Диссертация Гадецкая А.В

Казахский национальный университет имени аль-Фараби
УДК 661.123
На правах рукописи
ГАДЕЦКАЯ АНАСТАСИЯ ВАЛЕРЬЕВНА
Выделение субстанций из надземной части и корней растений рода
Limonium и их стандартизация
6D072100 - Химическая технология органических веществ
Диссертация на соискание ученой степени
доктора философии (PhD)
Научные консультанты
доктор химических наук,
профессор Жусупова Г.Е.
PhD, профессор
Университета Миссисипи
Самир А. Росс
Республика Казахстан
Алматы, 2015
СОДЕРЖАНИЕ
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.4.1
1.4.2
2
2.1
2.1.1
2.1.2
2.2
2.2.1
2.2.2
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
2.4
2.5
2.6
2.6.1
2.6.2
2.6.3
2.6.4
2.7
2.7.1
2.7.2
2.7.3
2.7.4
2.7.5
НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ……………………………………...
ОПРЕДЕЛЕНИЯ……………………………………………………
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ………………………….…
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………….…….
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Особенности растений рода Limonium…………………….………..
Историческая
перспектива
природных
соединений
и
традиционной медицины…………………………………….………
Флавоноиды, их классификация, структура и биологическое
значение………………………………………………………………
Опиоиды, опиодные рецепторы и лечение при болях…………..…
Структуры опиоидных рецепторов; терапевтический потенциал
селективных агентов κ рецепторов…………………………………
Идентификация флавоноидов как потенциальных лигандов
опиоидных рецепторов………………………………………………
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
Характеристика растительного сырья………………………………
Основные используемые реагенты, растворители и приборы…….
Методы исследования
Хроматография………………………………………………….……
Спектральный анализ………………………………………………...
Подтверждение подлинности и качества сырья
Методика исследования макро- и микроскопии…………………
Микробиологическая чистота……………………………………….
Радионуклидный контроль…………………………………………
Определение содержания тяжелых металлов……………………....
Количественное содержание действующих веществ……………...
Исследование состава эфирных масел……………………………...
Разработка технологии выделения субстанций из исследуемых
растений и разделение их комплекса биологически активных
веществ (БАВ) на индивидуальные соединения…………………...
Limonium myrianthum……………………………………………….
Limonium gmelinii……………………………………………………..
Limonium caspium…………………………………………………….
Limonium leptophyllum………………………………………………..
Скрининг биологической активности
Противомалярийная и антипротозойная активности……………...
Антибактериальная и противогрибковая активности……………...
Противораковая активность…………………………………………
Антиоксидантная активность………………………..………………
Каннабиноидная и опиоидная активности…………………………
2
4
5
6
8
13
15
17
19
24
29
31
31
32
34
36
37
37
38
38
39
40
41
43
44
44
45
46
47
48
49
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Показатели качества изучаемых видов сырья и количественное
содержание в них действующих веществ…………………………..
Получение субстанции в производственных условиях и анализ
фармрынка……………………………………………………………
Определение состава и активности эфирных масел исследуемых
растений………………………………………………………………
Разработка и составление схем разделения субстанций на
индивидуальные вещества. Их идентификация.
Взаимодействие выделенных соединений с опиодными
рецепторами…………………………………………………………..
Биоскрининг активностей (антималярийная, антипротозойная,
противогрибковая, антибактериальная и противораковая) для
выделенных экстрактов и индивидуальных веществ…………….
Метаболический анализ методом ВЭЖХ-MC (фингерпринтинг)
исследуемых растений и субстанций на их основе ………..
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………….…….
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ………….…
ПРИЛОЖЕНИЯ……………………………………………….…....
3
50
53
63
72
112
117
129
132
135
150
НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
В настоящей диссертации использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 13979.6-69 – Жмыхи, шроты и горчичный порошок. Метод
определения золы.
ГОСТ 14.004-83 (с изменениями от 01.01.1989) – Технологическая
подготовка производства. Термины и определения основных понятий.
СТ РК 3.17-2000 Государственная система сертификации Республики
Казахстан. Порядок сертификации лекарственных средств.
СТ РК 978-2001 – Экстракты из растительного сырья. Технические
условия. МУ 64-09-001-2002 – Производство лекарственных средств. Персонал
фармацевтических предприятий. Основные положения.
СТ РК 1617-2006 – Производство лекарственных средств. Надлежащая
производственная практика. Основные положения.
СТ РК ЕН 13427-2007 – Ресурсосбережение. Упаковка. Требования к
применению стандартов в области упаковки и упаковочных материалов.
СТ РК 1.9-2007 – Государственная система технического регулирования
Республики Казахстан. Порядок применения международных, региональных и
национальных стандартов государств, других нормативных документов по
стандартизации в Республике Казахстан.
СТ РК 1774-2008 – Оценка соответствия. Требования к оценке
лабораторий в области GLP.
ГК РК 04 – 2008 – Классификатор продукции по видам экономической
деятельности.
СТ РК 3.74-2010 – Государственная система технического регулирования
Республики Казахстан. Оценка соответствия. Руководство по подтверждению
соответствия медицинской техники и средств санитарно-гигиенического
назначения.
ГОСТ 10993-12-2011 – Изделия медицинские. Оценка биологического
действия медицинских изделий. Часть 12. Приготовление проб и контрольные
образцы.
ТР ТС 029/2012 – Требования безопасности пищевых добавок,
ароматизаторов и технологических вспомогательных средств.
Постановление Правительства Республики Казахстан от 31 декабря 2013
года № 1573 «О внесении изменения в постановление Правительства
Республики Казахстан от 8 февраля 2011 года № 102».
Постановление Правительства Республики Казахстан от 24 февраля 2014
года № 142 «Об утверждении стандартов государственных услуг в сфере
фармацевтической деятельности».
ГОСТ 32627-2014 – Методы испытаний химической продукции,
представляющей опасность для окружающей среды. Наземные растения.
Испытание на фитотоксичность.
ГОСТ 33044-2014 – Принципы надлежащей лабораторной практики.
4
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В настоящей диссертации применяют следующие термины с
соответствующими определениями.
Валидация
(Validation)
–
документированное
подтверждение
соответствия оборудования, условий производства, технологического процесса,
качества полупродукта и готового продукта действующим регламентам и/или
требованиям нормативной документации.
Внутрипроизводственный
контроль
(технологический,
межоперационный) (In-process Control) – проверки, выполняемые в ходе
производства с целью контроля и, в случае необходимости, корректировки
параметров технологического процесса для того, чтобы продукция
соответствовала требованиям спецификации. Контроль состояния окружающей
среды
или
оборудования
также
рассматривается
как
элемент
межоперационного контроля.
Контаминация (Contamination) – нежелательное внесение примесей
химического или микробиологического происхождения или постороннего
материала в исходный материал, промежуточный продукт или лекарственную
субстанцию в ходе производства, отбора проб, упаковки или переупаковки,
хранения или транспортирования.
Лекарственные средства – лекарственное вещество, субстанция или
смесь
веществ
синтетического
или
природного
происхождения,
представленные в виде лекарственной формы (таблетки, капсулы, растворы и
др.), прошедшие клинические испытания и разрешенные уполномоченным на
то органом в установленном порядке к применению для профилактики,
диагностики и лечения заболеваний.
Лекарственное средство из растительного сырья (Herbal Medicinal
Product) – лекарственное средство, содержащее в качестве активных
ингредиентов исключительно растительное сырье или препараты на их основе.
Препарат сравнения (Comparator Product) – зарегистрированное
лекарственное средство или плацебо, используемые в качестве контроля в
клиническом исследовании.
Спецификация (Specification) – стандарт организации, подробно
описывающий перечень испытаний, ссылок на аналитические методики и
соответствующие критерии приемлемости, устанавливающий численные
границы, диапазоны или критерии, которым должны соответствовать
используемые или получаемые в процессе производства продукция, сырье и
материалы.
Стандарт GMP (Good Manufacturing Practice) – надлежащая практика
производства; система норм, правил и указаний в отношении производства
лекарственных средств, медицинских устройств, изделий диагностического
назначения, продуктов питания, пищевых добавок и активных ингредиентов.
5
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
АДФ
БАВ
БСА (BSA)
ВАНД
ВЭЖХ
ГДФ, ГТФ
ГХ
ГФ РК
ДМСО
ДФМО
ЖЖЭ
ЖКТ
ККСВ
КоА (CoA)
КОЕ
НД
НЦЭЛС
МЗСР РК
МС
МДА
ПА
Поз.
ПОЛ
СГ
СГ/ОФ
ТБК
ТМ
ТП
ТСХ
ТФЭ (SPE)
уш. с
цАМФ
Ас
СD3ОD
СDСl3
DCM
DMSO-d6
DOR (DOP)
EI
ELs
Аденозиндифосфат
Биологически активные вещества
Бычий сывороточный альбумин (Bovine Serum Albumin)
Временный аналитический нормативный документ
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Гуанозиндифосфат, гуанозинтрифосфат
Газовая хроматография
Государственная Фармакопея Республики Казахстан
Диметилсульфоксид
Дифторметилорнитин
Жидкость-жидкостная экстракция
Желудочно-кишечный тракт
Константы спин-спинового взаимодействия
Кофермент А (коэнзим А)
Колониеобразующая единица
Нормативная документация
Национальный центр экспертизы лекарственных средств,
изделий медицинского назначения и медицинской техники
Министерства здравоохранения и социального развития
Республики Казахстан
Масс-спектрометрия
Малоновый диальдегид – продукт ПОЛ
Полиамид
Позиция
Перекисное окисление липидов
Силикагель
Силикагель/обратная фаза
Тиобарбитуровая кислота – реагент для МДА
Трансмембранный регион
Технологический процесс
Тонкослойная хроматография
Твердофазная экстракция (solid phase extraction)
Уширенный синглет
Циклический аденозинмонофосфат
Ацетон
Дейтерированный метанол
Дейтерированный хлороформ
Dichloromethane – дихлорметан (хлористый метилен)
Дейтерированный диметилсульфоксид
δ opioid receptor – дельта (δ) опиодный рецептор (δ opioid
peptide – δ опиоидный пептид)
Electron ionization – электронная ионизация
Extracellular loops – внеклеточные петли
6
ERK
EtOAc
FID
FTIR
GAP
Gs
Gi
Go
GLP
GMP
GRKs
HMBC
HMQC
HRMS
IC50
ILs
in vivo,
in vitro
JDTic
KOR (KOP)
L.
MAPK
MeOH
MOR (MOP)
ORL1
ppm
RP
UV-VIS
VLC
Extracellular
signal-regulated
kinase
–
внеклеточная
регулируемая киназа (классическая MAPK)
Этилацетат
Flame ionization detector – пламенно-ионизационный детектор
(ПИД)
Fourier Transform InfraRed – инфракрасная Фурьеспектроскопия
Good Agricultural Practice (надлежащая сельскохозяйственная
практика)
Стимулирующий G-белок
Ингибирующий G-белок
Аналогичный Gi G-белок с неизвестной функцией
Good Laboratory Practice (надлежащая лабораторная практика)
Good Manufacturing Practice (надлежащая производственная
практика)
G protein coupled receptor kinases – киназы рецепторов,
связанных с G-белками (GRK-киназы)
(Heteronuclear multiple bond connectivity) гетероядерная
многополосная корреляция в двумерных спектрах ЯМР
Нeteronucler Мultiple Quantum Сoherence – используют для
обнаружения корреляции протона и углерода 1H/13C (одна
связь)
High Resolution Mass Spectrometry – масс-спектрометрия
высокого разрешения
50 % ингибирующая концентрация препарата (концентрация
полумаксимального ингибирования)
Intracellular loops – внутриклеточные петли
Технология выполнения экспериментов, когда опыты
проводятся внутри и вне живой клетки
Производное 4-фенилпиперидина – первый селективный,
действующий для приема внутрь κ опиоидный антагонист
κ opioid receptor – каппа (κ) опиодный рецептор (κ opioid
peptide – κ опиоидный пептид)
Limonium – кермек
Mitogen-activated protein kinase – митоген-активируемая
протеинкиназа (сигнальный путь)
Метанол
μ opioid receptor – мю (μ) опиодный рецептор (μ opioid peptide
– μ опиоидный пептид)
opioid-receptor-like – ноцицептиновый рецептор (NOP)
Parts per-million – миллионная доля (10-6)
Reversed Phase – обращено-фазовый силикагель
Ultra Violet-Visible – видимый ультрафиолет
Vacuum Liquid Chromatography – вакуумно-жидкостная
хроматография
7
ВВЕДЕНИЕ
Общая характеристика работы.
Данная работа посвящена разработке оптимального метода получения
субстанций на основе растений рода Limonium, их стандартизации, а также
исследованию биологической активности с целью получения отечественных
лекарственных средств.
Оценка современного состояния решаемой задачи.
Исследованием растительных ресурсов в Казахстане занимаются еще с
1921 года. Такой интерес оправдан специфичностью флоры страны, ее
почвенно-климатическими условиями и особенностями филогенетического
развития [1]. Огромный вклад в изучение дикорастущих растений Казахстана
внесли коллективы ученых Института фитохимии МОН РК, Института
биологии и биотехнологии растений НЦБ МОН РК и Казахского
национального университета им. аль-Фараби. Однако, доля растений, которые
были использованы для фитохимического анализа и выявления биологических
активностей, незначительна. Род Limonium Mill изучался довольно широко,
начиная с 1960-х годов. Первые исследования проводились в области изучении
транспортировки ионов и воды данными растениями, так как они имеют
специальные солевые железки, которые служат для выведения избытка
минеральных солей ввиду их произрастания на засоленных почвах [2].
Последующие исследования заключались в определении биологического
действия данных растений, например гепатопротекторная активность и др. [34]. Одно из направлений изучения данных растений было связано с большим
содержанием дубильных веществ в них [5]. По сей день ведутся разработки по
определению химического состава и поиск новых видов растений рода
Limonium Mill благодаря их эвентуальной физиологической активности [6].
Сведения о патентных исследованиях и планируемом научнотехническом уровне разработки.
Анализ патентных данных для установления степени изученности
химического состава и биологической активности растений рода Limonium
показал, что основной процент исследований по данной теме приходится на
Китай [7]. Установление компонентного состава надземной части растений
вида Limonium caspium было осуществлено впервые. Основная часть БАВ в
составе исследуемых растений представляет собой полифенольные соединения
[8], которые обладают выраженной антивирусной, противоопухолевой,
противовоспалительной, ранозаживляющей, антиоксидантной, а также
гепатопротекторной активностью [9-10].
Обоснование проведения исследования. Основание и исходные данные
для разработки темы.
Предварительно нами было проведено исследование биологической
активности некоторых видов лекарственных растений, произрастающих на
территории Казахстана. Так на основе корней L. gmelinii ранее был получен ряд
лекарственных средств, внедренных в медицину под единым названием
«Лимонидин» в виде мази, сиропа и настойки [11]. Комплексное использование
8
растительного сырья, совместно с его надземной частью, является более
рациональным для сохранения отечественной флоры. При этом для данного
вида, как и для вида L. myrianthum, имеются достаточные сырьевые запасы.
Растения вида L.caspium произрастают в аридных зонах, а вида L. leptophyllum
являются эндемичными. В процессе эволюции у растений вырабатываются
адаптивные механизмы защиты к повреждающим воздействиям. Так как
Республика Казахстан имеет разнообразные природные ландшафты и
климатические условия, вполне понятна уникальность химического состава
растений страны. Доступность растительного сырья и условия произрастания –
это основные факторы при выборе объектов для последующих их
фитохимических и биологических исследований.
Актуальность проблемы.
Фармацевтический рынок это один из важнейших секторов развития
экономики любой страны, который служит показателем оптимального уровня
благосостояния населения. Тем не менее, налаживание фармацевтического
производства представляет собой долговременный и много затратный процесс.
Отечественной фармации все еще требуется наращивание производственных
мощностей. Всего в Республике Казахстан зарегистрировано и внесено в
Государственный реестр 14869 наименований лекарственных средств, при этом
доля отечественных препаратов составляет около 14 %, т.е. фармацевтический
рынок Казахстана зависит от импортной продукции [12]. Формирование
национальной лекарственной политики государства должно строиться на
принципах рационального производства, обеспечения соответствующего
качества и доступности отечественных лекарств. Для этого необходимо
учитывать реальную потребность в лекарственных препаратах и использовать
научно-исследовательский потенциал.
Научная новизна.
- впервые надземная часть растений вида L. gmelinii введена в медицину,
Государственный реестр лекарственных средств РК и в Государственную
Фармакопею Республики Казахстан;
- впервые разработанная лабораторная технология получения субстанции
из надземной части L. gmelinii апробирована в производственных условиях ФК
«Ромат», составлена и утверждена нормативная документация на субстанцию;
- впервые из растений вида L. caspium и L. leptophyllum выделены шесть
новых, ранее неописанных в литературе соединений: (2S,3S)-5метилдигидромирицетин-3`-О-сульфат, (2S,3S)-5-метилдигидромирицетин, 3метил-бут-3-ен-1-ил-4-О-α-L-рамнопиранозил-β-D-глюкопиранозид, 2-метилэритритол-галлат, дигидромирицетин-3`-О-сульфат и мирицетин-3`-О-сульфат;
- впервые из растений вида L. myrianthum, выделены четыре вещества: 1,2бис-(4,4´-фенил)-этан,
1,3-бис-(4,4´-фенил)-пропан,
1,3-бис-(4,4´-фенил)пропан-2-ол и цис-2-октил-3-пентил-оксиран, которые ранее были получены
только синтетическим путем;
- впервые из исследуемых видов растений рода Limonium были выделены
12 соединений: β-ситостерол-β-D-глюкозид-6-монолинолениат, таранинин,
флоридзин, тирамин, дигидромирицетин-3-O-рамнозид, (2R,3R)-3,5,7,3´,4´9
пентагидроксифлаванонол-3-O-(3´´-галлоил)-α-L-рамнозид,
кемпферол-3галлат, бергенин, мирицетин-3-галлат, 3´,4´,5,5´,7-пентагидроксифлаванон,
геранин А и франгулаэмодин;
- впервые изучен состав и ларвицидная активность эфирных масел
исследуемых видов растений рода Limonium;
- впервые для галловой кислоты, мирицетина, 3-О-β-D-(3´´-галлоил)глюкопиранозид
мирицетина,
3-О-β-D-(6´´-галлоил)-глюкопиранозид
мирицетина и мирицетин-3-О-α-L-арабинопиранозида выявили высокую
антипротозойную, противогрибковую, антибактериальную и противораковую
активности, а для тирамина – высокое противомалярийное действие;
- впервые для выделенных индивидуальных веществ проведено
компьютерное
моделирование
и
определены
закономерности
их
взаимодействия с опиоидными рецепторами;
- впервые отработан метод фингерпринтинг для идентификации растений
рода Limonium и установления хемотаксономических маркеров;
Связь данной работы с другими научно-исследовательскими
работами.
Результаты диссертационной работы были включены в отчеты о научноисследовательской работе по проектам: «Технология переработки надземной
части промышленно значимых, дикорастущих растений республики Казахстан
для получения на их основе оригинальных лекарственных средств в виде
настоек, таблеток и капсул и их комплексное исследование» (№ госрегистрации
0115РК00655), «Исследование химического состава субстанций, выделенных из
надземной части растений вида L.gmelinii и L. myrianthum, доклинические
исследования субстанции из L.gmelinii и внедрение в производство
технологической схемы ее получения с учетом требований GMP» (№
госрегистрации 0113РК00838) и «Технология создания нового лекарственного
средства в виде таблеток на основе высокоэффективной субстанции
«Лимонидин», выделяемой из фармакопейного сырья Казахстана» (№
госрегистрации 0112РК01390).
Объекты исследования – растения рода Limonium: надземная часть и
корни видов L. myrianthum и L. gmelinii, а также надземная часть видов
L. caspium и L. leptophyllum.
Целью исследования является определение оптимальных параметров
технологии выделения субстанций из растений рода Limonium (L.), и их
стандартизация.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать показатели качества изучаемых видов растений (L. gmelinii,
L. myrianthum, L. leptophyllum, L. caspium).
2. Установить качественный и количественный состав основных групп
биологически активных веществ (БАВ) в исследуемых видах растений;
3. Внедрить надземную часть L. gmelinii в медицину.
4. Разработать и установить оптимальные технологические параметры
получения субстанций в виде сухих экстрактов из исследуемых растений;
10
5. Провести адаптацию лабораторного способа получения субстанции из
надземной части L. gmelinii к опытно-промышленным условиям ТОО
«Фармацевтическая компания Ромат» (ФК «Ромат»), г. Павлодар.
6. Для стандартизации субстанций разработать и составить рациональные
схемы разделения их комплексов БАВ на индивидуальные соединения и
осуществить идентификацию выделенных веществ.
7. Изучить различные виды активности выделенных из субстанций
индивидуальных веществ для их применения в медицине.
Сведения о метрологическом обеспечении и методологическая база.
Структуры всех выделенных веществ идентифицированы методами
спектрального анализа одномерной (1H и 13C ЯМР, DEPT), двумерной (HMQC,
HMBC, COSY, NOESY), УФ-, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии.
ЯМР-спектры записаны на спектрометрах Bruker Avance DRX – 400 МГц
(с экранированным магнитом, зонд 3 мм), 500 МГц (с переменным контролем
температуры, зонд 3 мм и 4 мм) и Varian – 400 МГц (с переменным контролем
температуры, зонд 3 мм), 600 МГц (с угловым зондом 3 мм для измерения
данных ЯМР с микрограммов образца и подавлением воды).
ИК-спектры получены на ИК-спектрофотометре Bruker Vector 33, с
возможностями ИК-Фурье в ближней и средней областях (оснащен
аксессуарами волоконной оптики для дистанционного зондирования, и
HYPERION IRScope с возможностью нарушенного полного отражения для
твердофазного анализа).
УФ-спектры записаны на приборе UV-VIS-cпектрофотометр компании
Hewlett-Packard 8453 с диодной матрицей, который оснащен 7 передвижными
термостатированными ячейками и отдельным циркулятором воды.
Программный комплекс «Биохимический анализ» позволяет проводить
кинетический анализ и мониторинг в режиме реального времени.
Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) были получены на массспектрометре Micromass Q-TOF Micro с закрытым источником распыления.
Хроматографическое разделение проводилось на силикагеле (размер пор
70-230, Merck) и сефадексе LH-20 (Mitsubishi Kagaku, Токио, Япония).
Пластинки ТСХ (силикагель 60 Å F254) были использованы для мониторинга
фракций
колоночной
хроматографии.
Визуализация
ТСХ-пластинок
проводилась с помощью УФ-лампы (длина волны 254 и 365 нм) и распыления
реагента-проявителя:
анисовый
альдегид/кислота
(МеОН:уксусная
кислота:анисовый альдегид:серная кислота, 85:9:1:5).
Оборудование для молекулярного моделирования: 64-разрядный кластер
Infiniband Scyld Beowulf Linux с двухъядерным процессором Opteron 285 плюс,
головным узлом и мульти терабайтным устройством хранения доступа сети,
Microway WhisperStation 2.5 ГГц Xeon 8-ядерная и Microway WhisperStation
Intel Xeon L5520 2.26 ГГц 16-ядерная рабочие станции, рабочие станции Linux.
Программное обеспечение – Schrodinger, Spartan, Gold, MOE, и
программные пакеты Tripos, лицензии на CambridgeSoft ChemBioOffice,
MestReNova, Gaussian 03, Avogadro.
11
Положения, выносимые на защиту:
- подтверждение соответствия качества исследуемых видов растений
нормативным требованиям ГФ РК и определение в них количественного
содержания основных групп БАВ. Внедрение надземной части растений вида L.
gmelinii в медицину и ее введение в ГФ РК;
- технологическая схема получения субстанции из надземной части
растений вида L. gmelinii, ее адаптация и апробация в опытно-промышленных
условиях ФК «Ромат».
- разделение комплекса БАВ субстанций, полученных из исследуемых
растений на индивидуальные соединения и их стандартизация комплексом
физико-химических констант;
метод
фингерпринтинг
для
установления
систематической
классификации рода Limonium;
- различные виды биологической активности выделенных соединений.
Апробация практических результатов.
Основные выводы по теме диссертации нашли отражение в докладах,
представленных на международных конференциях, симпозиумах и конгрессах:
Xth International Symposium “Chemistry of Natural Compounds” (Узбекистан,
2013), Международная научно-практическая конференция «Свободные
радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине» (Новосибирск,
2013), 5th International symposium-cum-training course on molecular medicine and
drug research (Пакистан, 2015), 15th Annual Oxford International Conference on the
Science of Botanicals ICSB (США, 2015), XIXth International Congress
"Phytopharm 2015" New Phytotherapeutics – Developments, Requirements and
Success for Patients with Rational Phytotherapy (Германия, 2015).
Публикации по теме диссертации.
По результатам диссертации опубликована 21 научная работа, из них 4
статьи в изданиях из перечня, утвержденных Комитетом по контролю в сфере
образования и науки МОН РК; 2 публикации в рейтинговых журналах с
импакт-фактором по базе данных Thomson Reuters (Fitoterapia с импактфактором 2.345 и Planta Medica с импакт-фактором 2.152), 3 статьи в
специализированных журналах ближнего и дальнего зарубежья, 12 тезисов в
материалах профильных международных конференций.
Практическая ценность работы.
Надземная часть растений L. gmelinii внедрена в медицину, введена в
Государственный реестр лекарственных средств РК и ГФ РК. Для получаемой
из нее субстанции составлены и утверждены в ФК «Ромат» технологическая
схема ее производства, ВАНД, данные по стабильности с сохранением всех
показателей ее качества на регламентируемый срок хранения. Проведена
стандартизация субстанций, выделяемых из исследуемых растений. Результаты
исследований внедрены в элективную дисциплину магистров 2 курса:
«Научные основы организации производства лекарственных форм на базе
растительного лекарственного сырья». Выделенные новые соединения
пополнят мировой банк данных впервые идентифицированных органических
веществ.
12
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1 Особенности растений рода Limonium
Биологические особенности рода кермек заключаются быстром росте,
высокой урожайности и легкой адаптации к окружающей среде, а также в
размножении, как семенами, так и вегетативным способом. Эти растения
крайне неприхотливы, выносливы и способны расти на засоленных почвах.
Поэтому их культивирование может быть экологически благоприятным,
например, в аридных зонах [13]. Растения рода Limonium Mill, произрастающие
в Китае, Египте, США, Франции и Англии были исследованы зарубежными
учеными. В связи с этим, соответствующая идентификация биологически
активных соединений, способных вылечить различные заболевания, может
помочь не только в поднятии отечественного фармацевтического рынка, но
также улучшить социально-экономические показатели.
Растения, произрастающие в экстремальных климатических условиях (в
пустынях, на засоленных почвах) несомненно, представляют особый интерес
ввиду некоторых изменений экологических аспектов. Род Limonium является
одним из крупнейших галофитов, содержащих огромное количество
полифенольных соединений, таких как мирицетин, кверцетин, рутин,
3,3´,4´,5,5´,7-гексагидроксифлавон, кверцетин-3-О-α-L-рамнозид, мирицетин-7О-α-L-рамнозид [5, c. 100], мирицитрин, 1-галлоил-β-D-глюкоза, мирицетин-3O-α-L-арабинозид, (+)-галлокатехин, (-)-эппигаллокатехин-3-O-галлат, и
других [14]. Вышеперечисленные соединения выделены из различных видов
данного рода растений: L. popovii [15], L. sinense [16], L. axillare [16-18],
L. sinuatum [19]. Способность данных растений к произрастанию на засоленных
почвах объясняется наличием солевых железок на развитых листьях кермека. У
вида L. gmelinii насчитывается до 700 таких желез на 1 мм, которые могут
выделять примерно 0.05 г соли, т.е. около 1 мм3 раствора в час [20]. Следует
отметить, так как секреция представляет собой активный физиологический
процесс и зависит от температуры, присутствия кислорода и метаболизма,
состав и концентрация солей будет различна, в основном это ионы Na+, K+,
Mg2+, Са+ и Сl-, NO3-, SО4-. При этом, ионы сортируются избирательно, и таким
образом, поддерживается солевой баланс растения. Именно благодаря этой
особенности некоторые представители семейства Plumbaginaceae выносят
значительное содержание тяжелых металлов и других вредных веществ из почв
[21].
Некоторые виды рода Limonium Mill уже давно используются как
красители в связи с высоким содержанием дубильных веществ, особенно в
корнях. Достаточно большое количество исследований было проведено для
выделения и идентификации этих веществ, а также потенциального
использования видов кермека [22]. В таблице 1, приведены данные по
содержанию танина для наиболее важных видов Limonium, произрастающих на
территории Казахстана. Следует учесть, что были выбраны усредненные
результаты, а значит, их содержание может варьироваться в зависимости от
ареала распространения, времени сбора и экологических условий
13
произрастания. Время сбора сырья – фактор, который имеет большое значение
и несет ответственность в независимости от различных аналитических методик,
так как оказывает значительное воздействие на накопление биологически
активного комплекса в той или иной части растений или в растении в целом.
Таблица 1 – Содержания танина для некоторых видов Limonium
Вид
Часть
растения
L. caspium (Willd.) Gam
корни
L. gmelinii (Willd.) Ktze.
все растение
L. latifolium (Sm.) Ktze.
корни
L. meyeri (Boiss.) Ktze.
корни
L. myrianthum (Shrenk) Ktze. все растение
L. otolepis (Shrenk) Ktze.
все растение
L. sareptanum (Becker) Ktze. корни
L. suffruticosum (L.) Ktze.
все растение
L. tomentellum (Boiss.) Ktze. корни
L. popovii (Boiss.) Ktze.
все растение
L. leptophyllum (Boiss.) Ktze. все растение
Минимальное содержание танина
(% в пересчете на сухое вещество)
9.6
14.5
19.3
13.5
12.6
12.1
9.9
4.8
16.4
6.2
4.1
Почти все полученные данные свидетельствуют о том, что содержание танина в
корнях растений рода Limonium находится на самом высоком уровне весной и в
начале лета (апрель-июнь), именно в это время и рекомендуется сбор; осенью
содержание танина резко падает. На основе имеющихся аналитических данных
и практического опыта, следующие виды могут рассматриваться как наиболее
ценные производители танина: 1) L. gmellnii (Willd.) Ktze. – cодержание танина
высоко в любой географической зоне, в том числе L. tomentellum (Boiss.) Ktze. и
L. meyeri (Boiss.) Ktze.; 2) L. latifolium (Sm.) Ktze. – содержание танина
несколько выше, чем у предыдущих видов, но при этом распространение
гораздо более ограничено; 3) L. myrlanthum (Shrenk) Ktze. и L. otolepis (Shrenk)
Ktze. – содержание танина достаточно высоко в растениях, представленных на
территории Казахстана и Средней Азии; 4) L. сaspium (Willd.) Gams имеет не
высокие показатели, ввиду небольшого размера корней; 5) L. suffruticosum (L.)
Ktze. в связи с очень низким содержанием танина (около 5 %) может
представлять интерес только с точки зрения последующего введения в
культуру, благодаря крайней неприхотливости и способности произрастать на
солончаках, что в том числе достаточно перспективно. Необходимо также
учесть, что большинство видов исследуемых растений не являются кормовыми,
и, следовательно, имеют достаточные запасы для проведения фитохимических
исследований [23]. Так, в составе некоторых видов Limonium были обнаружены
алкалоиды [24]. Неферментативные антиоксиданты, такие как аскорбиновая
кислота, α-токоферол, флавоноиды и фенолокислоты присутствуют в большом
количестве в галофитных растениях. Это отражает их потенциальную
полезность как новых источников природных антиоксидантов в диетическом
14
питании. Метанольные экстракты таких растений были исследованы на их
противораковую и антипротозойную активности по оценке уровня ферментов
антиоксидантной защиты [25]. Кроме того, несколько видов рода Limonium
имеют потенциальные научные, фармакологические и медицинские
применения. Например, L. brasiliense, как сообщается, обладает
противовоспалительной и антибактериальной активностями [26], L. wrightii
применяется для лечения артрита и лихорадки [27], L. tetragonum и L. sinense,
имеют противовирусные свойства [28-29], а также L. axillare и L. californicum,
как было показано, обладают антибактериальными и цитотоксическими
эффектами [30, 31].
1.2 Историческая перспектива природных соединений и традиционной
медицины
Клинописные таблички примерно 650-х гг. до нашей эры описывают
обширную фармакопею древней Месопотамии, с не менее чем 100 и около 250
лекарственными средствами, полученными из минеральных и растительных
источников, соответственно [32]. Китай также имеет долгую историю
традиционной медицины, датируемую около 4000 лет до династии Шан [33].
Одними из самых известных национальных медицинских средств из Китая
являются эфедра и женьшень. Они были использованы на протяжении
тысячелетий для лечения широкого ряда заболеваний, начиная от астмы и
заканчивая недержанием. Китайская традиционная медицина хорошо
документирована и сохранена, с более чем 10000 известными лекарственными
веществами. Америка имеет свою собственную историю использования
природных соединений в ритуальных целях. Ацтеки, жители Центральной
Америки, использовали «teonanácatl», так называемый «священный гриб»,
широко известный благодаря своим психоделическим свойствам [34]. Около 60
лет прошло после выявления мескалина, до того как волшебный мексиканский
наркотик «teonanácatl» смог быть проанализирован в лаборатории
фармацевтической компании «Сандоз» (Sandoz), Базел (Швейцария) [35]. Еще
один пример хорошо документированной древней медицины это De material
medica, написанная Диоскоридом. Греческий врач, который работал в римской
армии в первом веке нашей эры, задокументировал сотни растений,
используемых для различных медицинских целей в пяти томах кодекса [36].
Это одна из немногих классических работ, которые продолжали
распространяться во времена средневековья, между 5-м и 14-м веками нашей
эры, и, таким образом, имела широко признанный авторитет в медицине и
фармакологии вплоть до 16-го века. Различные формы традиционной медицины
посей день остаются популярными в некоторых развитых странах. По данным
Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), до 80 % населения в
некоторых развивающихся странах по-прежнему полагается на традиционную
медицину, несмотря на рост современной медицины и фармакологии [37].
Опрос, проводимый Центром по контролю и профилактике заболеваний и
Национальным центром по статистике здравоохранения, в 2012 году, показал,
что почти 18 процентов взрослых американцев и около 5 процентов детей
15
приветствуют природные лекарственные средства для укрепления здоровья,
такие как рыбий жир, эхинацея, женьшень или глюкозамин, в качестве
альтернативной медицины [38]. При использовании современной терминологии
фраза "природные соединения", как правило, относится к вторичным
метаболитам, продуцируемым организмами в ответ на внешние изменения в их
окружающей среде, от недостатка питательных веществ, инфекции,
конкуренции и т.д. [39]. Исторически природные вещества терапевтически
использовались людьми в виде экстрактов [40]. Например, экстракты коры ивы,
Salix alba L. (Salicaceae), были использованы древними египтянами для лечения
воспаления [41]. Однако, в 1897 году Феликс Хоффманн, работая на компанию
Байер, впервые синтезировал ацетилсалициловую кислоту из салициловой
кислоты, выделенной из коры ивы, тем самым создав аспирин [42-43].
Аналогично, экстракты опийного мака, Papaver somniferum L. (Papaveraceae),
были использованы для лечения боли на протяжении 19-го века и
предшествующих тысячелетий [44-46]. Основное вещество, ответственное за
свойства опийного мака, морфин был выделен Surtürner в первой половине 19го века. Однако правильная структура морфина была предложена лишь в 1925
года Гулландом и Робинсоном [47-49] и их предположение было подтверждено
только в 1953 году, когда Гейтсом и Чуди 20-21 был опубликован его полный
синтез. Хотя открытия морфина из опийного мака, аспирина из коры ивы и
пенициллина из плесени (1928 г.) произошли в течение XIX и XX веков, эти
даты противоречат тысячелетиям их традиционного использования, которые
воодушевляют сегодняшние научные исследования. Использование этих
природных продуктов в виде индивидуальных химических объектов, как более
предпочтительных, чем в качестве экстрактов, создает современную
фармацевтическую промышленность [39, р. 41; 43, р. 47D]. За 2000-2010 годы,
природные вещества и их полусинтетические производные составили примерно
треть всех молекул от поданных заявок на регистрацию новых химических
объектов [50]. Только в 2010 году, 50 % заявок были вещества природного
происхождения. Возможно, одним из самых важных медицинских успехов,
достигнутых в 20-м веке, является открытие антибактериальных агентов,
которые могут быть использованы системно [51]. Хорошо известна история
открытия антибактериального пенициллина Александром Флеммингом в 1928
году [52]. Это было более десятью годами ранее, до того как пенициллин в 1941
году был введен в клиническую медицину, и после его успеха, большое
количество пенициллинов природного происхождения были введены в
медицинскую практику [51, p. 497]. В 1900 году пневмония, туберкулез,
диарея/энтерит и дифтерия стали причиной одной трети всех смертей [53]. В
1997 году только 4.5 % всех случаев смерти можно было бы отнести к
инфекционным заболеваниям, а средняя продолжительность жизни
увеличилась на 29 лет. Почти столетие исследований предоставляет широкий
спектр природных соединений с антибактериальными свойствами, и новые
средства продолжают производиться. Только с 1981 до 2010 года было введено
104 новых антибактериальных агентов и из них около 75 % являются
природными соединениями [50, p. 322].
16
1.3 Флавоноиды
Многочисленные виды растений использовались народной медициной
десятилетиями в качестве пищевых добавок и консервантов [54]. Большинство
растений имеют широкий спектр полифенольных соединений в особенности
флавоноидов, которые как сообщалось, ингибируют распространение
свободнорадикальных реакций, для защиты человека от болезней [55, 56]. Эти
вещества, способные задерживать или замедлять окисление липидов или
других молекул, рассматриваются в качестве антиоксидантных соединений.
Антиоксидантное ингибирование инициации или распространение цепных
окислительных реакций осуществляется одним из следующих механизмов:
снижением активности, поглощением свободных радикалов, потенциальным
комплексообразованием проокислителя металлов и гашением синглетного
кислорода [57]. Избыток воздействия свободных радикалов повреждает общую
структуру целостности клеток и как следствие их способность
функционировать, что приводит к следующему менее здоровому и
продуктивному поколению клеток. Флаваноны демонстрируют способность к
лечению и профилактике опухолей. За последние 30 лет именно флавоноиды
стали привлекательным источником для поиска биологически активных
компонентов [58]. Флавоноиды представляют собой природные соединения с
различным современным лекарственным и фармакологическим применением
[59-61]. Эти полифенольные вещества обладают противораковыми,
противовоспалительными и антиоксидантными свойствами. Флавоноиды, как
известно, способны образовывать хелатные комплексы с двухвалентными
металлами и блокировать окислительно-восстановительный цикл. Также было
показано, что они могут ингибировать различные киназы, ферменты,
ответственные за биосинтез простагландина, и топоизомеразы I и II,
связывающиеся с рецептором эстрогена [60]. Флавоноиды выделяются,
главным образом, из фруктов и овощей, сои, чайных листьев и трав [60, p.3]. В
связи с тем, что они производятся различными видами растений и широко
доступны в пищевых растительных продуктах, это обуславливает их
наименьший побочный эффект и токсичность по сравнению с другими
классами БАВ [62]. Благодаря фунгицидным и бактерицидным свойствам
полифенольных компонентов лекарственные растения также обладают
"консервирующим эффектом". Так как согласно последним научным
достижениям в группе «природных лекарств» полифенолы и биофлавоноиды
являются одними из сильнодействующих. Важно отметить синергизм при
применении
витаминов
совместно
с
флавоноидами
ввиду
их
однонаправленного действия. Исходя из вышесказанного, флавоноиды
являются основным классом для исследований в области природных
соединений.
Молекула флавоноидов построена вокруг ядра флавана (1), состоящего из
15 атомов углерода, расположенных в кольцах A, B и C [63]. Первый шаг к
синтезу флавоноидов – это конденсация одной молекулы 4-кумароил-КоА (5) с
тремя молекулами малонил-КоА, который дает халкон, предшественник
флавоноидов, в соответствии с рисунком 1 [60, p. 2].
17
Рисунок 1 – Биосинтез флавоноидов
4-кумароил-КоА получается дезаминированием фенилаланина (2)
действием фермента фенилаланин-аммоний-лиазы, гидроксилированием
полученного транс-коричного продукта (3) с циннамат-4-гидроксилазой и
цитохром P450 (CYP450) фермента с образованием 4-кумарат [64]. 4-кумаратКоА-лигаза катализирует активацию 4-кумарат и тиоэфира КоА, производя
предшественника 4-кумароил-КоА (5). Гидроксилирование в положение 3 и 4кумароил-КоА 4-кумароил-КоА-3-гидроксилазой дает CoA-кофейной кислоты
(6), которая является другим предшественником флавоноидов, найденной в
некоторых видах растений. Конденсация ацетил-КоА и СО2 при содействии
ацетил-СоА-карбоксилазы приводит к малонил-КоА. Далее, 2´, 4´, 6´, 4тетрагидроксихалкон (7) получают путем ступенчатой конденсации 4кумароил-КоА и трех молекул малонил-КоА, катализируемой ферментом
халкона синтазы. Стереоспецифическая циклизация предшественника халкона,
который катализируется халкон изомеразой приводит к 2S-флавонону
нарингенину (8), обладающему основным скелетным ядром флавоноидов. Этот
2S-флавонон простой каркас, который может быть существенно изменен с
помощью различных ферментов, чтобы получить широкий спектр структур с
различными биологическими активностями.
Флавоноиды классифицируются на основе структуры их углеродных
скелетов. Существуют восемь флавоноидных групп, в соответствии с рисунком
2: флаваны (1), флаваноны (9), флавоны (10), халконы (11).изофлаваноны (12),
и изофлавоны (13) [60, p. 2-3] Флавоноиды, как правило, назначаются в
18
качестве фитоэстрогенов из-за сходства их структуры и биологической
активности с существующими природными эстрогенами [65]. Наличие более
чем 8000 известных структур флавоноидных соединений, повсеместное
присутствие, обширный массив биологических активностей и простота синтеза
делает их главной мишенью для исследования фармакологической терапии
новых заболеваний [63, p.1035].
O
O
O
O
O
11
10
9
O
O
O
O
12
13
Рисунок 2 – Классификация флавоноидов
В ряде стран употребление флавоноидов нормируется количеством 60-70
мг в сутки для взрослого человека. При этом обнаруживается значительная
разница по статистики смертности от сердечнососудистых заболеваний против
среднего потребления 10-20 мг в сутки. Как показывает медицинская
статистика самым вероятным признан риск именно сердечнососудистых
заболеваний и на данный момент это уже приобретает характер эпидемии. Так,
например, в 2003 году на территории Российской Федерации был установлен
рекорд смертности (2370000 умерших людей). Хотя всего лишь сто лет назад
острые сердечные боли считались редким явлением. Все это связано с
экологическими проблемами, а также с возросшим числом стрессовых
ситуаций в жизни граждан. Очевиден тот факт, что средняя продолжительность
жизни в нашей стране составляет гораздо меньший срок в сравнении с другими
странами, а прогнозы, в большинстве своем, малоутешительны. Таким образом,
при создании благоприятных условий для роста уровня благосостояния
общества на первый план выходит производство специфических продуктов
питания, так называемых биологически активных добавок, чтобы по
возможности предотвратить смертность человечества от болезней сердца и
онкологии.
