МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА На правах рукописи
advertisement
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА На правах рукописи УДК 577.353.2 ВЛАДЫЧЕНСКАЯ ЕЛИЗАВЕТА АЛЕКСАНДРОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ГОМОЦИСТЕИНА И ГОМОЦИСТЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ЛИМФОЦИТЫ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук специальность 03.01.04 – Биохимия Москва 2010 Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович Официальные оппоненты: доктор биологических наук Гроздова Ирина Дмитриевна доктор биологических наук Порешина Лидия Петровна Ведущая организация: Институт Биофизики Клетки РАН Защита диссертации состоится 5 апреля 2010 г. В 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоноcова, Биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан «__» марта 2010 года Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук 2 Медведева М.В. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Гомоцистеин (ГЦ) является природным метаболитом, который образуется в ходе взаимопревращений метионина и цистеина. Он обнаруживается в крови преимущественно в связанном с цистеином белков состоянии, а также в виде продуктов его спонтанного окисления, главным образом, гомоцистеиновой кислоты (ГЦК). Содержание общего ГЦ в крови грызунов и человека не превышает 15 μМ [Seshadri et al., 2002], а повышение его уровня является фактором риска для развития нейродегенеративных заболеваний и деменции [Perry et al., 1995, Seshadri et al., 2002]. В литературе отмечается, что нейротоксический эффект у ГЦК выражен сильнее, чем у ГЦ [Gortz et al., 2004]. Токсическое действие этих соединений не ограничивается нервной тканью – отрицательные эффекты ГЦ и ГЦК описаны на тромбоцитах, гладкомышечной стенке сосудов, нейтрофилах [Болдырев, 2009]. В ряде исследований обнаружено, что мишенью действия ГЦ в мозге могут быть глутаматные рецепторы, в частности, NMDA-рецепторы [Zieminska et al., 2002; Махро и соавт., 2004]. Активация NMDA-рецепторов в нейронах инициирует вход кальция внутрь клетки, рост активных форм кислорода (АФК) и, возможно, азота. Недавно в литературе было описано наличие глутаматных рецепторов не только в нервной ткани, но и в некоторых клетках иммунной системы, в частности, в лимфоцитах [Ganor et al., 2003; Boldyrev et al., 2004; Pacheco et al., 2004; Mashkina et al., 2007]. Какова функция этих рецепторов в иммунокомпетентной системе, и какое значение имеет ГЦ для ее активности, оставалось неизвестным. В то же время, постоянная циркуляция ГЦ в крови в условиях гипергомоцистеинемии делает клетки потенциальной мишенью для этого соединения. 3 иммунной системы Целью нашей работы явилась характеристика действия ГЦ и ГЦК на лимфоциты крысы. В работе были поставлены и решены следующие задачи: 1. Оценить экспрессию глутаматных рецепторов NMDA-класса в лимфоцитах крысы. 2. Охарактеризовать взаимодействие ГЦ и ГЦК с глутаматными рецепторами на мембране лимфоцитов. 3. Исследовать влияние ГЦ и ГЦК на уровень внутриклеточного Са2+ и свободных радикалов в лимфоцитах. 4. Определить преимущественные источники свободных радикалов, образующихся при инкубации лимфоцитов с ГЦ и ГЦК. 5. Оценить влияние ГЦ и ГЦК на продукцию цитокинов лимфоцитами. Научная новизна и практическая значимость работы. В работе детально охарактеризован механизм действия ГЦ и ГЦК на иммунокомпетентные клетки. Показано, что при активации NMDAрецепторов в лимфоцитах крысы происходит увеличение содержания внутриклеточного кальция и следующее за ним увеличение уровня свободных радикалов. Выявлено, что при действии ГЦК на лимфоциты источником свободных радикалов являются НАДФН-оксидаза и NO-синтаза. Показана способность ГЦ и ГЦК регулировать синтез IFN- и ТNF- в лимфоцитах крыс. Полученные данные указывают, что в основе токсического действия ГЦ лежит специфическое влияние на иммунную систему, опосредованную исследования существенно глутаматными расширяют рецепторами. представления Проведенные о механизмах взаимодействия гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты с лимфоцитами, что существенно для понимания молекулярных механизмов токсичности гомоцистеина. 