Влияние допамина на ионорегулирующую функцию почек в
advertisement
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Оренбургский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Ландарь Лариса Николаевна ВЛИЯНИЕ ДОПАМИНА НА ИОНОРЕГУЛИРУЮЩУЮ ФУНКЦИЮ ПОЧЕК В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ 14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Кузьмин Олег Борисович доктор медицинских наук, профессор Оренбург – 2015 2 Оглавление Введение…………………………………………………………………………... 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………… 11 1.1. Роль простагландиновой, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем в контроле ионорегулирующей функции почек…………………………………………………………….... 11 1.1.1.Простагландиновая система почек………………………………….. 11 1.1.2. Калликреин-кининовая система почек…………………………….. 16 1.1.3. Ренин-ангиотензиновая система почек……………………………. 22 1.2. Участие почечной дофаминергической системы в регуляции транспорта натрия в канальцах почек…………………………………….. 30 1.3. Влияние дофамина на ионорегулирующую функцию почек……….….. 34 1.4. Заключение……………………………………………………………..….. 37 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………….. 39 Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………………. 44 3.1. Влияние допамина и антагониста D-дофаминовых рецепторов галоперидола на ионорегулирующую функцию почек крыс…………… 44 3.2. Взаимодействие допамина в почке крыс с ингибитором синтеза простагландинов диклофенаком натрия………………………………….. 49 3.3. Взаимодействие допамина в почке крыс с ингибитором калликреин-кининовой системы контрикалом…………………………... 54 3.4. Влияние ингибиторов системы ренин-ангиотензин эналаприла, лозартана и алискирена на реакцию почек крыс при действии допамина……………………………………………………………………. 57 3.5. Взаимодействие допамина с петлевым диуретиком фуросемидом в почке крыс с моделью сердечной недостаточности……………………... 66 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………… 72 ВЫВОДЫ………………………………………………………………………….. 82 3 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………………….. 83 Список сокращений………………………………………………………………. 84 Список литературы……………………………………………………………….. 86 4 Введение Актуальность темы исследования и степень ее разработанности Дофаминомиметик допамин, идентичный естественному медиатору дофамину, является лекарственным препаратом, который широко используется для лечения кардиогенного шока и острой сердечной недостаточности, включая острый кардиоренальный синдром, возникающий у лиц с острой декомпенсированной ХСН [16, 22]. В этих условиях допамин оказывает благоприятное влияние на почки, способствуя не только восстановлению почечной гемодинамики, но и увеличению диуреза и выделения с мочой электролитов, которое препятствует избыточной задержке жидкости и быстрому ухудшению клинического состояния больных. Благоприятное действие допамина на ионорегулирующую функцию почек связано с прямой стимуляцией D1-дофаминовых рецепторов, которые располагаются в гладкой мускулатуре почечных сосудов, гломерулярных артериолах, клетках проксимальных канальцев и других сегментов нефрона. При их возбуждении развивается выраженная диуретическая реакция, обусловленная, прежде всего, угнетением реабсорбции натрия в проксимальных канальцах, которое возникает в ответ на подавление активности апикального Na+/H+-ионообменника 3 типа (NHE3) и Na+, K+-АТФ-азы, локализованной в базолатеральных мембранах канальцевых клеток [45, 60]. Однако, несмотря на глубокую разработку современных представлений о дофаминергической регуляции функции почек, многие стороны действия допамина на почки изучены недостаточно или совсем не исследованы. Это касается возможного участия в механизме формирования сосудистого и канальцевого эффектов допамина ренин-ангиотензиновой системы и других почечных нейрогуморальных систем, которые участвуют в регуляции транспорта ионов в проксимальных канальцах и других сегментах нефрона. Их роль в механизме действия допамина на почки не исследована, хотя выяснение этого вопроса имеет существенное 5 значение не только для уточнения фармакодинамики этого препарата, но и оценки характера его взаимодействия в почках с ингибиторами РАС и других нейрогуморальных систем, которые широко применяются в кардиологической практике. Недостаточно исследованы также особенности фармакодинамического взаимодействия допамина в почках с фуросемидом и другими петлевыми диуретиками, которые применяются в комбинации с этим препаратом у больных с декомпенсированной ХСН для восстановления диуреза и устранения избыточной задержки жидкости в организме. В настоящей работе проведен фармакологический анализ роли простагландиновой, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем в механизме формирования почечных эффектов допамина и исследованы особенности его взаимодействия с диуретиком фуросемидом в почках крыс с моделью сердечной недостаточности. Цель исследования Цель работы – выяснение роли почечных нейрогуморальных систем в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек и оценка характера его фармакодинамического взаимодействия в почках с петлевыми диуретиками при экспериментальной сердечной недостаточности. Задачи исследования Для достижения поставленной цели решались следующие задачи. 1. Исследовать влияние дофаминомиметика допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс. 2. Оценить влияние антагониста D-дофаминовых рецепторов галоперидола на реакцию почек крыс в ответ на допамин. 3. Изучить влияние специфических ингибиторов простагландиновой системы (диклофенак натрия), калликреин-кининовой системы (контрикал) и ренинангиотензиновой системы (эналаприл, лозартан, алискирен) на ионорегулирующую функцию почек крыс при действии допамина. 4. Исследовать фармакодинамическое взаимодействие допамина с петлевым диуретиком фуросемидом в почке крыс с экспериментальной сердечной недоста- 6 точностью, вызванной длительным воздействием на сердце избыточной физической нагрузки и больших доз адреномиметика фенилэфрина. Методология и методы исследования Для фармакологической оценки роли почечных простагландиновой, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем в механизме действия дофаминомиметика допамина на ионорегулирующую функцию почек и изучения его взаимодействия в почках с фуросемидом при ЭСН использованы различные методические подходы. В экспериментах на 90 наркотизированных крысах-самцах с помощью специфических ингибиторов D-дофаминовых рецепторов (галоперидол), простагландиновой системы (диклофенак натрия), калликреин-кининовой системы (контрикал) и РАС (эналаприл, лозартан, алискирен) проведен фармакологический анализ роли D-дофаминовых рецепторов и указанных нейрогуморальных систем в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек. Для этого животным первоначально вводили ингибиторы с целью подавления активности соответствующих нейрогуморальных систем, а затем в течение 80-90 мин изучали динамику показателей ионорегулирующей функции почек в ответ на допамин. Функциональное состояние почек крыс оценивалось по величине клиренса инулина, отражающего СКФ, величине диуреза, выделении с мочой ионов натрия и калия, экскретируемой фракции натрия, характеризующей его реабсорбцию в канальцах почек, и отношению натрий/калий мочи. Каждый опыт ставился на одном животном. Всего выполнено 90 экспериментов (9 серий опытов). В экспериментах на 22 интактных крысах-самцах и животных с ЭСН, вызванной длительным действием на сердце избыточной физической нагрузки и больших доз адреномиметика фенилэфрина [6, 20], исследованы особенности фармакодинамического взаимодействия в почках допамина с петлевым диуретиком фуросемидом. Влияние препаратов на ионорегулирующую функцию почек крыс изучалось на фоне 3% водной нагрузки с добавлением 0,6% хлорида натрия. С этой целью животные после солевой нагрузки и введения препаратов помещались в индивидуальные плексигласовые боксы для сбора мочи. Моча собиралась 7 через каждые 1,5 часа в течение 4,5 часов. Функция почек оценивалась по величине диуреза, выделению с мочой креатинина, отражающему уровень СКФ, экскреции с мочой ионов натрия и калия и отношению натрий/калий мочи. Всего выполнено 60 экспериментов (6 серий опытов). Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора Научные положения, выводы и рекомендации диссертации основаны на анализе достаточного объема фактических данных, избранном дизайне и использовании современных методов оценки ионорегулирующей функции почек, адекватных сформулированным в работе целям и задачам. В работе использовались сертифицированные отечественные и импортные лекарственные препараты, позволившие получить достоверные данные о механизме формирования их почечных эффектов. Статистическая оценка результатов исследования проведена с использованием современных компьютерных методик обработки исходных количественных показателей. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы в материалах Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (г. Барнаул, 2011) Всероссийских конференций молодых ученых и специалистов Оренбургской области (г. Оренбург, 2012, 2013 гг.), Всероссийской научно-практической конференции «Нанотехнологии в фармакологии и медицине» (г. Оренбург, 2012 г.). Результаты исследований представлены в материалах Российского национального конгресса кардиологов (г. Москва, 2011, 2012 г.), Московского международного форума кардиологов (г. Москва, 2013, 2014 гг.) и IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (г. Казань, 2012 г.). По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, включая 4 журнальные статьи. Из них – 7 публикаций (3 статьи и 4 тезиса) в научных журналах, включенных в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. 6 работ опубликовано в материалах всероссийских и международных конференций. Апробация работы состоялась на расширенном заседании кафедры фарма- 8 кологии с участием сотрудников кафедры патологической физиологии, кафедры патологической анатомии, кафедры биохимии, кафедры клинической лабораторной диагностики, кафедры управления и экономики фармации, фармтехнологии и фармакогнозии ГБОУ ВПО «ОрГМУ» Минздрава России. Автор непосредственно участвовал в выполнении диссертации на всех этапах работы. Основная идея, задачи, дизайн исследования, его методология и общая концепция определялись совместно с научным руководителем д.м.н., профессором О.Б. Кузьминым. Анализ современной отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, экспериментальные исследования, статистическая обработка первичных данных, их анализ, написание и оформление диссертации, представление результатов работы в виде научных публикаций и докладов на конференциях осуществлялись лично соискателем. Соавторы к.м.н. М.О. Пугаева и к.м.н. Н.В. Бучнева оказывали консультативную помощь при подготовке ряда публикаций. Положения выносимые на защиту 1. Допамин увеличивает скорость клубочковой фильтрации и тормозит у крыс реабсорбцию натрия в почках, вызывая выраженную диуретическую реакцию с одновременным увеличением выделения натрия и калия с мочой. Реакция почек крыс на допамин устраняется антагонистом D-дофаминовых рецепторов галоперидолом. 2. Почечные простагландиновая и калликреин-кининовая системы не участвуют в механизме, опосредующем действие допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс. 3. Почечная ренин-ангиотензиновая система препятствует ингибирующему действию допамина на реабсорбцию натрия в почках, ослабляя его диуретический, натрийуретический и калийуретический эффекты. 