Овчинникова Светлана Яковлевна
advertisement
ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ – ФИЛИАЛ ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ На правах рукописи Овчинникова Светлана Яковлевна «ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО (LEVISTICUM OFFICINALE KOCH.)» 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель: Орловская Т.В., доктор фармацевтических наук, доцент Пятигорск – 2013 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 5 ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО (LEVISTICUM OFFICINALE KOCH.) ................................ 12 1.1 Ботаническая характеристика рода Levisticum ................................................. 12 1.2 Химический состав любистка лекарственного ................................................ 15 1.3 Использование в быту и медицине .................................................................... 18 1.4 Ареал распространения, биологические особенности и состояние агрокультуры любистка лекарственного ................................................................ 27 1.5 Результаты контент-анализа зарегистрированных в РФ лекарственных препаратов, обладающих диуретическим действием ................. 32 ВЫВОДЫ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................... 35 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ......................................................... 36 2.1 Объекты исследования ....................................................................................... 36 2.2 Методы исследования углеводов ...................................................................... 36 2.2.1 Свободные моносахариды ............................................................................... 36 2.2.2 Олиго- и полисахариды .................................................................................... 37 2.2.3 Выделение полисахаридов из растительного сырья .................................... 37 2.2.4 Кислотный гидролиз ........................................................................................ 37 2.2.5 Хроматографический анализ углеводов ........................................................ 38 2.2.6 Газожидкостная хроматография (ГЖХ) ..................................................... 38 2.2.7 Спектрометрия в инфракрасной области .................................................... 39 2.2.8 Количественное определение галактуронидов ............................................. 39 2.2.9 Определение физико-химических характеристик пектинов...................... 39 2.3 Методы исследования эфирных масел ............................................................. 40 2.3.1 Газожидкостная хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС) ....................... 40 2.4 Методы исследования фенольных соединений ............................................... 40 2.4.1 Выделение и качественное обнаружение фенольных соединений .............. 40 2.4.2 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ ....................................... 41 2.5 Методы исследования макро- и микроэлементного состава ......................... 42 2.6 Изучение аминокислотного состава .................................................................. 42 2.7 Общие методики стандартизации сырья .......................................................... 43 2.7.1 Методы отбора проб для анализа ................................................................. 43 2.7.2 Морфолого-анатомические исследования ..................................................... 43 2.7.3 Определение числовых показателей качества сырья .................................. 44 2.7.4 Определение микробиологической чистоты сырья ..................................... 44 2.7.5 Определение содержания радионуклидов ...................................................... 44 3 2.7.6 Определение сроков хранения сырья .............................................................. 44 2.7.7 Статистическая обработка данных ............................................................ 45 2.7.8 Валидация методик количественного определения ..................................... 45 2.8 Методы токсико-фармакологических исследований ...................................... 45 2.8.1 Исследование «острой» токсичности .......................................................... 45 2.8.2 Исследование отхаркивающего действия ..................................................... 46 2.8.3 Изучение антибактериальной активности .................................................. 47 2.8.4 Изучение спазмолитической активности ..................................................... 47 2.8.5 Изучение диуретической активности ........................................................... 48 2.8.6 Изучение желчегонной активности .............................................................. 49 ГЛАВА 3. ИНТРОДУКЦИОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО В УСЛОВИЯХ КАВКАЗСКИХ МИНЕРАЛЬНЫХ ВОД ............................................................ 50 3.1 Изучение лабораторной всхожести семян любистка лекарственного........... 51 3.2 Определение полевой всхожести...................................................................... 53 3.3 Фенологические особенности развития любистка лекарственного............... 54 3.4 Определение семенной продуктивности и урожайности любистка лекарственного в условиях культуры ..................................................................... 59 3.5 Обоснование выбора морфологической группы в качестве ЛРС .................. 61 ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 3 .................................................................................................... 63 ГЛАВА 4. МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОРНЕВИЩ И КОРНЕЙ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО ................................................ 64 4.1 Морфологическая характеристика сырья ......................................................... 64 ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4 .................................................................................................... 77 ГЛАВА 5. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОРНЕВИЩ И КОРНЕЙ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО ................................................ 78 5.1 Качественный анализ .......................................................................................... 78 5.2 Исследование углеводов ..................................................................................... 80 5.2.1 Выделение полисахаридов................................................................................ 80 5.2.2 Изучение химического состава углеводных фракций ................................... 81 5.2.2.1 Групповые качественные реакции на углеводы ......................................... 81 5.2.2.2 Изучение мономерного состава углеводных фракций методом хроматографии на бумаге........................................................................................ 83 5.2.2.3 Изучение мономерного состава углеводных фракций методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) ............................................................... 83 5.2.2.4 Изучение углеводных фракций методом ИК-спектроскопии .................. 84 5.2.2.5 Изучение физико-химических характеристик пектинов .......................... 86 5.3 Исследование эфирного масла ........................................................................... 88 5.3.1 Определение содержания эфирного масла.................................................... 88 5.3.2 Определение подлинности изучаемых образцов эфирного масла ............... 88 4 5.4 Исследование фенольных соединений.............................................................. 91 5.4.1 Качественное обнаружение фенольных соединений ................................... 91 5.4.2 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ ....................................... 97 5.4.3 Выделение кумаринов ..................................................................................... 102 5.4.4 Выделение производных фенолкарбоновых кислот .................................... 103 5.4.5 Спектральные характеристики выделенных фенольных соединений ............................................................................................ 105 5.5 Исследование аминокислотного состава ........................................................ 110 5.6 Исследование элементного состава................................................................. 110 ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 5 .................................................................................................. 114 ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА СЫРЬЯ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО....... 116 6.1 Разработка оптимальной методики экстракции сырья.................................. 116 6.2 Спектральная характеристика спиртовых извлечений из корневищ и корней любистка лекарственного ................................................ 118 6.3 Разработка методики ТСХ анализа ................................................................. 121 6.4 Количественное определение кумаринов ....................................................... 123 6.5 Количественное определение суммы фенольных соединений .................... 129 6.6 Определение товароведческих показателей корневищ и корней любистка лекарственного..................................................... 134 6.6.1 Определение числовых показателей ............................................................. 134 6.6.2 Определение микробиологической чистоты ............................................... 136 6.6.3 Определение содержания тяжелых металлов ........................................... 136 6.6.4 Определение содержания радионуклидов .................................................... 137 ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ....................................... 142 7.1 Изучение «острой» токсичности ..................................................................... 142 7.2 Изучение отхаркивающей активности ............................................................ 144 7.3 Изучение антибактериальной активности ...................................................... 144 7.4 Изучение спазмолитической активности ........................................................ 145 7.5 Изучение диуретической активности .............................................................. 146 7.6 Изучение желчегонной активности ................................................................. 148 ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 7 .................................................................................................. 151 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................................. 152 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................ 155 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения почти 80% населения нашей планеты предпочитают использовать для лечения препараты растительного происхождения [75], поэтому по-прежнему актуальным является исследование и разработка на их основе лекарственных средств. Наряду с высоким и оправданным интересом исследователей к поиску принципиально новых источников фитопрепаратов заслуживают не меньшего внимания лекарственные растения, уже давно применяемые в медицине, но вместе с тем, имеющие не полностью раскрытый фармакотерапевтический потенциал. Научные сведения о многих из них, в частности, об их химическом составе, фармакологических свойствах были получены десятки лет назад в рамках, имевшихся в то время возможностей науки, и с тех пор практически не пополнялись. Мировые статистические исследования показывают, что на долю заболеваний мочеполовой системы и патологий желчевыводящих путей среди населения Земли приходится около 70% [75]. По данным той же статистики лекарственные средства, использующиеся в России при данной патологии, в большинстве синтетического происхождения. Препараты на основе природного сырья в основном выпускаются зарубежными фармацевтическими компаниями, и на российском рынке представлены биологически активными добавками (БАД). Однако такой путь на наш взгляд является нерациональным, так как в этом случае приходится применять БАДы практически постоянно. Кроме того, использование БАД не всегда эффективно при уже возникшей патологии. В то время как лекарственные препараты такого типа стандартизированы по биологически активным веществам, что повышает их качество и чем они выгодно отличаются от БАДов. Особо актуальным представляется поиск лекарственных средств с направленным фармакологическим действием, например, диуретической и антимикроб- 6 ной активностями в сочетании с антиоксидантным эффектом, которые связаны с содержанием полифенольного комплекса. В этой связи наше внимание привлек любисток лекарственный (Levisticum officinale Koch.) из сем. сельдерейные (Apiaceae). Сырье любистка лекарственного включено в ряд зарубежных фармакопей, однако, в России используется только в традиционной медицине. Ограниченность производимой из данного сырья продукции объясняется не только недостаточностью химических исследований, но и отсутствием современной нормативной документации. А в связи с тем, что в целях рационального использования природного сырья основной акцент делается на разработку и внедрение новых конкурентоспособных, малоотходных и безопасных технологий, актуальным является изучение различных комплексов биологически активных соединений (БАС). Особенно актуальна на сегодняшний день проблема преодоления зависимости отечественной фармацевтической промышленности от импортного сырья и лекарственных препаратов. Поэтому в настоящее время Правительство России разработало концепцию по развитию собственных возможностей производства инновационных отечественных лекарственных средств. Таким образом, комплексное исследование фитохимического состава, совершенствование нормирования качества, в зависимости от пути использования сырья и группы БАС, определяющих фармакологическую активность, является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики. Степень разработанности темы исследования. В результате научных исследований ученых, в основном зарубежных, хорошо изучены такие классы соединений как эфирные масла, фталиды и полиацетилены. Изучена фармакологическая активность некоторых индивидуальных химических компонентов, характерных для видов рода Любисток и близкородственного рода Дудник. Несмотря на литературные данные любисток лекарственный остается малоизученным, отсутствуют нормативные документы, регламентирующие подлинность и качество 7 сырья, нет отечественных препаратов на основе его сырья. Цель и задачи. Целью настоящей работы явилось фармакогностическое изучение любистка лекарственного корневищ и корней, разработка нормативной документации (НД) на сырье, как потенциального источника получения БАС, обладающих желчегонной и мочегонной активностью. Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи: 1. Изучить возможность культивирования любистка лекарственного в условиях Кавказских Минеральных Вод (КМВ, Ставропольский край). 2. Провести фитохимический анализ подземной части любистка лекарственного (полифенольных соединений, углеводов, эфирного масла, аминокислот, макро- и микроэлементов). 3. Установить морфолого-анатомические диагностические признаки и числовые показатели качества сырья. 4. Разработать методики стандартизации корневищ и корней любистка лекарственного в зависимости от пути использования. 5. Определить острую токсичность и провести предварительное изучение специфической биологической активности различных фитосубстанций. 6. Разработать фармакопейную статью (проект ФС) «Любистка лекарственного корневища и корни» и инструкцию по сбору и сушке. Научная новизна. Проведенные интродукционные исследования, позволили прогнозировать выращивание этого вида и особенности интродукции в условиях культуры на КМВ. Изучен химический состав эфирного масла подземных органов любистка лекарственного, выращенного в условиях КМВ. Методом газожидкостной хроматографии с последующим анализом масс-спектров идентифицировали 17 компонентов, из них 5 ранее не описанных для этого вида: моноциклический терпен: эвкалиптол (цинеол); бициклический терпен: борнеол; сесвитерпен: кариофиллен оксид; сложные эфиры: линалил ацетат, нерил ацетат. 8 Методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) идентифицированы 16 фенольных соединения, из них 11 впервые для данного вида: фенолокислоты: галловая; кумарины: ангелицин, кумарин; флавоноиды: лютеолин, апигенин, кверцетин, гиперозид, кемпферол, дигидрокверцетин; дубильные вещества: катехин, эпигаллокатехин. В индивидуальном виде выделено 14 соединений, среди которых впервые для данного вида 3 производных фенолкарбоновых кислот: эллаговая, галловая, цикориевая и 6 кумаринов: императорин, псорален, оксипейцеданин, остол, ангелицин, кумарин. Впервые изучен полисахаридный комплекс (22,2-24,1%). Выделены: растворимые в спирте этиловом (0,45%), воде (4,7%), растворе аммония оксалата (6,0%) и растворах щелочей (12,0%) углеводы. Установлен их моносахаридный состав. Количественно определены функциональные группы пектиновых веществ. Проведено морфолого-анатомическое изучение любистка лекарственного (корневища и корни) с учетом современных требований и установлены диагностические признаки сырья. Впервые предложены методики оценки качества корневищ и корней любистка лекарственного, достоверно устанавливающие спектрофотометрическим методом содержание ангелицина и суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту в сырье любистка лекарственного. Впервые изучен аминокислотный и минеральный состав подземных органов любистка лекарственного. Установлены товароведческие показатели сырья (цельного, измельченного, порошка) и определены их нормы. Скрининговые фармакологические исследования фитосубстанций на основе сырья любистка лекарственного показали наличие антибактериальной, отхарки- 9 вающей, спазмолитической, диуретической и желчегонной активности. Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость исследования заключается в расширении знаний о химическом составе корневищ и корней любистка лекарственного, возможности его интродукции в условиях Ставропольского края и оценки урожайности различных видов сырья. Полученные данные в ходе фармакологического скрининга могут служить первым экспериментальным доклиническим обоснованием перспективности использования исследованных субстанций в качестве лечебно-профилактических средств. Практическая значимость исследования заключается в том, что в результате химического и фармакологического анализа доказана возможность использования отечественного сырья любистка лекарственного для производства препарата «Канефрон». Предложен новый вид ЛРС для включения в Государственную фармакопею России XII издания. Разработан унифицированный подход к стандартизации корневищ и корней любистка лекарственного в соответствии с современными требованиями и группой действующих БАС. Разработаны проект ФС «Любистка лекарственного корневища и корни» и инструкция по сбору и сушке любистка лекарственного корневища и корни. Результаты диссертационных исследований используются в учебных процессах на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России и кафедрах фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России и ГБОУ ВПО ДВГМУ Минздрава России. Методология и методы исследования. Методологической основой работы послужили методические рекомендации по расширению номенклатуры отечественных официнальных лекарственных растений, основанные на современных информационных ресурсосберегающих технологиях [Киселева Т.Л., 2009]. Фитохимические исследования проводились с использованием комплекса различных физико-химических методов: хроматография тонкослойная (ТСХ), бу- 10 мажная (БХ), спектрометрия газожидкостная (ГХ-МС), (ГЖХ), газожидкостная высокоэффективная жидкостная хромато-массхроматография (ВЭЖХ), спектрометрия в УФ, видимой и ИК- областях, атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС) и др. Для выявления фармакологической активности использованы биологические методы анализа. Положения, выносимые на защиту: 1. Результаты интродукционных исследований любистка лекарственного на территории КМВ. 2. Результаты изучения химического состава подземных органов любистка лекарственного физико-химическими методами. 3. Показатели подлинности и нормы качества «Любистка лекарственного корневища и корни», необходимые для разработки проекта нормативной документации. 4. Результаты изучения фармакологической активности сырья любистка лекарственного. Степень достоверности и апробация результатов. Оценка степени достоверности научных результатов определяется большим объемом проанализированной информационной базы, использованием современных физико-химических, биологических методов анализа, позволяющих получать воспроизводимые и однозначные результаты их математико-статистической обработкой. Разработанные методики количественного определения валидированы. Материалы исследования доложены и обсуждены на региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2012 г.) и «Инновационные идеи молодёжи Северного Кавказа – развитию экономики России» (г. Ставрополь, 2012 г.). Работа была представлена на Международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Израиль, Тель-Авив, 16-23 октября 2013 г.), Международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и 11 клинической медицины» (Тайланд, Бангкок-Паттайя, 20-30 декабря 2013 г.), Международной научной конференции «Перспективы развития растениеводства» (Италия, Рим-Венеция, 21-28 декабря 2013 г.), Международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Тайланд, Паттайя, 19-27 февраля 2014 г.), Международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Доминиканская Республика, 13-22 апреля 2014 г.). По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 7 в изданиях, рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 154 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы исследования», пяти глав экспериментальной части, заключения, списка литературы и приложения. В тексте содержится 47 таблиц, 42 рисунка. Список цитируемой литературы включает 230 источников, из них – 101 на иностранных языках. 12 ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО (LEVISTICUM OFFICINALE KOCH.) В день Троицын, когда народ Зевая слушает молебен, Умильно на пучок зари Они роняли слёзки три; А. С. Пушкин. Евгений Онегин, глава II, строфа XXXV 1.1 Ботаническая характеристика рода Levisticum Согласно системе А.Л. Тахтаджяна род Любисток (Levisticum) принадлежит к отделу Magnoliophyta, классу Magnoliopsida, подклассу Rosidae, надпорядку Cornanae, порядку Apiales, подпорядку Apiineae, семейству Apiaceae, подсемейству Apioideae, трибе Peucedaneae [107]. По одним источникам род Любисток является монотипным [17, 124]. По другим включает 3 вида, характерных для западной Европы, Малой Азии и Ирана. Во флоре России и странах СНГ встречается 1 вид [83]. В трибу Peucedaneae кроме рода Angelica входят еще 18 родов, многие виды хорошо известны в качестве пищевых, лекарственных и ядовитых растений: Levisticum (любисток), Ferula (ферула), Peucedanum (горичник), Anethum (укроп) и др. [107]. Родовое название Levisticum введено John Hill в 1756 г., но основоположник принятой в настоящее время системы ботанических наименований Карл Линней, в 1737 г. ввел для рода Любисток название Ligusticum. При этом John Hill признавал идентичность названий Levisticum или Ligusticum [15]. Происхождение термина Ligusticum также связано с древнеримским врачом Диоскоридом, который назвал любисток лигурийским сельдереем, потому что его выращивали в Лигурии (область в западной части Северной Италии). Другой древнеримский врач Гален немного изменил латинское название, и получилось Levisticum, которое в немецком трансформировалось в liebesstuckel, а затем и в 13 liebstock («liеb» по-немецки означает «любовь») [51]. В России закрепились названия «любисток» и «заря» («зоря»), в Европе Lovage [17]. Любисток лекарственный относят к роду Levisticum Hill., а идентичность видовых названий Ligusticum и Levisticum отражена в названии «Лигустикум любистоковый», приравненный к «Любисток лекарственный» (Ligusticum levisticum L. = Levisticum officinale Koch) [15, 146, 224]. Выделенные в настоящее время два рода Ligusticum и Levisticum, искусственно объединяют разнородные растения [171]. По-видимому, систематика растений, исторически построенная на ботаническом описании, не всегда отражает биологическое родство ввиду зависимости фенотипа от средовой экспрессии генов. Поэтому в настоящее время происходит пересмотр системы этого семейства в результате изучения молекулярной эволюции по итогам секвенирования спейсерных участков рДНК [108]. Любисток лекарственный (Рисунок 1) – многолетнее травянистое растение высотой до 2 м, с толстым корневищем и крупными многоглавыми корнями. Стебли многочисленные, прямостоячие, в верхней части ветвистые, цилиндрические, полые, бороздчатые. Листья крупные, влагалищные, длинночерешковые, дважды- трижды перисто-рассеченные, темно-зеленые, сверху блестящие. Средние листья имеют меньшие размеры, короткочерешковые, верхние – сидячие, с расширенным влагалищем и почти неразвитой пластинкой. Цветки мелкие, беловато-желтоватые, соцветие сложный зонтик с общей оберткой и оберточкой, расположенный на конце ветви. Плод – желто-бурый вислоплодник. Разновидности употребляемых в пищевых и лечебных целях любистков имеют общее происхождение и несущественные различия, связанные с климатом, характером почвы и условиями среды обитания, последствиями окультуривания, гибридизации и одичания. 14 Рисунок 1 – Внешний вид любистка лекарственного 15 1.2 Химический состав любистка лекарственного Химический состав любистка лекарственного изучен недостаточно. Известно, что корни содержат эфирное масло (0,2-1,7%), в состав которого входят фталиды (до 70%) такие как: 3-бутилфталад, цис- и транс- бутилденефталид (лигустикум лактон), цис- и транс- лигустид, лигустилид, сенкиунолид, левистолид А и B [175, 202, 218, 221], а также терпены: α- и β-пинен, карвакрол, α- и β-фелландрен, α- и β- терпинен, камфен, мирцен; фурокумарины: бергаптен, псорален, умбеллиферон, ситостерол и β-ситостерол-3-О-гликозид; смолы (в составе которой β-ситостерин и ангеликовая кислота); рутин; коричные кислоты: феруловая, кофейная, хлорогеновая, кумаровая и органические: яблочная, аскорбиновая; углеводы: крахмал и камедь [83, 135,160]. Выделены и установлены структуры (Z) –лигустилида, ангеолида, фалькариндиола, фалькаринола, левистолида и 5 димеров лигулистида [140,151, 176]. Разработаны параметры определения методами ТСХ, ВЭЖХ и ГХ-МС в корнях любистка фалькариндиола и (Z)-лигулистида [152]. Показано, что значительная часть экстрактивных веществ представлена легко- и трудногидролизуемыми полисахаридами (19,7%) и лигнином (12,1%), а также, что основными классами соединений являются полифенолы, дубильные вещества, горькие гликозиды и водорастворимые органические кислоты [41]. К наиболее изученным в химическом отношении относятся эфирные масла. Основными компонентами эфирного масла, полученного из растений, культивируемых в европейских странах, являются: β-фелландрен (0,1-48,9%), пентилциклогексадиен (0-12,3%), транс-сабинел ацетат (0-12,1%), α-терпинел ацетат (026,1%), (Z)-3-бутилиден фталид (0,1-31,2%), и (Z)-лигустилид (0,2-70,9%). Фталидные изомеры преобладали (73,2-82,6%) в маслах образцов любистка лекарственного из Эстонии, Франции и Бельгии. Эфирное масло подземных органов любистка лекарственного, выращенного в Шотландии было богато β-фелландреном (48,9%) и фенилацетальдегидом (17,2%). Максимальное содержание ацетатов транс-сабинела и α-терпинела (38,2%) было найдено в образцах из Голландии. 16 Эстонский образец содержал в больших количествах (Е)-лигустилид (52,4-70,9%) и пентилциклогексадиен (12,3%). При этом в эфирном масле, полученном из листьев любистка лекарственного в больших количествах содержатся α-терпенел ацетат (55,8%) и β-фелландрен (11,3%), содержание (Z)-лигулистида (17,0% ) было меньше, по сравнению с содержанием в корнях [153, 219, 222]. Корневища и корни любистка лекарственного, выращенного во Франции, в составе эфирного масла содержат монотерпены: α-пинен (0,59%), β-пинен (0,85%) и β-фелландрен (1,63%); углеводороды: фенил-гептан (0,48%), n-пентил циклогексадиен (3,96%) и фталиды: (Z)-3-пропилиден-фталид (1,16%), (Z)-3-бутилиденфталид (1,93%), (Z)-лигустилид (70,57%), (Е)-лигулистид (2,82%) и (Z)-3-валиден3,4-дигидрофталид (1,61%) [192]. Иранские образцы эфирного масла в качестве основных компонентов содержали β-фелландрен (42,5%), α-терпинеол (27,9%), цис-оцимен (7,5%) и дегидро-1,8-цинеол (6,8%) [150]. В эфирном масле, полученном из подземных органов любистка лекарственного, выращенного в Китае, доминирующими были β-фелландрен (16,47%), цитронеллаль 12,85%) и лигустилид (20,94%) [130]. В эфирном масле, полученном в целом из надземной части любистка лекарственного, произрастающего в Иране, основными компонентами являлись терпинил-ацетат (40,5%) и β-фелландрен (16,7%) [154]. При этом в листьях преобладали γ- терпинен ( 14,52%), β-фелландрен (13,85%) и (Z)-β-оцимен (12,91%); в стеблях γ-терпинен (12,86%), α-терпинеол (10,81%) и (Z)-β-оцимен (10,42%); в семенах (Z)-β-оцимен (23,70%), β-фелландрен (15,54%) и γ-терпинен (12,37%). В корнях этих же образцов – γ-терпинен (12,56%), β-пинен (8,47%) и (Z)-β-оцимен (8,89%) [223]. Как показывают результаты для эфирного масла, полученного из листьев, стеблей и семян были характерны только монотерпены (89,44%, 83,35% и 96,33 % соответственно), тогда как эфирное масло корней состояло из монотерпенов и сесквитерпенов (72,61% и 11,70 % соответственно). Содержание эфирного масла в 17 листьях, стеблях, семенах и корнях составляло 3,2% , 2,9%, 3,8% и 3,4% соответственно [150]. Таким образом, исходя из приведенных литературных данных, изменение состава эфирного масла зависит от способа выделения, органов растений, условий сбора и географического положения [149, 156, 163, 164, 185, 186, 191, 209, 214]. В извлечениях, полученных при помощи уксусной кислоты, методом ГЖХ идентифицировали 3-гидрокси-4,5-диметил-2-(5Н)-фуранон (сотолон), (Е)-n- дамасценон, 2-этил-4-гидрокси-5-метил-3-(2Н)-фуранон, 4-гидрокси-2,5-диметил3-(2Н)-фуранон [143]. Определены параметры получения CO2-экстрактов из различных морфологических групп сырья: листьев, семян и стеблей и установлено их влияние на процесс извлечения отдельных соединений [158, 165, 159]. Наиболее изученным из близкородственных видов является лигустикум (любисток) сычуаньский (Ligusticum chuaxiong Hort.), в котором при помощи метода высокоспецифичной жидкостной хромато-масс-cпектрометрии идентифицированы 18 основных компонентов: ванилин, феруловая кислота, сенкьюнолиды A, F, H, I, J, P, кониферил ферулат, (Z)-лигустилид, неокнидилид, 3бутилиденефталид, 3-бутилфталид, книдилид, рилигустилид, Z,Z’-6,8’,7,3’- дилигустилид, токинолид В, левистолид А [206]. Корневища этого вида также содержит алкалоиды: тетраметилпиразин (ТМП), перларилин, 5-гидроксиметил-2-фурил-перларилина. ТМП, он же лигустразин, чуансинозид, являющийся высокоактивным компонентом любистка сычуаньского, содержится в сырье в количестве менее 0,1 мкг/г [161], его содержание в родственных видах не обнаружено, вероятно, ввиду ещё более низкой концентрации. 18 1.3 Использование в быту и медицине Растения из группы близкородственных видов семейства Apiaceae под общеупотребительным названием «Любисток» (Lovage) давно известны и широко применяются в качестве пряности и средства народной и официнальной медицины в большинстве стран Европы (со времен Карла Великого), Америки, Азии, находят применение в тибетской медицине. Впервые это растение описал Диоскорид [224]. Эфирное масло любистка уже в XVI в. получали в промышленных масштабах. Листья, стебли и молодые корни (в отваренном виде) используют в пищу. Все части растения, в том числе и семена – популярная пряность при приготовлении салатов, соусов, маринадов, смесей пряных трав, при консервировании. Из сочных черенков и корней варят варенье и цукаты [92]. В традиционной медицине используется способность биологически активных соединений (БАС) из всех частей любистка возбуждать аппетит, усиливать выделение желудочного сока, тем самым стимулируя функциональную активность желудочно-кишечного тракта [81]. Применяют при заболеваниях почек, сердца, нервных заболеваниях, отеках, обусловленных сердечной недостаточностью [38]. Любисток оказывает желчегонное, ветрогонное, успокаивающее, обезболивающее, противосудорожное, отхаркивающее действия [67, 92]. Эфирное масло растения обладает антисептическими свойствами, что во многом способствует подавлению патогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, предупреждая процессы брожения и гниения [173, 174, 183]. Настои и отвары из всех частей растения оказывают умеренное мочегонное действие, но при этом значительно увеличивается экскреция мочевой кислоты. Поэтому в народной медицине европейских стран любисток применяют при мочекислом диатезе, подагре, ревматизме, считают хорошим акваретиком [14]. Любисток повышает клубочковую фильтрацию, и образование первичной мочи в почках, соответственно, ускоряет выведение из организма токсических 19 веществ. Этим обусловлено применение растения и в качестве детоксицирующего средства, например, как противоядия при укусах ядовитых змей и насекомых [49]. Издавна в народной медицине России наружно употребляли сок и отвары из травы, листьев, семян и корней любистка при опухолях полости рта и гортани, раке кожи. Механизм противоракового действия извлечений из этого растения еще недостаточно изучен, однако имеются экспериментальные данные о некоторой противоопухолевой активности в ряду фурокумаринов из любистка [129]. Исторически любисток применяли при нарушении менструального цикла (при скудных и болезненных менструациях). В настоящее время установлено, что БАC растения обладают эстрогеноподобной активностью [49]. Отвар корней и травы любистка используют для ускорения заживления гнойных ран. В домашней косметике – для очищения кожи, улучшения ее трофики. Настои и отвары втирают в кожу головы для укрепления волос [142]. Свежие и высушенные корни Levisticum officinale в отличие от надземной части обладают сильной антибиотической активностью в отношении грамположительных и Pilze бактерий [151]. Водные экстракты, полученные из корней любистка, используют для обработки семян сельскохозяйственных культур, таких как рапс и пшеница для предотвращения их болезней и повышения всхожести [200, 211]. Непосредственно перед цветением корень любистка становится ядовитым и непригодным в пищу. Его следует выкапывать только поздней осенью или весной. Зелень и корень любистка нельзя употреблять в пищу при беременности изза опасности ее прерывания. Растение противопоказано при гломерулонефрите. Фурокумарины могут вызывать фотодерматозы у особо чувствительных людей [49, 83, 156, 188]. Острая токсичность эфирного масла oral LD50 3,4 г/кг (мыши), derm. LD50 5 г/кг (морские свинки). В виде 2% раствора масло за 48 часов не вызывает раздражения кожи человека и реакции сенсибилизации. Комиссия IFRA не вводит ограничений на применение масла любистка в парфюмерии и косметике [16]. 