4 Апробация работы. Результаты работы докладывались на научных семинарах кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, 29th Annual Meeting of Neurochemical Society of Japan (Japan, Kyoto, 2006); 17th ESN Meeting (Spain, Salamanka, 2007); на ХХ съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Россия, Москва, 2007); Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Россия, Москва, 2007); Int. Symp. Lipid Peroxidation (Japan, Karuizawa, 2008); Ehrlich II World Conf. Magic Bullets (Germany, Nurnberg, 2008); 7th Int. Conf. on Homocysteine Metabolism (Czech Republic Prague, 2009). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, разделов «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и списка цитируемой литературы. Работа содержит 109 страниц машинописного текста, 6 таблиц и 37 рисунков. Список литературы включает 140 отечественных и зарубежных источников. В работе приняты следующие сокращения: АФК – активные формы кислорода, ГЦ – гомоцистеин, ГЦК – гомоцистеиновая кислота, НАДФН – никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный, Con A – concanavalin A, D-AP5 – L-(+)-2-Amino-5-phosphonopentainoic acid, DCF – dichlorofluorescein, DCFH2-DA – dichlorofluorescein diacetate, DHR 123 – dihydrorhodamine 123, ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay, FITC – fluoresceine isotiocianate, Fluo-3 АМ – 4-(6-Acetoxymethoxy-2,7-dichloro-3-oxo-9-xanthenyl)-4'-methyl-2,2'-(ethylenedioxy)dianiline-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl) ester, IFN-γ – interferon gamma, LY 294002 – 2-(4-Morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one, MK-801 – (5S,10R)-(-)-5Methyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5,10-imine, NMDA – N-methyl-D-aspartic acid, PI – Propidium iodide, PKC – Protein kinase C, TNF-α – tumor necrosis factor. 5 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования явились лимфоциты периферической крови крыс. Выделение лимфоцитов проводили стандартным методом. Для получения лимфоцитов кровь наслаивали на специфическую селективную среду «Lymphosep» (MP «Biomedicals»). Кольцо лимфоцитов, локализованное на границе двух сред, собирали, отмывали сначала от среды и тромбоцитов, после чего оставляли на 40 мин в пластиковой чашке Петри для адгезии гранулоцитов, В-лимфоцитов и моноцитов. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева и анализировали с использованием проточной цитометрии; кроме этого, клетки оставляли для роста на 72 ч, после чего анализировали методом «Elisa». Культура периферических лимфоцитов. Все работы проводили в стерильном ламинарном боксе. После отмывания клетки, полученные, как описано выше, суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% инактивированную телячью эмбриональную сыворотку, гентамицин 2 мг/мл, и инкубировали в СО2-инкубаторе. Плотность клеточной суспензии составляла 106 кл/мл. О появлении мертвых клеток в ходе эксперимента судили по окраске проб трипановым синим. Активированные лимфоциты получали в результате инкубации с конканавалином А (Сon A, ПанЭко, Россия) (10 мкг/мл) в течение 72 ч. Количество продуцируемых цитокинов оценивали методом ELISA (Bender Medsystems). Проточная цитометрия. Измерения проводили на приборе «EPICS XL» фирмы Beckman Coulter (США), оснащенном аргоновым лазером с длиной волны возбуждения 485 нм. В каждой пробе анализировали 10000 событий. Данные обрабатывали в программе WIN MDI. Для определения внутриклеточного уровня свободных радикалов использовали 