4. Допамин улучшает у крыс с моделью сердечной недостаточности, вызванной избыточной физической нагрузкой и введением больших доз адреномиметика фенилэфрина, ионорегулирующую функцию почек и значительно усиливает при добавлении к диуретику фуросемиду его диуретический эффект, способ- 9 ствуя дополнительному увеличению выделения натрия с мочой и повышению отношения натрий/калий мочи. Научная новизна Впервые в экспериментах с ингибитором простагландиновой системы диклофенаком натрия и ингибитором калликреин-кининовой системы контрикалом показано, что эти нейрогуморальные системы не участвуют в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс. Впервые в опытах с ингибиторами РАС эналаприлом, лозартаном и алискиреном установлено, что почечная ренин-ангиотензиновая система непосредственно включается в механизм действия допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс, выполняя функцию модулятора, препятствующего при действии этого дофаминомиметика избыточной потере воды и электролитов с мочой. В экспериментах на крысах с ЭСН, вызванной избыточной физической нагрузкой и введением больших доз адреномиметика фенилэфрина, впервые выявлено, что допамин при добавлении к диуретику фуросемиду не только значительно усиливает его диуретическое действие, но и вызывает преимущественное повышение потери натрия с мочой, способствуя существенному увеличению отношения натрий/калий мочи. Теоретическая и практическая значимость работы В экспериментах на крысах уточнена роль простагландиновой, калликреинкининовой и ренин-ангиотензиновой систем в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек и выяснены особенности его фармакодинамического взаимодействия в почках с ингибиторами АПФ, антагонистами АТ1ангиотензиновых рецепторов и прямыми ингибиторами ренина, которые широко применяются для лекарственной терапии ХСН. На крысах с моделью сердечной недостаточности уточнены также особенности совместного влияния на ионорегулирующую функцию почек допамина и диуретика фуросемида, комбинация которых широко применятся для устранения рефрактерности к диуретикам у лиц с декомпенсированной ХСН. Практическое значение результатов исследования определяется выяснением 10 особенностей фармакодинамического взаимодействия в почках допамина с ингибиторами синтеза простагландинов, кининов, различными по механизму действия ингибиторами РАС и диуретиком фуросемидом, которые необходимо учитывать при совместном назначении этих препаратов в клинике. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре фармакологии и кафедре пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России. 11 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Роль простагландиновой, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем в контроле ионорегулирующей функции почек Почки являются главным органом, который обеспечивает сохранение водно-электролитного баланса организма, необходимого для поддержания адекватного объема внеклеточной жидкости, АД крови и кровоснабжения органов и тканей организма. В почках происходит постоянное противодействие двух групп нейрогуморальных систем, контролирующих тонус сосудов коры, включая артериолы клубочков, мозгового слоя и транспорт натрия и других ионов в проксимальных канальцах, ТВКПГ и других отделах нефрона. Главную роль в этом нейрогуморальном механизме играют СНС, циркулирующая РААС и почечная тканевая РАС, которым противодействуют сосудорасширяющие натрийуретические нейрогуморальные системы, угнетающие реабсорбцию натрия в нефроне и препятствующие его избыточной задержке в организме. Главными функциональными антагонистами сосудосуживающих антинатрийуретических нейрогуморальных систем являются натрийуретические пептиды, адреномедуллин, выделение которых в кровь зависит от функционального состояния сердца, сосудистой системы и объема внеклеточной жидкости. В контроле ионорегулирующей функции почек непосредственно участвуют также почечные простагландины, кинины и дофаминовая система почек. 1.1.1. Простагландиновая система почек Простагландины представляют собой главную разновидность простаноидов, являющихся метаболитами широко распространенных полиненасыщенных жирных кислот. Основным ферментом, контролирующим образование этих биологи- 12 чески активных веществ, является фосфолипаза А2, которая высвобождает арахидоновую кислоту из фонда мембранных фосфолипидов (рисунок 1.1). Последующие процессы преобразования арахидоновой кислоты связаны с участием циклооксигеназы (простагландинсинтазы G2/H2) и других специфических ферментов, которые синтезируют в клетках 5 основных биологически активных простаноидов ПГЕ2, ПГI2, ПГD2, ПГF2α и ТХА2 [30]. Сейчас установлено существование двух изоферментов циклооксигеназы, ЦОГ-1 и ЦОГ-2, которые синтезируются различными генами и отличаются особенностями экспрессии и регуляции. ЦОГ-1 является «конститутивной» циклооксигеназой и весьма широко распространена в различных органах и тканях. ЦОГ-2 обозначается термином «индуцируемая», так как в обычных условиях слабо экспрессирована, но активируется под влиянием провоспалительных и/или пролиферативных цитокинов [37]. В почках конститутивная ЦОГ-1 экспрессирована в эндотелиальных клетках сосудов, включая гломерулярные афферентные артериолы, мезангиальных клетках клубочков и клетках собирательных трубок коры и, особенно, мозгового вещества [66]. Матричная информационная РНК и сам белок ЦОГ-2 выявляются в относительно небольших количествах в клетках macula densa (плотного пятна) ЮГА, прилегающих к ним клетках ТВКПГ и интерстициальных клетках внутреннего мозгового слоя почек [51]. Образующиеся под влиянием этих циклооксигеназ простаноиды специфически стимулируют простаноидные рецепторы клеток, которые обозначаются как ЕР (для Е-простаноидов), IP, DP, FP и ТР-рецепторы соответственно для каждой их отдельной разновидности. Функциональные сдвиги, возникающие в клетках-мишенях при возбуждении простаноидных рецепторов, определяется их сопряжением со стимулирующими (Gs) или ингибирующими (Gi) G-белками. EP2, EP4, IP и DP-рецепторы сопряжены с Gs- белками и опосредуют эффекты, связанные с активацией аденилатциклазы и увеличением содержания в клетках цАМФ. ЕР3-рецепторы специфически взаимодействуют с Gi-белками и поэтому, напротив, оказывают ингибирующее влияние на внутриклеточную продукцию этого биологически активного вещества [38]. Простагландины в основном синтезируются в почках, где их продуцируется 13 Рисунок 1.1. - Циклооксигеназный путь метаболизма основных продуктов арахидоновой кислоты. ПГЕ2 – простагландин Е2, ПГI2 – простагландин I2, ТХА2 – тромбоксан А2. ЕР, IP, FP и ТР – простаноидные рецепторы различных подтипов. 14 примерно в 10 раз больше, чем в других органах. Этот процесс наиболее активно происходит в интерстициальных клетках внутренней зоны мозгового вещества, липидные гранулы которых содержат большое количество предшественников этих биологически активных веществ. Другой основной источник образования простагландинов в почках – клетки собирательных трубок, локализованных в этой же зоне почечной ткани. В обычных условиях эти клетки продуцируют ПГЕ 2 и небольшое количество ПГF2α. Скорость и количество продуцируемых простагландинов в коре почек значительно ниже, чем в мозговом веществе, хотя ПГЕ2 синтезируется в биологически активных количествах в клубочках и клетках собирательных трубок, локализованных в корковом слое почек. Эндотелиальные клетки сосудов коры, клубочковых артериол и гломерулярных капилляров продуцирует преимущественно ПГI2, который, подобно ПГЕ2, обладает выраженными сосудорасширяющими свойствами. Простагландины, синтезируемые в почках, весьма нестойки и практически полностью разрушаются после однократного прохождения через легочный круг кровообращения. Благодаря этому их биологические эффекты развиваются локально и ограничиваются местом образования в клетках различных структур почечной ткани. Синтезируемые в почках простагландины играют важную роль в регуляции почечной микроциркуляции. Наиболее чувствительными к ним оказались прямые сосуды (vasa recta) мозгового вещества почек, в гладких мышцах которых локализованы в основном ЕР2, ЕР4 и IP-подтипы простаноидных рецепторов, опосредующие сосудорасширяющее действие этих биологически активных веществ. В связи с этим ПГЕ2 и ПГI2, генерируемые эндотелиальными клетками и интерстициальными клетками мозгового вещества, обеспечивают поддержание адекватного уровня медуллярного кровотока и снабжения кислородом этой зоны почечной ткани при состояниях и заболеваниях, связанных с гиперактивностью РААС и других сосудосуживающих нейрогормональных систем. Сейчас установлено, что компенсаторные сосудорасширяющие возможности ПГЕ2, продуцируемого эндотелием сосудов коры почек в значительной степени ограничены благодаря высо- 15 кой плотности в их гладкомышечных клетках ЕР1-рецепторов и, особенно, ЕР3рецепторов, которые опосредуют сосудосуживающее действие простаноидов [25]. Основным ПГ, синтезируемым в почках, является ПГЕ2, который продуцируется в клетках различных сегментов нефрона и действует как аутокринный фактор, регулирующий транспорт натрия и других ионов. К настоящему времени установлено, что он продуцируется в проксимальных канальцах, клетках ТВКПГ, но в наибольших количествах образуется в эпителиальных клетках собирательных трубок, локализованных в мозговом и корковом веществе почечной ткани [26] . В кортикальных собирательных трубках ПГЕ2 специфически возбуждает ЕР2рецепторы клеточных мембран, активирует внутриклеточный АЦ/цАМФ сигнальный путь и прямо тормозит транспорт натрия, ингибируя активность Na+, K+- АТФ-азы, локализованной в базолатеральных мембранах канальцевых клеток [107]. Ряд данных свидетельствует о том, что в клетках проксимальных канальцев ПГЕ1 способен оказывать стимулирующее влияние на Na+, K+-АТФ-азу базолатеральных мембран и повышать эффективность механизма, транспортирующего натрий в этом сегменте нефрона [57]. Особую роль в поддержании функционального состояния почек играет ПГЕ2, который в больших количествах синтезируется интерстициальными клетками мозгового слоя. Благодаря своим свойствам он не только поддерживает адекватный объем медуллярного кровотока, необходимого для нормального функционирования механизма концентрирования мочи, но и одновременно препятствует стимуляции реабсорбции натрия и воды в тех сегментах нефрона, которые, располагаются в этой зоне почечной ткани. Так, взаимодействуя с ЕР2рецепторами клеток собирательных трубок и медуллярной части ТВКПГ, ПГЕ 2 тормозит реабсорбцию натрия, предотвращая его задержку в организме при избыточном потреблении поваренной соли или под влиянием повышенной активности РААС и других сосудосуживающих нейрогуморальных систем [36]. Таким образом, ПГЕ2, являясь одним из основных звеньев сосудорасширяющей натрийуретической простагландиновой системы, выполняет в почках функцию модулятора, который препятствует избыточному влиянию на них СНС, 16 РААС и других сосудосуживающих нейрогуморальных систем, увеличивающих реабсорбцию натрия и задерживающих его организме. 1.1.2. Калликреин-кининовая система почек Брадикинин, главный эффекторный пептид калликреин-кининовой системы, синтезируется в плазме крови и в тканях организма под влиянием специфических кининогеназ и некоторых других протеолитических факторов из предшественников кининогенов, находящихся в крови, лимфе и ткани других органов (рисунок 1.2). Высокомолекулярный кининоген плазмы крови, синтезируемый в печени, существенно отличается по своим иммунологическим и другим свойствам от низкомолекулярного кининогена, продуцируемого клетками почек и некоторых тканей. Основными кининообразующими ферментами являются плазменный и железистый (тканевой) калликреины, представляющие собой протеазы, также отличающиеся иммунологическими, биохимическими и функциональными свойствами. Железистый калликреин, наибольшее содержание которого обнаружено в почках, слюнных железах, кишечнике и поджелудочной железе, выполняет роль тканевой кининогеназы и в обычных условиях генерирует образование в тканях лизилбрадикинина (каллидина) и брадикинина, обладающего более высокой биологической активностью. Биологические эффекты, возникающие под их влиянием, обусловлены возбуждением преимущественно В2-кининовых рецепторов, которые постоянно экспрессированы в мембранах различных клеток и опосредуют свое действие через увеличение продукции эндотелиального гиперполяризующего фактора (EDHF), NO и/или ПГI2 (простациклина). При повреждении тканей наблюдается не только увеличение продукции этих кининов, но и избыточная генерация патологически активных лиз-дез-Арг (9)-брадикинина и дез-Арг (9)- брадикинина, синтезируемых соответственно из лизил-брадикинина (каллидина) и брадикинина с учаcтием различных карбоксипептидаз. Реализация специфических эффектов этих вторичных кининов связана в основном со стимуляцией патологических В1-кининовых рецепторов, которые дополнительно экспрессируются в 17 Рисунок 1.2. - Основные звенья плазменной и тканевой калликреин-кининовых систем [104] 18 мембранах клеток поврежденных и воспаленных тканей под влиянием IL1β и различных провоспалительных цитокинов [41, 58, 70]. Для брадикинина, генерируемого в плазме крови и стенке сосудов, характерно мощное вазодилатирующее