20 Эфирное масло проявило активность по отношению против Bacillus subtilis ATCC 9372, Enterococcus faecalis ATCC 15753, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27852 и Klebsiella pneumoniae ATCC 3583. Особенно чувствительными по отношению к эфирному маслу любистка были Bacillus subtilis и Escherichia coli [215]. Экстракт, сырьё и масло Levisticum officinale (Lovage, Extract) зарегистрированы FDA в разделе 172.510 Natural flavoring substances and natural substances in conjunction with flavors в качестве добавки к пище, для которой выполняются нормы, соответствующие требованиям GMP. Корень Любистка упоминается в официальном издании FDA в качестве мягкого мочегонного средства [15]. Дихлорметановый экстракт из корней любистка показал значительную антимикобактериальную активность в отношении Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium aurum. В качестве активных компонентов в данном экстракте были идентифицированы стереоизомеры полиацетиленов: 3(R)-фалькаринол и 3(R)8(S)-фалькариндиол. По-своему микотоксическому действию на M. fortuitum полиацетилены намного превышали действие этамбутола, а по отношению к штаммам M. aurum действие 3(R)-8(S)-фалькариндиола было практически одинаковым с этамбутолом, но почти в 2 раза эффективнее по сравнению с изониазидом [133]. Экстракт, полученный при помощи n-гексана, значительно подавляет рост Mycobacterium smegmatis mc2155 и Mycobacterium bovis BCG [135]. Экстракт, полученный с помощью этилацетата, из семян любистка лекарственного отличается высоким фунгистатическим эффектом в отношении Fusarium culmorum и Botrytis cinerea, при этом показано, что активность данного экстракта не связана с наличием фурокумаринов [197]. Изучена фармакологическая активность некоторых индивидуальных химических компонентов, характерных для видов рода Любисток и близкородственного рода Дудник, что позволяет прогнозировать фармакологическую активность. 21 Углубленное изучение химического состава любистка лекарственного, дудника китайского и любистка сычуаньского с помощью методов ТСХ, ВЭЖХ и ГХ-МС не выявило существенных различий между этими видами, что указывает на возможную взаимозаменяемость указанных видов в медицинских и пищевых целях [230]. Установлено, что фалькариндиол является мощным ингибитором роста микобактерий туберкулеза [133, 138, 213]. (Z)- Ligustilide ингибирует рост Staphylococcus aureus [190] и клеточные линии рака [212]. (Z)-ligustilide – дигидрофталид, имеет слабую противовирусную и противомикробную активность в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных и дрожжевых микроорганизмов [139]. Отмечается высокая противовоспалительная и спазмолитическая активность лигустилида. На морских свинках показано, что интраперитонеальное введение лигустилида ингибирует астматические реакции, индуцированные ацетилхолином и гистамином. Седанолид и 3-n-бутилфталид ингибируют развитие опухолей, индуцированных введением бензпирена [9]. Фталиды (ligustilide, cnidilide и senkyunolide), растворимые в хлороформе оказывают в экспериментальных условиях центральный миорелаксирующий и антипролиферативный эффект [195, 212]. В экспериментальных условиях на модели спонтанной гипертензии у крыс продемонстрировано гипотензивное и сосудорасширяющее действие 3-n- butylphthalide [220], а также защитное действие при воспалении после транзиторного ишемического повреждения мозга [227]. Полиацетиленовые соединения, содержащиеся в эфирном масле: фалькаринол и фалькариндиол, обладают широким разнообразием фармакологических эффектов, включая антибактериальную, противогрибковую, и антимикобактериальную деятельность [151, 210], обладают высокой антибиотической, противоопухолевой, противовоспалительной, антиагрегатной и антитуберкулезной активностью [194, 199, 217, 230]. 22 Интересно, что стереохимия фалькаринола и фалькариндиола не оказывает значительного влияния на антимикобактериальную деятельность и, что стереоселективное ингибирование фермента может быть исключено в качестве активного начала [134, 210, 213]. В целом результаты показывают, что данные полиацетилены заслуживают дальнейшего внимания как потенциальные источники новых антимикобактериальных антибиотиков. Кроме того, внутрибрюшинное или per os применение фалькариндиола у мышей привело к гепатопротекторным эффектами за счет уменьшения сыворотки GPT (глутаминовой пировиноградной трансаминазы), и вызвало рост GOT (глутаминовой щавелевоуксусной трансаминазы) после D- галактозаминного и липополисахаридного поражения печени [226]. Falcarinol и falcarindiol обладают значительной цитотоксичностью [141, 178]. Установлено противораковое действие при употреблении данных полиацетиленов в составе овощей [145, 157, 181, 229]. Лигустразин [189] обладает широким спектром фармакологической активности по влиянию на сердечнососудистую систему, имеет мощный противотромботический потенциал и высокую эффективность при лечении цереброваскулярных заболеваний [208, 228]. Сесквитерпеноиды бициклической группы (a- и β-пинены) обладают местно-раздражающим, антисептическим, отхаркивающим и диуретическим действием [203]. Изучено действие некоторых кумаринов, спектр которых чрезвычайно разнообразен [19]. Так, императорин и ксантотоксин ингибируют активность ацетилхолинэстеразы [205] и наряду с экстрактом из листьев проявляют антипролиферативную активность [204], императорин дозозависимо обладает антиконвульсивным действием [187], императорин и изобергаптен – антифунгальным [184]. Исследованы свойства архангелицина: в экспериментах на животных это вещество при пероральном или внутрибрюшинном введении оказывает противосудорожное, расслабляющее мышцы и успокаивающее действие [129]. 23 Бергаптен, оксипеуцеданин и ксантоксол используют для лечения лейкодермии [36, 82] и псориаза [162]. Спазмолитической активностью обладают бергаптен, ксантоксин, остол [162], изопимпинеллин, императорин [82], изоимператорин, ксантоксол, умбеллиферон [2], пимпинеллин, оксипеудцеданин и др. [2]. У остола выявлена антипролиферативная активность [137], умбеллиферона – фунгицидная, бактерицидная и противовоспалительная [3]. Кроме этого, остол снижает выделение вирусов гепатита B, ингибирует вагинальные трихомонады, соответственно экстракты любистка используют для лечения заболеваний половой сферы, невралгии, артрита и грибковых заболеваний [9], атамантин оказывает спазмолитическое, гипотензивное, анаболическое, антиоксидантное, мембраностабилизирующее, противовоспалительное действие [93]. Кумарины, в частности псорален, обладают фунгистатической активностью. В пределах эталонных препаратов (нитрофунгин, сангвиритрин) рост поверхностных дерматитов задерживают 5-оксикеллин и императорин. Более широким спектром ингибирующего действия обладает ангелицин, фунгистатическое действие которого заметно проявляется на следующих штаммах возбудителей: Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Microsporum canis, Aspergillus niger и Candida albicans [19]. Не менее важными фармакологически активными компонентами любистка являются фенольные кислоты [47]. В частности феруловая кислота обладает антипролиферативными свойствами [169, 170]. Влияние феруловой кислоты на атерогенез и гиперлипидемию продемонстрировано в экспериментальных условиях на кроликах [207]. Соли феруловой кислоты способны влиять на феномен реперфузии мозговой ткани после ишемического повреждения [225]. Феруловая кислота обладает мощным антиоксидантным эффектом, что продемонстрировано в ряде исследований [144, 155]. При изучении влияния феруловой кислоты на перекисное окисление липидов в эксперименте со стрептозотоциновым диабетом, применение феруловой ки- 24 слоты вызывало снижение уровня гликемии, гидропероксидаз, свободных жирных кислот, при этом наблюдалось повышение активности супероксиддисмутазы, каталазы, глулатионпероксидазы и расширение панкреатических островков в поджелудочной железе [168]. Феруловая кислота оказывает синергический антиоксидантный эффект при совместном применении с α-токоферолом, β-каратином [136]. Кроме того, феруловая кислота обладает мощным гепатопротекторным эффектом [179, 182]. Хлорогеновая кислота также обладает широким спектром биологической активности. Доказано ее действие в качестве антибактериального, противовирусного, противовоспалительного, гепатопротекторного, антимутагенного и гипотензивного биологически активного вещества. Установлены ее пребиотические свойства [48, 110]. Хлорогеновая кислота и ее производные оказывают более сильный антиоксидантный эффект, чем аскорбиновая кислота, кофейная кислота и токоферол (витамин Е), может эффективно удалить ДФПГ радикал, гидроксильный радикал и супероксид анион радикалы, подавлять липопротеины низкой плотности окисления [126, 132]. Замещенные коричные кислоты, являются промежуточными веществами синтеза лигнина из аминокислот (фенилаланина и тирозина). Известны работы, в которых хлорогеновая кислота рассматривается как регулятор ростовых процессов, как защитный фактор по отношению к некоторым микроорганизмам [120]. Желчегонная и антиоксидантная активности связаны с присутствием фенольных кислот [1, 167]. Доказаны антиоксидантное и гипогликемическое действия кофейной кислоты [48, 131]. Ангеликовая кислота обладает седативным эффектом [9]. Цикориевая кислота (2,3-дикофеоилхинная) оказалась сильным ингибитором интегразы ВИЧ типа I (HIV-1). Интеграза способствует внедрению ВИЧ в ге- 25 ном иммуннокомпетентных клеток человека. Цикориевая кислота в концентрации 1-4 мкг/мл способна ингибировать данный фермент [48]. В экспериментальных исследованиях выявлена способность экстрактивных веществ любистка сычуаньского оказывать кардиопротекторный эффект [216], гипотензивный эффект [108], влиять на эндотелиальную дисфункцию посредством торможения перекисного окисления и действия свободных радикалов [198]. Любисток сычуаньский также обладает антиаритмическим эффектом за счет антиишемического и мембраностабилизирующего действия, оказывает антиагрегационное действие на уже адгезированные тромбоциты [108], подобно действию антагонистов кальция. Любисток улучшает сердечный выброс, сократительную способность миокарда, повышает пороговую величину ишемии, снижает потребление кислорода миокардом, а также способствует значительному снижению уровня триглицеридов крови, общего холестерина и холестерина липопротеидов низкой плотности, значительно повышает холестерин липопротеидов высокой плотности, понижает показатель вязкости плазмы крови и уровень фибриногена [108]. Алкалоиды любистка сычуаньского значительно улучшают деформируемость эритроцитов, реологические свойства крови, улучшают такие показатели, как общая вязкость крови, восстановленная вязкость крови, сравнительная вязкость плазмы крови, осмотическое давление эритроцитов, удельный вес крови и количество измененных эритроцитов [15]. По влиянию на ЦНС любисток проявляет синергизм с барбитуратами, увеличивая продолжительность сна, и является антагонистом кофеина. Эфирное масло тормозит проводимость в нервных синапсах центров ЦНС, снижает естественную двигательную активность животных, в терапевтической дозе стимулирует рефлекторную активность сосудодвигательного центра продолговатого мозга и дыхательный центр. Применение любистка значительно повышает перфузию капилляров почечных клубочков и не вызывает нарушений электролитного обмена [15]. 26 При артериальной гипертонии беременных отмечено снижение артериального давления, уменьшение отеков и протеинурии. Следует отметить, что в ходе лечения не выявлено отрицательного влияния на течение беременности или состояние плода [15]. В медицинской практике КНР сырье любистка сычуаньского широко используется при лечении следующих заболеваний: острого тромбоза сосудов головного мозга, ишемической болезни сердца, легочного сердца и легочносердечной недостаточности, хронической ишемии головного мозга. Любисток используется в комплексной терапии хронической почечной недостаточности, тубулопатии, эритремии, для улучшения реологических показателей при сахарном диабете. Достигнут значительный эффект при лечении мигрени, болезни Меньера, тромбофлебитов [15]. Таким образом, на основании представленного анализа литературы по проблеме применения в клинике препаратов, созданных с использованием любистка можно сделать вывод, что он обладает достаточно широким спектром фармакологической активности. Традиционное применение данного вида сырья в качестве компонента при приготовлении пищи свидетельствует о его безопасности, что также подтверждается исследованиями по острой, хронической и другим видам токсичности лекарственных препаратов, содержащих любисток [201]. Сырье любистка лекарственного включено в фармакопеи Европейскую [166], Великобритании [148], Британскую травяную [147], Немецкую и Французскую (помимо подземных органов еще листья и плоды), также было включено в отечественную фармакопею I издания [53]. Согласно Европейской и Британской Фармакопеям содержание эфирного масла в цельных корнях должно быть не менее 0,4% и в резанных не менее 0,3% [166]. Однако, как показано выше, как компонентный состав эфирного масла, так и его количество сильно варьируют в зависимости от места произрастания любистка лекарственного, поэтому можно предположить, что определение подлинно- 27 сти данного сырья только по показателю «эфирное масло» не имеет объективности. Согласно Европейской и Британской Фармакопеям подлинность сырья устанавливается методом ТСХ-анализа метанольного извлечения. Требования фармакопей сводятся к обнаружению на хроматограмме зон абсорбции, проявляющихся в ультрафиолетовом свете при длинах волн 254 и 365 нм, в качестве стандартных образцов используют кумарин и эвгенол [148, 166]. В Британской Травяной Фармакопее описываются только внешние и микроскопические признаки цельного сырья (корневищ) [147]. Фармакопея Китая регламентирует качество близкородственного вида Ligusticum sinensis по содержанию спирторастворимых экстрактивных веществ (не менее 9%) и методом ВЭЖХ по содержанию феруловой кислоты (не менее 0,05%) [196]. Опираясь на литературные данные, можно констатировать тот факт, что наиболее стабильными и активно действующими соединениями в подземных органах любистка лекарственного, являются сумма кумаринов и фенольных кислот. Поэтому будет целесообразнее наряду с количественным содержанием эфирного масла ввести в НД показатель идентификации и содержания именно этих групп веществ. В связи с этим считаем, что показатели качества, приведенные в зарубежных фармакопеях, нуждаются в критическом пересмотре, а для унификации химической стандартизации сырья необходимо выяснить и четкие пути его использования. 1.4 Ареал распространения, биологические особенности и состояние агрокультуры любистка лекарственного Любисток лекарственный в диком виде произрастает в средиземноморских районах Европы, как одичавшее в европейской части СНГ и Кавказа. Культивируется почти по всей Европе, Северной Америке, в СНГ. Любисток культивируется как лекарственное растение в Германии, Венгрии и бывшей Чехословакии. Установлена возможность введения в культуру в Египте [180]. 28 Анализ литературных данных позволяет утверждать, что разновидности употребляемого в разных странах в пищевых и лечебных целях любистков имеют общее происхождение и несущественные различия, связанные с климатом, характером почвы и другими условиями среды обитания, а также последствиями окультуривания, гибридизации и одичания [108]. В 1957 году европейский вид любистка лекарственного был интродуцирован в Китае и используется наравне с традиционным китайским видом Angelica sinensis (дудник китайский), также из семейства сельдерейных в медицинских целях и в приготовлении пищи [152]. Установлено, что на динамику накопления и содержание основных компонентов эфирного масла влияют сроки и возраст растения: двухгодичные листья и корни содержали больше эфирного масла, чем однолетние, независимо от степени сушки сырья (свежие и высушенные). При изучении динамики накопления эфирного масла в течение вегетационного периода, было определено, что наибольшее содержание эфирного масла наблюдается, когда листья собирают в середине августа, а корни во второй половине октября (Рисунок 2) [193]. 0,5 0,4 1 год (свежие) 0,3 2 год (свежие) 1 год (высушенные) 0,2 2 год (высушенные) 0,1 0 01.09. 19.09. 27.09. 12.10. 01.11. Рисунок 2 – Содержание эфирного масла в образцах корней любистка лекарственного 29 Так как любисток лекарственный выращивался с давних времен, его агротехника хорошо изучена [39, 40]. Любисток очень неприхотлив и может расти на любых почвах, в тени или на солнце, морозостоек. На одном месте выращивается 5-10 лет [118]. Его размножают семенами, делением кустов или корневыми черенками. Место под посадку любистка готовят следующим образом: вносят до 10 кг/м2 органических удобрений и минеральные удобрения: аммиачную селитру (20-30 г/м2), суперфосфат (40 г/м2), калийную соль (30 г/м2) [172]. Семена любистка высевают под зиму (в конце октября) или ранней весной. При весенних сроках посева в грунт всходы появляются на 20-40 день, при подзимних – в апреле. Грунтовая всхожесть семян 54%. Всходы появляются и от самосева. Глубина посадки семян 1-2 см, оптимальная температура для прорастания – 18-200 С. При размножении растений рассадой посев семян осуществляют в начале марта. В специальные горшки высевают по 2-3 семени. Через 20-25 дней начинают появляться всходы. Весь рассадный цикл занимает 60-70 дней [39]. В северных районах любисток цветет, но семена вызревать не успевают, поэтому его размножают вегетативно. Для вегетативного размножения подходят растения 3-летнего возраста. Корни разделяют на несколько частей, места среза обрабатывают золой. Части корневища, имеющие 2-3 почки, высаживают осенью или ранней весной (март) [74]. Один куст можно разделить только на 3-5 частей. При размножении делением кустов и корневыми черенками любисток быстро приживается и хорошо растёт. На одном квадратном метре допустимо выращивать не более 2-х растений, на расстоянии не менее 60 см. Уход заключается в периодическом рыхлении почвы, достаточном поливе и внесении необходимых удобрений. В течение первого года вегетации растения образуют только прикорневую розетку листьев. Срезку листьев проводят с растений второго года вегетации при достижении их высоты 10-15 см 3-4 раза на высоте 5-8 см. 30 Урожайность зелени на первый год вегетации – 2,5 кг/м2, на второй год – 4,5-6,0 кг/м2 (сорт Лидер) [118]. При соблюдении всех агрегационных условий с 1 га можно получить 2-2,5 т свежих корней и 4-6 т листьев и стеблей. Для лучшего развития после срезки необходимо вносить в почву удобрения. При недостатке влаги листья быстро грубеют. Поливают любисток 1 раз в 10-12 дней, расходуя по 12-15 литров воды на одно растение. После полива нужно провести рыхление на 3-5 сантиметров в глубину, чтобы корневища лучше разрастались. Цветение и плодоношение начинается со второго года развития растения. Пробуждение почек и отрастание зелени весной, начиная со второго года жизни, происходит очень рано в апреле первых числах мая, когда температура воздуха в почве поднимается выше 30 С. Цветет любисток в конце июня – первой декаде июля, цветение продолжается 18-30 дней. В период массового цветения, через неделю после распускания первых цветков, стебли имеют до 200 см высоту. От начала цветения до созревания первых плодов проходит в среднем 40 дней. Плодоносит регулярно. Массовое созревание плодов наблюдается в августе – сентябре. Вегетационный период продолжается в среднем 170 дней. Наблюдаются выпады растения при перезимовке. Если растения выращивают для получения надземной массы тогда необходимо систематически удалять цветоносные побеги. Для привлечения полезных насекомых (златоглазка и другие) 1-2 растения оставляют цветущими. На второй год и в дальнейшем, при многолетней культуре, любисток подкармливают в апреле комплексным минеральным удобрением «Весеннее», затем через пару недель – мочевиной (15-20 г/м2). В июле дают жидкое органическое удобрение, а осенью – компост, который заделывают в почву. Если растение выращивается для получения корней необходимо своевременно удалять цветоносы и не срезать много зелени с растения. Корень любистка выкапывают на второй или третий год после посева. Урожайность корней –1-1,5 кг/м2. Выкопанные корни промывают в холодной воде, режут на куски, сушат при температуре 30-350 С, в тени или в хорошо проветри- 31 ваемом помещении отдельно от других растений для предотвращения впитывания их сильного запаха. Хранят в плотно закрытых банках. С целью получения большого урожая листьев и корней любисток выращивают как двулетнюю культуру или как малолетнюю, обновляя посадки через 2-4 года. В Государственный реестр селекционных достижений допущенных к использованию включены 6 сортов [28, 74]: ❖ Амур – период от отрастания до срезки 22-25 дней, розетка листьев полуприподнятая, высотой 50-60 см. ❖ Геракл – период от отрастания до срезки 20-22 дня, до созревания семян – 130 дней. Растение среднекомпактное. Лист длинночерешковый, крупный, с сильным восковым налетом. Высокоароматичный, холодостойкий. ❖ Дон Жуан – отличается ранним отрастанием листьев весной, что дает возможность очень рано получать витаминную зелень. За лето зелень можно срезать до 6 раз. Урожайность зелени при многолетней культуре достигает 5-6 кг с растения. ❖ Лидер – период от отрастания до срезки 25-30 дней. Розетка листьев крупная, вертикальная, высотой до 70 см, цветонос до 2 м. ❖ Преображенский Семко – в первый год образует розетку из 7-9 листьев. Листья крупные, прикорневые. Со второго года переходит к цветению и образованию семян. Стебель прямостоящий, полый, ветвящийся в верхней части, высотой до 2 м. Лист крупный глянцевый, темно-зеленый, с сильным пряным ароматом и островато-горьковатым вкусом. ❖ Удалец – период от отрастания до срезки 25-30 дней, до цветения – 85 дней. Растение компактное, высотой до 1 м. Розетка приподнятая. Листьев до 40 штук. Лист крупный, желто-зеленый. Ароматичность сильная. Сортового районирования нет. 32 1.5 Результаты контент-анализа зарегистрированных в Российской Федерации лекарственных препаратов, обладающих диуретическим действием Современный фармацевтический рынок характеризуется неуклонным ростом номенклатуры – в Российской Федерации зарегистрировано около 18 тысяч торговых наименований лекарственных препаратов, значительная часть из них – воспроизведенные (дженерики). По имеющимся в литературе данным, диуретики составляют в среднем около 0,78% всех позиций в Государственном реестре ЛС в течение последних 20 лет. Поэтому информационный массив для проведения контент-анализа был сформирован на основании Государственного реестра ЛС за 2012 год [27]. По зарегистрированным в нем торговым наименованиям было определено, что российский фармацевтический рынок диуретиков в 2012 году включал 140 торговых наименований, что составляет 1% от общего числа зарегистрированных лекарственных препаратов. Диуретики Отечественные Импортные Рисунок 3 – Соотношение отечественных и импортных диуретических препаратов на рынке РФ Из числа зарегистрированных в России в 2012 году диуретических лекарственных препаратов 47% зарегистрированы российскими производителями и 53% зарубежными (Рисунок 3). 33 В ходе проведенных исследований была установлена средняя цена отечественных и импортных препаратов в группе диуретиков, представленных в розничной сети Ростовской области ООО «Ростов-Фарм». Розничные цены на лекарственные препараты в ООО «Ростов-Фарм» формируются в соответствии с Постановлением Правительства РФ от 08.08.2009 г. № 654 (ред. от 04.09.2012) «О совершенствовании государственного регулирования цен на лекарственные препараты, включенные в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов» и Постановлением региональной службы по тарифам Ростовской области от 25.02.2010 г. № 2/1 «Об утверждении предельных оптовых и предельных розничных надбавок к ценам на лекарственные средства и изделия медицинского назначения» [84, 85]. Для импортных препаратов средняя розничная цена составила 228,5 руб., а для препаратов отечественного производства – 35,2 руб [20]. Соотношение препаратов синтетического и растительного происхождения в группе диуретических средств представлено на рисунке 4. Содержание препаратов растительного происхождения в изучаемой группе составило 31,4%. Синтетические Растительного происхождения Рисунок 4 – Соотношение синтетических и растительных диуретических препаратов на рынке РФ 34 Препараты с включением любистка используются в европейской официнальной медицине, некоторые из них были зарегистрированы в России: травяной эликсир Биттнера (Р. Биттнер, Австрия), паста Фитолизин (Гербаполь, Польша), драже и раствор для внутреннего приёма Канефрон (Бионорика, Германия). В России, Украине, Грузии, Болгарии также зарегистрирован лекарственный препарат Болюсы Хуато, содержащий сырьё любистка сычуаньского [94]. Таким образом, из проведенных исследований следует, что отечественных препаратов на основе сырья любистка лекарственного нет, учитывая, что средняя цена диуретического препарата растительного происхождения составляет 83,80 руб. а синтетического – 181,40 руб. становится экономически целесообразной разработка отечественных препаратов растительного происхождения диуретического направления [27]. 35 ВЫВОДЫ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 1. В химическом отношении наиболее изученной группой являются фталиды, полиацетилены и эфирное масло. Другие группы БАС изучены недостаточно. 2. Содержание эфирного масла в сырье любистка лекарственного зависит от многих факторов: места произрастания, фазы развития растения, вида сырья (свежее или высушенное), органа растения взятого на анализ и т.п. 3. Любисток лекарственный издавна известен в народной медицине как отхаркивающее, противовоспалительное, желчегонное, мочегонное, спазмолитиче- ское, антибактериальное, противосудорожное, успокаивающее средство. 4. Установленная фармакологическая активность отдельных биологически активных соединений позволяет использовать любисток лекарственный для лечения актуальных нозологических форм заболеваний, в том числе, социально значимых, таких как злокачественные новообразования, инфекционные заболевания и др. 5. Корни и корневища любистка лекарственного включены в ряд зарубежных фармакопей в частности в Европейскую и Британскую Травяную Фармакопею. 6. Существующая нормативная документация не предусматривает оценку качества сырья по содержанию действующих веществ. Поэтому возникает необходимость в разработке новых подходов к стандартизации сырья и созданию современной нормативной документации. 7. Хорошо изучены приемы возделывания, интродукции, агротехники любистка лекарственного, что позволяет сделать вывод о достаточной сырьевой базе данного растительного объекта. 8. Применение и ассортимент завозимых из-за рубежа препаратов свидетельствует о необходимости восстановления Levisticum officinale в статусе официнального растения в Российской Федерации. 36 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Объекты исследования В качестве объектов исследования были использованы высушенные (в соответствии с требованиями НД, предъявляемыми к сушке эфирномасличных растений) и измельченные образцы растительного сырья – корневища и корни любистка лекарственного (Rhizomata et radices Levistici officinalis) сем. сельдерейных – Apiaceae, заготовленные осенью в период конца вегетации и весной до начала вегетации (2010-2013гг.) от выращенных на опытно-исследовательских участках (пос. Юца, Ставропольский край, сорт Удалец, площадь посева 20 м2) и культивируемых растений в других районах России (Ботанический сад ЮФУ, г. Ростов-наДону; Алтайский филиал Центрального Сибирского ботанического сада Сибирского отделения Российской академии наук «Горно-Алтайский ботанический сад», Республика Алтай, Шебалинский район, с. Камлак, урочище Чистый Луг; ботанический сад Воронежской государственной медицинской академии имени Н.Н. Бурденко, г. Воронеж). 2.2 Методы исследования углеводов 2.2.1 Свободные моносахариды Наличие свободных сахаров определяли с помощью реакции Бертрана (при нагревании смеси равных объемов водных экстрактов исследуемого сырья и реактива Фелинга) [106]. Моносахариды идентифицировали по стандартным образцам с помощью хроматографии на бумаге («Filtrak FN-15», «FN-12», «FN-7», «FN-1») нисходящим способом в системах: н-бутанол–пиридин–вода (6:4:3) и н-бутанол–кислота уксусная–вода (2:7:1) в течение 17-18 ч. Детектирование зон адсорбции на хроматограммах проводили раствором анилингидрофталата и нагревания 1050 С в течение 10-15 мин [123]. при 100- 37 2.2.2 Олиго- и полисахариды Качественное определение сахаров после гидролиза проводили реакциями с реактивом Фелинга и 20% раствором α-нафтола [26], с пикриновой кислотой в щелочной среде [78], с карбазолом в сернокислой среде [34]. Количественное содержание полисахаридов определяли методом осаждения путем прибавления к концентрированным водным извлечениям трехкратных объемов спирта этилового 96% [105]. 2.2.3 Выделение полисахаридов из растительного сырья После обезжиривания сырья хлороформом (1:15, 610 С), в течение 14 часов в аппарате Сокслета и удаления хлороформного извлечения, были последовательно выделены различные фракции углеводов: растворимые в спирте этиловом 96% (1:15, 780 С, 30 мин, дважды); растворимые в холодной воде (последовательно 1:30, 1:15, 250 С, по 2 часа); растворимые в горячей воде (1:15, 800 С, 2 часа, дважды); растворимые в 0,5% растворе аммония оксалата (1:15, 700 С, 2 часа, дважды); растворимые в 10% растворе натрия гидроксида (1:15, 250 С, 24 часа, дважды) [45]. В случае каждой фракции полученные извлечения фильтровали, объединя- ли, концентрировали под вакуумом до 1/10 первоначального объема, обрабатывали спиртом этиловым 96% (1:3), выделенные осадки фильтровали, высушивали при 700 С до постоянной массы и взвешивали. Спиртовую фракцию не обрабатывали спиртом. Щелочную фракцию до спиртовой обработки нейтрализовали 0,1 моль/л раствором уксусной кислоты до рН 7 [119]. 2.2.4 Кислотный гидролиз Для определения мономерного состава полисахаридов проводили кислотный гидролиз (10 % кислота серная; 1:4,9; 1000 C; 10 часов – для водорастворимых полисахаридов; 24 ч – для пектиновых веществ; 72 ч – для гемицеллюлоз) в запаянных ампулах [105, 106]. Содержимое ампул переносили в стаканчики, про- 38 мывали ампулы 5 мл воды, нейтрализовали бария карбонатом по универсальному индикатору до нейтральной среды. Растворы фильтровали, фильтры промывали водой до объема фильтратов 10 мл. К полученным растворам прибавляли 3 объема спирта этилового 96%, тщательно перемешивали и образовавшиеся осадки отфильтровывали через 1-2 часа. Фильтраты упаривали на кипящей водяной бане до получения объема около 1 мл (раствор А). Осадки бариевых солей уроновых кислот деионизировали катионитом КУ-2 (Н+) до рН 3-4. Растворы фильтровали, упаривали до получения около 1 мл раствора (раствор Б). 2.2.5 Хроматографический анализ углеводов Анализ проводили в соответствии с ОФС «Хроматография на бумаге» ГФ XII издания [25], нисходящим способом в системе: н-бутанол–пиридин–вода (6:4:3) в течение 17-18 часов со стандартными образцами нейтральных моносахаридов, и восходящим способом в системе: этилацетат–кислота уксусная–кислота муравьиная–вода (18:3:1:4) в течение 5-6 часов с образцами гексуроновых кислот на бумаге «FN-1». Хроматограммы высушивали на воздухе 1 час, обрабатывали раствором анилингидрофталата (для гексоз) и 5% спиртовым раствором мочевины (для кетоз), затем нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-1050 С [105, 106]. Идентификацию углеводов проводили в сравнении со стандартными образцами и по величине Rf. 2.2.6 Газожидкостная хроматография (ГЖХ) Анализ проводили в соответствии с ОФС «Газовая хроматография» ГФ XII издания [25]. Моносахаридный состав определяли методом ГЖХ в виде альдонитрилов ацетатов [45]. Исследование проводили на хроматографе Chrom-5 с пламенноионизационным детектором, колонка стеклянная (150х0,3 см), 5% Silicone XE-60 на хроматоне NAW-0,200-0,250 мм, температура термостата – 2100 С, температура детектора – 2800 С газ-носитель – азот. Скорость газа 60 мл/мин. Проба 1 мкл. 39 2.2.7 Спектрометрия в инфракрасной области Анализ проводили в соответствии с требованиями ОФС «Спектрометрия в инфракрасной области» [24] на ИК-спектрофотометре фирмы «Perkim-Elmer model 2000» в интервале волновых чисел 4000-500 см-1 в таблетках с калия бромидом (или суспензии с вазелиновым маслом) [33]. 2.2.8 Количественное определение галактуронидов Количественное определение галактуронидов методом спектрофотометрии по реакции взаимодействия с карбазолом при 530 нм проведено в сравнении с СО галактуроновой кислоты [34]. Галактурониды из фракций, извлеченных аммония оксалатом и горячей водой, выделяли путем обработки 1% водных растворов фракций спиртом этиловым 20% . Использование осадителя в указанной концентрации позволило предотвратить соосаждение сопутствующих низкомолекулярных нейтральных углеводов. 2.2.9 Определение физико-химических характеристик пектинов Значение рН 1% водных растворов анализируемых углеводных образцов при температуре 200 С определено методом потенциометрии с помощью рН-метра марки «рН-340» при использовании стеклянного в качестве индикаторного электрода и электрода сравнения – хлоридсеребряного [25]. Количественное определение свободных (Кс) и этерифицированных (Кэ) карбоксильных групп пектиновых веществ проводили титриметрическим методом с потенциометрической фиксацией точки эквивалентности на рН-метре марки «рН-340» с последующим вычислением степени этерификации. Объем титранта в точке эквивалентности определяли графически дифференциальным способом [12]. 40 2.3 Методы исследования эфирных масел 2.3.1 Газожидкостная хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС) Химический состав компонентов эфирных масел изучали методом хроматомасс-спектрометрии на газовом хроматографе Agilent Technologist 5975 SMART с квадрупольным масс-спектрометром в качестве детектора. Пробу эфирного масла разбавляли в хлористом метилене до концентрации 500 нг/мкл. Использовали хроматографическую колонку HP-5MS (кварцевый капилляр, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки неподвижной фазы 25 мкм). Режим анализа – программированный, скорость нагрева термостата колонки – 5 град/мин в диапазоне 80-2200 С. Температура испарителя 1800 С, детектора – 2200 С. Идентификацию эфирных масел проводили по масс-спектрам с использованием базы данных [109] и программ NIST ГХ-МС и Wiley 275 системы. Состав компонентов эфирного масла (%) вычисляли по площадям газохроматографических пиков без использования корректирующих коэффициентов. Анализ каждой пробы проводили 3 раза. 2.4 Методы исследования фенольных соединений 2.4.1 Выделение и качественное обнаружение фенольных соединений Для изучения фенольных соединений готовили спиртоводные извлечения с последующим фракционированием органическими растворителями различной полярности, что позволило сконцентрировать группы компонентов, различающихся по классам органических соединений. Для получения спиртового извлечения использовали спирт этиловый различной концентрации: 40, 70 и 96%. Кратность экстракции равна 3, время экстракции – по 60 минут, соотношение сырье – экстрагент – 1:10. Температура экстракции – 60-650 С. Суммарный выход составил – 35%. Затем экстрагент отгоняли под вакуумом до водного остатка, охлаждали при +40 С в течение 48 часов, фильтровали (отделяли хлорофилл и смолистые вещества) и сгущали, затем использовали для последовательной жидкофазной экстракции органические растворители: диэтиловый эфир, хлороформ и этилацетат 41 (порциями по 30 мл, 6-7 раз в делительной воронке). Полученные с помощью органических растворителей извлечения упаривали в вакууме до смолообразного остатка и использовали для проведения общепринятых качественных реакций и хроматографического анализа для каждой группы [123]. Для изучения флавоноидных агликонов полученные диэтилэфирные извлечения упаривали досуха. Остаток хроматографировали на бумаге в системах растворителей бензол–этилацетат–уксусная кислота (50:50:1) и 30% раствор кислоты уксусной. Хроматограммы просматривали в УФ свете (366 нм) до и после обработки их специфическими реактивами (пары аммиака, 10% раствор алюминия (III) хлорида в спирте этиловом). Хлороформные фракции использовали для обнаружения кумаринов методом ТСХ на пластинках «Silufol» с использованием в качестве подвижной фазы системы растворителей: бензол – этилацетат (2:1). Хроматограммы просматривали в УФ свете до и после обработки их специфическими реактивами (пары аммиака, 10% раствор калия гидроксида в спирте этиловом, раствор диазотированной сульфаниловой кислоты) [28]. 