2,7дихлордигидрофлуоресцеин-диацетат (DCFН2-DA, ex 485 нм, em 535 нм) в конечной концентрации 100 μМ. 6 Для регистрации изменения концентрации внутриклеточного кальция использовали флуоресцентный зонд Fluo-3 АМ (пентаацетоксиметиловый эфир [2-амино-5-(2,7-дихлор-6гидрокси - 3 - оксо-9-ксантенил)фенокси]-2-(2-амино-5-метилфенокси)этанN,N,N',N'-тетрауксусная кислоты, ex 485 нм, em 535 нм), в конечной концентрации 20 μМ. Для определения уровня свободных радикалов в митохондриях использовали флуоресцентный зонд дигидрородамин 123 (DHR 123, ex 485 нм, em 535 нм), в конечной концентрации 10 μМ. Для идентификации некроза клетки окрашивали иодидом пропидия (PI, ex 485 нм, em 610 нм), в конечной концентрации 10 μМ. Для оценки иммуноцитохимическое экспрессии рецепторов окрашивание. Окраску использовали моноклональными антителами к NR1 субъединице NMDA-рецептора (Abcam) проводили согласно протоколу производителя, затем клетки отмывали и окрашивали вторичными (FITC-мечеными) антителами. В пробу вносили около 100000 клеток. Антитела использовали в разведении 1:200. Определение продукции цитокинов с помощью набора «ELISA» осуществляли, как рекомендовано производителем «Bender Medsystems». В эксперименте использовали киты для определения IFN-γ и TNF-α. Для исследования участвующих в процессах использовали вовлеченности рецепторов и ферментов, внутриклеточной сигнализации лимфоцитов, специфические агонисты, антагонисты, субстраты и ингибиторы в подобранных концентрациях. Статистическая обработка результатов. Результаты измерений, проведенных в 3–5 параллельных пробах, представлены в виде «среднее значение ± средняя ошибка». Обработку результатов проводили при помощи программы «Biostatistika», используя для сравнения полученных выборок парный критерий Стьюдента. При этом исходили из предположения, что исходные данные имеют нормальное распределение. Достоверными считали различия с p<0,05. 7 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика действия ГЦ и ГЦК на лимфоциты Недавно методом ПЦР было показано, что лимфоциты грызунов содержат мРНК для канальной субъединицы NMDA-рецепторов, а лимфоциты мыши и человека способны продуцировать свободные радикалы в присутствии NMDA [Тунева и соавт., 2003; Mashkina et al., 2007]. Мы сопоставили действие NMDA, ГЦ и ГЦК на продукцию свободных радикалов лимфоцитами крысы и обнаружили, что ГЦ и ГЦК также способны увеличивать уровень свободных радикалов в этих клетках, как и NMDA. На рис. 1 видно, что при добавлении ГЦ и NMDA, происходит заметное смещение пика на гистограмме вдоль по оси флуоресценции DCF в область более высоких значений флуоресценции. Рис. 1. Флуоресценция DCF в лимфоцитах крыс в контроле (А) и после инкубации с 0,5 мМ NMDA (Б), 0,5 мМ ГЦ (В) и 0,25 мМ ГЦК (Г) Взаимодействие же ГЦК с лимфоцитами сопровождается еще большим смещением пика на гистограмме в область с еще более высокой флуоресценцией DCF, что указывает на более выраженное влияние ГЦК на свободнорадикальную продукцию в лимфоцитах. Временная и концентрационная характеристики действия NMDA, ГЦ и ГЦК на лимфоциты представлены на рис. 2 и 3. 8 Оказалось, что ГЦ, ГЦК и NMDA увеличивают уровень свободных радикалов в лимфоцитах в диапазоне концентраций от 0,1 до 1,0 мМ (данные концентрации соответствуют концентрациям ГЦ и ГЦК, характеризующих выраженную гипергомоцистеинемию) во временном интервале от 0 до 30 330 220 Флуоресценция DCF, % от контроля Флуоресценция DCF, % от контроля мин. NMDA, мМ 200 ГЦ, мМ 180 ГЦК, мМ 280 NMDA ГЦК 230 160 ГЦ 180 140 130 120 100 0 0,5 1 80 0 1,5 Исследуемое соединение, мМ Рис. 2. Концентрационная зависимость действия NMDА, ГЦ и ГЦК на флуоресценцию DCF в лимфоцитах. (инкубация 30 мин при 37ºС) 20 40 Время, мин 60 80 Рис. 3. Сравнение действия NMDA, ГЦ и ГЦК на флуоресценцию DCF в лимфоцитах (концентрация агонистов 0,5 мМ, температура 37ºС) Графики концентрационной и временной зависимостей для ГЦ и NMDA имеют сходный характер, в то время как действие ГЦК имеет особенности: в присутствии ГЦК нарастание свободных радикалов происходит быстрее и достигает более высоких значений. Следует отметить, что в разных опытах эффект этих соединений на уровень свободных радикалов в лимфоцитах варьировал в широких пределах. Вероятно, этот факт можно объяснить разным физиологическим состоянием самих животных и их индивидуальными особенностями. 