действие, которое связано с возбуждением В2кининовых рецепторов и увеличением продукции NO и ПГI2 в эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудов. Однако выраженность его сосудорасширяющего действия неодинакова в разных зонах почечной ткани. Результаты, полученные при введении брадикинина в почечную артерию и корковое вещество почек, показывают, что наибольшей чувствительностью к нему отличаются сосуды наружной и, особенно, внутренней зоны мозгового слоя, в которых наблюдается значительный прирост локального почечного кровотока. Поскольку сосуды коры почек, включая афферентные артериолы клубочков, слабо реагируют на брадикинин, при его введении отмечаются лишь минимальные и изменения СКФ и общего почечного кровотока. В связи с этим предполагается, что калликреинкининовая система сосудов участвует преимущественно в регуляции почечной микроциркуляции в мозговом слое почек и связанной с ней контроле выраженности прессорного натрийуреза и системного АД [82, 110]. В формировании почечных эффектов существенное значение имеет взаимодействие циркулирующей (плазменной) и почечной тканевой калликреинкининовой систем с ренин-ангиотензиновой системой. Ключевую роль в этом процессе играет АПФ, который одновременно выполняет функцию кининазы II, инактивирующей брадикинин до брадикинина 1-5, обладающего низкой биологической активностью. В ситуациях, связанных с активацией РАС и АПФ, некоторые эффекты, вызванные избыточным влиянием ангиотензина II на АТ 1ангиотензиновые рецепторы, усиливаются благодаря вторичному угнетению калликреин-кининовой системы. При назначении ингибиторов АПФ, напротив, наблюдается повышение активности калликреин-кининовой системы, которое включается в механизм сосудорасширяющего действия этой группы лекарственных препаратов (рисунок 1.3). Связующим звеном между тканевой калликреин-кининовой системой и 19 Рисунок 1.3. - Взаимодействие между калликреин-кининовой и ренинангиотензиновой системами [104] АПФ – ангиотензин I-превращающий фермент, NO – оксид азота, ПГI1 – простагландин I1 (простациклин). 20 РАС выступет также калликреин, который не только запускает процессы, связанные с метаболизмом кининогена и образованием, но и участвует совместно с АПФ и химазами в превращении ангиотензиногена в ангиотензин II, ключевой эффекторный пептид РАС [34]. Тканевая калликреин-кининовая система почек располагается по длиннику двух сегментов нефрона: от macula densa ЮГА до конечной части дистального извитого канальца и от связующего отдела до начала собирательных трубок коркового слоя. Основными клетками, продуцирующими калликреин в этих сегментах нефрона, являются соединительные клетки, хотя источник образования в них железистого калликреина окончательно не установлен. Предполагается, что железистый прекалликреин образуется главным образом в клеточном эндоплазматическом ретикулуме, откуда транспортируется с помощью аппарата Гольджи к апикальным и базолатеральным мембранам канальцевых клеток для дальнейшей активации катепсинами лизосом и другими протеолитическими ферментами. Образующийся железистый калликреин функционирует в клетках как эктоэнзим, активные центры которого располагаются на наружной поверхности цитоплазматических мембран и генерируют образование кининов из низкомолекулярного кининогена не только в просвете нефрона, но и в интерстициальной жидкоссти, омывающей базолатеральные мембраны и прилегающие к ним околоканальцевые капилляры. Синтезируемые в почках брадикинин и другие активные кинины действуют в месте образования, так как быстро разрушаются тканевыми кининазами, главным образом АПФ, который одновременно выполняет функцию кининазы II, метаболизирующей кинины до неактивных пептидов [116. 117]. Данные о роли калликреин-кининовой системы в контроле ионорегулирующей функции почек неоднозначны, хотя в апикальных и базолатеральных мембранах клеток проксимальных канальцев и, особенно, клеток ТВКПГ и собирательных трубок выявлена высокая плотность В2-кининовых рецепторов. Большинство полученных результатов указывает на то, что возбуждение брадикинином рецепторов этого подтипа на фоне обычной солевой диеты оказывает ингибирующее влияние на транспорт натрия в проксимальных и, особенно, дисталь- 21 ных сегментах нефрона. Наиболее выраженный ингибирующий эффект наблюдается в ТВКПГ и собирательных трубках коры и мозгового вещества [49, 61]. Стимуляция В2-кининовых рецепторов брадикинином сопровождается достаточно выраженной диуретической реакцией с увеличением выделения натрия с мочой, которая не зависит от влияния брадикинина на СКФ и кровоснабжение различных зон почечной ткани [56, 108]. Экспериментальные данные, полученные на крысах с генетическим отсутствием В2-кининовых рецепторов, показывают, что перевод таких животных на диету с избыточным содержанием хлорида натрия ведет, в отличие от обычных крыс, к задержке жидкости в организме, повышению чувствительности периферических сосудов к норадреналину и ангиотензину II и формированию чувствительной к соли артериальной гипертонии. С учетом этого высказано предположение, что при обычном или повышенном потреблении соли калликреин-кининовая система функционирует в почке как физиологический модулятор, препятствующий избыточной задержке натрия в организме [63]. Предполагается, что ингибирующее действие брадикинина на транспорт натрия в дистальных сегментах нефрона может быть связано с В2-кининовыми рецепторами, возбуждение которых сопровождается стимуляцией фосфолипазы С и активацией внутриклеточного каскада, вызывающего снижение проницаемости Na+-каналов апикальных мембран канальцевых клеток [76]. Сейчас становится все более очевидным, что почечная тканевая калликреин-кининовая система является, по-видимому, одним из гуморальных механизмов, которые включаются также в быструю адаптацию почек к избыточному поступлению калия в организм. Об этом говорит наличие тесной корреляция между экскрецией с мочой калия и калликреина после острой нагрузки калием, развитие гиперкалиемии после введения калия мышам с генетическим дефектом почечного тканевого калликреина и нарушение у таких животных активности Н +, К+-АТФазы клеток собирательных трубок, коркового слоя, которая осуществляет транспорт ионов калия в дистальных сегментах нефрона [42]. Таким образом, сосудистая калликреин-кининовая система почек обладает выраженным сосудорасширяющим действием, обусловленным возбуждением со- 22 судистых В2-кининовых рецепторов. Почечная тканевая калликреин-кининовая система, локализованная в клетках дистальных сегментов нефрона, оказывает влияние на ионорегулирующую функцию почек, однако направленность ее действия пока недостаточно ясна. 1.1.3. Ренин-ангиотензиновая система почек Ренин-ангиотензиновая система является нейрогуморальной паракринной, аутокринной и интракринной (внутриклеточной) системой, которая регулирует гомеостаз натрия и АД в организме. Функционально она делится на классическую (циркулирующую в крови) РААС и тканевые РАС, функционирующие в почках, сердце и других органах. В почке основным местом синтеза ренина являются гранулированные клетки ЮГА, располагающиеся в стенке афферентных артериол клубочков, с которыми они образуют единый функциональный комплекс. Первоначально ренин синтезируется в виде препроренина в эндоплазматическом ретикулуме и перемещается с помощью аппарата Гольджи в специальные гранулы, где хранится до выделения в виде проренина. Процесс секреции ренина и проренина в кровь и интерстиций, окружающий афферентные артериолы происходит путем экзоцитоза благодаря слиянию мембран гранул с цитоплазматической мембраной клеток, продуцирующих ренин. Секреция ренина клетками ЮГА регулируются механизмом, включающим 3 компонента: барорецепторы афферентных артериол, рецепторы плотного пятна (macula densa), чувствительные к изменению доставки с ионов натрия и хлора, и специфическим нейрогуморальным механизмом, эффекторные звенья которого локализованы непосредственно в цитоплазматической мембране гранулярных клеток. Важным звеном этого механизма являются β1-адренорецепторы гранулярных клеток ЮГА, возбуждение которых вызывает увеличение поступления ренина в кровь и почечный интерстиций благодаря активации внутриклеточного АЦ/цАМФ сигнального пути [68]. 23 Ангиотензин II плазмы крови, главный эффекторный пептид циркулирующей РААС, синтезируется из продуцируемого печенью предшественника ангиотензиногена, концентрация которого примерно в 1000 раз превышает содержание в крови других пептидов РАС. Ангиотензиноген с участием циркулирующего в крови ренина первоначально превращается в ангиотензин I, обладающий низкой биологической активностью. Впоследствии этот пептид, состоящий из 10 аминокислот, быстро метаболизируется АПФ и, в меньшей степени, химазой и CAGE (чувствительный к химостатину фермент) в высокоактивный октапепдид ангиотензин II, который может превращаться в другие эффекторные пептиды РАС (рисунок 1.4). Концентрация этих эффекторных пептидов в крови, за исключением ангиотензина (1-7), значительно ниже, чем ангиотензина II [54]. Образующийся в крови ангиотензин II действует как паракринный гормон в различных органах и тканях. Под его влиянием происходит преимущественное возбуждение тканевых АТ1-ангиотензиновых рецепторов, которое проявляется в сокращении гладкой мускулатуры сосудов, увеличении сократительной способности миокарда, стимуляции секреции альдостерона корой надпочечников, увеличении выделения катехоламинов из мозгового слоя надпочечников и адренергических нервных окончаний, ведущее к повышению активности СНС, увеличение сократительной способности миокарда, стимуляции секреции альдостерона корой надпочечников, увеличении выделения катехоламинов из мозгового слоя надпочечников и адренергических нервных окончаний, ведущее к повышению ак тивности СНС, увеличение чувства жажды и солевого аппетита. Ангиотензин II оказывает также специфическое активирующее влияние на транспорт натрия в эпителиальных клетках почек и кишечника [83, 94]. В формировании почечных эффектов РААС важную роль играет возбуждение внепочечных локализаций АТ1ангиотензиновых рецепторов. Наиболее существенным из них является возбуждение ангиотензином II АТ1ангиотензиновых рецепторов клеток клубочковой зоны коры надпочечников, которые продуцируют минералкортикоидный гормон альдостерон. Стимуляция этих клеток обеспечивает увеличение секреции гормона и включение его в РААС. 24 Рисунок 1.4. Ренин-ангиотензиновая система [13]. АПФ, АПФ 2 – ангиотензин I-превращающие ферменты; CAGE – чувствительный к химостатину фермент, генерирующий ангиотензин II; ПЭП – пролиловая эндопептидаза; НЭП – нейтральная эндопептидаза; КОП – карбоксипептидаза; АП А – аминопетидаза А; АП N – аминопептидаза N. Жирным шрифтом выделены подтипы АТ-ангиотензиновых рецепторов, специфически чувствительные к соответствующим эффекторным пептидам РАС. 25 Альдостерон действует на главные клетки собирательных трубок коры и мозгового слоя, где оказывает специфическое влияние на процессы реабсорбции натрия и секреции ионов калия в просвет нефрона. В этих клетках альдостерон связывается с внутриклеточными рецепторами, перемещается в ядро, где стимулирует транскрипцию генов, ответственных за синтез транспортных белков. В результате возрастает синтез белков, выполняющих в клеточных мембранах функцию Na+-каналов и Na+, K+-АТФ-азы, приводящий в дистальных отделах нефрона к увеличению реабсорбции натрия и секреции ионов калия [40, 81]. Тканевая РАС почек состоит из ряда функционально связанных между собой систем, которые генерируют ангиотензин II и другие эффекторные пептиды РАС в клубочках, клетках проксимальных канальцев, интерстициальной жидкости коры и мозговой слоя и других клеточных структурах. Образующиеся ангиотензин II и другие биологически активные пептиды действуют затем аутокринным или паракринным способом, влияя на функциональное состояние тех же самых и/или соседних клеток почечной ткани [32, 65]. Одним из основных компонентов этой системы является канальцевая тканевая РАС, основные звенья которой сосредоточены вокруг проксимальных канальцев в непосредственной близости от клеток ЮГА, синтезирующих и секретирующих ренин. Канальцевая РАС продуцирует ангиотензин II в просвете нефрона, клетках проксимальных канальцах и в окружающей их интерстициальной ткани. Ангиотензиноген плазмы крови, имеющий большой молекулярный вес в отличие от циркулирующего ренина, практически