Мочекаменная болезнь: молекулярно-биологические механизмы и пути

Мочекаменная болезнь:
молекулярно-биологические
механизмы и пути
фармакологической
метафилактики
В.Л. Эмануэль, С.Х. Аль Шукри
НЕМНОГО
ИСТОРИИ
Проблема уролитиаза.
По данным мировой статистики частота
возникновения уролитиаза составляет до 12% у
мужчин и до 7% у женщин ( Coe et al. 2005) и
отмечается рост заболеваемости во всех странах
мира (Knoll T. et al., 2004). Особенно тревожной
остается
ситуация
с
рецидивным
камнеобразованием, составляющим 42,0 – 50,0%.
 Поздняя диагностика МКБ - в стадии отчетливых
клинических
проявлений
по
результатам
ультразвукового и других методов визуализации
обуславливает стратегию лечения: литотрипсию
или удаление камней хирургическим путем.

Человек болеет
только той болезнью,
которой
может заболеть?
Человек болеет только той болезнью,
которой может заболеть !!!
Этиологические
факторы
Образ
продукция
жизни
ингибиторы
протеолиз
протеиназ
катаболизм
экскреция
анаболизм
где тонко,
там
и рвется
САНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ
ФОРМИРУЮТ ИНДИВИДУАЛЬНУЮ КАРТИНУ ЗАБОЛЕВАНИЯ
Внешняя
среда
Геном
Генетический
полиморфизм
Замена1
2
3
4
5
Неблагоприятные сочетания аллелей
генов «предрасположенности»
«Молекулярный
уровень»
диагностики
позволяет
менять
стратегию
медицинской
помощи
…….
……
Заболевание
Организм человека, все его ткани, системы и клетки продукт взаимодействия окружающей среды и генома
Растворимость
солей
и азотистых
шлаков в воде
соли
ТХ
гликопротеин
ТаммаХорсфалла
Igor Tamm
1922—1995
Tamm I, Horsfall F L.
Characterization and
separation of an inhibitor of
viral hemagglutination
present in urine. Proc Soc
Exp Biol Med 1950; 74: 108
– 114
Синонимы:
 Tamm-Horsfall Protein
 Uromodulin
 Uromucoid
Локализация БТХ в нефроне и образование
гиалиновых цилиндров
Гиалиновые цилиндры в основном состоят
из фибрилл БТХ
Структура БТХ
Мономер



Гликопротеин–92 kD, полипептид-85 kD: 640 а.о.; в зрелом белке–616 а.о.
Содержание полисахаридов 28%, сиаловых кислот до 5% (по массе),
7 сайтов N-гликозилирования, pI = 3.21
Общая структура N-гликановых цепей БТХ
Высокомолекулярные
сульфатированные
углеводные цепи БТХ
содержат 4 ди- и триантенные GalNAc4S-Nгликаны; 28 ди-, три- и
тетра-Gal3S-N-гликаны,
дополнительно
содержащие Sda
детерминант ((а2-3)связанная и/или (ф2-6)связанная сиаловая
кислота (NeuAc)).
Олигомер:
ММ = 7*106 D,
гидродинамический радиус (Rh)
- 108 нм
Изучение постгеномных
характеристик биообъектов
биофизическими методами
(лазерная корреляционная спектроскопия,
атомная силовая микроскопия,
кристаллография…)
как технология верификации
«биологических
дефектов»
Феномен Шатохиной - Шабалина
Кристаллографическое исследование
Метод позволяет выявлять активность кристаллобразования еще до
формирования почечного камня, оценивать эффективность лечебных и
профилактических мероприятий.
СТАНДАРТИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ИССЛЕДОВАНИЙ
раствор альбумина, меченого метиленовым синим
(в воде - а) в фациях мочи здорового человека (б) и
больного мочекаменной болезнью (в).
а
б
в
Схема циркуляции потоков в капле
1,2,3 - распределение частиц и направление их движения на разных
уровнях в капле жидкости;
4 - циркуляционные потоки жидкости в капле.
При формировании ФАЦИЙ из мочи здорового человека
происходит формирование краевой белковой зоны, связанной с
защитными свойствами белка в отношении кристаллов солей
при его фазовом переходе из золя в гель.
а) капля жидкости в разрезе;
б) краевая застойная зона;
1 – гидратированный уромукоид;
2 – ионы камнеобразующих солей;
3 – микрокристаллы солей;
4 – гель - фаза – студень;
При образовании ФАЦИЙ из мочи с камнеобразованием,
белковая зона не формируется и происходит
кристаллизация солей.
а – кристаллы камнеобразующих солей;
б – уромукоид (муцин);
Роль
белков
Взаимосвязь
молекулярнобиологических
направлений
Протеиновый уровень реализации патологических
процессов
Генетические мутации на уровне ДНК могут
вызвать неправильное производство протеинов
(серповидно-клеточная анемия).
 Нарушения посттрансляционной модификации
протеинов для обеспечения выполнения
конкретных функций (модификация факторов
свертывания крови при их активации).