2. Обнаружение функционально активных NMDA-рецепторов на мембране лимфоцитов периферической крови крыс Исходя из того, что влияние NMDA на лимфоциты предотвращается антагонистом NMDA-рецепторов МК-801 (таблица 1) и имеется аналогия в действии на лимфоциты NMDA, ГЦ и ГЦК, а также прослеживается их явное 9 структурное сходство, можно было предположить, что на мембране лимфоцитов крыс экспрессируются функционально активные NMDAрецепторы, обладающие способностью реагировать на ГЦ и ГЦК. Таблица. 1. Эффект NMDA на флуоресценцию DCF в лимфоцитах крысы в отсутствие и присутствии МК-801 (время инкубации 30 мин). «*» – (p<0,05 по сравнению с контролем); «**» – (p<0,05 по сравнению с NMDA) Флуоресценция DCF, % от контроля Условия инкубации Контроль 100±1 0,5 мМ NMDA 207±3 * 0,5 мМ NMDA+10 μМ МК-801 105±2** Для проверки этого предположения мы использовали моноклональные анти-NMDA антитела к NR1 субъединице этого рецептора (рис. 4). Рис. 4. Вид популяции лимфоцитов в контрольных условиях (А) и после обработки клеток моноклональными антителами к NR1 субъединице NMDA-рецептора (Б). Видно, что после обработки антителами часть клеточной популяции демонстрирует более высокие значения флуоресценции, отражая присутствие на мембране этих клеток NR1 субъединиц NMDA-рецептора 10 На приведенном рисунке видно, что в популяции лимфоцитов, выделенных из периферической крови крыс, имеются клетки, взаимодействующие с антителами на NR1 субъединицу NMDA-рецептора. Это позволило нам утверждать, что на мембране лимфоцитов действительно присутствуют функционально активные NMDA-рецепторы, способные реагировать увеличением уровня свободных радикалов в ответ на добавление NMDA. 3. Исследование действия ГЦК на NMDA-рецепторы лимфоцитов Полученные нами данные позволяли предположить, что действие гомоцистеина и его метаболитов в кровяном русле может быть направлено на лимфоциты и реализоваться с участием глутаматных рецепторов. Для оценки этого действия мы использовали ГЦК, как соединение, эффект которого наиболее выражен. Чтобы определить, какие классы рецепторов могут быть вовлечены во взаимодействие с ГЦК, мы использовали: МК-801 – антагонист NMDA рецепторов, который реализует свое действие, блокируя канал NMDAрецептора; D-AP5 – антагонист NMDA-рецепторов, предотвращающий 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Рис. 5. Действие разных антагонистов NMDA-рецепторов на флуоресценцию DCF, вызванную инкубацией ** лимфоцитов с 0,25 мМ ГЦК (15 мин). Концентрации антагонистов: МК–801 10 μМ, D-AP5 10 μМ. * ** ** ** 5 AP D- 01 -8 МК 5 DК+ ГЦ К+ МК -8 0 AP 1 К ГЦ ГЦ ро ль «*» – соответствует достоверности относительно контроля с величиной p<0,05, нт ко ф луо р есцен ци я D C F , % о т ко нтро ля связывание лиганда с рецептором (рис.5). 11 «**» – соответствует достоверности относительно ГЦК с величиной p<0,05 Полученные данные указывают на то, что действие ГЦК на лимфоциты опосредовано NMDA-рецепторами. Тот факт, что оба антагониста NMDAрецептора, МК-801 и D-AP5, предотвращают эффект ГЦК, указывает, что ГЦК не только связывается с NMDA-рецептором на мембране лимфоцитов, но и вызывает открывание канала рецептора, через который происходит вход кальция в клетку. В связи с этим мы провели оценку изменения уровня внутриклеточного кальция в ответ на действие ГЦК. Результаты, представленные на рис. 6, указывают на то, что