2009
ÖÈÒÎËÎÃÈß
Ò î ì 51, ¹ 5
ÂËÈßÍÈÅ ÀËÜÔÀ-ËÈÏÎÅÂÎÉ ÊÈÑËÎÒÛ ÍÀ ×ÓÂÑÒÂÈÒÅËÜÍÎÑÒÜ
ÒÐÀÍÑÔÎÐÌÈÐÎÂÀÍÍÛÕ ÔÈÁÐÎÁËÀÑÒÎÂ Ê ËÈÒÈ×ÅÑÊÎÉ ÀÊÒÈÂÍÎÑÒÈ
ÅÑÒÅÑÒÂÅÍÍÛÕ ÊÈËËÅÐÍÛÕ ÊËÅÒÎÊ.
ÑÐÀÂÍÅÍÈÅ Ñ ÄÅÉÑÒÂÈÅÌ NAC
© Í. À. Ôèëàòîâà, Ê. Ì. Êèðïè÷íèêîâà, Å. À. Âàõðîìîâà, È. À. Ãàìàëåé1
Í. À. Ôèëàòîâà, Ê. Ì. Êèðïè÷íèêîâà è äð.
Âëèÿíèå a-ëèïîåâîé êèñëîòû íà ÷óâñòâèòåëüíîñòü òðàíñôîðìèðîâàííûõ ôèáðîáëàñòîâ
1
Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã;
ýëåêòðîííûé àäðåñ: [email protected]
Ñðàâíèâàåòñÿ âëèÿíèå äâóõ àíòèîêñèäàíòîâ — àëüôà-ëèïîåâîé êèñëîòû (ALA) è N-àöåòèëöèñòåèíà
(NAC) — íà ÷óâñòâèòåëüíîñòü òðàíñôîðìèðîâàííûõ ìûøèíûõ ôèáðîáëàñòîâ 3T3-SV40 ê ëèòè÷åñêîìó
äåéñòâèþ åñòåñòâåííûõ êèëëåðíûõ êëåòîê (ÅÊÊ) — ñïëåíîöèòîâ ìûøåé.  îòëè÷èå îò NAC (10 ìÌ),
ïðèñóòñòâèå êîòîðîãî íå âëèÿåò íà ÷óâñòâèòåëüíîñòü ôèáðîáëàñòîâ ê äåéñòâèþ ÅÊÊ, ALA (1.25 ìÌ)
çíà÷èòåëüíî ñíèæàåò åå â òå÷åíèå íåñêîëüêèõ ÷àñîâ. Óäàëåíèå àíòèîêñèäàíòà èç ñðåäû êóëüòèâèðîâàíèÿ
êëåòîê ïðèâîäèò â îäíîì ñëó÷àå ê ïîñòåïåííîìó âîññòàíîâëåíèþ ÷óâñòâèòåëüíîñòè (ALA), à â äðóãîì — ê ïîëíîé åå ïîòåðå (NAC). Âûêëþ÷åíèå àêòèâíîñòè æåëàòèíàçû ÌÌÏ-2 (ìàòðèêñíîé ìåòàëëîïðîòåèíàçû) â ïðèñóòñòâèè èíãèáèòîðà GM6001 èëè ñïåöèôè÷åñêèõ àíòèòåë ïðèâîäèò ê ðåçóëüòàòó, ïîäîáíîìó äåéñòâèþ ALA, íî íå NAC, — ïàäåíèþ ÷óâñòâèòåëüíîñòè ôèáðîáëàñòîâ 3T3-SV40 ê àêòèâíîñòè ÅÊÊ. Èíàêòèâàöèÿ ÌÌÏ ÅÊÊ íå âëèÿëà íà èõ ëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü â îòíîøåíèè êëåòîê
3T3-SV40. Ðåçóëüòàòû ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì, ÷òî ïðÿìîé àíòèîêñèäàíò NAC (èìåþùèé âîññòàíîâëåííûå SH-ãðóïïû) è íåïðÿìîé ALA (âîññòàíàâëèâàåò SH-ãðóïïû è äåéñòâóåò êàê ïðÿìîé àíòèîêñèäàíò
òîëüêî âíóòðè êëåòêè) àêòèâèðóþò ïðèíöèïèàëüíî ðàçëè÷íûå âíóòðèêëåòî÷íûå ñèãíàëüíûå ïóòè, õîòÿ
îáà îíè âêëþ÷àþò â ñåáÿ èíàêòèâàöèþ ÌÌÏ-2.
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: àëüôà-ëèïîåâàÿ êèñëîòà, N-àöåòèëöèñòåèí, òðàíñôîðìèðîâàííûå ôèáðîáëàñòû, öèòîòîêñè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü, åñòåñòâåííûå êèëëåðíûå êëåòêè, ìàòðèêñíûå ìåòàëëîïðîòåèíàçû.
Ï ð è í ÿ ò û å ñ î ê ð à ù å í è ÿ: ÅÊÊ — åñòåñòâåííûå êèëëåðíûå êëåòêè, ÌÌÏ — ìàòðèêñíûå ìåòàëëîïðîòåèíàçû, ÖÈ — öèòîòîêñè÷åñêèé èíäåêñ, ALA — àëüôà-ëèïîåâàÿ êèñëîòà, NAC — N-àöåòèëöèñòåèí.
Duwe et al., 1985; Van Kessel et al., 1987; Malori et al., 1994;
Nariai (Nakada) et al., 2000; Viora et al., 2001; Watzl et al.,
2003).
