Экологическая химия 2002, 11(4), 271–278 НОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОЗЫ РТУТИ, ПОЛУЧАЕМОЙ ЧЕЛОВЕКОМ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЕЕ ПАРОВ С.Е. Погарев, 1В.В. Рыжов, 1Н.Р. Машьянов, 2С.Е. Шолупов и 3В.Д. Жарская 1 НИИ Земной Коры Санкт-Петербургского государственного университета, 199034 Санкт-Петербург 2 НПФ Аналитического приборостроения «Люмэкс», 199034 Санкт-Петербург 3 Реабилитационный центр «Приморский», 199198 Санкт-Петербург 1 Представлен новый экспрессный метод определения дозы ртути, получаемой человеком при вдыхании ее паров, основанный на прямом измерении ртути в выдыхаемом воздухе с помощью зеемановского атомно-абсорбционного спектрометра РА-915+. Предложенный метод успешно прошел проверку на двух добровольцах. С использованием электронного микроскопа показано, что у добровольцев после воздействия паров ртути существенно увеличилась доля незрелых эритроцитов в крови. Ключевые слова: пары ртути, ингаляционная доза, ртуть в выдыхаемом воздухе, атомно-абсорбционная спектроскопия, эритроциты. Введение Давно известно, что пары элементарной ртути обладают высокой токсичностью и представляют серьезную опасность для здоровья человека [1,2]. Ртуть, попадающая в организм через легкие, концентрируется затем в таких жизненно важных органах человека как мозг и железы внутренней секреции [3]. Воздействию паров ртути подвергаются не только работники предприятий, где она используется, но и люди, живущие или работающие в загрязненных помещениях, а также люди с амальгамными пломбами [4,5]. В настоящее время достаточно хорошо изучены последствия длительного воздействия лишь высоких концентраций паров ртути (свыше 5 мкг⋅м–3). Это связано с тем, что содержание ртути в традиционных диагностических средах (моча и кровь) плохо отражает полученную ингаляционным путем дозу, особенно, если воздействие длилось менее одного месяца [1,3]. Поэтому представляется важной разработка метода, который позволяет контролировать дневную дозу у работников ртутных производств, а также выявлять пострадавших от кратковременного воздействия паров ртути. Ингаляционное поглощение паров ртути человеком Ингаляционный коэффициент поглощения ((А А)) определяет долю ртути, поглощаеА мую человеком при вдыхании ее паров. Величину этого коэффициента оценивают по результатам измерения концентрации ртути во вдыхаемом (Свд) и выдыхаемом (Свыд) воздухе: А = (Свд – Свыд)/Свд. Зная коэффициент А и концентрацию паров ртути в воздухе, легко найти дозу ртути ( ), получаемую за время ингаляции (τ): (М М=А А⋅Свд ⋅v⋅τ, (1) где v — легочная вентиляция (средний объем воздуха вдыхаемый или выдыхаемый человеком в единицу времени). Ранее установлено, что средняя величина коэффициента ингаляционного поглощения составляет 70–80%, не зависит от концентрации ртути во вдыхаемом воздухе и существенно снижается даже при незначительном содержании этанола в крови [6,7]. Отметим, что эксперименты с добровольцами [6,7] изза низкой чувствительности и недостаточной 271 Новый метод определения дозы ртути, получаемый человеком селективности анализатора проводили только при высоких концентрациях паров Hg во вдыхаемом воздухе (Свд более 50 мкг⋅м–3), а для определения ртути в выдыхаемом воздухе использовали ее накопление в поглотительном растворе. С помощью метода изотопной метки было показано, что после прекращения ингаляционного поступления паров Hg в организм человека в выдыхаемом воздухе еще долго присутствует ртуть, причем ее концентрация снижается по экспоненциальному закону с периодом полувывода (T) около 18 часов [8] Свыд(t) = Совыд exp(–ln(2) t/T) ≈ Совыд exp(–0,04 t), (2) где Совыд и Свыд (t) — остаточные концентрации ртути в выдыхаемом воздухе сразу после прекращения воздействия паров Hg и через время t соответственно. Проинтегрировав по времени и