Особую важность следует уделить процессам производства препаратов на
основе флавоноидов, ввиду того, что эти соединения достаточно легко
подвергаются окислению при контакте с воздухом. Поэтому необходим их
жесткий контроль даже на стадиях хранения и переработки из-за чрезвычайной
нестабильности данного класса веществ.
1.4 Опиоиды, опиоидные рецепторы и лечение при болях
Биохимия – это одна из областей медицины, которая извлекает большую
пользу из выяснения новых биологических механизмов при разработке
19
улучшенных терапевтических препаратов. Одним из приоритетных
направлений данных исследований является развитие более эффективных
методов для лечения боли, которые крайне необходимы в медицине сегодня.
Острая послеоперационная боль и некоторые типы хронической боли
инициируются активацией ноцицепторов [66]. Боль является результатом
стимуляции периферийных нервных рецепторов, отвечающих за болевые
ощущения. Они расположены по всему телу и могут быть активированы с
помощью физического или химического раздражения, высвобождаемого из
окружающих тканей (например, гистамина или молочной кислоты), по сути
реагирующих на вредные стимулы трансмиттеров-медиаторов [67, 68]. Боль
воспринимается разными лицами по-разному в зависимости от окружающей
среды, пола, жизненного опыта, культуры, сообщества и другими факторами,
которые непосредственно не связаны с центральной нервной системой [67,
p. 321]. Сильная боль является наиболее распространенной причиной, на
которую ссылаются люди при обращении с жалобами в медицинские
учреждения [69]. Самыми распространенными методами лечения тяжелой,
хронической боли являются опийные алкалоиды, такие как морфин и
аналогичные препараты [46, p. 570]. В последние два десятилетия более чем 2.5
млрд долларов было потрачено в фармацевтической промышленности при
попытках выявить новые лекарства от боли. Несмотря на эти усилия, морфин и
родственные соединения остаются в терапии первой линии для умеренной и
сильной боли в большинстве стран. Опиоидные препараты, однако, имеют
много неприятных и вредных побочных эффектов, в том числе снижается
возбудимость нервных клеток, проводимость импульса, седатация и угнетение
центра терморегуляции, которые делают их не отвечающими требованиям для
регулярного использования [46, p. 570]. Опиоидные препараты блокируют боль,
ориентированную на MOR в качестве агонистов. Негативные побочные
эффекты опиоидных препаратов непосредственно вызваны активацией MOR.
Частота опиоидных эффектов, связанных с ЖКТ, является довольно высокой и
составляет 40-50 % или более у пациентов, получающих опиоидную терапию
[66, p. 11S; 69-70], что опосредовано преимущественно присутствием µ
опиоидных рецепторов, расположенных в кишечнике [69, p. 20S]. Так как
пациенты не испытывают снижение реакции к этому побочному эффекту
опиоидных препаратов, их непрерывное использование связано с хроническими
запорами и соответственно проблемами ЖКТ, которые известны как опиоидная
дисфункция кишечника [46, p. 573]. Угнетение дыхания, по меньшей мере,
частично вызвано взаимодействием опиоидов с дыхательным центром в стволе
головного мозга, что снижает чувствительность организма к повышению
уровня углекислого газа в крови и приводит к депрессии дыхания [71]. Этим
побочным эффектом можно управлять путем надлежащего количественного
анализа доз наркотиков, но дыхание является основной причиной смерти в
случае передозировки [72]. Другой отрицательный эффект опиоидов это
привыкание и снижение реакции организма на повторное введение в результате
продолжающегося использования. Толерантность возникает, когда действие
препарата приводит к снижению его эффективности со временем. В этом
20
случае для получения того же уровня эффекта от препарата требуются его
большие дозы [46, p. 575]. Все еще точная причина этого явления неизвестна и
пока считается свойством десенсибилизации и интернализации процессов,
которые происходят в сигнальном пути GRK-киназы/γ-аррестина. Зависимость,
когда пациент испытывает абстинентный синдром, происходит в случае
прекращения употребления наркотиков или значительного снижения дозы
опиоидов, а также введением опиоидного антагониста [73]. Эти эффекты
начинаются с задержки пищеварения в тонкой кишке и снижения
перистальтических волн в толстом кишечнике, что приводит к удержанию
содержимого кишечника. Это усугубляется повышенным тонусом внутреннего
анального сфинктера и релаксацией в ответ на растяжение прямой кишки, а
также рефлекторным сокращением наружного сфинктера при ректальном
растяжении. Эффект привыкания так обычно не обнаруживается и у пациента
при долгосрочной опиоидной терапии остается хронический запор. К счастью,
этот побочный эффект может быть уменьшен путем профилактического
введения слабительного [73, p. 655]. Наркомания определяется хроническим,
употреблением наркотиков, и продолжением их использования, несмотря на
тяжкий вред здоровью и благополучию [73, p. 657].
Опиоиды являются природными веществами, используемыми в медицине
как анальгетики (рисунок 3), из-за их способности уменьшать боль [67, p. 323].
В современной медицине нестероидные противовоспалительные препараты
используются для лечения от легкой до умеренной боли, в то время как,
опиоидные препараты – при постоянной или тяжелой боли [74].
HO
O
O
O
O
O
N
N
N
OH
O
HO
16
15
14
O
O
N
N
H
O
HO
N
O
17
18
19
H
O
O
N
H
O
20
21
Рисунок 3 – Клинически наиболее часто используемые опиоиды
21
Опиаты
имеют долгую историю
использования
в
качестве
обезболивающих, начиная тысячи лет назад с экстрактов мака. Применение
опиоидных анальгетиков для лечения тяжелых форм хронического рака и
болей, не связанных с раком, в настоящее время становится стандартной
медицинской практикой, но не без полемики [37, p. 21; 70]. Хотя в 1960-е годы
использование опиоидных препаратов для лечения хронической боли было
уменьшено, в 1970 годах в Лондоне (Больница Святого Кристофера) вернулись
к использованию опиоидов для лечения боли у онкологических больных [74].
Американское гериатрическое сообщество в 2009 году рекомендовало
лечение пациентов с хронической болью (без рака) под пристальным
наблюдением при использовании опиоидных препаратов [75]. Причиной
дискуссии по поводу применения опиоидных анальгетиков являются тяжелые
побочные эффекты, вызываемые этими препаратами, в том числе угнетение
дыхания, запор, толерантность и зависимость [44-46]. Несмотря на эти
проблемы, опиоидные препараты, по-прежнему, одни из основных методов
лечения боли. В качестве опиоидных анальгетиков, в соответствии с рисунком
3, наиболее часто используются в клинической практике морфин, кодеин (14),
гидроморфон (15), оксикодон (16), меперидин (17), фентанил (18), тапентадол
(19), метадон (20) и пропоксифен (21); последний был исключен из реестра
лекарственных средств, США в ноябре 2010 года из-за смерти пациента от его
кардиотоксических эффектов [46, p. 579].
Опиум получен из экстракта растения мака Papaver somniferum. Во втором
веке Гален, греческий врач, вводит опиум для пациентов с целью облегчения
болей от астмы и застойной сердечной недостаточности. В 1804 году, немецкий
химик Сертюрнер выделил морфин (22) из опиума. Тем не менее, до 1973 года
не было подтверждено, что морфин (22) взаимодействует с опиоидными
рецепторами [76]. Классификация опиоидных рецепторов развивалась вместе с
их исследованиями и пониманием [77-79]. Существование отдельного
положения опиоидного связывания было впервые предложено в 1954 году
Беккетом и Кейси [80]. К середине 1960-х годов Мартин [81] предположил
существование нескольких опиоидных рецепторов. Основываясь на
исследованиях, в 1970-е годы [82, 83] были классифицированы несколько типов
опиоидных рецепторов. Мартин предложил три разновидности опиоидных
рецепторов, опираясь на фармакологический профиль различных опиоидов, так
были определены μ, κ, и σ-рецепторы с прототипами эндогенных лиганд –
морфином (22), кетоциклозацином (23), и N- аллилнорциклозацином (24),
соответственно (рисунок 4).
Другой тип рецептора, δ-рецептор, был предложен позже после открытия
энкефалинов [84]. В 1971 году Гольдштейн и др. предполагают, что
радиоактивно меченые соединения могут быть использованы для решения
вопроса о существовании этих рецепторов, а также их характеристик [85].
После этой гипотезы три различных исследовательских групп одновременно и
независимо
друг
от
друга
продемонстрировали
существование
стереоспецифичного опиоидного связывания в мозгу млекопитающих [86-88].
Первое убедительное свидетельство нескольких типов опиоидных рецепторов
22
предложил Мартин и др. в 1976 [82, p. 517]. Они наблюдали поведенческие и
нейрофизиологические различия на модели привычного спинного мозга собаки.
N
O
HO
22
HO
HO
OH
23
O
O
N
N
24
Рисунок 4 – Агонисты, используемые Мартином для определения δ-, κ-, и μрецепторов
В 1977 году, Лорд и др. наблюдали различия в оценке порядка
эффективности опиоидных соединений между электрически индуцированными
судорогами в подвздошной кишке морской свинки и семявыносящих протоков
ткани мыши, что укрепило гипотезу о нескольких типах опиоидных рецепторов
[84, p. 495]. σ-рецептор, предложенный Мартином, не считался опиоидным,
потому что его эффекты не менялись посредством опиоидных антагонистов
[89]. Все μ, κ, и δ-рецепторы были клонированы; исследования при попытке
клонирования этих рецепторов привели к открытию другого рецептора, так
называемого ноцицептинового (ORL1) рецептора [90]. Он имеет те же
физиологические эффекты, что опиоидные рецепторы, но при этом не
показывает родство к лигандам опиоидных рецепторов, таких как налоксон.
Опыт показывает, что эффекты опиоидных рецепторов поступают из G-белков,
взаимодействующих с этими рецепторами [91, 92]. Клонированные опиоидные
рецепторы показывают структурное соответствие с суперсемейством этого Gбелок-связанного рецептора. G-белки в сочетании с опиоидными рецепторами
являются гетеротримерными, это означает, что они имеют три части, α, β, и γсубъединицы. Субъединица связывается с гуаниннуклеотидами и катализирует
гидролиз ГТФ в ГДФ. G-белки являются ключевой частью множества
различных типов рецепторов, в том числе и опиоидных рецепторов. Есть много
различных форм G-белков, например, Gs-белок, который стимулирует
аденилатциклазу, и Gi и Go, которые оба ингибируют аденилатциклазу.
Благодаря тому, что коклюшный токсин ингибирует Gi и Go АДФрибозилированием субъединиц, а холерный токсин активирует Gs, эти токсины
могут быть использованы для тестирования участия различных G-белков в
трансдукционном механизме опиоидов и других рецепторов. Через
исследование эффекторных систем механизмов трансдукции опиоидных
рецепторов, было показано, что опиоидный агонист, связываясь с рецептором,
ингибирует аденилатциклазу [91-94] и уменьшает внутриклеточный цАМФ в
ряде различных тканей. Либо Gi или Gо участвует в механизме трансдукции
опиоидных рецепторов, как показано чувствительностью коклюшного токсина
опиоидным ингибированием аденилатциклазы. Исследования показывают, что
все три типа клонированных опиоидных рецепторов показывают это
23
аденилинциклазное ингибирование, в то время как некоторые исследования
также показывают, что μ и δ-рецепторы могут стимулировать аденилатциклазу
в определенных тканях [92, 94-95]. Существует спор о влиянии κ-опиоидных
рецепторов на передачу фосфатидилинозита в различных тканях, но δ и μрецепторы не оказывает какого-либо влияния на перенос фосфатидилинозита в
клеточных линиях нейробластом NG108-15 и SK-N-SH [96]. G-белки также
позволяют опиоидным рецепторам соединяться с ионными каналами [93-94, 97]
и все три вида рецепторов уменьшают поток Ca+2. Потому что коклюшный
токсин останавливает действие опиоидов на поток Ca+2, и G-белки участвуют в
связывании кальциевых каналов с опиоидными рецепторами, само собой
разумеется, что участвует Gi или Gо. Соединительные опиоидные рецепторы с
калиевыми каналами показывают эффекты, аналогичные тем, которые
являются результатом связывания с кальциевыми каналами. Практика
показывает, что эти результаты, достигнутые с ионными потоками, исходят от
связывания G-белка с ионными каналами и с опиоидными рецепторами, а не в
результате ингибирования аденилатциклазы [97]. Связывание агониста с
опиоидным рецептором кажется, активирует каскад сигналов внеклеточной
регулируемой киназы (ERK). Сигнальный каскад ERK имеет три
внутриклеточные киназы, известные как митоген-активируемая протеинкиназа,
МАРK-киназы. Этот процесс, как представляется, связан либо с Gi или Gо [94].
1.4.1 Структуры опиоидных рецепторов
Опиоидные рецепторы относятся к классу A (Родопсиноподобные
рецепторы) семейства белков Gi/Go, связанных с рецепторами. На основе
модели рецепторов этого семейства, рецептор содержит внеклеточный Nконцевой домен, семь мнимых трансмембранных спиральных домена,
соединенных тремя внеклеточными доменами, три внутриклеточных домена и
внутриклеточный С-концевой хвост, возможно, образующий четвертый
внутриклеточный цикл с его мнимым пальмитоилированым сайтом (сайтами).
Опиоидные рецепторы имеют высокую степень сходства в их структурных
сгибах, с 67 % сходством для NOP по сравнению с другими рецепторами, и 76
% сходства между MOP и DOP [90, p. 33]. Это можно ожидать из-за высокой
идентичности последовательностей трансмембранных регионов. Наибольшая
разница между опиоидными рецепторами была найдена в их N и C-концах, а
также их внеклеточных петель [98]. Самая высокая гомология между
опиоидными рецепторами достигается в ТМ2, TM3 и TM7. Внутриклеточные
петли также показывают высокое сходство; третий внутриклеточный цикл, как
считается, участвует во взаимодействии с G-белками. С другой стороны, второй
и третий внутриклеточные петли, TM1 и ТМ4-6 демонстрируют меньшее
сохранение. Потенциальные сайты для возможной посттрансляционной
модификации были определены на рецепторах, таких как две потенциальные Cкиназы фосфорилирования, расположенные на С-конце, и третий сайт,
найденный в третьей внутриклеточной петле. Кроме того, два возможных
сайтов гликозилирования были найдены расположенными на N-конце.
Исследования показали, μ-рецептор кристаллизуется вокруг β24
фуналтрексамина (25), ковалентно-связанного морфинана [99]. Структура
представлена в соответствии с рисунком 5. Каждый рецептор кристаллизуется
вокруг родственного лиганда (рисунок 6). Кристаллическая структура
рецептора δ наблюдалась с нальтриндолом (26) [100] (рисунок 7), а для
рецептора ноцицептина с экзогенным лигандом (27) [101], кристаллическая
структура κ рецептора была показана в присутствии JDTic [102].
N
N
OH
O
O
O
OH
25
O
O
OH
N
H
N
N
H
N
O
O
OH
27
26
Рисунок 5 – Лиганды, кристаллизуемые с опиоидными рецепторами
Опиоидные препараты нацелены на четыре типа опиоидных рецепторов: μ,
δ, κ и ноцицептин. Каждый тип рецептора играет свою роль, и имеет свою
фармакологическую функцию, даже если существует высокая степень сходства
между рецепторами [103].
До недавнего времени успешная разработка лекарств на основе рецепторов
было чрезвычайно трудна, потому что взаимодействие между опиоидными
препаратами и рецепторами не было понятно на молекулярном уровне. Однако
с тех пор как кристаллическая структура опиоидных рецепторов была описана
[104-107], исследователи смогли воспользоваться этим знанием, чтобы открыть
для себя новые соединения, которые нацелены на эти рецепторы и могут быть
полезны для фармакологических и медицинских целей.
Рисунок 6 – Виды перекрывания кристаллических структур трех опиоидных
рецепторов. κ, δ и μ приведены в бирюзовом, зеленом и фиолетовом цветах
соответственно
25
На рисунке 6 показано перекрытие трех опиоидных рецепторов, которые
являются типичными серпентиновыми рецепторами с семью пересекающими
ТМ спиральными сгибами. До 40 % создаваемых на данный момент лекарств,
предназначаются именно для этих рецепторов [108]. Как уже упоминалось
выше, эти рецепторы связаны тремя внутриклеточными и тремя внеклеточными
петлями (ILs и ELs). Идентичность последовательности опиоидных рецепторов
в пределах ТМ доменов составляет 76 % между μ и δ, 73 % между μ и κ, и 74 %
между δ и κ, что показывает, как эти рецепторы разделяют подобные
структурные сгибы даже в менее неизменных регионах петли. Это делает
чрезвычайно сложным разработать селективные лиганды для конкретного
рецептора.
Рисунок 7 – Режим связывания β-фуналтрексамина (слева) и нальтриндола
(справа) в кристаллических структурах MOP и DOP рецепторов
Карманы в опиоидных рецепторах, где происходит связывание лиганда
имеют схожие формы. В соответствии с рисунком 7, показаны режимы
взаимодействия рецепторов с лигандами морфинана β-фуналтрексамина (слева)
и нальтриндола (справа), в кристаллических структурах MOP и DOP
рецепторов соответственно, где подобные лиганды занимают аналогичную
площадь, ограниченную спиралями TM3, TM5, TM6 и TM7 в связующих
карманах. Непосредственное сравнение между δ- и µ-рецепторами, показывает,
что 11 из 14 аминокислот в области кармана вокруг лигандов являются
идентичными (рисунок 8). Три различия MOR в позициях E229, K303 и W318,
которые являются D210, W284 и L300 в DOR, соответственно. Лейцин в
положении 300 µ-рецептора взаимодействует с индольной группой
нальтриндола. В результате нальтриндол селективен для дельты, потому как ни
W318 в μ, ни Y312 в κ стерически несовместимы со связыванием нальтриндола.
Аналогия «сообщение-адрес» уже давно используется для описания
опиоидной фармакологии, где каждый лиганд рассматривается как две
отдельные части. «Сообщение» это часть, которая определяет эффективность, в
то время как «адрес» определяет селективность. Это фармакологическое
явление прямой результат структуры опиоидных рецепторов, как показало
26
изучение структуры δ- и других рецепторов. По причине того, что нижняя
область связующего кармана очень похожа во всех трех рецепторах, эта часть
определяется ядром группы морфинанов, и получает «сообщение» лиганда.
Рисунок 8 –азличная аминокислота между µ- и δ-рецепторами, μ – βфуналтрексамин, δ – нальтриндол
Верхняя область связующего кармана рецептора имеет больше различий
между рецепторами, и в основном отвечает за определение селективности.
Часть лиганда, которая взаимодействует с этой верхней областью рецептора,
называется «адрес». Применение этих понятий к нальтриндолу, объясняет его
селективность к δ через индольный «адрес».
Применяя концепцию «сообщение-адрес» для анализа способа связывания
JDTic в κ-рецепторе (рисунок 9), можно объяснить его избирательность и
сходство форм лигандов для μ и κ-рецепторов. «Сообщение»,
тетрагидроизохинолин,
который
является
частью
JDTic
лиганда,
взаимодействует с рецептором в той же области, что и 3-гидрокси группа
морфинанов. 3-гидроксифенильная группа – «адрес» JDTic взаимодействует
неблагоприятно с аминокислотной K108 в верхней области δ рецептора, что
делает JDTic селективным в отношении κ и μ-рецепторов.
Рисунок 9 – Режим связывания нальтриндола внутри δ- и JDTic внутри κ (А).
Аминокислота K108, выталкивающая JDTic (В)
27
Терапевтический потенциал селективных агентов KOP рецепторов
Хорошо известно, что основные побочные эффекты опиоидных
анальгетиков это результат активации µ-рецепторов [69, p. 19S]. Наиболее
серьезным побочным эффектом этих препаратов является угнетение дыхания, в
случае передозировки являющееся наиболее распространенной причиной
смерти. Морфин и аналогичные опиоидные препараты связываются со всеми
тремя опиоидными рецепторами, чтобы произвести обезболивающее действие.
Создание селективного антагониста для µ-рецептора сделает возможным
введение антагониста вместе с опиоидными препаратами, позволяя им
создавать анальгетическую активность через κ- и δ-рецепторы, блокируя тем
временем побочные эффекты, вызванные µ-рецептором.
Из-за проблем, которые возникают при нацеливании препаратов на MOR,
исследования рассматривают возможность использования опиоидных лигандов
селективных для других рецепторов. Лиганды, селективные для κ-опиоидных
рецепторов, показали полезность в качестве анальгетиков. Они не проявляют
негативные побочные эффекты, такие как угнетение дыхания и проблемы
желудочно-кишечного
тракта,
которые
вызваны
лекарствами,
ориентированными на MOR [109]. Агонисты KOR имеют свои собственные
негативные побочные эффекты, в частности, расстройства настроения, такие
как дисфория (отрицательный эффект, антоним эйфории) [68, p 109]. Однако
есть некоторые предположения, что агонисты KOR, которые работают только
на периферийную нервную систему, могут иметь обезболивающее действие без
негативных последствий [109]. Эндогенный KOR агонист организма,
динорфин, производится в результате стресса. Активация KOR любым
лигандом с аналогичными свойствами данного агониста, считается частично
ответственной за депрессию и аналогичные расстройства настроения [110]. Это
говорит о том, что антагонист KOR, который будет предотвращать активацию
KOR, может быть полезным в лечении этих заболеваний. Были исследованы
эффективности различных KОР-селективных антагонистов, в том числе
норбинальторфимина (norBNI), GNTI и JDTic (рисунок 10) при лечении
депрессии у грызунов и они показали некоторые хорошие результаты [111].
N
OH
HO
N
N
OH
HN
NH2
HO
N
NH
N
O H H H O
HO
OH
28 nor-BNI
HO
O
H
N
H
29 GNTI
N
H
NH
O
30 JDTic
Рисунок 10 – Избирательные KOP антагонисты
Проблемой с этими исследованиями является тот факт, что KOR28
селективные антагонисты показывают долгосрочную профилактику активации
KOR, иногда до 56 дней [112]. Неселективные антагонисты не проявляют эти
долгосрочные последствия, и точная причина этой проблемы еще не
определена. Известно, что это не является результатом ковалентного
связывания антагониста с KOR, изменений рецептора, вызванных
антагонистом, или путем накопления в липидных мембранах. Группа Чарльза
Чавкина нашла, что длительность избирательного действия антагониста
положительно коррелирует с активацией с-Jun N-терминальной киназы (JNK),
хотя, как активация JNK приводит к долгосрочной инактивации KOP
рецепторов остается неясным [112, 113]. Таким образом, поиск селективных
KOP
антагонистов
с
улучшенными
фармакокинетическими
и
фармакодинамическими свойствами продолжается.
1.4.2 Идентификация флавоноидов как потенциальных лигандов
опиоидных рецепторов
Потенциал для флавоноидов в качестве источника для новых лигандов
опиоидных рецепторов был впервые описан [114], когда они показали, что
аментофлавон (31), бифлавон, найденный в экстрактах Hypericum perforatum L.
(Hypericaceae), конкурирует за связывание с опиоидными рецепторами. Поиск
новых веществ в данном направлении исследования приобрел новый всплеск
относительно недавно [115]. Так, флавоноиды из зверобоя продырявленного,
изначально были исследованы на их биологические активности.
Опубликованные работы показывает, что данное растение имеет
дегабитуационный потенциал [114]. При использовании экстрактов зверобоя на
крысах со смоделированной алкогольной зависимостью наблюдалось
ослабления алкогольного самоконтроля [116-117]. Также было показано, что
флавоноиды синергично работают с опиоидными антагонистами в затухании
потребления алкоголя грызунами [118]. Аналогично опиоидным антагонистам,
таким как налтрексон, используемым в клинике для лечения злоупотребления
алкоголем, эти результаты показывают, что угасание алкогольного
абстинентного синдрома у крыс вызвано блокированием опиоидных
рецепторов веществами, содержащимися в экстрактах зверобоя [114]. Кроме
того, скрининг in vitro рецепторов показал, что экстракты зверобоя ингибируют
связывание [3H] налоксона и [3H] дельторфина с опиоидными рецепторами
[119-120]. Аментофлавон является первым выделенным флавоноидом с
высоким сродством к рецептору δ и показывает антагонистическую активность
по отношению к κ- и δ рецепторам. Эти свойствами антагониста открывают
возможность нового структурного каркаса для развития опиоидных
антагонистов, и опиоидных лигандов в целом. После успеха с аментофлавоном
начали усиленно исследоваться структурные изменения его флавоноидного
ядра [114]. Для ряда флавоноидных природных соединений: апигенин (32),
гиперозид (33), 4'-гидроксифлавонон (34), (+)-катехин (35), (-)-эпигаллокатехин
(36) и (-)-катехингаллат (37) (рисунок 11) был проведен скрининг в [35S]-ГТФ-γS функциональном анализе. Каждый из этих флавоноидных соединений
29
показали некоторый уровень активности к κ и µ рецепторам, но не
существенную активность в отношении рецептора δ [114]. Эти результаты
показывают, что флавоноиды представляют собой потенциальный источник
молекул как с опиоидной активностью рецептора, так и низким структурным
сходством с известными опиоидными лигандами. Кроме того, учитывая
диапазон энергий между различными подтипами опиоидных рецепторов, эти
данные также показывают, что лигандами флавоноидов можно манипулировать
для создания оптимальной селективности рецепторов.
OH
OH
OH
OH
O
HO
O
HO
HO
O
OH O
OH
OH
O
O
HO
O
OH
O
OH O
OH
OH O
OH OH
33
32
31
HO
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
34
36
35
OH
HO
O
O
OH
O
O
OH
O
OH
OH
O
O
OH
Gluc
HO
O
O
OH O
OH O
OH
OH
38
37
39
Рисунок 11 – Флавоноиды, исследованные в [35S] ГТФ-γ-S функциональном
анализе
Так, флавоноид витексикарпин (38), показывающий активность
селективного агониста по отношению к δ рецептору, представляет собой
таксономический маркер рода Vitex [121]. Исследования с использованием
животных моделей, показали, что С-гликозидированный флавон витексин (39)
имеет антиносисептивный эффект, вызванный механизмом взаимодействия с
участием всех трех типов опиоидных рецепторов [122].
30
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы
2.1.1 Характеристика сырья
Объектом исследований являлись корни и надземные части растений рода
Limonium Mill видов L. myrianthum, L. gmelinii, L. caspium и L. leptophyllum.
Заготовка сырья, L. myrianthum, производилась на территории ЮжноКазахстанской области в августе 2010 года. Растения L. gmelinii были собраны
во время периода его цветения в сентябре 2012 года в Алматинской области.
Надземная часть L. caspium заготавливалась в предгорье Улытау в конце июля
2004 года. L. leptophyllum – в июле 2004 года в прибрежной зоне озера Балхаш.
Согласно требованиям GAP, лекарственное растительное сырье должно
проходить
предварительную
подготовку.
Изначально
сырье
было
идентифицировано и проверено на подлинность методами макро- и
микроскопии. Так, перед началом сушки сырье было очищено от земли,
ненужных сорняков, отмерших (пожелтевших) и поврежденных вредителями
частей. Далее исследуемые растения сушили, раскладывая их при этом тонким
слоем на чистую фильтровальную бумагу с необходимым доступом свежего
воздуха и без прямого попадания солнечного света. Для ускорения процесса
сушки траву аккуратно переворачивали несколько раз в день без нарушения ее
целостности. Степень высушивания проверялась таким образом, чтобы при
сгибании стеблей травы они ломались, а листья хорошо перетирались в руках.
Затем сырье измельчали до размера частиц в пределах 2.0-3.0 мм. После этого
проводили изучение доброкачественности всех исследуемых видов сырья и
установление в них количественного содержания основных групп
биологически активных веществ. Затем разрабатывались технологические
схемы получения субстанций из исследуемых видов сырья в виде сухих
экстрактов, разделение их суммы БАВ на индивидуальные соединения, а также
их идентификация с целью стандартизации выделенных субстанций. Был также
осуществлен биологический скрининг всех полученных фракций, экстрактов и
выделенных индивидуальных соединений [123].
2.1.2 Основные используемые реагенты, растворители и приборы
Для экстракции сырья использовались следующие растворители:
хлористый метилен, гексан, хлороформ, этилацетат, ацетон, метанол, этанол,
бутанол и вода.
Экстракцию проводили несколькими способами: многократно одним
экстрагентом и последовательно различными растворителями с увеличением их
полярности.
Дейтерированные растворители для ЯМР:
СD3ОD – метанол; DMSO-d6 – диметилсульфоксид; СDСl3 – хлороформ.
Все используемые химические вещества были приобретены у SigmaAldrich (Сент-Луис, Миссури, США). За исключением следующих реактивов
для экспериментов взаимодействия лиганд-рецептор: [3H] -СР-55940 (174.8
31
Ки/ммоль), [3H] -DAMGO (53.4 Ки/ммоль), [3H] -U-69593 (42.7 Ки/ммоль),
[3Н] -Enkephlin (45 Ки/ммоль), которые получали от фирмы Perkin-Elmer Life
Sciences Inc. (Бостон, Массачусетс, США). Синтетические каннабиноидные и
опиодные реагенты (CP-55940, DAMGO, DPDPE, nor-Binaltorphimine и Win
55.212-2) были приобретены у Tocris Bioscience (Ellisville, Сент-Луис, США).
Удельное вращение измеряли на поляриметре Rudolph Autopol IV (шести
волновой, обеспеченный диапазон объемов от 1.0 мл до 0.05 мл).
Оборудование для молекулярного моделирования: 64-разрядный кластер
Infiniband Scyld Beowulf Linux с двухъядерным процессором Opteron 285 плюс,
головным узлом и мульти терабайтным устройством хранения доступа сети,
Microway WhisperStation 2.5 ГГц Xeon 8-ядерная и Microway WhisperStation
Intel Xeon L5520 2.26 ГГц 16-ядерная рабочие станции, рабочие станции Linux.
Программное обеспечение – Schrodinger, Spartan, Gold, MOE, и
программные пакеты Tripos, лицензии на CambridgeSoft ChemBioOffice,
MestReNova, Gaussian 03, Avogadro.
2.2 Методы исследования
2.2.1 Хроматография
Хроматография представляет собой собирательный термин, характерный
для
набора
лабораторных
методов
разделения
смесей.
При
хроматографическом
разделении
используется
различное
сродство
разделяемых компонентов к подвижным и неподвижным (стационарным)
фазам, между которыми они распределены, т.е. за счет дифференциального
распределения. Различия в коэффициенте распределения соединений приводят
к дифференциальному удержанию их на стационарной фазе, изменяя
расстояние между молекулами. Таким образом, различные компоненты смеси
перемещаются на разных скоростях, что заставляет их разделяться.
Тонкослойная хроматография (ТСХ). Использовали следующие
разновидности пластинок:
- Fluka ТСХ пластины, cиликагель 60 Å F254+366 (Sigma Aldrich), толщина
слоя 0.2 мм, размер 20*20 см
- Fluka ТСХ пластины, оксид алюминия 60 Å F254+366 (Sigma Aldrich),
толщина слоя 0.2 мм, размер 4*8 см
- Aldrich ТСХ пластины С18 F254 (Sigma Aldrich), толщина слоя 0.25 мм,
размер 10*20 см
Системы растворителей:
1) гексан-этилацетат (1:1; 3:1; 2:1; 7:3)
2) хлороформ-метанол (1:9; 0.5:9.5; 9:1; 7:3; 1:1; 8.5:1.5)
3) хлороформ-метанол-вода (95:5:0.5; 80:20:2; 85:15:1.5)
4) хлористый метилен-метанол-вода (9:1:0.1)
5) хлористый метилен-метанол (98:2, 95:5)
6) этилацетат-хлороформ-метанол-вода (15:8:4:1)
7) этилацетат-хлористый метилен-метанол (15:8:4; 8:4:1)
8) этилацетат- метанол (9:1; 3:1; 8:5; 8.5:1.5)
32
9) этилацетат-уксусная кислота-вода (5:1:1)
10) этилацетат-метанол-вода (30:5:4)
11) хлороформ-ацетон (3:7; 8:2)
12) этилацетат-этанол-вода (8:1.8:0.2)
13) хлороформ-этанол (8:2)
14) бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5; 10:1:3; 40:12.5:29)
15) бутанол-ацетон-вода (3:1:5)
16) этилацетат-хлороформ (9:1; 7.5:2.5)
17) гексан-ацетон (2:8)
18) гексан-хлороформ (1:1)
19) вода-метанол (1:1; 7:3; 6:4; 8:2) для RP
Для визуализации и выявления подвижности компонентов, ТСХ
просматривали под УФ-лампой при 254 и 365 нм (коротковолновой и
длинноволновой диапазоны, соответственно), с последующим распылением
проявителей: анисовый альдегид/H2SO4 (метанол-уксусная кислота-анисовый
альдегид-серная кислота, 85:9:1:5) и 1 % ванилин/H2SO4 (при нагревании до 100
°С), реактив Драгендорфа, пары аммиака и йода.
Колоночная хроматография (ТСХ). В качестве неподвижной фазы
применяли сорбенты вида:
1. Силикагель (Sigma Aldrich) 60, размер частиц 0.04 – 0.063 мм
2. Fluka Полиамид (Sigma Aldrich), размер частиц 0.05 – 0.16 мм
3. Fluka C8-RP, обращенно-фазовый силикагель (Sigma Aldrich), размер
частиц 0.04 – 0.63 мм
4. Fluka C18-RP, обращено-фазовый силикагель (Sigma Aldrich), размер
частиц 0.23 – 0.4 мм
5. Sigma Сефадекс LH-20 (Sigma Aldrich), размер частиц 0.25 – 0.1 мм
6. Supelco Diaion HP-20 (Sigma Aldrich), размер частиц 0.25 – 0.85 мм
Применяли системы элюентов, выявленные при ТСХ.
Вакуумно-жидкостная хроматография (VLC). Вакуумно-жидкостная
хроматография достаточно быстрый метод предварительного разделения
веществ. Колонку, высотой 50 см и внутренним диаметром 5 см с с пористой
стеклянной пластинкой внизу, представляющей собой фильтр Шотта (класс S1
Medium), заполняют силикагелем на 30-40 см. Сухой экстракт (образец)
смешивают с небольшим количеством силикагеля при добавлении
растворителей, используемых для элюирования колонки. Полученную смесь
высушивают, затем помешают в верхнюю часть колонки над сорбентом,
загруженным сухим способ. Разделение проводят при градиентном
элюировании, начиная с неполярного растворителя (EtOAc) и последующим
увеличением количества полярного растворителя (MeOH), используя вакуум
или перепад давления для ускорения процесса Выделенные фракции,
одинаковые по Rf на ТСХ, объединяют и концентрируют в мягких условиях.
Высоко-эффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) по сути,
представляет собой тип колоночной хроматографии с оптимально упакованным
сорбентом в колонках. Элюирование производится под давлением воздуха при
высокой скорости потока. Чаще всего используются заводские колонны с
33
сухим, вертикально зажатым силикагелем 18 см высотой. Ввод образца
начинается после предварительной обработки колонки требуемой подвижной
фазой. Затем их растворяют в небольшом объеме исходного растворителя,
смешивают с сорбентом, высушивают и помещают в специальные чашечки,
которые располагают в верхнюю часть колонны непосредственно над
сорбентом. Разделение достигается при применении изократического или
градиентного элюирования, прокачивая через колонку газ под давлением. Эта
методика используется от низкого до среднего давления, для образцов от
нескольких миллиграммов до граммов. Разделение методом ВЭЖХ
осуществляли на приборах Waters Alliance HPLC (система аналитической
хроматографии): УФ, с диодной матрицей, детекторами испарительного
рассеяния света, и Waters Delta Prep серия 4000 (система препаративной
хроматографии): способность к разделению от сотен миллиграммов до граммов
в перспективе, препаративный жидкостной контроллер, блок доставки
растворителя, встроенная инжекторная панель, инжектор Rheodyne 7725I и
фотодиодная матрица Waters 996 или детектор двойного поглощения волны
Waters 2487.
Газовая хроматография (ГХ). Этот метод представляет собой
хроматографическое разделение, основанное на разнице в распределении
разделяемых веществ между двумя несмешивающимися фазами, в котором
подвижной фазой является газ-носитель. Однако он применим лишь к
веществам или их производным, которые испаряются при используемых
температурах. ГК основан на механизмах адсорбции и распределения массы.
Колонку, инжектор и детектор при используемых температурах и скоростях
потока газа нужно уравновесить пока не будет достигнута стабильная базовая
линия, т.е. откалибровать. Необходима предварительная подготовка тестового
раствора и раствора сравнения. Растворы должны быть свободны от твердых
частиц. Время калибровки составило 1 минуту, максимальная температура 250
0
С, программа испарения – начальная 45 0С/2 мин, далее 5 0С/мин и до 240 0С в
5 минут, объем шприца 10 мкл, давление 0.72 атм, скорость потока 21 мл/мин,
соотношение 15:1, скорость разделения 15 мл/мин, время прогона 46 мин.
Жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ). Применялась для разделения
экстрактов с использованием свойств веществ различного их распределения
между двумя несмешивающимися жидкими фазами (водой и органическим
растворителем). При этом гидрофобные вещества оставались в менее полярных
растворителях.
Твердофазная экстракция (ТФЭ). Представляет собой вид колоночной
хроматографии с использованием в качестве неподвижной фазы патронакартриджа объемами 6, 12 и 20 мл. Патроны-картриджи – это маленькие
колонки из полиэтилена с сорбентом (стационарная фаза), упакованным между
двумя пористыми фильтрами. Большинство стационарных фаз состоят из
кремнезема, связанного с конкретной функциональной группой, чаще всего это
обращенно-фазовой (RP) силикагель, который включает в себя углеводородные
цепи различной длины в качестве радикала. Скорость потока 2.5 мл/мин. Метод
ТФЭ является более рациональным по сравнению с ЖЖЭ, что связано с
34
лучшим фазовым разделением и утилизацией меньших количеств органических
растворителей, широким разнообразием адсорбентов и размеров колонок,
подходящих для селективной экстракции каждого образца. Применение
вакуума ускоряет процесс экстракции, т.е. продвижение образца через
неподвижную фазу.
2.2.2 Спектральный анализ
Структуры всех выделенных веществ идентифицированы методами
спектрального анализа одномерной (1H и 13C ЯМР, DEPT), двумерной (HMQC,
HMBC, COSY, NOESY), УФ-, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии.
ЯМР-спектры записаны на спектрометрах Bruker Avance DRX - 400 МГц
(с экранированным магнитом, зонд 3 мм), 500 МГц (с переменным контролем
температуры, зонд 3 мм и 4 мм) и Varian - 400 МГц (с переменным контролем
температуры, зонд 3 мм), 600 МГц (с угловым зондом 3 мм для измерения
данных ЯМР с микрограммов образца и подавлением воды).
1
H и 13C ЯМР-спектры были получены со стандартными импульсными
последовательностями, работающими на частоте 500 МГц и 125 МГц для ядер
1
H и 13С, соответственно. Значения химических сдвигов указаны в миллионных
долях (ppm), и в качестве внутренних стандартов химических сдвигов
использовались триметилсилан (ТМС) или известные сдвиги растворителей.
Константы были записаны в герцах (Гц). Стандартные импульсные
последовательности были использованы для COSY, HMQC, HMBC, TOCSY,
NOESY и DEPT. Эксперименты ЯМР проводили в соответствующем
растворителе, разбавляя раствор до 0.01 мл подходящим стандартом для
калибровки химического сдвига.
ИК-спектры получены на ИК-спектрофотометре Bruker Vector 33, с
возможностями ИК-Фурье преобразования в ближней и средней областях
(оснащен аксессуарами волоконной оптики для дистанционного зондирования,
и HYPERION IRScope с возможностью нарушенного полного отражения для
твердофазного анализа). Брали 1-2 мг высушенного испытуемого вещества,
осторожно растирали смесь и распределяли в подходящую фильеру на диск
диаметром 10-15 мм, прилагали к нему давление около 800 МПа и записывали
спектр подходящей интенсивности. Для неустойчивых при нормальных
атмосферных условиях или гигроскопичных веществ диск располагался в
вакууме. При этом необходимо учитывать несколько факторов, приводящих к
формированию дефектов. Это – недостаточная или избыточная степень помола,
влажность или другие примеси в дисперсионной среде. Диск отклоняется, если
визуальный осмотр показывает отсутствие единой прозрачности или
пропускания около 2000 см-1 (5 мкм).
УФ-спектры
получены
с
использованием
прибора
UV-VIScпектрофотометра компании Hewlett-Packard 8453 с диодной матрицей,
который оснащен 7 передвижными термостатированными ячейками и
отдельным циркулятором воды. Программный комплекс «Биохимический
анализ» позволяет проводить кинетический анализ и мониторинг в режиме
реального времени.
35
Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) были записаны на массспектрометре Micromass Q-TOF Micro с закрытым источником распыления.
Высокое разрешение достигается при прохождении ионного пучка через
электростатический анализатор прежде, чем он поступает в магнитный сектор.
С такой двойной фокусировкой масс-спектрометра, ионы масс могут быть
измерены с точностью приблизительно в 1 минуту. При этом атомное
содержание молекулярных ионов может быть определено. При использовании
электроспрея вещество поступает на ионизацию в виде раствора с полярным
растворителем, поэтому на спектрах могут нередко обнаружиться
молекулярные пики с катионами щелочных металлов, натрия или калия.
Оценка точности определения массы (∆) рассчитывалась из различия
измеряемой массы и вычисленной (теоретической) до четвертого знака после
запятой и выражалась в ppm: (∆) ppm = 106*(mтеор-mизм)/mтеор
КД-спектры соединений записывали с использованием спектрофотометра
– JASCO J-715 (США). Экспериментальный расчет КД-спектров проводили на
приборе Micromass Q-TOF (микрогибридный квадрупольный/ортогональный
высокого разрешения с Micromass капиллярной ВЭЖХ, с режимами
положительного и отрицательного ионов, включая источники LockSpray и
NanoFlow CapLC). Источник Nanoflow CapLC предоставляет возможность
контролирования скорости потока при нанолитр/мин. Источником света в
приборе является ксеноновая лампа; свет проходит через двойной
монохроматор, снабженный кварцевой призмой. Линейный пучок из первого
монохроматора разделяется на 2 поляризованных компонента под прямым
углом во втором монохроматоре. Выходная щель монохроматора исключает
внеочередной луч. Поляризованный и монохроматический свет проходит через
модулятор двойного лучепреломления, результатом оказывается переменный
циркулярно поляризованный свет. Затем пучок проходит через образец
измерения и достигает фотоумножителя, следующего за усилителем, который
производит два электрических сигнала: один постоянный ток, а другой
переменный ток с частотой модуляции, характерной для образца. Фаза дает
знак кругового дихроизма. Отношение переменного тока пропорционально
дифференциальному поглощению, который создает сигнал. Область длин волн,
который обычно покрывает дихрограф, от 170 нм до 800 нм.