Èçó÷àÿ âëèÿíèå òèîëîâûõ àíòèîêñèäàíòîâ (N-àöåòèëöèñòåèíà — NAC è ãëóòàòèîíà) íà ðàçíûå ïàðàìåòðû êëåòî÷íîé àêòèâíîñòè, ìû ïîêàçàëè, ÷òî äëèòåëüíîå
äåéñòâèå ýòîãî àíòèîêñèäàíòà ïðèâîäèò ê ÷àñòè÷íîé âðåìåííîé ðåâåðñèè òðàíñôîðìèðîâàííîãî ôåíîòèïà ôèáðîáëàñòîâ 3T3-SV40. Ðåâåðñèÿ âûðàæàåòñÿ â òîì, ÷òî ïîñëå äåéñòâèÿ NAC òðàíñôîðìèðîâàííûå ôèáðîáëàñòû
3T3-SV40, ìåíÿÿ ñâîþ ìîðôîëîãèþ, ïðèîáðåòàþò óñòîé÷èâîñòü ê áàêòåðèàëüíîé èíâàçèè è ê ëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÅÊÊ. Ýòî äåëàåò èõ ïîõîæèìè íà íîðìàëüíûå ôèáðîáëàñòû 3T3 (Ôèëàòîâà è äð., 2006, 2008; Gamaley et al.,
2006). NAC, ïðîíèêàÿ â êëåòêè, ñëóæèò ïðåäøåñòâåííèêîì ñèíòåçà ãëóòàòèîíà, îñíîâíîãî êîìïîíåíòà âîññòàíîâèòåëüíîãî áóôåðà â êëåòêå, ÷òî ÿâëÿåòñÿ îñíîâîé åãî
ïðèìåíåíèÿ êàê àíòèîêñèäàíòà. Îäíàêî ìû íå îáíàðóæèëè ïðÿìîé êîððåëÿöèè ìåæäó óâåëè÷åíèåì ñîäåðæàíèÿ
ãëóòàòèîíà â êëåòêàõ 3T3-SV40 è ïîòåðåé èìè ÷óâñòâèòåëüíîñòè ê äåéñòâèþ áàêòåðèé èëè ÅÊÊ (Gamaley et al.,
2006). Ýòî ãîâîðèëî î òîì, ÷òî ìèøåíüþ äåéñòâèÿ ïðÿìîãî àíòèîêñèäàíòà NAC (èìåþùåãî âîññòàíîâëåííûå
Èììóííûé ñòàòóñ îðãàíèçìà îöåíèâàåòñÿ ïî öåëîìó
ðÿäó ïîêàçàòåëåé, â òîì ÷èñëå ïî ëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè
åñòåñòâåííûõ êèëëåðíûõ êëåòîê (ÅÊÊ). ÅÊÊ — ýòî íåñåíñèáèëèçèðîâàííûå áîëüøèå ãðàíóëÿðíûå ëèìôîöèòû,
îñóùåñòâëÿþùèå íå çàâèñèìûé îò àíòèòåë è êîìïëåìåíòà ëèçèñ øèðîêîãî ñïåêòðà êëåòîê-ìèøåíåé (îïóõîëåâûõ,
çàðàæåííûõ âèðóñàìè è íåêîòîðûõ äðóãèõ) è ïîýòîìó èãðàþùèå âàæíóþ ðîëü â èììóííîì íàäçîðå çà ñîñòîÿíèåì
êëåòî÷íîé ïðîëèôåðàöèè, öèòîäèôôåðåíöèðîâêè è äðóãèõ ïðîöåññîâ (ñì. îáçîðû: Moretta et al., 2002; Moretta,
Moretta, 2004; Andoniou et al., 2006).
 ëèòåðàòóðå åñòü íåìíîãî÷èñëåííûå, â îñíîâíîì
äàâíèå è âåñüìà ïðîòèâîðå÷èâûå, äàííûå, ñâèäåòåëüñòâóþùèå î ïîïûòêàõ ïîíÿòü è îïðåäåëèòü çàâèñèìîñòü
âçàèìîîòíîøåíèé ÅÊÊ ñ êëåòêàìè-ìèøåíÿìè îò èõ ðåäîêñ-ñîñòîÿíèÿ, ò. å. îò áàëàíñà ìåæäó èõ îêèñëÿþùèìè (àêòèâíûìè ôîðìàìè êèñëîðîäà) è âîññòàíàâëèâàþùèìè (àíòèîêñèäàíòàìè) ýêâèâàëåíòàìè. Ýêñïåðèìåíòû
(in vivo è in vitro), îïèñûâàþùèå âëèÿíèå àíòèîêñèäàíòîâ
íà ðàçíûå ïîêàçàòåëè èììóííîãî ñòàòóñà îðãàíèçìà, ïîçâîëÿþò ñäåëàòü ëèøü ñàìûé îáùèé âûâîä î íåîáõîäèìîñòè îïðåäåëåííîãî ðåäîêñ-áàëàíñà äëÿ ïîääåðæàíèÿ ãîìåîñòàçà èììóííîé ñèñòåìû (Suthanthiran et al., 1984;
398
Âëèÿíèå a-ëèïîåâîé êèñëîòû íà ÷óâñòâèòåëüíîñòü òðàíñôîðìèðîâàííûõ ôèáðîáëàñòîâ
SH-ãðóïïû) ìîæåò áûòü íå òîëüêî ñèíòåç ãëóòàòèîíà, íî
è êàêèå-òî ñèãíàëüíûå ìîëåêóëû âî âíåêëåòî÷íîì ìàòðèêñå èëè íà ïîâåðõíîñòè êëåòêè. À ìîëåêóëÿðíàÿ ðåîðãàíèçàöèÿ ïîâåðõíîñòíîé ìåìáðàíû ìîæåò áûòü êðèòè÷íîé äëÿ âçàèìîäåéñòâèÿ êëåòîê-ìèøåíåé è ÅÊÊ (Davis et
al., 1999; Almedia, Davis, 2006).