умножив формулу (2) на величину легочной вентиляции (v), можно найти количество ртути (m), m m), выводимое из организма ингаляционным путем: m = Совыд ⋅v⋅⋅T/ln(2). (3) В работе [8] было установлено, что около 7% поглощенной ингаляционным путем дозы выводится через воздух, поэтому М = m/0.07. (4) Так как среднее за сутки значение легочной вентиляции человека известно (v = 0.83 м3⋅час–1) [1], то из формул (3) и (4) легко получить связь дозы ((М М,, мкг) с концентрацией М ртути в выдыхаемом воздухе (Совыд, нг⋅м-3): М = 0.3⋅Совыд. (5) Приведенная выше схема расчета справедлива для случая однократного воздействия паров ртути и при измерении остаточной концентрации сразу после прекращения воздействия. Однако формулу (5) можно легко обобщить. В случае, если у пациента перед воздействием паров осталась концентрация от предыдущего воздействия (С С1выд) или время (t), tt), прошедшее после окончания воздействия ртути до измерения остаточной концентрации Свыд (t), tt), превышает три часа, то для определения дозы следует использо- вать следующую формулу: М = 0.3⋅(Свыд(t)⋅exp(0.04⋅t) – – С1выд ⋅exp(–0.04⋅(t + τ)), (6) где τ — время воздействия ртути. Таким образом, теоретически возможен новый метод определения ингаляционной дозы, основанный на измерении остаточной концентрации ртути в выдыхаемом воздухе. Оценим интервал концентраций, в котором необходимо определять дозы кратковременного воздействия паров ртути. Человек, находящийся 12 часов в помещении с концентрацией паров ртути 300 нг⋅м–3 (ПДК ртути в воздухе для жилых помещений в России), получает дозу около 3 мкг (см. формулу 1). Работники ртутных производств за рабочий день могут получить дозу до 1000 мкг [1]. Таким образом, для определения дозы надо достаточно точно измерять Совыдд в интервале от 10 до 2000 нг⋅м–3 (см. формулу 5). До настоящего времени измерение остаточной концентрации ртути в выдыхаемом воздухе было затруднено из-за отсутствия селективной аппаратуры с широким динамическим диапазоном (от единиц до тысяч нг⋅м–3). Кроме того, методика измерений должна быть достаточно экспрессной, а ее правильность не должна зависеть от частоты, глубины дыхания и влажности выдыхаемого воздуха. Авторы работы [9] для определения ртути в выдыхаемом воздухе создали специальную установку. Ртуть из фиксированного объема выдыхаемого человеком воздуха (от 0.1 до 0.5 л) сначала накапливается в сорбционных трубках, а затем в них с помощью атомнофлуоресцентного анализатора измеряют содержание ртути. Эта установка позволила достичь достаточно низкого предела обнаружения (менее 10 нг⋅м–3) ртути в выдыхаемом воздухе. На нескольких примерах было показано, что остаточная концентрация ртути отражает факт воздействия паров ртути, но в то же время доза ртути не была определена. Следует отметить, что использование сорбционных трубок существенно ограничивает возможности метода, так как для массового обследования населения потребуется большое количество трубок, в которых необходимо контролировать содержание ртути как до, так и после их экспонирования. Наилучшими аналитическими характеристиками обладает предлагаемая методика 272 С.Е. Погарев и соавторы Рис. 1. Временной профиль аналитического сигнала анализатора РА-915+ при определении содержания ртути в выдыхаемом воздухе. Содержание ртути: 1 — в выдыхаемом воздухе при вдыхании атмосферного воздуха лабораторного помещения (11 нг⋅м–3), 2 — в выдыхаемом воздухе при вдыхании атмосферного воздуха, предварительно очищенного от ртути (4.3 нг⋅м–3), 3 — в атмосферном воздухе лабораторного помещения (30 нг⋅м–3). прямых селективных определений содержания ртути в выдыхаемом воздухе. Прямое определение содержания ртути в выдыхаемом воздухе В качестве детектора ртути в данной работе использовался атомно-абсорбционной ртутный анализатор РА-915+ с приставкой РП-91, выпускаемые