2.3 Подтверждение подлинности и качества сырья
2.3.1 Методика проведения макро- и микроскопического исследования
растений
При проведении макроскопического анализа указывают состав сырья
(цветки, листья, стебель, корни и др.). Исследования данного показателя
проводятся в соответствии с характерными внешними морфологическими
признаками. Микроскопическое исследование диагностирует признаки
анатомического строения сырья. Оба этих метода относятся к важнейшим
методам определения подлинности лекарственного сырья.
36
Растения были собраны в гербарий, для проведения структурного анализа
зафиксированы надземные и подземные вегетативные органы исследуемых
видов растений. Фиксацию проводили в 70 % спирте по методике СтрасбургерФлемминга (спирт:глицерин:вода 1:1:1). Анатомические препараты готовили от
руки и с помощью микротома с замораживающим устройством ТОС-2, срезы
заключали в глицерин и бальзам в соответствии с общепринятыми методиками
Прозиной М.Н. (1960), Пермякова А.И (1988), Барыкиной Р.П. (2001, 2004).
Толщина анатомических срезов 10-15 мкм. Подготовлено более 500 временных
препаратов. Микрофотографии сделаны на микроскопе МC-300 (увеличение
х100, х400) [124-126].
Метод оптической микроскопии применяется для установления
ботанической
принадлежности
исследуемого
растения-объекта
с
использованием оптических микроскопов. При этом наблюдается увеличение
от 18 до 40 крат, свет при осмотре — искусственный, отраженный. В этих
условиях четко выявляются анатомические признаки строения образца [127129].
2.3.2 Микробиологическая чистота
Данные исследования относятся к категории 4 «Лекарственные средства,
состоящие только из растительных компонентов, одного или нескольких
(цельных, измельченных, растертых в порошок)», указанной в главе 5.1.4.
Государственной Фармакопеи Республики Казахстан (ГФ РК) [129, c. 479]. Так
указано, что общее число жизнеспособных аэробных микроорганизмов должно
составлять не более 105 бактерий и 104 грибов, наличие энтеробактерии и
некоторых других грамотрицательных бактерий не более 103 в одном грамме
или миллилитре образца. Бактерии видов E. coli (10 г или 10 мл) и Salmonella
(10 г или 10 мл), согласно требованиям ГФ РК должны отсутствовать в
исследуемом сырье. Установление фертильности среды в присутствии
препарата проверяли посевом подходящего штамма. Если в конце
инкубационного периода рост микобактерий не происходил ни в одной из
испытуемых сред, то препарат соответствовал испытанию. Посев подходящих
количеств энтеробактерий, исследовали с содержанием в них 0.1 г, 0.01 г и
0.001 г (или 0.1 мл, 0.01 мл и 0.001 мл) препарата. Инкубировали при 30-35 0С в
течение 24-48 ч. Чашка Петри, содержащая агар или бульон с глюкозой в
качестве питательной среды, использовалась для культивирования
мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов и для
определения общего количества бактерий. Этот тест предназначен в основном
для определения, соответствует ли препарат установленной спецификации
микробиологического качества [130]. Если контаминирующие микроорганизмы
продолжали развиваться после инкубации, тест повторяли и в то же время
проводили бактериологическое исследование стерильности.
2.3.3 Радионуклидный контроль
Производится для проверки соответствия исследуемых образцов нормам
радиационной безопасности. Отбор пробы массой 50-1000 г осуществляли
37
методом квартования, т.е. выделения средней пробы, согласно требованиям НД
[129, c. 566]. Исследования радионуклидов (Сs-137, Sr-90) выполнялись на
гамма-бета-спектрометрическом комплексе «Прогресс БГ». Изначально
методом аттестованной геометрии на спектрометре в измерительной кювете
измерялось бета-излучение растений, помещенных в чашки Петри. После
получения отрицательных результатов, свидетельствующих о том, сырье
относится ко второй или третьей группе радиационной безопасности, массу
образца увеличивали. Далее для измерения гамма-излучения предварительно
измельченные образцы лекарственного сырья помещали в сосуды Маринелли,
находившиеся в защитной камере из свинца толщиной 10 см. При этом
проводилось термическое концентрирование, озоление растительных объектов
в муфельных печах при температуре 600-800 0С. Спектрометрические данные
для стронция-137 обрабатывались на фотопиках с энергией 662 КэВ. Стоит
иметь в виду, что активность большинства образцов стандартизированного
растительного сырья не превышает 1 % от нормативного показателя (так
называемые образцы с «нулевой активностью») [131]. Поэтому необходимо
следовать
последовательному
четкому
алгоритму
исследования
радиоактивности и выводы можно сделать только при соблюдении условия
точности менее 0.3. Техногенные изотопы цезий-137и стронций-90 считаются
наиболее опасными для человека. Очень важно нормировать условия хранения
и транспортировки с сырья момента его заготовки.
2.3.4 Определение содержания тяжелых металлов
Концентрацию тяжёлых металлов (Pb, Cd, Cu, As, Hg) определяли методом
атомно-абсорбционной спектроскопии по методике ГОСТ 30178-96 «Сырьё и
продукты пищевые. Атомно-адсорбционный метод определения токсичных
элементов». Данный метод основан на минерализации продукта способом
сухого или мокрого озоления и определении концентрации элемента в растворе
минерализата методом пламенной атомной абсорбции. При этом предельно
допустимая концентрация тяжелых металлов в лекарственном растительном
сырье составляет: не более 6.0, 1.0, 0.2 и 0.1 мг/кг в свинце, кадмии, мышьяке и
ртути, соответственно.
2.4 Количественное содержание действующих веществ.
Полифенольный состав определяли по микро-методом Folin-Ciocalteu
[132], содержание общих флавоноидов по методу [133]. Первоначально
необходимо
гомогенизировать
исследуемый
препарат.
Развести
соответствующий объем с водой таким образом, чтобы получить раствор,
который будет содержать 15 мкг фенола на миллилитр. Готовят серию
эталонных растворов с фенолом, содержащих 5 мкг, 10 мкг, 15 мкг, 20 мкг и 30
мкг на мл фенола соответственно. К 5 мл полученного раствора и 5 мл каждого
из контрольных растворов соответственно, добавляют 5 мл буферного раствора
рН 9.0, 5 мл раствора аминопиразолона и 5 мл раствора кровяной соли.
Оставляют на 10 мин и измеряют интенсивность цвета при 546 нм. Строят
график калибровочной кривой и вычисляют содержание фенола в образце.
38
Эксперименты проводили с использованием чистого кофейной и галловой
кислот, выбранных в качестве стандартов фенола. Кроме водных растворов
препараты также проверялись в метаноле. Растворы готовили двумя способами:
1) после 2 мин и 2) в течение 2 мин, добавили 600 мкл дистиллированной воды
и перемешали смесь снова, затем было добавлено 200 мкл 20 % раствор
карбоната натрия. Поглощение во времени исследованных смесей, ранее
вылитых и закрученных в 1-см кюветах, контролировали в течение 2 ч при 40
0
С, данные оптической плотности записывали каждые две минуты. Для
определения содержания флавоноидов, известный объем экстракта помещали в
10 мл мерную колбу. Доводили объем до 5 мл дистиллированной водой и
добавляли 0.3 мл NaN02 (1:20). Пятью минутами позже добавляли 3 мл А1С13
(1:10). После происшествия 6 минут добавляли 2 мл 1М NaOH и общий объем
доводили до 10 мл дистиллированной водой. Раствор хорошо перемешивали и
измеряли оптическую плотность на УФ-спектрофотометре при длине волны
510 нм. Все величины абсорбции по отношению к реакции испытываемых
смесей были оценены статистически с помощью анализа дисперсии с
использованием однофакторного дисперсионного анализа (p≤0.05).
2.5 Исследование состава эфирных масел
С целью получения эфирных масел навески воздушно-сухого
измельченного сырья массой в пределах 220-270 г помещали в круглодонные
колбы вместимостью 3000 мл, заливали 1000-1500 мл дистиллированной воды,
подсоединяли холодильник с приемником и доводили до кипения. Перегонку
проводили в течение 3 часов. Выход эфирных масел определяли
непосредственным взвешиванием по объему в приемнике после охлаждения.
Эфирные масла экстрагировали паровой дистилляции (90 мин) с
использованием модифицированного аппарата Клевенджера Scientific Glass,
Калифорния [134]. Содержание масла было рассчитано как количество (г)
масла к весу (г) взятого сухого сырья.
ГХ-МС анализ и подготовка образцов. Аппарат Клевенджера для
получения эфирного масла представляет собой колбу, присоединенную к
холодильнику с водяным охлаждением, помещенную в баню с регулируемым
подогревом. Используя микропипетку на 100 мкл, масла из каждого образца
переносили в 10 мл виалу фирмы «Agilent». Образцы были получены в объеме
после смывания веществ, адсорбированных на внутренней поверхности
обратного холодильника в аппарате Клевенджера, с помощью гексана при
охлаждении системы. Полученные масла концентрировали продувкой (10
мл/мин) в токе азота до минимального остаточного объема. После того как
паровая дистилляция была завершена, органический слой отделяли и
анализировали с помощью газовой хроматографии (ГХ) и хромато-масс
спектрометрии (ГХ-МС), одновременно. Те же самые условия анализа были
осуществлены как для ГХ, так и ГХ/МС с использованием системы Agilent
GC/MSD. Аликвота 1 мл каждого образца масла была помещена
хроматографическим шприцом в испаритель газового хроматографа для
анализа. Эфирные масла были проанализированы с помощью ГХ-МС
39
спектрометра Varian CP-3800 ГХ, со встроенным масс-спектрометрическим
детектором системы 5975 GS/MSD (Agilent, США). ГХ оснащен DB-5
капиллярной колонкой с плавленым силикагелем Hewlet Packard-Innowax FSC
(30 м × 0.25 мм, с толщиной пленки 0.25 мкм), управляемой при следующих
условиях: температура колонки 60-240 °С при нагревании 3 °С/мин, а затем
выдерживают при 240 °С; газ-носитель гелий; скорость потока 1 мл/мин; объем
впрыска 1 мкл (без деления потока/splitless). Поток в колонке был установлен
при постоянном давлении 5.66 фунтов на квадратный дюйм. Температура ГХ
печи поддерживалась на уровне 60 °С в течение 10 мин и увеличена до 220 °С
со скоростью 4 °С/мин, затем выдерживалась постоянной при 220 °С в течение
10 мин с последним запрограммированным нагреванием до 240°С со скоростью
1 °С/мин, и повторно второй раз при 240 °С в течение 20 мин. Деление потока
регулируется при соотношении 40:1. Температура инжектора 250 °С. Массспектрометр работал с электронной энергией в 70 эВ. Масс-спектры были
получены с прибора, установленного для сканирования m/z с 35 до 450, при
скорости сканирования с-1. Диапазон сканирований в секунду на 1.95, начиная с
3.5 мин после инъекции. ГХ-анализ проводили с использованием системы
Agilent 6890N GC. Температура FID детектора была 300 °С. Для того чтобы
получить тот же порядок элюирования с ГХ/МС, одновременный впрыск был
сделан с помощью той же колонки и соответствующих условий эксплуатации.
Идентификация компонентов эфирного масла была осуществлена путем
сравнения их относительного времени удерживания с подлинных образцов или
сравнивая их относительных индексов удерживания (индекс Ковача) для серии
н-алканов. Компьютер выявлял соответствия соединений, используя в качестве
ссылок библиотеки баз данных эфирных масел Wiley и MassFinder 3.1 [135].
Относительная концентрация разделенных соединений в процентах была
рассчитана на основе FID хроматограммы. Масс-спектры веществ
компонентного анализа эфирных масел сравнивали с данными библиотеки и
литературными источниками. Целевые пики были подтверждены временами
удерживания и масс-спектрами. Подтвержденные интегрированные пики
использовали для определения процентного содержания каждого компонента в
эфирном масле.
2.6 Разработка технологии выделения субстанций из исследуемых
растений и разделение их комплекса биологически активных веществ
(БАВ) на индивидуальные соединения
Первоначально, сухое измельченное до 3 мм сырье исследуемых растений
экстрагировали смесью воды и этилового спирта в различных соотношениях с
постоянным перемешиванием для ускорения процесса экстракции, используя
при этом ультразвуковую ванну. Масса сырья (300 г), объем экстрагента (2000
мл) и время экстракции (48 часов) оставались неизменными в каждой серии
опытов. Концентрация этилового спирта варьировалась от 30 % до 96 %. Было
проведено 3 серии опытов для подбора наиболее оптимального растворителя,
извлекающего максимальное количество экстрактивных веществ в виде
субстанции. С технологической, экономической и экологической точки зрения,
40
а также на основании результатов антиоксидантной активности экстрактов,
более рационально использование 50 %-ного этанола.
Определение оптимального времени экстракции каждой серии опытов
осуществляли в интервале от 5 до 48 часов. Анализ повторяли три раза для
сходимости результатов, при этом к одной и той же массе сырья приливали
выявленный оптимальный растворитель, строго контролируя время процесса.
Далее устанавливали оптимальное соотношение массы сырья и объема
выбранного экстрагента. При аналогичных условиях: одинаковая масса сырья,
температура и время экстракции, для каждого образца в трех повторностях
добавляли разный объем растворителя, постепенно увеличивая его
соотношение с сырьем (г/мл) от 1:5 до 1:10. Определение оптимальной
температуры экстракции проводили при постоянстве подобранных
технологических параметров, изменяя температурный режим от 20-25 °С до 5560 °С. При установлении кратности экстракции наиболее полное истощение
сырья наблюдалось после двухратного проведения процесса. Экстрагирование
растительных объектов в производственных условиях часто предусматривает
дополнительную операцию промывания водой сырья, оставшегося после
фильтрации экстракта второй экстракции. Полученные на стадии
общепринятого при производстве приема промывные воды используются для
эстрагировании новой порции сырья, обеспечивая тем самым более полное
извлечение экстрактивных веществ. Полученные первый и второй экстракты
объединяли и концентрировали на роторном испарителе в мягких условиях под
вакуумом до сухого остатка. Извлеченный сухой остаток, субстанцию,
представляющую собой комплекс биологически активных веществ, подвергали
дальнейшему разделению на индивидуальные соединения. Разделение
комплекса БАВ субстанций было проведено для всех четырех исследуемых
видов растений с составлением соответствующих схем разделения каждого из
них. Для стандартизации каждую из полученных фракций анализировали
хроматографически с применением различных сорбентов и систем
элюирования. Данные качественного и количественного содержания основных
групп БАВ в субстанциях лаконично согласуются между собой. Использование
промышленно значимых видов рода Limonium позволяют применять
исследуемые растения более рационально без вреда для отечественной флоры, а
отработанные оптимальные условия технологии представляются максимально
целесообразными.
2.6.1 Limonium myrianthum
Предварительно высушенное и измельченное сырье (корни 300 г и
надземная часть 180 г растений) последовательно экстрагировали
разнополярными органическими растворителями: гексан, этилацетат, ацетон,
метанол, вода-метанол (1:1). Избирательная экстракция проводилась для
частичного разделения биологически активных веществ, удаления
липофильных и балластных компонентов. Вначале воздушно-сухая масса
дважды экстрагировалась 300 мл гексана (300 мл x 2) при комнатной
температуре в течение суток. Фильтрат объединяли и концентрировали под
41
вакуумом на ротационном испарителе. Далее исчерпывающе экстрагировали
последующими растворителями по вышеописанной процедуре. Так из корней
было получено 23 г сухого ацетонового экстракта, 72 г метанольного экстракта
и 1 г 50 %-ного метанольного экстракта, а из надземной части соответственно,
2 г сухого гексанового экстракта и 2 г этилацетатного экстракта, которые
подвергали дальнейшему хроматографическому разделению.
Полученный ацетоновый экстракт (23 г) фракционировали на колонке,
заполненной силикагелем, элюирование проводили смесью растворителей
хлористого метилена и метанола в различных концентрациях с увеличением
полярности системы. При этом получили 14 фракций (01-014). Каждая из
выделенных фракций концентрировалась в мягких условиях. Объединенные
фракции 04-05 (1.2 г), имеющие одинаковые Rf на ТСХ, были подвержены
повторному хроматографированию на силикагеле с использованием смеси
гексана, этилацетата и метанола, с увеличением полярности растворителей.
Получено 59 фракций (А1-А59). Фракции А42-А45 (69 мг) делили на колонке
методом твердофазной экстракции с обращено фазовым силикагелем (C8) в
системе элюентов вода-метанол-ацетон (1:1, 7:3, 8:2, 9:1), таким образом, было
идентифицировано вещество 1.1.
Фракцию 07, полученную при элюировании колонки 30 % раствором
метанола в метиленхлориде и представляющую собой сумму веществ массой
3.9 г хроматографировали на Sephadex LH-20, элюирование проводили с
использованием метанола (100 %). При этом были получено 160 фракций (В1В160). Из объединенных фракций В74-В85 получили вещество 1.2 (32 мг).
Из фракции 08 (2.1 г) на колонке сефадекс марки LH-20 с использованием
метанола в качестве элюента были получены 140 фракций (С1-С140).
Объединенные фракции С1-С30 (66 г) повторно хроматографировали на
колонке, заполненной сефадексом марки LH-20, элюируя метанолом. При этом
получили 33 фракции (D1-D33) и из объединенных фракций F12-F13 получили
вещество 1.3 (10 мг). А фракция D11 (5 мг) была идентифицирована как
вещество 1.2.
Сухой водно-метанольный экстракт 1 г после двукратной экстракции
растворяли в небольшом количестве метанола и смешивали с 2 г селита,
высушивали под вытяжкой до полного удаления растворителя. Полученную
суспензию помещали на колонку, заполненную сефадексом и элюировали
метанолом. При этом были получены 80 фракций (Е1-Е80). Из объединенных
фракций Е26-Е28 выделено вещество 1.4 (21 мг).
Метанольный экстракт корней 72 г подвергали вакуумно-жидкостному
хроматографированию на силикагеле, элюируя этилацетатом-метанолом с
постепенным увеличением полярности растворителей. Таким образом, было
получено 3 фракции (1-3) и два осадка. Фракцию 2 (7.3 г) повторно делили на
колонке с силикагелем в аналогичной системе с получением 101 фракции (F11101). Так фракцию F13 массой 190 мг разделяли на сефадексе, что привело к
выделению 676 фракций (F21-676). Объединенные фракции F2279-305
идентифицировали как вещество 1.5 (1 мг). Фракции F16-9 (227 мг) и F110-12 (111
мг), с одинаковым Rf на ТСХ, объединяли и подвергали повторному
42
хроматографированию на сефадексе с получением 458 фракций F31-458. Из
хроматографически одинаковых фракций F366-74 (47 мг) выделено вещество 1.6.
Объединенные фракции F113-19 (218 мг) и F120-24 (165 мг) разделяли методом
твердофазной экстракции на обращено-фазовом силикагеле (С8) с системой
элюентов вода-метанол. Из полученных 236 фракций F41-236, объединенные
фракции F4194-224 привели к выделению вещества 1.7 (6 мг). А фракции F41-6
(173 мг) и F450-63 (15 мг) объединяли и помещали на колонку Sephadex LH-20 с
метанолом в качестве элюента, получив при этом 130 фракций F51-130. Из
фракций F586-88 (2 мг) была установлена структура вещества 1.8.
Из гексанового экстракта надземной части на колонке силикагеля в
системе растворителей гексан-хлороформ-метанол было выделено 45 фракций
– G1-G45. Фракцию J4 (18 мг) идентифицировали как вещество 1.9.
При хроматографическом разделении этилацетатной фракции с
использованием в качестве сорбента силикагеля и системы элюентов –
этилацетат-метанол, была получена 91 фракция (H1-H91), из которых
объединенные фракции H35-H36 общей массой 24 мг привели к разделению
веществ 1.10 и 1.11.
2.6.2 Limonium gmelinii
Предварительно высушенное и измельченное сырье (корни 127 г и
надземная
часть
58
г
растений)
экстрагировали
метанолом.
Сконцентрированный экстракт составил по 20 г для надземной части и корней,
которые растворяли в 100 мл воды. Далее проводили жидкость-жидкостную
экстракцию 3 раза 200 мл этилацетата и бутанола последовательно, для
предварительного разделения разнополярных веществ. После отделения на
делительной воронке образовавшихся слоев (органического и водного),
получили по 1 г этилацетатного экстракта, который далее подвергали
разделению на колонке, заполненной полиамидом, элюируя системой водаметанол-ацетон-этанол. Так было получено 465 фракций, которые объединяли
и подвергали повторному хроматографированию. Фракция FR1, выделенная в
количестве 261 мг, дала два вещества 2.1 и 2.2. Одинаковые фракции FR2-46
были идентифицированы в качестве соединения 2.3 (44 мг). Во фракциях FR47117 был получен осадок, который отфильтровывали декантацией, таким
образом, в растворе FR47-117 было обнаружено вещество 2.4, массой 45 мг, а
осадок FR47-117/1 определен как соединение 2.5 (64 мг).
Для разделения 1 г этилацетатного экстракта надземной части на
полиамидной колонке системой элюентов служили хлороформ-этанол-ацетонвода в различном соотношении. При этом извлекли 702 фракции (FA1-702).
Объединенные фракции FA109-124 (26 мг) привели к идентификации вещества
2.6. В хроматографически одинаковых фракциях FA133-152 было установлено
вещество 2.7 (72 мг). Из фракций FA169-224 общей массой 38 мг были
выделены вещества 2.8 и 2.9. Фракции FA225-292 (18 мг), с одинаковым Rf на
ТСХ, идентифицировали как вещество 2.10. А вещество 2.11 (23 мг)
обнаружили во фракциях FA365-435.
43
2.6.3 Limonium caspium
Надземную часть (0.24 кг) сушили на воздухе с последующим
измельчением в дробилке Wiley-Mill, используемой для растительных
объектов. Экстракцию проводили при комнатной температуре с
использованием 1.7 л дихлорметана, с получением 7.4 г сухого экстракта после
испарения растворителя. Шрот снова экстрагировали 2.2 л этанола, обеспечивая
11.3 г экстракта. Наконец, осуществляли экстракцию водой (2.5 л), что привело
к 17.8 г экстракта после лиофилизации для удаления воды.
6.8 г этанольного экстракта подвергали хроматографическому разделению
на колонке силикагеля с обратной фазой С-18 в объеме 120 грамм при
элюировании водой-метанолом. При этом субстанцию предварительно
смешивали с селитом массой 4 г и высушивали. Были выделены 7 фракций (F0107). В воде растворялись только первые две полученные фракции, поэтому
первую фракцию 3 г аналогично хроматографировали с сохранением всех
условий на колонке с получением фракций F1-9. Далее фракция F2 (88 мг)
разделялась на колонке LH-20 с метанолом в качестве элюента, что привело к
получению фракций 1G-10G. Вещество 3.1 было обнаружено во фракциях 4G
(22 мг) и 7G (17 мг). Фракцию 9G идентифицировали как соединение 3.2 (12
мг). Фракцию F3 399 мг, полученную после обратнофазового разделения,
подвергали очистке. Из выделенных 28 фракций (1В-28В) были обнаружены
вещества 3.3 (34 мг), 3.4 (103 мг) и 3.5 (33 мг). Фракция F4 разделялась на
колонке, заполненной сефадексом при элюировании метанолом, с извлечением
фракций 1Y-18Y. Хроматографически одинаковые фракции 5Y и 6Y
объединяли и повторно очищали на колонке сефадекс объемом 20 г. При этом
было выделено 3 фракции, фракция 2R установлена как соединение 3.6 (33 мг).
Объединенные фракции 16Y-17Y (55 мг) идентифицировали как вещество 3.7.
Из фракции F5 106 мг на колонке высотой 100 см и диаметром 3 см,
заполненной сефадексом марки LH-20, было получено 50 фракций. Так из
одинаковых фракций 10-11 (15 мг), 27-28 (12 мг) и 30-35 (21 мг) были
разделены соединения 3.8, 3.9 и 3.10 соответственно. Вещество 3.11 объемом
25 мг были определено во фракции F7 после элюирования колонки сефадекс
метанолом.
2.6.4 Limonium leptophyllum
Высушенную и измельченную надземную часть (0.26 кг) экстрагировали
при комнатной температуре с использованием последовательно 1.5 л
дихлорметана, 1.9 л этанола и 2.3 л воды. Так после концентрирования было
получено 6.7 г, 10.5 г и 16.2 г дихлорметанового, этанольного и водного
экстрактов соответственно.
Этанольный экстракт массой 6 г помещали на колонку, заполненную
синтетической смолой Dianon серии HP-20, и элюировали разнополярными
растворами воды-метанола. При этом получили метанольную 2.3 г и водную
2.14 г фракции. Далее метанольную фракцию помещали на полиамид с
аналогичной системой элюентов, получив 46 фракций (FM1-FM46).
Полученную фракцию FM4 (50 мг) разделяли на сефадексе LH-20, что привело
44
к обнаружению вещества 4.1 (6.4 мг), после очистки фракции L1 29.9 мг на 30 г
SPE-картридже С8 и системы растворителей DCM:MeOH (14:1). При
разделении на LH-20 фракций FM5-FM8, соединения 4.2 и 4.3, массой 12 и
12.2 мг соответственно, были выделены из фракций F3-10 (70.1 мг) и F3-12-3,
причем для обнаружения вещества 4.2, полученную фракцию L3 (20 мг)
повторно подвергали очистке на колонке сефадекс. Из фракций FM13-FM16,
объемом 95 мг, после сефадекса было идентифицировано вещество 4.4 (7.2 мг).
Объединенные
фракции
FM23-FM30
делили
методом
ТФЭ
на
обращеннофазовом силикагеле (С8 –картридж, Supelco), элюируя воднометанольными растворами, так было получено вещество 4.5 (6.9 мг) после
очистки 17 мг фракции F5-9-11 на сефадексе. 5.5. мг соединения 4.6
идентифицировали в хроматографически одинаковых фракциях FM35-FM46
(162.7 мг) после деления на колонке, заполненной LH-20.
Водную фракцию, с колонки Dianon HP-20, также подвергали разделению
на полиамиде в аналогичных условиях, получив при этом 23 фракции (FW1FW23). Из фракции FW4 (70.1 мг) после разделения на сефадексе LH-20 и
повторной очистки фракции L9 94.5 мг было обнаружению вещество 4.7 (13.3
мг). Хроматографически одинаковые фракции FW5-7 (32 мг) привели к
выделению 12 мг вещества 4.8. Фракции FW9-10 идентифицировали как
соединение 4.9 (63.3 мг). После очистки на LH-20 фракции FW13 получили
вещество 4.10, массой 4.2 мг. Объединенные фракции FW15(1)-16-17 помещали
на колонку, заполненную сефадексом с раствором метанола-воды (4:1) в
качестве элюента, выделив таким способом вещество 4.11 в количестве 13.5 мг.
Установление тонкой структуры всех выделенных соединений
проводилось в аккредитованной лаборатории Национального центра
исследования природных соединений на базе Университета Миссисипи, США.
2.7 Скрининг биологической активности.
2.7.1 Противомалярийная и антипротозойная активности
Анализ проводили in vitro. Противомалярийную активность [136]
определяли против хлорохин чувствительного (D6, Сьерра-Леоне) и
устойчивого (W2, Индо Китай) простейших Plasmodium falciparum, измеряя
активность фермента лактатдегидрогеназы, как описано ранее [137]. Экстракты
первоначально испытывают на концентрации 15867 нг/мл с повтором, и
процент ингибирования рассчитывают по отношению к отрицательному и
положительному контролю. На вторичном анализе образцы, растворенные в 20
мг/мл, испытывают при 47600, 15867, и 5289 нг/мл. Все IC50 рассчитываются с
использованием соответствующей кривой программного обеспечения XLfit.
Антипротозойную активность соединений тестировали против культуры
Leishmania donovani promastigotes; пентамидин и амфотерицин B были
использованы в качестве положительного контроля [138, 139]. В 96-луночный
микропланшет для анализа к культуре Leishmania promastigotes (2*106
клетки/мл) были добавлены образцы с соответствующим разведением.
Планшеты инкубировали при 26 °С в течение 72 часов и рост Leishmania
45
promastigotes определяли по методу синего красителя Alamar [140]. Для анализа
противомалярийной активности, суспензии эритроцитов, инфицированных D6
или W2 штамма P. falciparum (200 мкл, с 2 % паразитемии и 2 % гематокрита в
среде RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки человека и 60 мкг/мл
амикацина) были добавлены в лунки 96-луночного планшета, содержащего 10
мкл серийно разбавленных испытуемых образцов. Планшет промывали газовой
смесью 90 % N2, 5 % O2 и 5 % CO2 и инкубировали при 37 °С, в течение 72 ч в
инкубационной модульной камере (Биллапс-Ротенберг, Калифорния).
Паразитическую лактатдегидрогеназу определяли в соответствии с процедурой,
описанной Маклером [141]. 20 мкл инкубационной смеси смешивали с 100 мкл
реагента MalstatTM (Flow Inc., Портленд, штат Орегон), и инкубировали при
комнатной температуре в течение 30 мин. Затем добавляли 20 мкл смеси 1:1
соли нитротетразолия синего/феназин этосульфата (Sigma, Сент-Луис, штат
Миссури) и далее планшет инкубировали в темноте в течение 1 ч. Реакцию
затем останавливают добавлением 100 мкл 5 % раствора уксусной кислоты.
Планшет считывали при 650 нм. Артемизинин и хлорохин были включены в
каждом анализе как противомалярийный контроль. Величины IC50
рассчитывали из кривых доза-ответ. Добавляли разбавленные образцы, и
планшеты снова инкубировали в течение 48 ч. Количество жизнеспособных
клеток определяли путем анализа нейтрального красного, как описано ранее
[142]. Доксорубицин был использован в качестве положительного контроля для
цитотоксичности.
2.7.2 Антибактериальная и противогрибковая активности
Противомикробный анализ проводился in vitro. Все образцы были
протестированы на антимикробную активность против микроорганизмов,
полученных из Американской коллекции типовых культур (штат Виргиния,
США) и включают в себя штаммы Candida Albicans АТСС 90028, С. glabrata
АТСС 90030, С. krusei АТСС 6258, Cryptococcus neoformans, АТСС 90113,
Aspergillus fumigatus АТСС 204305, Staphylococcus aureus АТСС 29213,
метициллин-резистентный золотистый стафилококк ТСС 33591 (MRSA),
Escherichia coli АТСС 35218, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 и
Mycobacterium intracellulare АТСС 23068. Анализ проводили по методике,
описанной ранее [137, p. 87; 138]. Временные культуры (для немедленного
использования в анализах) всех организмов, за исключением М. intracellulare,
хранились либо на скошенном агаре, либо на пластинах при 4°С до их
использования. Для А. fumigatus длительное хранение штаммов осуществлялось
с помощью замораживания клеток в 10 % глицерине (бульон Штерна) при -70
°С, в бульоне Сабуро с декстрозой (Difco, Детройт) в течение 18-24 часов при
37 °С и 72 ч при 30 °С для штаммов Candida spp. и C. Neoformans и в бульоне
Миддлбрук в модификации 7Н9 (Difco) для М. intracellulare. А. fumigatus
хранится в картофельном агаре с декстрозой (Difco) при -70 °С. За
исключением, для М. intracellulare и А. fumigatus, свежие пластинки с агаром
готовят за 3-5 дней до каждого анализа, смешивая агар с суспензиями
замороженных запасов. М. intracellulare и А. fumigatus скошенные пластинки
46
готовят из замороженных запасов каждые 4-5 недель. М. intracelluare готовят
на скошенном агаре Лёвенштейна-Йенсена в течение 1 недели при 37 °С. За 7296 часов перед анализом субкультуры М. intracellulare получают путем
ресуспендирования клеток с поверхности скошенного агара в бульоне
Миддлбрук в модификации 7Н9 и инкубации при 37 °С и 10 % CO2. В день
анализа, подготовленные пробы (растворенные в ДМСО) серийно разбавляют с
помощью (20 % : 0.9 %) ДМСО/физиологический раствор и в повторе
переводят в 96-луночные микропланшеты. Candida spp., C. neoformans, и MRSA
посевы готовят, выбирая 1-3 колоний из чашек с агаром и ресуспендируя в ~5
мл 0.9 % стерильного физиологического раствора. Сравнивают поглощение 100
мкл засоленных суспензий и субкультуры М. intracellulare при 630 нм с
использованием EL-340 Biokinetics Reader (Bio-Tek Instruments, Вермонт). А.
fumigatus посев готовят удаляя споры и переместив в ~5 мл 0.9 %
физиологического раствора. Эту суспензию фильтруют через Miracloth
(Calbiochem, Ла Йолла, штат Калифорния) и разводят соответственно
(сравнивают со стандартной кривой) в 5 % растворе красителя Alamar
Blue™/среды RPMI 1640 бульона (2 % буферной раствор декстрозы при рН 4,5)
с получением в конечном итоге инокулят 3.0*104 КОЕ/мл. Микробный посев
добавляют к образцам для достижения конечного объема 200 мкл. Контроль
роста (только физиологический раствор), растворитель и пустой носитель
(среда) включены в каждую тестовую пластину.
2.7.3 Противораковая активность
Исследование цитотоксичности проводилось в эпителии клеток из почек
млекопитающих (Vero и LLC-PK1). Клетки культивируют в 75 см2 колбах
среды RPMI 1640 (Gibco. Invitrogen Corp., Калифорния, CШA) с добавлением
бычьей сыворотки теленка (10 %) и амикацина (60 мг/л), при 37 0С в атмосфере
с 95 % влажность, 5 % CO2. Анализ проводят в 96-луночных микропланшетах.
Клетки высевают в лунки планшета при плотности 25000 клеток/лунку и
культивируют в течение 24 ч при 37 0С. Образцы, разбавленные соответственно
в среде RPMI 1640, добавляют к клеткам и снова инкубируют в течение 48 ч.
Количество жизнеспособных клеток определяется процедурой нейтрального
красного окрашивания. После инкубации с образцами клетки промывают
физиологическим раствором и инкубируют в течение 90 мин со средой,
содержащей нейтральный красный краситель (160 мкг/мл). После промывания
планшета для удаления внеклеточного красителя добавляют раствор
подкисленного
изопропанола
(0.33
%
HCl),
чтобы
лизировать
жизнеспособность клеток. Поглощение считывают при 540 нм. IC50
(концентрацию тестируемого соединения, которая вызвала ингибирование
роста на 50 % после 48-часовой экспозиции клеток) рассчитывают по кривым
доз, генерируемым построением процентного роста по сравнению с
испытуемой концентрацией по логарифмической шкале с использованием
Microsoft Excel. Доксорубицин используется в качестве положительного
контроля в цитотоксичности.
47
Клеточные культуры и анализ ингибирования роста клеток. Клетки
острого HL60 и хронического К562 лейкоза человека были приобретены у
Американской коллекции типовых культур, Роквилл, штат Мэриленд, США.
Обе клеточные линии были выращены в суспензионной культуре при 37 °С в
среде RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС),
2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина. Для
анализа ингибирования роста клеток, HL60 клетки и K562 были созданы в
1*105 клеток на лунку в 24-луночных планшетах Costar. Клетки оставляли расти
в покое на 24 ч перед добавлением образца. Через 48 часов инкубации с
препаратами при 37 °С, количество живых клеток было рассчитано с помощью
метода трипанового синего для оценки жизнеспособности клеток [143].
2.7.4 Антиоксидантная активность
Эксперименты проведены в условиях in vitro на 20 взрослых (12-месячных)
белых лабораторных крысах-самцах массой 300 ± 50 г, в соответствии с
установленной процедурой лаборатории Института физиологии человека и
животных КН МОН РК. Исследования были выполнены м.н.с., к.б.н.
Аралбаевой А.Н. и Турумбетовой Ж.Ж. под руководством г.н.с., д.б.н.
Мурзахметовой М.К. Для выявления действия исследуемых образцов на
состояние клеточных мембран определяли уровень ПОЛ в микросомах печени.
Микросомальные фракции печени выделяли по методу [144]. Об интенсивности
перекисного окисления липидов (ПОЛ) в микросомах судили по содержанию
ТБК-активных продуктов. Концентрацию малонового диальдегида (МДА)
определяли по интенсивности развивающейся окраски в результате
взаимодействия с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по методу Н.О. Ohkawa e.a.
[145]. Крыс умерщвляют путем декапитации под легким эфирным наркозом.
Для получения гомогената, навеску 0.5-1.0 г ткани печени крыс после
промывания в охлажденном физиологическом растворе, помещали в 10 мл
среды, содержащей 0.85 % NaCl и 50 мМ КН2РО4, (рН 7.4 при 4 °С). Далее
гомогенизировали гомогенизатором типа Polytron в течение 90 сек. Гомогенат
центрифугировали при 10000 в течение 20 мин. Микросомную фракцию
получали, центрифугируя супернатант при 30000 в течение 60 мин.
Надосадочную жидкость осторожно сливали и осадок, представляющий собой
фракцию тяжелых микросом, суспендировали в среде, содержащей 25 %
глицерин, 0.1 мМ ЭДТА, 0.2 мМ СаСl2, 10 мМ гистидин, (рН 7.2 при 4 °С) и
хранили при минус 4 °С. Для индукции процесса ПОЛ в мембранах применяли
систему Fe2+ (0.02 мМ) + аскорбат (0.5 мМ). Окисление проводили в среде
гомогенизирования в термостатируемых ячейках при 37 °С с постоянным
перемешиванием в течение 60 мин. За накоплением малонового диальдегида
(МДА) - продукта ПОЛ, следили по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой,
оптическую плотность измеряли при 532 нм. Расчет содержания продуктов,
реагирующих с ТБК, проводили с учетом коэффициента молярной экстинкции
МДА, равного 1.56×105 М-1⋅см-1.
48
2.7.5 Каннабиноидная и опиоидная активности
Для исследования использовалось радиоактивное замещение лигандов для
различных подтипов рецепторов. Соединения оценивали в экспериментах с
использованием конкуренции оба подтипов каннабиноидных рецепторов, CB1
и CB2 [146, 147]. Анализ связывания каннабиноидных рецепторов проводили
при следующих условиях: 10 мкМ каждого соединения инкубировали с 0.5 нМ
[3H] -СР 55940, мощного каннабиноидного агониста с аффинностью к обоим
подтипам рецепторов, и 10 мкг СВ1 или СВ2 мембран в течение 90 минут в 96луночном планшете. Реакцию останавливали с помощью быстрой вакуумной
фильтрации через фильтры класса GF/C, предварительно замоченные в 0.3 %
БСА с использованием 96-луночный Perkin Elmer UNIFILTER (Perkin Elmer
Life Sciences Inc., Бостон, Массачусетс, США), а затем 10 раз смывали 50 мМ
трис-ацетатным буфером, содержащим 0.2 % БСА. Планшеты считывали с
использованием Perkin Elmer Topcount (Perkin Elmer Life Sciences Inc., Бостон,
Массачусетс, США). Общее связывание определяют как связывание в
присутствии 1.0 % ДМСО. Неспецифическое связывание, которое наблюдается
в присутствии 1.0 мкМ CP-55940. Специфическое связывание определяли как
разность между общим и неспецифическим связыванием.
Все соединения оценивались по связыванию опиоидных рецепторов
подтипов (δ, κ, μ), а также подтипов каннабиноидных рецепторов, упомянутых
выше [147, p. 1757]. Насыщаемость экспериментов проводилась после каждой
партии мембран, соскобленных для каждой из трех линий опиоидных клеток (δ,
κ, μ), чтобы определить оптимальный тритий и концентрацию мембраны,
которые будут использоваться в анализе. Насыщаемость экспериментов
определяет количество рецептора и сродство радиолиганда к мембране.
Опиоидные анализы связывания проводили при следующих условиях: 10 мкМ
каждого соединения инкубировали с [3Н] -DAMGO (μ), [3H] -U-69593 (κ) и [3H]
- энкефалин (δ) в течение 60 минут в 96-луночном планшете. Неспецифическим
связывание считали связывание, наблюдаемое в присутствии 10 мкМ DAMGO
(μ), норбиналторфимина (κ) и DPDPE (δ).
Молекулярное моделирование и докинг. Структурный файл белка (PDB ID:
4EJ4) был загружен из Банка данных белковых структур. Белок подвергался
обширному этапу структурной подготовки, чтобы исправить недостающие
атомы, порядок связей, таутомерные и ротамерные формы. Сетку рецептора
подготавливали, используя координаты связанного лиганда. Модуль Fred
программы OpenEye был использован для докинга. Все стыковки позы
подвергали термодинамическим расчетам с использованием SZMAP. Атомы
водорода были точно добавлены в белковые комплексы, а затем, были
назначены частичные заряды. Группы ОН, S и СН3 было разрешено
поворачивать в ходе расчета. При использовании точной молекулы воды в
качестве зондирования SZMAP вычисляет свободную энергию активной
поверхности площадки.
49
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1 Показатели качества изучаемых видов сырья и количественное
содержание в них действующих веществ
Подлинность лекарственного сырья подтверждается его макро- и
микроскопическими показателями.
Макроскопия. Предварительная визуальная оценка растений вида L.
myrianthum и L. gmelinii была осуществлена д.б.н. Р.A. Егеубаевой («Институт
ботаники и фитоинтродукции» КН МОН РК). Растения вида L. caspium и L.
leptophyllum были идентифицированы д.б.н. Н.Г. Гемеджиевой («Институт
ботаники и фитоинтродукции» КН МОН РК). Внешний вид исследуемых
растений представлен в приложении А.
Норма содержания в исследуемом сырье, частей растений, утративших
первоначальную окраску (пожелтевших, побуревших и почерневших), согласно
АНД составляет не более 1 %.
Для определения измельченности сырья, проба просеивалась через сито с
диаметром отверстия 7 мм, при этом количество частиц, не проходящих сквозь
сито должно составлять не более 4.0 %.
Микроскопия. Исследования были проведены к.б.н. Н.З. Ахтаевой под
руководством д.б.н. С.С. Айдосовой на кафедре биоразнообразия и биоресурсов
факультета
биологии
и
биотехнологии
КазНУ
им.
аль-Фараби.
Микроморфологические особенности некоторых таксонов рода Limonium
связаны с анатомией строения листьев, наличием в них солевых желез из-за
адаптации к конкретным засоленным условиям среды их местообитаний [148].
Результаты показывают, что таксоны проявляют сильные ксероморфные
приспособления, которые отражены в плоском строении стенок эпидермальных
клеток, толстой кутикулы, высоком соотношении разделительных стенок с
губчатой тканью, наличие склеренхимы клеток в мезофиллах листа и
механической ткани флоэмы и ксилемы. Данные таксоны имеют солевые
железы на адаксиальном и абаксиальном эпидермисе для выделения излишков
соли. Также признаками адаптации к повышенной солености служат
относительно высокие размеры клеток мезофилла, отсутствие безжелезистых
волосков и незащищенные устьица немного увеличены над уровнем
эпидермальных клеток [149]. Полученные данные отражены в приложении Б.
Для подтверждения качества сырья было исследовано содержание
тяжелых металлов, микробиологическая чистота и радионуклидный контроль.