Çàäà÷à íàñòîÿùåé ðàáîòû çàêëþ÷àëàñü â èññëåäîâàíèè âëèÿíèÿ äðóãîãî àíòèîêñèäàíòà — àëüôà-ëèïîåâîé
êèñëîòû (ALA) — íà ÷óâñòâèòåëüíîñòü ìûøèíûõ ôèáðîáëàñòîâ 3T3-SV40 ê ëèòè÷åñêîìó äåéñòâèþ ÅÊÊ (ñïëåíîöèòîâ ìûøåé). ALA â îòëè÷èå îò NAC àíàëîãè÷íî
îêèñëåííîìó ãëóòàòèîíó íå èìååò âîññòàíîâëåííûõ
SH-ãðóïï, íî ëåãêî âîññòàíàâëèâàåò èõ, áûñòðî ïðîíèêàÿ
â êëåòêè è äåéñòâóÿ êàê âîññòàíîâëåííûé àíòèîêñèäàíò
(äèãèäðîëèïîåâàÿ êèñëîòà) òîëüêî èçíóòðè êëåòêè (Packer
et al., 1995; Sen, Packer, 2000; Moini et al., 2002). Ïîýòîìó
â íàñòîÿùåé ðàáîòå ñðàâíèâàåòñÿ äåéñòâèå ïðÿìîãî àíòèîêñèäàíòà NAC è ìåòàáîëè÷åñêîãî ALA.
Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà
Ê ë å ò ê à ì è - ì è ø å í ÿ ì è ñëóæèëè ýìáðèîíàëüíûå
ìûøèíûå ôèáðîáëàñòû ëèíèè Balb/3T3 (êëåòêè 3T3) è
òàêèå æå ôèáðîáëàñòû, òðàíñôîðìèðîâàííûå âèðóñîì
SV 40 (êëåòêè 3T3-SV40). Êëåòêè ïîëó÷åíû èç Ðîññèéñêîé êîëëåêöèè êëåòî÷íûõ êóëüòóð ÈÍÖ ÐÀÍ. Êëåòêè êóëüòèâèðîâàëè â ñðåäå ÄÌÅÌ ñ äîáàâëåíèåì 10 % ýìáðèîíàëüíîé ñûâîðîòêè. Àíòèîêñèäàíò NAC èëè ALA (Sigma,
ÑØÀ) ââîäèëè â ñðåäó êóëüòèâèðîâàíèÿ êëåòîê äî êîíå÷íûõ êîíöåíòðàöèé ñîîòâåòñòâåííî 10 è 1.25 ìÌ íà 20 ÷.
Çàòåì ñðåäó çàìåíÿëè íà ñâåæóþ, íå ñîäåðæàùóþ àíòèîêñèäàíòà, è êóëüòèâèðîâàëè åùå 24 ÷.
Ê ë å ò ê è - ý ô ô å ê ò î ð û âûäåëÿëè èç ñåëåçåíêè èíòàêòíûõ ìûøåé-ñàìöîâ ëèíèè C3HA ìàññîé 18—20 ã, ïîëó÷åííûõ èç ïèòîìíèêà «Ðàïïîëîâî» ÐÀÍ (Ñàíêò-Ïåòåðáóðã). Èç ñåëåçåíêè ãîòîâèëè êëåòî÷íûå ñóñïåíçèè, îñâîáîæäåííûå îò ýðèòðîöèòîâ ñ ïîìîùüþ îñìîòè÷åñêîãî
øîêà ïî îïèñàííîé ðàíåå ìåòîäèêå (Ìàëûãèí, Àïðåëèêîâà, 1982), è ïîäñ÷èòûâàëè â êàìåðå Ãîðÿåâà êîëè÷åñòâî
ÿäðîñîäåðæàùèõ êëåòîê — ñïëåíîöèòîâ.
Åñòåñòâåííóþ
êèëëåðíóþ
àêòèâíîñòü
ñ ï ë å í î ö è ò î â (êëåòîê-ýôôåêòîðîâ) îöåíèâàëè ñ ïîìîùüþ 3H-óðèäèíîâîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî òåñòà (Hashimoto,
Sudo, 1971) â ìîäèôèêàöèè Ðûêîâîé ñ ñîòðóäíèêàìè
(1981). Êëåòêè-ìèøåíè ìåòèëè 3H-óðèäèíîì, ïîñëå ÷åãî
êëåòêè îòìûâàëè îò îñòàòêîâ 3H-óðèäèíà, àíòèîêñèäàíòà
èëè èíûõ àãåíòîâ. Ñîîòíîøåíèå ýôôåêòîðîâ è ìèøåíåé
ñîñòàâëÿëî 20 : 1. Óðîâåíü åñòåñòâåííîé êèëëåðíîé àêòèâíîñòè îöåíèâàëè ñ ïîìîùüþ öèòîòîêñè÷åñêîãî èíäåêñà (ÖÈ), îòðàæàþùåãî äîëþ ïîãèáøèõ êëåòîê â %.
Äëÿ óìåíüøåíèÿ àêòèâíîñòè ì à ò ð è ê ñ í û õ ì å ò à ë ë î ï ð î ò å è í à ç (ÌÌÏ) èñïîëüçîâàëè èíãèáèòîð ÌÌÏ
GM6001 (èëè Ilomastat; Calbiochem, Ãåðìàíèÿ) è ìûøèíûå ìîíîêëîíàëüíûå àíòèòåëà ïðîòèâ ÌÌÏ-2 è ÌÌÏ-9
÷åëîâåêà (Chemicon Int Co., ÑØÀ; íîìåðà ïî êàòàëîãó ñîîòâåòñòâåííî MAB13407 è MAB13416). Ñîãëàñíî õàðàêòåðèñòèêå ôèðìû-ïðîèçâîäèòåëÿ, àíòèòåëà ðàñïîçíàþò è
ëàòåíòíóþ, è àêòèâíóþ ôîðìû îáåèõ ÌÌÏ. ÖÈ îïðåäåëÿëè ÷åðåç 1 ÷ ïîñëå ñâÿçûâàíèÿ ÌÌÏ àíòèòåëàìè (ðàçâåäåíèå 1 : 1000), à òàêæå ÷åðåç 2, 4 è 20 ÷ ïîñëå äåéñòâèÿ
èíãèáèòîðà GM6001. Äîïîëíèòåëüíî ÖÈ îïðåäåëÿëè ÷åðåç 24 ÷ ïîñëå óäàëåíèÿ èíãèáèòîðà ñ ïîìîùüþ ñìåíû
ñðåäû.