инкубация лимфоцитов с ГЦК приводит не только к росту свободных радикалов (как уже отмечалось выше), но и к увеличению уровня внутриклеточного кальция. Рис. 6. Временная зависимость действия ГЦК (0,25 мМ) на стационарный уровень ионизированного кальция (оценивается по изменению флуоресценции Fluo3) в лимфоцитах крыс. Инкубация при 37ºС Флуоресценция Fluo3, % от контроля 112 110 108 106 104 102 100 98 96 0 10 20 Время, мин 30 40 Для выяснения того, существует ли причинная и временная связь между этими процессами, мы измерили активацию лимфоцитов в присутствии ГЦК и проникающего хелатора ионов кальция BAPTA-AM (10μМ). Оказалось, что в присутствии этого хелатора роста свободных радикалов под действием ГЦК не происходит. Этот факт позволил нам заключить, что первым (инициирующим) из этих двух процессов является рост уровня внутриклеточного кальция, а рост уровня свободных радикалов происходит только после этого. 12 Вход кальция в клетку может регулировать активность большого числа ферментов, что, в конечном итоге, приводит к росту свободных радикалов в лимфоцитах. Поэтому следующим этапом работы явилось выяснение того, какие ферменты вовлечены в внутриклеточным мишеням, обеспечивающим радикалов. и РКС передачу PI-3-киназа являются сигнала от рецепторов продукцию ключевыми к свободных ферментами, находящимися в начале этого регуляторного пути [Jones et al., 2000; Kashiwada et al., 2007]. 4. Исследование роли PKC и PI-3-киназы в активации лимфоцтов гомоцистеиновой кислотой Для проверки того, что активация протеинкиназы С в лимфоцитах приводит к росту свободных радикалов в этих клетках, нами был использован активатор этой протеинкиназы ФМА, а для оценки его специфичности – специфический ингибитор РКС – хелеритрин (IC50 = 660 нм) [Herbert et al., 1990] (таблица 2). Таблица 2. Действие ингибитора РКС хелеритрина на флуоресценцию DCF, вызванную инкубацией лимфоцитов с ФМА. Используемая концентрация ФМА 10-7 М («*» – p<0,05 по сравнению с контролем, «**» – p<0,05 по сравнению с ФМА) Флуоресценция DCF, % от контроля Название пробы Контроль 100±3 ФМА 10-7 М 149±2* ФМА 10-7 М + хелеритрин 10 µМ 95±5** При добавлении к клеткам ФМА наблюдалось увеличение уровня свободных радикалов в клетке, а в присутствии хелеритрина флуоресценция DCF, вызванная ФМА, не увеличивалась по сравнению с контролем. Этот 13 факт доказывает, что в используемых нами условиях действие ФМА на РКС в лимфоцитах является специфическим. Далее мы исследовали вовлеченность РКС в ГЦК-индуцированный рост свободных радикалов, для чего оценили влияние ГЦК на флуоресценцию DCF в присутствии хелеритрина. Согласно полученным данным, представленным на рис. 7, при инкубации лимфоцитов с ГЦК в присутствии двух различных концентраций хелеритрина роста уровня свободных радикалов в клетке не наблюдается. Это свидетельствует о том, что ГЦК, взаимодействуя с лимфоцитами, запускает сигнальный каскад, ключевым ферментом которого является протеинкиназа С. Для оценки вовлеченности PI-3-киназы в ГЦК-индуцированное увеличение уровня свободных радикалов в лимфоцитах был использован ее специфический ингибитор LY 294002 (IC50 = 1,4 μМ) [Vlahos et al., 1994]. На рис. 7 видно, что LY 294002 даже в концентрации, соответствующей десятикратной величине IC50, не препятствует действию ГЦК. Таким образом, PI-3-киназа, в противоположность PKC, не вовлекается 150 * 140 ** 130 ** 120 ** 110 100 мк М 02 40 29 ГЦ К+ LY К+ ГЦ К+ ГЦ Хе л1 0м Хе л1 мк кМ М К ГЦ нт ро ль 90 ко % от кон троля, ф луоресцен ция D C F в процесс генерации радикалов в лимфоцитах, который инициирует ГЦК. 14 Рис. 7. Действие ингибитора протеинкиназы С хелеритрина (Хел) и ингибитора PI-3киназы LY294002 на флуоресценцию DCF, вызванную инкубацией с 0,25 мМ ГЦК (15 мин). «*» – соответствует достоверности относительно контроля с величиной р<0,05, «**» – соответствует достоверности