не фильтруется в клубочках и поэтому в обычных условиях не участвует в образовании ангиотензина II в канальцевой жидкости. Специфическим субстратом для этого каталитического процесса является ангиотензиноген, который синтезируется в значительных количествах непосредственно в самих канальцевых клетках, а затем секретируется в просвет почечных канальцев по градиенту концентрации. Предполагается, что часть ренина, участвующего в превращении ангиотензиногена канальцевой жидкости в ангиотензин II, также поступает в нее из клеток проксимальных канальцев. В результате под влиянием АПФ, локализованного в мембранах щеточной каемки, в каналь- 26 цевом просвете генерируется количество активного пептида, которое в 30-50 раз превышает его концентрацию в плазме крови. Высокое содержание ангиотензина II обнаружено также и в интерстициальной жидкости, омывающей базолатеральные мембраны канальцевых клеток [86]. Клетки проксимальных канальцев продуцируют и другие эффекторные пептиды РАС, в частности, ангиотензин III и ангиотензин (1-7), в синтезе которого участвует АПФ 2, превращающий ангиотензин II в промежуточный метаболит ангиотензин (1-9). В мембранах щеточной каемки выявлена также высокая активность аминопепетидазы N, трансформирующей ангиотензин III в ангиотензин IV, который, возбуждая АТ4-ангиотензиновые рецепторы, может препятствовать стимулирующему влиянию ангиотензина II на транспорт ионов натрия в этом сегменте нефрона [72]. Другим основным компонентом этой системы является тканевая РАС клубочков, которая генерирует ангиотензин II в количествах, превышающих в несколько раз его содержание в плазме крови. Основным источником ангиотензина II в этой локальной гуморальной системе являются клубочковые эпителиальные клетки (подоциты). В этих клетках экспрессированы все основные компоненты РАС, включая ренин, ангиотензиноген, АПФ и другие ферменты, которые осуществляют синтез ангиотензина II и его метаболизм в другие эффекторные пептиды. В мембранах подоцитов обнаружена высокая плотность АТ1- и, в меньшей степени, АТ2-ангиотензиновых рецепторов, которые опосредуют большинство эффектов ангиотензина II и других эффекторных пептидов РАС. Мезангиальные клетки клубочков также продуцируют ангиотензин II с участием ангиотензиногена, ренина и АПФ, а в их клеточных мембранах экспрессированы оба основных подтипа АТ-ангиотензиновых рецепторов [73, 115]. Большинство физиологических и патологических эффектов ангиотензина II, синтезируемого в тканевой РАС почек, связано с возбуждением АТ1ангиотензиновых рецепторов, экспрессированных в клетках различных структур почечной ткани (таблица 1.1.). Рецепторы этого подтипа выявлены в гладкой мускулатуре почечных сосудов, включая афферентные и эфферентные артериолы 27 Таблица 1.1 - Основные эффекты, возникающие в почке при возбуждении АТ-ангиотензиновых рецепторов [13] Структура АТ1-ангиотензиновые рецепторы АТ2-ангиотензиновые рецепторы Сосуды коркового вещества Сужение с уменьшением почечного кровотока Гипертрофия и пролиферация гладкомышечных клеток Клубочковые артериолы Преимущественное сужение эф- Преимущественная диферентных артериол с увеличени- латация эфферентных артериол ем СКФ Подоциты Повышение активности клеточной РАС с увеличением продукции ангиотензина II Стимуляция профибротических генов с превращением в клетки фибротического генотипа Мезангиальные клетки Сокращение с уменьшением проницаемости фильтрационной поверхности клубочков Повышение активности клеточной РАС Стимуляция гипертрофии и пролиферации клеток Торможение гипертрофии и пролиферации клеток Клетки проксимальных канальцев Выраженная стимуляция реабсорбции натрия Повышение активности канальцевой РАС с увеличением продукции ангиотензина Угнетение реабсорбции натрия Клетки толстого восходящего колена петель Генле Увеличение реабсорбции натрия Угнетение реабсорбции натрия Ренинсекретирующие клетки ЮГА Торможение синтеза и секреции Торможение синтеза и секреции ренина ренина Вазодилатация с увеличением почечного кровотока 28 клубочков, мезангиальных клетках клубочков, апикальных и базолатеральных мембранах клеток проксимальных канальцев, ТВКПГ, собирательных трубок и клетках macula densa, участвующих в регуляции секреции ренина гранулярными клетками ЮГА [53, 80]. Одним из классических эффектов ангиотензина II в почке, обусловленных возбуждением АТ1-ангиотензиновых рецепторов, является увеличение реабсорбции натрия в почечных канальцах, которое играет важную роль в контроле ее ионорегулирующей функции и поддержании водно-солевого гомеостаза организма. Основной стимулирующий эффект ангиотензина II на транспорт натрия в нефроне локализован в проксимальных канальцах, которые реабсорбируют до 70 % натрия, профильтровавшегося в клубочках. В формировании этого почечного эффекта участвует повышение активности апикального Na+/H+-ионообменника 3 типа, а также Na+, HCO3¯-котранспортера и Na+, K+-АТФ-азы, которые обеспечивают перенос ионов через базолатеральные мембраны канальцевых клеток [55, 113, 120]. Недавно установлено что ангиотензин II способен также, взаимодействуя с АТ1-ангиотензиновыми рецепторами, увеличивать экспрессию белка и активировать чувствительный к гипотиазиду и другим тиазидным диуретикам Na+, Cl¯котранспортер, локализованный в апикальных мембранах клеток дистальных извитых канальцев [114]. АТ2-ангиотензиновые рецепторы, обладающие широким спектром биологической активности, на очень высоком уровне экспрессированы в клетках плода. Плотность их распределения в клеточных структурах взрослого организма относительно невелика, но они выявляются во многих органах и тканях. В почке АТ2ангиотензиновые рецепторы экспрессированы в гладкой мускулатуре сосудов, включая эфферентные артериолы клубочков и нисходящую медуллярную часть vasa recta, в гломерулярных подоцитах, клетках проксимальных канальцев, собирательных трубок и в интерстициальных клетках мозгового вещества, продуцирующих простагландины [77, 80, 92]. 29 Такая локализация АТ-ангиотензиновых рецепторов 2 типа предполагает их участие в регуляции почечного кровотока, СКФ и функционального состояния различных сегментов нефрона. АТ2-ангиотензиновые рецепторы входят в семейство трансмембранных рецепторов, сопряженных с эффекторными G-белками, и включают внутриклеточные сигнальные пути, которые препятствуют формированию клеточных эффектов, возникающих при возбуждении АТ1-ангиотензиновых рецепторов. Длительная инфузия ангиотензина II мышам с генетическим дефектом АТ2- ангиотензиновых рецепторов сопровождается повышенной прессорной реакцией и избыточной задержкой натрия в организме по сравнению с обычными животными [102]. К настоящему времени установлено, что вазодилатация, возникающая в почках при возбуждении АТ-ангиотензиновых рецепторов 2 типа, связана с индукцией в гладкомышечных клетках внутриклеточного брадикинин-NO-цГМФ сигнального пути, а в механизме торможения реабсорбции натрия в проксимальных канальцах и угнетения продукции и секреции ренина гранулированными клетками ЮГА участвует внутриклеточный NO-цГМФ-каскад [103]. Главным эндогенным агонистом АТ2-ангиотензиновых рецепторов, индуцирующих при своем возбуждении натрийурез и другие почечные эффекты, является ангиотензин III, который образуется на поверхности клеток-мишеней из ангиотензина II с участием аминопептидазы А [63, 95]. Таким образом, АТ2-ангиотензиновые рецепторы рассматриваются сейчас в качестве функциональных антагонистов АТ1-ангиотензиновых рецепторов, которые защищают почки от избыточных (патологических) функциональных сдвигов, возникающих в клетках различных структур почечной ткани при чрезмерной стимуляции АТ1-ангиотензиновых рецепторов. Вполне возможно, что АТ2- ангиотензиновые рецепторы препятствуют также неблагоприятному действию ангиотензина II на процессы, пролиферации, гипертрофии и профибротического перерождения мезангиальных клеток и клеток проксимальных канальцев, которые лежат в основе развития гломерулосклероза и тубулоинтерстициального фиброза 30 почечной ткани. Сейчас становится все более очевидным, что, помимо классической стимулирующей РАС АПФ – Анг II – АТ1- рецепторы, в почках дополнительно функционирует неклассическая РАС, включающая Анг II – Анг III – АТ2рецепторы и АПФ – Анг (1-7) – АТ (1-7)-рецепторы, которая противодействует классической РАС и вызывает в почках вазодилатацию, увеличивает диурез, натрийурез и тормозит процессы оксидативного повреждения почечной ткани [35]. В целом, имеются основания полагать, что тканевая РАС почек функционально дополняет циркулирующую РААС в механизме, контролирующем ионорегулирующую функцию почек, но, в отличие от РААС, обеспечивает быструю и краткосрочную регуляцию реабсорбции натрия в проксимальных канальцах и ТВКПГ. 1.2. Участие почечной дофаминергической системы в регуляции транспорта натрия в канальцах почек В контроле функционального состояния почек, помимо СНС, РААС и почечной тканевой РАС, обеспечивающих сохранение натрия в организме, участвуют нейрогуморальные системы, которые препятствуют его избыточной задержке, приводящей к отечному синдрому и другим нарушениям водно-солевого баланса организма. В эту группу нейрогуморальных систем входят натрийуретические пептиды, адреномедуллин, почечные простагландины и дофаминергическая система почек, обладающие выраженным сосудорасширяющим и натрийуретическим действием. Физиологические эффекты нейромедиатора и гормонального регулятора дофамина (допамина) опосредованы через семейство связанных с G-белками Dдофаминовых рецепторов, которые делятся на две главные группы: семейство, где под влиянием декарбоксилазы ароматических кислот превращается в дофамин, который секретируется через апикальные мембраны в просвет нефрона и в интерстициальную жидкость, омывающую базолатеральные мембраны канальцевых клеток, где под влиянием декарбоксилазы ароматических кислот превращается в 31 дофамин, который секретируется через апикальные мембраны в просвет нефрона и в интерстициальную жидкость, омывающую базолатеральные мембраны канальцевых клеток (D1- и D5-рецепторы) и семейство D2-дофаминовых рецепторов (D2-, D3- и D4- рецепторы). Имеются основания считать, что D1-дофаминовые рецепторы реализуют свои клеточные эффекты через семейство Gαs/olf- белков, которые стимулируют внутриклеточный сигнальный путь АЦ / цАМФ и локализованы исключительно постсинаптически в мембранах клеток ЦНС, почек и других органов. D2-дофаминовые рецепторы сопряжены с семейством Gαi/o- белков, которые, напротив, ингибируют активность АЦ и внутриклеточную продукцию цАМФ. В отличие от D1-дофаминовых рецепторов, D2-дофаминовые рецепторы экспрессированы как постсинаптически в клетках-мишенях, так и пресинаптически в дофаминергических нейронах ЦНС и периферической нервной системы [26]. В условиях гидратации организма и/или увеличения объема циркулирующей крови дофамин интенсивно синтезируется в клетках почечных канальцев. Предшественник дофамина L-ДОФА (3,4-дигидрокси-L-фенил-аланин) фильтруется из плазмы в просвет проксимальных канальцев и поступает в канальцевые клетки с помощью Na+- транспортера, локализованного в их апикальных мембранах. В канальцевых клетках L-ДОФА быстро метаболизируется в дофамин с помощью декарбоксилазы ароматических кислот, активность которой возрастает при избыточном поступлении натрия в организм и, наоборот, снижается при ограничении натрия в диете. Образующийся дофамин затем секретируется из клеток в просвет нефрона и в интерстициальную жидкость, где взаимодействует с дофаминовыми рецепторами канальцевых клеток [31, 78, 122]. Иммуногистохимические исследования показывают, что в различных структурах почек экспрессированы преимущественно D1-дофаминовые рецепторы. Высокая плотность этих рецепторов выявляется в гладкой мускулатуре почечных сосудов, включая афферентные и эфферентные артериолы клубочков, проксимальных канальцах, собирательных трубках коркового слоя и гранулированных клетках ЮГА, секретирующих ренин [87, 88]. D3-дофаминовые рецепторы 32 найдены в артериолах клубочков, и клетках проксимальных канальцев и ТВКПГ, локализованных в корковом веществе почек [88]. Уже ранние исследования с использованием селективного агониста D1дофаминовых рецепторов SEN 23390 показали, что дофамин, синтезируемый в проксимальных канальцах, действует локально на рецепторы этого подтипа и оказывает угнетающее влияние на транспорт натрия в этом сегменте нефрона, контролируя