399
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
Òðàíñôîðìèðîâàííûå êëåòêè 3T3-SV40 îêàçàëèñü
÷ðåçâû÷àéíî ÷óâñòâèòåëüíûìè ê äåéñòâèþ ëèïîåâîé êèñëîòû, êîòîðàÿ ëåãêî ïðèâîäèëà èõ ê ãèáåëè. Ïîýòîìó ïîäáîð åå êîíöåíòðàöèè, â ïðèñóòñòâèè êîòîðîé êëåòêè ìîãëè äîëãî ñîõðàíÿòü æèçíåñïîñîáíîñòü, îêàçàëñÿ òðóäíûì. Ïî âñåé âåðîÿòíîñòè, ýòî îòíîñèòñÿ ê êëåòêàì
ðàçíûõ òèïîâ, ïîñêîëüêó, ïî äàííûì èç ëèòåðàòóðû, èñïîëüçóåìûå êîíöåíòðàöèè ALA âàðüèðóþò â î÷åíü øèðîêîì äèàïàçîíå — îò 0.5 äî 10 ìÌ (Packer et al., 1995; Sen,
Packer, 2000; Moini et al., 2002). Äëÿ êëåòîê 3T3-SV40 ìû
îñòàíîâèëèñü íà êîíöåíòðàöèè 1.25 ìÌ, ïðè êîòîðîé íèêîãäà íå íàáëþäàëè ãèáåëè êëåòîê. NAC, êàê è ðàíåå, èñïîëüçîâàëè â êîíöåíòðàöèè 10 ìÌ (Ôèëàòîâà è äð., 2006,
2008).
Ó êëåòîê 3T3-SV40, îáðàáîòàííûõ 1.25 ìÌ ALA â òå÷åíèå 20 ÷, ÷óâñòâèòåëüíîñòü ê äåéñòâèþ ÅÊÊ óìåíüøàëàñü â îòëè÷èå îò ñëó÷àÿ ñ NAC (ñì. ðèñóíîê). Îäíàêî
óæå ÷åðåç 1 ñóò ïîñëå èçúÿòèÿ ýòîãî àíòèîêñèäàíòà èç ñðåäû êóëüòèâèðîâàíèÿ ýòà ÷óâñòâèòåëüíîñòü íà÷èíàëà óâåëè÷èâàòüñÿ, òîãäà êàê â ñëó÷àå ñ NAC îíà ïî÷òè èñ÷åçàëà
è ñòàíîâèëàñü ñõîäíîé ñ ýòîé æå ÷óâñòâèòåëüíîñòüþ íîðìàëüíûõ êëåòîê 3T3 (çíà÷åíèå èõ ÖÈ âàðüèðóåò îò 0 äî 2)
(Ôèëàòîâà è äð., 2006, 2008). Òàêèì îáðàçîì, äåéñòâèå
ALA â îòëè÷èå îò NAC ñïîñîáíî óìåíüøèòü, íî íå ëèøèòü êëåòêè 3T3-SV40 ÷óâñòâèòåëüíîñòè ê ëèòè÷åñêîé
àêòèâíîñòè ÅÊÊ. Ýòî ãîâîðèò î òîì, ÷òî ýòè äâà àíòèîêñèäàíòà äåéñòâóþò íà ðàçíûå ñèãíàëüíûå ïóòè êëåòêè, íà÷èíàþùèåñÿ â ñëó÷àå ñ NAC âíå êëåòêè, à â ñëó÷àå ñ
ALA, âîçìîæíî, òîëüêî âíóòðè íåå.
 ïðåäûäóùåé ðàáîòå (Âîðîíêèíà è äð., 2008) â ïîèñêàõ ìèøåíè áûñòðîãî ðåàãèðîâàíèÿ íà ââåäåíèå àíòèîêñèäàíòà ìû èññëåäîâàëè àêòèâíîñòü ÌÌÏ — ôåðìåíòîâ,
ðàçðóøàþùèõ ìàòðèêñ, ñïîñîáíûõ ãèäðîëèçîâàòü ïî÷òè
âñå êîìïîíåíòû âíåêëåòî÷íîãî ìàòðèêñà, âñòðå÷àþùèåñÿ
â ñîåäèíèòåëüíûõ òêàíÿõ (ñì. îáçîðû: Westermarck,
Kähäri, 1999; Mott, Werb, 2004). ÌÌÏ îáðàçóþòñÿ èç íåàêòèâíûõ ïðåäøåñòâåííèêîâ, êîòîðûå ïðåâðàùàþòñÿ â
àêòèâíûå ïðîòåèíàçû è ñåêðåòèðóþòñÿ êëåòêîé âî âíåêëåòî÷íóþ ñðåäó ïîä âîçäåéñòâèåì ðàçëè÷íûõ êëåòî÷-
Èçìåíåíèå ÷óâñòâèòåëüíîñòè òðàíñôîðìèðîâàííûõ ôèáðîáëàñòîâ 3T3-SV40, îáðàáîòàííûõ àíòèîêñèäàíòîì ALA (1.25 ìÌ)
èëè NAC (10 ìÌ), ê ëèòè÷åñêîìó äåéñòâèþ åñòåñòâåííûõ êèëëåðíûõ êëåòîê.
Öèòîòîêñè÷åñêèé èíäåêñ (ÖÈ) îïðåäåëÿëè ÷åðåç 20 ÷ ïîñëå ââåäåíèÿ àíòèîêñèäàíòà â ñðåäó êóëüòèâèðîâàíèÿ, à çàòåì ÷åðåç 24 ÷ ïîñëå åãî óäàëåíèÿ ñìåíîé ñðåäû. Äëÿ êàæäîãî ñëó÷àÿ äàíû ñðåäíèå çíà÷åíèÿ ÖÈ èç
12—18 èçìåðåíèé â 3 ýêñïåðèìåíòàõ. Ê — êîíòðîëü.