НПФ «Люмэкс», СанктПетербург [10]. Благодаря высокочастотной зеемановской коррекции неселективного поглощения (неселективная помеха, в 20 раз ослабляющая излучение, не приводит к появлению паразитного сигнала) и многоходовой аналитической кюветы (оптическая длина хода 9.6 м обеспечивает низкий предел обнаружения без накопления ртути на сорбенте) анализатор позволил создать крайне простую и наглядную процедуру определения ртути в выдыхаемом воздухе. Измерения производят в режиме реального времени с визуализацией процесса на дисплее компьютера. Пациент должен сделать 7–10 глубоких выдохов в респираторную трубку со средней объемной скоростью около 4 л⋅мин–1. Выдыхаемый воздух через барботеры (которые ис- пользуются для охлаждения выдыхаемого воздуха, и тем самым устраняется возможность осаждения паров воды на зеркалах кюветы) поступает в многоходовую кювету анализатора (объем кюветы 0.7 л) и далее в атмосферу. Во время первых 3–5 выдохов происходит 5–10-кратный обмен воздуха в кювете, а измерение происходит во время последующих 3–5 выдохов. Средней концентрации ртути в выдыхаемом воздухе соответствует сигнал анализатора, усредненный за 20–40 с. Для контроля нулевого уровня до и после измерения на вход респираторной трубки устанавливают сорбционный фильтр, и в течение 1–2 мин через систему со скоростью 4 л⋅мин–1 прокачивают воздух, не содержащий ртуть. Контроль стабильности градуировки установки и проверку влияния влажности воздуха на результаты измерений проводили с помощью генератора паров ртути (ГПР), позволяющего создавать поток воздуха с известной концентрацией ртути. В эксперименте воздух с заданной концентрацией 160, 1600 и 5200 нг⋅м–3 прокачивали через сосуд, наполовину заполненный водой, а затем воздух поступал в экспериментальную установку. Для изменения температуры и влажности воздуха сосуд с водой нагревали от комнатной температуры до 100 °С. При этом аналитический сигнал не менялся, что свидетельствует об отсутствии влияния температуры и влажности воздуха на результаты анализа во всем исследованном диапазоне концентраций. Важно отметить, что для определения остаточной концентрации ртути в выдыхаемом воздухе содержание ее в воздухе лаборатории, где установлен анализатор, не должно превышать 5–10 нг·м–3; в противном случае пациент должен вдыхать воздух через сорбционный фильтр. Для примера на рис. 1 приведены результаты определения содержания ртути в выдыхаемом воздухе, проводившегося в лаборатории, где концентрация ртути составляла около 30 нг⋅м–3 (пик 3). В промежутках между измерениями через аналитическую систему прокачивали воздух лабораторного помещения, очищенный специальным сорбционным фильтром (нулевой уровень). При вдыхании воздуха через сорбционный фильтр концентрация ртути в выдыхаемом воздухе составила 4.3 нг⋅м–3 (пик 2), а при вдыхании воздуха лаборатории — 11 нг⋅м–3 (пик 1). Такая заметная разница 273 Новый метод определения дозы ртути, получаемый человеком 1 Hg ( ) (V ) ,% V, 0 Рис. 2. Ингаляционное поглощение паров ртути; 1 — содержание ртути в воздухе помещения (260 нг⋅м–3), 2 — содержание ртути в выдыхаемом воздухе у добровольца «П» (55 нг⋅м–3) до употребления алкоголя (ингаляционное поглощение ртути А ≈ 80%), 3 — то же у добровольца «Р» (50 нг⋅м–3), 4 — содержание ртути в выдыхаемом воздухе у добровольца «П» (С = 180 нг⋅м–3) после употребления алкоголя (А ≈ 30%), 5 — то же у добровольца «Р» (С = 210 нг⋅м–3). объясняется тем, что около 20% ртути, поступающей в легкие, выдыхается обратно. Предлагаемая методика позволила быстро, « » « » 77 81 2.5 61 56 5 33 40 7.5 27 34 10 21 30 точно и наглядно определять величину ингаляционного поглощения ртути даже в случае низкой концентрации элемента в воздухе, а также исследовать закономерности поглощения в зависимости от состояния организма. Доля поглощения ртути из воздуха