относительно ГЦК с величиной р<0,05 5. Источники свободных радикалов при активации лимфоцитов гомоцистеиновой кислотой Основным источником АФК в нейтрофилах считают НАДФНоксидазу. Недавно в лимфоцитах был также найден этот комплекс [Jackson et al., 2004], что делало целесообразным исследование его участия в ГЦКиндуцированном росте свободных радикалов. Другим источником свободных радикалов в лимфоцитах может быть кальций-зависимая NO-синтаза [Karupiah et al., 2000]. Возможно, в этой системе она также задействована в реализации сигнала от глутаматных рецепторов. Свободные радикалы в клетках могут образовываться и при работе дыхательной цепи митохондрий. В настоящей работе мы проверили вовлеченность всех трех вышеуказанных процессов в образование свободных радикалов при активации лимфоцитов ГЦК. Вовлеченность НАДФН-оксидазы и NO-синтазы в генерацию свободных радикалов при действии ГЦК на лимфоциты была проверена с помощью ингибиторов НАДФН-оксидазы (апоцинина) и NO-синтазы (Nнитроаргинина). Мы использовали различные концентрации ингибиторов, учитывая их величины IC50. Так, для апоцинина IC50 = 10 μМ [Stefanska et al., 2008], а для NNA = 0,35 μМ [Alderton et al., 2001]. На рис. 8 представлены данные по ингибированию НАДФН-оксидазы различными концентрациями апоцинина. Отчетливо видно, что повышение концентрации апоцинина приводит к пропорциональному снижению эффекта ГЦК. Для характеристики работы NO-синтазы в лимфоцитах мы использовали субстрат этого фермента L-аргинин и его ингибитор Nнитроаргинин и обнаружили, что NO-синтаза в исследуемых клетках также функционально активна и активация данного фермента снимается специфическим ингибитором NNA. Убедившись в этом, мы исследовали вовлеченность данного фермента в эффект, вызванный ГЦК на лимфоцитах. 15 ф л у о р е сц ен ц и я D C F , % о т ко н тр о л я 125 * 120 115 ** 110 105 ** ** 100 ** 95 90 контроль ГЦК ГЦК+ ГЦК+ ГЦК+ ГЦК+ апоцинин апоцинин апоцинин апоцинин 5мкМ 10мкМ 20мкМ 50мкМ Рис. 8. Действие различных концентраций ингибитора НАДФНоксидазы апоцинина на флуоресценцию DCF, вызванную инкубацией лимфоцитов с ГЦК. «*» – соответствует достоверности относительно контроля с величиной р<0,05, «**» – соответствует достоверности относительно ГЦК с величиной р<0,05 В таблице 3 представлены данные по ингибированию NO-синтазы различными концентрациями NNA. Видно, что эффект имеет отчетливую дозовую зависимость. Из приведенных данных следует, что как апоцинин, так и N-нитроаргинин предотвращают увеличение флуоресценции, вызванное добавлением ГЦК, и эти эффекты являются дозо-зависимым. Этот факт свидетельствует, что как НАДФН-оксидаза, так и NO-синтаза участвуют в генерации свободных радикалов при инкубации лимфоцитов с ГЦК. Таблица 3. Действие ингибитора NO-синтазы NNA на флуоресценцию DCF, вызванную инкубацией лимфоцитов с ГЦК. «*» – соответствует достоверности относительно контроля с величиной р<0,05, «**» – достоверности относительно ГЦК с величиной р<0,05 Состав проб Флуоресценция DCF, отн. ед. ГЦК 24±4* ГЦК+NNA 0,7 μМ 20±3 ГЦК+NNA 3,5 μМ 10±3** ГЦК+NNA 30 μМ 3±4** 16 Сложно сказать, какой из этих ферментов в большей степени вовлекается в ответ лимфоцитов на добавление ГЦК, поскольку и тот, и другой ингибитор почти полностью предотвращают ГЦК-индуцированное увеличение стационарного уровня свободных радикалов. Это позволяет предположить существование общего промежуточного радикала, участвующего в реализации эффекта ГЦК в лимфоцитах. Кроме этого, мы оценили, участвует ли в исследуемом процессе дыхательная цепь митохондрий. Для этого был использован DHR 123 – флуоресцентный зонд, проникающий в митохондрии и отражающий количество свободных радикалов в них. Оказалось, что уровень флуоресценции DHR не изменяется при инкубации лимфоцитов с ГЦК по сравнению с контрольными клетками. Следовательно, дыхательная цепь не вовлечена