Í. À. Ôèëàòîâà, Ê. Ì. Êèðïè÷íèêîâà è äð.
400
Òàáëèöà 1
Àêòèâíîñòü ñïëåíîöèòîâ ìûøåé C3HA
â îòíîøåíèè êëåòîê 3T3-SV40, îáðàáîòàííûõ èíãèáèòîðîì
ìàòðèêñíûõ ìåòàëëîïðîòåèíàç GM6001 (GM)
Êîíöåíòðàöèÿ GM
è âðåìÿ äåéñòâèÿ
ÖÈ (%) â ïðèñóòñòâèè GM
ÖÈ (%) ÷åðåç 24 ÷
ïîñëå óäàëåíèÿ GM
0 (êîíòðîëü)
0.5 íÌ, 4 ÷
0.5 íÌ, 20 ÷
30 íÌ, 2 ÷
30 íÌ, 4 ÷
30 íÌ, 20 ÷
36.5 ) 1.2
16.0 ) 3.2
0
20.0 ) 4.4
4.1 ) 0.4
0
3.9 ) 0.8
0
2.2 ) 0.3
0.9 ) 0.4
0
Ï ð è ì å ÷ à í è å. Çäåñü è â òàáë. 1 è 2 ñîîòíîøåíèå ýôôåêòîðîâ è ìèøåíåé 20 : 1. Äëÿ êàæäîãî ñëó÷àÿ äàíû ñðåäíèå çíà÷åíèÿ öèòîòîêñè÷åñêîãî èíäåêñà (ÖÈ) èç 12—18 èçìåðåíèé â 3 ýêñïåðèìåíòàõ.
íûõ è âíåêëåòî÷íûõ ôàêòîðîâ. Áëàãîäàðÿ âûñîêîé ðåäîêñ-÷óâñòâèòåëüíîñòè ÌÌÏ ìîãóò ìåíÿòü ñâîþ àêòèâíîñòü ïðè äåéñòâèè îêñèäàíòîâ è àíòèîêñèäàíòîâ
(Springman et al., 1990; Van Wart, Birkedal-Hansen, 1990;
Svingen et al., 2008). Ìû ïîêàçàëè, ÷òî ââåäåíèå NAC èëè
ALA â ñðåäó êóëüòèâèðîâàíèÿ êëåòîê èçìåíÿåò àêòèâíîñòü ÌÌÏ — æåëàòèíàç ÌÌÏ-2 è ÌÌÏ-9 (Âîðîíêèíà
è äð., 2008). Îäíàêî èçìåíåíèÿ, âûçûâàåìûå ïðèñóòñòâèåì NAC èëè ALA, áûëè íåðàâíîçíà÷íûìè: NAC íåçàâèñèìî îò êîíöåíòðàöèè ïîëíîñòüþ èíàêòèâèðîâàë ÌÌÏ-2
è ÌÌÏ-9, à ALA ëèøü óìåíüøàëà àêòèâíîñòü ÌÌÏ-2,
õîòÿ è çíà÷èòåëüíî, è äàæå íåñêîëüêî óâåëè÷èâàëà àêòèâíîñòü ÌÌÏ-9 (Âîðîíêèíà è äð., 2008).
×òîáû ïîíÿòü, âíîñèò ëè âêëàä àêòèâíîñòü ÌÌÏ-2 è
ÌÌÏ-9 â ÷óâñòâèòåëüíîñòü êëåòîê ê ëèòè÷åñêîìó äåéñòâèþ ÅÊÊ, â íàñòîÿùåé ðàáîòå ìû èññëåäîâàëè ýòîò ïàðàìåòð, èíàêòèâèðîâàâ ÌÌÏ ó êëåòîê 3T3-SV40. Äëÿ ýòîãî
èñïîëüçîâàëè èíãèáèòîð ÌÌÏ GM6001. Ñîãëàñíî èíñòðóêöèè ôèðìû-ïðîèçâîäèòåëÿ, ýòîò èíãèáèòîð ïîäàâëÿåò
ïðàêòè÷åñêè âñå ÌÌÏ, õîòÿ äåéñòâèå åãî çàâèñèò îò êîíöåíòðàöèè: â áîëüøîé êîíöåíòðàöèè (30 íÌ) èíãèáèðóåòñÿ øèðîêèé ñïåêòð ÌÌÏ, à â ìàëîé (äî 5 ìÌ) — òîëüêî íåêîòîðûå, â ÷àñòíîñòè ÌÌÏ-2 è ÌÌÏ-9 (Calbiochem,
Ãåðìàíèÿ). Èç äàííûõ òàáë. 1 âèäíî, ÷òî äåéñòâèå
GM6001 íà êëåòêè 3T3-SV40 çàâèñèò îò êîíöåíòðàöèè è
âðåìåíè è ìîæåò ïî÷òè ïîëíîñòüþ ëèøèòü èõ ÷óâñòâèòåëüíîñòè ê äåéñòâèþ ÅÊÊ. Ïðè ýòîì äåéñòâèå èíãèáèòîðà ôàêòè÷åñêè íåîáðàòèìî è ïðîäîëæàåòñÿ ïîñëå åãî óäàëåíèÿ èç ñðåäû íåçàâèñèìî îò åãî êîíöåíòðàöèè è âðåìåíè ïðèñóòñòâèÿ â ñðåäå êóëüòèâèðîâàíèÿ êëåòîê. Êàê
îêàçàëîñü, ìíîãî÷àñîâîå äåéñòâèå GM6001 âûçûâàåò â
Òàáëèöà 2
Àêòèâíîñòü ñïëåíîöèòîâ ìûøåé C3HA
â îòíîøåíèè êëåòîê 3T3-SV40,
îáðàáîòàííûõ àíòèòåëàìè ê ÌÌÏ-2 è ÌÌÏ-9
Âàðèàíòû ïðåäîáðàáîòêè
3T3-SV40 (êîíòðîëü)
3T3-SV40 + ÀÒ ê ÌÌÏ-2
3T3-SV40 + ÀÒ ê ÌÌÏ-9
3T3-SV40 + (ÀÒ ê ÌÌÏ-2 + ÀÒ ê ÌÌÏ-9)
êîíöå êîíöîâ ãèáåëü êëåòîê, ïîýòîìó ìû íå áóäåì åãî
ðàññìàòðèâàòü. Èòàê, 4-÷àñîâîå äåéñòâèå 0.5 íÌ èíãèáèòîðà GM6001 çíà÷èòåëüíî óìåíüøàåò, íî íå ïîäàâëÿåò
÷óâñòâèòåëüíîñòü êëåòîê ê ëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÅÊÊ.