в норме составляет около 80 % и сильно зависит от уровня алкоголя в крови (рис. 2). Данные, приведенные в табл. 1, свидетельствуют, что даже небольшое количество алкоголя в 2–3 раза уменьшает коэффициент поглощения. Увеличение остаточной концентрации ртути в выдыхаемом воздухе (рис. 3) доказывает, что алкоголь ускоряет вывод ртути посредством дыхания после прекращения экспозиции. Этот эффект отмечается практически сразу после приема алкоголя, а его действие продолжается в течение нескольких часов (табл. 2). Разработанная методика позволила впервые проследить спад остаточной кон- Таблица 2 Концентрация ртути в выдыхаемом воздухе (Свыд) в зависимости от времени, прошедшего после употребления небольшого количества алкоголя (10 мл этанола) Рис. 3. Влияние алкоголя на содержание ртути в выдыхаемом воздухе; 1 и 2 — содержание ртути в выдыхаемом воздухе у добровольцев «П» и «Р» до употребления алкоголя, 3 и 4 — то же после употребления алкоголя (10 мл этанола). 274 Свыд, нг⋅м–3 Время, часы Доброволец «П» Доброволец «Р» До 17 15 0.2 55 85 1 70 60 2 33 30 3 15 20 С.Е. Погарев и соавторы Таблица 3 Сопоставление расчетных доз (Мр) и доз (Мо), определенных путем измерения С°выд Мр, мкг С°выд, нг⋅м –3 Мо, мкг Невязка (Δ),% Рис. 4. Содержание ртути (остаточная концентрация) в выдыхаемом воздухе добровольцев в зависимости от времени, прошедшего после воздействия паров ртути: 1 — доброволец «П», 2 — доброволец «Р»; сплошная линия — аппроксимация (уравнение 2). центрации ртути в выдыхаемом воздухе двух добровольцев без использования изотопной метки и накопления ртути на сорбенте. Полученные концентрации в зависимости от прошедшего после экспозиции времени хорошо аппроксимируются экспоненциальной функцией (формула 2) с периодом полувыведения около 17 часов (рис. 4), что практически совпадает с результатами работы [8]. Таким образом, предлагаемый способ измерения содержания ртути в выдыхаемом воздухе полностью удовлетворяет задаче определения ингаляционной дозы ртути. Полное время анализа не превышает трех минут, предел обнаружения составляет 2–3 нг⋅м–3, верхняя граница диапазона измерений — 5000 нг⋅м–3, а воспроизводимость повторных измерений — менее 10%. Определение дозы, полученной при ингаляционном воздействии паров ртути В эксперименте с двумя добровольцами была проведена проверка предложенного авторами метода определения дозы по измерению остаточной концентрации ртути в выдыхаемом воздухе. Кроме того исследовалась возможность использования традиционных диагностических сред (моча и кровь) для оценки полученной дозы. Два добровольца, у которых содержание 7 14 25 29 20 54 84 92 6 16 25 28 –14 +14 0 –3 ртути в выдыхаемом воздухе перед экспериментом не превышало 5 нг⋅м–3, провели три часа в помещении, где поддерживалась заданная концентрация ртути. Первые 1.5 часа концентрация поддерживалась на уровне 10, а вторые — на уровне 15 мкг⋅м–3. Сначала доброволец «П» выполнял работу средней интенсивности с постоянной легочной вентиляцией (v = 20 л⋅мин–1), а доброволец «Р» находился в покое (v = 10 л⋅мин–1); затем (через 1.5 часа) они поменялись местами. Во время эксперимента добровольцы не употребляли алкоголь. В эксперименте все величины, входящие в формулу (1) известны, поэтому можно рассчитать ингаляционные дозы ртути ((Мр), полученные добровольцами. За первые 1.5 часа доброволец «П» получил дозу ртути, равную 14, доброволец «Р» — 7 мкг, а за следующие 1.5 часа — 11 и 22 мкг соответственно. Всего за три часа «П» получил дозу ртути, равную 25, а «Р» — 29 мкг. У добровольцев измерялось содержание ртути в выдыхаемом воздухе до начала эксперимента, во время экспозиции (после 1.5 часов пребывания в загрязненной комнате) и на протяжении восьми дней после экспозиции. В табл. 3 приведены остаточные концентрации ртути в выдыхаемом воздухе, измеренные у