примерно 60% выделения натрия с мочой [99]. Более поздние исследования с использованием введения дофамина в почечный интерстиций подтвердили, что антагонисты D1-дофаминовых рецепторов специфически устраняют диуретический и натрийуретический эффекты этого препарата, прямо ослабляя экспрессию рецепторов этого подтипа в клетках почечных канальцев [121]. Затем было установлено, что выраженность диуретической и натрийуретической реакции, возникающей при стимуляции D1-дофаминовых рецепторов проксимальных канальцев, зависит от состояния натриевого баланса организма. При ограничении поступления натрия D1-дофаминовые рецепторы не проявляют своего специфического действия, в то время как при нормальном или избыточном содержании натрия в организме их возбуждение сопровождается угнетением реабсорбции натрия в проксимальном сегменте нефрона и выраженной натрийуретической реакцией [95]. Недавние исследования на мышах с генетически вызванным отсутствием в клетках проксимальных канальцев декарбоксилазы ароматических кислот, участвующей в синтезе дофамина, подтвердили важную роль этого гормонального регулятора в контроле реабсорбции натрия в почке и поддержании нормального АД крови [128]. Результаты этих экспериментов говорят о том, что образующийся в почке дофамин выполняет функцию нейрогуморального модулятора, который при нормальном и, особенно, избыточном содержании натрия в организме специфически возбуждает D1-дофаминовые рецепторы клеток проксимальных канальцев и тормозит реабсорбцию натрия в этом сегменте нефрона, препятствуя его избыточной задержке в организме. В результате развивается выраженная диуретическая и натрийуретическая реакция, поскольку дофамин дополнительно ингибирует реаб- 33 сорбцию натрия в ТВКПГ и собирательных трубках [50, 125]. Однако сейчас становится очевидным, что главной точкой приложения ингибирующего действия дофамина на систему транспорта натрия в почке является проксимальный отдел нефрона, в котором этот нейрогуморальный модулятор специфически подавляет активность двух основных транспортирующих ионы механизмов: Na+/H+обменника 3 типа (NHE3), локализованного в апикальной мембране канальцевых клеток [60], и Na+, K+-АТФ-азы, осуществляющей активный перенос этих ионов через их базолатеральную мембрану [23, 46, 50]. Недавно получены данные о том, что в механизм натрийуретической реакции, возникающей при возбуждении дофамином D1-дофаминовых рецепторов клеток проксимальных канальцев, одновременно включаются АТ2- ангиотензиновые рецепторы канальцевых клеток. Стимуляция D1-дофаминовых рецепторов апикальных клеточных мембран вызывает с участием АЦ/цАМФ сигнального пути и цитоплазматических микротрубочек перемещение в мембраны из цитоплазмы АТ2-ангиотензиновых рецепторов, которые прямо вовлекаются в механизм угнетения дофамином транспорта натрия в этом сегменте нефрона [46, 47, 95]. Таким образом, синтезируемый в почке дофамин функционирует как одно из звеньев сосудорасширяющего натрийуретического нейрогуморального механизма, который препятствует избыточному стимулирующему действию ангиотензина II на реабсорбцию натрия в нефроне, связанному с возбуждением клеточных АТ1-ангиотензиновых рецепторов. Реализация канальцевого эффекта дофамина обусловлена возбуждением D1-дофаминовых рецепторов клеток проксимальных канальцев, которое сопровождается подавлением активности Na+/H+-обменника 3 типа и Na+, K+-АТФ-азы, осуществляющих реабсорбцию натрия в этом отделе нефрона. В механизм угнетения транспорта натрия в проксимальных канальцах, возникающего под влиянием дофамина, дополнительно включаются также АТ2ангиотензиновые рецепторы, которые «рекрутируются» из цитоплазмы в апикальную мембрану канальцевых клеток [33]. 34 1.3. Влияние дофамина на ионорегулирующую функцию почек Дофаминомиметик допамин (дофамин) по химической структуре является катехоламином, который участвует в биосинтезе норадреналина, выполняя одновременно функцию медиатора в дофаминергических синапсах или нейрогуморального модулятора в клетках различных органов и тканей. Благодаря этому обладает фармакологическими свойствами, характерными для адреномиметических веществ. Прежде всего, это касается его способности возбуждать в очень низких концентрациях различными подтипы D-дофаминовых рецепторов, которые широко представлены в ЦНС, сердечно-сосудистой системе, почках и других органах. Фармакологические эффекты, возникающие в организме под влиянием этого препарата, поэтому напрямую зависят от величины вводимой дозы препарата, так как при внутривенной инфузии допамина в низких дозах (1-3 мкг/кг/мин) возбуждаются преимущественно D-дофаминовые рецепторы гладкой мускулатуры периферических сосудов и почечной ткани, а при введении его в средних дозах (3-10 мкг/кг/мин) дополнительно повышается активность β-адренорецепторов сердечно-сосудистой системы, почек и других локализаций. При внутривенной инфузии больших доз допамина (> 10 мкг/кг/мин) на первый план выступают фармакологические эффекты, характерные для стимуляции α1-адренорецепторов различных локализаций (таблица 1.2). У здоровых лиц небольшие дозы допамина оказывают выраженное сосудорасширяющее действие, которое связано с возбуждением постсинаптических D1дофаминовых рецепторов гладкой мускулатуры сосудов и пресинаптических D2дофаминовых рецепторов, угнетающих выделение норадреналина из симпатических нервных окончаний. В этих условиях АД также изменяется в зависимости дозы препарата: низкие дозы вызывают слабый гипотензивный эффект за счет снижения ДАД, в то время как при назначении высоких доз развивается прессорный эффект, связанный с увеличением САД. 35 Таблица 1.2 - Основные эффекты, возникающие в почке при возбуждении постсинаптических и внесинаптических адренорецепторов [12] Структура α1-Адренорецепторы Сосуды коркового вещества Сужение с уменьшением почечного кровотока β1-Адренорецептры Слабая вазодилатация Гипертрофия, пролиферация и миграция гладкомышечных клеток и интерстициальных фибробластов Клубочковые артериолы Сужение афферентных и эфферентных артериол с нарастающим снижением СКФ Подоциты Сокращение с уменьшением проницаемости фильтрационной поверхности клубочков Мезангиальные клетки Сокращение с уменьшением проницаемости фильтрационной поверхности клубочков Слабая вазодилатация? Стимуляция клеточного цикла с пролиферацией мезангиальных клеток Увеличение продукции матриксного белков фибронектина и коллагена Клетки проксимальных канальцев Выраженная стимуляция реабсорбции натрия Увеличение реабсорбции натрия Активация канальцевой РАС с увеличением продукции ангиотензина II Стимуляция клеточного цикла с пролиферацией канальцевых клеток Клетки толстого восходящего колена петель Генле Увеличение реабсорбции натрия Стимуляция секреции Н+ и НСО3¯ из вставочных клеток А и В типов Клетки собирательных трубок коркового и мозгового вещества Ренинсекретирующие клетки ЮГА Увеличение реабсорбции натрия Слабая стимуляция секреции ренина Выраженная стимуляция секреции ренина с увеличением активности циркулирующей РААС и почечной тканевой РАС 36 Исследования на здоровых людях показывают также, что при инфузии низких доз допамина сердечный выброс снижается в ответ на дилатацию периферических сосудов и уменьшение ОПСС, а при введении больших доз может возрастать, как и ЧСС, в ответ на стимуляцию β1-адренорецепторов миокарда, оказывающих выраженное кардиотоническое и тахиаритмическое действие. Хорошо известный натрийуретический эффект допамина, обусловленный прямой стимуляцией D1-дофаминовых рецепторов клеток проксимальных канальцев, достигает максимума при дозах 1-5 мкг/кг/мин, вызывая у здоровых людей примерно 2кратный прирост диуреза и выделения натрия с мочой. При увеличении дозы препарата и повышении АД первоначально включается прессорный натрийурез, который может смениться затем задержкой натрия в организме, обусловленной возбуждением допамином α1-адренорецепторов клеток почечных канальцев [71, 90]. В экспериментальных исследованиях на животных для оценки влияния допамина на ионорегулирующую функцию почек используются обычно небольшие «почечные» дозы препарата. Эти исследования подтвердили, что в такой дозировке допамин вызывает характерную реакцию почек крыс в виде выраженной диуретической реакции, которая сопровождается значительным увеличением потери натрия и калия с мочой. Одновременно наблюдается расширение почечных сосудов с увеличением локальных кровотоков в коре и наружном мозговом слое соответственно на 48,4 % и 57, 1 %. СКФ при этом возрастает или существенно не изменяется, что указывает на разнонаправленные изменения фильтрационной загрузки нефронов. Канальцевая реабсорбцию натрия при этом неизменно угнетает ся, способствуя существенному приросту почечной экскреции натрия и калия [1, 8, 10]. В формировании канальцевого и сосудистого эффектов допамина в почках важную роль играет почечная тканевая РАС, которая увеличивает реабсорбцию натрия в проксимальных канальцах и ТВКПГ за счет стимуляции ангиотензином II клеточных АТ1-ангиотензиновых рецепторов. Допамин, который в зависимости от вводимой дозы возбуждает в почках D1-дофаминовые рецепторы, в также β1- и α1-адренорецепторы, способен существенно изменять секрецию ренина ЮГА. 37 Предполагается, что влияние допамина на этот процесс может быть связано с тремя основными механизмами. Первый из них обусловлен прямой стимуляцией допамином D1-дофаминовых рецепторов гранулированных клеток ЮГА, возбуждение которых включает АЦ/цАМФ сигнальный путь и увеличивает их секреторную активность [59, 118]. Аналогичный эффект возникает при возбуждении допамином β1-адренорецепторов этих клеток. Другой путь, также оказывающий стимулирующее влияние на этот процесс, связан с возможным снижением АД и дилатацией афферентных артериол клубочков, контактирующих с гранулированными клетками ЮГА [64]. Третий путь – непрямое угнетение секреции ренина ЮГА, связанное с торможением реабсорбции натрия при возбуждении D1дофаминовых рецепторов проксимальных канальцев и увеличения доставки NaCl к рецепторам macula densa [105, 106, 127]. В обычных условиях при назначении «почечных» доз допамина величина АРП крови существенно не изменяется [71]. В целом, влияние допамина на ионорегулирующую функцию почек достаточно хорошо изучено и подтверждает современные представления о ведущей роли почечных D1-дофаминовых рецепторов в формировании сосудистого и канальцевого эффектов этого препарата. 1.4. Заключение Допамин, идентичный нейромедиатору и гормональному регулятору дофамину, широко применяется для лекарственной терапии кардиогенного шока и острой сердечной недостаточности различного происхождения, включая острый кардиоренальный синдром, возникающий у лиц с декомпенсированной ХСН [16, 22, 44]. У таких пациентов допамин оказывает благоприятное влияние на почки, способствуя восстановлению системной и почечной гемодинамики, устранению рефрактерности к диуретикам и увеличению диуреза и натрийуреза, которое препятствует избыточной задержке жидкости в организме и нарастающему ухудшению состояния больных. Действие допамина на ионорегулирующую функцию почек достаточно хо- 38 рошо исследовано. Вполне очевидно, что при назначении низких «почечных» доз этого препарата развивается выраженная диуретическая реакция, которая сопровождается увеличение выделения электролитов с мочой. Этот эффект дофамина определяется, прежде всего, прямой стимуляцией D1-дофаминовых рецепторов проксимальных канальцев, которая активирует защитную дофаминергическую систему почек, препятствующую избыточной задержке натрия и жидкости в организме. Вместе с тем, многие стороны механизма и особенностей действия допамина в почках остаются недостаточно изученными. Одним из таких вопросов является выяснение характера взаимодействия этого препарата с почечной тканевой РАС, почечными простагландинами и калликреин-кининовой системой почек, которые контролируют гемодинамику почек и транспорт натрия и других электролитов в нефроне. Требуют уточнения также особенности взаимодействия в почках допамина и петлевых диуретиков, комбинация которых используется у больных декомпенсированной ХСН для преодоления рефрактерности к этим препаратам и восстановления нарушенной почечной функции. Для выяснения этих вопросов мы провели фармакологический анализ роли РАС, простагландиновой и калликреин-кининовой систем в механизме формирования почечных эффектов допамина у наркотизированных крыс и