2.4.2 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ Анализ проводили в соответствии с ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография» (ВЭЖХ) ГФ XII изд. [25] на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «Gilston» (модель 305, Франция), инжектор ручной модель «Rheodyne» 7125 (США). Содержание рассчитывали методом абсолютной калибровки с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мультихром для «Windows». Анализу подвергали спиртовое извлечение из сырья (70% спирт этиловый; 1:50; t кип., 1 час). Параллельно с исследуемым извлечением готовили серию 0,05% растворов стандартных образцов в 70% спирте этиловом: изосалипурпозида, рутина, кверцетина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, галловой кислоты, кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, коричной кислоты, гиперозида, гесперидина, апигенина, арбутина, феруловой кислоты, изоферуловой, виценина, витек- 42 сина, 4-оксикумарина, скополетина, салициловой кислоты, неохлороеновой кислоты, эллаговой кислоты, робинина, дикумарина, кумарина, умбеллиферона, дигидрокверцетина, катехина, ориентина. Идентификацию разделенных веществ проводили путем сопоставления времен удерживания пиков, полученных на хроматограмме пробы, с временами удерживания растворов стандартных образцов. Оценку количественного соотношения идентифицированных веществ в исследуемых образцах проводили по площади пиков, используя метод внутренней нормализации [43, 44]. 2.5 Методы исследования макро- и микроэлементного состава Качественное и количественное содержание макро- и микроэлементов в золе, полученной из растительного сырья, проводили в Центральной испытательной лаборатории при ФГУП «Кавказгеолсъемка» методом полуколичественного спектрального анализа минерального сырья с использованием стандартных образцов (СО) [22]. Образцы сырья измельчали и подвергали озолению в муфельной печи при температуре 450-5000 С. Для получения спектра использовали спектрограф ДФС-8-1. Фотометрирование спектрограмм проводили с помощью атласа спектральных линий и спектров-стандартов [117]. Метод основан на полном испарении аналитической навески из кратера угольного электрода в плазме электрической дуги переменного тока. 2.6 Изучение аминокислотного состава Для проведения анализа сырье предварительно экстрагировали водой (1:20, 700 С, 30 мин., трижды), извлечения фильтровали, объединяли, упаривали досуха. Сухой остаток исследовали на содержание свободных и связанных аминокислот, образующихся после гидролиза (раствор кислоты хлористоводородной 6 моль/л, 1:5, 1100 С, 72 часа) с последующим удалением растворителя, растворением сухого остатка массой около 0,2 г (точная навеска) в ацетатном буферном растворе (рН 5,5) и доведением объема раствора до 10 мл. 43 Для анализа аминокислот использовали метод ВЭЖХ с применением аминокислотного анализатора марки «ААА-339» (Чехия) на колонке Waters AccQ Tag размером 3,9х150 мм в сравнении со стандартными образцами аминокислот (соответствующими ТУ 6-09-3147-83) в концентрации 2,5 моль/л. Детектирование зон адсорбции аминокислот проводили с помощью 1% раствора нингидрина, приготовленного на основе ацетатного буферного раствора (рН 5,5). Идентификацию и содержание аминокислот определяли по времени удерживания и площади пиков на хроматограмме [28]. 2.7 Общие методики стандартизации сырья 2.7.1 Методы отбора проб для анализа Отбор проб для товароведческого анализа сырья исследуемых видов проводили в соответствии с ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб» [77]. 2.7.2 Морфолого-анатомические исследования Макроскопический анализ образцов сырья проводили по методикам ГФ XI для различных морфологических групп [26]. Микроскопический анализ проводили на свежем, фиксированном (смесь спирта и глицерина) и высушенном растительном материале [30]. Препараты для микроскопического исследования готовили согласно статьям ГФ XI изд. [26]. Микропрепараты изучали с помощью микроскопа «Биолам». Микрофотографии были получены с помощью микроскопа «DM-111» фирмы «Motic» со встроенной цифровой камерой при увеличениях 40, 100, 400, 1000 с разрешением 640х480 пикселей. Фотоснимки обрабатывали на компьютере с помощью программы «Adobe Photoshop CS» и «CorelDRAW X3». 44 2.7.3 Определение числовых показателей качества сырья Определение числовых показателей (влажности, золы общей, золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, содержания экстрактивных веществ, примесей) проводили по методикам ГФ XI и ГФ XII [24, 25, 68]. 2.7.4 Определение микробиологической чистоты сырья Контроль качества ЛРС на микробиологическую чистоту проводили согласно статье ГФ XII «Методы микробиологического контроля лекарственных средств» [24]. 2.7.5 Определение содержания радионуклидов Подготовка счетных образцов сырья осуществлялась в соответствии с «Методическими рекомендациями по санитарному контролю за содержанием радиоактивных веществ в объектах внешней среды» и ОФС 42-0011-03 «Определение содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье. Стронций-90, Цезий-137. Отбор проб, анализ, оценка результатов» [76]. Выделение стронция-90 проводилось радиохимическим методом с дальнейшим измерением активности на установке РУБ-О1П1. Измерение радионуклидного состава проб проводилось на полупроводников гамма-спектрометре на основе IBM PC-386 [76]. 2.7.6 Определение сроков хранения сырья Срок годности сырья определяли на образцах, хранившихся в сухом, хорошо проветриваемом помещении, в защищенном от прямых солнечных лучей месте, в бумажных мешках по ГОСТ 17768-90 в условиях лаборатории. В образцах каждые полгода определялось содержание БАС. Определение числовых показателей проводили по методикам ГФ XI [26] и ГФ XII [24, 25] в высушенном растительном материале в 6 повторностях. 45 2.7.7 Статистическая обработка данных Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований проводилась по методике ГФ XII [25]. Результаты считали достоверно значимыми при наблюдении эффекта в 95 % случаев (P<0,05), анатомо-морфологических – по общепринятым методикам [35]. Расчеты проводили с помощью программы Microsoft Office Excel. 2.7.8 Валидация методик количественного определения Валидационная оценка разработанных методик количественного определения БАС в некоторых видах сырья, на которые разрабатывали проекты НД, проводилась в соответствии с требованиями ОФС «Валидация аналитических методик» ГФ XII [25]. 2.8 Методы токсико-фармакологических исследований Экспериментальная работа выполнена на животных двух видов: белых крысах линии Wistar (200-250 г), беспородных белых мышах (18-22 г). Животных содержали в условиях вивариев в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (г. Страсбург, 1986) [90]. 2.8.1 Исследование «острой» токсичности Опыты по изучению «острой» токсичности проводились по методу Кербера [96, 102]. Эксперименты выполнены на белых беспородных мышах обоего пола, прошедших 10-тидневный карантин при разных путях введения. При пероральном введении однократная доза исследуемого экстракта составила 5000 мг/кг, при внутрибрюшинном введении – 3000 мг/кг [96]. В работе соблюдались правила по содержанию, защите, использованию лабораторных животных, а также рекомендаций из руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [23, 96]. В 46 каждой группе было 6 мышей. Объекты вводили однократно перорально с помощью желудочного зонда. После введения экстракта оценивали состояние животных в течение 6 часов непрерывно, далее на протяжении 14 суток. Критериями оценки «острой» токсичности служила картина интоксикации и выживаемости животных, а также состояние внутренних органов. С целью установления или отсутствия нейротоксичности сухого экстракта любистка проводили тест «Открытое поле» на мышах. Опыт проводили через 24 часа после введения максимальной дозы экстракта. Оценивали такие показатели, как эмоциональная, физическая активность, горизонтальная и вертикальная энергичность по следующим параметрам: число пересеченных квадратов, время нахождения в центре, количество стоек, грумминга, актов дефекации и диуреза. Контролем служили животные, которым перорально вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. 2.8.2 Исследование отхаркивающего действия Исследование проводили на белых беспородных крысах. Проведено 3 серии экспериментов (6 трахей животных в каждой серии). Для этого была использована методика in vitro, так как активность ворсинок эпителия трахеи сохраняется в течение нескольких часов изоляции, что важно для этой методики на этапе отбора активаторов транспортной функции эпителия [102]. Методика изучения отхаркивающего действия заключается в следующем – у декапитированных крыс освобождали трахею от прилегающих тканей и извлекали. После чего трахею фиксировали на стеклянной пластинке и помещали ее в пластиковый бокс с раствором Тироде, во время эксперимента в боксе поддерживалась постоянная температура. Активность ворсинок трахеи определялась временем продвижения на 5 мм маковых зерен, помещенных на противоположный гортанному участок слизистой трахеи. Статистическую обработку полученных результатов производили с использованием критерия Стьюдента для независимых 47 рядов. Расчёты результатов проводились в пакете компьютерной программы Microsoft Excel 2000 [11]. 2.8.3 Изучение антибактериальной активности Антимикробную активность устанавливали в отношении стандартного набора индикаторных штаммов микроорганизмов методом культивирования микробов на среде с добавлением фитосубстанции в сравнении с контролем в соответствии с ГФ XII издания [24]. Из исследуемых субстанций готовили различные разведения в стерильном расплавленном и остуженном до 500 С питательном агаре. Содержимое после перемешивания заливали в стерильные чашки Петри и оставляли при комнатной температуре, после застывания агара чашки делили на секторы. Каждый сектор засевали штриховым методом взвесью суточных культур, содержащей 100 млн. микробных тел в 1 мл, в количестве одной бактериальной петли. Контролем являлись посевы тех же бактерий на питательные среды, не содержащие испытуемых препаратов. Посевы инкубировали в термостате при температуре +37 0 С. Результаты эксперимента учитывали через 24 и 48 часов (для грибов рода Candida). При этом регистрировали интенсивность роста колоний микроорганизмов (сильный рост, слабый рост) или его отсутствие. Антимикробную активность выражали в мкг/мл в пересчете на действующие вещества и воздушно-сухое сырье, из которого приготовлено извлечение. 2.8.4 Изучение спазмолитической активности Для предварительного изучения спазмолитической активности из верхнего отдела тонкой кишки крысы вырезали фрагмент длиной 4 см. Участок тонкого кишечника промывали раствором Рингера для теплокровных животных. Один конец кишки фиксировали к неподвижному упору, находящемуся на дне кюветы, второй с помощью нитки соединяли с легким рычажком. Рычажок должен быть жестко соединен с подвижной шторкой, выполненной из легкой фольги. В качестве регистрирующего устройства применяли фотоэлектрический датчик, соеди- 48 ненный с самопишущим прибором КСП-1. Кювету с фрагментом кишки заливали известным объемом раствора Рингера и погружалив термостат при 370 С. Сокращение или перистальтические движения кишки передаются на подвижный рычажок, который перемещает шторку фотоэлектрического датчика, изменяя световой поток от лампочки, укрепленной перед фотодатчиком. Сигнал от фотоэлектрического датчика передается на самопишущее устройство и регистрируется на бумажной ленте. Таким образом, любое изменение в характере тонуса или перистальтики кишки фиксируется документально. Изучаемые вещества в виде растворов вносили непосредственно в кювету, где инкубировалась кишка в растворе Рингера. Зная объем кюветы, вносимый объем раствора вещества и его концентрацию рассчитывали конечную концентрацию веществ в инкубационной смеси. По характеру кривой судили о влиянии изучаемого вещества на тонус, перистальтику и энергетический потенциал кишки. Экспериментальное исследование поводили на крысах линии Wistar массой 200-250 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Статистическая обработка результатов проводилась методом вариационной статистики с использованием комплекта программ MS Excel 2007 с использованием коэффициента Стьюдента. 2.8.5 Изучение диуретической активности Опыты проводили с использованием крыс линии Wistar массой 200-250 г. В день, предшествующий эксперименту, крысы не получали пищи и воды. Для регистрации мочегонного эффекта все животные получали водную нагрузку физиологическим раствором, из расчёта 5% от массы животного. Животные были разделены на 3 группы (n=6). В первой группе – биологический контроль – животные получали только физиологический раствор, во второй – группе сравнения – гипохлоротиазид в дозе 4,6 мг/кг, в третьей – опытной – исследуемый экстракт в дозе 975 мг/кг. Дозировка экстракта рассчитывалась с учетом LD50 и коэффициента межвидового переноса доз. После введения препаратов всех животных помещали в «обменные» клетки в течение 4 часов регистрировали диурез. 49 Оценивали количество мочи собранной от одного животного за 2 часа в мл/200 грамм массы тела. 2.8.6 Изучение желчегонной активности Оценку желчевыделительной функций печени проводили через сутки после 10-дневного введения субстанций здоровым животным. В качестве контроля использовали животных, получавших 10 дней растворитель. Определение скорости секреции желчи проводили по методу М.Д. Литвинчук и З.И. Новосилец 50, холестерина и желчных кислот в желчи – по В.П. Мирошниченко [55]. Результаты обрабатывались методом вариационной статистики. За 12 часов до операции по отбору желчи животных лишали еды. Подопытных крыс наркотизировали при помощи этаминала (40 мг/кг). После ее фиксации на операционном столике проводили вскрытие брюшной полости разрезом в эпигастральной области длиной 1,5-2,0 см. Находили двенадцатиперстную кишку и место вхождения в нее желчного протока. Выше этого места 12-типерстную кишку перевязывали, а вторую перевязку делали ниже впадения желчного протока в кишечник. В образовавшийся замкнутый мешочек, куда впадал желчный проток, вставляли трубку – канюлю и собирали желчь в мерную пробирку в течение 3-х часов. Регистрировали объем выделившейся желчи в целом за 3 часа. Для сохранения эвакуаторной функции желудочно-кишечного тракта с помощью эластичной трубки между проксимальной и дистальной частью кишечника накладывали анастомоз. Поступающую в желчный резервуар желчь через канюлю собирали в мерные пробирки с точной градуировкой (из гемометра Сали). Процесс желчевыделения оценивали по объему желчи в мл за 3 часа. Количество полученной желчи пересчитывали на единицу массы животного. 50 ГЛАВА 3. ИНТРОДУКЦИОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО В УСЛОВИЯХ КАВКАЗСКИХ МИНЕРАЛЬНЫХ ВОД Учитывая, что приемы возделывания, интродукции и агротехники любистка лекарственного достаточно хорошо изучены (глава 1.4) представляло интерес изучение возможности выращивания любистка лекарственного и на территории экологически безопасного района Ставропольского края (КМВ) с целью расширения мест культивирования данного вида. Работа проводилась на опытно-исследовательских участках ЗАО «ЛекМар» (пос. Юца, Предгорный район Ставропольского края). Поселок Юца расположен в предгорной зоне северного склона Центрального Кавказа на высоте 675 м над уровнем моря, по берегам рек Юца и Джуца, между гор Юца (973 м) и Джуца (1190 м) на Минераловодской равнине. Почвообразующей породой являются аллювиальные отложения, частично перекрытые делювием. Эти отложения отличаются высокой карбонатностью. Климат региона континентальный. Зима умеренно холодная, влажная, малоснежная. Лето жаркое. Переходные сезоны (весна, осень) короткие. Существенную роль в формировании климата играют Кавказские горы, преграждающие западный перенос воздушных масс. Такое положение заметно увеличивает увлажненность. При проведении интродукционных исследований руководствовались «Методикой исследований при интродукции лекарственных растений», разработанной в ВИЛАРе [52]. Растения выращивались на опытных трансектах площадью 20 м2 (10х2) в пяти биологических повторностях. Ширина междурядий составляла 20 см, между растениями 30 см, глубина посева семян 1-2 см. Опыты проводились в течение 3-х лет (2011-2013 гг.). В качестве исходного посадочного материала были использованы плоды любистка лекарственного культивируемого сорта Удалец (ООО СПК «Агропро- 51 мышленный дом», изготовитель ЗАО НПК «НК ЛТД» под маркой «Русский Огород»), а также плоды собственной репродукции (свежие и хранившиеся 1 год). Фенологические наблюдения велись за двулетними растениями. Исследовались условия прорастания семян (плодов), изучалась фенология растения, прохождение онтогенеза, накопления биомассы и действующих веществ, определялись факторы сырьевой продуктивности, сроки заготовок. 3.1 Изучение лабораторной всхожести семян любистка лекарственного В лабораторных условиях изучение биологических особенностей прорастания семян проводится для определения нормы и сроков посева семян в грунт, обоснования предварительной обработки семян и возможности установления сроков всхожести семян. В связи с этим в лабораторных условиях определяли всхожесть семян и энергию прорастания в условиях различных режимов стратификации. Температурный режим стратификации – постоянные температуры: + 5, 0, -5, -100 С в течение 1 месяца; переменные температуры: 1 месяц при повышенной и 5 месяцев при пониженной температуре, режимы: +20 – 0; +20 – -5, +20 – -100 С. Стратификацию семян проводили в чашках Петри. Семена были обеззаражены раствором калия перманганата и стратифицировались в холодильнике при соответствующих температурах. Для проращивания семян использовали, дезинфицированные этиловым спиртом чашки Петри. В случае появления плесени их перекладывали на чистое ложе. В качестве ложа в чашках Петри применяли смоченную водой вату и белую фильтровальную бумагу. Важное значение имеет правильность увлажнения ложа, так как при излишке воды задерживается доступ воздуха к семенам, а недостаточность увлажнения вызывает пересыхание ложа, что ведет к искажению результатов опыта. Семена раскладывают на ложе чашки Петри равномерно на расстоянии 0,5-1 см одно от другого. Такое расположение необходимо для предотвращения распространения инфекции и для правильной оценки основных частей ростка. 52 Условия освещения при проращивании: свет (дневной). Температура при проращивании +200 С. Круглосуточное проращивание семян на свету проводили в термостате с открытой наружной дверцей, поставив его лицевой стороной к свету. Для равномерного освещения семян в термостате снимали часть полок. Повторность (1 чашка – 50 семян) – 5-кратная. Для притока к семенам свежего воздуха необходимо ежедневно приоткрывать на 1-2 мин чашки Петри. Для данного эксперимента были использованы свежесобранные семена собственной репродукции. Ежедневно проводили осмотр чашек Петри для учета всхожести семян, удаляя все «нормально» и «ненормально» проросшие семена. К «нормально» проросшим семенам относят семена, имеющие нормально развитый корешок размером не менее длины семени. К «ненормально» проросшим семенам относили семена, имеющие следующие дефекты: уродливые ростки и корешки, ростки без корешков, нитевидные и водянистые корешки без волосков, корешки со вздутиями и ко времени определения всхожести не развившие дополнительных корешков, корешки или ростки с трещинами и перехватами, достигающие проводящих тканей, ненормально увеличенные семядоли и укороченные корешки. К невсхожим семенам относили набухшие семена, которые к моменту окончательного определения всхожести не проросли, но имели здоровый вид и при надавливании пинцетом не раздавливались; загнившие семена с мягким разложившимся эндоспермом, загнившим зародышем, с частично или полностью загнившими корешками; твердые семена, которые к установленному методикой сроку определения всхожести остаются не набухшими или не изменяют первоначального внешнего вида. Подсчет проросших семян проводили в течение 7 дней [42]. Энергию прорастания семян определяли на третий день проращивания [121]. Результаты представлены в таблице 1. 53 Таблица 1 – Влияние режимов стратификации на прорастание семян любистка лекарственного в лабораторных условиях Условия стратификации Энергия прорастания, % постоянная температура 0 +5 С 1,0±0,3 0 0 С 2,1±0,2 0 -5 С 8,0±0,2 0 -10 С 10,0±0,3 переменная температура 0 +20 – 0 С 13,0±0,2 0 +20 – -5 С 20,0±0,1 0 +20 – -10 С 35,5±0,1 Всхожесть, % 2,12±0,01 3,25±0,02 10,3±1,03 15,48±2,04 33,13±5,01 62,21±3,12 71,42±2,01 Таким образом, стратификация при постоянной температуре не дала значимых результатов. Стратификация, проведенная в условиях чередования теплых и холодных температур в течение 6 месяцев показала всхожесть от 33% до 71%, а с увеличением интервала температур возрастает и энергия проращивания. Так как подбор условий стратификации осуществлялся в соответствии с естественными природно-климатическими особенностями региона КМВ, можно предположить, что высокая всхожесть семян в почве может наблюдаться при условии посева в августе-сентябре свежесобранными созревшими семенами. 3.2 Определение полевой всхожести Полевую и лабораторную всхожесть семян после стратификации определяли при различных температурных режимах [115, 116]. Семена любистка лекарственного высеивали в открытый грунт 15 октября 2010 г., 15 марта 2011 г., 20 августа 2011 г., 20 сентября 2012 г. Использовались откалиброванные семена. Посев семян осенью осуществляли непосредственно после их сбора, весной после хранения в течение 7 месяцев. Данные о погодных условиях были взяты на Пятигорской гидрологической станции. Результаты опытов представлены в таблице 2. 54 Сравнивая результаты прорастания семян в лабораторных и полевых условиях, пришли к заключению, что полевая всхожесть сопоставима с лабораторной, учитывая перепады ночной и дневной температуры. Таблица 2 – Результаты сравнительной лабораторной и полевой всхожести семян любистка лекарственного Год посева 2010 (осень) 2011 (весна) 2011 (лето) 2012 (осень) Средняя температура при проращивании +150 С +100 С +320 С +300 С Лабораторная всхожесть, % 55 20 82 80 Полевая всхожесть, % 47 34 72 74 Таким образом, установлено, что семена любистка лекарственного в открытый грунт необходимо сеять в конце августа и начале осени. Это объясняется тем, что в данный период устанавливаются наиболее благоприятные температура воздуха и температура и влажность почвы. Косвенным подтверждением данного факта являются результаты полевых опытов, которые показали, что любисток лекарственный в условиях КМВ проходит все фазы развития, цветет и плодоносит, образует полноценные семена, и дает жизнеспособный самосев. 3.3 Фенологические особенности развития любистка лекарственного Одновременно с установлением оптимальных сроков посева семян в открытый грунт проводили фенологические наблюдения за растениями. Особенности развития растений исследовали путем установления сроков прохождения фенофаз. Отмечали следующие периоды развития: ювенильный, имматурный, виргинильный и генеративный. Начало периода датировалось при его наступлении у 10% растений, а ее массовое прохождение – у 70% растений [42]. Растения на первом году вегетации нормально росли и развивались. Наблюдения за появлением всходов показали, что ювенильный период растянут от 10 до 20 суток (Рисунок 5). 55 Рисунок 5 – Ювенильный период развития любистка лекарственного Через месяц после появления всходов сформировалась розетка из настоящих 4-5 листьев – имматурный период (Рисунок 6). Через два месяца масса всего растения достигала ~260-300 г, а масса подземных органов от 65 до 90 г. Во второй половине сентября началось постепенное отмирание листьев, которое закончилось к началу октября. Растения второго года вегетации начали давать проростки в начале апреля. К середине мая уже образуется розетка из 5-7 листьев, т.е. в течение второго года жизни происходит более быстрое нарастание вегетативной массы (Рисунок 7). В конце мая начале июня наблюдается наибольшее накопление массы надземной части, в это время она составляет ~450-620 г. Затем листья грубеют и отмирают. Поэтому заготовку надземной части следует производить не позднее начала июня (Рисунок 8). 56 Рисунок 6 – Имматурный период развития любистка лекарственного (первый год вегетации) Рисунок 7 – Виргинильный период развития любистка лекарственного (второй год вегетации) 57 Рисунок 8 – Период массовой вегетации надземной части (второй год вегетации) Бутонизация начинается в начале мая. Цветонос формируется после отрастания 5 прикорневых листьев. Массовое цветение наступает в конце июня (Рисунок 9). Период цветения продолжается от 10 до 25 дней. Возможно, продолжительность цветения зависит от засушливости периода. 58 А Б В Рисунок 9 – Генеративная фаза развития любистка лекарственного (второй год вегетации): А – период цветения, Б – цветение зонтика второго порядка, В – фаза плодоношения В культуре наступление генеративного периода наблюдается на второй год вегетации у 95% особей. Заготовку семян производят на второй год вегетации в начале августа после созревания семян зонтиков первого порядка. К концу второго года вегетации масса корневищ и корней составляла в среднем от 560 до 760 г. Итоги фенологических наблюдений представлены в таблице 3. 59 Таблица 3 – Ритм сезонного развития любистка лекарственного в условиях выращивания в регионе Кавказских Минеральных Вод второго года выращивания Фазы вегетации Проростки Появление развитых листьев Бутонизация: начало массовая Цветение: начало массовое Созревание плодов: начало конец Конец вегетации Сроки посева 15.10.2010 30.03 29.04 20.08.2011 02.04 02.05 29.05 2.06 05.06 10.06 12.06 20.06 14.06 21.06 25.07 15.08 15.09 22.07 16.08 10.09 В результате проведения фенологических наблюдений за любистком лекарственным в 2011-2013 гг. нами было установлено, что оптимальными сроками посева семян в открытый грунт являются, конец августа начало сентября. В этот период наблюдаются благоприятные климатические факторы, и отмечался наибольший процент всхожести в весенний период (74%). Растение за два года проходили все периоды развития. Наблюдения показывают, что каждая фаза вегетации любистка лекарственного ежегодно приходится приблизительно на одно и то же время. 3.4 Определение семенной продуктивности и урожайности любистка лекарственного в условиях культуры При оценке культуры определяющими факторами являются урожайность сырья и содержание в нем действующих веществ. Сырьевая и семенная продуктивность растения – это количество сырья и семян, выраженное в единицах массы, приходящееся в среднем на одно растение определенного возраста. Урожайность можно рассчитать из данных по продуктивности и густоте (числа) стояния растений на 1 га. 60 В исследовании учитывалась реальная семенная продуктивность [13]. Для определения семенной продуктивности использовался метод модельных растений. Подсчет проводили в полевых условиях. Семенную продуктивность рассчитывали как среднюю массу семян, приходящихся на одно растение. Проба включала 10 растений. Определение массы 1000 семян проводили после тщательного их перемешивания и деления на 10 проб по 100 шт. Каждую пробу взвешивали с погрешностью до 0,0001 г и суммировали. За достоверные образцы брали сумму двух проб, у которых расхождение в массе не превышало 5% [42]. Масса 1000 штук семян составляла в среднем 2,05 г. Таблица 4 – Урожайность семян любистка лекарственного в условиях выращивания в регионе КМВ Урожайность семян Масса Продуктивность семян, Год 1000 шт. г кг/м2 ц/га 2012 2,1468±0,43 42,56±15,19 0,15 14,89 2013 2,7612±0,91 45,64±12,78 0,19 18,26 Таблица 5 – Урожайность надземной части любистка лекарственного в условиях выращивания в регионе КМВ Число Продуктивность Урожайность Год растений надземной 2 2 кг/м ц/га на 1 м части, г 2011* 4 287,29±23,14 1,15 114,92 2012 3,5 580,96± 42,71 2,03 203,34 2013 4 491,08± 42,71 1,96 196,43 Таблица 6 – Урожайность подземной части любистка лекарственного в условиях выращивания в регионе КМВ Число Продуктивность Урожайность Год растений подземной кг/м2 ц/га 2 на 1 м части, г 2011* 4 77,73±12,55 0,31 31,09 2012 3,5 731,43± 25,97 2,56 256,00 2013 4 620,41± 54,23 2,48 248,16 В таблицах 5 и 6 за 2011* год приведены данные для растений первого года вегетации. 61 На основании приведенных по учету продуктивности и урожайности представленных в таблицах 4, 5, 6 видно, что в течение трех лет эксперимента были получены сравнительно стабильные результаты для растений второго года вегетации. Таким образом, проведенные исследования показывают, что данную лекарственную культуру можно выращивать в лесостепной зоне с элементами горностепного климата Ставропольского края. 3.5 Обоснование выбора морфологической группы в качестве ЛРС Для обоснования выбора морфологической группы в качестве лекарственного растительного сырья определили выход воздушно-сухого сырья от свежесобранного (Таблица 7) и количественное содержание основных групп БАС: кумаринов и эфирного масла (Таблица 8). Таблица 7 – Выход воздушно-сухого сырья любистка лекарственного Сырье Трава Корневища и корни Год сбора сырья 2012 2013 2012 2013 Масса свежесобранного сырья, г 1658,00 1682,45 2479,60 2924,00 Масса высушенного сырья, г 203,92 225,45 795,95 976,62 Выход, % 12,3 13,4 32,1 33,4 Таким образом, средний выход воздушно-сухого сырья составляет для травы – 12,85%, а корневищ и корней – 32,75%. Таблица 8 – Ориентировочный выход БАС из сырья любистка лекарственного в пересчете на воздушно-сухое сырье Корневища и корни Трава Год сбора Группа БАС % кг/га % кг/га сырья 2012 1,4 111,43 0,21 4,29 Эфирное масло 2013 1,6 136,73 0,32 7,21 2012 1,72 136,90 0,13 2,65 Кумарины 2013 1,81 154,67 0,17 3,83 62 Количественное определение эфирного масла проводили в аппарате Клевенджера, время перегонки составляло 4 часа. Определение кумаринов оценивали методом прямой спектрофотометрии хлороформных экстрактов при аналитической дине волны 320 нм [177]. Таким образом, как следует из полученных данных экономически выгодно использовать в качестве лекарственного растительного сырья подземные органы (корневища и корни) любистка лекарственного [73]. 63 ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 3 1. Изучена лабораторная и полевая всхожесть семян любистка лекарственного, различного географического происхождения и режимов стратификации. 2. Стратификация при постоянной температуре не дала значимых результатов. Стратификации, проведенная в условиях чередования теплых и холодных температур в течение 6 месяцев показала всхожесть от 33 до 71%. С увеличением интервала температур возрастала и энергия проращивания. 3. Установлено, что оптимальными сроками посева семян в открытый грунт являются, конец августа начало сентября. В этот период наблюдаются благоприятные климатические факторы, и отмечался наибольший процент всхожести в весенний период (74%). 4. Растение за два года проходили все периоды развития: ювенильный, имматурный, виргинильный и генеративный. Наблюдения показывают, что каждая фаза вегетации любистка лекарственного ежегодно приходится приблизительно на одно и то же время. 5. Установлены урожайность семян до 16 ц/га, урожайность надземной части до 200 ц/га, подземных органов до 250 ц/га. 6. Средний выход воздушно-сухого сырья для травы составил – 12,85%, а корневищ и корней – 32,75%. 7. Ориентировочный выход кумаринов из подземных органов любистка лекарственного составил от 2,65 до 3,83 кг/га, эфирного масла 4,29-7,21 кг/га. 8. Из полученных данных установлено, что экономически выгодно использовать в качестве лекарственного растительного сырья подземные органы (корневища и корни) любистка лекарственного. 9. Данную лекарственную культуру можно выращивать в лесостепной зоне с элементами горностепного климата Ставропольского края. 64 ГЛАВА 4. МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОРНЕВИЩ И КОРНЕЙ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО Основополагающим этапом стандартизации растительного сырья является определение морфологических характеристик с использованием метода микроскопии с включением в НД микрофотографий диагностически значимых признаков [86, 87, 88, 98]. Имеющиеся в научной литературе данные по этому вопросу, имеют фрагментарный характер, поэтому требуют уточнений и дополнений. 4.1 Морфологическая характеристика сырья Корень и корневища образуют мочковатый тип корневой системы, часто расщеплены вдоль. Корневище короткое до 5 см в диаметре, коническое, почти отвесное (является продолжением стебля), кольчато-морщинистое, внутри полое, с поперечными перегородками, простое или с бугорками с вертикально отходящими многочисленными придаточными корнями длиной до 30 см. В коре корневища расположены многочисленные смоляные ходы, которые хорошо визуально заметны на изломах в виде блестящих оранжевых точек. Корни слабо ветвящиеся, утолщены до 1,5 см и до 2,5 см длины, излом корня обычно гладкий, на изломе заметна очень широкая беловато-желтая кора и узкая полоска коричнево-желтой древесины. Тип корневой системы взрослых виргинильных особей меняется в зависимости от условий увлажнения. На заболоченных местах корневая система размещается в поверхностном 7-сантиметровом слое почвы, представлена коротким, сильно утолщенным базальным участком главного корня и отходящими от него многочисленными морщинистыми беловатыми боковыми корнями диаметром 1,5 см. Боковые корни густо покрыты тонкими диаметром 0,2-0,5 мм корнями, собранными в пучки. На дренированных почвах особи имеют хорошо выраженные разветвленный главный корень, достигающий значительной глубины. 