Тестирование было проведено в РГКП "Научно-практическом центре
санитарно-эпидемиологической экспертизы и мониторинга" (НПЦСЭЭиМ)
КГСЭН МЗ РК, специалистами санитарно-гигиенической лаборатории, а также
отдела радиационной гигиены и радиологии. Необходимость проведения
данных анализов обусловлена требованиями НД для введения лекарственных
растений в отечественную фармакопею [129, 130], результаты изложены в
приложении В.
Органические примеси («сульфатная зола») в сырье должны составлять не
более 1.0 %, количество минеральной примеси («зола, нерастворимая в 10 %
50
НСl») – не более 2.0 %; «зола общая» нормирована не более 6 %; показатель
товарной влажности сырья – не более 10 % (ГФ РК, Т. 1, Т. 2).
Наличие грамотрицательных бактерий и дрожжевых грибов допустимо в
пределах не более 103 и 104 соответственно на 1.0 г (мл) препарата, согласно
нормам, установленным в НД. Общее число жизнеспособных аэробных
микроорганизмов должно составлять не более 105 бактерий. Необходимо
отметить, что в данном сырье наблюдается отсутствие анаэробных
энтеробактерий. Содержание тяжелых металлов в исследуемых растениях не
обнаружено. Результаты радионуклидного контроля не превышают указанных
допустимых показателей, по которым содержание радионуклидов техногенного
происхождения цезия-137 (Cs-137) и стронция-90 (Sr-90) в продовольственном
сырье должно составлять не более 400 и 200 Бк/кг соответственно (ГФ РК, Т. 1,
Т. 2). По всем исследуемым параметрам сырье отвечает требованиям,
указанным в ГФ РК [129].
Результаты исследований общего полифенольного состава и содержания
общих флавоноидов в экстрактах надземной части (н.ч.) и корнях (к.)
представлено в таблице 2.
Таблица 2 – Общее содержание полифенолов и флавоноидов
Наименование препарата
Метанольный экстракт (н.ч.)
Метанольный экстракт (к.)
Общий
полифенольный
состав (мг/мл)
37,0±1,42
39,3±0,95
Общее содержание
флавоноидов
(мг/мл)
17,5±0,59
17,8±0,06
Ацетоновый экстракт (к.)
55,6±2,4
49,3±0,6
Ацетоновый экстракт (н.ч.)
47,3±2,0
28,0±0,87
Водно-метанольный экстракт (к.)
46,8±1,9
24,3±1,1
Водно-метанольный экстракт (н.ч.)
28,9±1,2
15,2±0,06
Этанольный экстракт (к.)
41,2±1,9
22,4±0,02
Этанольный экстракт (н.ч.)
27,4±0,89
12,4±0,04
Примечание – достоверно по сравнению с контролем - р <0,05*, р<0,01**
Экстракты, как видно из данных, представленных в таблице 2, содержащие
наибольшее количество флавоноидов – это ацетоновый, водно-метанольный и
этанольный для корней. Самым высоким содержанием полифенолов обладают
ацетоновый экстракты и соответственно для корней водно-метанольный,
этанольный и метанольный. Полученные результаты коррелируют с
характерным наличием полифенольных соединений в изучаемых растениях.
Таким образом, ацетоновый экстракт корней и надземной части были изучены в
пересчете на галловую кислоту и кверцетин, используемым в качестве
стандарта, поскольку они имеют высокий процент содержания в растениях рода
Limonium (данные таблицы 3). Здесь опять наблюдался более высокое
содержание полифенолов в сравнении с флавоноидами, а также наивысшая их
51
концентрация в корнях, нежели в надземной части растения, что вполне может
быть объяснено распадом флавоноидов, вызванным повышением температуры
под действием солнечных лучей.
Таблица 3 – Содержание полифенолов и флавоноидов (в пересчете на галловую
кислоту и кверцетин)
Наименование препарата
Общий полифенольный
состав (мг галл.
кислоты/мл)
Ацетоновый экстракт (н.ч.) 1.84
Ацетоновый экстракт (к.)
12.466
Общее содержание
флавоноидов (мг
кверц./мл)
0.89
1.96
Определение содержания жирных кислот и витаминов А, Е и С в
растениях рода Limonium производилось на базе Казахской академии питания
с.н.с. лаборатории биохимии и витаминологии, к.м.н. Кильмаевым В.В
(приложение Г). Так, в цветках надземной части и корнях больше всего
содержится витамина С 4.9, 4.1 и 4.5 мг/100 г соответственно. Витамины Е и А
меньше всего присутствуют в корнях, это объясняется тем, что они являются
жирорастворимыми, т.е. липофильными компонентами, следовательно
проявляют низкое сродство к воде, а значит плохо передвигаются в органах и
тканях растения, в результате чего возникают сложности в их накоплении.
Качественный и количественный анализ жирных кислот в соответствии с
хроматограммами, представленными в приложении Г, изложен в таблице 4.
Таблица 4 – Количественное содержание жирных кислот, обнаруженных в
цветках и надземной части (н.ч.) растений рода Limonium
Сn
Название кислоты
14:0
15:0
16:0
16:1
18:0
18:1
18:2
18:3
Тетрадекановая
Пентадекановая
Гексадекановая
Цис-9-гексадеценовая кислота
Октадекановая
Цис-9-октадеценовая кислота
9,12-октадекадиеновая кислота
9,12,15-октадекатриеновая кислота
% содержание жирных кислот
цветки
н. ч.
0.5
0.6
1.7
1.5
9.6
10.1
1.2
1.5
3.3
4.2
55.5
54.5
27.8
27.3
0.4
0.3
Имеется достаточно данных о количественном содержании жирных кислот
в корнях растений рода Limonium [5, 150-152], которые в достаточной мере
коррелируют с полученными показателями. Так, из насыщенных кислот
наибольший процент приходится на пальмитиновую кислоту, что также
52
подтверждается цифрами ГХ/МС анализа эфирных масел. Как видно из
таблицы 4, все образцы отличаются высоким содержанием ненасыщенных
кислот, моноеновых и наиболее ценных полиненасыщенных. Больше всего в
составе превалируют олеиновая и линолевая кислоты, относящиеся к группе
омега-9 мононенасыщенных и эссенциальных полиненасыщенных (омега-6)
жирных кислот соответственно. Линолевая и α-линоленовая кислоты, являясь
незаменимыми кислотами, не могут быть синтезированы и должны поступать в
организм с пищей.
3.2 Получение субстанции в производственных условиях и анализ
фармрынка
Процент извлечения из биологического сырья тех или иных классов
соединений напрямую зависит от степени растворимости извлекаемых веществ
в экстрагенте и проникающей способности органического растворителя в ткани
биологического материала. Последняя в свою очередь, определяется
структурной пористостью и степенью измельченности сырья. Также
немаловажен ряд других факторов, таких как интенсивность перемешивания
измельченного сырьевого материала с растворителем, кратности настаивания
полученного экстракта и температура. Влияние некоторых из перечисленных
выше факторов на выделение активных веществ из различных видов растений
рода Limonium приводится ниже. Рациональность технологической схемы в
процессе переработки лекарственного сырья обосновывается как можно более
полным его истощением. При производстве растительных субстанций полнота
экстракции активного комплекса определяется факторами, влияющими на ее
продолжительность.
При выборе технологического режима параметром оптимизации было
количественное содержание комплекса биологически активных веществ. Для
разработки оптимальной и рациональной технологии извлечения субстанции из
надземной части Limonium gmelinii в виде сухого экстракта учитывали природу
экстрагента, его соотношение с сырьем, температуру, время и кратность
экстракции. Сходимость результатов оценивали в 3-кратной повторности.
В зависимости от природы биологически активных веществ при
экстракции чаще всего используются разнополярные экстрагенты. Основываясь
на принцип «подобное растворяется в подобном», подбирали растворитель,
который максимально извлекал полифенолы различной природы с
минимальным содержанием балластных веществ. Из-за того, что целью
получения субстанции было ее дальнейшее применение в качестве активного
начала лекарственных средств, для проведения процесса экстрагирования были
апробированы растворы смеси этанола и воды в различных соотношениях.
В результате проведенного эксперимента было установлено, что наиболее
подходящим растворителем, извлекающими максимальное количество
биологически активных веществ является 50% водный этиловый спирт
(таблица 5). Повышение концентрации этилового спирта ведет к увеличению
извлечения липофильных компонентов.
53
Таблица 5 – Подбор подходящего растворителя для получения субстанции
Экстрагент
30% спирт
50% спирт
70% спирт
96% спирт
Выход, %
Анализ № 2
26,94
31,35
30,27
20,11
Анализ № 1
26,83
31,21
30,33
19,72
Анализ № 3
26,76
31,19
30,41
19,92
Учитывая, классы биологически активных веществ содержащиеся в
исследуемом растительном сырье было выявлено, что допустимое изменение
температуры процесса экстракции исследуемого вида растения оказывает
незначительное влияние на выход субстанции. Поэтому экстрагирование
осуществляли при комнатной температуре, поскольку во-первых, это более
рационально для снижения экономических затрат, а во-вторых, при низкой
температуре происходит осаждение слизей, пектинов и других ненужных
компонентов, за счет уменьшения их растворимости. В силу своей
поглощающей способности, сырье удерживает часть экстрагента внутри клеток,
т.е. не все извлеченные вещества из растения перейдут в соответствующий
экстракт. В связи с этим, при производстве экстрактов необходимо проведение
дополнительных операций: перемешивание, либо увеличение числа возможных
экстракций. В предложенной схеме, экстракция проводилась дважды, так как
двухкратность, способствует максимальному извлечению комплекса БАВ из
сырья.
Время экстракции варьировалось от 5 до 48 часов. Вначале экстрагент
проникает в материал и растворяет вещества, находящиеся внутри клетки,
затем происходит молекулярный перенос растворенных веществ на
поверхность кусочков материала. Из данных таблицы 6 следует, что
максимальное содержание БАВ достигается в течение 5 часов, поэтому
принимая в расчет сменность на производстве, было выбрано 6-часовое время
экстракции.
Таблица 6 – Подбор оптимального времени экстракции
Время, час
5
12
24
48
Выход, %
Анализ № 2
31,31
29,56
26,87
25,06
Анализ № 1
31,29
29,53
26,75
25,03
Анализ № 3
31,40
29,48
26,78
25,09
При неизменном количестве растительного материала движущей силой
массопереноса является разность концентраций веществ внутри и вне
растительной клетки, т.е. чем больше экстрагента будет участвовать в
54
экстракционном процессе, тем больше вещества будет растворено и вынесено
за пределы клетки в межклеточное пространство. Для получения экстрактов,
используемых в настоящее время в медицине, соотношение сырья и
экстрагента составляет 1:5 и 1:10. Поэтому следующим этапом оптимизации
технологии получения субстанции из надземной части L. gmelinii было
выяснение оптимального соотношения растительного сырья и экстрагента
(таблица 7).
Таблица 7 – Определение соотношения «сырье-экстрагент»
Соотношение
1:5
1:6
1:7
1:8
1:9
1:10
Выход, %
Анализ № 2
28,30
30,23
30,87
31,19
29,21
26,03
Анализ № 1
28,32
30,20
30,97
31,21
29,30
26,04
Анализ № 3
28,25
30,11
30,76
31,25
29,23
26,06
В лабораторных условиях отрабатывались выявленные оптимальные
параметры максимального извлечения комплекса биологически активных
веществ в виде сухих экстрактов, принципиальная схема представлена на
рисунке 12. Таковыми при технологии изготовления субстанции в
экспериментальных условиях являются: экстрагент – 50 % этанол, соотношение
сырья и экстрагента 1:8, время экстракции – 6 часов. Данные при определении
объёма используемого растворителя напрямую зависят от степени набухания
сырья. При измельчении надземной части и корней до размера частиц 3-5 мм в
исходном материале сохраняется клеточная структура, но за счет увеличения
поверхности соприкосновения преобладают диффузионные процессы. При
этом вытяжка содержит меньше механических примесей. Выбор этанола в
качестве экстрагента очевиден, благодаря тому, что он экономически и
экологически более целесообразен, так как при стандартизации не требуется
определение остаточных количеств растворителя в субстанциях, он менее
токсичен для организма, обладает антисептическим и дезинфицирующим
свойствами, и, следовательно, выгоден для применения как консервант.
Температура экстракции 20-23 °С. При этом процесс экстракции ускоряется с
помощью дополнительного перемешивания и незначительного повышения
температуры. Нагревание должно строго контролироваться ввиду того, что при
высоких температурах наблюдается деструкция некоторых классов
органических веществ, в частности танинов и катехинов, которые являются
действующими в исследуемых растениях рода Limonium.
Отработанные технологические условия были также подтверждены
результатами сравнительной антиоксидантной активности в качестве
оптимальных параметров для получения субстанции из надземной части
55
L. gmelinii. С целью для стандартизации полученной субстанции и
установления ее химического состава далее проводили разделение комплекса
БАВ на индивидуальные компоненты.
ВОДА
ЭТАНОЛ
50%-НЫЙ
РАСТВОР
ШРОТ
СЫРЬЕ
ИЗМЕЛЬЧЕННЫЕ
РАСТЕНИЯ
измельчение,
просеивание
(d=3 мм)
ЭКСТРАКЦИЯ
растительного сырья
ОБЪЕДИНЕННАЯ ВЫТЯЖКА
Отгон спирта
УПАРИВАНИЕ ИЗВЛЕЧЕНИЯ
ЭКСТРАКТ
СУШКА
СУБСТАНЦИЯ
СТАНДАРТИЗАЦИЯ
Рисунок 12 – Принципиальная схема получения субстанции в лабораторных
условиях
Схема получения субстанции из надземной части L. gmelinii в виде сухого
экстракта в промышленных условиях представлена на рисунке 13.
56
ВР.1.
Кт, Кх,
Км/б
ВР.2.
Кт, Кх
ВР.1.1.
Санитарная
обработка и
подготовка
производства
ВР.1.2.
Подготовка оборудования
ВР.1.3.
Подготовка персонала
ВР.2.1.
Подготовка
сырья
Подготовка помещений
Контроль
Измельчение
ВР.2.2.
Просеивание
ВР.2.3.
Взвешивание
Контроль
Потери
На ТП.1.2
ТП.1.
Кт, Кх
ТП.2.
Кт, Кх
Получение
экстракта
Очистка
вытяжки
ТП.1.1.
Приготовление экстрагента
ТП.1.2.
Загрузка, смачивание
ТП.1.3.
Настаивание, экстракция
ТП.2.1.
Отстаивание
ТП.2.2.
Фильтрование
Сгущение
извлечения
ПО
ТП.4.
Кт, Кх
Получение
субстанции
Контроль
Потери
Шрот в отвал
ТП.3.
Кт, Кх
Контроль
ТП.3.1.
Упаривание экстракта
ТП.3.2.
Получение концентрата
Рекуперация спирта
ТП.4.1.
Контроль
Потери
Сушка
Контроль
ТП.3.2.
Размол
Потери
УМО.1.
Кт, Кх,
Км/б
Фасовка и
упаковка
продукции
УМО.1.1. Маркировка
Контроль
УМО.1.2. Отгрузка
На склад
Рисунок 13 – Технологическая схема получения субстанции из надземной части
растений вида L. gmelinii рода Limonim
Как видно из преставленного рисунка 13, технологическая схема
получения субстанции в виде сухого экстракта из надземной части растений
вида L. gmelinii рода Limonim имеет несколько стадий, таких как
вспомогательные работы, экстракция, очистка вытяжки, сгущение извлечения,
стандартизация, фасовка, упаковка, маркировка, хранение и траспортирование,
57
а также регенерация отработанного растворителя. На стадиях вспомогательных
работ (ВР.1. и ВР.2.) осуществляется санитарная обработка и подготовка
производства, включающие в себя подготовку воздуха, приготовление
растворов антисептиков, подготовку технологической одежды, узлов,
материалов и сырья. При этом соблюдается контроль технологический,
химический и микробиологический, для обеспечения надлежащего качества
готового продукта. Подготовка вспомогательных материалов, в частности,
приготовление раствора 50 %-ного спирта, является первым технологическим
процессом, так как именно с этого начинается стандартизация получаемого
продукта в виде сухого экстракта. На ТП.1. проводится непосредственное
получение экстракта, предварительно настояв сырье определенное время для
ускорения процесса экстракции за счет частичного вымывания действующих
веществ из клеток растения. Экстрагирование ведут при ультразвуковом
перемешивании и повторяют дважды для максимального извлечения БАВ. На
стадии очистки ТП.2. полученную вытяжку отстаивают в отстойнике при
8-10 0С в течение регламентированного по НД времени для удаления
балластных веществ. Однако при коагуляции также могут выпадать в осадок и
проантоцианидины, которыми богат исследуемый экстракт. Поэтому
необходимо осуществлять постадийный контроль полученного извлечения на
содержание действующих веществ или сухого остатка. Далее отстоявшееся
извлечение подвергают фильтрации и отправляют на ТП.3. для сгущения.
Выпаривание проводят в вакуум-выпарной установке при температуре 40-50
0
С. Данный процесс заключается в максимальном удалении экстрагента,
который далее направляется на регенерацию. Рекуперация экстрагента из
отработанного сырья (шрота) основа на методе вымывания водой и
представляет собой стадию переработки отходов. Выпаривание проводят под
вакуумом на шаровом (роторном) испарителе до получения концентрата.
Последним технологическим процессом производства ТП.4. является сушка и
соответсвенно получение субстанции. Сконцентрированный экстракт сушат в
контактной вакуум-сушилке и размалывают, получая мелкодисперсный
порошок. На данном этапе необходимо контролировать содержание влаги, т.е.
гигроскопичность продукта, которая оказывает влияние на условия хранения, и
потерю действующих веществ, особенно термически не устойчивых. Стоит
заметить, что способ сушки может иметь последствия на фармакологическое
действие получаемого экстракта. Последним этапом производства УМО.1.
является упаковка, фасовка и отгрузка продукции на склад. Транспортировка
осуществляется согласно специальным (действующим) инструкциям
фармацевтической компании «Ромат». Все условия и последовательность
выполнения технологических операций отражены в промышленном регламенте
ФК «Ромат» на производство субстанции из надземной части растений вида L.
gmelinii (приложение Д). Стандартизацию готовой сухой субстанции проводят
по ряду показателей: сыпучесть, насыпная и объемная плотность, влажность,
представленных в таблице 8, проверяя ее на соответствие требованиям НД
(приложение Е), в том числе фармакопейным статьям. Для выявления
сходимости результатов анализ осуществляли в трех повторностях.
58
Усредненное значение насыпной плотности, которую измеряли в условиях
свободного неслежавшегося состояния, составило до усадки 0.85 г/см3, после –
0.69 г/см3. Влажность же должна находиться в пределах 0,62 % ± 0,02.
Таблица 8 – Основные технологические показатели субстанции из надземной
части L. gmelinii
№
п/п
Наименование
показателей
1
Насыпная плотность
До усадки
После усадки
Объемная плотность
Сыпучесть
Колонка 25мм
Колонка 15мм
Колонка 10мм
Влажность
2
3
4
Результаты анализа
№1
№2
№3
0,8336 г/см3
0,1004 г/см3
0,830 г/см3
0,8620 г/см3
0,9790 г/см3
0,860 г/см3
0,8540 г/см3
0,9810 г/см3
0,870 г/см3
11,0-23,3 г/с
8,6-10,5 г/с
6,5-8,3 г/с
0,62 %
24,4-142,9 г/с
13,2-20,8 г/с
6,2-10,2 г/с
0,61 %
15,4-58,8 г/с
12,8-15,9 г/с
6,2-8,4 г/с
0,63 %
Надземная часть L. gmelinii была введена в Государственный реестр
лекарственных средств для применения в медицине и Государственную
Фармакопею Республики Казахстан (приложение Ж). Получение субстанции
происходит согласно схеме, описанной на рисунке 14. Надземную часть L.
gmelinii измельчают на дробилке поз. 1 до размеров частиц не более 3 мм поз.2 .
Потери при помоле составляют 2,7-3,2 %. Молотое сырьё из бака-сборника поз.
3 взвешивают поз. 4 и передают на вторую стадию технологического процесса
получения экстракта. В реактор поз. 7 с помощью вакуума загружают из
мерника поз. 6 спирт этиловый 96 % и из мерника поз. 5 воду очищенную.
Смесь перемешивают 15-20 минут, после чего отбирают пробу раствора на
анализ. Содержание спирта должно быть 49-51 %, плотность 0,9382-0,9321
г/см3. Получают 1600 л 50 % спирта. Для приготовления 50 % спирта этилового
используют также отгоны спирта этилового со стадии ТП.3. и водную
промывку шрота со стадии ТП.2. На решетку экстрактора поз. 9 через боковой
люк застилают стальную сетку с размером отверстий 0,28 мм, на сетку
укладывают фильтр из сукна и зажимают полукольцами. Затем проверяют
герметичность экстрактора, для чего закрывают люк, запорную арматуру на
всех материальных линиях аппарата и при помощи инертного газа создают в
давление не более 0,07 МПа (0,7 кг/см2). За 5 минут допускается падение
давления не более чем на 0,002 МПа (0,2 кг/см2). При более быстром спаде
давления принимают меры к устранению неисправностей. С помощью вакуума
из реактора поз. 7 загружают 800 л 50% спирта этилового, затем давлением
инертного газа передают его вначале в мацерационный бак поз. 8, куда
вручную загружают 100 кг молотой надземной части L. gmelinii, затем
59
1 – мельница-измельчитель; 2 – сито-трясунок; 3 – бак-сборник; 4 – весы медицинские; 5 – мерник II класса для воды
очищенной; 6 – мерник I класса для спирта этилового; 7 – реактор-смеситель; 8 – мацерационный бак; 9 – перколятор;
10, 16, 20 – сборник; 11 – отстойник; 12 – фильтр; 13 – роторный испаритель; 14 – холодильник-конденсатор; 15 –
сборник отгона; 17 – вакуум-вальцовая сушилка с ловушкой; 18 – конденсатор; 19 – гранулятор. * 13, 14 и 15
представляют собой вакуум-выпарной аппарат
Рисунок 14 –Аппаратурная схема производства субстанции из надземной части растений вида Limonium gmelinii
60
полученную смесь помещают через верхний люк в экстрактор поз. 9 и
включают мешалку. Экстракцию ведут 5-6 часов при периодическом
перемешивании. Первый экстракт в количестве около 500 л с помощью
инертного газа сливают в сборник поз. 10. Процесс экстракции осуществляется
повторно. В экстрактор поз. 9 подают 850 л 50 % спирта этилового и процесс
проводят аналогично первому. Первый экстракт с помощью инертного газа
отфильтровывают через друк-фильтр поз. 12, заправленный сукном,
предварительно отстояв его в отстойнике поз. 11. Второй экстракт с помощью
давления инертного газа передают из экстрактора поз. 9 в мацерационный бак
поз. 8 на следующую загрузку сырья. По окончании второй экстракции при
работающей мешалке загружают в экстрактор поз. 9 воду и перемешивают
шрот в течение 1 часа. Промывную воду с помощью давления инертного газа
сливают в канализацию. Шрот выгружают в тележку через боковой люк и
сбрасывают в автомашину для вывоза в отвал. Содержание суммы дубильных
веществ в шроте не более 0,3%. Потери продукта со шротом составляют 8-9 %.
Выход на стадии по потерям в шроте составляет 91-92 %. Отфильтрованный
экстракт подают на роторный испаритель поз. 13 со скоростью 250 –300 л/час и
упаривают. Концентрирование экстракта ведут при вакууме 0,03-0,04 МПа
(0,2 – 0,4 кгс/м2) и давлении пара в рубашке испарителя 0,2 МПа (2 кгс/см2) до
минимального объема. Упаренный раствор собирают в сборник поз. 16. Отгон
спирта собирают в сборник поз.15, затем давлением инертного газа передают в
мерник поз. 6 и используют для приготовления 50 % спирта. Для получения
концентрата упаренный раствор доупаривают при температуре 55 –60 0С и
разрежении 0,7–0,8 атм до получения темно-коричневого сиропа. Полученное
извлечение из сборника поз. 16 сушат при температуре 40-450С и вакууме
0,09 - 0,092 МПа (0,9-0,92 кгс/см2) в сушилке поз. 17 в течение 20-24 часов,
получая пластины не более 1 см. Затем на грануляторе поз. 19 продукт
измельчают, далее выгружают в полиэтиленовые мешки и взвешивают.
Каждую загрузку продукта сдают на анализ в цеховую лабораторию для
определения качества согласно требованиям НД. По результатам анализа
лаборатории цеха составляют серию, которую предъявляют на анализ в ОТК
завода. Из 100 кг сырья в среднем получают 27,0 кг сухой субстанции. На
стадии фасовки и упаковки готовый продукт фасуют в пластмассовые тары,
наклеивают этикетку и упаковывают в соответствии с ГОСТ 17768-90. На
этикетке указывается: ФК “Ромат”, г. Павлодар, Республика Казахстан,
товарный знак, название препарата на латинском, государственном и русском
языках, количество препарата, условия хранения, регистрационный номер,
номер серии, срок годности, штрих-код. Транспортировку осуществляют по
ГОСТ 17768-90. Необходимо отметить, что перерабатываемых на отдельных
стадиях использованных и обезвреживаемых отходов и выбросов в
производстве субстанции из надземной части L. gmelinii нет [153]. Это
значительно повышает экологичность и как следствие рентабельность и
конкурентоспособность предлагаемого способа получения сухих экстрактов на
основе растений рода Limonium. Таблица 9 отражает производительность
61
предприятия по выходу готового продукта в рамках концепции GMP при
производстве лекарственных средств.
Таблица 9 – Материальный баланс
Наименование
сырья
1.Надземная часть
L. gmelinii
Загружено
Количество, кг
В
технической массе
В 100%
исчислении
98
9,82
2.
Спирт
этиловый
384
38,48
3.
Вода
очищенная
516
51,70
Итого:
998
Получено
Наименование
Количество, кг
конечного
В
В 100%
продукта,
техничес- исчислеотходов и
кой массе
нии
потерь
1. Субстанция
29
2,91
2. Спирт
этиловый отгон
481
48,20
3. Спирт
этиловый в
промывной
воде
173
17,33
5.Шрот
196
19,64
6. Потери:
-сырье
-спирт
-субстанция
-вода
Итого:
3
93
2
21
998
0,30
9,32
0,20
2,10
Так как материальный баланс позволяет выявить стадии производства с
большими потерями, он представляет собой огромное практическое значение и
отражает уровень технологического процесса, предоставляя при этом
возможность одновременно определять направление усовершенствования.
Выход действующих веществ, которые характеризуют биологическое действие
готового препарата, необходимо отражать после каждой стадии процесса для
расчета материального баланса. Как видно из таблицы 9 большие потери
приходятся на отгон этанола 48 % и отработанное сырье 20 %. Однако это
нивелируется за счет того, что отгон спирта отправляется обратно в
технологический процесс для экстракции сырья, а шрот, благодаря оставшимся
в нем некоторым количествам экстрактивных веществ, обладает хорошими
показателями активности. Поэтому отработанное сырье рекомендовано
применять в сельском хозяйстве для хранения шерсти, яблок и как корм на
62
птицефабриках. Таким образом, выход готового продукта в виде сухого
экстракта составляет около 30 % от общей массы загруженного сырья.
По результатам последнего информационно-аналитического обзора
интеграционных процессов в фармацевтической отрасли [12], в 2012 году
наибольшие объемы мирового фармацевтического производства были за Азией
27 %, Северной 23 % и Латинской Америкой 19 %, далее соответственно
следуют Европа 14 % и Япония 11 %. По прогнозам на 2020 год,
территориальное распределение рынка данного сегмента сохранится за Азией
33 %, Латинской 27 % и Северной Америкой 16 %. Так с 2006 по 2012 годы
позиции лидирующих стран упали с 73 % до 48 %, данная тенденция
продолжает наблюдаться и на сегодняшний день, что связано с глобальными
социальными и экономическими изменениями, трансформирующими мировой
рынок фармпродукции. Необходимо учитывать ряд факторов, оказывающих
непосредственное влияние при разработке тех или иных лекарственных
средств. К ним относятся особенности лечения в гериатрической практике,
развитие устойчивости к препаратам, пандемии, появление новых патогенов и
мутантных форм заболеваний, экологические проблемы и выявление ранее
неизвестных болезней.
Согласно Республиканской «Программе развития фармацевтической
промышленности в РК на 2010-2014 годы» в Казахстане планировалось достичь
50 %-ного уровня производства отечественных лекарственных средств и
перевода национальных производителей на стандарт GMP [12]. Однако все еще
наблюдается высокая доля импорта в страну продукции зарубежных
фармацевтических производств, так как Казахстан имеет небольшую долю
производителей местного значения на рынке. Крупнейшие партнеры по объему
импорта фармацевтической продукции в Казахстан – Германия (15 %), Россия
(9 %), Франция (8 %), Индия (7 %) и другие. После образования Таможенного
союза существенно возросли поставки из Российской Федерации [12]. Со
вступлением во Всемирную торговую организацию Казахстан встает на путь
открытого взаимодействия с обращением лекарственных средств в Едином
экономическом пространстве, согласно принципам свободной торговли,
регламентируемым законодательной базой. Реализация проектов и
мероприятий в данном направлении будет способствовать беспрепятственному
перемещению лекарств, и как следствие повышению конкуренции, что
неотъемлемо приведет к снижению цен и улучшению качества лекарственных
средств.
3.3 Определение состава и активности эфирных масел исследуемых
растений
После гидродистилляции (перегонки с водяным паром в течение 3 часов)
исследуемых видов растений получили 3.5, 4.6, 2.3, 1.7 и 6.0, 1.0 мг
маслообразной жидкости из L. leptophyllum, L. caspium, L. gmelinii (надземной
части и корней) и L. myrianthum (надземной части и корней) соответственно.
Масла имели окраску от бледно- до светло-желтого цвета. Анализ
выделенных эфирных масел проводили методом ГХ/МС, путем сравнения их
63
времен удерживания и масс фрагментов полученных структур с
соответствующими стандартами из базы данных библиотеки и доступных
источников с опубликованными данными, спектры компонентного состава
приведены в приложении И. Данные по качественной и количественной
характеристике состава отражены в таблицах 10-17.
В растениях видов L. leptophyllum и L. caspium было идентифицировано 20
и 22 компонента соответственно (таблица 10 и 11), при этом 11 были
представлены в обоих видах растений (таблица 12).
Таблица 10 – Химический состав эфирных масел растения вида L. leptophyllum
№
1
2
3
4
5
Время
удерживания,
мин
46,720
52,306
57,556
57,633
64,816
%-ное
содержание
каждого пика
1,00
1,94
5,50
2,10
1,53
6
71,822
1,43
7
8
9
71,998
72,387
76,351
6,59
2,33
1,77
Идентификация
Гексадекан
Гептадекан
Октадекан
Пентадекан
Изофитол
Метил αлиноленат
Метил олеат
Фитол
Докозан
Структура/
молекулярная формула
HO
O
O
O
O
HO
С16Н34
С17Н36
С18Н38
С15Н32
С20Н40О
С19Н32О2
С19Н36О2
С20Н40О
С22Н46
Таблица 11 – Химический состав эфирных масел растения вида L. caspium
№
1
Время
удерживания,
мин
2
%-ное
Идентификация
содержание
каждого пика
3
4
1
11,621
2,34
1,8-Цинеол
2
18,539
6,06
Камфора
3
46,663
1,51
Лауриновая
кислота
4
55,281
1,15
Дрименол
Структура/
молекулярная формула
5
O
С10Н18О
O
C10H16O
O
OH
HO
С12Н24О2
С15Н26О
С14Н28О2
O
5
57,157
2,92
Миристиновая
кислота
64
OH
Продолжение таблицы 11
1
6
7
2
3
59,737
10,29
60,473
2,63
4
6,10,14Триметил-2пентадеканон
5
O
Диизобутил
фталат
O
O
O
С16Н22О4
С18Н36
O
8
61,732
1,38
9
71,853
3,09
С18Н36О
(E)-5Октадецен
Генэйкозан
C21H44
O
O
10
11
72,760
1,50
102,682
2,81
Амбреттолид
C16Н28О2
С25Н50
(E)-3Пентакозен
Таблица 12 – Химический состав эфирных масел, представленный в обоих
видах растений L.caspium (LC) and L. leptophyllum (LL)
№
1
Время
удерживания,
мин
LC
2
LL
3
%-ное
содержание
каждого
пика
LC
LL
4
5
Идентификация
Структура/
молекулярная формула
6
7
O
1
42,175 42,222
1,82
1,81
Миристицин
O
O
2
3
4
5
46,518 46,554
62,479 62,702
63,867 64,018
65,101 65,179
1,82
1,30
3,80
3,27
1,35
5,29
5,55
1,67
α-Цедрол
Нонадекан
Метилпальмитат
HO
O
O
O
O
O
6
7
8
65
C15H26O
С19Н40
С17Н34О2
O
Дибутилфталат
Пальмитиновая
67,122 67,832 16,22 9,45
кислота
67,478 67,495 1,35 16,71 Эйкозан
71,464 71,589 2,42 2,92 Метил линолеат
С11Н12О3
С16Н22О4
С16Н32О2
O
OH
O
O
С20Н42
С19Н34О2
Продолжение таблицы 12
1
2
3
9 80,554 80,668
10
88,446 88,477
4
7,20
5
5,86
3,73
2,06
11 95,795 95,831
2,75
1,60
6
Трикозан
Метил
пентакозан
Тетракозан
7
С23Н48
C26H54
С24Н50
Эйкозан и пальмитиновая кислота были обнаружены в обоих видах
растений L. caspium и L. leptophyllum. При этом основным составляющим в
маслах из растения вида L. leptophyllum является эйкозан 16.71 %, а в маслах из
растения вида L. caspium – пальмитиновая кислота 16.22 % соответственно.
Стоит отметить, наилучшим запахом обладали летучие компоненты,
выделенные из растения вида L. caspium, что связано с наличием в его составе
камфоры (борнанон-2) 6.06 % и 2.34 % эвкалиптола (1,8-цинеол), которые часто
представлены в регулярных эфирных маслах.
Из таблицы 13 и 14, видно, что в составе эфирных масел корней и
надземной части растений вида L. gmelinii обнаружено 11 и 15 веществ
соответственно. Расчет количественного содержания летучих компонентов в
исследуемых объектах производили с использованием метода внутреннего
стандарта.
Таблица 13 – Химический состав эфирных масел корней растения вида
L. gmelinii
№
Время
удерживания,
мин
1
2
%-ное
содержание
каждого
пика
3
1
55,297
5,08
Идентификация
Структура/
молекулярная формула
4
5
Дрименол
С15Н26О
С18Н36О
HO
O
2
3
59,634
60,442
7,68
6,10,14Триметил-2пентадеканон
4,83
Диизобутил
фталат
O
O
O
С16Н22О4
С17Н34О2
O
4
5
63,837
65,075
2,43
2,52
Метилпальмитат
O
O
O
Дибутилфталат
O
O
O
66
С16Н22О4
Продолжение таблицы 13
1
2
3
6
67,019
45,40
7
8
9
10
11
71,843
80,492
88,400
95,779
102,667
3,52
7,41
1,93
2,66
2,58
4
Пальмитиновая
кислота
Генэйкозан
Гексадекан
Гептадекан
Докозан
(E)-3-Пентакозен
5
O
OH
С16Н32О2
C21H44
С16Н34
С17Н36
С22Н46
С25Н50
Как в корнях, так и в надземной части растений найдены дрименол (5.08 и
0.70 %), метилпальмитат (2.43 и 1.44 %), пальмитиновая кислота (45.50 и 2.90
%), генэйкозан (3.52 и 1.74 %), гексадекан (7.41 и 12.45 %) и докозан (2.66 и
1.13 %). Следует отметить, что процентное содержание данных веществ больше
в корнях, за исключением гексадекана, представленного в большем количестве
именно в надземной части.
Таблица 14 – Химический состав эфирных масел надземной части растения
вида L. gmelinii
1
1
Время
удерживания,
мин
2
14,400
2
26,770
№
%-ное
содержание
Идентификация
каждого пика
3
4
2,85
Октанол-1
3,71
Структура/
молекулярная
формула
5
C8H18O
HO
Витиспиран
O
O
3
4
39,518
49,416
3,21
Транс-β-Ионон
1,39
1-(4Изопропилфенил)2-метилпропил
ацетат
C13H20O
C13H20O
O
С15Н22О2
O
O
5
49,758
1,54
2,8-Диметокси-5,6хинолиндион
N
O
O
H
6
53,919
1,74
Дрим-8-ен-11-аль
7
55,407
0,70
Дрименол
62,931
63,869
10,40
1,44
Фарнезил ацетон С
Метилпальмитат
67
С11H9NO4
С15Н24О
HO
8
9
O
O
С15Н26О
С18Н30О
С17Н34О2
O
O
O
Продолжение таблицы 14
1
2
3
10
66,683
2,90
11
12
13
14
15
71,880
80,643
88,448
95,806
102,683
1,74
12,45
1,93
1,23
1,13
4
Пальмитиновая
кислота
Генэйкозан
Гексадекан
Нонадекан
Гептакозан
Докозан
5
С16Н32О2
O
OH
C21H44
С16Н34
С19Н40
С27Н56
С22Н46
Наибольший процент по содержанию эфирных масел в корнях растения
вида L. gmelinii приходится на фарнезил ацетон С 10.40 % и гексадекан 12.45 %.
Транс-β-ионон, который присутствует в растении в достаточном количестве
(3.21 %) обладает цветочным запахом. Дрименол представлен в наименьшем
количестве, всего 0.71 %, в надземной части растения вида L.gmelinii по
сравнению с другими исследуемыми видами.
Анализ эфирных масел корней растения вида L. myrianthum показал на
хроматограмме не менее 21 вещества, из которых 18 были идентифицированы
(таблица 15).
Таблица 15 – Химический состав эфирных масел корней растения вида
L. myrianthum
№
Время
удерживания,
мин
1
2
%-ное
содержание
каждого
пика
3
Структура/
молекулярная
формула
Идентификация
4
5
OH
1
21,827
1,15
α-Терпинеол
2
41,193
5,04
1,1,4,5,6Пентаметилиндан
С10Н18О
С14Н20
O
3
45,157
3,68
Скопарон
4
47,795
4,74
1,1,2,3,3,5Гексаметилиндан
5
6
52,733
54,158
3,68
20,46
2,3,10Триметиофенантре
н
2-Бутил-4метоксиизофталев
ый альдегид
68
O
O
C11H10O4
O
С15Н22
С17Н16
O
O
O
С13Н16О3
Продолжение таблицы 15
1
2
3
4
5
OH
7
8
9
54,407
59,221
60,486
2,73
2,39
2,23
Албиканол
6,8-Диметокси-3метил-1бензоксепин-5-он
Диизобутил фталат
С15Н26О
O
O
O
67,103
1,75
11
80,458
2,16
С13Н14О4
O
O
O
O
10
O
Стеариновая
кислота
Трикозан
С16Н22О4
С18Н36О2
O
OH
С23Н48
В надземной части растения вида L. myrianthum обнаружено 20 летучих
компонентов (таблица 16).
Таблица 16 – Химический состав эфирных масел надземной части растения
вида L. myrianthum
1
Время
удерживания,
мин
2
%-ное
содержание
каждого пика
3
1
26,779
1,16
Витиспиран
2
3
37,925
53,746
1,19
3,85
4
54,596
1,25
Геранил ацетон
Метил миристат
α-Гексилкоричный
альдегид
5
55,882
1,03
№
Структура/
молекулярная
формула
5
Идентификация
4
O
C13H20O
С13Н22О
С15Н30О2
O
O
O
O
Фенантрен
O
6
58,955
1,05
Версалид
7
8
9
10
11
12
62,976
64,800
71,936
80,652
88,488
95,877
2,01
7,29
2,25
11,25
2,39
2,97
13
102,759
2,29
Фарнезил ацетон С
Изофитол
Генэйкозан
Трикозан
Докозан
Нонадекан
9-Октилгептадекан
69
С15Н20О
С14Н10
С18Н26О
С18Н30О
С20Н40О
C21H44
С23Н48
С22Н46
С19Н40
O
HO
С25Н52
Семь веществ: лауриновая кислота, дрименол, дибутилфталат,
метилпальмитат, пальмитиновая кислота, 1-(4-изопропилфенил)-2-метилпропил
ацетат и 6,10,14-триметил-2-пентадеканон, были обнаружены в обеих частях
этих растений (таблица 17). Дрименол, пальмитиновая кислота и 1-(4изопропилфенил)-2-метилпропил ацетат в значительном количестве найдены в
корнях, а основным составляющим масла из надземной части растения вида L.
myrianthum является 6,10,14-триметил-2-пентадеканон (28.17 %) [154].
Таблица 17 – Химический состав эфирных масел растения вида L. myrianthum,
представленный как в надземной части (н.ч.), так и корнях (к.)
№
1
2
3
Время
удерживания,
мин
н.ч.
к.
46,735 46,644
49,466 49,437
55,483 55,433
%-ное
содержание
каждого
пика
н.ч.
к.
2,56 1,37
2,02
1,06
3,34
7,61
Структура/
молекулярная
формула
Идентификация
Лауриновая кислота
1-(4изопропилфенил)-2метилпропил ацетат
O
OH
O
С15Н22О2
O
Дрименол
С15Н26О
С18Н36О
HO
4
59,903 59,729 28,17
6,54
5
63,919 63,849
1,05
6
65,194 65,103
2,25
5,86
2,19
6,10,14-Триметил-2пентадеканон
Метилпальмитат
O
66,728 66,927
3,81
8,93
O
Дибутилфталат
Пальмитиновая
кислота
С17Н34О2
O
O
O
O
O
7
С12Н24О2
С16Н22О4
С16Н32О2
O
OH
Пальмитиновая кислота и метилпальмитат содержатся в достаточном
количестве во всех растениях, что также подтверждается данными,
полученными по жирнокислотному анализу. Изофитол был обнаружен только в
L. leptophyllum и надземной части L. myrianthum, а (Е)-3-пентакозен – в
L. caspium и корнях L.gmelinii. Нонадекан был идентифицирован в надземной
части всех исследуемых видов растений [155]. Докозан и генэйкозан
идентифицировали в растениях вида L.gmelinii и надземной части
L. myrianthum, а также 1.77 % в L. leptophyllum и 3.09 % в L. caspium
соответственно. Гексадекан выделен из L. leptophyllum и L.gmelinii, а
лауриновая кислота, напротив, из L. caspium и L. myrianthum. Вещества
диизобутилфталат и 6,10,14-триметил-2-пентадеканон получены из растений
вида L. caspium, корнях растений видов L.gmelinii и L. myrianthum, а последнее
соединение к тому же и в надземной части L. myrianthum. В надземных частях
70
растений видов L.gmelinii и L. myrianthum присутствуют витиспиран, αгексилкоричный альдегид, версалид и фарнезил ацетон С.
Таким образом, впервые хромато-масс-спектрометрическим методом
исследован состав эфирных масел растений видов L. leptophyllum, L. caspium,
L.gmelinii и L. myrianthum.