изучили особенности взаимодействия в почках допамина и петлевого диуретика фуросемида у животных с моделью сердечной недостаточности, вызванной длительной избыточной физической нагрузкой и введением адреномиметика фенилэфрина. Полученные результаты позволят не только расширить современные представления о роли почечных простагландинов, кининов и почечной тканевой РАС в механизме формирования почечных эффектов допамина, но и экспериментально оценить на модели ХСН особенности совместного влияния этого препарата и фуросемида на ионорегулирующую функцию почек крыс. 39 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на базе кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России в соответствии с планом научно-исследовательских работ академии (№ государственной регистрации 01201350436). Для оценки роли простагландиновой, калликреин-кининовой и ренинангиотензиновой систем в механизме действия дофаминомиметика допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс и выяснения особенностей совместного действия допамина и фуросемида на ионорегулирующую функцию почек крыс с моделью сердечной недостаточности использованы различные методологические подходы. Опыты на наркотизированных крысах Эксперименты выполнены на наркотизированных тиопенталом-натрия (50 мг/кг, в/б) белых беспородных крысах-самцах массой 190-220 г (питомник «Столбовая», Московская область), содержавшихся на обычном рационе вивария при свободном доступе к воде. После вхождения в наркоз крысу фиксировали на операционном столике на спине и делали трахеотомию для обеспечения нормального дыхания животного во время эксперимента. Затем срединным разрезом по белой линии живота вскрывали брюшную полость и в заднюю полую вену ниже впадения почечных вен вставляли полихлорвиниловый катетер для инфузии изотонического раствора хлорида натрия. Для поддержания постоянного уровня диуреза крысе первоначально внутривенно вводили 2 мл солевого раствора, содержавшего 0,25% инулина, а затем скорость введения снижали до 50 мкл/мин, которую поддерживали постоянно в ходе всего опыта, продолжавшегося 80-90 минут. Одновременно из мочевого пузыря с помощью катетера в микропипетки собирали 10-минутные порции мочи. После стабилизации диуреза, которая обычно наступала через 30-40 минут, заби- 40 рали две контрольные порции мочи и вводили исследуемые лекарственные препараты. Перед введением препарата, в середине и после окончания эксперимента из хвостовой вены брали пробы крови в объеме 0,1 мл, разводили в 0,9 мл 4% раствора трихлоруксусной кислоты и после осаждения белков центрифугировали при 3000 оборотов в минуту. В полученных образцах мочи и крови на фотоэлектроколориметре КФК-2-УХЛ42 антроновым методом определяли содержание инулина [15]. Концентрацию натрия и калия в моче и крови исследовали на пламенном фотометре ПФМ МУ. При подсчете концентрации натрия в крови делали поправку на гематокрит. После обработки полученных результатов в каждом эксперименте вычисляли: V – диурез, мкл/мин; Uin – концентрация инулина в плазме крови, мг%; Pin – содержание инулина в плазме крови, мг%; UNa – концентрация натрия в моче, мкмоль/мкл; PNa – содержание натрия в плазме крови, мкмоль/мкл; UK – содержание калия в моче, мкмоль/мкл. Затем на основании этих данных по общепринятым формулам [14, 19] рассчитывали величину основных показателей ионорегулирующей функции почек: Cin – клиренс инулина, мкл/мин; UNa▪V – выделение натрия с мочой, мкмоль/мин; EFNa – экскретируемая фракция натрия, %; UK•V – выделение калия с мочой, мкмоль/мин; UNa/UK – отношение натрий/калий мочи. Для более точной оценки все показатели ионорегулирующей функции почек пересчитывались на 100 г массы крысы. Каждый опыт ставился на одном животном. После окончания эксперимента наркотизированные крысы подвергались эвтаназии с помощью внутривенной передозировки наркоза. Всего выполнено 9 серий экспериментов (90 опытов). Препараты: Допамин (допмин, фирма «Орион-фармацевтика», Финляндия) 41 вводился подкожно однократно в дозе 1 мг/кг, вызывающей выраженную диуретическую реакцию. Функция почек крыс изучалась также при комбинации допамина с антагонистом D1-дофаминовых рецепторов галоперидолом (фирма «Richter», Венгрия), ингибитором калликреина контрикалом (апротинин, фирма «AWD», Германия) и ингибитором циклооксигеназы диклофенаком натрия (диклонат, фирма «Pliva», Хорватия), которые вводились внутримышечно соответственно в дозах 1 мг/кг, 6000 АТрЕ/кг и 3 мг/кг за 20 минут до введения допамина. Ингибитор АПФ эналаприл (энап, фирма «KRKA», Словения), антагонист АТ1ангиотензиновых рецепторов лозартан (козаар, фирма «MERCK SHARP&DOHME», Нидерланды) и прямой ингибитор ренина алискирен (расилез, фирма «Novartis Farma», Италия) предварительно назначались животным однократно внутрь в дозах соответственно 1,1 и 4 мг/кг/сутки в течение 7 дней до постановки эксперимента. Опыты на крысах с экспериментальной сердечной недостаточностью В экспериментах использовались 22 белые беспородные крысы-самцы массой 200-250 г, находившиеся на стандартном рационе вивария и имевшие свободный доступ к воде. Животные были разделены на две группы, в которых после первоначальной оценки действия допамина и фуросемида на функцию почек интактных крыс и 3-дневного периода “washout” моделировалась сердечная недостаточность и вновь изучалась реакция почек на исследуемые препараты. Экспериментальную сердечную недостаточность у крыс моделировали по методике В.И. Инчиной и др. (2000) в модификации С.П. Саликовой и др. (2002). Для этого животным в течение 10 дней ежедневно вводили подкожно 0,1 мл 1% раствора адреномиметика фенилэфрина и затем подвергали их интенсивному плаванию до полного изнеможения. В результате у крыс развивается экспериментальная сердечная недостаточность, которая подтверждается клиническими данными (тахикардия, асцит, гепатомегалия) и морфологическими данными (микроскопия гистологических срезов миокарда и печени) [6, 20]. У таких животных выявляется также характерный для застойной ХСН дефект реабсорбции натрия в 42 почке, который проявляется в ее увеличении и замедлении выведения натрия из организма после солевой нагрузки [3]. Влияние лекарственных препаратов на функциональное состояние почек крыс изучалось фоне 3% водной нагрузки с добавлением 0,6% хлорида натрия. С этой целью животные после солевой нагрузки и введения препаратов помещались в индивидуальные плексигласовые боксы для сбора мочи. Моча собиралась через каждые 1,5 часа в течение 4,5 часов. В качестве контроля использовались интактные крысы. В полученных образцах мочи с использованием коммерческих наборов CREATININE 60 (фирма «Кормей», Польша) определяли содержание креатинина на биохимическом анализаторе «Vitalit» (фирма «I.S.E.S.r.I.», Италия) и исследовали концентрацию натрия и калия на пламенном фотометре ПФМ МУ. Показатели диуреза, экскреции с мочой креатинина, натрия, калия и отношение натрий/калий мочи рассчитывали по общепринятым формулам в пересчете на 100 г массы животного. Для взвешивания крыс использовались электронные весы HL400 (фирма «A&D», Япония). По окончании опытов животных подвергали эвтаназии с помощью передозировки наркоза. Всего выполнено 6 серий экспериментов (60 опытов). Препараты: Допамин и петлевой диуретик фуросемид (лазикс, фирма «Хехт лимитед, Индия») водились однократно подкожно в дозах 1 мг/кг. Опыты на наркотизированных и бодрствующих крысах проведены в соответствии с этическими нормами, которые регламентированы требованиями по уходу, содержанию, экспериментам на животных и их утилизации, отраженными в международных и отечественных нормативно-правовых документах [5, 7, 17]. План исследования одобрен Локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения России (протокол № 68 от 26 сентября 2012 г.). Статистическая обработка Статистическая обработка данных проведена на персональном компьютере с использованием программы STATISTICA 5.0. При анализе количественных характеристик для оценки центральной тенденции использовалась М – средняя 43 арифметическая величина и m – средняя ошибка средней арифметической. Статистическую значимость различий количественных характеристик между выборками данных, полученных в экспериментах на наркотизированных крысах, оценивали с помощью критерия Вилкоксона для парных данных. Достоверность не связанных между собой данных, полученных в опытах на животных с экспериментальной ХСН, проверялась с помощью критерия Манна-Уитни [4, 18]. Статистически достоверными считались различия при р < 0,05. 44 Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе проведен фармакологический анализ роли D1-дофаминовых рецепторов, простагландиновой, калликреин-кининовой, ренин-ангиотензи-новой систем в механизме действия дофаминомиметика допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс и исследовано взаимодействие допамина с петлевым диуретиком фуросемидом в почке крыс с моделью сердечной недостаточности, вызванной избыточной физической нагрузкой и введением адреномиметика фенилэфрина. 3.1. Влияние допамина и антагониста D-дофаминовых рецепторов галоперидола на ионорегулирующую функцию почек крыс В первоначальных экспериментах была проведена оценка влияния дофаминомиметика допамина на основные показатели ионорегулирующей функции почек наркотизированных крыс. Введение допамина таким животным вызывало выраженную диуретическую реакцию, которая развивалась в первые 10 мин после инъекции препарата, быстро нарастала и в большинстве опытов достигала максимума спустя 30-40 мин после введения. К 80 мин наблюдения средний уровень диуреза вырос с 1,88±0,07 до 4,18±0,18 мкл/мин/100 г, то-есть в 2,22 раза (р < 0,05). Клиренс инулина, отражающий величину СКФ, при этом также возрос, указывая на незначительное, но достоверное увеличение клубочковой фильтрации. Одновременно с увеличением мочеотделения наблюдалась характерная натрийуретическая реакция, которая сопровождалась достоверным увеличением выделения натрия с мочой в 2,15 раза. Экскретируемая фракция натрия, отражающая количество натрия, удаляемого с мочой из профильтровавшейся в клубочках жидкости возросла с 0,28±0,02 % до 0,48±0,03 % (р < 0,05), что прямо свидетельствует о существенном угнетении реабсорбции этого иона в почечных канальцах. Натрийуретической реакции, развивавшейся у крыс при введении допамина, сопутство- 45 вало также увеличение выделения с мочой ионов калия. Экскреция этого иона спустя 80 мин наблюдения достоверно возросла в 2,77 раза. Индекс натрий/калий мочи при этом существенно не изменился, хотя и имел тенденцию к некоторому снижению (таблица 3.1). Результаты этих опытов подтвердили известные данные о том, что допамин вызывает у интактных и наркотизированных животных выраженную диуретическую и натрийуретическую реакцию, которая сопровождается увеличением потери калия с мочой. В механизме формирования этих эффектов допамина участвует незначительный прирост СКФ, но главную роль играет угнетение реабсорбции натрия в канальцах почек. Известно также, что диуретический и натрийуретический эффекты допамина в основном связаны с прямым возбуждением D1-дофаминовых рецепторов клеток проксимальных канальцев и ТВКПГ, которые опосредуют ингибирующее влияние препарата на реабсорбцию натрия в почках. Для уточнения роли этих рецепторов в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек мы исследовали реакцию почек крыс на допамин после предварительной блокады D1-дофаминовых рецепторов почек с помощью дофаминоблокатора галоперидола. С этой целью мы первоначально вводили крысам галоперидол, затем спустя 20 мин – допамин и оценивали характер их фармакодинамического взаимодействия в почках. Как показывают данные, предварительная инъекция галоперидола практически полностью устраняла диуретическую и натрийуретическую реакцию почек в ответ на дофаминомиметик допамин. К 80 мин наблюдения после введения этого препарата средняя величина мочеотделения практически не изменилась по сравнению с контрольным уровнем, составляя соответственно 2,50 ± 0,09 и 2,38 ± 0,09 мкл/мин/100 г (р > 0,05). Аналогичным образом допамин, действуя на фоне предварительной блокады D1-дофаминовых рецепторов почечной ткани, терял способность вызывать выраженную натрийурети ческую реакцию с одновременным увеличением объема клубочковой фильтрации и экскретируемой фракции натрия. Величина последнего показателя, отражающая реабсорбцию натрия в ка- 46 Таблица 3.1 - Влияние допамина на показатели ионорегулирующей функции почек наркотизированных крыс [M±m, n = 10] Показатель Контроль Допамин Клиренс инулина мкл/мин/100 г 207,3 ± 3,82 257,4 ± 3,69 * Диурез мкл/мин/100 г 1,88 ± 0,07 4,18 ± 0,18 * Выделение натрия мкмоль/мин/100 г 0,081 ± 0,003 0,174 ± 0,008 * Экскретируемая фракция натрия, % 0,28 ± 0,02 0,48 ± 0,03 * Выделение калия мкмоль/мин/100 г 0,114 ± 0,016 0,316 ± 0,036 * 0,82 ± 0,08 0,61 ± 0,03 Отношение натрий/калий в моче Примечание: контроль – значения показателей до введения допамина (1 мг/кг, подкожно). * р < 0,05 (критерий Вилкоксона). 