65 В соответствии с требованиями, предъявляемыми к стандартизации лекарственного растительного сырья, определили морфологические диагностические признаки корневищ и корней любистка лекарственного [100]. Цельное сырье (Рисунок 10). Куски корневищ и корней, разрезанные вдоль или поперек, преимущественно цилиндрической формы, твердые, плотные. Корневища короткие, толстые до 5 см в диаметре, с несколькими выступами, неочищенные от опробковевшего слоя, твердые, но легкие (не тонут в воде). Корни А Б Рисунок 10 – Внешний вид корневищ и корней любистка лекарственного: А – свежих, Б – высушенных 66 почти цилиндрической формы или расщепленные на 2-3 части, слегка суживающиеся к концу, без особого ветвления, редко спирально перекрученные, также неочищенные от пробки, диаметром 0,2-1,5 см, до 25 см в длину. Поверхность корневищ и корней продольно-морщинистая, излом зернисто-шероховатый, пористый, в центре видна узкая полоса светло-желтой древесины, окруженная очень широкой серовато-белой корой. Цвет поверхности корневищ и корней коричневый, запах ароматный, вкус водного извлечения острый, горьковатый. А Б Рисунок 11 – Внешний вид сырья любистка лекарственного: А – измельченного, Б – порошка Измельченное сырье (Рисунок 11 А). Кусочки корневищ и корней цилиндрической формы в сечении длиной до 5 см, шириной до 3 см, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Цвет с поверхности светло-коричневый, на изломе светло-желтоватый, запах ароматный, вкус водного извлечения горьковатый. Порошок (Рисунок 11 Б). Порошок светло-коричневого цвета, с темными вкраплениями, проходящий сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, запах ароматный, вкус водного извлечения горький. 67 4.2 Анатомическая характеристика корневищ и корней любистка лекарственного Корневище имеет непучковый тип строения проводящей системы (Рисунок 12 А). На поперечном срезе видна хорошо развитая покровная ткань – перидерма, состоящая из феллемы, феллогена и феллодермы. Феллема (пробка) хорошо выражена, многослойная. Клетки ее прямоугольной формы, вытянуты в тангентальном направлении, располагаются почти правильными рядами. Наружные клетки феллемы сдавлены и полости не видны. Кора занимает большой объем. Она состоит из клеток паренхимы и эфирномасличных каналов, схизогенного происхождения, которые на поперечном срезе имеют округлую форму. Секретирующие клетки живые, тонкостенные, овальной формы – ограничивают полость канала. Механическая ткань отсутствует. Клетки паренхимы многогранной формы, сравнительно мелкие, располагаются радиальными рядами, при этом светлые участки чередуются с более темными. Внутрь от коры располагаются центральный цилиндр, состоящий из флоэмы, камбия, ксилемы и сердцевины (Рисунок 13). Флоэма состоит из живых, тонкостенных, мелких клеток. Механические элементы в составе флоэмы отсутствуют. Камбий хорошо виден между флоэмой и ксилемой. Он состоит из нескольких слоев клеток. Ксилема по объему превышает флоэму в 2-3 раза. В ней имеются проводящие элементы – трахеи (сосуды), которые на поперечном срезе округлой формы, с утолщенной, одревесневшей стенкой. Располагаются трахеи радиальными рядами одиночно или небольшими группами. Трахеи хорошо выделяются на фоне мелких бесцветных клеток паренхимы, которые имеют многогранную форму, не одревесневшую клеточную стенку, располагаются плотно радиальными рядами (Рисунок 14). Механических элементов в ксилеме нет. Сердцевина занимает около 1/3 части объема корневища. Клетки ее многогранные, тонкостенные, заполнены крахмальными зернами. От сердцевины отходят широкие сердцевинные лучи. 68 А 1 Б 2 7 5 1 2 3 9 3 8 3 4 4 5 3 6 4 В 6 1 2 3 4 Рисунок 12 – Поперечный срез подземных органов любистка лекарственного: А – схема корневища: 1– покровная ткань, 2 – паренхима коры, 3 – флоэма, 4 – камбий, 5 – сердцевинный луч, 6 – ксилема, 7 – эфирномасличный канал, 8 – паренхима сердцевины, 9 – перециклические волокна; Б – участок среза корня в области центрального цилиндра: 1 – ситовидные трубки, 2 – камбий, 3 – сосуды ксилемы, 4 – паренхима, 5 – сердцевинный луч; В – участок среза корня в области коры: 1 – межклеточное пространство, 2 – паренхима, 3 – ситовидные трубки, 4 – выстилающий слой секреторной клетки, 5 – эфирномасличный канал, 6 – сердцевинный луч 69 1 2 3 5 6 4 7 9 8 Рисунок 13 – Микрофотография поперечного среза корневища (увел. х40): 1 – пробка, 2 – кора, 3 – камбий, 4 – сердцевинный луч, 5 – сосуды ксилемы, 6 – паренхима сердцевины, 7 – флоэма, 8 – эфирномасличный канал, 9 – перециклические волокна 1 2 3 4 Рисунок 14 – Микрофотография фрагмента поперечного среза корневища любистка лекарственного (увел. 240): 1 – трахеи, 2 – выстилающий слой эфирномасличного канала, 3 – секреторная клетка, 4 – клетки паренхимы 70 Корни любистка лекарственного вторичного строения. На поперечном срезе видно, что в перидерме различаются феллема (пробка), феллоген и феллодерма. Феллема состоит из клеток прямоугольной формы со слабоизвилистыми стенками. Стенки клеток опробковевшие. Клетки располагаются радиальными рядами. Феллоген – один слой живых тонкостенных клеток. Феллодерма состоит из нескольких слоев живых клеток многогранной формы, по объему она почти равна феллеме. Перициклическая зона представлена клетками паренхимы и эфирномасличными каналами. Клетки паренхимы многогранной формы, мелкие, тонкостенные, плотно расположены радиальными рядами. В более толстых корнях большие межклетники. Эфирномасличные каналы на поперечном срезе округлой формы. Они ограничены секретирующими живыми, тонкостенными клетками овальной формы. Располагаются беспорядочно, размер варьирует (Рисунок 12 В). Внутрь от перециклической зоны находится флоэма. Она четко выделяется на поперечном срезе в виде сплошного кольца, состоящего из мелких клеток многогранной формы, живых, тонкостенных, которые располагаются радиальными рядами. Во флоэме также имеются эфирномасличные каналы, в диаметре мельче, чем в перициклической зоне (Рисунки 12 В, 18 Б). Камбий хорошо виден между флоэмой и ксилемой. Он состоит из нескольких слоев живых тонкостенных клеток (Рисунок 12 Б). Ксилема располагается внутрь от камбия. Различается вторичная ксилема, и в центре корня – первичная. Вторичная ксилема имеет большое количество проводящих элементов – трахей, округлых на поперечном срезе. Они равномерно располагаются по всей ксилеме. Стенка сосудов утолщенная, одревесневшая. Первичная ксилема 4-5–лучевая, состоит из более мелких клеток. От ее лучей отходят первичные радиальные лучи, которые, постепенно расширяясь, проходят через вторичную ксилему, камбий, флоэму и заканчиваются в перециклической зоне. Имеются и вторичные радиальные лучи, они начинаются во вторичной ксилеме. Клетки радиальных лучей многогранной формы, изодиаметрические, больше в диаметре, чем рядом расположенные клетки паренхимы (Рисунок 15). 71 При рассматривании проводящих элементов ксилемы на продольном срезе, обнаружены узкие спиральные сосуды и широкие – лестничные (Рисунок 18 А). Таким образом, на основании изучения анатомического строения корневища и корня любистка лекарственного можно выделить следующие диагностические признаки сырья. Цельное сырье. На поперечном срезе корневища видно, что корневище имеет непучковое (лучистое) строение (Рисунок 12 А). Покровная ткань – перидерма, состоящая из нескольких слоев клеток прямоугольной формы с толстыми стенками. Кора состоит из паренхимных клеток с утолщенными стенками и эфирномасличных каналов, схизогенного происхождения (Рисунок 14). Центральный цилиндр состоит из перецикла, камбия, флоэмы, ксилемы и паренхимы сердцевины. Перицикл представлен паренхимными клетками. Камбий не дифференцирован. Флоэма представлена клетками округлой формы. Ксилема состоит из толстостенных сосудов округлой формы. Сердцевина, состоит из крупных, округлых, тонкостенных паренхимных клеток, часто разрушена (Рисунок 13). Корень на поперечном срезе имеет вторичное строение (Рисунок 12 Б, В). Покровная ткань представлена перидермой, состоящей из нескольких слоев прямоугольных клеток пробки (Рисунок 17). Клетки феллодермы имеют тонкие стенки, овальные или округлые, содержащие включения – крахмальные зёрна, обнаруживаемые в микропрепарате гистохимической реакцией с раствором Люголя (Рисунок 17). Клетки флоэмы тонкостенные, округлой или многогранной формы, плотно прилегают между собой. В клетках паренхимы коры и флоэме имеются секреторные клетки, имеющие в поперечном срезе округлую форму. Содержимое секретирующих клеток окрашивается реактивом Судан III в оранжево-красный цвет, что свидетельствует о наличии эфирного масла (Рисунок 17). В ксилеме расположено большое количество одревесневших механических тканей, представленных склеренхимой, которые под действием флороглюцина и 72 кислоты хлористоводородной или серной (конц.) окрашивались в малиновый цвет (Рисунок 16). Сосуды ксилемы на продольном срезе корня пористые (Рисунок 18). 2 4 5 3 6 1 Рисунок 15 – Микрофотографии поперечного среза корня любистка лекарственного (увел. х120): 1 – сердцевинные лучи, 2 – сосуды ксилемы, 3 – лубяные волокна, 4 – клетки паренхимы, 5 – первичная ксилема, 6 – камбий Рисунок 16 – Микрофотография поперечного среза корня любистка лекарственного (увел. х120), окрашенного растворами флороглюцина и конц. хлористоводородной кислотой 73 1 2 4 3 Рисунок 17 – Микрофотографии фрагмента поперечного среза корня любистка лекарственного (увел. 240): 1 – клетки паренхимы коры с крахмальными зернами, 2 – эфирномасличный канал, 3 – пробка, 4 – камбий А Б 1 2 3 Рисунок 18 – Микрофотографии продольного среза корня любистка лекарственного (увел. х1000): А – в районе центрального цилиндра, Б – в районе коры; 1 – сосуды ксилемы, 2 – секреторный канал, 3 – сердцевинный луч 74 Измельченное сырье. На поперечном срезе или «давленном» микропрепарате видна многослойная пробка, проводящие пучки коллатерального типа. Паренхима представлена сравнительно мелкими клетками многогранной формы с крахмальными зернами. Порошок. При микроскопическом исследовании сильно измельченного сырья и порошка (в хлоралгидрате) установлены следующие диагностические признаки: клетки пробки прямоугольной формы, клетки паренхимы мелкие, многогранной формы, зерна крахмала размером от 6 до 16 мкм, обрывки сосудов (спиральные, лестничные) и многочисленные вместилища (Рисунок 19). 1 2 3 4 5 6 Рисунок 19 – Микрофотографии элементов порошка подземных органов любистка лекарственного (увел. 240): 1 – клетки паренхимы, 2 – клетки с сосудами ксилемы, 3 – обрывки ткани с эфирномасличным каналом, 4 – пробка, 5 – крахмальные зерна, 6 – спиральный сосуд 75 Таким образом, в ходе проведенного микроскопического исследования были выявлены основные диагностические признаки подземных органов любистка лекарственного: непучковый тип строения корневища, 4-5–лучевая первичная ксилема корня, эфирномасличные каналы схизогенного происхождения в перециклической зоне и во флоэме корня, а также составе коры корневища. Гистохимические реакции. Поперечный срез корня любистка лекарственного помещают в раствор Судана III, накрывают покровным стеклом и нагревают. Капли эфирного масла окрашиваются в оранжево-желтый цвет (эфирные масла). Поперечный срез корня помещают в раствор Люголя, накрывают покровным стеклом. Крахмальные зерна окрашиваются в синий цвет. Срез помещают в 1% раствор флороглюцина в спирте, затем несколько капель серной кислоты (конц.). Через 1- 2 мин. наблюдают появление яркого малинового окрашивания (одревесневшие оболочки клеток). Люминесцентная микроскопия. Изучение люминесценции проводили на свежем сырье с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ – Р8 (фрагмент работы выполнен на базе лаборатории СКФУ, г. Ставрополь). Для возбуждения люминесценции использовали УФ свет при λmax=365 нм. Люминесценция свежего корня характеризуется следующими признаками: пробка темно-коричневая, в коре ярко светятся секреторные каналы, клетки лубяной паренхимы имеют слабое светло-голубое свечение, другие элементы коры и камбия не флуоресцируют. В древесине яркую зеленовато-синюю флуоресценцию имеют лигнифицированные оболочки сосудов ксилемы, волокон либриформа и древесной паренхимы. Нелигнифицированные оболочки клеток древесной паренхимы не флуоресцируют. Очень ярко флуоресцирует содержимое секреторных каналов – от голубоватосинего до фиолетово-голубого свечения. Клетки выстилающего слоя каналов не флуоресцируют. 76 При высушивании корня довольно ярким голубым свечением обладают секреторные каналы, лубяная паренхима, лубяные волокна и нелигнифицированные клетки древесной паренхимы. Лигнифицированные оболочки элементов древесины, как и в свежем корне, имеют зеленовато-синюю флуоресценцию. Сердцевинные лучи и камбий имеют светлое голубоватое свечение. При замачивании сырья в хлороформе свечение содержимого секреторных каналов прекращается, флуоресценцией в данных микропрепаратах обладают только оболочки лигнифицированных элементов древесины. На срезах корня приготовленных из сырья после кипячении в 5% растворе натрия гидроксида, содержимое секреторных каналов окрашивалось в желтый цвет. В связи с растворимостью содержимого секреторных каналов в хлороформе и окрашивания раствором щелочи можно предположить, что кумарины в корнях любистка лекарственного локализуются именно в этих образованиях, что может иметь диагностическое значение. Выявленные морфолого-анатомические признаки сырья «Любистка лекарственного корневища и корни» позволяют подтвердить его подлинность для включения в разделы фармакопейной статьи «Внешние признаки» и «Микроскопия». 77 ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4 1. Проведены морфолого-анатомические исследования цельных, измельченных и в виде порошка корневищ и корней любистка лекарственного. 2. Выявленные морфолого-анатомические признаки сырья «Любистка лекарственного корневища и корни» позволяют подтвердить его подлинность и включить их в разделы фармакопейной статьи «Внешние признаки» и «Микроскопия». 3. В анатомическом строении подземных органов любистка лекарственного наиболее важным диагностическим признаком является наличие секреторных каналов в коре корня. 4. С помощью люминесцентной микроскопии установлено, что кумарины в корнях любистка лекарственного локализуются в содержимом секреторных каналов. 78 ГЛАВА 5. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОРНЕВИЩ И КОРНЕЙ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО Учитывая, что основная часть биомассы любистка лекарственного приходится на подземные органы (глава 3), представляло интерес исследование химического состава корневищ и корней. 5.1 Качественный анализ Идентификацию биологически активных соединений проводили в извлечениях, полученных согласно методикам, описанным в главе 2, используя общепринятые реакции. Полученные результаты приведены в таблице 9. Таблица 9 – Результаты качественного анализа корневищ и корней любистка лекарственного Класс БАС 1 Полисахариды Аминокислоты Сапонины Дубильные вещества Органические кислоты Реакция 2 Келлера – Килиани осаждения 96% спиртом этиловым биуретовая нингидриновая пенообразования комплексообразования с железоаммониевыми квасцами с метиловым красным БХ в системе 2% раствора к-ты уксусной Коричные кислоты с железа (III) хлоридом реакция с 10% раствоАнтрагликозиды ром натрия гидроксида Ожидаемый эффект 3 синее окрашивание Результат 4 + хлопьевидный осадок + фиолетовое окрашивание синее окрашивание стойкая пена осадок зелено-черное окрашивание (конденсированные) сине-черное окрашивание (гидролизуемые) красное окрашивание голубая флюоресценция пятен в УФ-свете темно-зеленое окрашивание вишнево-красное окрашивание + + + + + – + + + + 79 1 2 цианидиновая проба Флавоноиды Кумарины Кислота аскорбиновая с 1% раствором железа (III) хлорида с 10% спиртовым раствором натрия гидроксида со свинца ацетатом основным реакция с диазореактивом в щелочной среде лактонная проба ТСХ в системе растворителей: этилацетат – ледяная уксусная кислота (8:2). Проявитель: 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия с реактивом Вагнера Алкалоиды с реактивом Драгендорфа с реактивом Бушарда с кислотой пикриновой с кремневольфрамовой кислотой с танином Сальковского Фитостерины Либермана – Бурхарда 3 оранжево-красное окрашивание буро-зеленое окрашивание 4 + + желтое окрашивание + осадок желтого цвета + коричнево-красное окрашивание + желтое окрашивание + пятно белого цвета на розовом фоне + кристаллы крестообразной формы бурого цвета – осадок красного цвета – осадок краснокоричневого цвета – осадок желтого цвета – осадок белого цвета – осадок белого цвета оранжевое переходящее в красное окрашивание сине-фиолетовое переходящее в зеленое окрашивание – Примечание: «+» – результат положительный, «–» – результат отрицательный _ – 80 5.2 Исследование углеводов В качестве потенциальных лекарственных препаратов большое внимание привлекают природные соединения полисахаридной природы, благодаря их нетоксичности, большой степени свободы дозирования, экологически чистым и экономичным технологиям производства и широкому спектру фармакологического действия. Полисахариды оказывают противовоспалительный, отхаркивающий, противоязвенный, иммуномодулирующий, фармакосанирующий и др. эффекты [11]. Анализ проводили в соответствии с методиками указанными в разделе 2.2. 5.2.1 Выделение полисахаридов Используя описанный способ (раздел 2.2.3) выделены углеводные фракции: растворимые в спирте этиловом 82% (СРС); растворимые в воде углеводы (ВРПС); кислые углеводы (ПВ); геммицеллюлозы (щелочные углеводы, ГЦ). Статистически достоверные результаты (n=7, p= 0,95) количественного определения различных фракций полисахаридов представлены в таблице 10. Таблица 10 – Физические свойства и технологические выходы углеводных фракций, выделенных из корневищ и корней любистка лекарственного Фракции углеводов, растворимые в спирте этиловом 82% воде 0,5% растворе аммония оксалата 10% растворе натрия гидроксида Технологические выходы, Физические свойства фракций % к сырью 0,45±0,02 Жидкость желто-коричневого цвета Порошок коричневого цвета, легко 4,70±0,08 растворим в воде с образованием вязкого раствора Аморфный порошок светло6,00±0,32 коричневого цвета, плохо растворим в воде Порошок темно-коричневого цвета, 12,00±0,51 нерастворим в воде 81 Водный раствор полисахаридов с йодом дает положительную реакцию, это позволяет предположить о присутствии полисахаридов глюканового типа. Гравиметрический анализ свидетельствует о преобладании гемицеллюлоз. Полученные данные также свидетельствуют и о высоком содержании углеводов, извлеченных характерным для галактуронидов экстрагентом – аммония оксалатом. Растворимость в воде этой фракции, как и водорастворимых углеводов, косвенно предполагает их высокую биологическую доступность в организме человека. Полисахариды любистка лекарственного могут представлять интерес по аналогии с полисахаридами алтея, льна, подорожника, обуславливающими отхаркивающее и противовоспалительное действие соответствующих лекарственных препаратов. 5.2.2 Изучение химического состава углеводных фракций 5.2.2.1 Групповые качественные реакции на углеводы Присутствие углеводов (крахмала, полиуронидов и восстанавливающих сахаров) устанавливали путем проведения универсальных реакций (раздел 2.2.1; 2.2.2) . Результаты качественного анализа углеводов в выделенных из различных растительных объектов фракциях приведены в таблице 11. Данные полученные после поведения химических реакций свидетельствуют о наличии во всех углеводных фракциях полисахаридов и восстанавливающих сахаров. Галактурониды обнаружены во всех фракциях. На следующем этапе исследования изучали мономерный состав углеводов. 82 Таблица 11 – Результаты качественного анализа углеводных фракций с помощью групповых реакций Углеводные фракции Ожидаемый результат ВРПС ПВ ГЦ реакция осаждения осадок + + + спиртом этиловым 96% белого цвета Полисахариды реакция осаждения осадок + + + ацетоном белого цвета окислительноосадок восстановительная реакция красно-коричневого + + + с реактивом Фелинга цвета окислительноВосстанавливающие восстановительная реакция раствор сахара окрашивания с кислотой оранжевого цвета, + + + пикриновой в щелочной максимум светопоглосреде, метод спектрофото- щения при 460 нм метрии Группа углеводов Методы анализа Крахмал реакция окрашивания с йодом раствор синего цвета Урониды реакция взаимодействия с карбазолом в сернокислой среде, метод спектрофотометрии раствор краснофиолетового цвета, максимум светопоглощения при 530 нм + + + + Заключение во всех фракциях установлено наличие полисахаридов во всех фракциях установлено наличие восстанавливающих сахаров — в водорастворимой и кислых фракциях установлено наличие крахмала + во всех фракциях установлено наличие галактуронидов Примечание: «+» – положительный результат реакции; «—» – отрицательный результат реакции; ВРПС – растворимые в воде углеводы; ПВ – кислые углеводы; ГЦ – гемицеллюлозы 5.2.2.2 Изучение мономерного состава углеводных фракций методом хроматографии на бумаге Углеводные фракции после кислотного гидролиза, проведенного, как описано в разделе 2.2.4, были подвергнуты хроматографированию на бумаге (раздел 2.2.5). По появлению на хроматограммах красно-коричневых пятен с соответствующими величинами подвижности веществ (Rf) оценивали углеводный состав фракций. Во всех фракциях полисахаридов идентифицированы: глюкоза и галактоза. По интенсивности окраски пятен основным углеводом в водорастворимой и кислой фракциях является галактоза, в гемицеллюлозных фракциях – глюкоза. Спирторастворимые сахара представлены фруктозой, сахарозой и глюкозой. 5.2.2.3 Изучение мономерного состава углеводных фракций методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) Полученные в результате кислотного гидролиза моносахариды были переведены в альдонитрилы и подвергнуты анализу методом ГЖХ (раздел 2.2.6). Статистически достоверные данные (n=7, p=0,95) по определению соотношения в углеводных фракциях моносахаридов методом ГЖХ приведены в таблице 12. Таблица 12 – Содержание и моносахаридный состав полисахаридов корневищ и корней любистка лекарственного Соотношение моносахаридных остатков Фракции углеводов Xyl Ara Man Glc Gal UAc ВРПС – 1,60±0,38 сл. 1,0±0,27 2,70±0,41 32,50±11,89 ПВ – – – 1,0±0,15 1,28±0,25 58,80±21,86 ГЦ 1,16±0,39 1,0±0,23 1,40±0,21 34,50±3,71 сл. 20,10±8,37 В подземных органах любистка лекарственного преобладает гемицеллюлоза – гетерополисахарид, состоящий из глюканов и кислых полисахаридов. Основными моносахаридами в ВРПС и ПВ являются галактоза и уроновые кислоты. В гидролизате во всех фракциях наряду с нейтральными моносахаридами, БХ была идентифицирована уроновая кислота (Таблица 12). 84 Учитывая достаточно высокий выход (23,15%), углеводы Levisticum officinale можно считать перспективными в отношении фармакологических исследований. 5.2.2.4 Изучение углеводных фракций методом ИК-спектроскопии Из предварительных исследований установлено, что все фракции содержат уроновые кислоты, присутствие которых необходимо было подтвердить методом ИК-спектроскопии (раздел 2.2.7). ИК-спектры различных углеводных фракций, выделенных из исследуемых растительных объектов, приведены на рисунке 20. Выявленные в ИК-спектрах характеристические полосы поглощения приведены в таблице 13. Таблица 13 – Характеристические полосы поглощения (см-1) в ИК-спектрах углеводных фракций корневищ и корней любистка лекарственного ВРПС ПВ ГЦ 3435 3272, 3585 3473 2926, 2857 2853 1630 1416, 1440 1328, 1373 1233 2890, 2946 1731, 1748 1660 1426 1331 1236 1153 1149 1022, 1079, 1020, 1104 1102 830 830 1655 1411 1316 1239 Вероятностное отнесение полос поглощения [111, 112, 113, 114] ν(ОН, ассоциированные внутримолекулярными водородными связями) ν(СН) νas(С=О сложноэфирных групп) νas(СОО-) νs(СОО-) δ(ССН) + δ(СОН) ν(СОО-) ν(СО пиранозного цикла) + ν(СО гликозидной связи) + ν(СС связи) 950, 1015, ν(СО пиранозного цикла) 1099 829 ν(СО α-гликозидной связи 85 80 75 70 531.46 576.10 1079.64 1102.09 1022.01 1233.56 1153.74 1440.55 1416.19 85 1630.12 % Transmittance 90 1748.23 2926.86 2857.84 95 1373.42 1328.67 100 830.76 760.83 105.0 65 3435.61 60 55 50.0 4000 3600 3200 2800 2400 1400 1800 1600 2000 Wavenumber (cm-1) 1200 1000 600 800 400.0 1 83.0 830.76 763.63 699.30 80 75 70 35 30.0 4000.0 3600 3200 2800 2400 1400 1600 1800 2000 Wavenumber (cm-1) 1020.42 1149.65 1104.89 1660.71 3272.94 40 3585.43 45 1748.25 50 1236.36 55 1426.23 1331.46 1731.46 60 2946.77 2890.75 Transmittance % 65 1200 800 1000 600 400 2 83.0 75 30.0 4000.0 3600 3200 2800 1800 2000 2400 Wavenumber (cm-1) 1600 1400 1200 693.70 639.98 779.82 1015.37 1655.94 1611.18 35 3314.82 40 3473.38 45 1144.54 1316.00 50 1411.67 55 1099.58 60 2933.42 Transmittance % 65 950.65 1239.16 70 539.04 469.93 892.06 80 1000 800 3 Рисунок 20 – ИК-спектры полисахаридов корневищ и корней любистка лекарственного: 1 – ВРПС; 2 – ПВ; 3 – ГЦ 86 В ИК-спектрах анализируемых углеводных фракций по характеристическим полосам поглощения установлено наличие остатков галактуроновых кислот в пиранозной форме в составе полисахаридов, находящихся в 4С1-α-конформации. Также установлено, что уроновые кислоты благодаря первичным и вторичным спиртовым гидроксилам ассоциированы внутримолекулярными водородными связями. Карбоксильные группы преимущественно находятся в ионизированной форме и частично этерифицированы метанолом. 5.2.2.5 Изучение физико-химических характеристик пектинов Анализ проводили по методикам указанным в разделе 2.2.9. Различий физико-химических свойств пектинов в ВРПС и ПВ фракциях не установлено. Пектины имеют кислую реакцию среды в пределах рН от 3,1 до 3,6, что исключает раздражающее влияние на слизистую оболочку желудка при их пероральном применении. Титриметрическим методом определено содержание в ВРПС и ПВ свободных (Кс) 0,54±0,11% и 0,18±0,02% и этерифицированных (Кэ) 2,70±0,16% и 3,24±0,20% карбоксильных групп соответственно. Степень этерификации (λ) при этом составляет 84,50±,5,19% и 94,70±2,36%, а, следовательно, относятся к высокоэтерифицированным пектиновым веществам. Эти данные свидетельствуют о перспективности галактуронидов в качестве энтеросорбентов, а значит, и как антиоксидантов, а также вспомогательных компонентов при изготовлении лекарственных форм другого назначения. С фармакологической точки зрения наибольший интерес из всех обнаруженных углеводов представляет галактуроновая кислота (мономер пектина), имеющая значение и как лекарственное (энтеросорбент, антимикробное), и как вспомогательное (стабилизатор, пролонгатор, наполнитель) вещество [80]. Поскольку содержание уроновых кислот отмечено во всех фракциях, они дополнительно исследованы на наличие галактуроновой кислоты методом спектрофотометрии по реакции с карбазолом (раздел 2.2.8). В обоих случаях на спектрах вы- 87 явлен максимум поглощения при длине волны 530 нм, характерный для уронидов даже при совместном присутствии нейтральных углеводов (Рисунок 21). 0,8 А 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 -0,4 380 430 480 530 580 630 λ, нм Рисунок 21 – Спектр светопоглощения продукта взаимодействия углеводных фракций, извлеченных из корневищ и корней любистка лекарственного раствором аммония оксалата с карбазолом Характер спектра, а именно: положение максимума светопоглощения при 530 ± 2 нм, отсутствие других максимумов (характерных для восстанавливающих сахаров), выраженный пик, доказывают наличие галактуроновой кислоты в анализируемом объекте. Используя известную расчетную формулу [34], в сравнении со стандартным образцом галактуроновой кислоты, содержание полигалактуроновой кислоты в сырье составило во фракции ВРПС – 32,5±1,25%, ПВ – 58,8±2,43% и ГЦ – 20,1±1,5%. Таким образом, учитывая достаточно высокий выход углеводов из подземных органов любистка лекарственного (22,2–24,1%), полисахариды можно считать перспективными в отношении фармакологических исследований и учитывать их в качестве целевого продукта при комплексной переработке сырья [61]. 88 5.3 Исследование эфирного масла Многочисленными исследованиями, установлено, что количественное содержание эфирного масла и его химический состав во многом зависят от вида и даже подвида растения, места и условий его произрастания, фазы вегетации, метеорологических условий и времени суток на момент сбора, а также от условий сушки и хранения сырья с момента сбора и до момента анализа [54]. 5.3.1 Определение содержания эфирного масла Эфирное масло получали методом перегонки из воздушно-сухого сырья (метод 3 – Клевенджера) водяным паром с добавлением толуола [56, 166]. Время гидродистилляции составляло 4 часа. Эфирное масло отделяли от воды эфиром диэтиловым и в течение 12 часов высушивали над фосфора (V) оксидом в эксикаторе. Содержание эфирного масла в различных образцах сырья составляло от 1,2 до 2,4% и представляло собой густую жидкость темно-желтого цвета, с характерным запахом и приятным вкусом. 5.3.2 Определение подлинности изучаемых образцов эфирного масла Полученные образцы эфирного масла анализировали согласно требованиям ОФС ГФ XI «Масла эфирные» и соответствующих методик ГФ XI и XII изданий [24, 25, 26]. Физико-химические показатели исследуемых эфирных масел представлены в таблице 14. Таблица 14 – Физико-химические показатели эфирного масла любистка лекарственного плотность угол вращения 1,0321,047 +40– +60 Показатели показатемпература тель затвердевапреломления, 0 С ния 1,546-2 1,554 кислотное число (IA) 8,0214,38 эфирное число (IE) 221-248 89 Полученные данные о физико-химических свойствах эфирного масла выделенного из корневищ и корней любистка лекарственного согласуются с литературными [16, 21]. Растворимость в спирте этиловом дает представление не только о подлинности, но и о качестве масла. Большинство углеводородов плохо растворимо в спирте (особенно в разведенном), поэтому по растворимости можно судить об их количестве в масле. В равной степени по растворимости можно определить и примесь жирных масел. Растворимость эфирного масла любистка лекарственного в спирте этиловом приведена в таблице 15. Таблица 15 – Растворимость эфирного масла любистка лекарственного в спирте этиловом Растворимость в 70% спирте этиловом в 80% спирте этиловом в 90% спирте этиловом Значение легко растворимо очень легко растворимо очень легко растворимо Таким образом, растворимость эфирного масла любистка лекарственного можно характеризовать терминами «легко растворимо» (70% спирт этиловый) и «очень легко растворимо» (80% и 90% спирт этиловый). Подлинность масла определяли по органолептическим характеристикам (цвет, прозрачность, запах и вкус). Более надежной оценкой подлинности является анализ методом ГЖХ, а при необходимости – методом хромато-массспектроскопии (раздел 2.3.1). Оценка качественного состава эфирных масел методом ГЖХ может быть затруднена в связи с наличием стереоизомеров, дающих близкие времена удерживания при хроматографии. В связи с этим, работа по идентификации компонентов эфирного масла исследуемых образцов была проведена методом газожидкостной хромато-масс-спектрометрии (раздел 2.3.1). В корневищах с корнями любистка лекарственного идентифицировали 17 компонентов, что составляет 97,67% от всех обнаруженных. Доминирующими 90 компонентами являются бициклические монотерпеновые углеводороды: линалоол (42,88%) и линалилацетат (36,20%) (Таблица 16). Таблица 16 – Химический состав эфирного масла подземных органов любистка лекарственного Компонент пинен эвкалиптол терпинеол цис-линалоол-оксид линалоол дигидрокарвон борнеол терпинеол/изопулегол изоборнеол линалил ацетат (бергамот) диметил-гептадиеналь геранил ацетат 8-гидроксилиналоол не идентифицирован нерол ацетат октадиенол-диметил-ацетат кариофиллен-оксид Время удерживания, мин 3,23 3,71 3,81 4,14 4,45 5,28 5,55 5,69 5,87 6,69 6,98 7,23 8,08 8,3 8,5 8,84 12,58 Содержание, % 2,50 0,75 2,17 1,65 42,88 0,73 0,91 3,74 0,98 36,20 0,26 0,32 2,37 2,33 0,55 0,80 0,88 Сравнивая полученные данные с литературными, следует, что компонентный состав эфирного масла из любистка лекарственного, выращенного в условиях Кавказских Минеральных Вод, отличается от всех ранее исследованных образцов, полученных от растений из других регионов РФ, стран Европы, Азии и Ближнего Востока, и в тоже время отличается наиболее высоким показателем общего выхода эфирного масла (раздел 1.2). Проведя данный фрагмент работы, мы убедились, что изученные нами образцы эфирного масла отличались от ранее исследованных как по составу, так и по количеству идентифицированных компонентов, в связи, с чем считаем, что проводить стандартизацию сырья, только по показателю «Эфирное масло» нецелесообразно. 91 5.4 Исследование фенольных соединений Менее изученной группой биологически активных соединений в корневищах и корнях любистка лекарственного являются фенольные соединения, особенно кумарины (раздел 1.2), притом, что для многих из них доказан выраженный фармакологический эффект (раздел 1.3). Данные соединения до настоящего времени не выступали в качестве аналитической или ведущей группы БАС в корневищах и корнях любистка лекарственного. В связи с этим нами проведено изучение фенольных соединений с целью разработки методик качественной и количественной оценки изучаемого сырья. 5.4.1 Качественное обнаружение фенольных соединений В виду высокой разносторонней биологической активности фенольных соединений, выявляли данные вещества с помощью качественных реакций и хроматографических методов [5, 6, 7]. Таблица 17 – Качественные реакции на флавоноидные соединения Реактив Класс флавоноидов Наблюдаемое окрашивание Металлический флавонолы, магний в солянокрасное флаваноны, флавоны кислой среде флавонолы, желтое, при нагревании флаваноны, флавоны, оранжево-красное Раствор аммиака флаванонолы халконы, ауроны красное (пурпурное) Раствор аммиака, антоцианы синее или фиолетовое натрия карбонат Кислота серная флавоны, флавонолы ярко-желтое Свинца ацетат ос- флавоны, халконы, ярко-желтое новной ауроны катехины, Кислота борная и лейкоантоцианидины, зеленая или желтая лимонная флавонолы, флюоресценция флаванонолы оранжевая или Соли диазония флавоны красная Примечание: «+» – результат положительный, «–» – результат отрицательный Результат реакции + + – _ + + _ + 92 По результатам качественных реакций можно предположить, что основные классы флавоноидов представлены флавонолами и флавонами (Таблица 17). Фракционное разделение фенольных соединений проводили по схеме, представленной на рисунке 22 (раздел 2.4.1). Лекарственное сырье Шрот последовательная экстракция спиртом этиловым различной концентрации Водно-спиртовой экстракт концентрирование водный концентрат Фракционирование диэтиловый эфир эфирная фракция хлороформ хлороформная фракция этилацетат этилацетатная фракция водный остаток Рисунок 23 – Схема выделения фенольных соединений Рисунок 22 – Схема фракционного разделения фенольных соединений Изучение полученных фракций продолжили методом бумажной хроматографии (БХ) и тонкослойной хроматографии (ТСХ) (раздел 2.4.1). 