Комары являются важными векторами заболеваний человека и
животноводства, будучи неприятными вредителями. В поиск экологически
безопасных и эффективных способов контроля комаров оценивалась
ларвицидная активность эфирных масел, выделенных из растений рода
Limonium. Личная защита является одним из подходов к предупреждению
комариных укусов. Предварительная оценка от воздействия сдерживания их
кормления с помощью эфирных масел была сделана на добровольцах с
растворением 0.200 мг/см2 масла на ткани [156]. Для исследования
ларвицидной активности было подготовлено семь образцов четырех
исследуемых таксонов (таблица 18). Также определение проводилось при
меньших концентрациях 61-50 и 31-25 ppm.
Таблица 18 – Предварительные данные различных экстрактов против роста
личинок первой возрастной стадии при концентрациях 125 ppm (мг/л)
Таксон
Limonium myrianthum
Limonium myrianthum
Limonium gmelinii
Limonium gmelinii
Limonium gmelinii
Limonium caspium
Limonium leptophyllum
часть растения
корни
надземная часть
корни
надземная часть
цветки
надземная часть
надземная часть
125 ppm
80
20
60
20
20
100
80
40
60
20
20
60
Как видно из данных таблицы 18 эфирные масла, полученные из
надземных частей исследуемых растений, за исключением вида L. caspium,
смогли убить 60-80 % личинок первого возраста А. Aegypti, в концентрации 125
промилле с повтором. Затем была оценена личиночная смертность при
концентрациях 62.5 и 31.25 м.д. соответственно. Основываясь на умеренную
активность, найденную в данном личиночном анализе, эфирные масла не
считались подходящими для дальнейшего тестирования. Взрослая смертность
уже не наблюдалась при указанных концентрациях, поэтому дополнительный
анализ для соединений при концентрации 3.125 промилли не осуществлялся.
Полученные результаты, установили, что исследуемые образцы, имеют
ограниченный потенциал для борьбы с комарами. Так как средняя
концентрация для отпугивания насекомых должна иметь более высокую
концентрацию, чем у эфирного масла, то в настоящее время более
целесообразно анализировать дополнительные компоненты в масле на
активность репеллента, так как они, вероятно, будут более мощными.
71
Результаты этого анализа показали, что масла были репелленты, однако только
один или более компонентов производили наблюдаемый эффект отталкивания
комаров А. Aegypti от взрослых. Однако так как масла состоят из множества
отдельных соединений, многие из которых не могут быть эффективны, любое
натуральное масло показывает отталкивание на <0.375 мг/см2. С этой точки
зрения эффективная комплексная стратегия уничтожения комаров в
значительной степени зависит от борьбы с личинками и первыми этапами
возрастных групп.
3.4 Разработка и составление схем разделения субстанций на
индивидуальные вещества. Их идентификация
Экстракты растений имели различную окраску, что связано с
индивидуальным составом БАВ, который варьируется в зависимости от многих
факторов. Прежде всего, необходимо учитывать климатические условия
произрастания, время сбора и заготовки, в виду того, что в разные периоды в
растениях накапливаются разные классы веществ. Также нужно проверять
собранные лекарственные образцы на соответствие требованиям качества
сырья, при этом немаловажным фактором является их транспортировка. И,
наконец, с химической точки зрения надлежит разработка рациональной схемы
получения субстанций в виде сухих экстрактов, так как процесс экстракции
основан на селективности используемых растворителей. Сущность этого
заключается в диффузии, которая ускоряется благодаря сродству компонентов
с органическими экстрагентами. Так, экстракт корней L. gmelinii имел красный
окрас, что свидетельствует о наличии в нем большого числа танинов и
катехинов. Экстракт же надземной части этих растений был более желтого
цвета, характерного при доминировании в нем флавоноидов. Надземная часть
L. myrianthum дала зеленый тон экстракта, что говорит о высоком содержании в
нем хлорофилла; а экстракт корней приобрел оранжевую расцветку, типичную
для полифенольных соединений различной природы.
Было проведено разделение вторичных метаболитов всех исследуемых
видов растений. Способ разделения экстракта, полученного из вида Limonium
myrianthum, представлен на рисунке 15. Так, из растения было выделено 11
веществ различной природы (рисунок 16).
Фракционирование экстракта корней привело к выделению четырех новых
соединений природного происхождения: 4,4´-(1,2-этандиил)-бис-фенол (1.2),
4,4´-(1,3-пропандиил)-бис-фенол (1.3), проптерол А (1.4) и цис-2-октил-3пентил-оксиран (1.9), наряду с пятью известными соединениями:
продельфинидин B3 (1.5) [157], галловая кислота (1.6) [158], (+) катехин (1.7)
[159], мирицетин-3-О-β-D-глюкопиранозид (1.10) [160, 161] и 3-О-β-D-(6´´галлоил)-глюкопиранозид мирицетина (1.11) [162]. Cоединения β-ситостерол-βD-глюкозид-6-монолинолениат (1.1) и тример таранинин (1.8) выделены
впервые из растений рода Limonium.
Объединенные фракции 04-05 (схема 2), полученные из ацетонового
экстракта корней, подвергали дополнительной очистке на силикагеле, элюируя
колонку
раствором
гексан-этилацетат-метанол
с
последовательным
72
увеличением полярности растворителей. При этом получили 59 фракций (А1А59). Из хроматографически одинаковых фракций А42-А45 было выделено
вещество 1.1, которое представляло собой белый аморфный порошок. В массспектре высокого разрешения вещества 1.1 имеется пик положительного
молекулярного иона [M + Na]+ с m/z 859.7243, который соответствует
молекулярной формуле C53H88O7Na (рассчитанный для C53H88O7Na с m/z
859.6428) [163]. В 13C ЯМР и DEPT спектре для вещества 1.1, записанного в
пиридине при частоте 100 МГц, наблюдаются сигналы семи метильных групп в
области от δ 11.7 до 19.7 м.д., двадцати двух метиленовых групп при δ 21.1-64.4
м.д. и двадцати СН-групп в области δ 29.2-130.2 м.д.. Четыре четвертичных
атома углерода (δ 36.8 –173.3 м.д.). Метиленовая группа δ 64.4 м.д. относится к
С-6´, так как сдвинута в слабое поле за счет соединения с гетероатомом, в
данном случае гидрокси-группой. Четвертичный углеродный атом δ 140.8 м.д.
ненасыщенной связи и δ 173.3 м.д. карбонильной группы также смещены в
слабое поле. Углерод при аномерном протоне прописывается в области δ 47.89
м.д. Кроме того, обнаружен ряд сигналов, характерных для углеводного
фрагмента соединения С-4´, С-2´, С-5´ и С-3´ при δ 71.4, 74.9 и 78.1 м.д.
соответственно. Сигнал аномерного протона резонирует в области 4.89 м.д., за
счет корреляции которого было доказано положение сахара. На основании
данных физико-химического анализа и их сравнения с литературными
источниками вещество 1.1 идентифицировано как β-D-глюкопиранозид(3β,24S)-стигмаст-5-ен-3-ил-6-(9Z,12Z,15Z)-9,12,15-октадекатриеноат:
O
O
O
HO
O
OH
OH
1.1
Данное соединение впервые выделено из растений рода Limonium.
Соединение 1.8 показало заметный ионный пик c m/z 1347, указывающий
на тримерную структуру проантоцианидина, состоящего из трех
галлокатехин/эпигаллокатехин единиц. Три четких двупротонных синглетов в
области δ 6.38-7.03м.д. 1H ЯМР-спектра, записанного в CDCl3, характерно для
пирогаллольного типа B-кольца составных единиц флаван-3-ола. Позиция
межфлавоноидной состыковки C-4/С-8 связей была признана по HMBC
корреляциям Н-4 с C-8. Гетероциклические константы КССВ (J2,3<2 Гц)
подтвердили относительную 2,3-цис конфигурацию "верхних" и "нижних"
фрагментов молекулы. Сигналы при δ 78.5 м.д. (С-2) и δ 69.9 м.д. (С-3) в 13С
ЯМР спектре свидетельствуют о том, что верхний блок флавоноида при С-4 βориентирован [164].
73
Limonium myrianthum
Корни
(300 г)
Водно-метанольный
экстракт (50/50) 1 г
Ацетоновый
экстракт 23 г
СГ
СГ
Фракция 08
2.1 г
MeOH
A1-59
B1-160
A42-45
69мг
LH-20
H2O-MeOH-Ac
1
2
СГ
Фракция 2
7.3 г
СГ
4
MeOH
Этилацетатный
экстракт 2 г
СГ
Hex-СHCl3-MeOH
F13
190 мг
MeOH
LH-20
3
G1-45
H1-91
G4
18 мг
H35-36
24 мг
9
10
F16-9+F110-12
227+111 мг
ТФЭ, СГ/ОФ-С8 H2O-MeOH
F31-458
D12-D13
10 мг
F113-19+F120-24
218+165 мг
MeOH LH-20 MeOH
F21-676
F2279-305
1 мг
5
F366-74
47 мг
F41-236
F4194-224
6 мг
F41-6+F450-63
173+15 мг
LH-20
6
7
8
MeOH
F51-130
F586-88
2 мг
Рисунок 15 – Схема разделения вторичных метаболитов растения вида L. myrianthum
74
EtOAc-MeOH
EtOAc-MeOH
F11-101
D1-33
D11
5 мг
EtOAc-MeOH
Фракции
1-3
E26-E28
21 мг
C1-30
66 мг
B74-85
32 мг
Гексановый
экстракт 2 г
C1-140
LH-20
ТФЭ, СГ/ОФ-С8
VLC
E1-E80
Фракция 07
3.9 г
Hex-EtOАc-MeOH
LH-20
Метанольный
экстракт 72 г
MeOH
LH-20
CH2Cl2-MeOH
Фракции
01-014
Фракция 04-05
1.2 г
Н.ч.
(180
11
O
OH
O
O
O
HO
HO
OH
1.2
OH
HO
OH
1.3
1.1
OH
OH
HO
O
OH
OH
HO
OH
OH
OH
HO
1.4
OH
O
O
OH
HO
HO
OH
HO
HO
OH
OH
OH
HO
1.6
1.5
O
OH
OH
HO
OH
HO
O
HO
OH
OH
OH
O
HO
OH
OH
OH
OH
O
HO
1.7
OH
OH
O
O
OH
HO
OH
O
HO
OH
OH
1.9
1.8
OH
OH
OH
HO
OH
O
HO
O
OH
OH
O
OH
O
O
OH
OH
HO
O
OH
O
OH
O
O
OH
OH
HO
OH
O
1.10
OH
C
OH
1.11
Рисунок 16 – Вещества, выделенные из растений вида L. myrianthum
Также карбонильная группа фрагмента галловой кислоты была
идентифицирована в области 167.6 м.д. Cравнением полученных физикохимических данных с литературными соединение 1.8 было идентифицировано
как эпигаллокатехин-(4β→8)-эпигаллокатехин-3-О-галлат-эпигаллокатехин:
75
OH
HO
O
OH
HO
OH
HO
OH
OH
O
HO
OH
OH
O
HO
OH
OH
O
O
OH
HO
OH
HO
OH
OH
1.8
Оно было впервые обнаружено в растениях рода Limonium Mill.
Соединение 1.2 было получено в виде желтого масла. HRESIMS спектр
данного вещества показал пик молекулярного иона при [M + Na]+ с m/z
237.0895, что соответствует молекулярной формуле C14H14O2. В ИК-спектре
соединения (приложение К, рисунок К1) присутствуют полосы поглощения при
3192.90, 1599.39, 1514.27, 1439.10, 1197.63, 823.38 и 762.28 см-1, характерные
наличию СН2- и ОН-групп, валентных колебаний ароматического кольца,
колебаний с участием связи С-О и деформационных колебаний С-Н. Спектр 1HЯМР указывает на присутствие двух ароматических сигналов протонов δ 7,01
м.д. (4H, д, J = 8 Гц) и 6,69 м.д. (4H, д, J = 8 Гц), и один сигнал резонирует как
триплет в δ 2,71 м.д. (4H, т) для двух метиленовых групп (таблица 19).
Таблица 19 – 400 МГц 1H-ЯМР и 100 МГц 13C-ЯМР данные веществ 1.2 и 1.3*
№
1.2 (DMSO-d6)
1.3 (CD3OD)
δH (мультп.; J в Гц)
δc
δH (мультп.; J в Гц)
δc
1
127.2
128.4
2 7.01 (4H, д, J=8)
129.7
7.03 (4H, д, J=8)
130.7
3 6.69 (4H, д, J=8)
115.4
6.72 (4H, д, J=8)
116.6
4
156.2
157.6
5 6.69 (4H, д, J=8)
115.4
6.72 (4H, д, J=8)
116.6
6 7.01 (4H, д, J=8)
129.7
7.03 (4H, д, J=8)
130.7
7 2.71 (4H, т)
32.3
2.79 (4H, т)
33.7
8 2.71 (4H, т)
32.3
3.07 (2H, м)
42.3
9
2.79 (4H, т)
33.7
1´
127.2
128.4
2´ 7.01 (4H, д, J=8)
129.7
7.03 (4H, д, J=8)
130.7
3´ 6.69 (4H, д, J=8)
115.4
6.72 (4H, д, J=8)
116.6
4´
156.2
157.6
5´ 6.69 (4H, д, J=8)
115.4
6.72 (4H, д, J=8)
116.6
6´ 7.01 (4H, д, J=8)
129.7
7.03 (4H, д, J=8)
130.7
*
δH и δC значения записаны с использованием сигналов растворителей
(DMSO-d6: δH 2.50/δC 39.5 для 1.2; CD3OD: δH 3.31/δC 49.0 для 1.3)
76
Эти данные рассчитаны для двенадцати протонов, однако только пять
углеродных сигналов появились в 13С ЯМР спектре, предполагая, что молекула
вещества 1.2 симметрична с двумя одинаковыми бензольными кольцами. Из
HMBC спектра (рисунок 17): сигнал протона, резонирующего при δ 7,01 м.д.
(4H, д, J = 8 Гц), показал корреляцию с сигналами метиленового атома углерода
(δ 32,3 м.д.) и C-4 (δ 156,2 м.д.), а также, корреляцию между сигналом при δ
6,69 м.д. (4H, д, J = 8 Гц) и сигналами δ 127,2 м.д. (С-1), δ 115,4 м.д. (С-5). На
основании вышеописанных данных структура соединения 1.2 была определена
как 4,4´-(1,2-этандиил)-бис-фенол.
OH
HO
1.2
Cоединения 1.2 и 1.3 являются новыми веществами природного
происхождения, которые ранее были получены лишь синтетическим путем
[165, 166]. Структуры подтверждены значениями сигналов, полученных из
двумерных экспериментов (1H-1H COSY, HMQC и HMBC).
OH
HO
HO
1.2
OH
1.3
HO
OH
OH
1.4
O
1.9
Рисунок 17 – Основные HMBC корреляции новых природных соединений
Для соединения 1.3 молекулярная формула C15H16O2 подтверждена пиком
молекулярного иона [М + Н - Н2О]+ с m/z 211.1153 в его HRESIMS спектре. Его
спектральные характеристики позволили предположить, что 1.3 имеет
структуру, аналогичную соединению 1.2. 1H ЯМР спектр показал наличие двух
ароматических колец из 1,4-замещенных ароматических сигналов протонов при
δ 6,69 м.д. (4H, д, J = 8 Гц) и 7,01 м.д. (4H, д, J = 8 Гц), однако соединение 1.3
показало два дополнительных сигнала протонов при δ 2,79 м.д. (4H, т) и 3,07
м.д. (2H, м). HMBC корреляции (рисунок 17) позволили определить положения
Н-2 и Н-3 протонов при δ 7,03 м.д. (4H, д, J = 8 Гц) и δ 6,72 м.д. (4H, д, J = 8 Гц)
соответственно. Протон во 2-м положении показал сильную корреляцию с
углеродами при δ 130,7 м.д. (С-6) и δ 157,6 м.д. (С-4), а в 3-м – при δ 128,4 м.д.
(С-1), δ 157,6 м.д. (С-4) и δ 116,6 м.д. (С-5) (таблица 19). На основании этих
данных структура 1.3 была определена как 4,4´-(1,3-пропандиил)-бис-фенол:
77
HO
1.3
OH
Cтруктура соединения 1.4 показала пик молекулярного иона при [М]+ 244,
соответствующего молекулярной формуле C15H16O3 и была установлена как
1,3-бис-(4-гидроксифенил)-пропан-2-ол. В УФ-спектре соединения максимум
поглощения в метаноле наблюдается при λ 279 (приложение К, рисунок К2),
которое сопоставимо с пара-С-алкилированным фенолом. Пики при δ 3.30 м.д.
(1Н) и 8.47 м.д. (2H) (уш. с) в 1H ЯМР спектре и полоса поглощение при νmax
3600-3200 см-1 (широкая) в ИК-спектре соединения 1.4 позволили
предположить о наличии одной спиртовой и двух фенольных гидроксильных
групп. Его 1H ЯМР-спектр показал квартет при δ 6.80-7.20 м.д., что составляет
четыре пары ароматических протонов, сравнимых с пара-крезолом, так Н-2´(Н6´) и Н-3´(Н-5´) проявились при 7.06 и 7.11 м.д. соответственно. Cигналы при
δ 2.75 м.д. (д, J = 6 Гц, 4Н) принадлежат двум наборам метиленовых протонов в
положениях 1 и 3, а сигнал при δ 3.40 м.д. (м, 1H, Н-2) протону СН-группы
вторичного спирта. 13С ЯМР-спектр соединения 1.4 показал только шесть
резонансных пиков при δ 151.86, 133.17, 120.34, 129.00, 66.43 и 34.70 м.д. для
пятнадцати атомов углерода, соответствующих его молекулярной формуле и
представляющих собой два пара-гидроксибензольных фрагмента, которые
присоединены к вторичному атому углерода, несущего гидроксильную группу.
Вследствие близкого сходства во фрагментах структуры сигналы атомов
углерода С-2´, С-2´´, С-6´, C-6´´ (δ 129.00 м.д., дд, J = 4,88 и 7.30 Гц), С-3´, C3´´, C-5´, С-5´´ (δ 120.34м.д., дд, J = 4,88 Гц), С-4´, C-4´´ (δ 151,86 м.д., т, J = 8,55
Гц) и С-1´, C-1´´ (δ 133.17 м.д., т, J = 7.32 и 3.66 Гц) перекрываются в четыре
сигнала и хорошо сопоставимы с соответствующими сигналами атомов
углерода п-крезола. Сигналы при δ 34.70 м.д. (т) и 66.43 м.д. (д, J = 4,88 Гц)
были присвоены C-l и C-3 (метиленовым углеродам) и фрагменту >СНОН
соответственно. Мультиплетность, КССВ и сигналы, наблюдаемые в
двумерных спектрах HMBC, полностью подтверждают структуру соединения
1.4 (рисунок 17), идентифицированного как 1,3-бис-(4-гидроксифенил)-пропан2-ол:
OH
HO
OH
1.4
В масс-спектре (EI, 70 эВ) проптерола наблюдались осколочные ионы с
m/z 107 (100 %) и 137 (50 %), принадлежащие соответственно, фрагментам
СН2=С6Н4=ОН+ и Ar-CH2-CH=ОН+, как и ожидалось. 1,3-диарилпропан-2-олы,
хотя и представлены в растительных объектах, они принадлежат к редкому
классу флавоноидов. Проптерол А 1.4 является уникальным соединением
наряду с также выделенными веществами 1.2 и 1.3 в представлении
симметричного шаблона замещения в ароматических кольцах вторичных
метаболитов данного вида и выявлен среди простых флавоноидов,
встречающихся в природе.
78
Соединение 1.9 получено в виде белой аморфной маслянистой субстанции.
В HRESIMS спектре обнаружен пик молекулярного иона [2М + Na]+ с m/z
475.3557, что соответствует молярной формуле C15H30O. В масс-спектре
вещества имеется множество фрагментов, соответствующих потере метильной
139
-14
-14
125
111
-14
97
-CH2
-14
83
-14
-14
69
-CH2
55
группы:
. Также
имеется характеристичный пик с m/z 199, свидетельствующий о потере
карбонильной группы [М - 28]+. Время удерживания вещества 1.9 в ГХ/МС
анализе составляет 25.552 мин. В 13C ЯМР-спектре этого вещества, записанного
в пиридине при 125 МГц (DEPT-эксперимент), было обнаружено одиннадцать
сигналов метиленовых групп в области δ 23.5-39.1 м.д. Две группы –СН при
атоме кислорода сдвинуты в слабой поле δ 71.4 м.д. Также имеется два сигнала
метильной группы при δ 14.5 и δ 18.8 м.д. Сигнал протона при Н-7 коррелирует
с атомом углерода при δ 39.1 м.д. (С-5). Одна метильная группа имеет HMBCкорреляцию с сигналами С-2 и С-3 при δ 23.4 и δ 26.9 м.д. соответственно.
Также обнаружена корреляция между атомами при С-5 и С-3. Спектральные
данные позволили идентифицировать 1.9 как цис-2-октил-3-пентил-оксиран:
-CH2
-CH2
-CH2
-CH2
O
1.9
Хотя ранее сообщалось о веществах 1.4 и 1.9 в качестве синтетических
соединений [167, 168], из природного источника они были выделены впервые.
Хроматографическое разделение растений вида Limonium gmelinii
проводилось согласно этапам, описанным на рисунке 18. Выделено 11
индивидуальных
веществ,
представленных
на
рисунке
19
и
идентифицированных как: (2R,3R)-3,5,7,3´,4´-пентагидроксифлаванонол-3-O(3´´-галлоил)-α-L-рамнозид (2.1), дигидромирицетин-3-O-рамнозид (2.2),
мирицетин-3-галлат (2.3), 3´,4´,5,5´,7-пентагидроксифлаванон (2.4), кемпферол3-галлат (2.5), кверцетин-3-α-L-рамнозид (2.6) [169], 3-O-метилмирицетин (2.7)
[170], 3-О-β-D-(4´´-галлоил)-рамнозид мирицетина (2.8) [171], 3-О-β-D-(3´´галлоил)-глюкопиранозид мирицетина (2.9) [172], 5-метоксикверцетин (2.10)
[173], и 3-О-β-D-(6´´-галлоил)-глюкопиранозид мирицетина (2.11) [162], причем
соединения 2.1-2.5 выделены впервые из растений рода Limonium.
Экспериментальные данные, полученные в процессе спектрального анализа,
приведены в таблице 20.
Этанольный экстракт, извлеченный из надземной части Limonium caspium,
подвергали хроматографическому разделению на силикагеле с получением
серии
производных
мирицетина:
дигидромирицетин
(3.4)
[174],
дигидромирицетин-3`-О-сульфат (3.2) [175], мирицетин-3`-О-сульфат (3.9)
[175], 5-метилмирицетин (3.5), мирицетин (3.7) [176], мирицетин-3-О-βглюкозид (3.10) [177], а также соединений флоридзин (3.11) [178] и тирамин
(3.6) [179], выделенных впервые из рода Limonium.
79
Limonium gmelinii
Корни
(127 г)
Н.ч.
(58 г)
Метанольный
экстракт 20 г
ЖЖЭ
Метанольный
экстракт 20 г
ЖЖЭ
H2O-EtOAc-BuOH
Этилацетатный
экстракт 1 г
Этилацетатный
экстракт 1 г
ПА
ПА
H2O-MeOH-Ac-EtOH
1
2
CHCl3-EtOH-Ac-H2O
FA1-702
FR1-465
FR1
261 мг
H2O-EtOAc-BuOH
FR2-46
44 мг
FR47-117
45 мг
3
4
FR47-117/1
64 мг
5
FA109-124
26 мг
FA133-152
72 мг
6
7
FA169-224
38 мг
8
FA225-292
18 мг
9
10
Рисунок 18 – Схема разделения вторичных метаболитов растения вида L. gmelinii
80
FA365-435
23 мг
11
OH
OH
OH
OH
OH
OH
HO
O
HO
O
HO
OH
O
OH
O
O
O
O
OH
OH
O
O
O
OH
OH
O
OH
O
C
OH
O
OH
C
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
2.1
2.3
2.2
OH
OH
OH
HO
O
OH
HO
OH
O
O
HO
O
O
OH
OH
O
OH
O
O
OH
C
OH
O
OH
O
OH
OH
2.4
2.5
OH
OH
2.6
OH
OH
OH
OH
HO
O
OH
HO
OH
O
OH
OH
O
OH
O
O
HO
OH
2.7
O
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
HO
O
O
O
O
OH
O
C
O
C
HOH2C
OH
OH
O
OH
O
OH
HO
O
OH
OH
OH
2.10
2.8
2.9
OH
OH
HO
O
OH
OH
HO
O
OH
OH
O
O
O
HO
C
OH
C
H2
O
OH
2.11
Рисунок 19 – Вещества, выделенные из растений вида L. gmelinii
81
Таблица 20 – Спектральные данные метаболитов таксона L.gmelinii
1
№
H ЯМР при 400 МГц ( J в Гц)
2.1 δм.д: 5.13 (1H, д, J = 11.1, H-2), 4.61
(1H, д, J = 11.1, H-3), 5.94 (1H, д, J
= 2.0, H-6), 5.92 (1H, д, J = 2.0, H8), 6.99 (1H, д, J = 2.0, H-2´), 6.81
(1Н, д, J = 8.2, H-5´), 6.89 (1Н, дд,
J = 8.2, 2.0, H-6´), рамноза: 4.02
(1H, д, J = 2.3, H-l´´), 4.49 (1H, м,
H-2´´), 5.15 (1H, д, J = 10, H-3´´),
3.66 (1H, т, J = 10, H-4´´), 3.80 (1H,
м, H-5´´), 1.25 (3H, д, J = 5.1, H6´´), 7.13 (2H, с, H-2´´´, H-6´´´)
2.2 δм.д: рамноза: 1.35 (3H, д, J = 6,
СН3), 3.33-3.68 (4H, м), 3.71 (1H,
д, J = 1.5, H-l´´), 4.65 (1 H, д, J =
11, H-3), 5.31 (1H, д, H-2), 6.05
(2H, с, H-6, H-8), 6.65 (2H, с, H-2´,
H-6´)
2.3 δм.д: 6.19 (1H, д, J = 1.8, H-6), 6.38
(1H, д, J = 1.8, H-8), 7.32 (2H, c,
H-2´, H-6´), 6.94 (2H, с, H-2´´, H6´´)
2.4 δм.д: 5.45 (1H, дд, J = 2.5, H-2), 2.82
(1H, дд, J = 2.5, H-3α), 3.08 (1H,
дд, H-3β), 6.40 (1H, д, J = 2.0, H-6),
6.31 (1H, д, J = 2.0, H-8), 6.95 (2H,
д, J = 2.0, H-2´, H-6´)
2.5 δм.д: 6.18 (1H, с, H-6), 6.42 (1H, с,
H-8), 6.92 (2H, д, J = 8.7, H-3´,5´),
8.04 (2H, д, J = 8.7, H-2´, 6´), 12.46
(1H, с, 5-OH), 10.77 (1H, с, 7-OH),
9.37 (1H, с, 4´-OH). 7.20 (2H, Н2´´, H-6´´)
C ЯМР при 100 МГц
δм.д: 84.1 (C-2), 79.1 (C-3), 196.0 (C-4),
165.7 (C-5), 97.6 (C-6), 168.8 (C-7), 96.5
(C-8), 164.3 (C-9), 102.7 (C-10), 129.4
(C-1´), 116.5 (C-2´), 146.5 (C-3´), 147.7
(C-4´), 115.6 (C-5´), 120.7 (C-6´), 102.4
(C-1´´), 70.9 (C-2´´), 75.6 (C-3´´), 71.5
(C-4´´), 69.9 (C-5´´), 18.1 (C-6´´), 121.9
(C-1´´´), 110.6 (C-2´´´, C-6´´´), 146.5
(C-3´´´, C-5´´´), 139.9 (C-4´´´), 168.3
(-CОO)
13
δм.д: 83.9 (C-2), 72.3 (C-3), 198.5 (C-4),
163.3 (C-5), 95.7 (C-6), 167.6 (C-7), 96.7
(C-8), 164.2 (C-9), 101.2 (C-10), 127.9
(C-1´), 107.7 (C-2´, C-6´), 146.5 (C-3´,
C-5´), 134.2 (C-4´), 101.8 (C-1´´), 70.6
(C-2´´), 70.3 (C-3´´), 71.2 (C-4´´), 70.0
(C-5´´), 17.5 (C-6´´)
δм.д: 156.4 (C-2), 134.0 (C-3), 177.6 (C4), 161.3 (C-5), 98.8 (C-6), 164.4 (C-7),
93.6 (C-8), 156.5 (C-9), 103.9 (C-10),
119.7 (C-1´), 108.6 (C-2´, C-6´), 145.5
(C-3´, C-5´), 136.9 (C-4´), 120.7 (C-1´´),
111.9 (C-2´´, C-6´´), 145.6 (C-3´´, C-5´´),
138.1 (C-4´´), 167.7 (-CОO)
δм.д: 79.2 (C-2), 43.0 (C-3), 197.8 (C-4),
164.9 (C-5), 98.0 (C-6), 167.2 (C-7), 95.5
(C-8), 162.9 (C-9), 105.2 (C-10), 131.4
(C-1´), 108.9 (C-2´, C-6´), 141.9 (C-3´,
C-5´), 137.8 (C-4´)
δм.д: 159.1 (C-2), 133.1 (C-3), 179.8 (C4), 161.2 (C-5), 99.9 (C-6), 165.4 (C-7),
94.8 (C-8), 156.1 (C-9), 105.4 (C-10),
120.7 (C-1´), 132.3 (C-2´, C-6´), 115.1
(C-3´, C-5´), 161.5 (C-4´), 120.3 (C-1´´),
110.1 (C-2´´, C-6´´), 145.5 (C-3´´, C-5´´),
138.7 (C-4´´), 164.5 (-СОО)
Всего было выделено 11 соединений (рисунок 20), из них восемь ранее
описанных веществ, включая два – 3.9 и 3.2 впервые полученных в кислотной
форме; три новых, ранее не описанных соединения – (2S,3S)-582
метилдигидромирицетин (3.3), (2S,3S)-5-метилдигидромирицетин-3`-О-сульфат
(3.1) и 3-метил-бут-3-ен-1-ил-4-О-α-L-рамнопиранозил-β-D-глюкопиранозид
(3.8). Разделение индивидуальных веществ осуществлялось в соответствии со
схемой на рисунке 21.
HO
O
O
OH
O
OH
OH
( S)
OH
OH
OH
HO
OH
OSO3H
OSO3H
( S)
( S)
OH
OH
OH
OH
O
O
O
O
3.3
OH
OH
OH
OH
HO
HO
O
O
OH
OH
NH2
OH
OH
O
O
OH
O
3.6
3.5
3.4
OH
OH
OH
HO
O
3.2
3.1
HO
OH
OSO3H
OH
HO
1`` O
HO
H
O
HOH2C
O
OH
OH
1
O
HO
O
OH
1` O
OH
OH
O
OH
OH
( S)
OH
3.8
3.7
O
3.9
OH
OH
OH
OH
HO
HO
O
OH
O
OH
O
OH
O
HO
O
OH
OH
O
HOH2C
OH
O
OH
OH
3.10
3.11
Рисунок 20 – Вещества, выделенные из растений вида L. caspium
83
Limonium caspium (н.ч.)
Этанольный экстракт (6.8 г)
СГ/ОФ-С18
H2O-MeOH
F01-07
СГ/ОФ-С18
H2O-MeOH
F1-9
LH-20
MeOH
1
7G
17 мг
MeOH
LH-20
LH-20
1В-28В
1G-10G
4G
22 мг
F4 (254 мг)
F3 (399 мг)
F2 (88 мг)
F5 (106 мг)
MeOH
9G
12 мг
10B
34 мг
11B
103 мг
13B
33 мг
2
3
4
5
5Y+6Y
42+23 мг
1R-3R
LH-20
MeOH
LH-20
1Y-18Y
F7 (141 мг)
1Y2-14Y2
1-50
16Y+17Y
50+5 мг
10-11
15 мг
27-28
12 мг
30-35
21 мг
3Y2
25 мг
7
8
9
5
11
2R
33 мг
6
Рисунок 21 – Схема разделения вторичных метаболитов растения вида L. caspium
84
MeOH
Для данного вида растения это первое фитохимическое исследование
[180]. Структуры всех известных выделенных соединений были подтверждены
сравнением полученных данных физико-химического анализа (1H ЯМР, ЯМР
13
С, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC, НМВС), а также HRESIMS с опубликованными
характеристиками.
Соединение 3.3 было выделено в виде желтоватого аморфного вещества.
1
H ЯМР (рисунок 22) показал синглетный сигнал трех протонов при δ 3,75 м.д.,
что характерно наличию одной метоксигруппы и двух протонов, резонируемых
при δ 6,38 м.д. (2H, д, J = 2,16 Гц), связанных с B-кольцом (Н-2` и Н-6`).
Рисунок 22 – 1Н ЯМР-спектр соединения 3.3
Скелет дигидромирицетина прослеживается из шаблона КССВ С-3 и С-2,
которые резонируют при δ 4,16 м.д. (1Н, д, J = 10,6) и δ 4,81 м.д. (1Н, д, J =
10,45) соответственно. Анализ спектра 13С ЯМР и DEPT экспериментов
(рисунки 23 и 24) подтвердил фрагмент дигидромирицетина с наличием
сигнала кетонного карбонила при δ 189,8 м.д. и типичного незамещенного Акольца с сигналами при δ 93,3 и 95,5 м.д. для C-8 и C-6 соответственно. 1H ЯМР
и 13С ЯМР спектроскопические данные вещества 3.3 оказались аналогичны
дигидромирицетину (3.4) [174] за исключением присутствия в 3.3
метоксигруппы (таблица 21).
85
Рисунок 23 – 13С ЯМР-спектр соединения 3.3
Рисунок 24 – DEPT-спектр соединения 3.3
86
Характер и природа этого дигидромирицетина были выявлены методами
двумерной ЯМР-спектроскопии (рисунок 25).
Рисунок 25 – HMQC-спектр соединения 3.3
Анализ HMBC спектров (рисунок 26) показал, что протон при δ 4,81 м.д.
(1Н, д, J = 10,45 Гц, Н-2) имеет сильную корреляцию с углеродом при δ 106,9
м.д. (С-2`) и слабую с атомом углерода при δ 127,5 м.д. (С -1`); также
корреляцию между сигналом при δ 6,38 м.д. (2H, с) и сигналами при δ 82,7 м.д.
(С-2), δ 145,8 м.д. (С-3`) и δ 133,4 м.д. (С-4`) (таблица 21). Положение
метоксигруппы установлено по сильной корреляции сигнала при δ 3,75 м.д. с
углеродом C-5 резонирующим в области δ 162,2 м.д., что с учетом
опубликованных данных [174]. Все представленные спектральные данные
позволило идентифицировать соединение (3.3) как 2-(3,4,5-тригидроксифенил)2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-5-метокси-4H-1-бензопиран-4-он:
OH
OH
O
OH
OH
( S)
( S)
OH
O
O
3.3
87
Рисунок 26 – HMBC-спектр соединения 3.3
Таблица 21 – 1H и 13C ЯМР данные для соединений 3.3 и 3.4 (в ДМСО)
№
3.3
δH (мультп.; J в Гц)a
4.81 (д, 10.45)
4.16 (д, 10.6)
3.4
δH (мультп.; J в Гц)a
4.91 (д, 10.8)
4.42 (д 10.72)
δc
δcb
2
82.7
83.7
3
72.9
72.1
4
189.8
198.0
5
162.2
162.9
6
5.93 (с)
95.5
5.91 (д, 1.8)
96.4
7
164.8
167.2
8
6.08 (с)
93.3
5.86 (д, 1.76)
95.4
9
163.7
163.8
10
102.6
100.9
1´
127.5
127.7
2´
6.38 (с)
106.9
6.40 (с)
107.2
3´
145.8
146.1
4´
133.4
133.8
5´
145.8
146.1
6´
6.38 (с)
106.9
6.38 (с)
107.2
-CH3
3.75 (с)
55.8
a1
Примечание – H ЯМР снят при 400 МГц, b 13C ЯМР – 100 МГц [174]
b
88
Соединение 3.3 имеет пики молекулярных ионов [M + H]+ и [М - Н]- в
HRESIMS при m/z 335.0750 и 333.0393 соответственно, что согласуется с
молекулярной формулой C16H14O8. Предварительно оба 2R,3S- и 2S,3Rэнантиомеры были устранены на основе КССВ сигналов протонов для H-2 и Н3. В 1Н ЯМР спектре 3.3 оба этих протонных сигнала прописываются в виде
дуплетных пиков: 4,81 (1H, J = 10,45 Гц, 2-H), 4,16 (1H, J = 10,6 Гц, 3-Н), тогда
как в его 2R,3S-изомере они оба представлены одиночными пиками [181]. Это
свидетельствует, что протоны в положениях 2-Н и 3-Н могут быть либо 2R,3R
либо 2S,3S энантиомерами [181]. Однако для окончательного подтверждения
абсолютной конфигурации стереогенных центров в положениях С-2 и С-3 был
записан КД-спектр для вещества 3.3. Последние достижения в расчете
электронного кругового дихроизма значительно повысили ценность в
определении абсолютной конфигурации хиральных молекул. Несколько
квантово-химических методов, включая многофункциональную теорию
зависимости времени от плотности, могут быть использованы для расчета и
предсказания КД хиральных молекул. В нашем исследовании, чтобы
однозначно установить абсолютные конфигурации веществ и получить
понимание, как вращение ахирального С-кольца влияет на наблюдаемый
экспериментальный КД-спектр, для структур с двумя стереогенными центрами
и хиральной осью был выбран именно этот метод для теоретического расчета.
Результаты
позоляют
обеспечить
новые
идеи
в
интерпретации
экспериментально наблюдаемых КД-спектров этого класса соединений.
Полученные экспериментальные данные сравнивали с расчетными значениями
для 2R,3R- и 2S,3S-энантиомеров (рисунки 27 и 28). Все расчеты были
выполнены при 298 К в программе Gaussian03. Полуэмпирический метод
применяли для сканирования поверхностной потенциальной энергии
выявленных конформеров. Были получены полные энергии отдельных
конформеров и сделан вибрационный анализ, чтобы подтвердить их
энергетические минимумы. Энергии возбуждения измеряли в нм, а их силы
вращения в виде скорости и длины диполя были смоделированы в кривой КДспектра с помощью функции Гаусса. Как видно из рисунка 27, теоретически
рассчитанного для 2R,3R-энантиомера, два пика положительного эффекта
Коттона прописываются при 183 нм и 197 нм, а пики отрицательного эффекта
Коттона – при 217 и 245 нм. На рисунке 28 для 2S,3S-энантиомера наблюдается
один пик положительного эффекта Коттона, прописанного при 197 нм, и
отрицательного эффекта Коттона при 217. Аналогично 2R,3S-энантиомер
(рисунок 29) дает отрицательный эффект Коттона при 217 нм и положительный
пик при 197 нм, в то время как 2S,3R-энантиомер (рисунок 30) дает
противоположные эффекты Коттона. Однако их мы не брали в расчет из-за
выявленных ранее эмпирических правил КД для хиральных атомов простых
структур флавоноидов. Основное значение для расчетов КД-спектров является
использование конформеров, которые лучше всего отражают их
предпочтительные конфигурации в растворе, например, для сложных
природных соединений. Проведенные нами исследования указывают, что
вращательные ограничения существенно влияют на КД флаванонов, как
89
показали существенные различия в расчетах КД-спектров двух ротамерных
серий. Эти данные способствуют будущему изучению абсолютной
конфигурации более сложных структур флавоноидов с вращательно
ограниченными хиральными структурными фрагментами.
Рисунок 27 – Расчетный КД-спектр 2R, 3R-энантиомера
Рисунок 28 – Расчетный КД-спектр 2S, 3S-энантиомера
90
Рисунок 29 – Расчетный КД-спектр 2R, 3S-энантиомера
Рисунок 30 – Расчетный КД-спектр 2S, 3R-энантиомера
Экспериментальный спектр КД показал положительный эффект Коттона
при 197 нм и отрицательный эффект Коттона при 217 нм (рисунок 31).
91
Рисунок 31 – Экспериментальный (черный для 3.3 и зеленый для 3.1) спектр по
сравнению с расчетным (красный) КД-спектром 2S, 3S-энантиомера
B3LYP/6-31G смоделированный КД-спектр [182] для 2S, 3S-энантиомера,
полученного из 40 возбужденных состояний, использующих гауссовые формы
полос для пиков, дал пики при 197 и 217 нм. Рассчитанный КД 2S,3Sэнантиомера показал отличное сходство с экспериментальными данными.
Соединение 3.3 является новым ранее не описанным в литературе метиловым
эфиром дигидромирицетина-5, и назван (2S,3S)-5-метилампелопсин.
Соединение 3.1 получили в виде бледно-желтого аморфного порошка. При
проявлении соединения с 10% H2SO4 и нагревании на ТСХ проявилось
желтовато-розовое окрашивание. 1H ЯМР спектр (рисунок 32) вещества показал
два дублетных протона в мета-положении при δ 6,10 (J = 1,96 Гц) и 5,98
(J = 1,64 Гц) м.д., соответствующих C-6 и C-8 протонам флавоноидного скелета.
Протоны при δ 7,05 (1Н, д, J = 1,8 Гц, H-1´) и 6,87 (1H, д, J = 1,8 Гц, H-6´)
показали дублеты в мета-положениях, принадлежащих флавоноидному Bкольцу, которое обладает несимметричной 3´,4´,5´-тризамещенной структурой
(таблица 22). 13С ЯМР спектр соединения 3.1 показал 15 углеродных сигналов
(рисунок 33), в том числе δ 82,9 м.д. (С-2), 72,9 м.д. (С-3), и 191,4 м.д. (С-4),
которые являются характерными во флаванон-3-оловом фрагменте.
Дигидромирицетин (3.4) показал точное соответствие с химическими сдвигами
углеродных атомов 3.1 (таблица 22) за исключением некоторых в В-кольце
δ 128,0 (C-1´), 113,3 (C-2´), 146,3 (C-3´), 138,0 (C-4´), 140,2 (C-5´), 112,0 (C-6´) и
С-5 в А-кольце (рисунок 34).