Çàìåòèì, ÷òî ïðåäîáðàáîòêà ñàìèõ ÅÊÊ èíãèáèòîðîì
GM6001 â òåõ æå êîíöåíòðàöèÿõ íå âëèÿëà íà èõ ëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü. ÖÈ êëåòîê 3T3-SV40 îñòàâàëñÿ íåèçìåííûì — 25.7 ± 3.8 % ïðîòèâ 27.1 ± 2.6 % â êîíòðîëå.
Ïîñêîëüêó äåéñòâèå GM6001 íåñïåöèôè÷íî â îòíîøåíèè
êîíêðåòíîãî òèïà ÌÌÏ, ìû èñïîëüçîâàëè àíòèòåëà ïðîòèâ ÌÌÏ-2 è ÌÌÏ-9 äëÿ èõ èíàêòèâàöèè, ÷òîáû âûÿâèòü, íàñêîëüêî íåîáõîäèìà èìåííî èõ àêòèâíîñòü äëÿ
ñîõðàíåíèÿ ÷óâñòâèòåëüíîñòè êëåòîê 3T3-SV40 ê ëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÅÊÊ.
Ðåçóëüòàòû öèòîòîêñè÷åñêîãî òåñòà ïîñëå 1-÷àñîâîãî
ñâÿçûâàíèÿ ÌÌÏ-2 è ÌÌÏ-9 ñîîòâåòñòâóþùèìè àíòèòåëàìè ïðèâåäåíû â òàáë. 2. Îêàçàëîñü, ÷òî ÖÈ êëåòîê
3T3-SV40 óìåíüøàåòñÿ ëèøü â ñëó÷àå ïðåäîáðàáîòêè
êëåòîê àíòèòåëàìè ê ÌÌÏ-2 è ïðàêòè÷åñêè íå èçìåíÿåòñÿ â ñëó÷àå èñïîëüçîâàíèÿ àíòèòåëà ê ÌÌÏ-9. Ñòåïåíü
óìåíüøåíèÿ ÖÈ ïîñëå îáðàáîòêè êëåòîê 3T3-SV40 àíòèòåëàìè ê ÌÌÏ-2 èëè èíãèáèòîðîì GM6001 ïðèáëèçèòåëüíî îäèíàêîâà.
Òàêèì îáðàçîì, èíàêòèâèðîâàíèå æåëàòèíàçû
ÌÌÏ-2 ñ ïîìîùüþ èíãèáèòîðà, ñïåöèôè÷åñêèõ àíòèòåë
èëè àíòèîêñèäàíòà ALA áûñòðî ïðèâîäèò ê ïîòåðå òðàíñôîðìèðîâàííûìè êëåòêàìè ÷óâñòâèòåëüíîñòè ê äåéñòâèþ
ÅÊÊ. Ïî-âèäèìîìó, ïðèíöèïèàëüíàÿ ñõåìà ìîëåêóëÿðíûõ ñîáûòèé ïðè äåéñòâèè ýòèõ àãåíòîâ îäèíàêîâà è
ÌÌÏ-2 ÿâëÿåòñÿ åå îáÿçàòåëüíûì è äîñòàòî÷íûì ó÷àñòíèêîì. Îäíàêî â ýòó ñõåìó íå âïèñûâàåòñÿ äåéñòâèå ïðÿìîãî àíòèîêñèäàíòà NAC, ïîñêîëüêó ïðè åãî äåéñòâèè
ïîëíîãî âûêëþ÷åíèÿ ÌÌÏ-2 íåäîñòàòî÷íî äëÿ èçìåíåíèÿ ÷óâñòâèòåëüíîñòè êëåòîê 3T3-SV40 ê ëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÅÊÊ. Ýòà ÷óâñòâèòåëüíîñòü èçìåíÿåòñÿ ëèøü âî
âðåìåíè ïîñëå óäàëåíèÿ NAC èç ñðåäû êëåòîê â ðåçóëüòàòå êàêèõ-òî âòîðè÷íûõ èçìåíåíèé, ñëåäóþùèõ, â ÷àñòíîñòè, çà âûêëþ÷åíèåì ÌÌÏ-2. Êðîìå òîãî, ñàì ìåõàíèçì
èíàêòèâèðîâàíèÿ ÌÌÏ ïðè äåéñòâèè NAC è äðóãèõ èñïûòàííûõ àãåíòîâ ìîæåò áûòü ðàçíûì. Íåîáõîäèìî ó÷èòûâàòü è òî, ÷òî ëþáîé àãåíò ìîæåò èìåòü íå îäíó ìèøåíü, à íåñêîëüêî. ALA, êàê è îêèñëåííûé ãëóòàòèîí
(Cho et al., 2003; Filomeni et al., 2003), ìîæåò èìåòü ñâîè
ñïåöèôè÷åñêèå ìèøåíè è íà ïîâåðõíîñòè êëåòêè. Ñëåäñòâèåì àíòèîêñèäàíòíîãî äåéñòâèÿ, âûêëþ÷åíèÿ èëè óìåíüøåíèÿ àêòèâíîñòè ÌÌÏ â ñðåäå ìîæåò áûòü è èçìåíåíèå àêòèâíîñòè ÌÌÏ ìåìáðàííîãî òèïà (ÌÒ-ÌÌÏ), îò
êîòîðûõ òîæå çàâèñÿò ìíîãèå ôóíêöèè êëåòêè. Òàê, îäíà
èç ìåìáðàííûõ ÌÌÏ (ÌÒ1-ÌÌÏ) ïðÿìî ñâÿçàíà ñ àêòèâíîñòüþ ÌÌÏ-2 (Mott, Werb, 2004). Ê êàêèì ìîëåêóëÿðíûì ïåðåñòðîéêàì â êëåòêå ìîæåò ïðèâîäèòü âûêëþ÷åíèå èëè óìåíüøåíèå àêòèâíîñòè ÌÌÏ-2 — ïðåäìåò
äàëüíåéøèõ èññëåäîâàíèé.