Биоинформатика – наука, занимающаяся
изучением биологической информации с
помощью математических, статистических
и компьютерных методов.

При изучении белков – два подхода:
 исследование в растворе
исследование в кристаллическом состоянии
рентгеноструктурный анализ
Кристаллопротеомика – один из
разделов молекулярной медицины,
изучающий свойства кристаллов
протеома клеток в норме и патологии

Характер дегидратационной
самоорганизации белково-солевых систем
Т.А. Яхно с соавт., 2007
Кристаллобразование в биосредах

Среды с высоким содержанием белка

Сыворотка
крови
Слюна
Желудочная слизь
Лимфа
Создана методология научного направления
биокристалломики – синтетического представления о
биогенных кристаллах.
Образец биологического материала, обладая всеми свойствами
первоначальной среды, является функциональной системой,
несущей в себе генетически детерминированную информация.
Геном
Структуры
системы
Картина
биокристаллогенеза
Продукты
реализации
генетической
информации
(белки,
жиры,
Синтез
углеводы)
белка
Жидкая
биосреда с
уникальным
компонентным
Модификация
составом
Дегидратация субстрата
Агрегаты нанокристалломицелл
белков (фолдинг)
Верификация
элементов
в процессе
дегидратации
Белок Тамма-Хорсфалла
Турбодиметрия
Лабораторные методы основанные на рассеянии света
Radiant of light
with given
breadth of a
spectrum
Нефелометрия
Monochromatic
radiant of light
Лазерная
корреляционная
спектроскопия
R(t )
Лазерная корреляционная
спектроскопия
% от общего числа
частиц
40
105
90
67 56
48 43
36 29
20
20
t
10
0
25
30
15
15
0
3
Диаметр частиц (мкм)
70.
50.
40.
30.
10.
0.
Rh нм
БТХ в моче
Гидролиз
БТХ
% 80.
70.
50.
40.
30.
10.
0.
Rh нм
1.25
1.68
2.27
3.06
3.82
5.14
6.92
9.32
12.56
16.92
22.79
30.69
41.35
55.69
75.02
101.05
136.11
183.34
246.95
332.64
448.07
603.54
812.96
1095.05
1475.03
1986.85
2676.26
3604.90
4855.76
6540.67
8810.22
11867.2
БТХ в моче
БТХ в нативной моче
80.00
70.00
80.00
1.25
1.68
2.27
3.06
3.82
5.14
6.92
9.32
12.56
16.92
22.79
30.69
41.35
55.69
75.02
101.05
136.11
183.34
246.95
332.64
448.07
603.54
812.96
1095.05
1475.03
1986.85
2676.26
3604.90
4855.76
6540.67
8810.22
11867.2
1.25
1.68
2.27
3.06
4.12
5.54
7.47
10.06
13.55
18.25
24.58
33.11
44.6
60.08
80.92
109.
146.82
197.77
266.39
358.83
483.34
651.05
876.96
1181.25
1591.14
2143.25
2886.93
3888.67
5238.
7055.54
9503.74
12801.4
%
80.
1.25
1.68
2.27
3.06
4.12
5.54
7.47
10.06
13.55
18.25
24.58
33.11
44.6
60.08
80.92
109.
146.82
197.77
266.39
358.83
483.34
651.05
876.96
1181.25
1591.14
2143.25
2886.93
3888.67
5238.
7055.54
9503.74
12801.4
Наблюдение БТХ - ЛКС методом
(динамическое светорассеяние)
Выделенный БТХ
БТХ - олигомер
60.
60.00
50.00
20.
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
БТХ + 0.58 М Na Cl
БТХ - полимер
70.00
60.
60.00
50.00
40.00
20.
30.00
20.00
10.00
0.00
Различия в прогнозировании камнеобразования при
изолированном применении метода оценки кристаллогенеза и в
сочетании с лазерной корреляционной спектроскопией и
осмоляльностью мочи (б) у здоровых детей и пациентов с
кристаллурическими диатезами и МКБ
Кристаллурические
диатезы
Контроль
67,4%
а
б
52%
55%
32,6%
2,2%
48%
45%
83%
97,8%
МКБ
72%
17%
28%
Процесс кристаллообразования отсутствует
ДС = 97,8%
Активный процесс кристаллообразования
Сопоставление кристаллографической
технологии и холодовой пробы мочи
Моча пациента без камнеобразования
Фация мочи
Пробирка с мочей
помещенная в
холодильник
Сопоставление кристаллографической
технологии и холодовой пробы мочи
Моча больного с активным камнеобразованием
Фация мочи
Пробирка с мочей
помещенная в
холодильник
Микроскопическое исследование осадков мочи
окрашенных суправитально краской Штернгеймера
после проведения холодовой пробы
Осадок мочи с отсутствием
камнеобразования
Слизь небольшое
количество
Осадок мочи с активным
камнеобразованием
Слизь значительное
количество
Осадки мочи окрашенные суправитально
краской Штернгеймера
после проведения холодовой пробы
Уромукоид на дне пробирок специфически окрашен
скрининг – верификация группы риска
развития МКБ
Общий анализ мочи
рН-мочи
Осмоляльность мочи
Утренняя
порция мочи
Посев
мочи
Структурно-оптические
свойства мочи (ЛКС)
Исследование
активности
кристаллобразования
Боннский индекс
кристаллизации СаОх
Дифференциация
механизмов
камнеобразования и
прогнозирование
развития
мочекаменной
болезни
Риск камнеобразования – Боннский индекс
кристаллизации оксалата кальция
►отношение
концентрации Са2+
к количеству оксалата
(Ох2-) при индукции
преципитации
кристаллов оксалата
кальция (СаОх)
(Laube N. et al., 2000).
Бактериологическое исследование
мочи
Патогенные микроорганизмы мочевых путей