92
Рисунок 32 – 1Н ЯМР-спектр соединения 3.1
Рисунок 33 – 13С ЯМР-спектр соединения 3.1
93
Таблица 22 – 1H и 13C ЯМР данные для соединений 3.1, 3.2 и 3.9 (в CD3OD)
№
3.9
δH (мультп.;
J в Гц)a
δcb
3.2
δH (мультп.;
J в Гц)a
4.91 (д, 11.56)
4.53 (д, 11.64)
δcb
3.1
δH (мультп.;
J в Гц)a
4.86 (д, 11.68)
4.38 (д, 11.72)
δcb
2
147.1
83.5
82.9
3
137.6
72.3
72.9
4
177.3
196.9
191.4
5
162.3
163.9
164.6
6
6.19 (с)
99.3
5.93 (д, 2.12)
96.0
6.10 (д, 1.96)
95.7
7
165.6
167.3
165.9
8
6.42 (с)
94.5
5.90 (d, 2.2)
94.9
5.98 (д, 1.64)
93.1
9
158.1
163.0
162.7
10
104.5
100.5
102.3
1´
123.3
127.8
128.0
2´
7.80 (с)
115.3
7.04 (д, 2.16)
113.3
7.05 (д, 1.8)
113.3
3´
147.6
146.3
146.3
4´
141.1
138.0
138.0
5´
141.6
140.2
140.2
6´
7.68 (с)
113.5
6.86 (д, 2.16)
112.1
6.87 (д, 1.56)
112.0
-CH3
3.83 (с)
55.0
a1
b 13
Примечание – H ЯМР записан при 400 МГц, C ЯМР при 100 МГц
Рисунок 34 – DEPT-спектр соединения 3.1
94
Положения атомов в структуре вещества 3.1 было подтверждено
корреляциями в экспериментах двумерной ЯМР-спектроскопии HMQC
(рисунок 35) и HMBC (рисунок 36).
Рисунок 35 – HMQC-спектр соединения 3.1
Рисунок 36 – HMBC-спектр соединения 3.1
95
Соединение 3.1 имеет пик иона [M + H]- в HRESIMS при m/z 414.02053, в
соответствии с молекулярной формулой C16H14O11S. Таким образом, на
основании комплекса физико-химических констант структура 3.1 была
идентифицирована как 3´-О-сульфат-метилдигидромирицетин. Присутствие
многих сульфатных форм флавоноидов известно в растениях [183]. Эффект Oсульфата в качестве электроноакцепторной группы наблюдался в спектре 13С
ЯМР [183]. Атомы углерода, находящиеся в орто-положении к сульфатной
группе, показывают сдвиг в слабое поле на 5.1-6.9 м.д., что является
результатом пониженной электронной плотности. Пик атома углерода,
связанного с сульфо-группой, сдвинут на 3,7 м.д. в сильное поле из-за
повышенной электронной плотности. Полученные данные хорошо
коррелируют с химическими сдвигами, рассчитанными ранее для кверцетин-3´сульфата и флороглюцин-сульфата [184].
Экспериментальный КД-спектр вещества 3.1 показал пик отрицательного
эффекта Коттона при 217 нм и положительного эффекта Коттона при 197 нм
(рисунок 31), что аналогично соединению 3.3. Основываясь на вышеописанные
спектральные данные, структура 3.1 была идентифицирована как (2S,3S)-3´-Oсульфат-5-О-метилдигидромирицетин:
OSO3H
OH
HO
O
OH
( S)
( S)
OH
O
O
3.1
Два других сульфатных флавоноида – 3.2 и 3.9 были впервые выделены в
кислотной форме, и идентифицированы методами спектроскопического анализа
и сравнения полученных данных с литературными [173]. Несмотря на то, что
сульфопроизводные соединения содержатся повсеместно в высших растениях,
не ясно, какое физиологическое значение эти соединения имеют в природных
источниках. Возможно, они играют важную роль в нейтрализации реактивных
гидроксильных групп. Кроме того, поскольку эти соединения накапливаются в
растениях, которые зачастую растут в засоленных условиях, возможно, что они
играют важную роль в секвестрации (отторжении нежизнеспособных тканей)
сульфат-ионов [185]. Лигнан, (+)-изоларисирезинол-3α-О-сульфат [186], и
кумарин сульфаты [187], содержащие сульфатированные спиртовые группы,
являются примерами других типов фенольных сульфатов.
Соединение 3.8 имеет пики молекулярных ионов [M + Na] + и [М + Cl]- в
спектре HRESIMS при m/z 417.1737 и 429.1544 соответственно, что
подтверждает его молекулярную формулу C17H30O10. Спектр 1H-ЯМР
обнаруживает два аномерных сигнала протонов (рисунок 37) при δ 5,19 (1H,
уш. с) и 4,36 (1H, д, J = 7,6 Гц), что соответствует аномерным протонам
рамнозы и глюкозы соответственно (таблица 23).
96
Рисунок 37 – 1Н ЯМР-спектр соединения 3.8
Таблица 23 – 1H и 13C ЯМР данные соединения 3.8 (in CD3OD)
№
3.8
δH (мультп.; J в Гц)
4.0 (m); 3.6 (м)
2.36 ( т, 7.6)
δcb
1
67.8
2
37.3
3
142.3
4
1.75 (д, 6.9).
110.7
5
1.75 (с)
21.5
1´
4.36 (д, 7.6 )
101.6
2´
3.93
70.8
3´
3.40
77.7
4´
3.49
77.9
5´
3.29
76.3
6´
3.87
61.3
1´´
5.19 (уш. с)
100.8
2´´
3,97
70.9
3´´
3.27
70.4
4´´
3.41
72.6
5´´
3.67
68.3
6´´
1.23 (д, 6.1 )
16.6
a1
b 13
Примечание – H ЯМР записан при 400 МГц, C ЯМР – 100 МГц [174]
a
97
С ЯМР сигналы, прописанные при 16,6 (С-6´´, м), 68,3 (С-5´´, д), 72,6 (С4´´, д) 70,4 (С-3´´, д), 70,9 (С-2´´, д) и 100,8 (С-1´´, д), относятся к концевой α-Lрамнозе, в то время как δ 61,3 (C-6´, т), 76,3 (C-5´, д), 77,9 (С-4´, д), 77,7 (С-3´,
д), 70,8 (С-2´, д) и 101,6 (С-1´, д) показаны для внутренней β-D-глюкозы. Сдвиг
гликозилирования C-4´[188, 189] предполагает, что компонент концевой
рамнозы присоединен к C-4´части молекулы глюкозы (рисунок 38).
13
Рисунок 38 – 13С ЯМР-спектр соединения 3.8
В дополнение к сигналам сахара 1H ЯМР спектр показал сигналы,
представляющие одну метиловую при δ 1,75 (3H, с), одну алифатическую
метиленовую при δ 2,36 (2Н, т, J = 7,6 Гц), одну гидрокси-метиленовую при δ
4,0 (1H, м) и δ 3,6 (1H, м) и геминальную метиленовую при δ 1,75 (2H, д, J = 6,9
Гц) группы. Их 13С ЯМР сигналы появились в спектре при δ 21,5 (С-5, м), 37,3
(С-2; т) 67,8 (С-1; т), 110,7 (С-4; т) и 142,3 (С-3; с), соответственно, что
указывает на присутствие CH2 = C (CH3) CH2CH2O-фрагмента (рисунок 39). В
эксперименте HMBC H-1´показал четкую корреляцию для С-1 и Н-1´´ для С-3´и
С-2´. В HMBC эксперименте (рисунок 40) протон при δ 1,75 (3H, с) показал
сильные корреляции с атомами углерода при δ 142,3 (С-3), 110,7 (C-4) и 37,3
(C-2), а также корреляции между сигналом при δ 2,36 (1H, т, J = 7,6) и
сигналами при δ 142,3 (C-3), 110,7 (С-4) и 67,8 (С-1). Определение положения
атомов было основано на COSY, HMBC и HMQC корреляциях (рисунок 41).
98
Рисунок 39 – DEPT-спектр соединения 3.8
Рисунок 40 – HMBC-спектр соединения 3.8
99
Рисунок 41 – HMQC-спектр соединения 3.8
На основании вышеизложенных данных структура соединения 3.8
идентифицирована как 3-метил-бут-3-ен-1-ил-4-О-α-L-рамнопиранозил-β-Dглюкопиранозидом:
OH
OH
HO
1`` O
HO
H
O
HOH2C
OH
1
O
1` O
3.8
Таким образом, соединения 3.1, 3.3 и 3.8 являются новыми ранее не
описанными в литературе.
Разделение 6 г этанольного экстракта надземной части L. leptophyllum на
ионообменной смоле Diaion HP20 (рисунок 42) привело к выделению 11
соединений (рисунок 43). Три вещества: бергенин (4.3) [190], димер геранин А
(4.5) [191] и aнтрахинон франгулаэмодин (4.6) [192] выделены впервые из
растений рода Limonium, наряду с семью известными соединениями:
мирицетин (4.1) [176], мирицитрин (4.4) [193], арбутин (4.7) [194],7-O-галлоилD-седогептулоза (4.8) [195], мирицетин-3-О-α-L-арабинопиранозид (4.9) [196],
галловая кислота-4-O-β-D-глюкозид (4.10) [197] и галловая кислота (4.11) [159],
а вещество 2-метил-эритритол-галлат (4.2) является, новым ранее не описанным
в литературе соединением.
100
Limonium leptophyllum (н.ч.)
Этанольный экстракт (6 г)
Diaion HP-20
FW15(1)-16-17
98.5 мг
Водная фракция
(2.14 г)
ПА
LH-20
FW13
4.2 мг
H2O-MeOH
FW1-FW23
FW9-10
65.3 мг
FW4
70.1 мг
LH-20
MeOH
L9
94.5 мг
LH-20
FW5-7
32 мг
MeOH
LH-20
L7
12 мг
MeOH
7
8
H2O-MeOH
FM4
50 мг
LH-20
MeOH-H2O
4-1
63-69
13.5 мг
ПА
L1
29.9 мг
ТФЭ, СГ/ОФ-С8
10
Метанольная фракция
(2.3 г)
MeOH
FM1-FM46
DCM-MeOH
14-1
1
11
FM13-16
95 мг
9
FM5-8
140 мг
LH-20
LH-20
MeOH
F3-10
70.1 мг
LH-20
F3-12-13
12.2 мг
MeOH
L3
20 мг
LH-20
MeOH
H2O-MeOH
MeOH
F4-1-56
FM23-30
700 мг
ТФЭ, СГ/ОФ-С8
F5-9-11
17 мг
LH-20
F4-30-37
7.2 мг
H2O-MeOH
L5
6.9 мг
5
2
Рисунок 42 – Схема разделения вторичных метаболитов растения вида L. leptophyllum
101
MeOH
LH-20
F6-15-31
5.5 мг
MeOH
3
4
FM35-46
162.7 мг
6
OH
OH
OH
HO
HO
O
O
3
4
OH
2
1'
1
9
O
HO
8
4
OH
H
O
6
6a
HO
O
OH
3
H
10
10a 10b 4a
MeO
OH
OH
2
O
OH
HO
OH
OH
11
OH
7
O
4.1
2'
OH
8
HO
9 O
7
O
OH
6
O
OH
O
4' OH
3'
OH
HO
4.3
4.2
5'
1'
2
510 4
OH
OH
O
6'
3
OH
8
5
10
4
8a
7
OH
10
6
9
9a
10a
1
2
3
4a
OH
4
5
O
3 OH
5'
4.5
4.4
OH
6'
4'
HO
OH
7 6
8
9
O
2' 1'2
3'
OH
O
OH
O
4.6
OH
OH
OH
OH
HO
O
O
OH
OH
O
HO
HO
HO
O
O
OH
OH
O
O
HO
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
4.8
4.7
4.9
OH
HO
HO
OH
HO
HO
HO
O
O
COOH
OH
HO
HO
O
4.11
4.10
Рисунок 43 – Вещества, выделенные из растений вида L. leptophyllum
Соединение 4.3 было получено в виде бесцветных кристаллов,
молекулярная масса подтверждена для С14Н16О9 с молекулярным пиком при m/z
327 [М - Н]. ИК-спектр показал широкую полосу поглощения при 3425-3200 см1
ОН-групп с межмолекулярными водородными связями и сильную полосу
карбонильной группы при 1703 см-1. Спектральные данные ЯМР представлены
в таблице 24.
102
Таблица 24 – Значения химических сдвигов в
соединения 4.3
№
2
3
4
4a
6
6a
7
8
9
10
10a
10b
11
H-ЯМР, 400 Гц
δН, м.д. (J, Гц)
H
3.77, т
1H, 2-H
3.53, т
1H, 3-H
3.88, т
1H, 4-H
4.14, дд (8.9, 10)
1H, 4a-H
7.14, с
1H, 7-H
5,04, д (10.8)
1H, 10b-H
4.09, м
1H, 11-Ha
3.78, м
1H, 11-Hb
3,97, с
3H, 9-CH3О
1
H- и
С-ЯМР-спектрах
13
C-ЯМР, 100 Гц
δc, м.д.
C-H корреляции
82.9 H-10b, 3, 4
71.8 H-4, 2
75.6 H-10b, 4a, 3
81.3 H-10b, 4
165.7 H-7
119.3 H-7, 10b
111.0 8-OH
152.2 8-OH, H-7
142.2 8-OH, 10-OH, H-7, 9-CH3O
149.3 10-OH, H-10b
117.2 10-OH, H-7, 10b, 4a
74.2 H-4a, 2
1
13
62.6
H-3, 2
60.9
H-7, 6, 5
Значения 1H были назначены на основе COSY-спектра и затем данные 13CЯМР были определены из DEPT, HMQC и HMBC-спектров. 1Н ЯМР-спектр
показал синглет при δ 7.14 (1Н, Н-7), сигнал метоксильной группы (δ 3.97, 3H,
с) и серии сигналов, характеристичных для сахарного фрагмента. Отсутствие
обычного O-гликозидного аномерного протонного сигнала и наличие сигнала
при δ 5.04 (1H, д, J = 10.8 Гц) указывает на присутствие С-гликозида. 13С ЯМРспектр показал два фенольных углерода и один карбонильный (δ 142.2, 149.3 и
152.2), один ароматический углерод (δ 111.0), метоксильную группу (δ 60.9),
два четвертичных углерода (δ 117.2 и 119.3), лактонный карбонил (δ 165.7), и
шесть сигналов при δ 62.6, 71.8, 74.2, 81.3 и 82.9, которые связаны с сахарным
остатком. НМВС-спектр гликозида показал корреляции между ароматическим
протоном (δ 7.14, с, H-7) и лактонным карбонилом (δ 165,7, C-6); протоном
сахара (δ 5.04, Н-10b) и четвертичными углеродами (δ 117.2, С-10а и 119.3, С6а). Вышеуказанные спектральные данные соединения 4.3 в сравнении с теми,
что ранее сообщались, подтверждают структура вещества как бергенин:
11
O
OH
2
H
10
10a 10b 4a
MeO
9
8
6a
HO
6
7
O
4.3
103
O
OH
OH
3
4
OH
H
Н ЯМР-спектр соединения 4.5 показал 11 ароматических протонов, три из
которых проявились в сильном поле (δ 5.85-5.97 м.д.) и соответствовали
положениям С-6 и С-8 A-кольца флаванового скелета (таблица 25).
1
Таблица 25 – Спектральные характеристики соединения 4.5
δH (м.д.),
мультиплетность, J (Гц)
Структурная единица A
2
3
3.869, м
4
4.274
5
6
5.858, д, 2.4
7
8
5.914, д, 2.4
9
10
1´
2´, 6´
7.501, д,9.0
3´, 5´
6.823, д,9.0
4´
Структурная единица B
2
4.612, д, 8.0
3
3.869, м
4акс.
2.426, дд, 8.8, 16.4
4экв.
2.735, дд, 5.6, 16.4
5
6
5.978, с
7
8
9
10
1'
2´, 6´
7.304, д, 8.4
3´, 5´
6.757, д, 8.4
4´
Положение
δC (м.д.)
HMBC (H→C)
корреляции
98.6
66.0
27.8
156.8
94.6
158.9
94.3
154.2
102.4
130.3
128.1
114.3
157.4
-
81.8
66.6
C-4, 3, 2´, 6´
-
29.1
-
156.1
96.2
152.2
105.5
151.4
101.6
129.2
128.8
114.7
156.9
C-2
-
Данные 13C-спектра обнаружили два пика при δ 94 м.д., принадлежащих C6 и только один пик при δ 96 м.д. резонировал для позиции С-8, это указывает,
что соединение 4.5 состоит из двух флавановых единиц, соединенных через
положение С-8 одной единицы. В то время как алифатические сигналы
протонов при δ 2,43 (дд, 1H) 2,74 (дд, 1H), 3,87 (с, 1Н) и 4,61 (д, 1H),
сопоставимы с позициями С-2, С-3, С-4 афзелецина. Спектр 13С показал пик,
104
резонирующий при 98.6 м.д., данные двумерной спектроскопии подтвердили,
что он принадлежит углероду С-2 второй единицы димера. Однако В-кольцо
показало A2B2 шаблон в обеих структурных единицах. Природа и характер
соединения были выявлены из двумерных экспериментов ЯМР-спектроскопии
(COSY, NOESY, TOCSY и HSQC). HMBC корреляции между атомами Н-4А/Н2B, Н-3A и Н-6A/Н-2´B, Н-6´B позволили определить (4→8,2→O→7) связь
(таблица 26). В сравнении полученных спектральных характеристик с
литературными источниками структура для соединения 4.5 была определена
как эпиафзелецин-(4β→8,2β→O→7)-афзелецин:
4' OH
3'
5'
2'
8
HO
9 O
7
6
1'
2
510 4
OH
6'
3
O
OH
8
9
O
2' 1'2
7 6
5
10
4
OH
3 OH
6'
3'
4'
HO
5'
4.5
Таблица 26 – Сравнение 13С-спектра нижней структурной единицы B с
литературными показателями
81.8
66.6
(-) афзелецин
(Su et al., 2008)
80.9
65.2
(-) эпиафзелецин
(Kpegba et al., 2010)
100.5
64.8
29.1
27.2
28.2
156.8
96.2
152.1
105.5
151.4
101.6
129.2
128.8
114.7
156.9
156.0
96.6
152.1
106.8
151.4
103.2
129.8
130.1
116.3
158.7
156.7
98.2
159.1
96.6
154.3
104.0
131.6
130.0
115.5
158.8
Позиция
δC (м.д.)
2
3
4акс.
4экв.
5
6
7
8
9
10
1´
2´,6´
3´,5´
4´
В масс-спектре соединения 4.6, полученного электрораспылительной
ионизацией в режиме отрицательных ионов, содержится стабильный
молекулярный ион [М - Н] при m/z 269. Эта информация, наряду с данными
105
ЯМР 1Н и 13С, соответствует молекулярной формуле С15Н10О5 (m/z 270)
эмодина. УФ-спектр поглощения наблюдали в этаноле при максимальной λ
223, 250, 267, 290 и 442 нм. Основные пики в ИК-спектре поглощения были при
ν 3400 см -1 (OH), 1635 и 1625 см-1 (карбонил хинона). 1H ЯМР-спектр
соединения анализировали с помощью данных двумерной ЯМР спектроскопии
(COSY, HMBC). Спектр показал наличие сигналов протона для двух
бензольных колец при δ 6.91 (д, 2.4 Гц, Н-2) и δ 6.44 (д, 2.4 Гц, H-4), а также δ
7.23 (с, Н-5) и δ 6.93 (с, Н-7). Сигналы H-5 и H-7 могут быть легко определены
из-за дальней корреляции связи с сигналом водородов бензольной метильной
группы при δ 2.29 м.д. (уш. с, 3Н, Н-11), которая часто встречается в
оксиантрахинонах. 13С ЯМР (δ 181.3) спектроскопические данные показывают,
что соединение 4.6 имеет сопряженный кетон в своей молекулярной структуре.
Положение функциональной группы кетона было выявлено на основании
HMBC корреляций между обнаруженным сигналом Н-9, данные приведены
ниже в таблице 27. Полученные данные свидетельствуют о том, что выделенное
соединение идентично ранее известному метаболиту франгулаэмодин [198]:
O
OH
8
8a
7
6
9a
10
OH
10a
9
1
2
3
4a
OH
4
5
O
4.6
Таблица 27 – Значения химических сдвигов 1H- и 13С-ЯМР соединения 4.6
№
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
8a
10a
9a
4a
11
H-ЯМР, 400 Гц
δН, м.д. (J, Гц)
H
11.9, с
ОН
6.44, д, (2.4)
1H
1H
6.91, д (2.4)
1H
7.23, с
6.93, с
1H
11.8, с
ОН
2.29, с
3H, -CH3
1
106
C-ЯМР, 100 Гц
C-H корреляции
Н-2
Н-4
Н-2
Н-2
Н-11, 7
Н-11
Н-11, 5
Н-7
Н-5, 4
13
δc, м.д.
164.5
108.0
165.8
109.0
120.5
148.4
124.2
161.5
181.3
189.6
113.3
108.9
132.7
135.0
21.7
Н-5, 7
Н-7
Н-5, 7
Соединения 4.6, 4.5 и 4.3 были выделены из растений рода Limonium
впервые. Таким образом, в исследуемых растениях присутствуют
конденсированные танины, представляющие собой различные формы флаван-3олов и 3,4-флаван-3,4-диолов, а также установлено наличие классов
антрахинонов и кумаринов. В настоящее время применение эфиров
ароматических кислот природного происхождения, соединенных с
многоатомными спиртами, ограничивается из-за их редкой доступности и
сложности выделения из растений.
Соединение 4.2 представляет собой белый аморфный порошок. ИК-спектр
соединения показал валентные колебания ненасыщенных С-С связей
ароматического кольца в области 1450-1620 см-1, колебания эфирной связи в
области 1660-1760 см-1, а также колебания связанных ОН-групп в области 31003600 см-1. УФ-спектр соединения 4.2 показал максимум поглощения при λ 218
и 276 нм. 1Н ЯМР спектр (рисунок 44) вещества указал на наличие галлоильной
группы при δ 7.14 м.д. (2Н, с).
Рисунок 44 – 1Н ЯМР-спектр соединения 4.2
Помимо сигнала ароматических протонов в спектре 1H ЯМР проявились
сигналы протонов остатка полиола: два дублета в области δ 4.20 м.д. (J = 11.2
Гц) и δ 4.28 м.д. (J = 11.6 Гц), соответствующих двум метиленовым протонам
ацилированной первичной гидроксильной группы, два дублета в области δ 3.87
и 3.91 м.д. (J = 3.2 и 14.4 Гц) и мультиплет δ 3.66 метиленовых протонов,
присутствующие в геминальном положении по отношению к гидроксильной
группе. Метиновый протон вторичной гидроксильной группы молекулы был
107
представлен в виде двух дублетов при δ 3.76 и 3.78 м.д. (J = 3.2 и 11.2 Гц).
Метильные протоны прописались в области δ 1.25 м.д. (3Н, с).
13
С-ЯМР-спектр (рисунок 45) вещества показал сигналы, соотносимые с
одной метиновой (δ 75.8) и двумя метиленовыми атомами углерода (δ 63.6 и
70.0), соединенные с гидроксигруппами.
Рисунок 45 – 13С ЯМР-спектр соединения 4.2
Так, молекулярная формула была предложена как С12Н16О8, что
дополнительно подтвердилось появлением интенсивного пика молекулярного
иона [M - H] при m/z 287 в полевой десорбции масс-спектра (рисунок 46).
Рисунок 46 – Масс-спектр соединения 4.2
Место расположения галлоильной группы было определено следующим
образом: в 1Н-ЯМР спектре вещества 4.2, сигнал метиленового протона,
несущего галлоил, был сдвинут в сторону слабого поля (δ 4.20 и 4.28, J = 11.2 и
11.6 Гц). Соседние С-3 и С-4 протоны оба обладают осевой ориентацией исходя
из их большой константы спин-спинового взаимодействия (таблица 28). Сигнал
протона C-1 также может считаться аксиальным (рисунок 47).
108
Таблица 28 –1H- и 13С-ЯМР характеристики нового соединения 4.2
№
1
2
3
4
1´
2´, 6´
3´, 5´
4´
-СН3
-СОО
H-ЯМР, 400 Гц
δН, м.д. (J, Гц)
4.20, д (11.2)
4.28, д (11.6)
3.76, д (3.2 и 11.2)
3.78, д (3.2 и 11.2)
3.66, м
3.87, д (3.2 и 14.4)
3.91, д (3.2 и 14.4)
7.14, с
1.25, с
1
C-ЯМР, 100 Гц
C-H корреляции
13
H
δc, м.д.
2Н
70.0
Н-3, -СН3
-
74.2
Н-1, 3, -СН3
1H
75.8
Н-4
2H
63.6
Н-3
2Н
3Н
-
121.3
110.2
146.2
139.7
19.7
168.4
Н-2´
Н-6´, 2´
Н-2´, 6´
Н-2´, 6´
Н-1
Н-1, 2´, 6´
Рисунок 47 – DEPT-спектр соединения 4.2
Спектр 13С ЯМР подтвердил, что первичная гидроксигруппа молекулы
была ацилирована, поскольку углеродный атом в α-положении к
сложноэфирной связи сдвинут в слабое поле. Химические сдвиги
109
ароматических атомов углерода остатка галловой кислоты, представленные на
рисунке 48, были установлены в соответствии корреляциями, обнаруженными в
спектре HMBC эксперимента (рисунок 49). Эксперимент гетероядерной
многоквантовой корреляции HMQC (рисунок 50) позволил выявить химические
сдвиги ядер, между которыми существует прямое спин-спиновое
взаимодействие.
OH
OH
HO
HO
O
OH
HO
O
Рисунок 48 – HMBC корреляции нового соединения 4.2
Рисунок 49 – HMBC-спектр соединения 4.2
Структура соединения 4.2 была подтверждена методами одно- и
двумерной спектроскопии (1H ЯМР, ЯМР 13С, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC,
НМВС), а также HRESIMS. Спин-спиновая связь между протонами была
выявлена из спектров эксперимента COSY (рисунок 51) и позволила
определить положения мультиплетных сигналов в структуре вещества 4.2.
110
Рисунок 50 – HMQC-спектр соединения 4.2
Рисунок 51 – СOSY-спектр соединения 4.2
111
На основании приведенных выше результатов физико-химического
анализа, структура нового соединения была идентифицирована как 2,3,4тригидрокси-2-метил-бутил-галлат:
OH
OH
HO
HO
O
3
4
HO
2
1'
1
OH
O
4.2
3.5 Взаимодействие выделенных соединений с опиодными
рецепторами.
Известно что, флавоноиды обладают высоким сродством к δ-рецептору и
показывают антагонистическую активность по отношению к κ-рецептору [114].
Данные показывают, что флавоноидами, в качестве лигандов, можно
манипулировать для создания оптимальной селективности в связывании с
определенным рецептором [114]. Для рационального создания лекарственных
препаратов необходимо предсказать степень связывания лиганда с
макромолекулой, поэтому исследования в области молекулярного докинга
представляются
вполне
актуальными.
Для
поиска
потенциальных
«активаторов» рецепторов предварительный анализ осуществляли с
экстрактами (таблица 29), чтобы выявить селективность в связывании с
определенными подтипами рецепторов (каннабиноидные и опиоидные).
Таблица 29 – Исследование активности каннабиноидных и опиодных
рецепторов в экстрактах
Образец
Масса
мкл ДМСО
CB1* CB2* Delta*
LMr-II
3,0
300
20,0
23,5
7,8
LMa-II
3,1
310
17,9
14,4
14,6
LGr-II
3,0
300
20,5
11,2
33,7
LGa-II
3,1
310
49,8
30,4
3,7
LC-II
3,1
310
28,0
30,6
LL-II
3,0
300
40,8
8,1
17,0
*-процент ингибирования при концентрации 10 мкг/мл
Kappa*
20,2
23,5
40,4
31,2
15,3
8,9
Mu*
18,7
15,7
17,6
17,8
10,4
Как видно из представленных в таблице 29 данных, выделенные экстракты
растений не показали высокого связывания с рецепторами, что связано со
структурными особенностями взаимодействия белков с лигандами.
Наибольший процент ингибирования около 50% показал экстракт, полученный
из надземной части растений вида Limonium gmelinii, что доказывает
перспективность разработок в области идентификации вторичных метаболитов
для поиска перспективных терапевтических препаратов. Благодаря тому, что
флавоноиды имеют низкое структурное сходство с уже используемыми
112
опиоидными лигандами, проявляя при этом свойства опиоидных антагонистов
κ- и µ-рецепторов, их структурный каркас с изменениями флавоноидного ядра
открывает огромные перспективы их использования.
Соединения при концентрации 10 мкМ также были оценены на их
сходство с ранее известными лигандами при связывании с каннабиноидами
(CB1 и CB2) и опиоидами (µ, κ и δ-рецепторы). Для объяснения высокой
биологической активности выделенных соединений 2.8, 2.9, 2.11, 3.10, 4.4, 4.9
(таблица 30) нами было проведено вычислительное исследование с
использованием
рентгеновских
структур
опиоидных
рецепторов,
опубликованных за последние несколько лет. Эти структуры соответствуют
идентификационным кодам Банка данных белковых молекул (PDB) 4DKL для
μ-рецептора, 4EJ4 для δ-рецептора, 4DJH для κ-рецептора, и 4EA3 для
рецептора NOP [74-107].
Таблица 30 – Процент ингибирования при связывании выделенных веществ
исследуемых растений с каннабиноидными и опиодными рецепторами
Образец*
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
1.10
1.11
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10
2.11
3.1
3.2
3.3
Объем р-теля (мкл)
2
119
467
438
215
164
588
346
218
442
224
215
165
329
213
198
228
331
314
158
158
301
158
329
312
299
CB1
3
7,6
26,7
17,0
2,8
20,0
3,2
16,5
21,5
15,5
2,7
11,5
8,1
0,8
4,3
1,5
16,9
1,3
113
CB2
4
9,4
5,2
4,8
7,3
7,2
0,8
2,7
9,5
13,0
13,7
8,3
0,2
2,2
3,3
7,5
8,1
Delta
5
2,0
34,6
20,3
11,7
3,6
21,7
24,7
14,5
9,7
-
Kappa
6
4,6
4,6
12,5
6,3
9,8
9,2
1,2
19,2
21,3
7,5
9,7
34,7
29,5
43,8
58,6
48,4
-
Mu
7
1,5
6,2
14,0
4,0
2,6
2,0
6,2
11,8
2,9
6,7
5,2
15,9
37,8
8,0
16,1
16,2
16,6
2,3
-
Продолжение таблицы 30
1
2
3.4
312
3.5
301
3.6
352
3.7
314
3.8
253
3.9
314
3.10
208
3.11
221
4.1
314
4.2
218
4.3
292
4.4
222
4.5
100
4.6
173
4.7
215
4.8
301
4.9
222
4.10
100
4.11
215
* масса образца 1 мг
3
6,1
4,2
32,7
3,4
6,0
1,9
2,5
0,8
16,0
2,0
10,8
4
3,8
0,2
0,9
8,9
5,2
5,7
4,5
2,3
18,0
4,8
3,0
7,7
0,7
4,6
8,1
5
10,6
13,1
3,2
2,4
19,2
21,1
9,3
0,1
20,0
29,2
7,0
6
0,3
4,1
4,2
39,8
8,4
37,0
2,3
53,0
12,6
29,9
23,6
1,7
54,4
42,0
8,9
7
3,9
2,0
1,9
10,0
14,2
11,5
46,8
20,2
16,1
4,4
11,6
3,4
22,4
29,6
0,4
Молекулярный докинг соединений в кристаллическую структуру κрецептора 4DJH (в присутствии JDTic [102]) проводился с использованием
программы FRED 2.1.2 и сравнивался с закрепленной позой JDTic в
кристаллической структуре κ. Как V-образная связывающая ориентация JDTic в
кристаллической структуре κ, данные соединения связываются с рецептором κ
в V-образной ориентации. На рисунке 52а показано связывание JDTic и
активной части κ-рецептора. Активная часть рецептора представлена тремя
гидрофобными карманами: первый, где располагается изохинолиновое кольцо
молекулы, другой с фенольным кольцом, а третий связан изопропиловой
частью лиганда. При сравнении флавонола (вещества 2.9), представленного на
рисунке 52б, видно, что его кольцо В связывается аналогично изопропиловой
части лиганда JDTic, а кольца А и С занимают положение изохинолиновой
части, сахар же не достиг глубокой позиции в кармане как фенольное кольцо
JDTic, и остался на уровне пиперидина. Соединение 2.9 показало высокое
сходство с JDTic при связывании с рецептором, где оба лиганда плотно
прикрепляются к активной части, образуя обширные гидрофобные
взаимодействия. Если использовать этот же подход для вещества 4.4 (рисунок
52в), сравнивая его с 2.9, то можно наблюдать, что оно еще менее закреплено в
2-х карманах, значит, имеет меньшее взаимодействие, что и подтверждают
данные таблицы 30.
114
а
б
в
Рисунок 52 – Связывающая ориентация JDTic (желтый) в кристаллической
структуре κ (а). Соединения 2.9 и 4.4 связываются с κ-рецептором в
аналогичной JDTic V-образной ориентации (б и в)
Соединение 3.10 идеально расположено в карманах рецептора (рисунок
53), однако группа СН2ОН конфликтует с аминокислотой в ТМ6 и ТМ5,
поэтому по сравнению с остальными соединениями 3.10 показывает
минимальное связывание.
Рисунок 53 – Положение соединения 3.10 в карманах при связывании с
активной частью κ-рецептора
Вещество 4.9 на рисунке 54 показывает высокое сродство с соединением
2.9 в связывании c κ-рецептором при энергетически наиболее выгодном
расположении. Азот пирролидина в JDTic дает классическое ионное
взаимодействие с неизменно сохраняющейся аминокислотой Asp138 в TM3,
присутствие которой в аминергических серпентинах необходимо для
определения протонированных аминосодержащих лиганд и отвечает за
связывание рецепторов с этими лигандами.
115
Рисунок 54 – Модель связывания исследуемых соединений (2.8, 2.11 и 4.9) в
кристаллической структуре κ-рецептора
Поскольку Asp138 сохраняется во всех опиоидных рецепторах и
исследования мутагенеза показывают, что эта аминокислота необходима для
закрепления положительно заряженных лигандов [199], следовательно,
создание
функциональных
групп,
образующих
ионные
полярные
взаимодействия с аминокислотой, должно увеличить сродство в связывании с
данным рецептором, основываясь на полученные данные. JDTic
взаимодействует с четырьмя аминокислотами, которые не встречаются в
других опиоидных рецепторах [200] (рисунок 55), что способствует
селективности JDTic для κ-рецептора и созданию других κ-селективных
лиганд. Эти четыре аминокислоты являются (аминокислоты найдены в μ и δрецепторах, соответственно, указаны в скобках): Val108 (Аla и Аla), Val118
(Asn и Lys), Ile294 (Val и Val), и Tyr312 (Trp и Leu).
Рисунок 55 – Схема взаимодействия JDTic (серый) в связывающем кармане
боковых цепей. Аминокислотные остатки, которые варьируются между μ, δ и κ
подтипами выделены красным цветом
116
Так как все исследуемые соединения не имеют ионного взаимодействия с
данной аминокислотой, они демонстрируют менее 70 % связывания, но
показывают высокую селективность взаимодействия с κ-рецептором в отличие
от других опиодных рецепторов. Следует отметить, что скелет такого рода
молекул может обусловливать возможность их селективного применения в
отношении κ-рецептора, при этом химически модифицируя структуры для
лучшего связывания с активной частью.
Анализ аминокислот, участвующих в связывании JDTic с κ-рецептором
показывает, что все описанные остатки могут способствовать селективности
профиля JDTic [102, 201-202]. В κ-рецепторе, Val важен для избирательного
связывания JDTic. Когда эта аминокислота заменяется на Lys (найденный в δрецепторе), то большие гидрофильные аминокислоты препятствуют
взаимодействию между лигандом и рецептором, что делает JDTic селективным
только для κ-рецептора.
3.6 Биоскрининг активностей (антималярийная, антипротозойная,
противогрибковая,
антибактериальная
и
противораковая)
для
выделенных экстрактов и индивидуальных веществ
При проведении предварительного (первичного) анализа определяется
процент ингибирования для выявления потенциально активных компонентов.
Таковыми считались образцы с показателями выше 50 %. Далее проводился
вторичный анализ, где устанавливали IC50 для соединений при трех различных
концентрациях, что представляет собой концентрацию соединения, которая
подавляет 50 % роста организма и обычно приведена в микрограммах или
нанограмм на мл. Так, если IC50 составляет менее 1 мкг/мл, предполагается, что
соединение является очень активным, если IC50 в пределах от 1 до 10 мкг/мл,
соединение активно, если IC50 между 10-20 мкг/мл, соединение умеренно
активное, и выше данного показателя, соединение не активно. Интерпретация
результатов проводилась в соответствии с рекомендациями по общепринятой
практике определения активностей. Все выделенные соединения и экстракты
были
оценены
на
их
антибактериальные,
противогрибковые,
противомалярийные и антипротозойные активности. Антибактериальные
испытания проводили in vitro против золотистого стафилококка (Staphylococcus
aureus), метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA),
кишечной палочки (Escherichia coli), синегнойной палочки (Pseudomonas
aeruginosa) и Mycobacterium intracellulare. Противогрибковые исследования
были оценены против ряда патогенных грибов (Candida albicans, С. glabrata, С.
krusei, Cryptococcus neoformans и Aspergillus fumigatus), связанных с
оппортунистическими инфекциями при иммунодефиците.
При изучении противомалярийной активности против паразитов вида
Plasmodium falciparum экстракт из растений вида L. myrianthum оказался не
достаточно активным, экстракт корней и надземной части показал 27 и 26
процентов ингибирования соответственно. Самыми активными были водные
экстракты видов L. gmelinii, L. caspium и L. leptophyllum, а также этанольный
117
экстракт надземной части L. gmelinii и дихлорметановый экстракт надземной
части L. leptophyllum c соответствующими показателями ингибирования в 41,
44, 42, а также 41 и 44 процентов. Среднюю противомалярийную активность
проявил метанольный экстракт корней и надземной части L. gmelinii
полученные данные составили 28 и 37 процентов подавления роста простейших
паразитов P. falciparum. Дихлорметановый экстракт надземной части L. gmelinii
не выявил высокой противомалярийной активности, процент ингибирования
составил лишь 26 %. Таким образом, девять экстрактов (таблица 31)
извлеченных различными растворителями из исследуемых видов растений
были подвержены биологическому скринингу для выявления наиболее
перспективных для их потенциального применения в качестве активного начала
лекарственных средств. При исследовании IC50 противомикробной активности
(таблица 32) три таксона (L. myrianthum, L. gmelinii и L. leptophyllum) показали
среднюю активность менее 8 мкг/мл против гаплоидных дрожжей вида С.
glabrata и низкую – более 200 мкг/мл против грибковой плесени A. fumigatus.
Антибактериальную активность против кишечной палочки (E. coli) и
грамположительной бактерии M. intracellulare зафиксировали аналогично более
200 мкг/мл для данных видов, за исключением дихлорметанового экстракта
надземной части L. leptophyllum, который проявил активность со значениями
IC50 165.92 и 154.45, соответственно. Из всех полученных экстрактов только
экстракт надземной части растений вида L. leptophyllum проявил активность
против бактерий вида Mycobacterium intracellulare, при этом процент
ингибирования составил 7 мкг/мл. Метанольные экстракты корней L. gmelinii и
L. myrianthum, а также дихлорметановый экстракт надземной части L.
leptophyllum показали противогрибковую активность против дрожжеподобных
грибов вида Cryptococcus neoformans, возбудителей криптококкоза у человека,
в концентрациях 2, 11 и 13 мкг/мл соответственно [203]. Данные по
определению биологической активности выделенных индивидуальных
соединений представлены на рисунках 56-59.
Рисунок 56 – Противогрибковая, антипротозойная и противораковая
активности соединений 1.3, 1.5-1.8 и 1.10, идентифицированных в растении
вида L.myrianthum
118
Таблица 31 – Противомикробный анализ экстрактов исследуемых растений
Экстракт
Таксон
Часть
растения
Метанольный
LM
надземная
Метанольный
LM
корни
Метанольный
LG
надземная
Метанольный
LG
корни
Водный
LG
надземная
Этанольный
LG
надземная
Дихлорметановый
LG
надземная
Водный
LC
надземная
Водный
LL
надземная
Дихлорметановый
LL
надземная
*Тестовая концентрация 50 мкг/мл
C.
albicans
48
73
89
91
1
1
34
0
2
31
C.
glabrata
83
82
85
94
60
52
56
9
53
40
C.
krusei
82
99
65
100
0
3
40
0
0
37
A.
fumigatus
2
7
3
6
2
2
0
1
4
10
S.
aureus
11
22
27
25
5
7
40
0
16
80
MRS
14
21
22
15
3
0
20
0
4
57
E
coli
27
38
40
39
0
0
7
4
23
21
P.
aeruginosa
15
35
46
44
20
15
17
22
37
31
Таблица 32– Значения IC50 противомикробной активности экстрактов, полученных из растений рода Limonium
Экстракт
Таксон
Часть
Candida
растения albicans
Метанольный
LM
надземная
19.79
Метанольный
LM
корни
28.88
Метанольный
LG
надземная
51.4
Метанольный
LG
корни
19.45
Дихлорметановый
LG
надземная
н/и
Водный
LL
надземная
н/и
Дихлорметановый
LL
надземная
77.52
Примечание – н/и – невозможно измерить
Candida
krusei
<8
<8
<8
<8
19.26
>200
57.84
119
Cryptococcus
neformans
>200
>200
>200
58.71
>200
>200
114.29
Staphylococcus
aureus
>200
109.74
>200
>200
15.030
>200
<8
MRS
>200
61.14
95.78
187.86
29.35
>200
13.13
Pseudomonas
aeruginosa
66.02
55.9
17.96
56.18
164.52
>200
122.78
При изучении антипротозойной активности в качестве стандарта
использовали ДФМО со значением IC50 2.38 мкг/мл. Как видно из рисунка 56,
соединение 1.6 обладает высокой антипротозойной активностью с
показателями IC50 и IC90 1.18 и 1.51мкг/мл соответственно, что в два раза
активнее в сравнении со стандартом. Также вещество оказалось активно в
ингибировании роста лейкозных клеток К562, которое составило 90 %.
Соединение 1.5 проявило аналогичное действие в отношении противораковой
активности, с подавлением роста в 95 %. Все вещества показали средние
значения активности против сонной болезни. А соединение 1.8 выявило
противогрибковую активность при IC50 4.96 мкг/мл.
Рисунок 57 – Противогрибковая, антипротозойная и противораковая
активности соединений 2.1, 2.3, 2.4, 2.7-2.9 и 2.11, идентифицированных в
растении вида L. gmelinii
Рисунок 58 – Противогрибковая, антипротозойная и противораковая
активности соединений 3.3, 3.4, 3.7, 3.9 и 3.10, идентифицированных в растении
вида L. caspium
120
12,00
Trypanosoma brucei IC50
10,00
мкг/мл
8,00
Trypanosoma brucei IC90
6,00
Candida glabrata IC50
4,00
2,00
Лейкозные клетки К562
0,00
соединение
Рисунок 59 – Противогрибковая, антипротозойная и противораковая
активности соединений 4.1, 4.4, 4.6- 4.10, идентифицированных в растении вида
L. leptophyllum
На рисунке 57 отражено биологическое действие вторичных метаболитов
растений вида L. gmelinii. Так вещества 2.1, 2.9, 2.11 проявили хорошую
активность против возбудителя африканского трипаносомоза с данными при
4.86, 5.31 и 4.44 мкг/мл. Последнее вещество, как и 2.8, обозначили динамику
противомикробного воздействия при IC50 4.75 и 3.55 мкг/мл. А 2.9
зарекомендовало себя в качестве возможного ингибитора роста клеток линии
хронической лейкемии человека. По рисунку 58 можно судить, что
индивидуальные компоненты таксона L. caspium не обладают выраженной
активностью, что подтвердило результаты предварительного исследования
экстрактов (таблица 31), где данное растение также не являлось
перспективным. Согласно рисунку 59 можно заметить, что вещество 4.1
обладает ярко выраженной активностью против штамма C. glabrata, с IC50
4.62 мкг/мл. Соединения 4.7, 4.9 и 4.10 обнаружили умеренное действие против
простейших возбудителей вида T. brucei IC50 (5.02, 5.75и 5.12 мкг/мл) и IC90
(7.63, 7.59 и 7.9 мкг/мл) соответственно. А препараты 4.1 и 4.4 демонстрируют
свыше 90 % подавления роста клеток серии К562 лейкоза.