47 нальцах почек, в этих условиях практически не изменилась, что прямо указывает на потерю допамином способности оказывать специфическое ингибирующее влияние на этот процесс. Устранению галоперидолом натрийуретического действия допамина сопутствовало также резкое ослабление калийуретического эффекта этого препарата, хотя полностью его калийуретический эффект при этом не устранялся. Выделение ионов калия с мочой спустя 80 мин после введения крысам допамина возросло с 0,159 ± 0,02 до 0,213 ± 0,02 мкмоль/мин/100 г (р < 0,05). Индекс натрий/калий мочи при этом достоверно снизился в 1,46 раза (таблица 3.2). Результаты экспериментов с галоперидолом подтвердили представление о том, что реакция почек на дофаминомиметик допамин связана со специфической стимуляцией D-дофаминовых рецепторов гладкой мускулатуры почечных сосудов, клубочковых артериол, клеток проксимальных канальцев и других сегментов нефрона. Хорошо известно, что выраженная диуретическая реакция, развивающаяся при возбуждении D1-дофаминовых рецепторов почек, обусловлена не столько увеличением СКФ, сколько прямым угнетением реабсорбции натрия в проксимальных канальцах в ответ на подавление активности апикального Na +/H+обменника 3 типа, локализованного в люменальных мембранах канальцевых клеток [27], и Na+, K+-АТФ-азы, осуществляющей активный перенос этих ионов через их базолатеральные мембраны [47, 99]. Однако не исключено, что в механизм формирования эффектов, возникающих в почках при возбуждении D1дофаминовых рецепторов, могут вовлекаться также различные нейрогуморальные системы, которые участвуют в регуляции транспорта натрия и других ионов в различных сегментах нефрона. Прежде всего, это касается почечной тканевой РАС, активность которой может существенно изменяться под влиянием допамина. Вполне возможно, что в механизм действия этого препарата на ионорегулирующую функцию почек могут включаться также простагландиновая и калликреин-кининовая системы почек, которые непосредственно контролируют транспорт натрия, воды и других электролитов в проксимальных и дистальных отделах почечных канальцев. Для того чтобы получить представление о роли простагландиновой, кали- 48 Таблица 3.2 - Влияние галоперидола на показатели ионорегулирующей функции почек наркотизированных крыс при действии допамина [M±m, n = 10] Контроль Галоперидол + допамин Клиренс инулина мкл/мин/100 г 213,5 ± 5,11 215,0 ± 4,58 Диурез мкл/мин/100 г 2,38 ± 0,09 2,50 ± 0,09 Выделение натрия мкмоль/мин/100 г 0,203 ± 0,04 0,200 ± 0,04 Экскретируемая фракция натрия, % 0,65 ± 0,04 0,64 ± 0,03 Выделение калия мкмоль/мин/100 г 0,159 ± 0,02 0,213 ± 0,02 * Отношение натрий/калий в моче 1,41 ± 0,17 0,96 ± 0,06 * Показатель Примечание: контроль – значения показателей спустя 20 мин после инъекции галоперидола до введения допамина. * р < 0,05 (критерий Вилкоксона). 49 креин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек мы исследовали его взаимодействие в почках крыс со специфическими ингибиторами этих нейрогуморальных систем. 3.2. Взаимодействие допамина в почке крыс с ингибитором синтеза простагландинов диклофенаком натрия Простагландиновая система почек прямо участвует в регуляции гемодинамики и ионорегулирующей функции почек, ослабляя избыточное влияние СНС, РААС и почечной тканевой РАС на тонус сосудов и транспорт натрия и других электролитов в различных отделах нефрона. В то же время данные, полученные в экспериментах на крысах, свидетельствуют о том, что не только адренергические почечные нервы, но и циркулирующий в крови дофамин могут оказывать стимулирующее влияние на процессы образования и выделения почками простагландинов, включая ПГЕ2 [119]. Для выяснения возможного участия почечной простагландиновой системы в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек мы изучили влияние специфического ингибитора циклооксигеназы диклофенака натрия, который подавляет синтез ПГЕ2 и других простагландинов в ткани почек и других органов, на формирование почечных эффектов этого препарата. С этой целью мы первоначально оценили влияние одного ингибитора циклооксигеназы на состояние ионорегулирующей функции почек, а затем исследовали характер его фармакодинамического взаимодействия в почках крыс с допамином. Диклофенак натрия вводился наркотизированным животным внутримышечно за 20 мин до инъекции дофаминомиметика в дозе 3 мг/кг, которая при назначении внутрь значительно угнетает синтез ПГЕ2 в ткани коркового слоя почек крыс [109]. Введение крысам одного диклофенака натрия (таблица 3.3) сопровождалосьумеренным снижением мочеотделения и экскреции почками натрия, характерным для всех нестероидных противовоспалительных средств. Величина диуреза начинала уменьшаться в первые 20 мин после инъекции препарата и достигала 50 Таблица 3.3 - Влияние диклофенака натрия на показатели ионорегулирующей функции почек наркотизированных крыс [M±m, n = 10] Контроль Диклофенак натрия Клиренс инулина мкл/мин/100 г 250,0 ± 8,67 219,4 ± 19,4 * Диурез мкл/мин/100 г 2,34 ± 0,20 1,86 ± 0,21 * Выделение натрия мкмоль/мин/100 г 0,147 ± 0,019 0,123 ± 0,021 * Экскретируемая фракция натрия, % 0,42 ± 0,04 0,39 ± 0,05 Выделение калия мкмоль/мин/100 г 0,195 ± 0,023 0,181 ± 0,027 0,87 ± 0,12 0,77 ± 0,11 Показатель Отношение натрий/калий в моче Примечание: контроль – значения показателей до введения диклофенака натрия (3 мг/кг, внутримышечно). * р < 0,05 (критерий Вилкоксона). 51 максимальных значений спустя 50 мин наблюдения. К этому времени диурез упал по сравнению с контрольным уровнем с 2,34 ± 0,20 до 1,86 ± 0,21 мкл/мин/100 г (р < 0,05). Одновременно с замедлением мочеотделения отмечалось нарастающее уменьшение выделения почками натрия, также достигавшее максимальных значений спустя 50 мин после инъекции ингибитора циклооксигеназы. В этих условиях потеря натрия с мочой незначительно, но достоверно снизилась с 0,147 ± 0,019 до 0,123 ± 0,021 мкмоль/мин/100 г (р < 0,05). Поскольку величина экскретируемой фракции натрия, характеризующая реабсорбцию этого иона в почечных канальцах, при этом заметно не изменилась, основной причиной задержки натрия в организме под влиянием диклофенака натрия стало замедление СКФ, которая достоверно уменьшилась с 250,0 ± 8,67 до 219,4 ± 19,4 мкл/мин/100 г (р < 0,05). Выделение калия с мочой и индекс натрий/калий мочи, характеризующий соотношение выделяемых ионов с мочой, при этом также существенно не изменились, что указывает на отсутствие влияния препарата на показатели калийуретической функции почек. В последующих экспериментах мы изучили влияние предварительного угнетения диклофенаком натрия синтеза почечных простагландинов на реакцию почек крыс в ответ на допамин. Полученные данные представлены в таблице 3.4. В результате опытов оказалось, что введение допамина на фоне предварительной блокады синтеза почечных простагландинов вызывает у наркотизированных крыс практически такую же диуретическую реакцию, которая наблюдалась в контрольных опытах с одним дофаминомиметиком. Если в контрольных экспериментах с допамином величина диуреза возросла к 80 мин наблюдения с 1,88±0,07 до 4,18±0,18 мкл/мин/100 г, то-есть в 2,22 раза (р < 0,05), то при совместном введении диклофенака натрия и допамина этот показатель также вырос с 1,88 ± 0,18 до 4,18 ± 0,32 (р < 0,05). Аналогичным образом изменялось и выделение натрия с мочой, которое к концу периода наблюдения достоверно выросло в 3,02 раза по сравнению с контрольным уровнем. Практически полностью сохранилась также способность допамина увеличивать СКФ и тормозить реабсорбцию натрия в почечных каналь- 52 Таблица 3.4 - Влияние диклофенака натрия на показатели ионорегулирующей функции почек наркотизированных крыс при действии допамина [M±m, n = 10] Контроль Диклофенак натрия + допамин Клиренс инулина мкл/мин/100 г 197,5 ± 3,11 259,5 ± 6,67 * Диурез мкл/мин/100 г 1,88 ± 0,18 4,18 ± 0,32 * Выделение натрия мкмоль/мин/100 г 0,093 ± 0,004 0,281 ± 0,021 * Экскретируемая фракция натрия, % 0,33 ± 0,02 0,76 ± 0,08 * Выделение калия мкмоль/мин/100 г 0,123 ± 0,008 0,358 ± 0,039 * 0,93 ± 0,08 0,88 ± 0,07 Показатель Отношение натрий/калий в моче Примечание: контроль – значения показателей спустя 20 мин после инъекции диклофенака натрия до введения допамина. * р < 0,05 (критерий Вилкоксона). 53 цах. Экскретируемая фракция натрия, отражающая процесс его реабсорбции в почках, возросла при этом с 0,33 ± 0,02% до 0,76 ± 0,08%, то-есть даже в большей степени, чем при введении одного допамина. Экскреция калия с мочой спустя 80 мин после инъекции допамина на фоне действия диклофенака натрия достоверно увеличилась в 2,91 раза, а отношение натрий/калий мочи, как и в контрольных опытах, существенно не изменилось. Следовательно, предварительное подавление активности почечной простагландиновой системы ингибитором циклооксигеназы диклофенаком натрия не оказывает заметного влияния на реакцию почек крыс в ответ на дофаминомиметик допамин. В связи с этим имеются основания считать, что образующиеся в почках простагландины не включаются в механизм действия допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс. Материалы данного раздела опубликованы в следующих изданиях : 1. Ландарь, Л.Н. Роль простагландиновой и калликреин-кининовой систем в формировании почечных эффектов допамина // Нанотехнологии в фармакологии и медицине: материалы Всероссийской научно-практической конференции. Оренбург. – 2012. – С. 42-44. 2. Ландарь, Л.Н. Взаимодействие негликозидного кардиотоника допамина с ингибиторами синтеза простагландинов и кининов в почке крысы // Дни молодежной науки: материалы I Всероссийской конференции с международным участием молодых ученых и студентов. – Оренбург: Изд-во ГОУ ВПО «ОрГМА», 2012. – С. 165. 3. Ландарь, Л.Н. Влияние ингибиторов синтеза простагландинов и кининов на формирование почечных эффектов кардиотоника допамина / Л.Н.Ландарь, О.Б.Кузьмин // Материалы Московского международного форума кардиологов 2012. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2012. – № 11. – С. 63. 4. Ландарь, Л.Н. О роли нейрогуморальных систем в действии допамина на ионорегулирующую функцию почек / Л.Н.Ландарь, О.Б.Кузьмин // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2013. – Т. 76. – № 6. – С. 18-21. 54 5. Ландарь, Л.Н. Влияние ингибиторов синтеза простагландинов и кининов на формирование почечных эффектов допамина // Альманах молодой науки. – 2013. – Т. 1. – №1. – С. 6-9. 6. Ландарь, Л.Н. Взаимодействие ингибиторов простагландиновой и ренинангиотензиновой систем с допамином в почке крысы / Л.Н.Ландарь, О.Б.Кузьмин // Материалы Московского международного форума кардиологов 2013. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2013. – № 12. – С. 103-104. 