived stem cells induced by recombinantly expressed fibroblast growth factor10 in vitro and in vivo. // In. Vitro. Cell. Dev. Biol. Animal. 2010. V. 46. P. 60–71. 153. Zhang Z, Vuori K, Reed JC, Ruoslahti E. The alpha 5 beta 1 integrin supports survival of cells on fibronectin and up-regulates Bcl-2 expression. Proc Natl Acad Sci U S A. – 1995.- Jun 20;92(13):6161-5. 154. Zhong B., Tien P., Shu H-B. Innate immune responses: Crosstalk of signaling and regulation of gene transcription. // Virology. – 2006. – V. 352. – P. 14 – 21. 155. Zhong X.Y , Hahn S., Kiefer V., Holzgreve W. Is the quantity of circulatory cell-free DNA in human plasma and serum samples associated with gender, age and frequency of blood donations. // Ann. Hematol. – 2006. – V. 86. – P 139-143. 112 Благодарности Я благодарю д.б.н., заведующую лаборатории молекулярной биологии Наталью Николаевну Вейко, а также к.м.н., ведущего научного сотрудника лаборатории молекулярной биологии Светлану Викторовну Костюк ФГБУ Медико-генетического научного центра РАМН за помощь в организации и проведении научных исследований по теме диссертации. 113