Шесть соединений 1.8, 2.3, 2.7, 3.5, 4.1 и 4.9 проявили очень высокую
противогрибковую активность по отношению к С. glabrata, поэтому для них
было проведено исследование IC90 с представленными показателями 3.77,
10.25, 8.87, 12.27, 7.99 и 12.48 мкг/мл соответственно. Значение IC90 для
флуканазола, используемого в качестве контроля 6,26 мкг/мл. Для соединения
2.7 также выявлена высокая антибактериальная активность против метициллинрезистентного золотистого стафилококка со значением IC90 15.58 мкг/мл.
Соединение 3.6 показало высокую противомалярийную активность против
обоих устойчивого и чувствительного штаммов Plasmodium falciparum со
значениями IC50 1.82 и 1.51 мкг/мл соответственно. Соединения 1.6 показало
высокую антипротозойную активность против жгутиконосного простейшегопаразита вида Leishmania donovani Promastigote, являющегося возбудителем
антропонозного висцерального лейшманиоза. Так, при вторичном анализе
121
вещество показало значение IC50, равное 9.41 мкг/мл, а при третичном
испытании активности значение IC90 – 8,7 мкг/мл соответственно. Данное
соединение также проявило противомикробную активность против MRS, IC50
определено как 7.45 мкг/мл.
Флавоны являются одними из фенольных соединений, показывающих
потенциальную способность в лечении и профилактики опухолей [204].
Интересно заметить, что выделенные индивидуальные соединения показали
более высокий процент ингибирования лейкозных клеток по сравнению с
экстрактами (таблица 33). При исследовании подавляющего рост лейкозных
клеток действия экстрактов было выявлено, что максимальный процент
ингибирования показал метанольный экстракт корней L. myrianthum. Экстракт
надземной части L. leptophyllum также показал сравнительно высокий процент
подавления роста клеток линии К562. Данные, представленные выше, для
соединений 1.5, 1.6, 4.1 и 4.4 находятся в очень хорошем соответствии,
подтверждая полученные результаты.
Таблица 33 – Предварительное исследование цитотоксичности экстрактов в
отношении клеток линии К562 лейкемии человека
Образец
Концентрация(мкг/мл) рост (%) ингибирование (%)
L. gmelinii (корни)
100
75,0
25
L. myrianthum (н.ч.)
100
85,0
15
L. myrianthum (корни)
100
65,0
35
L. gmelinii (н.ч.)
100
90,0
10
L. gmelinii (цветки)
100
75,0
25
L. caspium
100
88,0
12
L. leptophyllum
100
70,0
30
Таксол*
0.1 мкM
6,3
93,7
* – контроль
Соединения 1.5, 1.6, 2.9, 4.1 и 4.4, проявившие высокое ингибирование
роста против двух линий клеток HL60 и К562 лейкемии человека, исследовали
на IC50 при более низких концентрациях для выявления закономерности их
действия. Активности этих соединений оценивали через 48 ч выдержки in vitro.
Все они значительно ингибируют рост HL60 и К562. Их ингибирующее
действие напрямую зависит от концентрации (рисунки 60 и 61). Расчетные
значения IC50 приведены в таблице 34. При этом никаких существенных
различий в чувствительности этих двух клеточных линий исследуемые
соединения не проявили.
Клетки обрабатывали исследуемыми соединениями в течение 48 ч, а затем
количество клеток было определено тестом элиминации трипанового синего.
Результаты представляют собой средние значения для трех измерений
экспериментов ± стандартное отклонение (SD).
122
Таблица 34 – Ингибирующее действие выделенных соединений на рост линий
клеток лейкоза человека in vitro (48-часовая экспозиция препарата в клетках
HL60 и К562)
Линия
IC50 (мкM)*
клеток
1.5
1.6
2.9
4.1
4.4
HL60
0.035 ± 0.008
0.05 ± 0.02
0.45 ± 0.5 0.032 ± 0.001 0.08 ± 0.01
K562
0.045 ± 0.05 0.065 ± 0.002 0.80 ± 0.2
0.03 ± 0.01 0.12 ± 0.03
* эксперименты проводились в трех повторах
Рост (% контроля)
120
1.5
100
4.1
80
1.6
60
4.4
40
2.9
20
0
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
10
Концентрация (мкM)
Рисунок 60 – Концентрационно-зависимые эффекты выделенных соединений
на рост клеток линии HL60 острой лейкемии человека
Рост (% контроля)
120
100
1.5
80
4.1
60
1.6
40
2.9
4.4
20
0
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
10
Концентрация (мкM)
Рисунок 61 – Концентрационно-зависимые эффекты выделенных соединений
на рост клеток линии K562 хронической лейкемии человека
Клетки HL60 острого лейкоза человека были более чувствительны к
исследуемым соединениям, чем клетки К562 хронического лейкоза.
Соединение 4.1 показало более сильную ингибирующую активность, чем
остальные в обеих линиях клеток HL60 и К562. За последние 30 лет флавоны
стали потенциальным источником в поиске соединений и биологически
активных компонентов [204].
123
При исследовании антиоксидантной активности предварительно
анализировали субстанции, полученные в качестве сухих экстрактов, которые
вначале изучались при больших концентрациях 5-20 мкг/мл с постепенным
снижением
до
1-10
мкг/мл,
если
обнаруживался
значительный
противоокислительный эффект [205]. Так результаты исследования
ацетонового экстракта корней показаны на рисунке 62.
А
120
Б
120
уровень ПОЛ в %
уровень ПОЛ в %
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
100
80
60
40
20
0
20
0
1
3
5
10
концентрация субстанции в мкг/мг
концентрация субстанции в мкг/мг
Рисунок 62 – Влияние ацетонового экстракта корней на процессы ПОЛ в
микросомах печени
Из рисунка видно, что субстанция обладает значительными
антиоксидантными
свойствами.
Рисунок
62Б
показывает,
что
противоокислительный эффект субстанции проявился при концентрации 1
мкг/мг белка - уровень ПОЛ снизился на 10 %, увеличение концентрации до 3
мкг привело к ингибированию процессов липопероксидации до 26 %, тогда как
при действии концентраций выше 5 мкг отмечалось полное ингибирование
ПОЛ (рисунок 62А).
На рисунке 63 представлены результаты исследования субстанции,
выделенной из водно-метанольного экстракта корней (WMR). Как выявили
исследования, свойства субстанции WMR, как и в первом случае, проявляются
дозозависимо. Действие субстанции плавно снижает интенсивность
образования продуктов ПОЛ в диапазоне концентраций 5-10 мкг/мл белка,
концентрации субстанции от 10 мкг ингибируют процессы липопероксидации
на 95 %.
Б 120
120
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
уровень ПОЛ в %
уровень ПОЛ в %
А
100
80
60
40
20
0
0
5
7
10
15
концентрация субстанции в мкг/мг
концентрация субстанции в мкг/мг
Рисунок 63 – Влияние субстанции WMR на процессы ПОЛ
Анализ осуществлялся в трех повторах с расчетом стандартного
отклонения. Исследование антиокислительных свойств субстанции из
надземной
части
водно-метанольного
экстракта
(WMA)
выявило
дозозависисмый эффект препарата (рисунок 64A). Субстанция WMA
124
практически полностью снизила образование ТБК-активных продуктов (на
92,5%) при концентрации 20 мкг/мг белка. А на рисунке 64Б показаны
результаты исследования надземной части ацетонового экстракта. Так можно
наблюдать, что при концентрации ацетонового экстракта, равной 5 мкг,
содержание продуктов ПОЛ снижается на 23 %, тогда как при действии воднометанольного экстракта – на 39 %. Однако с повышением концентрации до 15
мкг проявляется противоположная картина.
Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что
противоокислительный эффект субстанций проявляется в прямой зависимости
от концентрации. Наряду с этим исследованные субстанции в зависимости от
их антиоксидантного действия можно расположить следующим образом:
субстанция из ацетонового экстракта корней > субстанция WMR > субстанция
из ацетонового экстракта надземной части > субстанция WMA. Полученные
результаты хорошо коррелируют с данными по определению содержания
полифенолов, и в том числе флавоноидов в экстрактах (таблица 2), выделенных
из исследуемых растений.
120
100
80
60
40
20
0
Б
уровень ПОЛ в %
уровень ПОЛ в %
А
0
5
10
15
120
100
80
60
40
20
0
20
0
5
10
13
15
20
концентрация субстанции в мкг/мг
концентрация субстанции в мкг/мг
Рисунок 64 – Влияние субстанции WMA (A) и ацетонового экстракта
надземной части (Б) на процессы ПОЛ в микросомах печени
уровень ПОЛ в %
Исследование антиоксидантных свойств этанольного экстракта корней и
надземной части показало дозозависимое действие препаратов на содержание
ТБК-активных продуктов в микросомах печени (рисунок 65).
120
100
80
60
к.
40
н.ч.
20
0
0
5
10
15
20
концентрация субстанции в мкг/мг
Рисунок 65 – Влияние этанольного экстракта, выделенного из корней (к.) и
надземной части (н.ч.) на процессы ПОЛ в микросомах печени
При концентрации экстракта корней, равной 5 мкг/мг белка, содержание
продуктов ПОЛ уменьшилось на 25 %, тогда как при действии экстракта
125
надземной части – на 15 % относительно контроля. При повышении
концентрации обоих экстрактов до 10 мкг наблюдалась противоположная
картина, содержание МДА при действии субстанции из корней снизилось на
43 %, а из надземной части – на 55 %. Действие более высоких концентраций
препаратов от 15 мкг/мг и выше практически полностью подавляет накопление
ТБК-активных продуктов в мембранах.
Результаты исследования противоокислительных свойств водноэтанольного (50 %-ного раствора) экстракта корней и надземной части
приведено на рисунке 66. Как видно из рисунка, с увеличением концентрации
экстракта корней резко снижается уровень перекисных продуктов в
микросомах печени и при концентрации выше 10 мкг/мг белка практически
полностью предотвращается накопление перекисных продуктов. Следует
обратить внимание, что при действии возрастающих концентраций экстракта
надземной части плавно дозозависимо снижается содержание МДА в
микросомах печени и только при концентрации 25 мкг/мг белка полностью
ингибируется образование перекисных продуктов. Основываясь на полученных
результатах, можно заключить, что антиоксидантные свойства экстракта из
корней существенно выше по сравнению с экстрактом, полученным из
надземной части.
120
уровень ПОЛ в %
100
80
60
н.ч.
40
к.
20
0
0
5
10
15
20
25
концентрация субстанции в мкг/мг
Рисунок 66 – Влияние водно-этанольного экстракта корней (к.) и надземной
части (н.ч.) на процессы ПОЛ
Сравнительный анализ антиоксидантных свойств этанольного и водноэтанольного экстрактов, полученных из корней, приведен в таблице 35. Из
таблицы видно, что исследованные субстанции дозозависимо ингибируют
образование продуктов ПОЛ. Однако антиокислительные свойства водноэтанольного экстракта корней более выражены по сравнению с этанольным
экстрактом корней. Следовательно, этанольный экстракт защищает мембраны
гепатоцитов от перекисного окисления и проявляет наилучший протекторный
эффект. Необходимо учесть, что эффективность данного препарата в качестве
гепатопротектора должна быть в обязательном порядке подтверждена
клиническими испытаниями, так как предварительный анализ осуществляется
только in vitro.
126
Таблица 35 – Влияние этанольного и водно-этанольного экстрактов корней на
интенсивность процессов ПОЛ в микросомах печени
Интенсивность процессов ПОЛ (%)
Концентрация вещества в
мкг/мг белка
Водно-этанольный экстракт Этанольный экстракт
0
100
100
5
75,4±5,0
99,1±3,8
10
56,6±3,5
89,4±3,3
15
4,5±0,15
52,1±2,2
20
3,5±0,10
12,7±1,0
25
2±0,09
3,4±0,1
Примечание – достоверно по сравнению с контролем – р <0,05*, р<0,01**
При сравнении антиокислительных свойств этанольного, водноэтанольного и ацетонового экстрактов надземной части исследуемых растений
было выявлено, что они полностью ингибируют процесс накопления ТБКактивных продуктов в концентрациях от 15 мкг/мг белка (рисунок 67).
Антиоксидантный эффект препаратов в дозах 5-10 мкг проявлялся по-разному.
При действии этанольного экстракта в концентрации 5 мкг/мг уровень ПОЛ
снижался на 15%, водно-этанольного экстракта – на 18 % и ацетонового – на
23 %, соответственно. Повышение концентрации до 10 мкг привело к усилению
антиоксидантного эффекта экстрактов, тем не менее, этанольный экстракт
ингибировал интенсивность накопления продуктов липопероксидации на 76 %,
водно-этанольный экстракт – на 88 % и ацетоновый экстракт – на 82 %.
уровень ПОЛ в %
120
100
80
60
1
40
2
3
20
0
0
5
10
15
20
концентрация субстанции в мкг/мг
Рисунок 67 – Сравнительное влияние этанольного (1), водно-этанольного (2) и
ацетонового (3) экстрактов, выделенных из надземной части на процессы ПОЛ
в микросомах печени
В таблице 36 приведены данные результатов определения концентрации
новых соединений природного происхождения (1.2, 1.3 и 1.4), при которой
отмечается 50 % ингибирование процессов ПОЛ (ІС50). Как видно из таблицы
36 и из рисунка 68, все исследованные индивидуальные вещества проявляют
одинаковые антиоксидантные свойства, значения IC50 практически одинаковы.
Это подтверждено и идентифицированными структурами выделенных
соединений, которые отличаются друг от друга лишь метиленовой группой.
127
Таблица 36 – Значения IC50 новых соединений 1.2, 1.3 и 1.4, выделенных
впервые из природного источника
Соединение
1.4
1.2
1.3
* р≤0,005
Значение ІС50 (мкг/мг белка)*
14,0
13,0
13,0
На рисунке 68 представлены результаты экспериментов по воздействию
возрастающих концентраций соединений на содержание перекисных продуктов
в микросомах печени.
уровень ПОЛ в %
120
100
80
1.4
60
40
1.2
20
1.3
0
0
5
10
15
20
50
100
концентрация субстанции в мкг/мг
Рисунок 68 – Влияние новых соединений природного происхождения на
интенсивность накопления продуктов ПОЛ в гепатоцитах
Данные антиоксидантной активности свидетельствуют, что все три
соединения (1.2, 1.3, 1.4) обладают ярко выраженным ингибирующим
действием на процессы ПОЛ, о чем говорит значительное снижение
содержания ТБК-активных продуктов до концентрации 20 мкг/мг белка. При 5
мкг/мг уровень ПОЛ достигает 91 % в сравнении с контролем, а при 20 мкг/мг
уровень ПОЛ снижается до 10 % от контроля. Это доказывает высокую
антиоксидантную активность анализов перекисного окисления липидов в
микросомах печени. Тем не менее, антиоксидантные свойства требуют
дальнейшего изучения. При дальнейшем увеличении концентрации соединений
свыше 20 мкг ингибирование процессов пероксидации происходит почти
полностью, и зарегистрировано на 85-90 %. Результаты показали, что введение
в рацион крыс экстрактов растений снижает содержание ТБК-активных
продуктов в микросомах печени. Снижение уровня продуктов перекисного
окисления липидов указывает на то, что растительные экстракты обладают
антиоксидантными свойствами и могут обеспечивать защиту органа от высокой
концентрации свободных радикалов, образующихся под действием
гепатотоксических препаратов [206].
128
3.7 Метаболический анализ методом ВЭЖХ-MC (фингерпринтинг)
исследуемых растений и субстанций на их основе
Для стандартизации полученных из растений экстрактов нами был
проведен компонентный анализ методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии с целью установления взаимосвязи состава и количественного
накопления веществ различной природы в исследуемых растениях.
Предварительно был отработана методика наилучшего разделения при
использовании УФ-лампы различных длин волн (220 и 276 нм) для
детектирования и данных масс-спектрометрии как характеристичных величин
соединений. В качестве стандартов использовались все выделенные маркеры
веществ, чтобы выявить закономерности их выхода по времени удерживания.
Так было определено, что основную часть присутствующих в растениях
веществ
составляют
полифенольные
соединения.
Метаболическое
исследование растений рода Limonium привело к выделению и идентификации
галловой кислоты, мирицетина, его производных и гликозидов. Это первое
сравнительное изучение соединений данного рода методом ВЭЖХ-МС. Так,
мирицетин и мирицитрин (3-рамнозид мирицетина) были обнаружены во всех
исследуемых видах растений. Галловая кислота и мирицетин-3-О-α-Lарабинопиранозид найдены в видах L. gmelinii, L. myrianthum и L. leptophyllum,
а мирицетин-3-О-β-D-глюкопиранозид – L. gmelinii, L. myrianthum и L. caspium,
соответственно. Следующие 12 веществ: β-ситостерол-β-D-глюкозид-6монолинолениат,
дигидромирицетин-3-O-рамнозид,
мирицетин-3-галлат
(2R,3R)-3,5,7,3´,4´-пентагидроксифлаванонол-3-O-(3´´-галлоил)-α-L-рамнозид,
тример таранинин, 3´,4´,5,5´,7-пентагидроксифлаванон, кемпферол-3-галлат,
флоридзин, тирамин, изокумарин бергенин, димер геранин А и aнтрахинон
франгулаэмодин никогда не сообщались выделенными из рода Limonium.
Соединения
3-О-β-D-(6´´-галлоил)-глюкопиранозид
мирицетина,
эпигаллокатехин-3-О-галлат и 3,5,7,3',4',6'-гексагидроксифлавон были ранее
определены в видах L. gmelinii, L. myrianthum [207]. Разделение надземной
части растения вида L. caspium на метаболиты осуществлено впервые, только
корни были исследованы в 1996 году [208]. Таким образом, было высказано
предположение, что флавоноиды, в частности мирицетин и его гликозиды
могут быть использованы в качестве хемотаксономических маркеров рода
Limonium. Различные формы олигомерных проантоцианидинов и производных
дигидромирицетина также были обнаружены в некоторых видах,
принадлежащих данному роду, и как обширные классы соединений могут
обеспечить связь между проявляемыми активностями растений рода в целом и
с точки зрения химического строения. Проантоцианидины, как и производные
дигидромирицетина, характеризуются С6-С3-С6-флавоноидным скелетом,
типичным для флаван-3-олов, с наиболее распространенным замещением
3´,4´,5´-тригидрокси или 3´,4´-дигидрокси групп кольца В. Связываются
катехиновые единицы, относящиеся к типам А, В и С, в основном через 4-е, 8-е,
7-е и 2-е положения углеродных атомов. Кроме того, производные мирицетина,
выявленные во всех видах рода Limonium Mill, следуют аналогичной схеме
гликозилирования, так большинство из них гликозилированы по связи С-3
129
наиболее распространенными сахарами, такими как глюкоза, рамноза,
галактоза и арабиноза, иногда присоединенные остатком галловой кислоты.
Следовательно, флавоноиды, встречающиеся в исследуемых растениях,
представлены в свободном виде (агликоны), в виде алкилированных,
сульфатных производных и гликозидов. Важнейшим аспектом проявления
биологической активности любого препарата является его биодоступность [209].
Мирицетин – это широко известный флавонол, который наряду с
глизозидированными
формами
отличается
антиоксидантными,
сосудоукрепляющими,
притовомикробными,
антидиабетическими
и
противораковыми свойствами. В медицине их часто применяют в комплексе с
другими БАВ для увеличения биологического спектра и эффективности
действия. При этом они проявляют минимальный кумулятивный эффект, не
отличаются особой токсичностью и не вызывают аллергенных свойств, что
связано с количеством и позицией в структуре гидроксильных групп.
Флавоноиды хорошо окисляются, а значит, могут принимать участие в
окислительно-восстановительных процессах, и как следствие, проявлять
значительную противоопухолевую активность. За счет достаточной
стабильности и высокого сродства к внутренним системам организма
полифенольные соединения по праву считаются наиболее биодоступными.
Итак, в силу прогресса материально-технической обеспеченности и
интенсивно развивающегося приборостроения ярко проявляется потребность в
унификации методов анализа природных метаболитов. Помимо эффективности,
достоверности и воспроизводимости методики, сегодня необходимо также
учитывать такие аспекты, как экспрессность и системность исследования. На
сегодняшний день существенной сложностью в организации такого рода
экспериментов является невозможность создания единого технологического
способа стандартизации различных метаболитов из биологических объектов.
Это связано, прежде всего, с изменчивостью в накоплении природных
соединений в зависимости от многих факторов, а также их биологических
функций в связи с принадлежностью к тем или иным классам химических
молекул. Метаболический анализ проводился при 254, 210 и 280 нм, с целью
выявления составных частей многокомпонентных смесей экстрактов надземной
части и корней растений видов L. gmelinii и L. myrianthum (приложение Л).
Метаболический фингерпринтинг подразумевает собой структурный
отпечаток вещества, который предоставляет возможность детекции продуктов
метаболизма без привязки к концентрации, т.е. по сути, классификация биопроб
на основе шаблонов с количественными характеристиками входящих в них
вторичных метаболитов [210]. Метод ВЭЖХ-МС является одним из наиболее
успешно применяемых в метаболическом фингерпринтинге при исследовании
различных биологических объектов разнообразной направленности. При
данном способе после разделения метаболитов жидкостной хроматографией
осуществляется их фрагментация для структурного анализа и идентификации,
что увеличивает информативность и диапазон детекции. Высокая
селективность и чувствительность делают метаболомику идеальным средством
анализа живых систем посредством биомаркеров, что предполагает собой явное
130
преимущество в клинических испытаниях. Прототипы же выявленных
шаблонов за счет их максимального приближения к фенотипам представляются
неотъемлемым арсеналом практической медицины. В процессе анализа, как
видно из рисунков 63-66, длина волны в 210 нм показала лучшее разделение на
компоненты, а при 280 нм более высокое количественное содержание, поэтому
оптимальной выбрана длина волны, равная 254 нм. При этом все
исследованные растения демонстрируют следующие закономерности: пики до 5
минут соответствуют различным фенольным кислотам простого строения,
далее в области от 5 до 15 минут проявляются флавоноиды (агликоны и их
гликозиды соответственно), а после 15 минут уже прописываются их
олигомерные формы – проантоцианидины. Таким образом, по полученным
спектрам (приложение Л) можно заключить, что надземная часть и корни как L.
gmelinii, так и L.myrianthum содержат ряд фенольных кислот, что
подтверждается идентифицированной во всех изучаемых видах галловой
кислотой. В области 5-15 минут обнаруживается огромное количество пиков,
что
также
подкреплено
данными
фитохимического
анализа,
свидетельствующего о присутствии большого числа различных структурных
флавоноидов. При этом самым разнообразным составом обладает надземная
часть вида L.myrianthum (приложение Л, рисунок Л1), а самым бедным
соответственно – L.gmelinii (приложение Л, рисунок Л2), которая, однако,
показывает большее наличие проантоцианидинов в сравнении с корнями этого
вида (приложение Л, рисунок Л3). Состав корней L.myrianthum аналогичен его
надземной части, за исключением сравнительно меньшего количественного
содержания флавоноидов и более высокого олигомерных форм (приложение Л,
рисунок Л4). Это объясняется способностью растений накапливать те или иные
классы веществ в различных частях для поддержания оптимального баланса,
обеспечивающего максимальную защиту и рост. В нашем случае L.myrianthum
был собран в фазу цветения, поэтому обнаружен высокий процент
флавоноидов, а L.gmelinii – в фазу относительного покоя, когда корни уже
накапливают полезные компоненты на зиму.
Такой подход в анализе метаболитов растений может быть использован
для сравнения групп образцов, выявления существенных различий в
концентрации обеспечивать основу для последующей сегрегации групп.
131
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании результатов проведенного диссертационного исследования
можно сделать следующие выводы:
1. Подтверждена доброкачественность исследуемых четырех видов
растений (L. gmelinii, L. myrianthum, L. leptophyllum, L. caspium) рода Limonium.
2. Установлен качественный и количественный состав эфирных масел,
жирных кислот, витаминов и полифенолов в изучаемых видах растений.
3. Надземная часть растений вида L. gmelinii внедрена в медицину, введена
в Государственный реестр лекарственных средств РК и ГФ РК.
4. Для исследуемых растений в лабораторных условиях отработаны
оптимальные параметры извлечения из них субстанций и установлены
показатели их качества в соответствии с нормативными требованиями.
5. На базе ФК «Ромат» из надземной части вида L.gmelinii получены три
серии опытно-промышленных партий субстанции, в соответствии с которыми
на нее разработаны и утверждены нормативные документы На основании
доклинического исследования выделенной субстанции в НЦЭЛС МЗСР РК
получено заключение о безопасности ее использования, ввиду принадлежности
к V классу токсичности, т.е. к группе нетоксичных препаратов.
6. Проведено разделение комплексов БАВ исследуемых субстанций на
индивидуальные вещества, при этом идентифицированы 44 соединения. Из
растений вида L. caspium и L. leptophyllum выделены шесть новых, ранее
неописанных в литературе соединений: 2-метил-эритритол-галлат, 3-метил-бут3-ен-1-ил-4-О-α-L-рамнопиранозил-β-D-глюкопиранозид, дигидромирицетин3`-О-сульфат,
(2S,3S)-5-метилдигидромирицетин-3`-О-сульфат,
(2S,3S)-5метилдигидромирицетин и мирицетин-3`-О-сульфат; из растений вида L.
myrianthum, выделены четыре вещества: 1,2-бис-(4,4´-фенил)-этан, 1,3-бис(4,4´-фенил)-пропан, 1,3-бис-(4,4´-фенил)-пропан-2-ол и цис-2-октил-3-пентилоксиран, которые ранее были получены только синтетическим путем; 12
соединений были выделены впервые из исследуемых видов растений рода
Limonium:
β-ситостерол-β-D-глюкозид-6-монолинолениат,
таранинин,
флоридзин, тирамин, дигидромирицетин-3-O-рамнозид, (2R,3R)-3,5,7,3´,4´пентагидроксифлаванонол-3-O-(3´´-галлоил)-α-L-рамнозид,
кемпферол-3галлат, бергенин, мирицетин-3-галлат, 3´,4´,5,5´,7-пентагидроксифлаванон,
геранин А и франгулаэмодин. Для установления систематической
классификации рода Limonium методом фингерпринтинг были выявлены его
хемотаксономические маркеры.
7. Для галловой кислоты, мирицетина, 3-О-β-D-(3´´-галлоил)глюкопиранозид
мирицетина,
3-О-β-D-(6´´-галлоил)-глюкопиранозид
мирицетина и мирицетин-3-О-α-L-арабинопиранозида выявлены высокая
антипротозойная, противогрибковая, антибактериальная и противораковая
активности, а для тирамина – высокое противомалярийное действие. Впервые
проведено компьютерное моделирование и определены закономерности
взаимодействия выделенных соединений с опиоидными рецепторами для
создания болеутоляющих лекарств нового поколения.
132
Оценка полноты решения поставленных исследовательских задач.
Задачи, поставленные для достижения цели диссертационной работы,
решены полностью. Так, все виды растений (L. myrianthum, L.gmelinii,
L.leptophyllum, L. caspium), используемые в исследовании, были изучены на их
соответствие качеству лекарственного сырья согласно требуемым нормам.
Определен качественный и количественный состав эфирных масел, жирных
кислот, витаминов и полифенолов. Разработаны рациональные технологические
схемы получения субстанций в виде комплекса БАВ из исследуемых растений.
Отработаны оптимальные технологические параметры извлечения субстанции
из надземной части растений вида L. gmelinii в опытно-промышленных
условиях ФК «Ромат». Надземная часть растений вида L. gmelinii внедрена в
медицину, введена в Государственный реестр лекарственных средств РК и
Государственную Фармакопею РК. Проведено разделение комплекса БАВ
полученных субстанций на индивидуальные соединения. Для стандартизации
субстанций выполнена идентификация выделенных из них индивидуальных
веществ комплексом физико-химических методов анализа. Осуществлен
биоскрининг активностей исследуемых препаратов для их применения в
качестве активного начала лекарственных средств отечественной медицины.
Рекомендации по разработке исходных данных для конкретного
применения результатов.
Стандартизация и контроль качества растительных субстанций является
важным аспектом, особенно, когда они используются в лечебных целях.
Следовательно, развитие быстрых и эффективных аналитических методов для
их метаболического анализа представляет большой интерес. Так как ряд
вторичных метаболитов (гликозидированные формы флавоноидов, галловая
кислота и другие) был обнаружен во всех исследованных видах растений рода
Limonium, некоторые из идентифицированных соединений, могут служить
хемотаксономическими маркерами других видов растений данного рода.
Данное заключение также подтверждено в процессе установлении
систематической классификации с использованием новейшего и интенсивно
развивающегося метода анализа биологических объектов – фингерпринтинга.
т.е. по своей сути сравнительной оценке шаблонов, формируемых различными
характеристиками, выявленными при разделении биопроб. Эти закономерности
наряду с требованиями, предъявляемыми к показателям качества, позволят
осуществлять стандартизацию сырья и выделенных веществ в условиях GMP,
что является в настоящее время необходимым фактором при производстве
фармацевтических препаратов.
Растения вида L. gmelinii зарегистрированы на территории Республики
Казахстан и введены в Государственную Фармакопею нашей страны. Базируясь
на полученные в ходе исследования показатели биологической активности,
целесообразно осуществить внедрение и других видов изучаемого рода,
например L.myrianthum, L. leptophyllum, как перспективных источников для
получения отечественных импортозамещающих лекарственных средств.
Благодаря огромному количеству разнообразных структур, большой
распространенности и обширному спектру различных биологических
133
активностей флавоноидные соединения, широко представленные в
исследуемых субстанциях, могут быть главной мишенью для исследования
фармакологической терапии новых заболеваний. Исходя из вышесказанного,
для поиска новых лекарств-блокаторов боли, как наиболее востребованных на
сегодняшний день в практической медицине, было проведено компьютерное
моделирование взаимодействия ряда выделенных индивидуальных веществ с
опиоидными рецепторами.
Таким образом, проведенный цикл работ может рассматриваться в
качестве фундамента для проведения последующих теоретических и
практических изысканий в исследуемой области с целью поиска
потенциальных видов растений и созданию лекарств на их основе.
Оценка технико-экономической эффективности внедрения и научного
уровня выполненной работы в сравнении с лучшими достижениями в
данной области.
Впервые надземная часть растений L. gmelinii внедрена в медицину,
введена в Государственный реестр лекарственных средств РК и ГФ РК.
Комплексное использование растительного сырья, наряду с корнями,
введенными в ГФ РК в 2009 году, является более рациональным для
сохранения отечественной флоры при производстве отечественных
высокоэффективных оригинальных лекарственных средств. Для получаемой из
надземной части растений L. gmelinii субстанции в ФК «Ромат» составлены и
утверждены технологическая схема ее производства, ВАНД, данные по
стабильности с сохранением всех показателей ее качества на
регламентируемый срок хранения. По ряду активностей получаемая субстанция
превосходит внедренную ранее в медицину субстанцию «Лимонидин» на
основе корней. Проведена стандартизация субстанций, выделяемых из
исследуемых растений. Установление тонких структур всех индивидуальных
веществ, выделенных из субстанций исследуемых растений, проведение их
биологических испытаний осуществлялось комплексом стандартизированных
физико-химических методов анализа с применением современных приборов и
оборудования последнего поколения на базе аккредитованной лаборатории
Национального центра исследования природных соединений, США.
Обзор литературы и экспериментальные данные суммируют результаты,
касающиеся исследования химического состава и фармакологического
действия для растений рода Limonium Mill за последние годы.
Выделенные новые соединения пополнят мировой банк данных впервые
идентифицированных органических веществ.
Результаты проведенных научных исследований внедрены в элективную
дисциплину магистров 2 курса специальности 6М072100 – «Химическая
технология органических веществ»: «Научные основы организации
производства лекарственных форм на базе растительного лекарственного
сырья».
Полученные
данные
доказывают
перспективность
применения
исследованных растений рода Limonium Mill в условиях развивающейся
фармацевтической промышленности Казахстана.
134
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1 Введение в фитохимические исследования и выявление биологической
активности веществ растений /под ред. Мамонова Л.К. и Музычкиной Р.А. –
Алматы: «Школа XXI века», 2008. – 216 с.
2 Hill A.E. Ion and water transport in limonium: I. Active transport by the leaf
gland cells //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. – 1967. –
Vol. 135, № 3. – P. 454-460.
3 Chaung, S.S., Lin C.C., Lin J., Yu K.H., Hsu Y.F., and Yen M.H. The
hepatoprotective effects of Limonium sinense against carbon tetrachloride and
β‐D‐galactosamine intoxication in rats //Phytotherapy Research. – 2003. – Vol. 17,
№ 7. – P. 784-791.
4 Yamashiro S., Noguchi K., Matsuzaki T., Miyagi K., Nakasone J., Sakanashi
M., Sakanashi M., Kukita I., Aniya Y., Sakanashi M. Cardioprotective effects of
extracts from Psidium guajava L. and Limonium wrightii, Okinawan medicinal
plants, against ischemia-reperfusion injury in perfused rat hearts //Pharmacology. –
2003. – Vol. 67, № 3. – P. 128-135.
5 Жусупова Г.E. Химический состав растений рода Limonium Mill и
создание препаратов на их основе: автореф. дисс. … док. хим. наук: 02.00.10. –
Алматы: КазНУ, 2007. – 36 с.
6 Medini F., Fellah H., Ksouri R., and Abdelly C. Total phenolic, flavonoid and
tannin contents and antioxidant and antimicrobial activities of organic extracts of
shoots of the plant Limonium delicatulum //Journal of Taibah University for Science.
– 2014. – Vol. 8, № 3. – P. 216-224.
7 Tang X., Shen M. Research Advancement of the Chemical Components and
Pharmacological Action for the Plants of Limonium Mill.[J] //Lishizhen Medicine
and Materia Medica Research. – 2007. – Vol. 8, № 18. – P. 1874-1876.
8 Жусупова Г.Е., Абилов Ж.А., Рахимов К.Д. Способ получения
суммарного полифенольного комплекса из корней кермека Гмелина //Патент №
14418 РК от 15.10.07 - 5 с.
9 Жусупова Г.Е., Пучкина Л.Н., Тулегенова А.У. Суппозитории
“Лимонидин”, обладающие ранозаживляющим, противовоспалительным,
антимикробным действием //Патент № 20484 РК от 15.12.08 - 3 с.
10 Жусупова Г.Е., Пучкина Л.Н., Тулегенова А.У. Капсулы “Лимонидин”,
обладающие гепатопротекторным действием //Патент № 20298 РК от 17.11.08.
11 Zhusupova G. et al. Phytopreparations from the Species of Limonium Mill
//Biodiversity. – Springer US, 2002. – P. 367-369.
12 Ташенов А.C. Перспективы развития фармацевтического рынка
Единого экономического пространства //Евразийская Экономическая
Интеграция. – 2014. – Т. 23, № 2. – С.75-84.
13 Hameed A., Khan M. A. Halophytes: biology and economic potentials
//Karachi University Journal of Science. – 2011. – Vol. 39, № 1. – P. 40-44.
14 Кожамкулова Ж.А., Биологически активные вещества растений
Limonium gmelinii, Limonium myrianthum и Halimodendron halоdendron и
фитопрепараты на их основе: дисс. … Ph.D. – Алматы: КазНУ, 2011. – 125 с.
135
15 Korul’kina L.M., Shul’ts E.E., Zhusupova G.E., Abilov Z.A., Erzhanov K.B.,
and Chaudri M.I.Biologically active compounds from Limonium gmelinii and L.
Popovii I //Chemistry of natural compounds. – 2004. – Vol. 40, № 5. – P. 465-471.
16 Lin L.P., Chou P. J. Flavonoids and phenolics from Limonium sinense
//Planta medica. – 2000. – Vol. 66, № 4. – P. 382-383.
17 Kandil F.E., Ahmed K.M., Hussieny H.A., and Soliman A.M. A new
flavonoid from Limonium axillare //Archiv der Pharmazie. – 2000. – Vol. 333, № 8.
– P. 275-277.
18 Bashir A.K., Abdalla A.A., Wasfi I.A., Hassan E.S., Amiri M.H., and Crabb
T.A. Flavonoids of Limonium axillare //International journal of pharmacognosy. –
1994. – Vol. 32, № 4. – P. 366-372.
19 Ross S.A. Myricetin-3'-methyl Ether-7-glucoside from Limonium sinuatum
//Journal of Natural Products. – 1984. – Vol. 47, № 5. – P. 862-864.
20 Рощина В.Д., Рощина В.В. Выделительная функция высших растений. –
М.: Наука, 1989. – 214 c.
21 Arisz W.H., Camphuis I.J., Heikens H., and Tooren A.V. The secretion of the
salt glands of Limonium latifolium Ktze //Acta botánica neerlandica. – 1955. – Vol. 4,
№ 3. – P. 322-338.
22 Павлов Н.В. Растительное сырье Казахстана. – Москва–Ленинград: Издво АН СССР, 1947. – 551 c.
23 Байтенов М.С.Флора Казахстана: родовой комплекс флоры: в 2-х т –
Алматы: Гылым, 2001. – Т. 2.– 280 с.
24 Bouftira I., Al Hajari S., Abdelly C., and Sfar S. Antioxidative and free
radical of Limonium axillare from Qatarian coasts //WebmedCentral: Pharmaceutical
Sciences. – 2010. –Vol. 1, №9. – P. 1-11.
25 Saidana D., Boussaada O., Ayed F., Mahjoub M.A., Mighri Z., and Helal
A.N. The in vitro free radical-scavenging and antifungal activities of the medicinal
herb Limonium echiodes L. growing wild in Tunisia //Journal of Food Processing and
Preservation. – 2013. – Vol. 37, № 5. – P. 533-540.
26 Murray A.P., Rodriguez S., Frontera M.A., Tomas M.A., and Mulet M.C.
Antioxidant metabolites from Limonium brasiliense (Boiss.) Kuntze //Zeitschrift für
Naturforschung P. – 2004. – Vol. 59, № 7-8. – P. 477-480.
27 Aniya Y., Miyagi C., Nakandakari A., Kamiya S., Imaizumi N., and Ichiba
T. Free radical scavenging action of the medicinal herb Limonium wrightii from the
Okinawa islands //Phytomedicine. – 2002. – Vol. 9, № 3. – P. 239-244.
28 Kuo Y.C., Lin L.C., Tsai W.J., Chou C.J., Kung S.H., and Ho Y.H.
Samarangenin B from Limonium sinense suppresses herpes simplex virus type 1
replication in Vero cells by regulation of viral macromolecular synthesis
//Antimicrobial agents and chemotherapy. – 2002. – Vol. 46, № 9. – P. 2854-2864.
29 Im Lee J., Kong C.S., Jung M.E., Hong J.W., Lim S.Y., and Seo Y.
Antioxidant activity of the halophyte Limonium tetragonum and its major active
components //Biotech. and Bioprocess Engineering. – 2011. – Vol. 16, № 5. –
P. 992-999.
30 Sakagami Y., Murata H., Nakanishi T., Inatomi Y., Watabe K., Iinuma M.,
Tanaka T., Murata J., and Lang F.A. Inhibitory Effect of Plant Extracts on Production
136
of Verotoxin by Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 //Journal of Health
Science. – 2001. – Vol. 47, № 5. – P. 473-477.
31 de Paiva S.R., da Silva Marques S., Figueiredo M.R., and Kaplan M.A.C.
Plumbaginales: A pharmacological approach //Florestae Ambiente. – 2003. – Vol. 10.
– P. 98.
32 Borchardt J.K. The beginnings of drug therapy: Ancient mesopotamian
medicine //Drug News Perspect. – 2002. – Vol. 15, № 3. – P. 187-192.
33 Borchardt J.K. Traditional Chinese drug therapy //Drug News Perspect. –
2003. – Vol. 16, № 10. – P. 698.
34 Diaz J.L. Ethnopharmacology of sacred psychoactive plants used by the
Indians of Mexico //Annual review of pharmacology and toxicology. – 1977. – Vol.
17, № 1. – P. 647-675.
35 Hofmann A. Teonanácatl and Ololiuqui, two ancient magic drugs of Mexico.
//Bulletin on Narcotics. – 1971. – Issue 1. – P. 3-14.
36 Rhizopoulou S., Katsarou A. The plant material of medicine //Adv. Nat.
Appl. Sci. – 2008. – Vol. 2. – P. 94-98.
37 World Health Organization (WHO). Traditional Medicine. – Geneva: WHO
Media center, 2003. – Fact Sheet № 134.
38 Barnes P.M., Bloom B., and Nahin R.L.Complementary and alternative
medicine use among adults and children //Natl Health Stat Report. – 2008. – Vol. 10,
№ 12. – P. 1-23.
39 Strohl W.R. The role of natural products in a modern drug discovery program
//Drug discovery today. – 2000. – Vol. 5, № 2. – P. 39-41.
40 Mishra B.B., Tiwari V.K. Natural products: an evolving role in future drug
discovery //European journal of medicinal chemistry. – 2011. – Vol. 46, № 10. –
P. 4769-4807.
41 Vainio H., Morgan G. Aspirin for the second hundred years: new uses for an
old drug //Pharmacology and toxicology. – 1997. – Vol. 81, № 4. – P. 151-152.
42 Sneader W. The discovery of aspirin: a reappraisal //BMJ: British Medical
Journal. – 2000. – Vol. 321, № 7276. – P. 1591.
43 Rishton G.M. Natural products as a robust source of new drugs and drug
leads: past successes and present day issues //The American journal of cardiology. –
2008. – Vol. 101, № 10. – P. S43-S49.
44 Foye W.O. Foye's principles of medicinal chemistry, 6th ed. – Lippincott
Williams and Wilkins, 2008. – 1377 р.
45 Aldrich J.V.; Vigil-Cruz S.P. Narcotic Analgesics. //Burger's Medicinal
Chemistry and Drug Discovery, 6th ed. Edited by Abraham D. A. – New York: John
Wiley and Sons, Inс, 2003. – Vol. 6. – P. 329-482.
46 McCurdy P.R.; Prisinzano T.E. Opioid Receptor Ligands. //Burger's
Medicinal Chemistry, Drug Discovery, and Development, 7th ed. Edited by Abraham
D.A., Rotella D.P. – John Wiley and Sons, Inс, 2010. – Vol 8. – P 569–736.