Àâòîðû âûðàæàþò áëàãîäàðíîñòü È. Â. Âîðîíêèíîé
çà ó÷àñòèå â îáñóæäåíèè ðàáîòû è ïîìîùü â ïîëó÷åíèè
ðÿäà ðåàêòèâîâ.
ÖÈ, %
28.8 ) 4.6
12.9 ) 3.9
28.6 ) 4.3
13.9 ) 4.1
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå Ðîññèéñêîãî ôîíäà ôóíäàìåíòàëüíûõ èññëåäîâàíèé (ïðîåêòû 06-04-48586 è 09-04-00467), à òàêæå ÷àñòè÷íîé ïîääåðæêå ïðîãðàììû ïðåçèäåíòà ÐÔ «Âåäóùèå íàó÷íûå
øêîëû» (ÍØ-774.2008.4) è ïðîãðàììû ÐÀÍ «Ìîëåêóëÿðíàÿ è êëåòî÷íàÿ áèîëîãèÿ».
Âëèÿíèå a-ëèïîåâîé êèñëîòû íà ÷óâñòâèòåëüíîñòü òðàíñôîðìèðîâàííûõ ôèáðîáëàñòîâ
Ñïèñîê ëèòåðàòóðû
Âîðîíêèíà È. Â., Êèðïè÷íèêîâà Ê. Ì., Ñìàãèíà Ë. Â., Ãàìàëåé È. À. 2008. Èçìåíåíèå àêòèâíîñòè ìàòðèêñíûõ ìåòàëëîïðîòåèíàç íîðìàëüíûõ è òðàíñôîðìèðîâàííûõ ôèáðîáëàñòîâ ìûøè ïðè äåéñòâèè àíòèîêñèäàíòîâ. Öèòîëîãèÿ. 50 (10) :
879—883.
Ìàëûãèí À. Ì., Àïðåëèêîâà Î. Í. 1982. Åñòåñòâåííàÿ ïðîòèâîîïóõîëåâàÿ àêòèâíîñòü ñïëåíîöèòîâ ìûøåé C3HA. Ýêñïåðèì. îíêîëîãèÿ. 4 (3) : 37—39.
Ðûêîâà Ì. Ï., Ñïèðàíäå È. Â., Çåäãåíèäçå Ì. Ñ., Ëÿõîâ Â. Â., Ôóêñ Á. Á. 1981. Íîâàÿ âûñîêî÷óâñòâèòåëüíàÿ òåõíèêà òåñòèðîâàíèÿ íîðìàëüíûõ êèëëåðîâ. Èììóíîëîãèÿ. 1 :
88—90.
Ôèëàòîâà Í. À., Êèðïè÷íèêîâà Ê. Ì., Ãàìàëåé È. À. 2006.
Óìåíüøåíèå àêòèâíîñòè åñòåñòâåííûõ êèëëåðîâ ïî îòíîøåíèþ ê òðàíñôîðìèðîâàííûì ôèáðîáëàñòàì 3T3-SV40, îáðàáîòàííûì N-àöåòèëöèñòåèíîì. Öèòîëîãèÿ. 48 (5) : 438—442.
Ôèëàòîâà Í. À., Êèðïè÷íèêîâà Ê. Ì., Ãàìàëåé È. À. 2008.
Ðåîðãàíèçàöèÿ àêòèíîâîãî öèòîñêåëåòà â êëåòêàõ 3T3-SV40 è
èõ ÷óâñòâèòåëüíîñòü ê ëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè åñòåñòâåííûõ
êèëëåðíûõ êëåòîê. Öèòîëîãèÿ. 50 (3) : 261—167.
Almeida C. R., Davis D. M. 2006. Segregation of HLA-C from
ICAM-1 at NK cell immune synapses is controlled by its cell surface density. J. Immunol. 177 : 6904—6910.
Andoniou C. E., Andrews D. M., Degli-Esposti M. A. 2006.
Natural killer cells in iralinfection: more than just killers. Immunol.
Rev. 214 : 239—250.
Cho K. J., Moini H., Shon H. S., Chung A. S., Packer L. 2003.
Alpha-lipoic acid decreases thiol reactivity of the insulin receptor
and protein tyrosine phosphatase 1B in 3T3-L1 adipocytes. Biochem. Pharmacol. 66 : 849—858.
Davis D. M., Chiu I., Fassett M., Cohen G. B., Mandelboim O., Strominger J. L. 1999. The human natural killer cell immune
synapse. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 96 : 15 061—15 067.
Duwe A. K., Werkmeister J., Roder J. C., Lauzon R., Payne U.
1985. Natural killer cell-mediated lysis involves an hydroxyl radical-dependent step. J. Immunol. 134 : 2627—2644.
Filomeni G., Rotilio G., Ciriolo M. R. 2003. Glutathione disulfide induces apoptosis in U937 cells by a redox-mediated p38 MAP
kinase pathway. FASEB J. 17 : 64—66.
Gamaley I., Efremova T., Kirpichnikova K., Kever L., Komissarchik Y., Polozov Yu., Khaitlina S. 2006. N-acetylcysteine-induced changes in susceptibility of transformed eukaryotic cells to bacterial invasion. Cell Biol. Int. 30 : 319—325.