93 Таблица 18 – Результаты хроматографического разделения флавоноидных агликонов любистка лекарственного CO и исследуемое извлечение Окраска зон адсорбции 10% раствор Пары аммиака, алюминия хлоУФ-свет УФ-свет рида спиртовой, УФ-свет Кверцетин желтая ярко-желтая зелено-желтая Лютеолин коричневая оранжевая желто-зеленая Апигенин коричневая зеленая ярко-желтая желтая желто-зеленая ярко-желтая коричневая зеленая ярко-желтая желто-зеленая желтая желто-зеленая темная желтооранжевая желто-зеленая желтая желтая желто-зеленая Кемпферол Диэтиловое извлечение Значение Rf 0,55±0,03А 0,11±0,01Б 0,64±0,01А 0,16±0,02Б 0,88±0,02А 0,18±0,01Б 0,83±0,01А 0,09±0,01Б 0,88±0,02А 0,19±0,01Б 0,83±0,01А 0,08±0,01Б 0,65±0,01А 0,17±0,02Б 0,51±0,02А 0,10±0,02Б Примечание: А – бензол–этилацетат–уксусная кислота (50:50:1); Б – 30% р-р уксусной кислоты Полученные с помощью диэтилового эфира извлечения упаривали досуха. В составе остатка хроматографически (БХ) обнаружили 4 зоны адсорбции, две из которых в сравнении со стандартными образцами идентифицированы как лютеолин и апигенин (Таблица 18). Этилацетатную фракцию выдерживали при температуре +40 С в течение 7 суток. При этом выпадал осадок желто-зеленого цвета, который при хроматографической проверке оказался индивидуальным веществом. Для отделения флавоноидов от фенолкарбоновых кислот этилацетатную фракцию после отделения осадка упаривали до смолообразного остатка, который растворяли при нагревании в минимальном количестве спирта метилового, быст- 94 ро охлаждали и добавляли избыток эфира диэтилового. При этом выпадал осадок, который также отделяли фильтрованием. Полученный осадок растворяли в спирте этиловом и анализировали его состав методом БХ. Также анализировали водный остаток спиртоводного извлечения после обработки этилацетатом в сравнении со стандартными образцами. Водный остаток выдерживали в холодильнике 10-12 часов. В результате из него выпадали мелкие игольчатые хроматографически однородные кристаллы желтого цвета (2,4 г). Осадок отделяли и перекристаллизовали из этилового спирта. Результаты представлены в таблице 19. Таблица 19 – Результаты хроматографического разделения флавоноидных агликонов и гликозидов любистка лекарственного CO и исследуемое извлечение Окраска зон адсорбции спиртовой р-р Пары аммиака, натрия УФ-свет УФ-свет гидроксида, УФ-свет – 0,54±0,01А; 0,10±0,01Б; 0,12±0,02В 0,50±0,02Б – 0,25±0,02В оранжевая желтооранжевая 0,55±0,02Б желтая – – желтая ярко-желтая темная желтая желтая желтая желтая коричневая светло-желтая желтая темно-бурая оранжевая Кверцетин желтая ярко-желтая Гиперозид коричневая Цинарозид коричневая – желтооранжевая Рутин темно-бурая Кемпферол Спиртовое извлечение Водный остаток Значение Rf желтооранжевая желтооранжевая желтая – – – желтооранжевая Примечание: А – бензол–этилацетат–уксусная кислота (50:50:1); Б – 15% р-р уксусной кислоты; В – 30% р-р уксусной кислоты 0,15±0,01Б; 0,09±0,01В 0,54±0,01А; 0,10±0,01Б 0,20±Б 0,40±Б 0,85±Б 0,96±Б 0,54±0,02Б 95 Таким образом, по результатам БХ из 5 обнаруженных зон адсорбции в этилацетатной фракции удалось идентифицировать кверцетин, а в водном остатке – рутин. Определение фенолкарбоновых кислот проводили методом БХ эфирнометанольного раствора и осадка полученного после вымораживания этилацетатной фракции (осадок отделяли и перекристаллизовали из этилового спирта). Таблица 20 – Результаты хроматографического разделения фенолкарбоновых кислот любистка лекарственного Окраска зон адсорбции CO и Пары 3 % р-р исследуемое Значение Rf УФ-свет аммиака, железа (III) извлечение УФ-свет хлорида Коричная к-та – желтая оранжевая 0,77±0,03 светлояркосине0,82±0,01А; Кофейная к-та голубая голубая зеленая 0,27±0,01Б 0,83±0,03А; Феруловая к-та голубая ярко-голубая оранжевая 0,33±0,02Б темно-сероГалловая к-та – 0,62±0,02А голубая светложелто0,40±0,01А; n-кумаровая к-та фиолетовая фиолетовая оранжевая 0,50±0,01Б 0,63±0,01А; Хлорогеновая к-та голубая зеленая зеленая 0,66±0,01Б 0,83±0,03А; голубая ярко-голубая оранжевая 0,33±0,02Б 0,63±0,02А; голубая желто-зеленая сине-зеленая 0,72±0,01Б светло0,82±0,01А; Извлечение голубая серо-зеленая голубая 0,27±0,01Б темно-серо0,61±0,02А – голубая 0,25±0,01А; сиреневая желтая – 0,12±0,01Б 0,63±0,01А; голубая зеленая зеленая 0,66±0,01Б Примечание: А – БУВ (4:1:2); Б – 2% р-р уксусной кислоты Хроматограммы проявляли в УФ-свете и обрабатывали раствором аммиака и 1% водным раствором железа (III) хлорида. Наилучшее разделение, а значит 96 наибольшее количество зон абсорбции (голубое свечение в УФ-свете) достигнуто в системах БУВ (4:1:2) и 2% уксусной кислоте, поэтому дальнейшее изучение гидроксикоричных кислот продолжили в этих системах с использованием следующих стандартных образцов: спиртовые растворы кофейной, коричной, галловой, n-кумаровой, хлорогеновой и феруловой кислот. Результаты хроматографического разделения фенолкарбоновых кислот в спиртоводном извлечении любистка лекарственного представлены в таблице 20. По результатам БХ в извлечении из подземной части любистка лекарственного, было обнаружено шесть контрастных зон адсорбции, четыре из которых по сравнению с СО идентифицированы как кофейная, галловая, хлорогеновая и феруловая кислоты. Хлороформную фракцию исследовали методом ТСХ на пластинках «Silufol». Таблица 21 – Результаты хроматографического разделения кумаринов любистка лекарственного Окраска зон адсорбции CO и 10 % Значение исследуемое Пары аммиака, спиртовой Rf УФ-свет извлечение УФ-свет раствор КОН, УФ-свет Кумарин – – зеленоватая 0,80±0,01 Умбеллиферон голубая ярко-голубая ярко-голубая 0,32±0,02 Скополетин голубая ярко-голубая ярко-голубая 0,20±0,01 Эскулетин голубая голубая оранжевая 0,04±0,01 зеленоватоАнгелицин синяя голубая 0,84±0,02 голубая голубая ярко-голубая голубая 0,32±0,02 зеленоватозеленовато0,82±0,03 желтая желтая голубоватозеленовато0,81±0,01 фиолетовая желтая Извлечение – – зеленоватая 0,80±0,01 голубая голубая 0,81±0,02 зеленоватосиняя голубая 0,84±0,03 голубая желтый желтый 0,85±0,03 Примечание: система: бензол – этилацетат (2:1) 97 В результате хроматографического исследования, представленного в таблице 21, идентифицированы: умбеллиферон, ангелицин и кумарин. 5.4.2 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ С использованием метода ВЭЖХ провели аналитический скрининг и определили относительное содержание отдельных идентифицированных фенольных веществ (раздел 2.4.2). В качестве неподвижной фазы использована металлическая колонка Luna C18 4,6х150 мм с размером частиц 5 мкм. Подвижная фаза: ацетонитрил и 2% раствор муравьиной кислоты. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 1 мл/мин при продолжительности подачи от 0 до 40 мин. Объем пробы 20 мкл. Детектирование осуществляли с помощью УФ-детектора, при длине волны 365 нм. Использовался градиентный режим элюирования от 5% ацетонитрила до 60%. Результаты, представленные в таблице 22 и на рисунках 23-25 показывают, что наибольшее количество веществ фенольной природы извлекается спиртом этиловым 70%. Основными по содержанию являются хлорогеновая (0,004% в пересчете на абсолютно-сухое сырье) и феруловая (0,003%) кислоты [62]. Таблица 22 – Содержание идентифицированных фенольных соединений в корневищах и корнях любистка лекарственного Название вещества Хлорогеновая кислота Кофейная кислота Гиперозид Феруловая кислота Кемпферол Содержание в извлечениях, приготовленных с помощью спирта 40% 70% 0,002000 0,004300 0,000160 0,000200 0,000029 0,000021 0,001800 0, 003600 0,000020 0,000008 98 12 10 8 6 4 23 5 Кемпф ерол 0. 183 14 Г ипероз ид 0. 06 9 Ф еру лова я 0 .2 52 16 Ко фейная 0. 04 5 Хло рогенова я 0 .5 17 mV 18 10 17 14 12 13 1516 11 24 22 23 18 19 20 9 6 2 ch1 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 мин 16 14 12 8 6 4 23 2 Ко фейная 0. 05 6 10 7 11 15 19 14 16 13 17 12 18 2021 Кемпф ерол 0. 072 mV Г ипероз ид 0. 05 0 Ф еру лова я 0 .5 01 Хло рогенова я 1 .0 84 Рисунок 23 – Хроматограмма извлечения, приготовленного с помощью спирта этилового 40% из корневищ с корнями любистка лекарственного 24 23 10 6 5 0 ch1 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 мин Рисунок 24 – Хроматограмма извлечения, приготовленного с помощью спирта этилового 70% из корневищ с корнями любистка лекарственного 20 15 10 Апигенин 0. 20 9 Кемпф ерол 1. 221 25 Ко фейная 0. 83 8 Хло рогенова я 0 .7 66 30 Кверцети н 1 .6 78 mV Р ут ин 1 .5 94 Г ипероз ид 1. 13 0 Ф еру лова я 0 .3 74 99 5 0 ch1 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 мин Рисунок 25 – Хроматограмма растворов стандартных образцов Учитывая доминирующее содержание и ввиду высокой биологической активности хлорогеновая кислота может быть предложена в качестве аналитического вещества для стандартизации корневищ и корней любистка лекарственного и спиртовых экстрактов полученных его их основе. Анализ извлечения, приготовленного с помощью спирта этилового 70%, продолжили при других условиях ВЭЖХ. В качестве неподвижной фазы использовали металлическую колонку «Kromasil» С 18 размером 4,6х250 мм, размер частиц – 5 мк. В качестве подвижной фазы система растворителей метанол–вода–кислота фосфорная конц. в соотношении 400:600:5. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 0,8 мл/мин. Продолжительность 70 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора «Gilston» UV/VIS, модель 151, при длине волны 254 нм. 100 Всего обнаружено 17 соединений (Таблица 23, рисунок 26), из которых 10 идентифицированы, что составило 76,83% от всех фенольных соединений, содержащихся в корневищах и корнях любистка лекарственного. Таблица 23 – Компонентный состав фенольных соединений корневищ и корней любистка лекарственного № Время, мин Конц., % 1 2,31 0,61 2 3,544 28,13 3 4,139 18,23 4 5,229 20,03 5 6,755 2,46 6 7,365 1,18 7 8,389 7,11 8 9,513 3,40 9 10,35 2,26 10 14,03 2,53 11 16,61 0,97 12 17,65 1,22 13 20 1,50 14 22,92 0,77 15 24,43 6,92 16 26,4 1,73 17 28,94 0,95 Название не идентифицирован галловая кислота катехин эпигаллокатехингаллат не идентифицирован кофейная кислота не идентифицирован не идентифицирован дигидрокверцетин феруловая кислота кумарин лютеолин гиперозид рутин не идентифицирован не идентифицирован не идентифицирован г а лл ов а я к - т а 101 mV к а т е хи н 200 э г кг 150 0 0 ch1 2 4 6 8 н н н р ут и н г и п е ро зи д 10 к ум а ри н л ю т е о ли н 7 - г лю П и к1 50 ф е р ул ов а я к- т а н к оф е й н а я к 0 т а н н д и ги д ро кв е рц е т 100 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 мин Рисунок 26 – Хроматограмма извлечения, приготовленного с помощью спирта этилового 70% из корневищ с корнями любистка лекарственного Основными по содержанию являются галловая кислота (28,13% – содержание в выделенной смеси) и эпигаллокатехингаллат (ЭГКГ – 20,03%). Поэтому представляло интерес установить их количественное содержание в исследуемом сырье, которое проводили также методом ВЭЖХ. Пробоподготовку проводили вышеописанным способом (раздел 2.4.2). В качестве растворов сравнения использовали СО галловой кислоты и ЭГКГ. Для этого около 0,01 г (точная навеска) галловой кислоты или 0,04 (точная навеска) ЭГКГ помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл спирта этилового 70% перемешивали до растворения и доводили объём до метки тем же растворителем (СО). По 20 мкл исследуемого раствора и раствора СО вводили в хроматограф и хроматографировали по вышеприведенной методике. Расчёт количественного содержания галловой кислоты и ЭГКГ производили методом абсолютной калибровки с помощью компьютерной программы «Мультихром» для Windows и стандартной формуле, в пересчете на абсолютно сухое сырье. 102 S1 – площадь пика галловой кислоты или ЭГКГ; S – площадь пика СО галловой кислоты или ЭГКГ; m – навеска сырья, г; n – навеска СО, г; W – влажность сырья, % В результате установлено, что в корневищах и корнях любистка лекарственного содержится галловой кислоты 0,37% и ЭГКГ – 0,08% [63]. Проведенные исследования необходимы для определения показателей норм качества сырья, и могут быть включены в современную нормативную документацию. 5.4.3 Выделение кумаринов Кумарины выделяли путем экстракции 90% спиртом этиловым из 1,0 кг измельченных до размера частиц 1-1,5 мм корневищ и корней любистка лекарственного. Водно-спиртовое извлечение (10 л) упаривали под вакуумом до густого водного остатка (3 л), который выдерживали в холодильнике при температуре +40 С в течение 10 часов. Выпавший при этом осадок хлорофилла и липофильных веществ отделяли фильтрацией на складчатом фильтре, затем промывали 200 мл воды. Образовавшуюся водную фракцию (3,2 л) очищали гексаном, обрабатывали хлороформом (3 раза по 1 л). Полученное хлороформное извлечение упаривали под вакуумом, водный остаток оставляли для выделения флавоноидов и фенолкарбоновых кислот (Рисунок 22). Методом хроматографии в хлороформном извлечении обнаружены вещества 5.01, 5.02, 5.03, 5.04, 5.05, 5.06, 5.07, 5.08, 5.09, 5.10. Используя лактонные свойства производных кумарина, освобождались от веществ некумариновой природы путем растворения в 200 мл 3% раствора натрия гидроксида остатка хлороформного извлечения. Полученный раствор обрабаты- 103 вали (4 раза по 100 мл) хлороформом. Водную фракцию подкисляли 10% раствором кислоты серной до рН 3-4. При этом происходит замыкание о-кумариновых кислот в кумарины, которые вновь извлекали хлороформом (4 раза по 150 мл). Извлечения объединяли, промывали дистиллированной водой до отрицательной реакции на лакмус, сушили безводным сульфатом натрия и упаривали. Полученный смолообразный остаток (44,25 г) растворяли в 50 мл этилового спирта 96%, смешивали с 50 г силикагеля (L 40/100 мкм) и высушивали при температуре 30-350 С до удаления запаха спирта. Порошок наносили на слой силикагеля, сформированный в хлороформе. Хроматографическую колонку элюировали хлороформом и смесью хлороформ–спирт этиловый. Процесс разделения контролировали, просматривая колонку в УФ-свете, а также хроматографированием отбираемых фракций (по 50 мл) нисходящей хроматографией на бумаге, импрегнированной формамидом в хлороформе, а также тонкослойной хроматографией на пластинках «Silufol» в системе растворителей: бензол–этилацетат (2:1). Фракции, содержащие индивидуальные вещества, упаривали в вакууме, и остатки кристаллизовали из этилового спирта или из спирто-хлороформной смеси [32]. В результате получили вещества кумариновой природы: 5.01 (3,50 г, т. пл. 101-1020 С), 5.02 (6,07 г, т. пл. 188-1900 С), 5.03 (2,12 г, т. пл. 161-1630 С), 5.04 (1,35 г, т. пл. 141-1430 С), 5.05 (9,59 г, т. пл. 84-850 С), 5.06 (7,26 г, т. пл. 1381400 С), 5.07 (1,34 г, аморфное вещество), 5.08 (2,03 г, аморфное вещество), 5.09 (4,05 г, 233-2340 С), 5.10 (1,12 г, т. пл. 67-680 С). Физико-химическое изучение других фракций, ввиду их малого выхода, нами не проводилось. 5.4.4 Выделение производных фенолкарбоновых кислот Для выделения фенолкарбоновых кислот из подземных органов любистка лекарственного использовали этилацетатные фракции (Рисунок 22). 104 Этилацетатную фракцию выдерживали при температуре +40 С в течение 5 суток. При этом выпадал желто-зеленый осадок, который отфильтровывали, перекристаллизовывали из спирта этилового. В результате выделили 5,02 г вещества (5.11, т.пл. 3600 С). Ацетоновый раствор вещества 5.11 давал положительную реакцию на свободную кислоту эллаговую (с натрия нитритом и кислотой уксусной образуется красно-фиолетовая окраска, при стоянии переходящая в краснокоричневую). Этилацетатную фракцию после отделения осадка концентрировали под вакуумом до образования смолы, которую растворяли в минимальном количестве спирта метилового, быстро охлаждали и выливали в избыток диэтилового эфира при перемешивании. При этом образовался осадок, который отфильтровывали, растворяли в спирте этиловом, смешивали с 30 г полиамидного сорбента, высушивали на воздухе при температуре 20-250 С. Для разделения осадка, полученного при прибавлении диэтилового эфира, использовали хроматографию на колонке с полиамидным сорбентом (d=3 см, h=45 см, размер частиц сорбента 0,2-0,3 мм, суспензия полиамида в этилацетате). Сухой порошок полиамидного сорбента с суммой веществ смешивали с этилацетатом и наносили полученную суспензию на подготовленную колонку. Элюирование проводили водой и водно-спиртовыми смесями (5%, 10% спирт этиловый). Фракции отбирали по 50 мл и анализировали их состав хроматографией на бумаге в системе растворителей: 2% раствор уксусной кислоты. Фракции, содержащие индивидуальное вещество объединяли, упаривали в вакууме и кристаллизовали из разбавленного спирта этилового [32]. В результате выделили 5 веществ: 5.12 (0,63 г, 248-2500 С), 5.13 (0,95 г, 203-2060 С), 5.14 (0,19 г, 168-1700 С), 5.15 (0,5 г, 204-2060 С) и 5.16 (1,02 г, т. пл. 194-1960 С). Физико-химическое изучение других фракций, ввиду их малого выхода, нами не проводилось. Для идентификации кислоты галловой и ее эфиров с веществом 5.12 проводили реакцию с 1% раствором железа (III) хлорида, в результате которой образовалось синее окрашивание [8]. 105 Вещества 5.11-5.16 флуоресцировали на хроматограммах в УФ-свете, а также результаты качественных цветных реакций позволили их отнести к производным коричной кислоты [32]. Пятно с веществом 5.13 после обработки реактивом барбитуровой кислоты на хроматограмме имело голубое окрашивание, что свидетельствует о наличии в структуре этого соединения хинной кислоты. Выделенные вещества 5.11 и 5.12 с диазореактивом образуют серо- коричневую окраску, что позволяет отнести их к ароматическим фенольным веществам. 5.4.5 Спектральные характеристики выделенных фенольных соединений Вещества 5.01 – 5.10 на основании качественных реакций и ТСХ отнесены к производным кумарина, голубая флуоресценция веществ на хроматограммах, усиливалась после обработки парами аммиака или спиртовым раствором натрия гидроксида, что позволило предположить наличие в их структуре свободной гидроксильной группы у С-7. Данные УФ- (максимумы поглощения в области 210-270 нм и 290-360 нм) и ИК-спектроскопии (Таблица 24) подтверждают предварительные данные об отнесении исследуемых соединений к производным кумарина [46]. Таблица 24 – Спектральные характеристики выделенных кумаринов (производных бензо-α-пирона) в УФ- и ИК-области Номер Название -1 λ ИК-спектр, ν, см max, нм вещества вещества 3140, 3116, 3076, 3025 (С-Н), 219, 250, 265 5.01 императорин 1726 (CO-δ-лактона), 1628, перегиб, 301 1590 (С=С) 3144, 3111, 3087, 3011 (С-Н), 222, 245, 250, 5.02 бергаптен 1734 (CO-δ-лактона), 1632, 259, 268, 311 1579 (С=С) 3161, 3122, 3064 (С-Н), 5.03 псорален 249, 291, 322 1732 (CO-δ-лактонного цикла), 1640, 1625, 1584, 1546 (С=С) 5.04 оксипейцеданин 220, 249, 266, 3159, 3124, 3064 (С-Н), 106 1730 (CO-δ-лактона), 1620, 1580 (ароматическое кольцо), 1256 (эпокси-группа), 1074 (бензофуран) 3115, 3083, 3033 (С-Н), 5.05 остол 232, 258 1725 (CO-δ-лактонного цикла), 1612, 1562 (ароматическое кольцо) 3170, 3130 (С-Н фуранового кольца), 5.06 ангелицин 248, 274, 311 1730 (a-пироновое кольцо фурокумаринов), 1637, 1621 (С=С) 5.07 неидентифиц. – – 5.08 неидентифиц. – – 3182 (О-Н), 216, 244, 254, 1713, 1688 (CO-δ-лактона), 1622, 5.09 умбеллиферон 300, 324 1613, 1575, 1512 (С=С ароматического цикла) 3115, 3058, 3001(С-Н), 1711 (CO-δ-лактонного цикла), 1625, 5.10 кумарин 275, 325 1606, 1567 (С=С бензольного цикла) Изучение спектров поглощения молекул в инфракрасной области имеет 306 важное значение для идентификации и установления строения природных кумаринов. Полосы валентных колебаний в области 1750-1700 см-1 относятся к карбонильным группам, точное значение зависит от положения заместителей в бензольном кольце. Сильные полосы поглощения, наблюдаемые в ИК-спектрах кумаринов в области 1620-1470 см-1 обусловлены колебаниями ароматических двойных связей. В ИК-спектре псоралена имеется в области выше 3000 см-1 три типа полосы: 3161, 3122 и 3064 см-1, соответствующих трем типам С-Н-связям: фурановому, бензольному, a-пирановому замещенным циклам. Тогда как в спектрах кумарина отсутствует первый тип связи С-Н, что приводит к исчезновению высокочастотной полосы (3161 см-1). Все фурокумарины, за исключением с не полностью замещенным фурановым кольцом, в спектре поглощения дают полосу 3170-3130 см-1, кумарины и фурокумарины – полосу 3130-3110 см-1. Все соединения, имеющие С-Н-связи замещенного бензольного ядра, поглощают в области 3090-3045 см-1. 107 К валентным колебаниям С-Н-связей в фурановом кольце некоторые авторы относят две полосы: 3175-3157 и 3137-3112 см-1. По мнению других исследователей, полоса 3139-3110 см-1 свидетельствует о наличии С-Н-связей a-пиронового кольца. В области 3100-2850 см-1 обнаруживаются также полосы валентных колебаний С-Н-связей. В области 1750-1680 см-1 находится полоса поглощения карбонильной группы δ-лактонов. В растворе четыреххлористого углерода или хлороформа карбонильная полоса a-, β- и δ-ненасыщенных лактонов появляется в интервале 1725-1745 см-1. По положению полосы С=О-группы можно отличать кумарины от хромонов. Для хромонов эта полоса лежит ниже 1680 см-1. В области 1639-1615 см-1 одну из полос относят к валентным колебаниям С=С-связей фуранового цикла. Ароматические полосы, связанные с колебаниями С=С-связей находятся в области 1620-1580 и 1550-1450 см-1. Интенсивность полос поглощения в области 1650-1550 см-1 позволяет отличать кумарины от насыщенных фурокумаринов, а также ненасыщенные фурокумарины от фурокумаринов с насыщенным фурановым циклом. Исследование, именно, этой области может позволить представить характер замещения в фурокумаринах. Например, по интенсивности полос поглощения при 1650-1550 см-1 можно отличать 5- и 8-замещенные фурокумарины. В первом случае в ИК-спектре соединений содержатся две интенсивные полосы в области 1630-1600 и 1585 см-1, причем первая полоса расщеплена на два максимума. 8-замещенные фурокумарины в этой области имеют, резко отличные по интенсивности, полосы при 1620 и 1585 см-1, при этом полоса 1620 см-1 значительно менее интенсивная. Это отчетливо видно в спектрах 5-замещенного фурокумарина – оксипейцеданина (Рисунок 27) и 8-замещенного фурокумарина – императорина (Рисунок 28). 108 100 90 80 70 60 %T 50 40 30 20 10 3600 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 см-1 1000 800cm-1 Рисунок 27 – ИК-спектр оксипейцеданина 100 90 80 70 60 %T 50 40 30 20 10 3600 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 Рисунок 28 – ИК-спектр императорина В отличие от ненасыщенных фурокумаринов фурокумарины с насыщенным фурановым циклом дают при 1650-1500 см-1 две интенсивные полосы, но первая полоса из них не расщеплена на два максимума, как в случае 5-замещенных фурокумаринов [46, 79, 101]. Таким образом, изучение области ИК-спектра с привлечением УФ-спектров позволяет определить характер замещения в кумариновых производных, отличить фурокумарины от кумаринов, а также идентифицировать полностью замещенные фурокумарины. 109 Особый интерес вызывало изучение структуры коричных кислот, т.к. по литературным данным в корнях любистка лекарственного ранее были обнаружены только кофейная, хорогеновая феруловая и кумаровая кислоты (раздел 1.2). Максимум поглощения веществ 5.13–5.16 в области 330 нм и «плечо» в области 280-300 нм в УФ-спектре веществ 5.13–5.16 (Таблица 25) характерны для гидроксикоричных кислот, имеющих кислородсодержащие функциональные группы при С3 и С4 [1]. ИК-спектры выделенных фенолкарбоновых кислот показывают сильное поглощение в области 3420-3450 см-1 (-OH), 1640-1660 cм-1 (C=O), 2950 см-1 (С-Н), 1590-1620 см-1 (С=Саром), а также высокоэффективное поглощение в области 1270 см-1, характеризующее наличие свободных гидроксильных групп в молекуле [125]. Таблица 25 – Спектральные характеристики выделенных фенолкарбоновых кислот в УФ- и ИК-области Номер вещества Название вещества λmax, нм 5.11 эллаговая кислота 256, 366 5.12 галловая кислота 216, 273 5.13 хлорогеновая кислота 245, 300 пл, 330 5.14 феруловая кислота 242, 290 пл, 324 5.15 цикориевая кислота 280 пл, 330 5.16 кофейная кислота 217, 234, 299 пл, 325 ИК-спектр, ν, см-1 3390 (Ar–OH группы), 3350 (фенольные оксигруппы), 1700 (С=O), 1620-1450 (Ar) 3400-3300 (-OH), 1712 (C=O и COOH), 1620-1455 (С=С), 1023(СH3–O) 2970, 2900, 2780 (OH), 1740-1710 (сложноэфирная группировка), 1660, 1625 (>C=O), 1605-1550 (Ar), 840 (замещенный бензол) 3570 (фенольные оксигруппы), 2830 (метоксильная группа), 1623 (>C=O) 1589, 1500, 1420 (Ar), 1485 (эфирная группировка) 3600 (Ar-OH группы), 1735 (С=О), 1655, 1751, 1700 (карбонильная группа), 1600, 1450 (Ar) 3400, 3235, 2975 (OH), 1647, 1630 (>C=O), 1607, 1540 (Ar), 880, 860 (замещенный бензол) 110 Таким образом, сравнение физико-химических свойств выделенных соединений, величин их Rf в нескольких системах растворителей, а также идентичность УФ- и ИК-спектров позволили охарактеризовать выделенные соединения, как: императорин, бергаптен, псорален, оксипейцеданин, остол, ангелицин, умбелиферон, кумарин, эллаговую, галловую, хлорогеновую, феруловую, цикориевую и кофейную кислоты. 5.5 Исследование аминокислотного состава Анализ проводили по методике указанной в разделе 2.6. Статистически достоверные средние результаты определения аминокислот (n=7, р=0,95) методом ВЭЖХ представлены в таблице 26. Таблица 26 – Аминокислотный состав корневищ и корней любистка лекарственного Аминокислота Содержание, % Аминокислота Содержание, % Глутаминовая кислота 0,58±0,03 Серин 0,28±0,01 Фенилаланин 0,45±0,02 Тирозин 0,26±0,01 Аспарагиновая кислота 0,37±0,01 Глицин 0,23±0,01 Лейцин 0,34±0,03 Аланин 0,20±0,01 Гистидин 0,34±0,02 Изолейцин 0,07±0,01 Аргинин 0,34±0,02 Валин 0,06±0,01 Лизин 0,31±0,01 Метионин 0,04±0,01 Треонин 0,30±0,01 Сумма аминокислот 4,16±0,85 Полученные данные свидетельствуют о наличии 15 аминокислот с суммарным количественным содержанием 4,16%. Из обнаруженных аминокислот 9 являются незаменимыми (треонин, валин, изолейцин, аргинин, метионин, лейцин, лизин, фенилаланин, гистидин) с суммарным содержанием 54,1% аминокислот. Из количественно доминирующих аминокислот следует отметить накопление глутаминовой кислоты, фенилаланина, лейцина, аланина, аспарагиновой кислоты, гистидина (Таблица 26), их наличие свидетельствует о высокой биологической ценности анализируемого сырья. 5.6 Исследование элементного состава 111 В настоящее время при поиске эффективных растительных средств исходят из того, что в патогенезе развития и формирования осложнений большую роль играют нарушения минерального обмена, а недостаточность сведений о содержании макро- и микроэлементов в лекарственном растительном сырье не позволяет его рационально использовать. Изучение элементного состава актуально и по другой причине это – проблема загрязнения окружающей среды [4]. Содержание микроэлементов в растении в первую очередь зависит от почвенно-экологических условий и химических свойств микроэлементов. Из 92 встречающихся в природе элементов 81 обнаружен в организме человека, при этом 15 из них (Ca, P, K, Cl, Na, Zn, Mn, Mo, I, Se, S, Mg, Fe, Cu, Co) признаны эссенциальными, т.е. жизненно необходимыми (биогенными), а 10 (F, Si, Ti, V, Cr, Ni, As, Br, Sr, Cd) относят к вероятно (условно) необходимым (условно эссенциальными элементами) [103, 104]. Существенную роль в течение многих заболеваний играет нарушение микроэлементного равновесия в организме человека. Для восполнения недостатка микроэлементов широко применяются минеральные соли, однако их усвоение не превышает 3-10% [57]. Наиболее оптимальным источником макро- и микроэлементов являются растительные объекты, к тому же в них они находятся в доступной и усвояемой форме [89], что облегчает их переход и в лекарственные формы. В наибольших количествах в воде растворяются марганец и цинк, в наименьших – железо. Среднее содержание тяжелых металлов в водных извлечениях уменьшается для микроэлементов в следующем ряду: кадмий > цинк > свинец > медь > железо [58]. Учитывая, что изучаемый вид может использоваться для получения экстемпоральных лекарственных форм, определение микроэлементов в сырье имеет и практическое значение. Качественное и количественное содержание макро – микроэлементов в сырье (золе) проводилось в центральной испытательной лаборатории при ФГУП «Кавказгеолсъемка» по методике предприятия МП – 4С – полуколичественным 112 спектральным методом анализа минерального сырья из кратера угольного электрода (50 элементов) (раздел 2.5). Результаты определения элементного состава свидетельствуют о том, что подземные органы любистка лекарственного являются богатым источником минеральных элементов (Таблица 27). Переход различных элементов из почвы в сырье колеблется в пределах от 1,0 до 3,3. К малоподвижным элементам следует отнести Ti, Mo, V, Mg. Высокая степень подвижности установлена для Zn, Ca, Cr, Br и др. Расчет коэффициентов биологического поглощения показал, что накопление из почвы меди, свинца, хрома достаточно низкое. Активно поглощаются, но не концентрируются серебро, никель, калий, концентрируются – цинк, кальций. Таблица 27 – Элементный состав корневищ и корней любистка лекарственного Элементы Калий Кальций Кремний Фосфор Магний Марганец Алюминий Натрий Железо Стронций Титан Барий Бор Цинк Медь Свинец Ванадий Молибден Цирконий Иттербий Кобальт Концентрация в объекте, % 3,0 · 10-2 1,0 · 10-2 1,0 · 10-2 >5,0 · 10-3 3,0 · 10-3 3,0 · 10-3 3,0 · 10-3 1,5 · 10-3 3,0 · 10-4 <6,0 · 10-5 5,0 · 10-5 <3,0 · 10-5 3,0 · 10-5 0,2 · 10-5 1,0 · 10-5 <1,0 · 10-5 6,0 · 10-6 5,0 · 10-6 <2,0 · 10-6 <2,0 · 10-6 1,0 · 10-6 Концентрация в почве, % 5,1· 10-2 3,3· 10-2 1,2· 10-2 >6,5· 10-3 3,3· 10-3 4,1· 10-3 3,6· 10-3 2,0· 10-3 3,7· 10-4 <6,5· 10-5 5,1· 10-5 <3,5· 10-5 3,5· 10-5 0,8· 10-5 1,4· 10-5 <1,5· 10-5 6,6· 10-6 5,3· 10-6 <3,0· 10-6 <3,0· 10-6 2,0· 10-6 КБП 1,7 3,3 1,2 1,3 1,1 1,4 1,2 1,3 1,2 1,1 1,0 1,2 1,2 4,0 1,4 1,5 1,1 1,1 1,5 1,5 2,0 113 Никель Бром Хром Галлий Иттрий Серебро Скандий 1,0 · 10-6 1,0 · 10-6 1,0 · 10-6 <1,0 · 10-6 <3,0 · 10-7 1,0 · 10-7 <3,0 · 10-7 2,0· 10-6 2,0· 10-6 2,0· 10-6 <2,0· 10-6 <3,0· 10-7 2,0· 10-7 <4,0· 10-7 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,3 Примечание: «<» - содержание меньше порога обнаружения; «>» - содержание больше порога обнаружения. Примечательно низкое накопление тяжелых и токсичных металлов, что делает безопасным фармацевтическое использование исследуемого сырья любистка лекарственного. Обращает на себя внимание высокая концентрация жизненно необходимых («биогенных») металлов (калия, кальция, магния, марганца, натрия, железа), значимость которых определяется их ролью в качестве каталитических центров ферментов, а также участием в синтезе белков, системе антиоксидантной защиты. Железо, участвует в окислительных процессах, поддержании иммунитета, Марганец обеспечивает стабильность клеточных мембран нервных клеток и нервной системы в целом, необходим для нормального функционирования половых желёз и опорно-двигательного аппарата [103, 104]. 114 ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 5 1. Исследован качественный состав любистка лекарственного, выявлено наличие углеводных производных, дубильных веществ, флавоноидов, кумаринов, фенолкарбоновых, органических и амино- кислот, сапонинов и антрагликозидов. 2. Установлено количественное содержание полисахаридов (22,2-24,1%). Выделены различные углеводные фракции: растворимые в спирте этиловом (0,45%), воде (4,70%), растворе аммония оксалата (6,0%) и растворах щелочей (12,0%). Методом ГЖХ впервые установлен и качественный и количественный моносахаридный состав. В подземных органах любистка лекарственного преобладает гемицеллюлоза – гетерополисахарид, состоящий из глюканов и кислых полисахаридов. Основными моносахаридами в ВРПС и ПВ являются галактоза и уроновые кислоты. По характеристическим полосам поглощения в ИК-спектрах анализируемых углеводных фракций установлено наличие остатков галактуроновых кислот. Определены физико-химические свойства пектинов: рН водных растворов, содержание свободных и этерифицированных карбоксильных групп, содержание полигалактуроновой кислоты в сырье составило во фракции ВРПС – 32,5%, ПВ – 58,8% и ГЦ – 20,1%. 3. Содержание эфирного масла в различных образцах сырья составляло от 1,2 до 2,4%. Методом газовой хромато-масс-спектрометрии в эфирном масле корневищ и корней любистка лекарственного идентифицировали 17 компонентов, что составляет 97,67% от всех обнаруженных. Доминирующими компонентами являются бициклические монотерпеновые углеводороды: линалоол (42,88%) и линалилацетат (36,20%). 4. Методами БХ, ТСХ и ВЭЖХ в исследуемом сырье идентифицированы фенольные соединения: фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды и кумарины. 5. В индивидуальном виде выделены 14 соединений, среди которых 6 производных фенолкарбоновых кислот: эллаговая, галловая, кофейная, хлорогеновая, феруловая и цикориевая; и 8 кумаринов: императорин, бергаптен, псорален, 115 оксипейцеданин, остол, ангелицин, умбелиферон, кумарин, структура которых подтверждена методами УФ-, ИК- спектрометрии, физико-химическими характеристиками. 6. Изучен качественный и количественный состав свободных и связанных аминокислот, представленных 15 соединениями, 9 из которых являются незаменимыми (треонин, валин, изолейцин, аргинин, метионин, лейцин, лизин, фенилаланин, гистидин) с суммарным содержанием 54,1% аминокислот. Из количественно доминирующих аминокислот следует отметить накопление глутаминовой кислоты, фенилаланина, лейцина, аланина, аспарагиновой кислоты, гистидина. 7. Переход различных элементов из почвы в сырье колеблется в пределах от 1,0 до 3,3. К малоподвижным элементам следует отнести Ti, Mo, V, Mg. Высокая степень подвижности установлена для Zn, Ca, Cr, Br и др. Расчет коэффициентов биологического поглощения показал, что накопление из почвы меди, свинца, хрома достаточно низкое. Активно поглощаются, но не концентрируются серебро, никель, калий, концентрируются – цинк, кальций. 116 ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА СЫРЬЯ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО Разработка современной НД, обеспечивающей высокое качество лекарственного растительного сырья, с привлечением наиболее современных и перспективных физико-химических методов в настоящее время является актуальной задачей [127]. Согласно требованиям, предъявляемым к современным методам стандартизации ЛРС, необходимо разработать показатели норм качества сырья в зависимости от пути его использования при производстве лекарственных средств [97]. Используя результаты первичного аналитического химического скрининга, в изучаемом сырье фенольные соединения являются доминирующими и на их долю приходится основной вклад ожидаемого фармакологического эффекта, поэтому и разрабатывали методики их качественного и количественного определения. Необходимо также учесть, что доказанное медицинское действие препаратов любистка как спазмолитического средства связано с присутствием кумаринов, а желчегонного – с фенолкарбоновыми кислотами (раздел 1.3). В качестве аналитических веществ на основании химического состава и фармакологической активности были выбраны фенольные соединения: ангелицин и хлорогеновая кислота. 6.1 Разработка оптимальной методики экстракции сырья Главная проблема при разработке методики количественного определения для лекарственного растительного сырья состоит в изучении основных гидродинамических факторов экстракционного процесса. Процесс экстракции зависит от измельченности сырья, времени экстракции, температурного режима, типа экстрагента, соотношения сырье – экстрагент [69]. Измельченность сырья оказывает большое влияние на процесс экстрагирования. Оптимальные значения степени измельченности, найденные различными авторами в среднем совпадают и равны 0,5-2 мм [28, 122]. 117 Проведенные нами исследования по изучению влияния степени измельченности на экстракцию БАС из сырья приведены в таблице 28. В каждом из полученных экстрактов определяли выход экстрактивных веществ в соответствии с методикой ОФС ГФ ХI [26, 68]. Таблица 28 – Выбор оптимальной степени измельченности сырья для экстракции БАС Степень измельченности сырья, мм 0,5 1,0 2,0 3,0 Содержание экстрактивных веществ, экстрагент, % 40 % спирт 70 % спирт вода этиловый этиловый 44,02 24,36 22,85 43,37 24,12 22,46 42,81 23,85 22,32 35,95 20,06 16,21 Примечание: указано среднее значение из 6 определений Из данных таблицы 28 видно, что максимальное извлечение экстрактивных веществ из корневищ и корней любистка лекарственного достигается уже при степени измельчения 2 мм. Дальнейшее измельчение не приводит к существенному увеличению результатов. Важную роль для экстракции действующих веществ играет тип растворителя. Нами устанавливалась оптимальная концентрация этилового спирта для извлечения суммы фенольных соединений. Как следует из полученных данных (Таблица 28), максимальное извлечение экстрактивных веществ достигается 40 и 70% спиртом этиловым. Но, изучив спектральные характеристики извлечений, полученных с использованием спирта разной концентрации (раздел 5.4.2), пришли к выводу, что спирт этиловый 70% в данном виде сырья обладает наибольшей экстрагирующей способностью оксикоричных и фенолкарбоновых кислот. При последующем изучении условий экстракции установлено, что оптимальными условиями экстракции являются соотношение сырье : экстрагент (1 : 20) (Таблица 29). 