47 Gulland J.M., Robinson R. CXII.—The morphine group. Part I. A discussion
of the constitutional problem //Journal of the Chemical Society, Transactions. – 1923.
– Vol. 123. – P. 980-998.
137
48 Gulland J.M., Robinson R. CXIII.—The morphine group. Part II.
Thebainone, thebainol, and dihydrothebainone //Journal of the Chemical Society,
Transactions. – 1923. – Vol. 123. – P. 998-1011.
49 Gulland J.M., Robinson R. Constitution of codeine and thebaine //Mem Proc
Manchester Lit Phil SoP. – 1925. – Vol. 69. – P. 79-86.
50 Newman D.J., Cragg G.M. Natural products as sources of new drugs over the
30 years from 1981 to 2010 //Journal of natural products. – 2012. – Vol. 75, № 3. –
P. 311-335.
51 Mitscher L.A. Coevolution: Mankind and Microbes //Journal of natural
products. – 2008. – Vol. 71, № 3. – P. 497-509.
52 Fleming A. On the antibacterial action of cultures of a penicillium, with
special reference to their use in the isolation of B. influenzae //British journal of
experimental pathology. – 1929. – Vol. 10, № 3. – P. 226.
53 Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Achievements in Public
Health, 1900-1999: Control of Infectious Diseases //MMWR weekly. – 1999. –
Vol. 48, № 29. – P. 621-629.
54 Beuchat L.R. Antimicrobial properties of spices and their essential oils
//Natural antimicrobial systems and food preservation. Edited by Dillon Y. M., Board
R. G. – CAB International, Oxon, 1994. – P. 167-179.
55 Kinsella J.E., Frankel E., German B., and Kanner J. Possible mechanisms for
the protective role of antioxidants in wine and plant foods //Food technology. – 1993.
– Vol.47, № 4. – P. 85-89.
56 Terao J. Flavonoids as inhibitors of lipid peroxidation in membranes
//Flavonoids in health and disease. – 1997. – P. 277-293.
57 Pulido R., Bravo L., Saura-Calixto F. Antioxidant activity of dietary
polyphenols as determined by a modified ferric reducing/antioxidant power assay
//Journal of Agricultural and Food Chem. – 2000. – Vol. 48, № 8. – P. 3396-3402.
58 Silberberg M., Gil-Izquierdo A., Combaret L., Remesy C., Scalbert A., and
Morand C. Flavanone metabolism in healthy and tumor-bearing rats //Biomedicine
and pharmacotherapy. – 2006. – Vol. 60, № 9. – P. 529-535.
59 Benavente-Garcia O., Castillo J. Update on uses and properties of citrus
flavonoids: new findings in anticancer, cardiovascular, and anti-inflammatory activity
//Journal of Agricultural and Food chem. – 2008. – Vol. 56, № 15. – P. 6185-6205.
60 Hodek P., Trefil P., Stiborová M. Flavonoids-potent and versatile
biologically active compounds interacting with cytochromes P450 //Chemicobiological interactions. – 2002. – Vol. 139, № 1. – P. 1-21.
61 Jaganath I. B. and Crozier A. Flavonoid Biosynthesis //Plant metabolism and
biotechnology. Edited by Ashihara H., Crozier A., Komamine A. – Wiley, 2011. –
Chapter 11. – P. 293–320.
62 Lovell K.M., Simpson D.S., Cunningham C.W., and Prisinzano T.E.
Utilizing nature as a source of new probes for opioid pharmacology //Future
medicinal chemistry. – 2009. – Vol. 1, № 2. – P. 285-301.
63 Pietta P.G. Flavonoids as antioxidants //Journal of natural products. – 2000. –
Vol. 63, № 7. – P. 1035-1042.
64 Harborne J.B., Williams P. A. Advances in flavonoid research since 1992
138
//Phytochemistry. – 2000. – Vol. 55, № 6. – P. 481-504.
65 Kummer V., Maskova J., Canderle J., Zraly Z., Neca J., and Machala M.
Estrogenic effects of silymarin in ovariectomized rats //VETERINARNI
MEDICINA-PRAHA-. – 2001. – Vol. 46, № 1. – P. 17-23.
66 Pappagallo M. Incidence, prevalence, and management of opioid bowel
dysfunction // AM J SURG. – 2001. – Vol. 182, № 5. – P. S11-S18.
67 Prisinzano T., Gebhart G.F. Pain Overview //Comprehensive Medicinal
Chemistry II. Edited by Taylor J. B., Triggle D. J. – Elsevier Science Ltd, 2007. –
Vol. 6. – P. 321-326.
68 Kivell B., Prisinzano T. E. Kappa opioids and the modulation of pain
//Psychopharmacology. – 2010. – Vol. 210, № 2. – P. 109-119.
69 Foss J.F. A review of the potential role of methylnaltrexone in opioid bowel
dysfunction // AM J SURG. – 2001. – Vol. 182, № 5. – P. S19-S26.
70 Friedman J.D., Buono F.A. D. Opioid antagonists in the treatment of opioidinduced constipation and pruritus //Annals of Pharmacotherapy. – 2001. – Vol. 35,
№ 1. – P. 85-91.
71 Cherny N.I. Opioid analgesics: comparative features and prescribing
guidelines //Drugs. – 1996. Vol. 51, № 5. – P. 713-737.
72 Gutstein H.B. et al. Opioid analgesics //Goodman and Gilman's The
Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. Edited by Hardman J.G., Limbird
L.E., Gilman A.G. – New York, McGraw-Hill, 2001. – P. 569-620.
73 Savage S.R., Joranson D.E., Covington E.C., Schnoll S.H., Heit H.A., and
Gilson A.M. Definitions related to the use of opioids for the treatment of pain
//Consensus Document from the American Academy of Pain Medicine, American
Pain Society, American Society of Addiction Medicine. – 2001.
74 Smith H.S. Opioids: maximizing efficacy, minimizing adverse effects
//Therapy. – 2009. – Vol. 6, № 5. – P. 629-631.
75 Chou R., Fanciullo G.J., Fine P.G., Adler J.A., Ballantyne J.C., Davies P.,
Donovan M.I., Fishbain D.A., Foley K.M., Fudin J., Gilson A.M., Kelter A.,
Mauskop A., O'Connor P.G., Passik S.D., Pasternak G.W., Portenoy R.K., Rich B.A.,
Roberts R.G., Todd K.H., and Miaskowski C. Clinical guidelines for the use of
chronic opioid therapy in chronic noncancer pain //The Journal of Pain. – 2009. –
Vol. 10, № 2. – С. 113-130.
76 Corbett A.D., Henderson G., McKnight A.T., and Paterson S.J. 75 years of
opioid research: the exciting but vain quest for the Holy Grail //British journal of
pharmacology. – 2006. – Vol. 147, № S1. – P. S153-S162.
77 Knapp R.J., Malatynska E., Collins N., Fang L., Wang J.Y., Hruby V.J.,
Roesee W.R., and Yamamura H.I. Molecular biology and pharmacology of cloned
opioid receptors //The FASEB Journal. – 1995. – Vol. 9, № 7. – P. 516-525.
78 Satoh M., Minami M. Molecular pharmacology of the opioid receptors
//Pharmacology and therapeutics. – 1995. – Vol. 68, № 3. – P. 343-364.
79 Simon E.J., Hiller J.M. Opioid peptides and opioid receptors //Basic
neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 5th ed. Edited by Siegel G.
S., Agranoff B. W., Albers R. W., Molinoff P. B. – New York : Raven Press, 1994. –
P. 321-329.
139
80 Beckett A.H., Casy A.F. Synthetic analgesics: stereochemical considerations
//Journal of Pharmacy and Pharmacology. – 1954. – Vol. 6, № 1. – P. 986-1001.
81 Martin W.R. Opioid antagonists //Pharmacological Reviews. – 1967. –
Vol. 19, № 4. – P. 463-521.
82 Martin W., Eades C.G., Thompson J., Huppler R.E., and Gilbert P.E. The
effects of morphine-and nalorphine-like drugs in the nondependent and morphinedependent chronic spinal dog //Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics. – 1976. – Vol. 197, № 3. – P. 517-532.
83 Gilbert P.E., Martin W.R. The effects of morphine and nalorphine-like drugs
in the nondependent, morphine-dependent and cyclazocine-dependent chronic spinal
dog //Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. – 1976. – Vol. 198,
№ 1. – P. 66-82.
84 Lord J.A., Waterfield A.A., Hughes J., and Kosterlitz H.W. Endogenous
opioid peptides: multiple agonists and receptors //Nature. – 1977. – Vol. 267,
№ 5611. – P. 495-499.
85 Goldstein A., Lowney L.I., Pal B.K. Stereospecific and nonspecific
interactions of the morphine congener levorphanol in subcellular fractions of mouse
brain //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1971. – Vol. 68, № 8. –
P. 1742-1747.
86 Pert P.B., Snyder S.H. Opiate receptor: demonstration in nervous tissue
//Science. – 1973. – Vol. 179, № 4077. – P. 1011-1014.
87 Simon E.J., Hiller J.M., Edelman I. Stereospecific binding of the potent
narcotic analgesic [3H] etorphine to rat-brain homogenate //Proceedings of the
National Academy of Sciences. – 1973. – Vol. 70, № 7. – P. 1947-1949.
88 Terenius L. Stereospecific interaction between narcotic analgesics and a
synaptic plasma membrane fraction of rat cerebral cortex //Acta pharmacologica et
toxicologica. – 1973. – Vol. 32, № 3‐4. – P. 317-320.
89 Quirion R., Chicheportiche R., Contreras P.C., Johnson K.M., Lodge D.,
Tam S.W., Woods J.H., and Zukin S.R. Classification and nomenclature of
phencyclidine and sigma receptor sites //Trends in neurosciences. – 1987. – Vol. 10,
№ 11. – P. 444-446.
90 Mollereau C., Parmentier M., Mailleux P., Butour J.L., Moisand C., Chalon
P., Caput D., Vassart G., and Meunier J.C. ORL1, a novel member of the opioid
receptor family: cloning, functional expression and localization //FEBS letters. –
1994. – Т. 341. – №. 1. – С. 33-38.
91 Cox B.M. Opioid receptor-G protein interactions: acute and chronic effects
of opioids //Opioids I. Edited by Herz A., Akil H., Simon E. J. – Springer Berlin
Heidelberg, 1993. – Chapter 8. Vol. 104, № 1. – P. 145-188.
92 Childers S.R. Opioid receptor-coupled second messenger systems // Opioids
I. Edited by Herz A., Akil H., Simon E. J. – Springer Berlin Heidelberg, 1993. –
Chapter 9. Vol. 104, № 1. – P. 189-216.
93 Loh H.H., Smith A.P. Molecular characterization of opioid receptors
//Annual review of pharmacology and toxicology. – 1990. – Vol. 30, № 1. –
P. 123-147.
140
94 Fowler C.J., Fraser G.L. μ-, δ-, κ-Opioid receptors and their subtypes. A
critical review with emphasis on radioligand binding experiments //Neurochemistry
international. – 1994. – Vol. 24, №. 5 – P. 401-426.
95 Akil H. et al. Endogenous opioids: overview and current issues //Drug and
alcohol dependence. – 1998. – Vol. 51, № 1. – P. 127-140.
96 Victor C.Y., Sadée W. Phosphatidylinositol turnover in neuroblastoma cells:
regulation by bradykinin, acetylcholine, but not μ-and δ-opioid receptors
//Neuroscience letters. – 1986. – Vol. 71, № 2. – P. 219-223.
97 North R.A. Opioid actions on membrane ion channels //Opioids I. Edited by
Herz A., Akil H., Simon E.J. – Springer Berlin Heidelberg, 1993. – Chapter 30.
Vol. 104, № 1. – P. 773-797.
98 Wu B., Chien E.Y., Mol C.D., Fenalti G., Liu W., Katritch V., Abagyan R.,
Brooun A., Wells P., Bi F.C., Hamel D.J., Kuhn P., Handel T.M., Cherezov V., and
Stevens R.C. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and
cyclic peptide antagonists //Science. – 2010. – Vol. 330, № 6007. – P. 1066-1071.
99 Portoghese P.S., Larson D.L., Sayre L.M., Fries D.S., and Takemori A.E. A
novel opioid receptor site directed alkylating agent with irreversible narcotic
antagonistic and reversible agonistic activities //Journal of medicinal chemistry. –
1980. – Vol. 23, № 3. – P. 233-234.
100 Portoghese P.S., Sultana M., Takemori A.E. Naltrindole, a highly selective
and potent non-peptide δ opioid receptor antagonist //European journal of
pharmacology. – 1988. – Vol. 146, № 1. – P. 185-186.
101 Goto Y., Arai-Otsuki S., Tachibana Y., Ichikawa D., Ozaki S., Takahashi
H., Iwasawa Y., Okamoto O., Okuda S., Ohta H., and Sagara T. Identification of a
novel spiropiperidine opioid receptor-like 1 antagonist class by a focused library
approach featuring 3D-pharmacophore similarity //Journal of medicinal chemistry. –
2006. – Vol. 49, № 3. – P. 847-849.
102 Thomas J.B., Atkinson R.N., Rothman R.B., Fix S.E., Mascarella S.W.,
Vinson N.A., Xu H., Dersch C.M., Lu Y.-F., Cantrell B.E., Zimmerman D.M., and
Carroll F.I. Identification of the first trans-(3 R, 4 R)-dimethyl-4-(3-hydroxyphenyl)
piperidine derivative to possess highly potent and selective opioid κ receptor
antagonist activity //Journal of medicinal chemistry. – 2001. – Vol. 44, № 17. –
P. 2687-2690.
103 Cox B.M. Recent developments in the study of opioid receptors //Molecular
pharmacology. – 2013. – Vol. 83, № 4. – P. 723-728.
104 Granier S. et al. Structure of the δ-opioid receptor bound to naltrindole
//Nature. – 2012. – Vol. 485, № 7398. – P. 400-404.
105 Manglik A. et al. Crystal structure of the [micro]-opioid receptor bound to a
morphinan antagonist //Nature. – 2012. – Vol. 485, № 7398. – P. 321-326.
106 Thompson A.A., Liu W., Chun E., Katritch V., Wu H., Vardy E., Huang X.P., Trapella C., Guerrini R., Calo G., Roth B.L., Cherezov V., and Stevens, R.C.
Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic
//Nature. – 2012. – Vol. 485, № 7398. – P. 395-399.
107 Wu H., Wacker D., Mileni M., Katritch V., Han G.W., Vardy E., Liu W.,
Thompson A.A., Huang X.-P., Carroll F.I., Mascarella S.W., Westkaemper R.B.,
141
Mosier P.D., Roth B.L., Cherezov V., and Stevens R.C. Structure of the human [kgr]opioid receptor in complex with JDTic //Nature. – 2012. – Vol. 485, № 7398. –
P. 327-332.
108 Filmore D. It’s a GPCR world //Modern drug discovery. – 2004. – Vol. 7,
№ 11. – P. 24-28.
109 Chartoff E.H., Papadopoulou M., MacDonald M.L., Parsegian A., Potter D.,
Konradi C., and Carlezon W.A. Desipramine reduces stress-activated dynorphin
expression and CREB phosphorylation in NAc tissue //Molecular pharmacology. –
2009. – Vol. 75, № 3. – P. 704-712.
110 Mague S.D., Pliakas A.M., Todtenkopf M.S., Tomasiewicz H.C., Zhang Y.,
Stevens W.C., Jones R.M., Portoghese P.S., and Carlezon W.A. Antidepressant-like
effects of κ-opioid receptor antagonists in the forced swim test in rats //Journal of
Pharmacology and Experimental Therapeutics. – 2003. – Vol. 305, № 1. –
P. 323-330.
111 Spanagel R., Shippenberg T. S. Modulation of morphine-induced
sensitization by endogenous κ opioid systems in the rat //Neuroscience letters. –
1993. – Vol. 153, № 2. – P. 232-236.
112 Bruchas M.R., Yang T., Schreiber S., DeFino M., Kwan S.C., Li S., and
Chavkin C. Long-acting κ opioid antagonists disrupt receptor signaling and produce
noncompetitive effects by activating c-Jun N-terminal kinase //Journal of Biological
Chemistry. – 2007. – Vol. 282, № 41. – P. 29803-29811.
113 Melief E.J., Miyatake M., Carroll F.I., Beguin C., Carlezon W.A., Cohen
B.M., Grimwood S., Mitch C.H., Rorick-Kehn L., and Chavkin C. Duration of action
of a broad range of selective κ-opioid receptor antagonists is positively correlated
with c-Jun N-terminal kinase-1 activation //Molecular pharmacology. – 2011. – Vol.
80, № 5. – P. 920-929.
114 Katavic P.L., Lamb K., Navarro H., and Prisinzano T.E. Flavonoids as
opioid receptor ligands: identification and preliminary structure-activity relationships
//Journal of natural products. – 2007. – Vol. 70, № 8. – P. 1278-1282.
115 Головко А.И., Коноплин Д.А., и Некрасов Ю.А. Нейрохимия опиатной
наркомании //Нейрохимия. – 2000. – Т. 17, № 1. – P. 3-12.
116 Rezvani A.H., Overstreet D.H., Perfumi M., and Massi M. Plant derivatives
in the treatment of alcohol dependency //Pharmacology Biochemistry and Behavior. –
2003. – Vol. 75, № 3. – P. 593-606.
117 Overstreet D.H., Keung W.M., Rezvani A.H., Massi M., and Lee D.Y.
Herbal remedies for alcoholism: promises and possible pitfalls //Alcoholism: Clinical
and Experimental Research. – 2003. – Vol. 27, № 2. – P. 177-185.
118 Perfumi M., Santoni M., Cippitelli A., Ciccocioppo R., Froldi R., and Massi
M. Hypericum perforatum CO2 Extract and Opioid Receptor Antagonists Act
Synergistically to Reduce Ethanol Intake in Alcohol‐Preferring Rats //Alcoholism:
Clinical and Experimental Research. – 2003. – Vol. 27, № 10. – P. 1554-1562.
119 Simmen U., Schweitzer C., Burkard W., Schaffner W., and Lundstrom, K.
Hypericum perforatum inhibits the binding of μ-and κ-opioid receptor expressed with
the Semliki forest virus system //Pharmaceutica Acta Helvetiae. – 1998. – Vol. 73,
№ 1. – P. 53-56.
142
120 Simmen U., Burkard W., Berger K., Schaffner W., and Lundstrom K.
Extracts and constituents of Hypericum perforatum inhibit the binding of various
ligands to recombinant receptors expressed with the Semliki Forest virus system
//Journal of Receptors and Signal Transduction. – 1999. – Vol. 19, № 1-4. – P. 59-74.
121 Webster D.E., He Y., Chen S.N., Pauli G.F., Farnsworth N.R., and Wang
Z.J. Opioidergic mechanisms underlying the actions of Vitex agnus-castus L
//Biochemical pharmacology. – 2011. – Vol. 81, № 1. – P. 170-177.
122 Özkay Ü.D., Can Ö.D. Anti-nociceptive effect of vitexin mediated by the
opioid system in mice //Pharmacology Biochemistry and Behavior. – 2013. –
Vol. 109. – P. 23-30.
123 Поверин Д.И., Поверин А.Д., Технология промышленной переработки
лекарственного растительного сырья. – М.: Изд-во МСХА, 2001. – 208 c.
124 Rudall P.J. Anatomy of flowering plants: An introduction to structure and
development. - 3d ed. //Cambridge University Press, 2007. - 145 с.
125 Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г., Джалилова Х.Х., Ильина
Г.М., и Чубатова Н.В. Основы микро-технических исследований в ботанике
//Справочное руководство. - М.: Изд. каф. высших растений МГУ, 2000. - 127 с.
126 Кларк Э.Р., Эберхард К.Н. Микроскопические методы исследования
материалов. // М.: Техносфера, 2007. - 376 с.
127 Takhtajan A. Flowering plants. – Springer Science & Business Media,
2009. – 871 c.
128 Beck C.B. An introduction to plant structure and development: plant
anatomy for the twenty-first century. - 2nd ed. //Cambridge University Press, 2010. –
464 c.
129 Государственная Фармакопея Республики Казахстан. – Алматы:
Издательский дом «Жибек жолы», 2008. - Т. 1. – 592 с.
130 European pharmacopoeia. - 7th ed. // Strasbourg: European Department for
the Quality of Medicines, 2010. - Vol. 1. – 1297 pp.
131 Великанова Н.А., Кукуева Л.Л. Оценка радионуклидного загрязнения
лекарственного растительного сырья в г. Воронеж и его окрестностях
//Известия ВГПУ. – 2013. – Т. 260, №1. – С. 232-236.
132 Cicco N., Lanorte M.T., Paraggio M., Viggiano M., and Lattanzio V. A
reproducible, rapid and inexpensive Folin–Ciocalteu micro-method in determining
phenolics of plant methanol extracts //Microchemical journal. – 2009. – Vol. 91, № 1.
– P. 107-110.
133 Zhishen J., Mengcheng T., Jianming W. The determination of flavonoid
contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals //Food
chemistry. – 1999. – Vol. 64, № 4. – P. 555-559.
134 Zheljazkov V.D., Callahan A., Cantrell C.L. Yield and oil composition of
38 basil (Ocimum basilicum L.) accessions grown in Mississippi //Journal of
agricultural and food chemistry. – 2007. – Vol. 56, № 1. – P. 241-245.
135 Tabanca N., Bernier U.R., Tsilokia M., Becnel J.J., Sampson B., Werle C.,
Demirci B., Başer K.H.C., Eugene K. Blythe E.K., Pounders C., and Wedge D.E.
Eupatorium capillifolium essential oil: chemical composition, antifungal activity, and
143
insecticidal activity //Natural product communications. – 2010. – Vol. 5, № 9. –
P. 1409-1415.
136 Pridgeon J.W., Becnel J.J., Clark G.G., and Linthicum K.J. A highthroughput screening method to identify potential pesticides for mosquito control
//Journal of medical entomology. – 2009. – Vol. 46, № 2. – P. 335-341.
137 Bharate S.B., Khan S.I., Yunus N.A., Chauthe S.K., Jacob M.R., Tekwani
B.L., Khan I.A., and Singh I.P. Antiprotozoal and antimicrobial activities of Oalkylated and formylated acylphloroglucinols //Bioorganic & medicinal chemistry. –
2007. – Vol. 15, № 1. – P. 87-96.
138 Ma G., Khan S.I., Jacob M.R., Tekwani B.L., Li Z., Pasco D.S., Walker
L.A., and Khan I.A. Antimicrobial and antileishmanial activities of hypocrellins A
and B //Antimicrobial agents and chemotherapy. – 2004. – Vol. 48, № 11. –
P. 4450-4452.
139 Hamid R., Rotshteyn Y., Rabadi L., Parikh R., and Bullock P. Comparison
of alamar blue and MTT assays for high through-put screening //Toxicology in vitro.
– 2004. – Vol. 18, № 5. – P. 703-710.
140 Mikus J., Steverding D.A simple colorimetric method to screen drug
cytotoxicity against Leishmania using the dye Alamar Blue® //Parasitology
international. – 2000. – Vol. 48, № 3. – P. 265-269.
141 Makler M.T., Hinrichs D.J. Measurement of the lactate dehydrogenase
activity of Plasmodium falciparum as an assessment of parasitemia //The American
journal of tropical medicine and hygiene. – 1993. – Vol. 48, № 2. – P. 205-210.
142 Mustafa J., Khan S. I., Ma G., Walker L. A., and Khan I. A. Synthesis and
anticancer activities of fatty acid analogs of podophyllotoxin //Lipids. – 2004. –
Vol. 39, № 2. – P. 167-172.
143 Roper P.R., Drewinko B. Comparison of in vitro methods to determine
drug-induced cell lethality //Cancer Research. – 1976. – Vol. 36, № 7, Part 1. –
P. 2182-2188.
144 Конь И.Я., Горгошидзе Л.Ш., Васильева О.Н., Кулакова С.Н. Витамин
А и перекисное окисление липидов: влияние недостаточности ретинола
//Биохимия. – 1986. – Т. 51, № 1. – С. 70-75.
145 Ohkawa H.O., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal
tissues by thiobarbituric acid reaction //Analytical biochemistry. – 1979. – Vol. 95,
№ 2. – P. 351-358.
146 Ross R.A., Gibson T.M., Stevenson L.A., Saha B., Crocker P., Razdan
R.K., and Pertwee R.G.Structural determinants of the partial agonist‐inverse agonist
properties of 6′‐azidohex‐2′‐yne‐Δ8‐tetrahydrocannabinol at cannabinoid receptors
//British journal of pharmacology. – 1999. – Vol. 128, № 3. – P. 735-743.
147 León F., Gao J., Dale O.R., Wu Y., Habib E., Husni A.S., Hill R.A., and
Cutler S.J. Secondary metabolites from Eupenicillium parvum and their in vitro
binding affinity for human opioid and cannabinoid receptors //Planta medica. – 2013.
– Vol. 79, № 18. – P. 1756-1761.
148 Aydosova S.S., Zhussupova G.E., Akhtayeva N.Z., Gadetskaya A.V., and
Abilov Z.A. Macro-and microscopy of upper parts from Limonium gmelinii genus
144
plants //International journal of biology and chemistry. – 2012. – Vol. 3, №. 2. ––
С. 77-80.
149 Гадецкая А.В. Технологические параметры извлечения субстанций из
корней и надземной части растений Limonium myrianthum: дисс. … магистра
техники и технологии: 6М072100 – Алматы: КазНУ, 2012. – 100 с.
150 Zhusupova G.E., Artamonova N.A., Abilov Z.A. Fatty-acid composition of
roots of certain plant species of the genus Limonium. VIII //Chemistry of natural
compounds. – 2006. – Vol. 42, № 5. – P. 602-603.
151 Korul’kina L.M., Zhusupova G.E., Shul’ts E.E., and Erzhanov K.B. Fattyacid composition of two Limonium plant species //Chemistry of natural compounds. –
2004. – Vol. 40, № 5. – P. 417-419.
152 Zhusupova G.E., Artamonova N.A., Abilov Z.A., and Orazbaeva Z.K.
Lipophilic pigments and fatty acids from the aerial parts of certain plant species of
the genus Limonium. VII //Chemistry of natural compounds. – 2006. – Vol. 42,
№ 5. – P. 512-514.
153 Гадецкая А.В., Жусупова Г.Е., Росс С.А., Абилов Ж.А., Карева Л.В.,
Ибрашева Ж.О., Васильева Н.С. Применение отходов фитохимических
производств //II Всероссийская конференция c международным участием
"Актуальные вопросы химической технологии и защиты окружающей среды". –
Новочебоксарск, 2013. – С. 8-9.
154 A.V. Gadetskaya, G.E. Zhusupova, Zh.A. Abilov, S.A. Ross Chemical
composition of the volatile oil obtained from the aerial part of Limonium
myrianthum. //Xth International Symposium “Chemistry of Natural Compounds”. –
Bukhara, 2013. – P. 374.
155 A.V. Gadetskaya, G.E. Zhusupova, S.A. Ross Composition of the volatile
oil from aerial parts of Limonium genus //«Химический журнал Казахстана». –
2015. – Vol. 50, № 2. – P. 285-291.
156 Katritzky A.R., Wang Z., Slavov S., Tsikolia M., Dobchev D., Akhmedov
N.G., Hall C.H., Bernier U.R., Clark G.G., and Linthicum K.J. Synthesis and
bioassay of improved mosquito repellents predicted from chemical structure
//Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2008. – Vol. 105, № 21. – P.
7359-7364.
157 Petereit F., Kolodziej H., Nahrstedt A. Flavan-3-ols and proanthocyanidins
from Cistus incanus //Phytochemistry. – 1991. – Vol. 30, № 3. – P. 981-985.
158 Gottlieb H.E., Kumar S., Sahai M., and Ray A.B. Ethyl brevifolin
carboxylate from Flueggea microcarpa //Phytochemistry. – 1991. – Vol. 30, № 7. –
P. 2435-2438.
159 Kashiwada Y., Iizuka H., Yoshioka K., Chen R.-F., Nonaka G.-I., Nishioka
I.Tannins and related compounds. XCIII. Occurrence of enantiomeric
proanthocyanidins in the leguminosae plants, Cassia fistula L. and C. javanica L
//Chemical and Pharmaceutical Bulletin. – 1990. – Vol. 38, № 4. – P. 888-893.
160 Gadetskaya A.V., Zhusupova G.E., Abilov Z.A., Murzakhmetova M.K.,
Aralbaeva A.N., Turumbetova Z.Z., and Ross S.A. Phytochemical studies on
Limonium myrianthum growing in Kazakhstan //Planta Medica. – 2014. – Vol. 80,
№. 10. – P. PD56.
145
161 Scharbert S., Holzmann N., Hofmann T. Identification of the astringent
taste compounds in black tea infusions by combining instrumental analysis and
human bioresponse //Journal of agricultural and food chemistry. – 2004. – Vol. 52,
№ 11. – P. 3498-3508.
162 Braca A., Politi M., Sanogo R., Sanou H., Morelli I., Pizza C., and De
Tommasi N. Chemical composition and antioxidant activity of phenolic compounds
from wild and cultivated Sclerocarya birrea (Anacardiaceae) leaves //Journal of
agricultural and food chemistry. – 2003. – Vol. 51, № 23. – P. 6689-6695.
163 Matsuda H., Tokunaga M., Iwahashi H., Naruto S., Yagi H., Masuko T.,
and Kubo M. Studies on Palauan medicinal herbs. II. Activation of mouse
macrophages RAW 264.7 by Ongael, leaves of Phaleria cumingii (Meisn.) F. Vill.
and its acylglucosylsterols //Biological and Pharmaceutical Bulletin. – 2005. –
Vol. 28, № 5. – P. 929-933.
164 Qa'Dan F., Petereit F., Nahrstedt A. Prodelphinidin trimers and
characterization of a proanthocyanidin oligomer from Cistus albidus //Die
Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences. – 2003. – Vol. 58,
№ 6. – P. 416-419.
165 Yamaguchi Y., Okada Y., Chiba K. Understanding the Reactivity of Enol
Ether Radical Cations: Investigation of Anodic Four-Membered Carbon Ring
Formation //The Journal of organic chemistry. – 2013. – Vol. 78, № 6. –
P. 2626-2638.
166 Waibel M., De Angelis M., Stossi F., Kieser K.J., Carlson K.E.,
Katzenellenbogen B.S., and Katzenellenbogen J.A. Bibenzyl-and stilbene-core
compounds with non-polar linker atom substituents as selective ligands for estrogen
receptor beta //European journal of medicinal chemistry. – 2009. – Vol. 44, № 9. –
P. 3412-3424.
167 Maurya R., Ray A.B., Chattopadhyay S.K., Duah F.K., Lin M.C., Slatkin
D.J., and Schiff Jr P.L.The synthesis of propterol, a novel 1, 3-diarylpropan-2-ol from
Pterocarpus marsupium //Journal of Natural Products. – 1985. – Vol. 48. – № 2. –
P. 313-315.
168 Rollin P., Pougny J.R. Synthesis of (6Z)-cis-9S, 10R-epoxyheneicosene, a
component of the ruby tiger moth pheromone //Tetrahedron. – 1986. – Vol. 42,
№ 13. – P. 3479-3490.
169 Ye G., Huang C. Flavonoids of Limonium aureum //Chemistry of natural
compounds. – 2006. – Vol. 42, № 2. – P. 232-234.
170 Yoo H., Kim S.H., Lee J., Kim H.J., Seo S.H., Chung B.Y., Jin C., and Lee
Y.S. Synthesis and antioxidant activity of 3-methoxyflavones //Bulletin-korean
Chemical Society. – 2005. – Vol. 26, № 12. – P. 2057-2060.
171 Nicollier G., Thompson A.C. Flavonoids of Desmanthus illinoensis
//Journal of Natural Products. – 1983. – Vol. 46, № 1. – P. 112-117.
172 Yang Z.G., Jia L.N., Shen Y., Ohmura A., and Kitanaka S. Inhibitory
effects of constituents from Euphorbia lunulata on differentiation of 3T3-L1 cells
and nitric oxide production in RAW264. 7 cells //Molecules. – 2011. – Vol. 16,
№ 10. – P. 8305-8318.
146
173 Harborne J. B. Comparative biochemistry of the flavonoids-IV.:
Correlations between chemistry, pollen morphology and systematics in the family
plumbaginaceae //Phytochemistry. – 1967. – Vol. 6, № 10. – P. 1415-1428.
174 Jeon S.H., Chun W., Choi Y.J., and Kwon Y.S. Cytotoxic constituents from
the bark of Salix hulteni //Archives of pharmacal research. – 2008. – Vol. 31, № 8. –
P. 978-982.
175 Kim H.H., Oh M.H., Park K.J., Heo J.H., and Lee M.W. Anti-inflammatory
activity of sulfate-containing phenolic compounds isolated from the leaves of Myrica
rubra //Fitoterapia. – 2014. – Vol. 92. – P. 188-193.
176 Movsumov I.S. Flavonoids of the roots of Limonium caspium //Chemistry
of natural compounds. – 1996. – Vol. 32, № 6. – P. 922-922.
177 Scharbert S., Holzmann N., Hofmann T. Identification of the astringent
taste compounds in black tea infusions by combining instrumental analysis and
human bioresponse //Journal of agricultural and food chemistry. – 2004. – Vol. 52,
№ 11. – P. 3498-3508.
178 Shao X., Bai N., He K., Ho C.T., Yang C.S., and Sang S. Apple
polyphenols, phloretin and phloridzin: new trapping agents of reactive dicarbonyl
species //Chemical research in toxicology. – 2008. – Vol. 21, № 10. – P. 2042-2050.
179 Gadetskaya A.V., Tarawneh A.H., Zhusupova G.E., Gemejiyeva N.G.,
Cantrell C.L., Cutler S.J., and Ross S.A. Sulfated phenolic compounds from
Limonium caspium: isolation, structural elucidation, and biological evaluation
//Fitoterapia. – Vol. 104. – 2015. – P. 80-85.
180 García-Egido E., Paz J., Iglesias B., and Muñoz L. Synthesis of
cyanoformamides from primary amines and carbon dioxide under mild conditions.
Synthesis of ceratinamine //Organic & biomolecular chemistry. – 2009. – Vol. 7,
№ 19. – P. 3991-3999.
181 Zhang Y., Que S., Yang X., Wang B., Qiao L., and Zhao Y. Isolation and
identification of metabolites from dihydromyricetin //Magnetic resonance in
chemistry. – 2007. – Vol. 45, № 11. – P. 909-916.
182 Sang Y.M., Yan L.K., Wang J.P., and Su Z.M. TDDFT studies on the
electronic structures and chiroptical properties of mono-tin-substituted Wells–
Dawson polyoxotungstates //The Journal of Physical Chemistry A. – 2012. –
Vol. 116, № 16. – P. 4152-4158.
183 Barron D., Varin L., Ibrahim R.K., Harborne J.B., and Williams C. A.
Sulphated flavonoids—an update //Phytochemistry. – 1988. – Vol. 27, № 8. –
P. 2375-2395.
184 de Beck P.O., Dijoux M.G., Cartier G., and Mariotte A.M. Quercitrin 3′sulphate from leaves of Leea guinensis //Phytochemistry. – 1998. – Vol. 47, № 6. –
P. 1171-1173.
185 Harborne J.B. Flavonoid sulphates: a new class of sulphur compounds in
higher plants //Phytochemistry. – 1975. – Vol. 14, № 5. – P. 1147-1155.
186 Zhong X.N., Ide T., Otsuka H., Hirata E., and Takeda Y. (+)-Isolarisiresinol
3a-O-sulphate from leaves of Myrsine seguinii //Phytochemistry. – 1998. – Vol. 49,
№ 6. – P. 1777-1778.
147
187 Lemmich J., Shabana M. Coumarin sulphates of Seseli libanotis
//Phytochemistry. – 1984. – Vol. 23, № 4. – P. 863-865.
188 Shinozaki Y., Tobita T., Mizutani M., and Matsuzaki A.T. Isolation and
identification of two new diterpene glycosides from Nicotiana tabacum //Bioscience,
biotechnology, and biochemistry. – 1996. – Vol. 60, № 5. – P. 903-905.
189 Sousa E.A. D., Da Silva A.A., Cavalheiro A.J., Lago J.H. G., and Chaves
M.H. A new flavonoid derivative from leaves of Oxandra Sessiliflora R.E. Fries
//Journal of the Brazilian Chemical Society. – 2014. – Vol. 25, № 4. – P. 704-708.
190 Nazir N., Koul S., Qurishi M.A., Najar M.H., and Zargar M.I. Evaluation of
antioxidant and antimicrobial activities of Bergenin and its derivatives obtained by
chemoenzymatic synthesis //European journal of medicinal chemistry. – 2011. –
Vol. 46, № 6. – P. 2415-2420.
191 Calzada F., Cerda-García-Rojas C.M., Meckes M., Cedillo-Rivera R., Bye
R., and Mata R. Geranins A and B, new antiprotozoal A-type proanthocyanidins from
Geranium niveum //Journal of natural products. – 1999. – Vol. 62, № 5. – P. 705-709.
192 Guo S., Feng B., Zhu R., Ma J., and Wang W. Preparative isolation of three
anthraquinones from Rumex japonicus by high-speed counter-current
chromatography //Molecules. – 2011. – Vol. 16, № 2. – P. 1201-1210.
193 Chung S.K., Kim Y.C., Takaya Y., Terashima K., and Niwa M. Novel
flavonol glycoside, 7-O-methyl mearnsitrin, from Sageretia theezans and its
antioxidant effect //Journal of agricultural and food chemistry. – 2004. – Vol. 52,
№ 15. –P. 4664-4668.
194 Cepanec I., Litvić M. Simple and efficient synthesis of arbutin //Arkivoc. –
2008. – Vol. 2. – P. 19-24.
195 Yokozawa T., Park C.H., Noh J.S., Tanaka T., and Cho E.J. Novel action of
7‐O‐galloyl‐d‐sedoheptulose isolated from Corni Fructus as a hypertriglyceridaemic
agent //Journal of Pharmacy and Pharmacology. – 2009. – Vol. 61, № 5. –
P. 653-661.
196 Kadota S. Takamori Y., Nyein K., Kikuchi T., Tanaka K., Ekimoto H.
Constituents of the leaves of Woodfordia fruticosa Kurz. I. Isolation, structure, and
proton and carbon-13 nuclear magnetic resonance signal assignments of
woodfruticosin (woodfordin C), an inhibitor of deoxyribonucleic acid topoisomerase
II //Chemical and pharmaceutical bulletin. – 1990. – Vol. 38, № 10. –
P. 2687-2697.
197 Pawlowska A.M., De Leo M., Braca A. Phenolics of Arbutus unedo L.
(Ericaceae) fruits: identification of anthocyanins and gallic acid derivatives //Journal
of agricultural and food chemistry. – 2006. – Vol. 54, № 26. – P. 10234-10238.
198 Cantrell C.L., Mamonov L.K., Ryabushkina N., Kustova T.S., Fischer N.H.,
and Schrader K.K. Bioassay-guided isolation of anti-algal constituents from Inula
helenium and Limonium myrianthum //Arkivoc. – 2007. – Vol. 7. – P. 65-75.
199 Subramanian G., Paterlini M.G., Larson D.L., Portoghese P.S., and
Ferguson D.M. Conformational analysis and automated receptor docking of selective
arylacetamide-based κ-opioid agonists //Journal of medicinal chemistry. – 1998. –
Vol. 41, № 24. – P. 4777-4789.
148
200 Vortherms T.A., Mosier P.D., Westkaemper R.B., and Roth B.
L.Differential Helical Orientations among Related G Protein-coupled Receptors
Provide a Novel Mechanism for Selectivity Studies with Salvinorin A and the κopioid Receptor //Journal of Biological Chemistry. – 2007. – Vol. 282, № 5. –
P. 3146-3156.
201 Cai T.B., Zou Z., Thomas J.B., Brieaddy L., Navarro H.A., and Carroll F.I.
Synthesis and in vitro opioid receptor functional antagonism of analogues of the
selective kappa opioid receptor antagonist (3 R)-7-hydroxy-N-((1 S)-1-{[(3 R, 4 R)4-(3-hydroxyphenyl)-3, 4-dimethyl-1-piperidinyl] methyl}-2-methylpropyl)-1, 2, 3,
4-tetrahydro-3-isoquinolinecarboxamide (JDTic) //Journal of medicinal chemistry. –
2008. – Vol. 51, № 6. – P. 1849-1860.
202 Runyon S.P., Brieaddy L.E., Mascarella S.W., Thomas J.B., Navarro H.A.,
Howard J.L., Pollard G.T., and Carroll F.I. Analogues of (3 R)-7-Hydroxy-N-[(1 S)1-{[(3 R, 4 R)-4-(3-hydroxyphenyl)-3, 4-dimethyl-1-piperidinyl] methyl}-2methylpropyl)-1, 2, 3, 4-tetrahydro-3-isoquinolinecarboxamide (JDTic). Synthesis
and in Vitro and in Vivo Opioid Receptor Antagonist Activity //Journal of medicinal
chemistry. – 2010. – Vol. 53, № 14. – P. 5290-5301.
203 A.V. Gadetskaya, G.E. Zhusupova, Amer H. Tarawneh, S.A. Ross
Evaluation of antifungal and antimicrobial activities of secondary metabolites
isolated from Limonium Mill //5th international symposium-cum-training course on
molecular medicine and drug research. – Karachi, 2015. – P. 91.
204 Silberberg M., Gil-Izquierdo A., Combaret L., Remesy C., Scalbert A., and
Morand C. Flavanone metabolism in healthy and tumor-bearing rats //Biomedicine
and pharmacotherapy. – 2006. – Vol. 60, №. 9 – P. 529-535.
205 Жусупова Г.Е., Шалахметова Т.М., Мурзахметова М.К., Гадецкая А.В.,
и Жусупова А.И. Антиоксидантная активность некоторых препаратов,
полученных на основе растений Казахстана //Вестник Новосибирского
государственного педагогического университета. – 2013. – №. 5. – Т.15. –
С. 43-65.
206 Gadetskaya A.V., Zhussupova A.I., Shalakhmetova T.M., Murzakhmetova
M.K., and Zhussupova G.E.Natural antioxidants of plant origin //International journal
of biology and chemistry. – 2015. – Vol. 8, №. 1. – С. 26-31.
207 Гадецкая А.В., Жусупова Г.Е., Абилов Ж.А. Соединения,
идентифицированные в растениях вида Limonium myrianthum //VIII
Международный симпозиум по фенольным соединениям. – Москва, 2012. –
С.47-51.
208 Movsumov I.S. Flavonoids of the roots of Limonium caspium //Chemistry
of natural compounds. – 1996. – Vol. 32, № 6. – P. 922-922.
209 Спрыгин В.Г., Кушнерова
Н.Ф. Природные олигомерные
проантоцианидины-перспективные регуляторы метаболических нарушений
//Вестник Дальневосточного отделения РАН. – 2006. – № 2. – С. 81-90.
210 Лохов П.Г., Арчаков А.И. Масс-спектрометрические методы в
метаболомике //Биомедицинская химия. – 2008. – Т. 54. – № 5. – С. 497-511.
149