добровольцев сразу после экспозиции (Совыд), определенные по ним (формула 5) дозы Мо и расчетные дозы Мр. Невязки между расчетными и измеренными дозами не превышают 15%, что говорит о возможности надежного определения индивидуальной ингаляционной дозы на основании измерения концентрации остаточной ртути в выдыхаемом воздухе. За весь период релаксации ингаляционным путем (рис. 4) из организма добровольцев «П» и «Р» вывелось 1.6 и 1.8 мкг ртути соответственно (формула 3). Это подтверждает установленный в экспериментах с использованием изотопной метки факт [8], 275 Новый метод определения дозы ртути, получаемый человеком Таблица 4 Концентрация ртути (С) в моче до и после эксперимента Число дней Время отбора мочи 5 утро 1.0 0.7 0.6 То же день 0.11 0.18 «Р» утро 1.8 1.8 То же день 0.78 0.55 Доброволец «П» до эксперимента 3 после эксперимента 1 1 3 5 1.1 0.7 1.1 0.12 1.1 0.21 0.10 2.6 1.8 1.1 1.0 0.83 0.95 0.62 1.0 С, мкг⋅л что доля выводимой ртути через дыхание составляет около 6–7% от полученной дозы. Таким образом, результаты эксперимента с добровольцами доказывают, что предложенный метод позволяет определять индивидуальные ингаляционные дозы после кратковременного воздействия паров ртути. Основные достоинства предложенного метода — достоверность и простота. Этот метод не требует знания величин, которые обычно неизвестны (концентрация ртути во вдыхаемом воздухе, время ингаляции, легочная вентиляция и содержание этанола в крови). Применение метода ограничено, если пациент имеет амальгамные пломбы, которые являются постоянно действующим источником высокого содержание ртути в выдыхаемом воздухе [11], а также, если во время измерения остаточной концентрации ртути в крови пациента присутствует этанол. До и после экспозиции у добровольцев был проведен отбор мочи (утренней и дневной) и венозной крови. Концентрацию ртути в пробах мочи и крови определяли методом холодного пара с пределом обнаружения не выше 0.1 мкг⋅л ⋅ –1 [4]. ⋅л Оказалось, что до и после экспозиции концентрация ртути в крови добровольцев оставалась постоянной (у «П» — 3.5 мкг⋅л ⋅ –1, ⋅л у «Р» — 6.5 мкг⋅л ⋅ -1). По результатам изме⋅л рения концентрации ртути в моче (табл. 4) также невозможно выявить не только полученную добровольцами дозу, но и сам факт воздействия паров ртути. Проведено изучение эритроцитов крови добровольцев в сканирующем режиме электронного микроскопа (метод Эритротест [12]). Этот метод позволяет по изменению конфигурации эритроцитов, по их способности к агглютинации и по состоянию сопровождающей плазмы крови проводить дифферен- –1 циальную диагностику аллергопатологий, включая действие тяжелых металлов (ртуть, свинец, кобальт и др.). Образцы крови обезвоживают в спиртах возрастающей крепости, высушивают до критической точки диоксида углерода и напыляют золотом, после чего их просматривают в электронном микроскопе (увеличение в 1000–4000 раз) и фотографируют (рис. 5). Статистический анализ распределения эритроцитов по формам (от нормоцитов до распадающихся дегенерировавших клеток) производят из расчета 200 клеток на образец. В табл. 5 приведено относительное содержание основных форм эритроцитов в крови добровольцев до и после воздействия паров ртути. Приведенные данные свидетельствуют, что у обоих добровольцев после воздействия паров ртути (поглощенная доза около 20 мкг) существенно повысилась доля незрелых нормоцитов (нормоциты с диаметром менее 6 мкм называются микроцитами), а также отмечалась слабая тенденция к снижению нормальных и функционально измененных форм эритроцитов (нормоциты и стоматоциты) за счет увеличения различных дегенерирующих и дегенеративных форм (эхиноциты, тороциты, овалоциты и др.). Следует отметить, что оба добровольца ранее в силу своей профессиональной деятельности периодически находились в контакте со ртутью. Поэтому существенное превышение нормального уровня дегенеративных форм эритроцитов у добровольцев даже до воздействия паров ртути, вероятно, было обусловлено микромеркуализмом (хроническим отравлением микродозами ртути). По нашим данным, микроцитоз и нарушение реологических свойств крови, вызванное повышенной агглютинацией эритроцитов и потерей пластических свойств их мембран, явля276 С.