118 Таблица 29 – Выбор соотношения сырье : экстрагент для экстракции БАС Соотношение сырье : экстрагент 1 : 10 1 : 15 1 : 20 1 : 50 Содержание экстрактивных веществ, % 15,18 20,85 22,16 22,32 Для извлечения суммы БАС нами использована экстракция с нагреванием на кипящей водяной бане до наступления равновесия. Проведенные исследования динамики экстракции из измельченного материала кипящим спиртом при соотношении сырье : экстрагент (1:20) показали максимальный выход БАС через 1 час с последующим наступлением равновесия (Таблица 30). Таблица 30 – Выбор времени экстрагирования для экстракции БАС Время экстракции, мин 15 мин 30 мин 45 мин 60 мин 1 ч 15 мин 1 ч 30 мин 1 ч 45 мин 2ч Содержание экстрактивных веществ, % 1,25 8,34 16,15 22,16 22,68 22,74 22,79 22,85 Таким образом, экспериментально установлено, что наиболее оптимальными являются условия экстракции: экстрагент – 70% спирт этиловый, время экстракции – 1 час, соотношение сырье : экстрагент 1:20 и степень измельченности сырья до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм. 6.2 Спектральная характеристика спиртовых извлечений из корневищ и корней любистка лекарственного Разработке оптимальной методике количественного анализа и выбору аналитического вещества предшествовала работа по изучению поглощений в УФ- 119 области спектра спиртовых извлечений, приготовленных по параметрам указанным в разделе 6.1. Полученные данные свидетельствуют о том, что спектры поглощения спиртовых извлечений из сырья с помощью 70% спирта этилового, имеют полосы поглощения в интервале длин волн 250-290 и 320-380 нм, что характерно для соединений фенольного ряда, поэтому можно сделать вывод о содержании в данных извлечениях флавоноидов, дубильных веществ и фенолкарбоновых кислот [37], что согласуется с результатами, полученными методом ВЭЖХ (Рисунок 29). Максимум поглощения экспериментальных извлечений наблюдают при длине волны 278 и 327 нм, что совпадает с УФ-спектром СО хлорогеновой кислоты (Рисунок 30). А λ, нм Рисунок 29 – УФ-спектр поглощения извлечения, приготовленного с помощью спирта этилового 70% из корневищ с корнями любистка лекарственного 120 А λ, нм Рисунок 30 – УФ-спектр поглощения раствора CO хлорогеновой кислоты Для разработки методики количественного определения кумаринов в корневищах и корнях любистка лекарственного изучили спектры светопоглощения извлечения приготовленного с помощью 96% спирта этилового и раствора СО ангелицина (Рисунок 31, 32). 1,4 А 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 200 -0,2 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 λ, нм -0,4 Рисунок 31 – УФ-спектр извлечения подземных органов любистка лекарственного, полученного с помощью 96% спирта этилового 121 1,6 А 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 -0,2 400 λ, нм -0,4 Рисунок 32 – УФ-спектр раствора CO ангелицина Как следует из рисунков спектр поглощения извлечения, приготовленного с помощью 96% спирта этилового, имеет максимумы в диапазоне длин волн от 250 до 300 нм, а максимум поглощения при 270±2 нм соответствует максимуму поглощения раствора СО ангелицина. 6.3 Разработка методики ТСХ анализа корневищ и корней любистка лекарственного Для качественного обнаружения ангелицина и определения подлинности сырья любистка лекарственного использовали метод хроматографии в тонком слое сорбента (Рисунок 33). Приготовление извлечения. Около 3,0 г сырья (точная навеска) измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм, помещали в колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 30 мл спирта этилового 96% и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 20 мин. Извлечение фильтровали в горячем виде и к фильтрату добавляли по каплям при постоянном помешивании 10% раствор свинца ацетата. При этом большая часть веществ фенольного характера, обладающая способностью к азосочета- 122 нию, осаждалась. Еще горячую массу переносили на фильтр, отделяли осадок солей свинца и промывали осадок 3 мл спирта. К фильтрату прибавляли 5 мл воды. Для дальнейшей очистки фильтрат помещали в делительную воронку вместимостью 100 мл, приливали 20 мл хлороформа и встряхивали. Отделяли нижний хлороформный слой. Хлороформ отгоняли под вакуумом, а остаток в колбе растворяли в 6 мл 96% спирта. Спиртовой раствор и растворы СО кумаринов наносили капилляром на линию старта пластинки, покрытой слоем силикагеля. Пластинку сушили на воздухе в течение 5 мин., затем помещали в камеру со смесью растворителей толуол – этилацетат (1:1) и хроматографировали восходящим способом. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Рисунок 33 – ТСХ в системе: толуол – этилацетат (1:1) извлечений из корневищ с корнями любистка лекарственного: 1 – спиртом этиловым 96%, 2 – извлечение СО умбеллиферона, 3 – извлечение СО императорина, 4 – извлечение СО феруловой кислоты, 5 – извлечение СО кофейной кислоты, 6 – извлечение СО оксипеуцеданина, 7 – извлечение СО хлорогеновой кислоты, 8 – извлечение СО ангелицина, 9 – извлечение СО галловой кислоты 123 Хроматограмму просматривали в УФ-свете при λ=365 нм, опрыскивали 10% спиртовым раствором натрия гидроксида, подсушивали в сушильном шкафу при температуре 110-1200 С в течение 2-3 мин. Кумарины имеют в УФ-свете зеленую, ярко-голубую, зеленовато-голубую и фиолетовую флуоресценцию, которая усиливается под действием щелочи. Пятно ангелицина имело ярко-голубую окраску с Rf ~0,8. Ввиду большого количества индивидуальных веществ в извлечении, идентификация ангелицина и других компонентов без сравнения со стандартным образцом затруднена. 6.4 Количественное определение кумаринов Спектрометрическое количественное определение суммы кумаринов проводили по следующей методике. Около 0,5 г сырья (точная навеска) помещали в колбу вместимостью 100 мл и прибавляли 50 мл спирта этилового 96%, содержащего 1% концентрированной кислоты хлористоводородной. Содержимое колбы кипятили однократно с обратным холодильником в течение 30 минут, затем полученное извлечение фильтровали и упаривали. Полученное сгущенное извлечение растворяли в спирте этиловом 96% и количественно переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, после чего доводили тем же растворителем до метки. Затем 2,5 мл полученного извлечения переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки спиртом, после чего тщательно перемешивали. Спектры поглощения извлечений из сырья и раствора СО ангелицина регистрировали на спектрофотометре СФ2000 относительно растворителя. Остаток количественно переносили и растворяли в мерной колбе вместимостью 25 мл в 20 мл спирта этилового 96%, объем раствора в колбе доводили до метки тем же растворителем. Аликвоту в количестве 1 мл переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл и объем раствора в колбе доводили до метки спиртом этиловым 96%. Оптическую плотность полученного раствора измеряли при длине волны 270 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – спирт этиловый 96%. 124 В качестве стандартного раствора использовали раствор СО ангелицина. Для этого 0,1 г СО ангелицина (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл и растворяли в 40 мл спирта этилового 96%, после чего содержимое колбы доводили до метки тем же растворителем (раствор А). 1мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили объем раствора до метки тем же растворителем. Оптическую плотность полученного раствора измеряли при длине волны 270 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – спирт этиловый 96% (Рисунок 34). 1 2 Рисунок 34 – УФ-спектр поглощения раствора СО ангелицина (1) и извлечения из корневищ с корнями любистка лекарственного (2) Содержание кумаринов (Х,%) в пересчете на ангелицин и абсолютно сухое сырье рассчитывали по формуле: Х Ах а0 Wx1 Wx 2 Va 0 100% 100 , где А0 а х Vax W01 W02 (100 В) А0 и Ах – значения оптических плотностей растворов СО ангелицина и анализи- руемого образца соответственно; а0 и а х – массы навесок СО ангелицина и извлечения любистка лекарственного соответственно, г; 125 W0 и Wx – мерные колбы, использованные для разведения навесок СО ангелицина и анализируемого образца соответственно, мл; Va0 и Vax – аликвоты растворов СО и анализируемого образца соответственно, мл. В – влажность сырья, 9,70%. Определение линейности методики проводили с помощью оценки градуировочного графика, отражающего зависимость величины оптической плотности от количества кумаринов в 1 мл извлечения из сырья любистка лекарственного. Нами были приготовлены 5 извлечений по вышеописанной методике, но из разных навесок сырья: 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 и 0,7 г. Количественное содержание кумаринов в 1 мл извлечения рассчитывали по формуле: Х Ах а0 Wx 2 Va 0 100 , где А0 Vax W01 W02 (100 В) А0 и Ах – значения оптических плотностей растворов СО ангелицина и анализи- руемого образца соответственно; а0 – масса навески СО ангелицина, г; W0 и Wx – мерные колбы, использованные для разведения навесок СО ангелицина и анализируемой аликвоты соответственно, мл; Va0 и Vax – аликвоты растворов СО и анализируемого образца соответственно, мл. В – влажность сырья, 9,70%. По результатам эксперимента построен градуировочный график зависимости значений оптической плотности от содержания кумаринов в исследуемом растворе (Рисунок 35). 126 Рисунок 35 – Градуировочный график зависимости оптической плотности от содержания кумаринов в исследуемом извлечении, уравнение регрессии, коэффициент корреляции Наличие линейной зависимости между х и у (y=bx+a) подтверждали расчетным путем. Для этого по экспериментальным данным, полученным при калибровке, оценивали достоверность линейной связи между х и у с использованием корреляционного анализа, а затем рассчитывали значения констант а и b зависимости. В первом приближении судить о достоверности линейной связи между переменными х и у можно по величине коэффициента корреляции r, который вычисляли по уравнению исходя из экспериментальных данных: m r m m 1 1 m xi y i xi y i 1 m 2 m m 2 m 2 m xi xi m yi yi 1 1 1 1 2 Чем ближе значение r к единице, тем менее наблюдаемая линейная зависимость между переменными х и у может рассматриваться как случайная. В аналитической химии в большинстве случаев используют линейные зависимости, отвечающие условию r 0,99. 127 Коэффициенты а и b и метрологические характеристики зависимости рассчитывали с использованием регрессионного анализа методом наименьших квадратов по экспериментально измеренным значениям переменной у для заданных значений аргумента х (Таблица 31, ГФ XII). Таблица 31 – Промежуточные данные для вычисления коэффициента корреляции xi yi xi× yi x i2 yi 2 0,5884 0,157 0,09238 0,3462 0,0246 1,0194 0,272 0,2773 1,0392 0,0740 1,4091 0,376 0,5298 1,9856 0,1414 1,7539 0,468 0,8208 3,0762 0,2190 2,2186 0,592 1,3134 4,9222 0,3505 6,9894 3,0337 Рассчитанное значение коэффициента корреляции составило 0,999. Коэффициенты а и b 0,2668 и 0,00005 соответственно. Таким образом, уравнение линейной зависимости имеет вид: y = 0,2668×x + 0,00005 Значение коэффициента корреляции максимально приближено к 1, поэтому можно утверждать о наличии линейной зависимости значений оптической плотности от содержания кумаринов в исследуемом извлечении. Для определения внутрилабораторной воспроизводимости (прецизионности) методики содержание кумаринов определяли в шести разных навесках сырья по разработанной методике. Результаты эксперимента представлены в таблице 32. 128 Таблица 32 – Результаты количественного определения кумаринов в сырье любистка лекарственного (в пересчете на ангелицин и абсолютно сухое сырье) (A0 = 0,591; В=9,70%) Масса навески, г 0,5048 0,5116 0,4997 0,5005 0,4990 0,5028 Значение оптической плотности, А (λ = 270 нм) 0,376 0,368 0,347 0,342 0,354 0,362 Найдено кумаринов, % 6,9785 6,7393 6,5060 6,4020 6,6466 6,7454 Метрологические характеристики RSD=3,04% Как следует из представленных данных, содержание кумаринов в корневищах и корнях любистка лекарственного, найденное спектрофотометрическим методом, составило 6,67%, а относительная погрешность определения – 3,04%. Для оценки правильности методики готовили модельный препарат с содержанием кумаринов в исследуемом извлечении 2,155 мг/мл, полученном из навески 0,7 г сырья, так как это содержание находится на верхнем пределе линейности методики. Чтобы получить смеси с тремя уровнями концентраций – 1:0,5; 1:1 и 1:2, полученное извлечение разводили спиртом этиловым 96%. На каждом уровне концентраций проводили определение содержания кумаринов, рассчитывали открываемость и оценивали правильность методики (Таблица 33). 129 Таблица 33 − Результаты оценки правильности методики количественного определения кумаринов в экстракте любистка лекарственного (исходное содержание 2,155 мг/мл) Разведение Расчетное модельного содержание препарата суммы кумаринов, мг/мл 1: 0,5 1,4370 1: 0,5 1,4370 1: 0,5 1,4370 1: 1 1,0775 1: 1 1,0775 1: 1 1,0775 1: 2 0,7183 1: 2 0,7183 1: 2 0,7183 Найденное содержание суммы кумаринов, мг/мл 1,4771 1,5027 1,4101 1,0536 1,0917 1,0773 0,7409 0,7129 0,7196 Открываемость, Метрологические R,% характеристики 102,79 104,57 98,13 97,78 101,32 99,98 103,15 99,25 100,18 Х RSD=2,32% Из представленных результатов следует, что на всех трех уровнях концентраций анализируемого объекта получаются сопоставимые результаты, а относительная погрешность определения правильности методики равна 2,32% [65]. 6.5 Количественное определение суммы фенольных соединений Для количественного определения суммы фенольных соединений использовали метод спектрофотометрии. Спектр поглощения раствора СО хлорогеновой кислоты (Sigma-Aldrich, США) в спирте этиловом 70% имел максимум поглощения при длине волны 325±2 нм и характерный участок при длине волны 300 нм. Детектирование хлорогеновой кислоты и ее изомеров осуществляли при 325 нм. Извлечение из корневищ с корнями любистка лекарственного получали, используя установленные параметры экстракции (глава 6.1). Около 0,5 (точная навеска) измельченного воздушно-сухого сырья до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, экстрагировали спиртом этиловым 70% в течение 1 часа на водяной бане. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объемом 25 мл и до- 130 водили спиртом этиловым 70% до метки. 1 мл полученного извлечения помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили тем же растворителем до метки (исследуемый раствор). Для приготовлении раствора СО 0,001 г (точная навеска) кислоты хлорогеновой помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляли 5 мл спирта этилового 70%, перемешивали до растворении и доводили до метки (раствор А). 1 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили тем же растворителем до метки (СО). Оптическую плотность полученных растворов измеряли при длине волны 325 нм относительно спирта этилового 70% в кювете с толщиной слоя 10 мм (Рисунок 39). Количественное содержание суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту в абсолютно-сухом сырье рассчитывали по формуле: A1 – оптическая плотность исследуемого раствора; A – оптическая плотность раствора CO; n – масса навески CO хлорогеновой кислоты, г; m – масса навески сырья, г; W – потеря в массе при высушивании, %. 1 0,8 0,6 А 2 0,4 0,2 1 0 200 300 400 λ, нм Рисунок 36 – УФ-спектр поглощения раствора СО хлорогеновой кислоты (1) и извлечения из корневищ с корнями любистка лекарственного(2) 131 Таблица 34 – Метрологические характеристики методики t(P, f) f s P, % ∆x 5 0,48 0,0013 95 2,57 0,0014 ε,% 0,29 Содержание суммы фенольных соединений, в пересчете на хлорогеновую кислоту в корневищах с корнями любистка лекарственного составило 0,48±0,001% (Таблица 34) [64]. Для качественной идентификации и количественного определения хлорогеновой кислоты применяли также метод планарной хроматографии с последующей денситометрической обработкой хроматограмм. Хроматографирование проводили на пластинках марки «Sorbfil» (г. Краснодар) размером 10х15 см. В качестве подвижной фазы использовали систему nбутанол – ледяная уксусная кислота – вода (5:4:1). Высота подъема растворителя 9 см. Детектирование проводили парами аммиака. На линию старта хроматографической пластинки длиной 15 см наносили 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 мкл раствора СО с содержанием хлорогеновой кислоты 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 мкг соответственно. На этой же пластинке обозначали четыре линии контрольных треков, на которые наносили спиртовое извлечение хлорогеновой кислоты объемом 15 и 20 мкл. Пробы наносили при помощи микрошприца МШ-10 (агат). Пластинки помещали в камеру для хроматографирования объемом 2000 см3, насыщенную парами растворителя. После подъема растворителя на необходимый уровень пластинки вынимали, высушивали в вытяжном шкафу при комнатной температуре до удаления паров растворителя. Через 10-15 минут появляются пятна тёмно-коричневого цвета. Для усиления окраски пластинку держали над парами аммиака концентрированного. Далее пластинки сканировали при помощи планшетного сканера «HP Scanjet 3670» (разрешение 100 dpi) и осуществляли их цифровую обработку с помощью компьютерной программы «Видеоденситометр Sorbfil v1.7» (г. Краснодар). Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки (внешнего стандарта), по градуировочному графику зависимости «масса вещества – площадь пика» (линейная аппроксимация). 132 Определение хроматографических характеристик. Для выбора наиболее эффективных пластинок исследовали пластинки следующих марок: ПТСХ-П-ВУФ, ПТСХ-П-А-УФ и ПТСХ-АФ-В-УФ (г. Краснодар). Эффективность пластинки определяли по числу теоретических тарелок (NTR) и асимметрии (As) пятен стандартных образцов. Результаты приведены в таблице 35. Таблица 35 – Показатели эффективности различных типов пластинок Тип пластики ПТСХ-П-В-УФ ПТСХ-П-А-УФ ПТСХ-АФ-В-УФ NTR 1308±250 694±185 604±121 As 0,67±0,09 0,48±0,03 0,39±0,03 Наиболее эффективными являются пластинки марки ПТСХ-П-В-УФ, которые были выбраны нами для определения хлорогеновой кислоты в спиртовом извлечении. Чувствительность детектирующего реагента устанавливали по величине предела обнаружения (ПО), нанося точно известное количество СО хлорогеновой кислоты на хроматографическую пластинку (m, мкг). Готовили растворы стандартного образца с концентрациями 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0 и далее – до 3-х мкг/мкл. На пластинку наносили по 1 мкл приготовленных растворов и хроматографировали, как указано выше. На рисунке 33 видно, что наименьшая концентрация хлорогеновой кислоты, которая идентифицируется данным методом составляет 0,5 мкг/мкл. Специфичность определяли по величине Rf пятна контрольного трека, которое должно соответствовать Rf пятен стандартного образца (0,56±0,02). На треках контрольного образца визуально обнаруживалось пятно тёмно-коричневого цвета с Rf 0,54, что соответствует окраске и величине Rf стандартных образцов (Рисунок 37). 133 Рисунок 37 – Оцифрованная хроматограмма растворов СО хлорогеновой кислоты: 1 – 1 мкг/мкл; 2 – 1,5 мкг/мкл; 3 – 2 мкг/мкл; 4 – 2,5 мкг/мкл; 5 – 3 мкг/мкл; 6 – спиртовое извлечение Таблица 36 – Результаты определения хлорогеновой кислоты в корневищах и корнях любистка лекарственного Содержание, % Метрологические характеристики 0,37±0,04 Хср = 0,37 SD = 0,024 RSD = 5,5% Х = 0,025 Е = 6,84% Примечание: данные приводятся в пересчете на воздушно-сухое сырье Таким образом, содержание хлорогеновой кислоты в корнях и корневищах любистка лекарственного, определённое данной методикой, составило 0,37% в пересчёте на воздушно сухое сырьё (Таблица 36). Полученные данные свидетельствуют, что разработанная методика определения хлорогеновой кислоты методом планарной хроматографии специфична, имеет достаточно высокую чувствительность и эффективность. Данную методику 134 можно использовать для качественного и количественного определения хлорогеновой кислоты в растительном сырье [68]. 6.6 Определение товароведческих показателей корневищ и корней любистка лекарственного В результате товароведческого анализа устанавливали показатели доброкачественности корневищ и корней любистка лекарственного, выращенного в природно-климатических условиях КМВ. 6.6.1 Определение числовых показателей Для характеристики анализируемого сырья определены следующие показатели: влажность, зола общая, зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной, содержание экстрактивных веществ, примесей, степень измельчённости [24, 25, 68]. Результаты анализа (n=6) товароведческих показателей представлены в таблице 37. Содержание экстрактивных веществ достигало максимальных значений при использовании в качестве экстрагента 40% спирта этилового и воды очищенной, что обусловило перспективность использования данных экстрагентов при получении фитосубстанций. Исходя из полученных данных, считаем целесообразным установить следующие нормы числовых показателей. Цельное сырье. Влажность – не более 12%; золы общей – не более 10%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной – не более 2%; корневищ и корней, потерявших окраску – не более 5%; корневищ с остатками листьев – не более 2%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм – не более 5%; органической примеси – не более 1%; минеральной примеси – не более 1%. 135 Таблица 37 – Числовые показатели корневищ и корней любистка лекарственного Показатель Влажность Зола общая Зола, нерастворимая в10% HCl Экстрактивные вещества (экстрагент): вода спирт этиловый 40 % спирт этиловый 70 % спирт этиловый 96 % Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями 7 мм Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями 2 мм Кусочки корней потерявших окраску Остатков листьев и стеблей Органические примеси Минеральные примеси цельное 8,87–9,37 4,36–4,80 0,35–0,87 Содержание, % измельченное 6,82–7,32 3,65–4,09 0,28–0,80 порошок 6,29–6,79 3,55–3,99 0,26–0,78 42,16–44,58 45,81–48,09 23,87–24,37 16,81–17,09 9,7–10,0 2,33–4,56 — — — 1,21–2,54 — — 3,48–3,87 — — — 7,15–9,68 1,23–3,26 0,34–1,28 0,21–0,52 0,12–0,27 0,13–2,16 — 0,25–0,46 0,02–0,10 — — — — Измельченное сырье. Влажность – не более 12%; золы общей – не более 10%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной – не более 2%; корневищ и корней, потерявших окраску – не более 3%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм – не более 3%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм – не более 5%; органической примеси – не более 1%; минеральной примеси – не более 1%. Порошок. Влажность – не более 10%; золы общей – не более 10%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной – не более 2%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм – не более 10%. 136 6.6.2 Определение микробиологической чистоты Контроль качества лекарственного растительного сырья на микробиологическую чистоту проводили согласно статье ГФ XII «Методы микробиологического контроля лекарственных средств» [25]. Выполняя экспериментальное исследование, нами учитывался риск получения ложных микробиологических результатов при контроле качества лекарственных средств [29]. Таблица 38 – Содержание микроорганизмов в корневищах и корнях любистка лекарственного Бактерии (в 1 г) норма – не более 7 10 аэробных бактерий 2,0х102 Грибы (в 1 г) норма – не более 105 дрожжевых и плесневых грибов 2,0х102 Escherichia coli (в 1 г) норма – не более 102 Не обнаружено Исходя из приведенных в таблице 38 данных, образцы исследуемого сырья по показателю микробиологической чистоты соответствовали требованиям ГФ ХII (категория 4А). 6.6.3 Определение содержания тяжелых металлов Содержание тяжелых металлов и железа определяли по методике ГФ XII издания в зольном остатке после сжигания сырья. Окраска, появившаяся в испытуемом растворе, не превышала окраски эталонного раствора, что свидетельствует о соответствии всех образцов сырья по содержанию тяжелых металлов требованиям ГФ XII. С позиции оценки экологической чистоты ЛРС прежде всего необходимо определение концентраций кадмия, свинца и ртути [31]. Проблема становится актуальной и в связи с тем, что тяжелые металлы из ЛРС могут переходить в лекарственные формы [91]. Таким образом, нормирование содержания тяжелых металлов в сырье и фитопрепаратах – одна из важнейших задач современной науки, решение которой позволит гарантировать безопасность ЛРС и фитопрепаратов для населения. 137 В настоящее время отсутствует общая фармакопейная статья по определению тяжелых металлов в ЛРС, поэтому для повышения безопасности применения ЛРС, используют метод нормирования 3 наиболее опасных тяжелых металлов (свинца, кадмия и ртути), определяемых методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Нормой допустимого предела содержания тяжелых металлов служат показатели для БАД растительного происхождения, согласно действующему СанПин [31, 91, 99]. Концентрации тяжелых металлов (свинца, кадмия и ртути) в сырье определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии по методике ГОСТ 30178-96 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов». Результаты исследования представлены в таблице 39. Таблица 39 – Содержание тяжелых металлов в корневищах корнях любистка лекарственного Концентрация Pb, мг/кг 0,87 Содержание от допустимого уровня, % 14,5 Концентрация Cd, мг/кг 0,80 Содержание от допустимого уровня, % 80,00 Концентрация Hg, мг/кг 0,009 Содержание от допустимого уровня, % 9 Примечание: допустимые пределы не более свинец – 6,0 мг/кг; кадмий – 1,0 мг/кг; ртуть – 0,1 мг/кг Анализ показал, что все образцы сырья удовлетворяют требованиям СанПиН 2.3.2 1078-01 в редакции СанПиН 2.3.2 1280-03 по содержанию кадмия, свинца и ртути. 6.6.4 Определение содержания радионуклидов Согласно ОФС 42-0011-03, в растительном сырье нормируется содержание радионуклидов техногенного происхождения, в первую очередь Sr-90 и Cs-137, источниками которых являются АЭС и предприятия по переработке отходов ядерной промышленности [76]. Установлено, что накопление Sr-90 происходит, в основном, в органах многолетних растений (кора крушины, кора дуба, некоторые корневища). Переход Sr-90 из лекарственного сырья в водные извлечения состав- 138 ляет 5-8%, что объясняется интрацеллюлярным накоплением Sr-90 в растениях и выраженной способностью к комплексообразованию. Из 40 известных изотопов цезия действующая нормативная документация регламентирует содержание только Cs-137. Цезий является аналогом щелочных металлов (натрия, калия, лития), способность к комплексообразованию с БАВ у него не выражена. Основным для человека является пероральный путь поступления Cs-137 при употреблении загрязненных продуктов питания [76]. C точки зрения радиологической безопасности исследуемые образцы растительного сырья не представляют опасности, так как накапливают до 1% Cs-137 и 0,15-0,30 % Sr-90 от допустимого нормативной документацией уровня (Таблица 40). Таблица 40 – Содержание радионуклидов в корневищах и корнях любистка лекарственного Be-7 K-40 Ra-226 Th-232 Cs-137 Sr-90 Радионуклид Общая сумма радионуклидов 11,429 225,19 – – – <0,3 236,619 Содержание Сумма Cs-137 в Csсырье в % от 137+ допустимого Sr-90 уровня 0,3 – Содержание Sr-90 в сырье в % от допустимого уровня 0,15 Примечание: допустимый уровень в лекарственных растениях (по ОФС 42-001-03), Cs-137 не более 400 Бк/кг, Sr-90 не более 200 Бк/кг 6.7 Обоснование норм качества «Любистка лекарственного корневища и корни» В результате проведенного фитохимического исследования корневищ и корней любистка лекарственного, а также учитывая значение в оказании фармакологического эффекта, в качестве приоритетных групп БАВ выделили хлорогеновую кислоту и сумму кумаринов. Для объективной оценки качества сырья с учетом различных путей использования необходимо внести ряд показателей в НД. Для этого нами проведены исследования по разработке методик качественного и количественного определения основных групп БАВ, морфолого- 139 анатомические исследования. При разработке НД на лекарственное растительное сырье проводили исследования по изучению сроков хранения сырья и их влияние на его качество. Результаты исследований представлены в разработанном проекте фармакопейной статьи (ФС) и Инструкции по заготовке и сушке (см. приложение). Нормативная документация оформлена в соответствии с требованиями ОСТ 91500.05.001-00. Хранение сырья корневища и корни любистка лекарственного необходимо проводить в сухом, хорошо проветриваемом помещении, при температуре 18200 С в течение 2 лет (см. приложение). Таким образом, на основании проведенных исследований по изучению содержания основных групп БАС, сроков годности сырья, товароведческих, морфолого-анатомических исследований предложены показатели и нормы качества для сырья исследуемого вида, которые положены в основу современной нормативной документации (Таблица 41). Таблица 41 – Показатели норм качества «Любистка лекарственного корневища и корни» Показатели 1 Внешние признаки Микроскопия Качественные реакции Хроматография Методы 2 Визуальный, органолептический Микроскопический Поперечный срез корневища или корня помещают в раствор Судана III, накрывают покровным стеклом и нагревают. ТСХ-анализ Нормы 3 В соответствии с ФС 42- Планарная хроматография Зона адсорбции с Rf около 0,54±0,02 (хлорогеновая кислота) В соответствии с ФС 42Капли эфирного масла окрашиваются в оранжево-желтый цвет (масла). Зона адсорбции голубого цвета с Rf около 0,8±0,02 (ангелицин) 140 1 УФ-спектры Влажность Зола общая Зола нерастворимая в 10% р-ре HCl Органические примеси Минеральные примеси Количественное определение Микробиологическая чистота Упаковка Маркировка Транспортировка Сок годности 2 1. УФ-спектр спиртовых извлечений из сырья с помощью 70% спирта этилового 2. УФ-спектр спиртовых извлечений из сырья с помощью 96% спирта этилового ГФ XI, вып. 1, С. 285-286 ГФ XI, вып. 1, С. 24 ГФ XI, вып. 1, С. 25 3 Максимумы поглощения в области 278±2 нм, 327±2нм (хлорогеновая кислота) Максимум поглощения при 270±2 нм (ангелицин) ГФ XI, вып. 1, С. 276 ГФ XI, вып. 1, С. 276 Спектрофотометрический (сумма кумаринов) Спектрофотометрический (сумма фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту) ГФ XII – метод 3 (эфирное масло) ГФ XII ОФС 42-0016-07 Не более 1% Не более 1% Не менее 5% ГФ XI, вып. 2, С. 381 ГОСТ 6077-80 Не более 12 % Не более 10 % Не более 2% Не менее 0,4% Не менее 1,0% Категория 4 А В мешки тканевые или льно-джуто-кенафные не более 40 кг нетто ГФ XI, вып. 12, С. 384 ГОСТ На этикетке указывается 14192-96 наименование предприятия–изготовителя, его товарный знак, юридический адрес, название лекарственного средства на русском и латинском языках, масса 40 кг при влажности не более 12 %, регистрационный номер, номер серии, срок годности, условия хранения, «Продукция прошла радиационный контроль» ГФ XI, вып. 2, С. 385 ГОСТ 14192-77 и ГОСТ 17768-80 2 года 141 ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 6 1. Экспериментально обоснованы оптимальные параметры экстракции биологически активных веществ: экстрагент – 70% спирт этиловый, время экстракции – 1 час, соотношение сырье : экстрагент 1:20 и степень измельченности сырья до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм. 2. Разработана методика идентификации и количественного определения хлорогеновой кислоты методом планарной хроматографии на пластинках марки ПТСХ-П-В-УФ (г. Краснодар) в корневищах и корнях любистка лекарственного, которое составило 0,37% в пересчёте на воздушно сухое сырьё. Полученные данные свидетельствуют, что методика специфична, имеет достаточно высокую чувствительность и эффективность. 3. Разработана методика ТСХ-анализа определения кумаринов в корневищах и корнях любистка лекарственного. 4. Разработана спектрофотометрическая методика определения суммы кумаринов в пересчете на ангелицин с установлением валидационных характеристик по параметрам: линейность, прецизионность, правильность и специфичность. 5. Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту с установлением метрологических характеристик. 6. Установлены товароведческие показатели сырья (цельного, измельченного, порошка) и определены их нормы для включения в раздел фармакопейной статьи «Числовые показатели». 7. Наиболее высокой экстрагирующей способностью для БАС корневищ и корней любистка лекарственного обладают 40% спирт этиловый и вода очищенная. 8. Образцы исследуемого сырья по показателю микробиологической чистоты соответствовали требованиям ГФ ХII (категория 4А). 9. Анализ показал, что все образцы сырья удовлетворяют требованиям СанПиН 2.3.2 1078-01 в редакции СанПиН 2.3.2 1280-03 по содержанию кадмия, свинца и ртути. 10. Исследуемые образцы растительного сырья не представляют опасности, так как накапливают до 1% Cs-137 и 0,15-0,30% Sr-90 от допустимого нормативной документацией уровня. 142 ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ Несмотря на успехи химии, предоставившей медицине много новых эффективных лекарств, использование средств из лекарственных растений приобретает все большие масштабы. Основываясь на результатах проведенного фитохимического анализа и учитывая литературные данные о биологической активности идентифицированных групп веществ, провели фармакологический скрининг некоторых субстанций и изучение безопасности применения сухого экстракта полученного из корневищ и корней любистка лекарственного, включающее определение острой токсичности и нейротоксичности в эксперименте на животных. 7.1 Изучение «острой» токсичности В ходе опыта отмечено, что каких-либо изменений в общем состоянии животных, особенности их поведения, интенсивности и характера двигательной активности, тонуса скелетных мышц, потребления корма и воды, диуреза и дефекации не выявлено. Выживаемость животных в опытных группах составила 100%. Введение дозы 9000 мг/кг не привело к гибели ни одного животного в течение двух недель, LD50 > 5000 мг/кг, т.е. сухой экстракт по классификации токсичности К.К. Сидорова относится к 5 классу соединений – практически нетоксичным (Таблица 42). Таблица 42 – Результаты определения «острой» токсичности сухого экстракта, n=6 Доза мг/кг 500 1500 3000 4500 6500 9000 Выжило 6 6 6 6 6 6 Погибло 0 0 0 0 0 0 Z 0 0 0 0 0 D 1000 1500 1500 2000 2500 D•Z 0 0 0 0 0 Анализируя полученные результаты, следует отметить, что в группах животных, получавших исследуемый экстракт различными путями введения, показатели двигательной и эмоциональной активности имеют незначительные 143 отличия. Сравнивая аналогичные показатели с интактными животными, следует отметить, что в опытных группах происходит снижение двигательной горизонтальной активности на 19,35% в группе, получавшей экстракт per os, и на 31,61% в группе, получавшей экстракт внутрибрюшинно. О повышении тревожности свидетельствует снижение количества стоек на 42,6% и 57,14% в указанных группах животных соответственно, повышение актов дефекации в 5 раз в группе 1, получавшей экстракт перорально и в 6,5 раз в группе 2, получавшей экстракт внутрибрюшинно. Избегание центра животными опытных групп также указывает на повышение тревожности (Таблица 43). Таблица 43 – Оценка двигательной и эмоциональной активности мышей в тесте «Открытое поле» через 24 часа после введения максимальной дозы экстракта любистка лекарственного Интактные per оs 5000 мг/кг (группа 1) Внутрибрюшинно 3000 мг/кг (группа 2) 31,0±13,93 25,0±21,26 21,2±8,00 1,4±1,14 0,8±0,84 0,6±0,89 11,6±8,02 7,6±8,35 8,0±6,36 Груммииг 2,4±4,34 1,8±1,48 2,6±2,07 Диурез 0,4±0,55 0,8±0,84 0±0 Дефекация 0,4±0,55 2±1,87 2,6±2,07 Группа Критерий Пересеченный квадрат Пересечённый центр Стойка Примечание: * - достоверно к интактным животным Таким образом, проведенные исследования по изучению безопасности применения сухого экстракта любистка лекарственного позволяют отнести исследуемый экстракт к 5 классу токсичности веществ по классификации К.