•
Escherichia coli
 •
Другие энтеробактерии (Proteus, Klebsiella,
Enterobacter, Citrobacter)
 •
Pseudomonas aeruginosa
 •
Enterococcus
 •
Staphylococcus aureus и сапрофитные стафилококки
 •
Streptococcus agalactiae (группа B) – в осн. у женщин
 •
Candida spp.
Нефропатогенные вирусы (например, вирусы полиомы)
Более редкие патогены:
Бактерии внутри конкрементов:
Corynebacterium urealyticum
«Нанобактерии»:
• Haemophilus influenzae,
(кальций-содержащие частицы
• Blastomyces dermatitidis
размерами менее 0,5 мкм)
• Neisseria gonorrhaeae
обнаружены в составе
• Mycobacterium tuberculosis
почечных камней
Proteus mirabilis – источник струвитных
камней (аммоний+фосфат+магний)
Уреазо -позитивные штаммы
бактерий способствуют
защелачиванию мочи и
повышают риск формирования
оксалатных камней
(Corynebacterium urealyticum и
C. Рseudogenitalium)
Proteus mirabilis образует
биопленки – основу для
образования кальциевых
конкрементов (внутри
катетеров)

ТХ
Микро
кристалл
Микро
кристалл
ТХ
ТХ
ТХ
ТХ
ТХ
Белок
Тамма-Хорсфалла
Микро
кристалл
Микро
кристалл
ТХ
Микро
кристалл
ТХ
ТХ
ТХ
ТХ
Микро
кристалл
Микро
кристалл
ТХ
Белок
Тамма-Хорсфалла
Микро
кристалл
ТХ
Микро
кристалл
Микро
кристалл
ТХ
Механизм развития мочекаменной болезни
ТХ
Микро
кристалл
ТХ
ТХ
Микро
кристалл
ТХ
Механизм развития мочекаменной болезни
ТХ
Микро
кристалл
ТХ
Микро
кристалл
ТХ
Механизм развития мочекаменной болезни
ТХ
Микро
кристалл
ТХ
Микро
кристалл
ТХ
ТХ
ТХ
ТХ
ТХ
Механизм развития мочекаменной болезни
ТХ
Микро
кристалл
ТХ
ТХ
Микро
кристалл
Микро
кристалл
Микро
кристалл
Микро
кристалл
ТХ
ТХ
ТХ
Микро
кристалл
ТХ
Механизм развития мочекаменной болезни
ТХ
Микро
кристалл
Микро
кристалл
Микро
кристалл
Микро
кристалл
ТХ
ТХ
Микро
кристалл
Микро
кристалл
Микро
кристалл
Микро
кристалл
Микро
кристалл
Микро
кристалл
Микро
кристалл
ТХ
ТХ
ТХ
Микро
кристалл
Микро
кристалл
Микро
кристалл
ТХ
Механизм развития мочекаменной болезни
ТХ
ТХ
Биофизические методы верификации
биологического дефекта протеома
Тамма Хорсфала в обосновании методов ее
лечения
«Курорт «Краинка»
ЗАЛЕСКИЙ М.Г.
ПИЯФ
Группа профессора
Носкина
Леонида Алексеевича
Изменение уровня активности камнеобразования в моче
под действием химических