Е. Погарев и соавторы Рис. 5. Фотографии эритроцитов добровольца «П» (увеличение в 4000 раз) до (1) и после (2) воздействия паров ртути. Таблица 5 Содержание основных форм эритроцитов в крови (%) до и после воздействия паров ртути Доброволец «П» Формы эритроцитов Доброволец «Р» В норме До воздействия После воздействия До воздействия После воздействия Нормоциты и стоматоциты > 90 70 65 64 62 Дегенериующие и дегенеративные формы < 10 30 35 36 38 Микроциты < 11 10 23 12 20 ются первичными следствиями ртутной интоксикации. Заключение Предлагаемый метод ртутной дозиметрии позволяет быстро и надежно определять полученные ингаляционным путем дозы, начиная с единиц мкг, что подтверждено результатами эксперимента, проведенного на двух добровольцах. В то же время традиционные методы (определение содержания ртути в моче или крови) не позволили выявить даже факт воздействия паров ртути на добровольцев. Показано, что кратковременное воздействие паров ртути (поглощенная доза около 20 мкг) приводит к существенному повышению доли микроцитов в крови. Подтверждены следующие ранее установленные закономерности поглощения паров ртути человеком: коэффициент поглощения равен 80% и снижается в 2–3 раза при наличии этанола в крови, период полувыведения ртути из организма составляет около 17 часов, через дыхание выводится около 7% ртути, полученной ингаляционным путем. Литература 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 277 Критерии санитарно-гигиенического состояния окружающей среды. Ртуть (1979) Женева: ВОЗ, 148 с. Ртуть: экологические аспекты применения (1992) Женева: ВОЗ, 127 с. Falnoga I., Tusek-Znidaric M., Horvat M. and Stegnar P. (2000) Mercury, selenium and cadmium in human autopsy samples from Idrija residents and mercury mine workers. Environ. Res. A84, 211–218. Погарев С.Е., Рыжов В.В., Древаль Т.В. и Машьянов Н.Р. (1994) Использование зеемановского спектрометра для определения ртути в моче. Журн. экологич. химии. 3, 227–231. Barregard L., Sallsten G. and Jarvholm B. (1995) People with high mercury uptake from their own dental amalgam fillings. Occup. and Environ. Med. 52, 124–128. Kudsk F.N. (1965) Absorption of mercury vapor from the respiratory tract in man. Acta Pharmacol. et toxicol. 23, 250–262. Kudsk F.N. (1965) The influence of ethyl alcohol on the absorption of mercury vapor from the lungs in man. Acta Pharmacol. et toxicol. 23, 263–274. Hurh J.B., Clarkson T.W., Cherian M.G., Vostal Новый метод определения дозы ртути, получаемый человеком J.J. and Mallie R.V. (1976) Clearance of mercury (Hg-197, Hg-203) vapor inhaled by human subjects. Arch. Environ. Health. 31, 302–309. 9. Sallsten G. and Nolkrantz K. (1998) Determination of trace amounts of mercury vapour in humid air: Performance of gold traps in an atomic fluorescence system. Analyst. 123, 665–668. 10. Ганеев А.А., Шолупов С.Е. и Сляднев М.Н. (1996) Зеемановская модуляционная поляризационная спектрометрия как вариант атомноабсорбционного анализа: возможности и огра- ничения. Журн. аналит. химии. 51, 855–864. 11. Halbach S., Kremers L., Willruth H., Mehl A., Welzl G., Wack F, Hickel R. and Greim H. (1997) Compartmental transfer of mercury released from amalgam. Human and Experimental Toxicology. 16, 667–672. 12. Жарская В.Д. и Семенов А.В. (1996) Эритротест — метод дифференциальной диагностики интоксикации тяжелыми металлами. В кн.: Ртуть. Комплексная система безопасности. Материалы конференции. СПб., с. 32–39. 278