Hashimoto Y., Sudo H. 1971. Evaluation of cell damage in immune reactions by release of radioactivity from 3H-uridine labeled
cells. Gann. 62 : 139—145.
Malori W., D’Ambrosio A., Rainaldi G., Rivabene R., Viora M.
1994. Thiol supplier N-acetylcysteine enhances conjugate formation between natural killer cells and K562 or U937 targets but increases the lytic function only against the latter. Immunol. Lett. 43 :
209—214.
401
Moini H., Packer L., Saris N. E. 2002. Antioxidant and prooxidant activities of alpha-lipoic acid and dihydrolipoic acid. Toxicol.
Appl. Pharmacol. 182 : 84—90.
Moretta L., Bottino C., Pende D., Mingari M. C., Biassoni R.,
Moretta A. 2002. Human natural killer cells: their origin, receptors
and function. Eur. J. Immunol. 32 : 1205—1211.
Moretta L., Moretta A. 2004. Unravelling natural killer cell
function: triggering and inhibitory human NK receptors. EMBO J.
23 : 255—259.
Mott J. D., Werb Z. 2004. Regulation of matrix biology by
matrix metalloproteinases. Cur. Opin. Cell Biol. 16 : 558—564.
Nariai (Nakada) N., Kitagawa K., Nariai K., Kosaka T., Kuwabara M., Kiuchi Y. 2000. Active-oxygen involvement in canine
NK-mediated cytotoxicity. Vet. Med. Sci. 62 : 457—460.
Packer L., Witt E. H., Tritschler H. J. 1995. Alpha-lipoic acid
as a biological antioxidant. Free Radic. Biol. Med. 19 : 227—250.
Sen C. K., Packer L. 2000. Thiol homeostasis and supplements
in physical exercise. Amer. J. Clin. Nutr. 72 (Suppl. 2) : 653S—
669S.
Springman E. B.,
Angleton E. L.,
Birkedal-Hansen H.,
Van Wart H. E. 1990. Multiple modes of activation of latent human
fibroblast collagenase: evidence for the role of a Cys73 active-site
zinc complex in latency and a «cysteine switch» mechanism for activation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 87 : 364—368.
Suthanthiran M., Solomon S. D., Williams P. S., Rubin A. L.,
Novogrodsky A., Stenzel K. H. 1984. Hydroxyl radical scavengers
inhibit human natural killer cell activity. Nature. 307 : 276—278.
Svingen G., Ravuri C., Rikardsen O., Huseby N. E., Winberg J. O. 2008. The role of reactive oxygen species in integrin and
matrix metalloproteinase expression and function. Connect Tissue
Res. 49 : 197—202.
Van Kessel K. P., Van Strijp J. A., Van Kats-Renaud H. J.,
Miltenburg L. A., Van Der Tol M. E., Fluit A. C., Verhoef J. 1987.
Further evidence against a role for toxic oxygen products as lytic
agents in NK cell-mediated cytotoxicity. Immunology. 62 : 675—
678.
Van Wart H. E., Birkedal-Hansen H. 1990. The cysteine
switch: a principle of regulation of metalloproteinase activity with
potential applicability to the entire matrix metalloproteinase gene
family. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 87 : 5578—5582.
Viora M., Quaranta M. G., Straface E., Vari R., Masella R.,
Malorni W. 2001. Redox imbalance and immune functions: opposite effects of oxidized low-density lipoproteins and N-acetylcysteine. Immunology. 104 : 431—438.
Watzl B., Bub A., Briviba K., Rechkemmer G. 2003. Supplementation of a low-carotenoid diet with tomato or carrot juice modulates immune functions in healthy men. Ann. Nutr. Metab. 47 :
255—261.
Westermarck J., Kähäri V. 1999. Regulation of matrix metalloproteinase expression in tumor invasion. FASEB J. 13 : 781—
792.
Ïîñòóïèëà 24 XII 2008
EFFECT OF ALPHA-LIPOIC ACID ON THE SENSITIVITY OF TRANSFORMED FIBROBLASTS
TO LYSIS BY NATURAL KILLER CELLS. COMPARISON WITH NAC ACTION
N. A. Filatova, K. M. Kirpichnikova, E. A. Vahromova, I. A. Gamaley1
Institute of Cytology RAS, St. Petersburg;
1 e-mail: [email protected]
The purpose of this study was to compare the effects of two antioxidants, alpha-lipoic acid (ALA) and
N-acetylcysteine (NAC) on the sensitivity of 3T3-SV40 fibroblasts to lytic activity of natural killer (NK) cells.
ALA (1.25 mM) reduced significantly the fibroblast sensitivity in several hours, whereas NAC (10 mM) did not
change it. Subsequent removal of the antioxidants from the cultivation medium resulted in gradual recovery of
the sensitivity in the case of ALA and in complete loss of it in the case of NAC. Inactivation of gelatinase
MMP-2 (matrix metalloproteinase) using pretreatment of the cells with the inhibitor of MMP, G6001, or speci-
402
Í. À. Ôèëàòîâà, Ê. Ì. Êèðïè÷íèêîâà è äð.
fic antibodies to MMP-2 or MMP-9 resulted in decrease of 3T3-SV40 sensitivity to NK cells activity. This effect was similar to that of ALA, not to the NAC one. Pretreatment of NK cells with G6001 did not influence
their lytic activity. The results obtained demonstrate that the direct antioxidant, NAC (having reduced thiol groups), and the indirect one, ALA (reducing thiol groups and acting as a direct antioxidant only inside the cell) activate principally different intracellular signal pathways. However, both NAC and ALA pathway includes inactivation of MMP-2.
K e y w o r d s: alpha-lipoic acid, N-acetylcysteine, 3T3-SV40 fibroblast, cytotoxic activity, natural killer
cells, matrix metalloproteinases.
Скачать

влияние альфа-липоевой кислоты на чувствительность