в процесс генерации радикалов в лимфоцитах, запускаемый ГЦК. В результате проведенных экспериментов мы убедились, что ГЦ и ГЦК могут стимулировать рост уровня свободных радикалов в лимфоцитах, активируя NMDA-рецепторы. Однако функция образующихся при этом свободных радикалов оставалась не ясной. При анализе клеток с флуоресцентным зондом PI, в популяции не было обнаружено мертвых клеток (рис. 9), из чего следует, что образующиеся свободные радикалы в используемых условиях не приводят к окислительному стрессу клетки и ее смерти. Опираясь на данные литературы о том, что свободные радикалы в лимфоцитах могут выполнять функции вторичных мессенджеров и приводить к изменению в иммунных функциях этих клеток [Arnold et al., 2001; Jackson et al., 2004], мы предприняли исследование того, как влияют ГЦ и ГЦК на продукцию цитокинов лимфоцитами. 17 А Б Рис. 9. Вид популяции лимфоцитов в контрольных условиях (А) и после инкубации с 0,25 мМ ГЦК (Б) в координатах PI/DCF. Линией обозначена граница, выше которой должны находится мертвые клетки 6. Оценка продукции цитокинов лимфоцитами Ранее в нашей лаборатории были проведены исследования по идентификации субпопуляций лимфоцитов, которые участвуют в реализации клеточного ответа на активацию глутаматных рецепторов. С помощью специфических антител было показано, что такими клетками являются Тлимфоциты и НK-клетки [Mashkina et al., 2007]. Об активации Т-лимфоцитов обычно судят по продукции IFN-γ и некоторых других цитокинов [Ройт и соавт., 2000]. Поэтому мы решили оценить влияние ГЦ и ГЦК на способность лимфоцитов продуцировать различные цитокины. Были выбраны два основных цитокина, продуцируемых Т-лимфоцитами и НKклетками – IFN-γ и TNF-α. Проведенные исследования показали, что продукция IFN-γ лимфоцитами, активированными Соn A, дополнительно активируется ГЦ, в то время как действие ГЦ на не активированные Соn A лимфоциты, пренебрежимо мало (рис. 10). В этих опытах было получено, что ГЦК проявляет гораздо более слабое активирующее влияние. 18 1600 * IFN-gamma, % от контроля 1400 1200 1000 Рис. 10. Влияние ГЦ на продукцию IFN-γ активированными лимфоцитами. «*» – соответствует достоверности относительно контроля с величиной р<0,05 800 600 400 * 200 0 контроль ГЦ con A con A+ГЦ Аналогичные данные были получены и при анализе продукции TNF-α; ГЦ увеличивает продукцию TNF-α активированными клетками, и этот эффект снижается при использовании антагонистов NMDA-рецепторов; влияние ГЦК выражено гораздо слабее (рис. 11). На рис. 11 также видно, что МК-801, антагонист NMDA-рецептора предотвращает действие ГЦ на продукцию цитокинов лимфоцитами, свидетельствуя, что NMDA-рецепторы, задействованные, как мы показали, в продукции свободных радикалов в присутствии ГЦ (см. гл.1 и 3), участвуют и в регуляции этого процесса. Рис. 11. Влияние 0,5 мМ ГЦ и 10 µМ МК-801 на продукцию TNF-α активированными лимфоцитами. TNF-alpha, % от контроля 600 ** 500 400 300 «*» – (p<0,05 по сравнению с контролем), «**» – (p<0,05 по сравнению с Сon A + ГЦ). * ** 200 100 0 1 2 3 4 5 19 1 – контроль, 2 – Сon A, 3 – Сon A+ГЦ, 4 – Сon A+ГЦ+МК-801, 5 – ГЦ Возможно, что ГЦ является посредником между иммунной и нервной системами, связывая их в единую функциональную сеть. Обращает на себя внимание и тот факт, что влияние ГЦ и ГЦК на продукцию свободных радикалов и продукцию цитокинов неравнозначно. ГЦ вызывает меньший, по сравнению с ГЦК, рост уровня свободных радикалов в лимфоцитах, но имеет гораздо более сильное влияние на продукцию цитокинов, нежели ГЦК. Однако количественное сопоставление действия этих лигандов на 2 исследуемых процесса провести сложно вследствие неодинаковых условий эксперимента – рост уровня свободных радикалов мы наблюдаем через 15-30 мин промежуток времени, который недостаточен для измерения продукции цитокинов – их измерение проводится через 72 часа инкубации. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В своей работе мы показали, что гомоцистеин, взаимодействуя с NMDA-рецепторами на мембране лимфоцитов, увеличивает уровень кальция и свободных радикалов в клетке, что, в конечном итоге, приводит к увеличению продукции лимфоцитами IFN-γ и TNF-α. В этих процессах задействованы PKC, НАДФН-оксидаза и NO-синтаза. Полученные данные позволяют считать, что в кровяном русле в условиях гипергомоцистеинемии ГЦ и продукты его обмена (главным образом, ГЦК) могут оказывать систематическую стимуляцию клеток иммунной системы, тем самым истощая ее и являясь серьезным фактором риска при возникновении ряда заболеваний. Нельзя исключить, что при нормальном уровне гомоцистеина в крови он может служить регулятором вышеназванных рецепторов, модулируя активность иммунной системы. 20 ВЫВОДЫ 1. Методом иммуноцитохимического анализа выявлены ионотропные рецепторы NMDA-класса на мембране лимфоцитов периферической крови крыс. 2. ГЦ и ГЦК вызывают увеличение продукции свободных радикалов в лимфоцитах крысы через активацию NMDA-рецепторов. 3. Охарактеризованы концентрационная и временная зависимости действия ГЦ и ГЦК. Обнаружено, что увеличению внутриклеточного уровня свободных радикалов в лимфоцитах предшествует увеличение концентрации кальция. 4. В реализации эффекта ГЦК участвуют PKС, а также НАДФН-оксидаза и NO-синтаза. 5. Активация лимфоцитов в присутствии ГЦ и ГЦК приводит к усилению продукции IFN-γ и TNF-α; этот эффект ослабляется в присутствии антагониста NMDA-рецепторов МК-801. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ТО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Е.А. Владыченская, О.В. Тюлина, А.А. Болдырев. Влияние гомоцистеина и гомоцистиновой кислоты на глутаматные рецепторы лимфоцитов крысы. Бюлл. эксп. биол. мед., 2006, 142 (№1), 47-50. 2. A.A. Boldyrev, E.R. Bulygina, O.N. Davydova, A.P. Mashkina, E.A. Vladychenskay, O.V. Tyulina. Functional role of glutamate receptors of NMDA class in immune system. Abstr. of the 29th Annual Meeting of the Japan Neuroscience Society (Japan, Kyoto), 2006, OS3P-3-01. 3. E.A. Vladychenskaya, O.V. Tyulina. Effect of glutamate analogs homocysteine and homocysteic acid on blood cells. Abstr. 17th ESN Meeting 21 «Advances in Mol Mechanisms of Neurological Disorders» (Spain, Salamanka), 2007, PS3-22. 4. Е.Р. Булыгина, Е.А. Владыченская, А.В. Махро, О.В.Тюлина. Гомоцистеин как фактор риска для нервной и иммунной систем. В материалах ХХ съезда Физиол. общества имени И.П. Павлова (Москва), 2007, с. 21. 5. Е.А. Владыченская. Влияние гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты на лимфоциты крысы. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». Москва, с. 179. 6. А.А. Болдырев, Е.А. Владыченская, Л.В. Карпова, Е.А. Брюшкова, Е.Е. Аккуратов, М.С. Беляев, И.С. Добротворская, О.А. Трунова. Роль природных факторов в защите мозга от окислительного стресса. Международная конференция «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». Санкт-Петербург, 2008, с. 19. 7. E. Vladychenskaya, S. Urano, A. Boldyrev. Effect of homocysteine and homocysteic acid on blood cells. Int. Symp. on lipid peroxidation (Karuizawa, Japan), 2008, Р-16. 8. L. Karpova, E. Bryushkova, A. Makhro, A. Mashkina, E. Bulygina, E. Vladychenskaya, M. Stepanova, T. Fedorova, A. Boldyrev. Toxic effect of homocysteine on nervous and immune system. In Abstr. book of Ehrlich II World Conf. on Magic Bullets (Nurnberg, Germany), 2008, p.151. 9. Е.А. Владыченская, А.А. Болдырев. Влияние гомоцистеина на дыхательный взрыв нейтрофилов, вызванный индуктором хемотаксиса fMLP. Нейрохимия, 2009, 26 (1), 72-78. 10. E. Bryushkova, E. Vladychenskaya, T. Fedorova, A. Boldyrev. Molecular mechanisms of homocysteine toxicity. 7th Int. Conf. on Homocysteine Metabolism (Prague, Czech Republic), 2009, p.60. 22