и фармакологических препаратов in situ
Фация мочи с камнеобразованием
Фация этой же мочи, после добавления
20% уксусной кислоты, без
центрифугирования.
Фация мочи после добавления в мочу
мукалтина и термостатирования при 36º
С в течение 19 часов
Фация мочи после добавления в мочу
бромгексина термостатирования при 36º
С в течение 19 часов
1.25
1.68
2.27
3.06
3.82
5.14
6.92
9.32
12.56
16.92
22.79
30.69
41.35
55.69
75.02
101.05
136.11
183.34
246.95
332.64
448.07
603.54
812.96
1095.05
1475.03
1986.85
2676.26
3604.90
4855.76
6540.67
8810.22
11867.2
80.00
70.00
БТХ + 0.58 М Na Cl
80.00
ТНР - полимер
80.00
70.00
70.00
60.00
60.00
50.00
50.00
40.00
40.00
30.00
30.00
20.00
20.00
10.00
10.00
0.00
0.00
1.25
1.68
2.27
3.06
3.82
5.14
6.92
9.32
12.56
16.92
22.79
30.69
41.35
55.69
75.02
101.05
136.11
183.34
246.95
332.64
448.07
603.54
812.96
1095.05
1475.03
1986.85
2676.26
3604.90
4855.76
6540.67
8810.22
11867.2
1.25
1.68
2.27
3.06
3.82
5.14
6.92
9.32
12.56
16.92
22.79
30.69
41.35
55.69
75.02
101.05
136.11
183.34
246.95
332.64
448.07
603.54
812.96
1095.05
1475.03
1986.85
2676.26
3604.90
4855.76
6540.67
8810.22
11867.2
Наблюдение БТХ - ЛКС методом
(динамическое светорассеяние)
Выделенный БТХ
ТНР - олигомер
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
БТХ отмытый от NaCl
ТНР – после разрушения
полимера муколитиками
Особенности кристаллизация солей в капле высыхающей мочи при высокой ее
осмоляльности и преобладании макро частиц свидетельствует о благоприятном
прогнозе уролитиаза.
«Болезнь нужно лечить
за 3 года до ее появления,
а не за 3 дня до смерти»
Китайская мудрость
Фунт профилактики дороже пуда
лечения (Н.И.Пирогов)
Проблемная комиссия №21
«Клиническая лабораторная диагностика»
совместно с кафедрой урологии
1. профессор Е.Т.Голощапов. (СПбГМУ)
2. д.ф-м.н. Дюк В.А. (Институт информатики РАН)
3. Ст.н.с. Ланда С.Б. (ПИЯФ РАН )
4. к.м.н. Лапин С.В.(СПбГМУ)
5. к.м.н. Мартусевич А.К. (Нижний Новгород)
6. к.м.н.Сысоев К.А. (СПбГМУ)
7. к.м.н. Чередниченко Д.В.(СПбГМУ)
8. д.м.н. Чухловин А.Б. (СПбГМУ)
9. к.м.н. Эмануэль Ю.В. (СПбГМУ),
а также интерны, ординаторы и СНОвцы СПбГМУ и
дипломанты (Томск).
Спасибо за внимание!