К. Сидорова [10]. Однако следует отметить, что применение экстракта повышает тревожность животных и снижает двигательную активность по сравнению с интактными животными [128]. 144 7.2 Изучение отхаркивающей активности Отхаркивающее действие гранул с углеводными фракциями Levisticum officinale изучалось в сравнении с официнальным препаратом «Мукалтин». Для этого была использована методика in vitro (раздел 2.8.2). Изучаемые гранулы и препарат сравнения содержали действующие вещества (водорастворимые полисахариды – ВРПС, пектиновые вещества – ПВ и гемецеллюлозы – ГЦ) в одинаковых дозах 0,05 г [18]. Полученные результаты представлены в таблице 44. Таблица 44 – Влияние углеводных фракций любистка лекарственного на активность ворсинок трахеи крыс Время, мин ВРПС ПВ ГЦ Мукалтин 9,0±0,3 10,2±0,2 14,2±0,4 11,8±0,5 Примечание: достоверно по отношению к контролю при P<0,05; в таблице указаны средние значения Полученные данные доказывают, что углеводные фракции любистка лекарственного обладают отхаркивающим действием, выраженным в разной степени. Наибольшей активностью обладают водорастворимые полисахариды. Наибольший эффект выявлен у ВРПС выявили, двигательная активность мерцательного эпителия увеличивалась на 23,47% , чем у препарата сравнения «Мукалтин» (Таблица 44) [71]. 7.3 Изучение антибактериальной активности Изучение антибактериальной активности водного и спиртового извлечений, а также эфирного масла корневищ и корней любистка лекарственного определяли по отношению к 10 тест-культурам методом диффузии в агар (способ «колодцев») (раздел 2.8.3). Изучение антибактериального действия выявило преимущественно активность эфирного масла и спиртового извлечения. Максимальную активность проявляло эфирное масло. Результаты исследований представлены в таблице 45. 145 Таблица 45 – Уровень антибактериального действия исследуемых субстанций Объект Корневища и корни любистка лекарственного 1 + — Диаметр зоны задержки роста тест-культур микроорганизмов, мм 2 3 4 5 6 7 8 9 + + ± + + — ± ± — + ± + — — — ± 10 ± — — — ± Извлечения водное спиртовое эфирное масло — ± — — — — ± Примечание: «—» – отсутствие роста (>12 мм); «±» – слабый рост (~10-12 мм); «+» – такой же рост как в контроле; используемые тест-культуры: 1. Staphylococcus aureus (209); 2. Staphylococcus aureus (Макаров); 3. Staphylococcus aureus (Type); 4. Staphylococcus epidermides Wood-46; 5. Escherichia coli 675; 6. Salmonella typhimurium; 7. Shigella flexneri 266; 8. Shigella sonnei; 9. Bacillus subtilis L2; 10. Bacillus antracoides-96. Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о наличии у подземных органов любистка лекарственного широкого спектра антибактериальной активности, что дает основание для его дальнейшего углубленного изучения в качестве потенциального противомикробного средства для лечения заболеваний кожи и слизистых, вызванных патогенными стафилококками, энтеробактериями и бациллами [72]. 7.4 Изучение спазмолитической активности Экстрагентом при получении сухого экстракта служил спирт этиловый 70% в соотношении 1 : 2. Извлечение получали путём реперколяции (повторная или многократная перколяция). Сущность метода заключалась в том, что сырье делили на части и каждую последующую его порцию экстрагировали вытяжкой, полученной из предыдущей. Сухой экстракт корневищ и корней любистка лекарственного представлял собой коричневый гигроскопичный порошок со специфическим приятным запахом, вяжущего вкуса. Опыты проводили с использованием методики указанной в разделе 2.8.4. Результаты показали, что в группе биологического контроля объём мочи составил 2,12±0,55 мл. В группе сравнения объем мочи был достоверно выше, чем в группе 146 биологического контроля, и составил 9,4±1,36 мл (P<0,01). В группе, получавшей экстракт любистка лекарственного, объём мочи превысил значения группы биологического контроля в среднем в 3 раза и составил 6,37±1,16 (P<0,01), однако относительно группы сравнения различия недостоверны (Рисунок 38). обьём мочи, мл 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Биологический контроль Группа сравнения Опыт Рисунок 38 – Влияние экстракта любистка лекарственного на диурез Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о выраженной диуретической активности экстракта любистка лекарственного. При этом его мочегонная активность не уступает гипохлортиазиду [59]. 7.5 Изучение диуретической активности Сырье любистка лекарственного экстрагировали 70% спиртом этиловым в соотношении 1:10. Полученное извлечение сгущали и сушили в сушильном шкафу при температуре не выше 600 С до сухого остатка. Из сухого остатка готовили раствор с водой очищенной, используемый в дальнейшем для определения спазмолитической активности исследуемого объекта по методике указанной в разделе 2.8.5. Проведено две серии опытов. В первой серии изучали влияние экстракта любистка лекарственного на тонус гладкой мускулатуры интактного кишечника. 147 Во второй серии – влияние экстракта на тонус гладкой мускулатуры кишечника в условиях ацетилхолинового спазма. Ацетилхолин использовался в разведении 1:2000000, а конечная концентрация экстракта в инкубируемой среде составила 0,5%. Оценку тонуса производили в условных единицах, принимая за 0 и за 100 пределы чувствительности измерительного прибора. Средний исходный тонус интактного кишечника составил 60,3±0,73 усл. ед. в условиях эксперимента (Рисунок 39). Рисунок 39 – Влияние экстракта любистка на тонус тонкого кишечника Результаты опыта показали, что при введении экстракта корневищ и корней любистка лекарственного тонус тонкого кишечника достиг 25,0±1,39 усл. ед. что соответствует снижению тонуса в среднем на 90,84% (P<0,001). С целью предположения возможного механизма действия изучаемого экстракта, спазмолитическая активность была изучена на фоне ацетилхолинового спазма (вторая серия опытов). Исходный тонус в условиях данного эксперимента составил 57,7±0,30 усл. ед. (Рисунок 40). При введении ацетилхолина в инкубируемый раствор, тонус гладкой мускулатуры достиг максимальных значений (95-100 усл. ед.). При последующем введении экстракта любистка лекарственного тонус спазмированного кишечника 148 достиг 34,3±1,78 усл. ед., что соответствует снижению тонуса в среднем на 40,35% относительно исходного тонического уровня (P<0,001). Рисунок 40 – Влияние экстракта любистка лекарственного на тонус тонкого кишечника при ацетилхолиновом спазме: 1 – время введения ацетилхолина, 2 – экстракта любистка лекарственного Возможный механизм действия связан с опосредованным влиянием компонентов экстракта на М-холинорецепторы, либо миотропный характер спазмолитической активности. Полученные нами результаты позволяют рассматривать любисток лекарственный как растение, обладающее спазмолитической активностью [60]. 7.6 Изучение желчегонной активности Сухие экстракты, получали из подземных органов любистка лекарственного извлечением водой очищенной и 70% спиртом этиловым в соответствии с требованиями ГФ XI. В качестве препарата сравнения использовались водные и спиртовые извлечения из кукурузных столбиков с рыльцами. За час до наркотизации животным per os зондом вводили исследуемые объекты в 1 мл водного раствора в дозе 150 мг/кг. Вторую такую же дозу вводили шприцем непосредственно во вре- 149 мя операции в тощую кишку, обеспечивая всасывание субстанций in siti, ниже сформированного желчного резервуара. Животных разделили на 6 групп по 6 крыс в каждой: 1 – контрольная группа «В» – вода (50 мг/кг); 2 – опытная группа «ЛЛ-В» – водное извлечение любистка лекарственного; 3 – опытная группа «ЛЛ-С» – спиртовое извлечение любистка лекарственного; 4 – группа сравнения «КР-Т80» – водное извлечение кукурузных рылец; 5 – группа сравнения «КР-Т80» – спиртовое извлечение кукурузных рылец. Полученные результаты представлены в таблице 46. Таблица 46 – Влияние извлечений из корневищ и корней любистка лекарственного на желчевыделение у крыс (n=5) № группы 1 2 3 4 5 Общее кол-во желчи за 3 ч., мг/100 г (М±m) Желчные кислоты желчи, мг% (М±m) Холестерин желчи, мг%(М±m) Холятохолестериновый коэфициент 542,6±79,5 856,1±132,7 Р1˂0,01 1348,5±246,9 Р1˂0,001 952,7±125,3 Р1˂0,001 Р2˃0,2 524,7±123,0 Р1˃0,5 Р3˂0,001 156,0±20,0 165,7±24,6 Р1˃0,2 315,4±22,6 Р1˂0,001 221,3±4,9 Р1˂0,001 Р2˂0,01 460,6±1,5 Р1˂0,001 Р3˂0,001 17,5±0,53 4,3±0,7 Р1˂0,001 25,8±2,0 Р1˂0,001 3,7±0,2 Р1˂0,001 Р2˃0,05 1,1±0,3 Р1˂0,001 Р3˂0,001 8,9 38,5 12,2 59,8 418,7 Примечание: n – количество опытов, Р1 – вероятность различия к контролю, Р2 – вероятность различия к водному извлечению любистка лекарственного, Р3 – вероятность различия к спиртовому извлечения любистка лекарственного Однократное введение водного извлечения из сырья любистка лекарственного вызвало усиление желчеотделения на 57,8% с повышением содержания в желчи желчных кислот и снижением холестерина, что повлекло резкое увеличение холатохолестеринового коэффициента. Однако больший рост желчеотделения наблюдался при введении спиртового извлечения (на 82,2%), при этом также происходили рост содержания в желчи желчных кислот (на 83%) и уменьшения холе- 150 стерина (на 20,4%), но увеличение холатохолестеринового коэффициента было менее значительным (Таблица 46). Следует подчеркнуть, что спиртовое извлечение из корневищ и корней любистка лекарственного по своей желчегонной активности в 2,5 раза превосходило воздействие препарата сравнения (спиртовое извлечение кукурузных рылец), тогда как водное извлечение уступало действию водного извлечения кукурузных рылец. Таким образом, проведенные эксперименты на здоровых белых крысах показали отчетливое желчегонное действие извлечений из корневищ и корней любистка лекарственного, при этом спиртовое извлечение существенно по своей активности превосходит водное и препарат сравнения из кукурузных столбиков с рыльцами [70]. 151 ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 7 1. Проведенные исследования по изучению безопасности применения сухого экстракта любистка лекарственного позволяют отнести исследуемый экстракт к 5 классу токсичности веществ по классификации К.К. Сидорова. Однако следует отметить, что применение экстракта повышает тревожность животных и снижает двигательную активность по сравнению с интактными животными. 2. Полученные данные по изучению отхаркивающей активности доказывают, что углеводные фракции любистка лекарственного обладают отхаркивающим действием, выраженным в разной степени. Наибольшей активностью обладают водорастворимые полисахариды, при этом двигательная активность мерцательного эпителия увеличивалась на 23,47% , по-сравнению с препаратом сравнения «Мукалтин». 3. Изучение антибактериального действия выявило преимущественно активность эфирного масла и водного извлечения из корневищ и корней любистка лекарственного. Максимальную активность проявляло эфирное масло. 4. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о выраженной диуретической активности экстракта любистка лекарственного. При этом его мочегонная активность не уступает гипохлортиазиду. 5. Результаты опыта показали, что при введении экстракта корневищ и корней любистка лекарственного тонус тонкого кишечника достиг 25,0±1,39 усл. ед. что соответствует снижению тонуса в среднем на 90,84% (P<0,001). Полученные результаты позволяют рассматривать любисток лекарственный как растение, обладающее спазмолитической активностью. 6. Однократное введение спиртового извлечения любистка лекарственного привело к достоверному увеличению желчи на 57,8%. 152 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В рамках настоящей работы проведены интродукционные, морфологоанатомические, фитохимические исследования, разработаны нормы качества сырья корневищ и корней любистка лекарственного (Levisticum officinale) и проведен фармакологический скрининг отдельных фитосубстанций. Основные результаты диссертационного исследования отражены в следующих выводах: 1. Проведены интродукционные исследования по выращиванию любистка лекарственного на территории Ставропольского края (КМВ). Определена лабораторная и полевая всхожесть семян в условиях различных режимов стратификации, установлены оптимальные сроки посева в открытый грунт, урожайность семян в условиях культуры (до 16 ц/га), урожайность надземной части (до 200 ц/га), подземных органов (до 250 ц/га). На основании оценки среднего выхода воздушно-сухого сырья для травы (12,85%) и корневищ и корней (32,75%), а также ориентировочного выхода кумаринов из подземных органов любистка лекарственного (от 2,65 до 3,83 кг/га) и эфирного масла (4,29-7,21 кг/га.) экономически обоснован вид сырья – корневища и корни. 2. Установлены морфолого-анатомические признаки цельных, измельченных и в виде порошка корневищ и корней любистка лекарственного позволяющие подтвердить подлинность и включить их в разделы фармакопейной статьи «Внешние признаки» и «Микроскопия». С помощью люминесцентной микроскопии установлено, что кумарины в корнях любистка лекарственного локализуются в содержимом секреторных каналов. 3. Исследован качественный состав любистка лекарственного, выявлено наличие углеводных производных, дубильных веществ, флавоноидов, кумаринов, фенолкарбоновых, органических и амино- кислот, сапонинов и антрагликозидов. 4. Установлено количественное содержание полисахаридов (22,2-24,1%). Выделены различные углеводные фракции: растворимые в спирте этиловом (0,45%), воде (4,70%), растворе аммония оксалата (6,0%) и растворах щелочей 153 (12,0%). Методом ГЖХ впервые установлен качественный и количественный моносахаридный состав. Определены физико-химические свойства пектинов: рН водных растворов, содержание свободных и этерифицированных карбоксильных групп, содержание полигалактуроновой кислоты в сырье составило во фракции ВРПС – 32,5%, ПВ – 58,8% и ГЦ – 20,1%. 5. Содержание эфирного масла в различных образцах сырья составляло от 1,2 до 2,4%. Методом газовой хромато-масс-спектрометрии в эфирном масле корневищ и корней любистка лекарственного идентифицировали 17 компонентов, что составляет 97,67% от всех обнаруженных. Доминирующими компонентами являются бициклические монотерпеновые углеводороды: линалоол (42,88%) и линалил ацетат (36,20%). 6. Методами БХ, ТСХ и ВЭЖХ в исследуемом сырье идентифицированы фенольные соединения: фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды и кумарины. В индивидуальном виде выделены 14 соединений, среди которых 6 производных фенолкарбоновых кислот: эллаговая, галловая, кофейная, хлорогеновая, феруловая и цикориевая; и 8 кумаринов: императорин, бергаптен, псорален, оксипейцеданин, остол, ангелицин, умбелиферон, кумарин, структура которых подтверждена методами УФ-, ИК- спектрометрии, физико-химическими характеристиками. 7. Изучен качественный и количественный состав свободных и связанных аминокислот, представленных 15 соединениями, 9 из которых являются незаменимыми с суммарным содержанием 54,1% аминокислот. 8. Экспериментально обоснованы оптимальные параметры экстракции биологически активных веществ: экстрагент – 70% спирт этиловый, время экстракции – 1 час, соотношение сырье : экстрагент 1:20 и степень измельченности сырья до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм. 9. Разработана спектрофотометрическая методика определения суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту, которое составило 0,48%. Также количество хлорогеновой кислоты также установлено методом 154 планарной хроматографии (ТСХ) с последующей денситометрической обработкой в корневищах и корнях любистка лекарственного, которое составило 0,37%. 10. Разработана спектрофотометрическая методика определения суммы кумаринов в пересчете на ангелицин (6,67%) с установлением валидационных характеристик по параметрам: линейность, прецизионность, правильность и специфичность. 11. Установлены товароведческие показатели сырья (цельного, измельченного, порошка) и определены их нормы для включения в раздел фармакопейной статьи «Числовые показатели». 12. Проведены фармакологические скрининговые исследования различных фитосубстанций из подземных органов любистка лекарственного, в результате которых выявлены антибактериальное, спазмолитическое, желчегонное, отхаркивающее и диуретическое действия. *** Таким образом, в ходе проведенных исследований расширены знания о химическом составе, экспериментально обоснованы нормы качества для разработки фармакопейной статьи «Любистка лекарственного корневища и корни» и инструкции по сбору и сушке, что открывает возможность для их внедрения в научную медицину и фармацевтическую промышленность. Полученные данные могут служить первым экспериментальным доклиническим обоснованием перспективности использования исследованных субстанций в качестве лечебнопрофилактических средств и внедрения новых отечественных фитопрепаратов. 155 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Авдеева, Е.В. Лекарственные растения, содержащие фенилпропаноиды, как источник получения гепатопротекторных и иммуномодулирующих препаратов: дис. … д-ра фармац. наук: 15.00.02 / Авдеева Е.В. – Пятигорск, 2007. – 288 с. 2. Авраменко, Л.Г. Изучение кумаринов дудников скального и низбегающего и взаимосвязи между строением и спазмолитической активностью: автореф. дис. … канд. фармац. наук: 792 / Л.Г. Авраменко. – М., 1971. – 28 с. 3. Анаболитическая, антиоксидантная, гепатозащитная, противовоспалительная активности некоторых природных кумаринов и хромонов / Комиссаренко Н.Ф. [и др.] // Раст. ресурсы. – 1993. – Вып. 3. – С. 15-21. 4. Антропогенные воздействия на лекарственные растения / С.А. Листов [и др.] – М.: МЗ СССР, 1990. – 106 с. 5. Бандюкова, В.А. Качественный анализ флавоноидов в растительном материале при помощи хроматографии на бумаге / В.А. Бандюкова, А.А. Шинкаренко. – Пятигорск, 1972. – 24 с. 6. Бандюкова, В.А. Методы исследования природных флавоноидов / В.А. Бандюкова. – Пятигорск: Бальнеологич. ин-т, 1977. – 72 с. 7. Бандюкова, В.А. Тонкослойная хроматография флавоноидов: методические рекомендации / В.А. Бандюкова, А.А. Шинкаренко. – Пятигорск, 1973. – 16 с. 8. Бандюкова, В.А. Фенолокислоты растений, их эфиры и гликозиды / В.А. Бандюкова // Химия природ. соединений. – 1983. – № 3. – С.263-272. 9. Баширова, Р.М. Растения рода дягиль: химический состав и фармакологические свойства / Р.М. Баширова, А.Ю. Касьянова, И.В. Галяутдинов // Фармация. – 2004. – № 4. – С. 46-48. 10. Березовская, И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения / И.В. Березовская // Хим.-фармац. журн. – 2003. – Т. 37, № 3. – С. 32-34. 11. Биологическая активность комплекса водорастворимых полисахаридов из надземной части гибискуса тройчатого / Т.А. Лысенко [и др.] // Междунар. журн. эксперим. образования. – 2012. – № 12. – С. 103-104. 156 12. Бузина, Г.В. Титрометрический метод количественной и качественной характеристики пектиновых веществ / Г.В. Бузина, О.Ф. Иванова, Л.Б. Сосновский // Хлебопекарная и кондитерская пром-сть. – 1965. – № 4. – С. 15-18. 13. Вайнагий, И. В. О методике изучения семенной продуктивности / И. В. Вайнагий // Бот. журн. – 1974. – Т. 59, № 6. – С. 826-832. 14. Вайс, Р.Ф. Фитотерапия. Руководство: пер. с нем. / Р.Ф. Вайс, Ф. Финтельманн. – М.: Медицина, 2004. – 552 с. 15. Валентинов, Б.Г. Сырье традиционной китайской медицины. Rhizoma Chuanxiong – корневище любистока сычуаньского / Б.Г. Валентинов, Э.М. Наумова, М.М. Олейникова // Вестник новых медицинских технологий . – 2005 – Т. 12, № 3-4. – С. 97-100. 16. Войткевич, С.А. Эфирные масла для парфюмерии и ароматерапии / С.А. Войткевич. – М.: Пищевая пром-сть, 2001. – 283 с. 17. Вульф, Е.В. Мировые ресурсы полезных растений (Пищевые, кормовые, технические, лекарственные и др.): справочник / Е.В. Вульф, О.Ф. Малеева. – Л.: Наука, 1969. – 569 c. 18. Гацура, В.В. Методы первичного фармакологического исследования биологически активных веществ / В.В. Гацура. – М.: Иностр. лит., 1974. – С. 103105. 19. Георгиевский, В.П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В.П. Георгиевский, Н.Ф. Комисаренко, С.Е. Дмитрук. – Новосибирск: Наука, 1990. – 333 с. 20. Годин, А.М. Статистика / А.М. Годин. – 4-е изд., перераб. и доп. – М.: Дашков и К°, 2006. – 492 с. 21. Горяев, М.И. Методы исследования эфирных масел / М.И. Горяев, И. Плива. – Алма-Ата: АН КазССР, 1962. – 752 с. 22. ГОСТ 30178-96. Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов. – Введ. 1998-01-01. – М.: Стандартинформ, 2010. – 10 с. 23. ГОСТ Р 53434-2009. Принципы надлежащей лабораторной практики. – Введ. 2010-03-01. – М.: Стандартинформ, 2010. – 16 с. 24. Государственная фармакопея Российской Федерации. – 12-е изд. – М.: Науч. центр экспертизы средств мед. применения, 2007. – Ч. 1. – 704 с. 157 25. Государственная фармакопея Российской Федерации. – 12-е изд. – М.: Науч. центр экспертизы средств мед. применения, 2010. – Ч. 2. – 678 с. 26. Государственная фармакопея СССР: в 2 вып. – 11-е изд. – М.: Медицина, 1987-1989. – 2 вып. 27. Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://grls.rosminzdrav.ru/. – Загл. с экрана. 28. Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию. – М., 2013. – Т. 1 Сорта растений. – С. 133. 29. Гунар, О.В. Риск получения ложных микробиологических результатов при контроле качества лекарственных средств / О.В. Гунар // Фармация. – 2005. – № 2. – С. 29-31. 30. Долгова, А.А. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии / А.А. Долгова, Е.Я. Ладынина. – М.: Медицина, 1977. – 288 с. 31. Дополнения и изменения № 5 к санитарно-эпидемическим правилам СанПин 2.3.3 1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» СанПин 2.3.2.2227-07. – М., 2007. – 261 с. 32. Дроздова, И.Л. Исследование растительных источников полисахаридов и фенольных соединений и перспективы их практического использования в фармации: дис. ... д-ра фармац. наук: 15.00.02 / Дроздова И. Л. – Пятигорск, 2006. –389 c. 33. Жбанков, Р.Г. Инфракрасные спектры и структура углеводов / Р.Г. Жбанков. – Минск: Наука и техника, 1972. – 456 с. 34. Зависимость колориметрической реакции галактуроновой кислоты и нейтральных моносахаридов с карбазолом от условий ее проведения / М.П. Филиппов [и др.] // Изв. АН МССР: Сер. биол. и хим. наук. – 1976. – № 1. – С. 75-86. 35. Зайцев, Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике / Г.Н. Зайцев. – М.: Наука, 1984. – 424 с. 36. Захаров, В.П. Лекарственные вещества из растений и способы их производства / В.П. Захаров, Н.И. Либизов, Х.А. Асланов. – Ташкент: Фан, 1980. – 232 с. 37. Изучение фенольного состава подземных органов сабельника болотного / О.Л. Жукова // Вестн. моск. ун-та. Сер. 2. Химия. – 2006. – Т.47, № 5. – С. 342-345. 158 38. Изучение химического состава некоторых пищевых растений, культивируемых в Ставропольском крае / В.А. Челомбитько [и др.] // Вопросы биол., мед. и фармац. химии. – 2012. – № 4. – С. 44-47. 39. Интродукция лекарственных, ароматических и технических растений / Г.М. Балабас [и др.]. – М., Л.: Наука, 1965. – С. 375-376. 40. Интродукция растений природной флоры СССР: справочник. – М.: Наука, 1979. – 431 с. 41. Исследование химического состава корней и корневищ любистока лекарственного / Л.В. Наймушина [и др.] // Вестн. КрасГАУ, 2010. – № 4. – С. 283287. 42. Касьянова, А.Ю. Дягиль лекарственный (Archangelica officinalis Hoffm.) в Предуралье: перспективы интродукции, пути повышения биологической продуктивности и изучение биохимического состава: дис. … канд. биол. наук: 06.01.13 / А.Ю. Касьянова. – М., 2005. – 139 с. 43. Косман, В.М. Информационное обеспечение для идентификации фенольных соединений в обращено-фазовой ВЭЖХ. Флавоны, флавонолы и их гликозиды / В.М. Косман, И.Г. Зинкевич // Раст. ресурсы. – 1997. – Т. 33, вып. 2. – С. 14-26. 44. Косман, В.М. Информационное обеспечение для идентификации фенольных соединений растительного происхождения. Кумарины и фурокумарины / В.М. Косман, И.Г. Зинкевич, Н.Ф. Комиссаренко // Раст. ресурсы. – 1997. – Т. 33, вып. 3. – С. 32-36. 45. Кочетков, Н.К. Химия биологически активных природных соединений / Н.И. Кочетков. – М.: Химия, 1970. – 378 с. 46. Кузнецова, Г.А. Природные кумарины и фурокумарины / Г.А. Кузнецова. – Л.: Наука, 1967. – 248 с. 47. Куркин, В.А. Фенилпропаноиды лекарственных растений. Распространение, классификация, структурный анализ, биологическая активность / В.А. Куркин // Химия природ. соединений. – 2003. – № 2. – С. 87-110. 48. Левицкий, А.П. Хлорогеновая кислота: биохимия и физиология / А.П. Левицкий, Е.К. Вертикова, И.А. Селиванская // Мікробіологія і біотехнологія. – 2010. – № 2. – С. 6-20. 49. Лечебные свойства пищевых растений / под общ. ред. Т.Л. Киселевой. – М.: ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2007. – С. 290-293. 159 50. Литвинчук, М.Д. Точный и быстрый метод оценки активности желчегонных средств на крысах / М.Д. Литвинчук, З.И. Новосилец // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 1980. – № 6. – С. 750-752. 51. Любисток полезные свойства и применение [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.vsluhblog.ru/2012/06/blog-post_7060.html . – Загл. с экрана. 52. Методика исследований при интродукции лекарственных растений / Н.И. Майсурадзе [и др.] // Лекарственное растениеводство: Обзорная информация. – М., 1984. – № 3. – 32 с. 53. Методические рекомендации по расширению номенклатуры отечественных официнальных лекарственных растений / под общ. ред. Т.Л. Киселевой. – М.: Изд-во Проф. ассоциации натуротерапевтов, 2009. – 88 с. 54. Методы контроля качества эфирных масел / Н.В. Сегуру [и др.] // Фармация. – 2005. – № 3. – С. 3-5. 55. Мирошниченко, В.И. Исследование холятохолестериновой функции печени при вирусном гепатите и холелитиазе новым методом фотометрического анализа: дис. … канд. мед. наук / В.И. Мирошниченко. – Запорожье, 1978. – 128 с. 56. Молчан, Н.В. Определение эфирного масла в лекарственном растительном сырье / Н.В. Молчан, И.П. Рудакова, И.А. Самылина // Фармация. – 2009. – № 5. – С. 3-4. 57. О возможности использования лекарственных растений для лечения и профилактики микроэлементозов и патологических состояний / М.Я. Ловкова [и др.] // Микроэлементы в медицине. – 2005. – Т. 6, № 4.–С.3-9. 58. Овчинникова, С.Я. Аминокислотный и элементный состав подземных органов любистока лекарственного / С.Я. Овчинникова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2012. – Вып. 67. – С. 93-94. 59. Овчинникова, С.Я. Изучение диуретической активности экстракта корневищ и корней любистока лекарственного / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская, М.А. Оганова // Научные ведомости Белгородского гос. университета. Серия Медицина. Фармация. – 2012. – № 10 (129). – С. 158-159. 60. Овчинникова, С.Я. Изучение спазмолитической активности экстракта корневищ и корней любистока лекарственного / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орлов- 160 ская // Научные ведомости Белгородского гос. университета. Серия Медицина. Фармация. – 2012 . – № 4 (123). – С. 275-277. 61. Овчинникова, С.Я. Изучение углеводов Levisticum officinale / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская, М.Х. Маликова // Химия природ. соединений. – № 5. – 2013. – С. 788-798. 62. Овчинникова, С.Я. Изучение фенольных соединений корневищ и корней любистка лекарственного методом ВЭЖХ / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская // Междунар. журн. приклад. и фундамент. исследований. – 2014. – № 4. – С. 216-217. 63. Овчинникова, С.Я. Изучение фенольных соединений подземных органов любистока лекарственного / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск: Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, 2013. – Вып. 68. – С. 72-74. 64. Овчинникова, С.Я. Количественное определение суммы фенольных соединений в корневищах и корнях любистка лекарственного / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская // Междунар. журн. приклад. и фундамент. исследований. – 2014. – № ….. – С. 65. Овчинникова, С.Я. Количественное определение кумаринов в корневищах и корнях любистка лекарственного / С.Я. Овчинникова, Л.Б. Губанова, Т.В. Орловская // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 1; URL: www.science-education.ru/115-11543. 66. Овчинникова, С.Я. Морфолого-анатомическое изучение корневищ и корней любистока лекарственного / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская // Фармация. – 2013. – № 2. – С. 14-17. 67. Овчинникова, С.Я. Некоторые результаты фитохимического исследования любистока лекарственного / С.Я. Овчинникова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2012. – Вып. 67. – С. 94-95. 68. Овчинникова, С.Я. Определение хлорогеновой кислоты методом планарной хроматографии / С.Я.Овчинникова, Т.Д. Мезенова, Т.В. Орловская // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 6; URL: www.science-education.ru/113-11408. 69. Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье / А.А. Сорокина [и др.] // Фармация. – 2010. – № 3. – С. 3-4. 161 70. Орловская, Т.В. Изучение желчегонной активности сухих экстрактов, полученных из корневищ и корней любистока лекарственного / Т.В. Орловская, С.Я. Овчинникова // Междунар. журн. приклад. и фундамент. исследований. – 2014. – № 1. – С. 118-119. 71. Орловская, Т.В. Изучение отхаркивающей активности углеводов корневищ и корней любистка лекарственного / Т.В. Орловская, С.Я. Овчинникова // Междунар. журн. приклад. и фундамент. исследований. – 2014. – № 1. – С. 9495. 72. Орловская, Т.В. Определение антибактериальной активности субстанций, полученных из корневищ с корнями любистка лекарственного / Т.В. Орловская, С.Я. Овчинникова // Междунар. журн. приклад. и фундамент. исследований. – 2013. – № 10. – С. 474-475. 73. Орловская, Т.В. Опыт выращивания любистка лекарственного в условиях Ставропольского края / Т.В. Орловская, С.Я. Овчинникова // Междунар. журн. приклад. и фундамент. исследований. – 2014. – № 1. – С. 104-105. 74. Осипова, Г.С. Огород. Работа на участке / Г.С. Осипова. – Изд. 4-е. – СПб.: БХВ-Петербург, 2011. – 255 с. 75. Официальный сайт Всемирной Организации Здравоохранения. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.who.int. – Загл. с экрана. 76. ОФС 42-0011-03 Определение содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье. Стронций-90, цезий-137. Отбор проб, анализ, оценка результатов. – М., 2003. – 27 с. 77. ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб» // Фармация. – 2003. – № 6. – С. 3-8. 78. Пат. 2403566 Российская Федерация, С2 Способ количественного определения восстанавливающих сахаров / Н.Ш. Кайшева, А.Ш. Кайшев, Т.В. Орловская (РФ). – № 2008149186/21; заявл. 12.12.08; опубл. 10.11.10, Бюл. № 31. – 14 с. 79. Перельсон, М.Е. Спектры и строение кумаринов, хромонов и ксантонов / М.Е. Перельсон, Ю.Н. Шейнкер, А.А. Савина. – М.: Медицина, 1975. – 232 с. 80. Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств / Н.А. Криштанова [и др.] // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. – 2005. – № 1. – С. 212-221. 81. Пилат, Т.Л. Биологически активные добавки к пище (теория, производство, применение) / Т.Л. Пилат, А.А. Иванов. – М.: Аввалон, 2002. – С. 313. 162 82. Пименов, М.Г. Перечень растений – источников кумариновых соединений / М.Г. Пименов. – Л.: Наука, 1971. – 202 с. 83. Попова, Н.В. Лекарственные растения мировой флоры / Н.В. Попова, В.И. Литвиненко. – Харьков: СПДФЛ Мосякин В.Н., 2008. – 510 с. 84. Постановление Правительства РФ от 08.08.2009 г. № 654 (ред. от 04.09.2012) «О совершенствовании государственного регулирования цен на лекарственные препараты, включенные в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов» [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_135243/. – Загл. с экрана. 85. Постановление региональной службы по тарифам Ростовской области от 25.02.2010 г. № 2/1 «Об утверждении предельных оптовых и предельных розничных надбавок к ценам на лекарственные средства и изделия медицинского назначения» [Электронный ресурс]. – Режим доступа:. http://www.rlsnet.ru/docarc/61.pdf. – Загл. с экрана. 86. Потанина, О.Г. Оценка доброкачественности лекарственного растительного сырья с учетом диагностически значимых признаков / О.Г. Потанина, И.А. Самылина // Фармация. – 2003. – № 4. – С. 12-14. 87. Потанина, О.Г. Совершенствование стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм из него на основе микроскопического метода исследования: дис. … д-ра фармац. наук / Потанина О.Г. – М., 2003. – Т. 1. – 432 с. 88. Потанина, О.Г. Совершенствование стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм из него на основе микроскопического метода исследования: дис. … д-ра фармац. наук / О.Г. Потанина. – М., 2003. – Т. 2. – 217 с. 89. Почему растения лечат / М.Я. Ловкова [и др.]. – М.: Наука, 1989. – 256 с. 90. Приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.03 «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» 91. Проблемы нормирования тяжелых металлов в лекарственном растительном сырье / О.И. Терешкина [и др.] // Фармация. – 2010. – № 2. – С. 7-11. 92. Пряности, специи, эфирные масла. Полная энциклопедия. – СПб.: ВЕСЬ, 2001. – С. 109-110. 93. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Rutaceae – Elaeagnaceae / отв. ред. П.Д. Соколов. – Л.: Наука, 1988. – 357 с. 163 94. Регистр лекарственных средств России [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.rlsnet.ru/. – Загл. с экрана. 95. Регистр лекарственных средств России [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.rlsnet.ru/. – Загл. с экрана. 96. Руководство по экспериментальному (доклиническому изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 2005. – 832 с. 97. Самылина, И.А. Пути использования лекарственного растительного сырья и его стандартизация / И.А. Самылина, И.А. Баландина // Фармация. – 2004. – № 2. – С. 39-41. 98. Самылина, И.А. Фармакогнозия. Атлас: учеб. пособие: в 3 т. / И.А. Самылина, О.Г. Аносова. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. – Т. 1. – 192 с. 99. СанПин 2.3.2 1078-01 «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов» от 14.11.2001/22.03.02. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.service-holod.ru/SanPiN2/SanPiN_2_3_2_1078_01.htm. – Загл. с экрана. 100. Сборник методических рекомендаций по стандартизации лекарственных средств / В.Л. Багирова [и др.]. – М.: Пеликан, 2006. – 392 с. 101. Серкеров, С. Инфракрасные спектры и строение сесквитерпеновых лактонов и кумаринов / С. Серкеров, А. Алескерова. – Баку, 2006. – 224 с. 102. Сернов, Л.Н. Элементы экспериментальной фармакологии / Л.Н. Сернов, В.В. Гацура. – М.: Медицина, 2000. – 352 с. 103. Скальный, А.В. Биоэлементы в медицине / А.В. Скальный, И.А. Рудаков. – М.: ОНИКС 21 век; Мир, 2004. – 276 с. 104. Скальный, А.В. Химические элементы в физиологии и экологии человека / А.В. Скальный. – М.: ОНИКС 21 век: Мир, 2004. – 216 с. 105. Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (Моносахариды) / Б.Н. Степаненко. – М.: Высш. шк., 1977. – 222 с. 106. Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (Полисахариды) / Б.Н. Степаненко. – М.: Высш. шк., 1978. – 256 с. 107. Тахтаджян, А.Л. Система магнолиофитов / А.Л. Тахтаджян. – Л.: Наука, 1987. – 439 с. 164 108. Терентьева, Е.И. Молекулярная эволюция растений семейства зонтичных (Umbelliferae) по результатам секвенирования спейсерных участков рДНК: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.00.03 / Е.И. Терентьева. – М., 1999. – 24 с. 109. Ткачев, А.В. Библиотека хромато-масс-спектрометрических данных летучих веществ растительного происхождения / А.В. Ткачев. – Новосибирск: Новосибирский ин-т орган. химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, 2006. 110. Тутельян, В.А. Биологически активные вещества растительного происхождения. Фенольные кислоты: распространенность, пищевые источники, биодоступность / В.А. Тутельян, Н.В. Лашнева // Вопросы питания. – 2008. – Т. 77, №1. – С. 4-19. 111. Филиппов, М.П. Доступность гидроксильных групп пектиновых веществ для дейтерирования / М.П. Филиппов, М.С. Комисаренко // Химия природ. соединений. – 1987. – № 3. – 343-348. 112. Филиппов, М.П. ИК-спектроскопическое определение карбоксильных групп в пектиновых веществах / М.П. Филиппов // Журн. аналит. химии. – 1973. – Т. 28, вып. 5. – С. 30-31. 113. Филиппов, М.П. Инфракрасные спектры пектиновых веществ / М.П. Филиппов // Методы анализа пищевых продуктов (Проблемы аналитической химии). – М.: Наука, 1988. – Т. 8. – С. 198-216. 114. Филиппов, М.П. Природа связи в растительной ткани, строение и инфракрасные спектры как основа классификации пектиновых веществ: автореф. … дис. д-ра хим. наук / М.П. Филиппов. – Одесса, 1990. – 38 с. 115. Фоканов, А.М. Совершенствование метода определения всхожести семян / А.М. Фоканов // Селекция и семеноводство. – 1983. – № 1. – С. 39-42. 116. Фоканов, А.М. Урожайные свойства семян с разной всхожестью / А.М. Фоканов, Н.Ф. Лоскутов // Селекция и семеноводство. – 1980. –№ 7. – С. 37-40. 117. Хавезов, И. Атомно-адсорбционный анализ: пер. с болг. / И. Хавезов, Д. Палев; под ред. С.З. Яковлевой. – Л.: Химия, 1983. – 144 с. 118. Харченко, В.А. Достижения в селекции зеленных и пряно-вкусовых овощных культур / В.А. Харченко // Овощи России. – 2011. – № 4 (13). – С. 38-45. 119. Химия углеводов / Н.К. Кочетков [и др.]. – М.: Химия, 1967. – 672 с. 120. Хлорогеновая кислота плодов и листьев некоторых растений семейства Berberidaceae / В.И. Дейнека // Химия раст. сырья. – 2008. – № 1. – С. 57-61. 165 121. Хорошайлов, Н.Г. Энергия прорастания – важный показатель качества семян / Н.Г. Хорошайлов // Селекция и семеноводство. – 1977. – № 2. – С. 60-62. 122. Хренова, Д.Х. Изучение процесса экстракции при получении препарата растительного происхождения / Д.Х. Хренова, Т.Д. Даргаева, Л.И. Брутко // Технологические аспекты создания лекарственных форм. ВНИИ Фармации. – 1986. – Т. 24. – С. 85-90. 123. Хроматография на бумаге / под ред. И.М. Хайца, К. Мацека. – М.: Изд-во иностран. лит., 1962. – 851 с. 124. Черепанов, С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР) / С.К. Черепанов. – СПб.: Мир и семья, 1995. – 39с. 125. Черняева, Г.Н. Фенолкарбоновые кислоты и мономерные флаваны коры Larix sibirica Ledeb. / Г.Н. Черняева, Г.В. Пермякова // Раст. ресурсы. – 2000. – Вып. 3. – С. 47-51. 126. Шаполовалова, И.Е. Хлорогеновая кислота – антиоксидантный потенциал семян подсолнечника / И.Е. Шаповалова, З.П. Федякина [Электронный ресурс]. 2013. – Режим доступа: http://www.sworld.com.ua/index.php/ru/conference/the-content-ofconferences/archives-of-individual-conferences/june-2013. – Загл. с экрана. 127. Шемерянкина, Т.Б. Требования к стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов на его основе / Т.Б. Шемерянкина, Т.А. Сокольская, Т.Д. Даргаева // Вопр. биол., мед. и фармац. химии. – 2010. – № 3. – С. 9-12. 128. Шемонаева, М.В. Изучение безопасности применения сухого экстракта любистока лекарственного / М.В. Шемонаева, С.Я. Овчинникова, А.В. Сергиенко // Экология и здоровье: сб. науч. тр. – Ессентуки, 2010. – Вып. 14. – С. 123126. 129. Энциклопедия лекарственных растений. – М.: Ридерс Дайджест, 2004. – С. 79. 130. Analysis of headspace of root of Levisticum officinale / Chu Jian-qin [et al.] // Acta Botanica Sinica. – 1991. – Vol. 33, № 6. – Р. 486-488. 131. Antihyperglycemic and Antioxidant Properties of Caffeic Acid in db/db Mice / J.J. Un [et al.] // J. of Pharmacol, and Exper. Therapeutics. – 2006. – Vol. 318, № 2. – P. 476-483. 132. Antihypertensive effects and mechanisms of chlorogenic acids / Zhao Y. [et al.] // Hypertens Rec. – 2012. – Vol. 35, № 4. – Р. 370-374. 166 133. Antimycobacterial polyacetylenes from Levisticum officinale / A. Schinkovitz [et al.] // Phytother. Res. – 2008b. – Vol. 22. – P. 681-684. 134. Antimycobacterial polyynes of Devil’s Club (Oplopanax horridus), a North American native medicinal plant / M. Kobaisy [et al.] // J. Nat. Prod. – 1997. – Vol. 60. – P. 1210-1213. 135. Antimycobacterials from Lovage Root (Ligusticum officinale Koch) / J. D. Guzman [et al.] // Phytother. Res. – 2012. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: Published online in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com) DOI: 10.1002/ptr.4823. – Загл. с экрана. 136. Antioxidant effect of ferulic acid in isolated membranes and intact cells: synergistic interactions with alpha-tocopherol, beta-carotene, and ascorbic acid / S. Trombino [et al.] // J. Agric. Food. Chem. – 2004. Vol. 52, № 8. – P. 2411-2420. 137. Antiproliferative effect in rat vascular smooth muscle cells by osthole, isolated from Angelica pubescens / J.H. Guh [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 2002. – Vol. 298. – P. 191-197. 138. Anti-TB polyynes from the roots of Angelica sinensis / S. Deng [et al.] // Phytother. Res. – 2008. – Vol. 22. – P. 878-882. 139. Beck, J.J. Addition of methyl thioglycolate and benzylamine to (Z)-ligustilide, a bioactive unsaturated lactone constituent of several herbal medicines. An improved synthesis of (Z)-ligustilide / J.J. Beck, F.R. Stermitz // J. Nat. Prod. – 1995. – Vol. 58, № 7. – P. 1047-1055. 140. Beck, J.J. The structural diversity of phthalides from the Apiaceae. / J.J. Beck, SC. Chou // J. Nat. Prod. – 2007. – Vol. 70. – P. 891-900. 141. Bioactive metabolites from Sicilian marine fennel, Crithmum maritimum / F. Cunsolo [et al.] // J. Nat. Prod. – 1993. – Vol. 56. – P. 1598-1600. 142. Biologocal screening of 100 plant extracts for cosmetic use (1): inhibitory activities of tyrosinase and DOPA auto-oxidation / K.T. Lee [et al.] // International J. of cosmetic Science. – 1997. – № 19. – Р. 191-298. 143. Blank, I. Analysis of the seasoning-like flavour substances of a commercial Lovage extract (Levisticum officinale Koch.) / I. Blank, P. Schieberle // Flavour and Fragrance J. – 1993. – Vol. 8. – Р. 191-195. 144. Bound ferulic acid from bran is more bioavailable than the free compound in rat. / L. Rondini [et al.] // Аgric. Food. Chem. – 2004. – Vol. 52, № 13. – P. 43384343. 167 145. Brandt, K. Vegetables as Neutriceuticals – Falcarinol in carrots and other crops // K. Brandt, P. Christensen // Royal Society of Chemistry: Cambridge, UK. – 2000. – P. 386-391. 146. Braun, R. Beiträge zur Kenntnis des Liebstocköls Pharmazie. 1897. – Vol. 235, № 1-3. – P.1-19. / R. Braun // Archiv der 147. British Herbal Pharmacopoeia 1996. – London: Published by the British Herbal Med. association, 1996. – 212 p. 148. British Pharmacopoeia 2009 [Электронный ресурс]. – Режим доступа: ttp://www.pharmacopoeia.co.uk/2009/. – Загл. с экрана. 149. Bylaitė, E. Influence of harvesting time on the composition of volatile components in different anatomical parts of lovage (Levisticum officinale Koch.) / E. Bylaitė, P.R. Venskutonis, J.P. Roozen // J. Agric. Food Chem. – 1998. – Vol. 46. – P. 3735-3740. 150. Chemical composition of the essential oils of Levisticum officinale growing wild in Iran / M. Moradalhadeh [et al.] // Химия природ. соединений. – 2011. - № 6. – С. 876-877. 151. Cichy, M. Neue Inhaltsstoffe von Levisticum officinale Koch (Liebstockel) / M. Cichy, V. Wray, G. Hofle // Ann. Chem. – 1984. – P. 397-400. 152. Comparative Study of Roots of Angelica sinensisand Related Umbelliferous Drugs by Thin Layer Chromatography, High-Performance Liquid Chromatography, and Liquid Chromatography – Mass Spectrometry / Sibylle Zschocke [et al.] // Phytochem. Anal. – 1998. – Vol. 9. – P. 283-290. 153. Composition of the essential oil of Levisticum officinale W.D.J. Koch from some European countries / R. Ain [et al.] // J. Essential Oil Res. – 2008. – Vol. 20, № 4. – P. 318-322. 154. Composition of the volatiles of Ferulago carduchorum Boiss. et Hausskn. and Levisticum officinale Koch obtained by hydrodistillation and extraction / K. Samiee [et al.] // J. Essent. Oil Res. – 2006. – Vol. 18, №1. – P. 19-21. 155. Conformational analysis: a tool for the elucidation of the antioxidant properties of ferulic acid derivatives in membrane models / C. Anselmi [et al.] // J. Pharm. Biomed. Anal. – 2004. – Vol. 35, № 5. – P. 1241-1249. 156. Contact dermatitis caused by lovage (Levisticum officinalis) essential oil / H. Lapeere [et al.] // Contact Dermatitis. – 2013. – Vol. 69. – P. 181-191. 168 157. Czepa, A. Structural and sensory characterization of compounds contributing to the bitter off-taste of carrots (Daucus carota L.) and carrot puree // A. Czepa, T. Hofmann // J. Agric. Food. Chem. – 2003. – Vol. 51. – P. 3865-3873. 158. Daukšas, E. Extraction of Lovage (Levisticum officinale Koch.) roots by carbon dioxide. 1. Effect of CO2 parameters on the yield of the extract / E. Daukšas, P.R. Venskutonis, B. Sivik // J. Agric. Food Chem. – 1998. – Vol. 46, № 10. – Р. 4347. 159. Daukšas, E. Supercritical CO2 extraction of the main constituents of lovage (Levisticum officinale Koch.) essential oil in model systems and overground botanical parts of the plant Egidijus / E. Daukšas, P.R.Venskutonis , B. Sivik // J. of Supercritical Fluids. – 1999. – Vol. 15. – P. 51-62. 160. Determination of quantitative composition of poliphenolic compounds occur in anatomically different parts of Levisticum officinale Koch / NAJDA A. [et al.] // Electronic Journal of polish agricultural universities. – 2003. – Horticulture, Vol. 6, Is. 1. – http://www.ejpau.media.pl. 161. Determination of the Active Ingridients in Chuanxiong by HPLC, HPLS-MS, and EI-MS / H.X. Li [et al.] // J. Liquid Chromatography & Related Technologies. – 2001. – Vol. 24, № 13. – P. 2017-2031. 162. Duke, J.A. Medicinal plants of China / J.A. Duke, E.S. Ayensu // Algonac (Mich.): Reference publ. – 1985. – Vol. 1-2. – 705 p. 163. Dynamic headspace gas chromatography of different botanical parts of lovage (Levisticum officinale Koch.) / E. Bylaite [et al.] // Developments in Flavour Science. – The Royal Society of Chemistry, UK. – 1996. – P. 66-69. 164. Dynamic headspace-gas chromatography-olfactometry analysis of different anatomical parts of lovage (Levisticum officinale Koch.) at eight growing stages / E. Bylaitė [et al.] // J. Agric. Food Chem. – 2000. – Vol. 48. – Р. 6183-6190. 165. Effect of fast CO2 pressure changes on the yield of lovage (Levisticum officinale Koch.) and celery (Apium graveolens L.) extracts / E. Dauksˇas [et al.] // J. of Supercritical Fluids. – 2002. – Vol. 22. – P. 201-210. 166. European Pharmacopoeia, 6th ed., 2008 [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.edgm.eu. – Загл. с экрана. 167. Farnsworth, N.R. A review of some biologically active compounds isolated from plants as reported in the 1974-75 literature / N.R. Farnsworth, G.A. Cordell // Lloydia. – 1976. – Vol. 39, № 6. – Р. 420-455. 168. Ferulic acid alleviates lipid peroxidation in diabetic rats / M.S. Balasubashini [et al.] // Phytother. Res. – 2004. – Vol. 18, № 4. – P. 310-314. 169 169. Ferulic acid inhibits endothelial cell proliferation through NO down-regulating ERK1/2 pathway / Y. Hou [et al.] // J. Cell. Biochem. – 2004. – Vol. 93, № 6. – P. 1203-1209. 170. Ferulic acid inhibits vascular smooth muscle cell proliferation induced by angiotensin II / Y.Z. Hou [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 2004. – Vol. 199, № 1-2. – P. 85-90. 171. Flora of China [Электронный ресурс]. – Режим http://www.tropicos.org/Name/1700152?projectid=8. – Загл. с экрана. доступа: 172. Galambosi, B. The effect of nitrogen fertilization and leaf harvest on the root and leaf yield of Lovage / B. Galambosi, Z. Szebeni-Galambosi // J. Herbs, Spices and Med. Plants. – 1992. – Vol.1. – P. 3-13. 173. Gautam, R. Indian medicinal plants as a source of antimycobacterial agents / R. Gautam, A. Saklani, S.M. Jachak // J. Ethnopharmacol. – 2007. – Vol. 110. – P. 200-234. 174. Gibbons, S. Plants as a source of bacterial resistance modulators and anti-infective agents / S. Gibbons // Phytochem. Rev. – 2005. – Vol. 4. – P. 63-78. 175. Gijbels, M.J.M. Phthalides in the essential oil from roots of Levisticum officinale / M.J.M. Gijbels, J.J.C. Scheffer, B. Baerheim-Svendsen // Planta Med. – 1982. – Vol. 44. – P. 207-211. 176. Growth and essential oil composition of hairy root cultures of Levisticum officinale W.D.J. Koch (Lovage) / P.A.G. Santos [et al.] // Plant Sci. – 2005. – Vol. 168. – P. 1089-1096. 177. Hauffe, K.D. Elicitor-stimulated furanocoumarin biosynthesis in cultured parsley cells: S-adenosyl-L-methionine: bergaptol and S-adenosyl-L-methionine: xanthhotoxol O-methyltransferase / K.D. Hauffe, K. Hahlbrock, D. Scheel // Z. Naturforschung. – 1985. – № 41. – P. 228-239. 178. Hepatoprotective and nitric oxide production inhibitory activities of coumarin and polyacetylene constituents from the roots of Angelica furcijuga / H. Matsuda [et al.] // Bioorg. Chem. Lett. – 1998. – Vol. 8. – P. 2191-2196. 179. Hepatoprotective role of ferulic acid: a dose-dependent study / R. Rukkumani [et al.] // J. Med. Food. – 2004. – Vol. 7, № 4. – P. 456-461. 180. Ibrahim, M.E. Evalution of lovage (Levisticum officiale Koch.) as a new aromatic plant under Egyptian cultivation conditions / M.E. Ibrahim // Egypt. J. Hort. – 1999. – Vol. 26, № 2. – P. 177-186. 170 181. Inducible nitric oxide synthase inhibitors from Saposhnikovia divaricata and Panax quinquefolium / C.N .Wang [et al.] // Planta Med. – 2000. – Vol. 66. – P. 644-647. 182. Influence of ferulic acid on circulatory prooxidant-antioxidant status during alcohol and PUFA induced toxicity / R. Rukkumani // J. Physiol. Pharmacol. – 2004. – Vol. 55, № 3. – P. 551-561. 183. Investigation into the composition and bioactivity of essential oil from lovage (Levisticum officiale W.D.J. Koch.) / C.L. Hogg [et al.] // J. Aromatherapy. – 2001. – Vol. 3. – Р. 144-151. 184. Kedzia, B. Activity of furanocoumarin from Archagelica officinalis Hoffm. and Hercleum sosnowskyi Manden. friits on dermatophytes / B. Kedzia // Herba Pol. – 1996. – Vol. 42, № 1. – Р. 47-54. 185. Lawrence, B.M. Progress in Essential Oils / B.M. Lawrence // Perfum. Flavor. – 1999. – Vol. 24. – P. 35. 186. Lawrence, B.M. Progress in Essential Oils / B.M. Lawrence // Perfum. Flavor. – 2004. – Vol. 29. – P. 80. 187. Luszczki, J.J. Time-course and dose-response relationships of imperatorin in the mouse maximal electroshock seizure threshold model / J.J. Luszczki, K. Glowniak, S.J. Czuczwar // Neurosci. Res. – 2007. – Vol. 59, № 1. – Р. 18-22. 188. Machado, S. Occupational allergic contact dermatitis from falcarinol / S. Machado, E. Silva, A. Massa // Contact Dermatitis. – 2002. – Vol. 47. – P. 113-114. 189. Mechanisms responsible for the in vitro relaxation of ligustrazine on porcine left anterior descending coronary artery / A.A. Shan [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 2003. – Vol. 468, № 3. – P. 199-207. 190. Modulation of multi-drug resistance (MDR) in Staphylococcus aureus by Osha (Ligusticum porter L., Apiaceae) essential oil compounds / P. Cégiéla-Carlioz [et al.] // Flavour. Frag. J. – 2005. – Vol. 20. – P. 671-675. 191. Najda, A. Chemical composition in the roots and fruits of lovage (Levisticum officinale Koch.) and chromatographic analysis of essential oils in the studied material / A. Najda, T. Wolski // Annals UMCS, Sec. EEE. – 2003. – Vol. 12. – P. 45-52. 192. New Directions aromatics [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.chemblink.com/MSDS/MSDSFiles/8016-317_New%20Directions.pdf/. – Загл. с экрана. 171 193. Novák, I. Effect of Harvesting Time and Plant Age on some Quality Parameters of Lovage (Levisticum officinale Koch.) / I. Novák, É. Németh [Электронный ресурс]. – 2010. – Режим доступа: // http://wwwlib.teiep.gr/images/stories/acta/Acta%20576/576_46.pdf. – Загл. с экрана. 194. Novel antiproliferative falcarindiol, furanocoumarin ethers from the root of Angelica japonica / H. Matsunaga [et al.] // Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. – 1998. – № 8. – Р. 1-6. 195. Ozaki, Y. Centrally acting muscle relaxant effect of phthalides (ligustilide, cnidilide and senkyunolide) obtained from Cnidium officinale Makino. / Y. Ozaki, S. Sekita, M. Harada // Yakugaku Zasshi. – 1989. – Vol. 109, № 6. – P. 402-406. 196. Pharmacopoeia of the people's Republic of China (English edition 2005). – China: Chinese Pharmacopoeia Commission, People's Medical Publishing House, 2005. – Vol. 1. – P. 266-267. 197. Possibilities for use of seed extracts from selected Apiaceaeus plants in plant protection against diseases / J. B. Zbigniew [et al.] // Ecological chemistry and engineering A. – 2010. – Vol.17, № 9. – Р.1077-1082. 198. Protective effect of Ligusticum chuanxiong and Angelica sinensis on endothelial cell damage induced by hydrogen peroxide / Y.Z. Hou [et al.] // Life Sci. – 2004. – Vol. 75, № 14. – Р. 1775-1786. 199. Recent developments in bioavailabity of falcarinol / J. Haraldsdottir [et al.] // proceedings of workshop in Karresbaeksminde. – Denmark, 2002. – P. 24-29. 200. Sas-Piotrowska, B.Vitality and Healthiness of Seeds of Cereal Plants Treated with Plant Extracts / B. Sas-Piotrowska, W. Piotrowski // Środkowo-Pomorskie Towarzystwo Naukowe Ochrony Środowiska. – 2008. – T. 10. – P. 103-121. 201. Scientific Opinion on the substantiation of health claims related to Levisticum officinale W.D.J. Koch and improvement of diuretic function (ID 2292, 3420) pursuant to Article 13(1) of Regulation (EC) No 1924/20061 / J.-L. Bresson [et al.] // EFSA J. – 2009. – Vol. 7, № 9:1297. – 10 р. 202. Segebrecht, S. Ligustilide: guiding component for preparation of Levisticum officinale roots / S. Segebrecht, H. Schilcher // Planta Medica. – 1989. – Vol. 55. – P. 572-573. 203. Shui-Yin, W. Comparative study of ligustilide in different parts of radix Angelicae sinensis by high-performnce liquid chromatography / W. Shui-Yin, T. Man-Ling, C. Foo-Tim // ANYL. – 2003. – № 66. – P. 187-191. 172 204. Sigurdsson, S. Antiproliferative effect of Angelica archangelica fruits / S. Sigurdsson, H.M. Ogmundsdottir, S. Gudbjarnason // Z. Naturforsch., C: Biosci. – 2004. – Bd. 59, № 7-8. – S. 523-527. 205. Sigurdsson, S. Inhibition of acetylcholinesterase by extracts and constituents from Angelica archangelica and Geranium sylvaticum / S. Sigurdsson, S. Gudbjarnason // Z. Naturforsch., C: Biosci. – 2007. – Bd. 62, № 9-10. – S. 689-693. 206. Simultaneous Analysis of Seventeen Chemical Ingridients of Ligusticum Chuanxiong by on-line High Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detector-Mass Spectrometry / S.L. Li [et al.] // Planta med. – 2003. – Vol. 69. – P. 445-451. 207. Sodium ferulate inhibits atherosclerogenesis in hyperlipidemia rabbits / B. Wang [et al.] // J. Cardiovasc. Pharmacol. – 2004. – Vol. 43, № 4. – P. 549-554. 208. Song, Z.J. Protective effect of tetramethylpyrazine and L-arginine on rats with acute myocardial infarction / Z.J. Song, Q. Chen, B.L. Li // Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. – 2004. – Vol. 24, № 10. – Р. 912-914. 209. Stahl-Biskup, E. Composition of the essential oils from roots of some Apiaceae in relation to the development of their oil duct systems. / E. Stahl-Biskup, E.-M. Wichtmann // Flavour Fragrance J. – 1991. – № 6. – P. 249-255. 210. Stavri, M.The antimycobacterial constituents of Dill (Anethum graveolens) / M. Stavri, S. Gibbons // Phytother. Res. – 2005. – Vol. 19. – P. 938-941. 211. Stratu, A.The effect of extracts from Apium graveolens l. and Levisticum officinale Koch leaves on the germination of certain dicotyledons species / A. Stratu, D.Toma, N. Costică // Biologie vegetală. – 2012. – Vol. 58, № 2. – Р. 73-79. 212. Study of the antiproliferative effects and synergy of phthalides from Angelica sinensis on colon cancer cells / W.L.T. Kan [et al.] // J. Ethnopharmacol. – 2008. – Vol. 120. – P. 36-43. 213. The anti-staphylococcal activity of Angelica dahurica (Bai Zhi) / D. Lechner [et al.] // Phytochemistry. – 2004. – Vol. 65. – P. 331-335. 214. The chemical composition of lovage headspace and essential oils produced by solvent extraction with various solvents / J. Cu [et al.] // J. Essent. Oil Res. – 1990. – Vol. 2. – P. 53-59. 215. The composition and antibacterial activity of the essential oil of Levisticum officinale Koch. flowers and fruits at different developmental stages / M. H. Mirjalili [et al.] [Электронный ресурс]. – 2010. – Режим доступа: 173 http://www.shd.org.rs/JSCS/JSCS_OnLine_First/4784_OLF.pdf. – Загл. с экрана. 216. The protective effects of ligustrazine on ischemia-reperfusion and DPPH free radical-induced myocardial injury in isolated rat hearts / Y. Zhou [et al.] // Planta Med. – 2004. – Vol. 70, № 9. – P. 818-822. 217. Toguchida, T. Hepatoprotective and nitric oxide production inhibitory activities of coumarin and polyacetylene constituents from the roots of Angelica furcijuga I. / T. Toguchida // Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. – 1998. – Vol. 8, № 16 (18). – Р. 2191-2196. 218. Toulemonde, B. Phthalides from lovage (Levisticum officinale Koch.) / B. Toulemonde, F. Paul, I. Noleau // Flavour Science and Technology. John Wiley & Sons, 1987. – P. 89-94. 219. Toulemonde, B. Volatile constituents of lovage (Levisticum officinale Koch.) / B. Toulemonde, I. Noleau // Flavour and Fragrances: a World Perspective. – Amsterdam, 1988. – P. 641-657. 220. Tsi, D. Cardiovascular Pharmacology of 3-n-butylphthalide in Spontaneously Hypertensive Rats / D. Tsi, B.K.H. Tan // Phytotherapy Research. – 1997. – Vol. 11. – P. 576-582. 221. Uhlig, J. Effect of phthalides on celery flavor / J. Uhlig, A.Chang, J.J.J. Jen // Food Sci. – 1987. – Vol. 52, № 3. – P. 658-660. 222. Venskutonis, P. R. Essential oil composition of some herbs cultivated in Lithuania / P.R. Venskutonis // Flavours, Fragrances and Essential Oils. – Istanbul: AREP, 1995. – Vol. 2. – P. 108-123. 223. Verdian, R.M. The essential oil composition of Levisticum officinalis from Iran / R.M. Verdian, H. Abbas // Asian J. Biochem. – 2007. – Vol. 2. – Р. 161-163. 224. Vollmann, C. Levisticum officinale – Der Liebstöckel / C. Vollmann // Zeitschrift für Phytotherapie. – 1988. – Vol. 9. – P. 128-132. 225. Wang, Q. Effect of sodium ferulate on activation of extracellular signal regulated kinase after cerebral ischemia/reperfusion injury in rats / Q. Wang, L.Z. Xiong, S.Y.Chen // Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. – 2003. – Vol. 23, № 12. – P. 918-921. 226. Wittstock, U. Effects of cicutoxin and related polyacetylenes from Cicuta virosa on neuronal action potentials. A comparative study on the mechanism of the convulsive action / U. Wittstock, K.H. Lichtnow, E. Teuscher // Planta Med. – 1997. – Vol. 63. – P. 120-124. 174 227. Xu, H.L. Inhibitory effects of chiral 3-n-butylphthalide on inflammation following focal ischemic brain injury in rats / H.L. Xu, Y.P. Feng // Acta Pharmacol. Sin. – 2000. – Vol. 21, № 5. – Р. 433-438. 228. Zhou, S. Clinical study of Astragalus injection plus ligustrazine in protecting myocardial ischemia reperfusion injury / S. Zhou, W. Shao, W. Zhang // Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. – 2000. – Vol. 20, № 7. – Р. 504-507. 229. Zloh, M. Quantum chemical studies on structure activity relationship of natural product polyacetylenes / M. Zloh, F. Bucar, S. Gibbons // Theor. Chem. Acc. – 2007. – Vol. 117. – P. 247-252. 230. Zschocke, S. Polyacetylenic acetate and a coumarin from Angelica pubescens F. biserrata / S. Zschocke, J.-H. Liu, R. Bauer // Phytochemistry. – 1998. – Vol. 49. – № 1 (103). – Р. 211-213. 175 ПРИЛОЖЕНИЯ 176 МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Livistici officinalis rhizomata et radices Любистка лекарственного корневища и корни ФС 42Вводится впервые Срок введения установлен с « ___» ______________20 г. Срок действия до « ___» _____________ 20 г. Настоящая Фармакопейная статья распространяется на заготовленные осенью в период конца вегетации и весной до начала вегетации и высушенные корневища и корни многолетнего культивируемого и дикорастущего растения любистка лекарственного Levisticum officinale Koch. семейства сельдерейных – Apiaceae, используемые как сырье для получения лекарственных средств ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ ПЕРЕПЕЧАТКА ВОСПРЕЩЕНА 177 Внешние признаки. Цельное сырье. Куски корневищ и корней, разрезанные вдоль или поперек, преимущественно цилиндрической формы, твердые, плотные. Корневища короткие, толстые до 5 см в диаметре, с несколькими выступами, неочищенные от опробковевшего слоя, твердые, но легкие (не тонут в воде). Корни почти цилиндрической формы или расщепленные на 2-3 части, слегка суживающиеся к концу, без особого ветвления, редко спирально перекрученные, также неочищенные от пробки, диаметром 0,2-1,5 см, до 25 см в длину. Поверхность корневищ и корней продольно-морщинистая, излом зернисто- шероховатый, пористый, в центре видна узкая полоса светло-желтой древесины, окруженная очень широкой серовато-белой корой. Цвет поверхности корневищ и корней коричневый, запах ароматный, вкус водного извлечения острый, горьковатый. Измельченное сырье. Кусочки корневищ и корней цилиндрической формы в сечении длиной до 5 см, шириной до 3 см, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Цвет с поверхности светло-коричневый, на изломе светложелтоватый, запах ароматный, вкус водного извлечения горьковатый. Порошок светло-коричневого цвета, с темными вкраплениями, проходящий сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, запах ароматный, вкус водного извлечения горький. Микроскопия. Цельное сырье. На поперечном срезе корневища видно, что корневище имеет непучковое (лучистое) строение. Покровная ткань – перидерма, состоящая из нескольких слоев клеток прямоугольной формы с толстыми стенками. Кора состоит из паренхимных клеток с утолщенными стенками и эфирномасличных каналов, схизогенного происхождения. Центральный цилиндр состоит из перецикла, камбия, флоэмы, ксилемы и паренхимы сердцевины. Перицикл представлен паренхимными клетками. Камбий не дифференцирован. Флоэма представлена клетками округлой формы. Ксилема состоит из толстостенных сосудов округлой формы. 178 Сердцевина, состоит из крупных, округлых, тонкостенных паренхимных клеток, часто разрушена. Корень на поперечном срезе имеет вторичное строение. Покровная ткань представлена перидермой, состоящей из нескольких слоев прямоугольных клеток пробки. Клетки феллодермы имеют тонкие стенки, овальные или округлые, содержащие включения – крахмальные зёрна, обнаруживаемые в микропрепарате гистохимической реакцией с раствором Люголя. Клетки флоэмы тонкостенные, округлой или многогранной формы, плотно прилегают между собой. В клетках паренхимы коры и флоэме имеются секреторные клетки, имеющие в поперечном срезе округлую форму. Содержимое секретирующих клеток окрашивается реактивом Судан III в оранжево-красный цвет, что свидетельствует о наличии эфирного масла. В ксилеме расположено большое количество одревесневших механических тканей, представленных склеренхимой, которые под действием флороглюцина и кислоты хлористоводородной или серной (конц.) окрашивались в малиновый цвет. Сосуды ксилемы на продольном срезе корня пористые. Измельченное сырье. На поперечном срезе или «давленном» микропрепарате видна многослойная пробка, проводящие пучки коллатерального типа. Паренхима представлена сравнительно мелкими клетками многогранной формы с крахмальными зернами. Порошок. При микроскопическом исследовании сильно измельченного сырья и порошка (в хлоралгидрате) установлены следующие диагностические признаки: клетки пробки прямоугольной формы, клетки паренхимы мелкие, многогранной формы, зерна крахмала размером от 6 до 16 мкм, обрывки сосудов (спиральные, лестничные) и многочисленные вместилища. 179 А 1 Б 2 5 1 2 7 3 3 9 3 4 8 4 3 5 В 6 1 2 6 4 3 4 Рисунок 12 – Поперечный срез подземных органов любистка лекарственного: А – схема корневища: 1– покровная ткань, 2 – паренхима коры, 3 – флоэма, 4 – камбий, 5 – сердцевинный луч, 6 – ксилема, 7 – эфирномасличный канал, 8 – паренхима сердцевины, 9 – перециклические волокна; Б – участок среза корня в области центрального цилиндра: 1 – ситовидные трубки, 2 – камбий, 3 – сосуды ксилемы, 4 – паренхима, 5 – сердцевинный луч; В – участок среза корня в области коры: 1 – межклеточное пространство, 2 – паренхима, 3 – ситовидные трубки, 4 – выстилающий слой секреторной клетки, 5 – эфирномасличный канал, 6 – сердцевинный луч 180 Качественные (гистохимические) реакции. 1. Поперечный срез корня любистка лекарственного помещают в раствор Судана III, накрывают покровным стеклом и нагревают. Капли эфирного масла окрашиваются в оранжево-желтый цвет (эфирные масла). 2. Поперечный срез корня помещают в раствор Люголя, накрывают покровным стеклом. Крахмальные зерна окрашиваются в синий цвет. 3. Срез помещают в 1% раствор флороглюцина в спирте, затем несколько капель серной кислоты (конц.). Через 1- 2 мин. наблюдают появление яркого малинового окрашивания (одревесневшие оболочки клеток). УФ-спектр. 1. УФ-спектр спиртовых извлечений из сырья с помощью 70% спирта должен иметь максимумы поглощения в области 278±2 нм, 327±2нм (хлорогеновая кислота). 2. УФ-спектр спиртовых извлечений из сырья с помощью 96% спирта должен иметь максимум поглощения при 270±2 нм (ангелицин). Числовые показатели. Содержание эфирного масла не менее 1,0% (ГФ XII – метод 3), суммы кумаринов в пересчете на ангелицин не менее 5%, суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту не менее 0,4%. Цельное сырье. Влажность – не более 12%; золы общей – не более 10%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной – не более 2%; корневищ и корней, потерявших окраску – не более 5%; корневищ с остатками листьев – не более 2%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм – не более 5%; органической примеси – не более 1%; минеральной примеси – не более 1%. Измельченное сырье. Влажность – не более 12%; золы общей – не более 10%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной – не более 2%; корневищ и корней, потерявших окраску – не более 3%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм – не более 3%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм – не более 5%; органической 181 примеси – не более 1%; минеральной примеси – не более 1%. Порошок. Влажность – не более 10%; золы общей – не более 10%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной – не более 2%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм – не более 10%. Микробиологическая чистота. Испытания проводят в соответствии с требованиями ГФ XII ОФС 42-0016-07. Категория 4 А. Количественное определение. 1. Около 0,5 г сырья (точная навеска) помещают в колбу вместимостью 100 мл и прибавляют 50 мл спирта этилового 96%, содержащего 1% концентрированной кислоты хлористоводородной. Содержимое колбы кипятят однократно с обратным холодильником в течение 30 минут, затем полученное извлечение фильтруют упаривают. Полученное сгущенное извлечение растворяютв спирте этиловом 96% и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, после чего доводят тем же растворителем до метки. Затем 2,5 мл полученного извлечения переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки спиртом, после чего тщательно перемешивают. Спектры поглощения извлечений из сырья и раствора СО ангелицина регистрируют на спектрофотометре относительно растворителя. Остаток количественно переносят и растворяют в мерной колбе вместимостью 25 мл в 20 мл спирта этилового 96%, объем раствора в колбе доводят до метки тем же растворителем. Аликвоту в количестве 1 мл переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и объем раствора в колбе доводят до метки спиртом этиловым 96%. Оптическую плотность полученного раствора измеряют при длине волны 270 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – спирт этиловый 96%. В качестве стандартного раствора используют раствор СО ангелицина. Для этого 0,1 г СО ангелицина (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и растворяют в 40 мл спирта этилового 96%, после чего содержимое колбы доводят до метки тем же растворителем (раствор А). 1мл раствора А пере- 182 носят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Оптическую плотность полученного раствора измеряют при длине волны 270 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – спирт этиловый 96%. Содержание кумаринов (Х,%) в пересчете на ангелицин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле: Х Ах а0 Wx1 Wx 2 Va 0 100% 100 , где А0 а х Vax W01 W02 (100 В) А0 и Ах – значения оптических плотностей растворов СО ангелицина и анализи- руемого образца соответственно; а0 и а х – массы навесок СО ангелицина и извлечения любистка лекарственного соответственно, г; W0 и Wx – мерные колбы, использованные для разведения навесок СО ангелицина и анализируемого образца соответственно, мл; Va0 и Vax – аликвоты растворов СО и анализируемого образца соответственно, мл. В – влажность сырья, 9,70%. 2. Около 0,5 (точная навеска) измельченного воздушно-сухого сырья до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, экстрагируют спиртом этиловым 70% в течение 1 часа на водяной бане. После охлаждения смесь фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу объемом 25 мл и доводят спиртом этиловым 70% до метки. 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят тем же растворителем до метки (исследуемый раствор). Для приготовлении раствора СО 0,001 г (точная навеска) кислоты хлорогеновой помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляют 5 мл спирта этилового 70%, перемешивают до растворении и доводят до метки (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят тем же растворителем до метки (СО). Оптическую плотность полученных растворов измеряют при длине волны 325 нм относительно спирта этилового 70% в кювете с толщиной слоя 10 мм. 183 Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту в абсолютно-сухом сырье рассчитывают по формуле: A1 – оптическая плотность исследуемого раствора; A – оптическая плотность раствора CO; n – масса навески CO хлорогеновой кислоты, г; m – масса навески сырья, г; W – потеря в массе при высушивании, %. Упаковка. В мешки тканевые или льно-джуто-кенафные не более 40 кг нетто. Хранение. В соответствии с ОФС. В сухом, защищенном от света месте. Срок годности. 2 года. 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193