3.3. Взаимодействие допамина в почке крыс с ингибитором калликреин-кининовой системы контрикалом Роль тканевой калликреин-кининовой системы в контроле ионорегулирующей функции почек недостаточно ясна, хотя установлено, что образующиеся в почках кинины, возбуждая клеточные В2-кининовые рецепторы, могут оказывать прямое ингибирующее влияние на транспорт натрия в дистальных сегментах нефрона [74, 124]. Становится также все более очевидным, что почечная тканевая калликреин-кининовая система является также одним из звеньев гуморального механизма, который обеспечивает быструю адаптацию почек к избыточному поступлению в организм ионов калия [2]. Для выяснения роли почечной калликреин-кининовой системы в механизме действия дофаминомиметика допамина на ионорегулирующую функцию почек мы исследовали его взаимодействие в почках крыс с контрикалом (апротинином), который является специфическим ингибитором калликреина и других сериновых протеаз и избирательно тормозит процесс превращения плазменного и тканевого кининогенов в брадикинин и другие кинины. С этой целью контрикал вводился наркотизированным крысам за 20 мин до инъекции допамина внутримышечно в дозе 6000 АТрЕ/кг, которая весьма существенно подавляет кининогеназную активность мочи крыс и содержание в ней иммунореактивного калликреина и кининов [100]. Для более точной оценки характера фармакодинамического взаимодействия 55 допамина в почках с контрикалом мы первоначально изучили влияние одного ингибитора калликреина на функциональное состояние почек наркотизированных крыс. В результате оказалось, что введение животным этого препарата не оказывает достоверного влияния на показатели ионорегулирующей функции почек в течение всего 80-минутного периода наблюдения. Это касается практически всех функциональных показателей, включая величину СКФ, объем мочеотделения, величину экскретируемой фракции натрия и потерю электролитов с мочой (таблица 3.5). Дальнейшие эксперименты показали, что предварительное введение контрикала не оказывает также заметного влияния и на формирование обычной реакции почек в ответ на допамин. На фоне действия ингибитора калликреинкининовой системы допамин вызывал характерную диуретическую реакцию с увеличением СКФ и значительным проростом потери с мочой ионов натрия. Величина мочеотделения спустя 80 мин наблюдения достоверно возросла в 2,41 раза по сравнению с исходным уровнем, то-есть даже несколько больше, чем в контрольных экспериментах с одним допамином. Экскретируемая фракция натрия, характеризующая процесс его реабсорбции в почечных канальцах, возросла в этих условиях с 0,42 ± 0,02% до 0,78 ± 0,08% (р < 0,05), что свидетельствует о полном сохранении ингибирующего действия дофаминомиметика на реабсорбцию этого иона в почках. Повышенная потеря натрия с мочой под влиянием допамина сопровождалась также, как и в контрольных опытах, достоверным приростом калийуреза. Отношение натрий/калий мочи при этом снизилось с 1,67 ± 0,15 до 0,87 ± 0,04 (р < 0,05), что указывает на преимущественное увеличение потери с мочой натрия по сравнению с потерей калия при совместном применении контрикала и допамина (таблица 3.6). Результаты экспериментов с ингибитором синтеза кининов контрикалом предполагают, что почечная калликреин-кининовая система также не участвует в механизме, реализующем действие допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс. 56 Таблица 3.5 - Влияние контрикала на показатели ионорегулирующей функции почек наркотизированных крыс [M±m, n = 10] Контроль Контрикал Клиренс инулина мкл/мин/100 г 219,0 ± 7,22 217,6 ± 11,8 Диурез мкл/мин/100 г 2,72 ± 0,21 2,81 ± 0,30 Выделение натрия мкмоль/мин/100 г 0,191 ± 0,020 0,198 ± 0,029 Экскретируемая фракция натрия, % 0,63 ± 0,06 0,66 ± 0,08 Выделение калия мкмоль/мин/100 г 0,264 ± 0,029 0,279 ± 0,037 0,75 ± 0,06 0,73 ± 0,06 Показатель Отношение натрий/калий в моче Примечание: контроль – значения показателей до введения контрикала (6000 АТрЕ/кг, внутримышечно) * р < 0,05 (критерий Вилкоксона). 57 Материалы данного раздела опубликованы в следующих изданиях : 1. Ландарь, Л.Н. Роль простагландиновой и калликреин-кининовой систем в формировании почечных эффектов допамина // Нанотехнологии в фармакологии и медицине: материалы Всероссийской научно-практической конференции. Оренбург. – 2012. – С. 42-44. 2. Ландарь, Л.Н. Взаимодействие негликозидного кардиотоника допамина с ингибиторами синтеза простагландинов и кининов в почке крысы // Дни молодежной науки: материалы I Всероссийской конференции с международным участием молодых ученых и студентов. – Оренбург: Изд-во ГОУ ВПО «ОрГМА», 2012. – С. 165. 3. Ландарь, Л.Н. Влияние ингибиторов синтеза простагландинов и кининов на формирование почечных эффектов кардиотоника допамина / Л.Н.Ландарь, О.Б.Кузьмин // Материалы Московского международного форума кардиологов 2012. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2012. – № 11. – С. 63. 4. Ландарь, Л.Н. О роли нейрогуморальных систем в действии допамина на ионорегулирующую функцию почек / Л.Н.Ландарь, О.Б.Кузьмин // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2013. – Т. 76. – № 6. – С. 18-21. 5. Ландарь, Л.Н. Влияние ингибиторов синтеза простагландинов и кининов на формирование почечных эффектов допамина // Альманах молодой науки. – 2013. – Т. 1. – №1. – С. 6-9. 3.4. Влияние ингибиторов системы ренин-ангиотензин эналаприла, лозартана и алискирена на реакцию почек крыс при действии допамина Почечная тканевая РАС поддерживает в почках необходимый уровень реабсорбции натрия и обеспечивает его сохранение в организме для поддержания адекватного объема внеклеточной жидкости и АД крови. Ангиотензин II, главный эффекторный пептид этой системы, оказывает, в противоположность допамину, прямое стимулирующее влияние на реабсорбцию натрия в проксимальном канальце, повышая активность Na+/H+-ионообменника 3 типа, локализованного в 58 Таблица 3.6 - Влияние контрикала на показатели ионорегулирующей функции почек наркотизированных крыс при действии допамина [M±m, n = 10] Контроль Контрикал + допамин Клиренс инулина мкл/мин/100 г 210,4 ± 8,67 298,0 ± 15,8 * Диурез мкл/мин/100 г 1,90 ± 0,07 4,58 ± 0,45 * Выделение натрия мкмоль/мин/100 г 0,123 ± 0,008 0,311 ± 0,037 * Экскретируемая фракция натрия, % 0,42 ± 0,02 0,78 ± 0,08 * Выделение калия мкмоль/мин/100 г 0,179 ± 0,027 0,306 ± 0,030 * 1,67 ± 0,15 0,87 ± 0,04 * Показатель Отношение натрий/калий в моче Примечание: контроль – значения показателей спустя 20 мин после инъекции контрикала до введения допамина. * р < 0,05 (критерий Вилкоксона). 59 апикальных мембранах канальцевых клеток, а также Na+, K+-АТФ-азы и Na+/HCO3¯-котранспортера, осуществляющих транспорт этих ионов через их базолатеральные мембраны [55, 113]. В последнее время установлено, что ангиотензин II, способен прямо активировать эпителиальные Na+- каналы и увеличивать реабсорбцию натрия в дистальных отделах нефрона, чувствительных к действию альдостерона [75, 125]. Согласно данным, полученным в экспериментальных исследованиях, допамин в зависимости от дозы может существенно изменять процесс секреции ренина ЮГА и, следовательно, активность циркулирующей РААС и почечной тканевой РАС. При назначении малых, «почечных» доз этого препарата, возбуждающих преимущественно D1-дофаминовые рецепторы клеток ЮГА, продуцирующих ренин, наблюдается не только характерная диуретическая реакция, но и увеличение их секреторной активности, ведущее к активации РАС [118]. Следовало поэтому ожидать, что повышение активности почечной РАС, возникающее при действии допамина, может прямо вовлекаться в механизм действия этого препарата на ионорегулирующую функцию почек. Для выяснения этого вопроса мы изучили взаимодействие допамина в почках крыс с ингибиторами РАС различного механизма действия. С этой целью использовались ингибитор АПФ эналаприл, антагонист АТ1-ангиотен-зиновых рецепторов лозартан и прямой ингибитор ренина алискирен, которые назначались животным внутрь соответственно в дозах 1, 1 и 4 мг/кг/сутки в течение 7 дней до постановки эксперимента. Действительно, уже первоначальные эксперименты с эналаприлом, который подавляет активность РАС и снижает уровень ангиотензина II в плазме крови и почечной ткани [53, 67], показали, что предварительное назначение этого препарата весьма существенно изменяет реакцию почек крыс на допамин (таблица 3.7). Если в контрольных экспериментах с одним допамином диурез к 80 мин наблюдения увеличился в 2,22 раза, то при совместном применении эналаприла и дофаминомиметика величина этого показателя достоверно возросла в 3,46 раза. К этому времени потеря натрия с мочой с мочой увеличилась в 3,15 раза, в то время 60 Таблица 3.7 - Влияние эналаприла на показатели ионорегулирующей функции почек наркотизированных крыс при действии допамина [M±m, n = 10] Контроль Эналаприл + допамин Клиренс инулина мкл/мин/100 г 197,4 ± 4,11 246,6 ± 4,80 * Диурез мкл/мин/100 г 1,96 ± 0,13 6,78 ± 0,40 * Выделение натрия мкмоль/мин/100 г 0,079 ± 0,020 0,249 ± 0,013 * Экскретируемая фракция натрия, % 0,29 ± 0,02 0,78 ± 0,08 * Выделение калия мкмоль/мин/100 г 0,111 ± 0,020 0,551 ± 0,050 * 0,91 ± 0,10 0,45 ± 0,03 * Показатель Отношение натрий/калий в моче Примечание: контроль – значения показателей до введения допамина крысам, получавшим предварительно эналаприл в течение 7 дней (1 мг/кг/сутки, внутрь). * р < 0,05 (критерий Вилкоксона). 61 как прирост натрийуреза в контрольных опытах составил всего 2,15 раза. В этих условиях отмечен также сопоставимый с введением одного допамина прирост клиренса инулина, отражающий величину СКФ, в то время как экскретируемая фракция натрия возросла с 0,29 ± 0,02% до 0,78 ± 0,08% (р < 0,05), что существенно превышает данные, полученные в контрольных опытах, и указывает на более значительное угнетение реабсорбции натрия в почечных канальцах. Одновременно наблюдалась и более выраженная калийуретическая реакция с увеличением потери калия с мочой с исходных 0,111 ± 0,020 до 0,551 ± 0,050 мкмоль/мин/100 г (р < 0,05), при которой величина калийуреза выросла почти в 5 раз по сравнению с исходным уровнем. Индекс натрий/калий мочи при этом достоверно снизился, что указывает на преимущественный прирост выделения с мочой калия по сравнению с натрием. Таким образом, предварительное угнетение эналаприлом активности почеч ной тканевой РАС не только не ослабляет, а, напротив, значительно усиливает ингибирующее влияние допамина на реабсорбцию натрия в почках крыс и существенно увеличивает выраженность эго диуретического, натрийуретического и калийуретического действия. Весьма похожие результаты были получены и в экспериментах с антагонистом АТ1-ангиотензиновых рецепторов лозартаном, который препятствует возбуждению в почках эффекторных тканевых рецепторов РАС, несмотря на повышение в крови АРП, концентрации циркулирующего ангиотензина II и его содержания в ткани почек [43, 85]. Результаты этой серии опытов представлены в таблице 3.8. При совместном применении лозартана и допамина также наблюдалась значительно более выраженная диуретическая реакция, чем при введении одного дофаминомиметика. Величина диуреза достоверно возросла при этом спустя 80 мин наблюдения в 3,27 раза по сравнению с исходным уровнем, в то время как выделение натрия с мочой увеличилось с 0,085 ± 0,004 до 0,267 ± 0,013 мкмоль/мин/100 г (р < 0,05), то-есть в 3,14 раза. В механизме натрийуреза, возникавшего у крыс под влиянием допамина на фоне подавления активности почечной тканевой РАС, также как и в контрольных экспериментах с одним дофаминоми- 62 Таблица 3.8 - Влияние лозартана на показатели ионорегулирующей функции почек наркотизированных крыс при действии допамина [M±m, n = 10] Контроль Лозартан + допамин Клиренс инулина мкл/мин/100 г 194,6 ± 3,56 239,0 ±3 ,78 * Диурез мкл/мин/100 г 1,80 ± 0,11 5,88 ± 0,63 * Выделение натрия мкмоль/мин/100 г 0,085 ± 0,004 0,267 ± 0,013 * Экскретируемая фракция натрия, % 0,31 ± 0,03 0,75 ± 0,09 * Выделение калия мкмоль/мин/100 г 0,168 ± 0,012 0,505 ± 0,037 * 0,51 ± 0,02 0,51 ± 0,03 Показатель Отношение натрий/калий в моче Примечание: контроль – значения показателей до введения допамина крысам получавшим предварительно лозартан в течение 7 дней (1 мг/кг/сутки, внутрь). * р < 0,05 (критерий Вилкоксона). 63 метиком, участвовали умеренный прирост СКФ и угнетение реабсорбции натрия в канальцах почек. Об этом свидетельствует не только увеличение клиренса инулина, но и достоверное увеличение экскретируемой фракции натрия с 0,31 ± 0,03% до 0,75 ± 0,09% (р < 0,05). Выделение калия с мочой также значительно и достоверно возросло, но в меньшей степени, чем при совместном назначении крысам эналаприла и допамина. Отношение натрий/калий мочи при этом заметно не изменилось, что свидетельствует о примерно одинаковом приросте выделения обоих электролитов с мочой. В заключительной серии экспериментов для подавления активности РАС использовался прямой ингибитор ренина алискирен, который специфически снижает АРП и образование активного ренина и ангиотензина II непосредственно в ткани почек [21, 98, 112]. Как и в предыдущих сериях экспериментов с ингиби тором АПФ эналаприлом и антагонистом АТ1-ангиотензиновых рецепторов лозартаном, предварительное назначение крысам алискирена резко повышало чувствительность почек к допамину. Введение допамина на фоне подавления активности почечной РАС сопровождалось достоверным увеличением диуреза в 6,57 раза с одновременным приростом потери натрия с мочой в 7,18 раза. К этому времени отмечено дополнительное увеличение СКФ, однако экскретируемая фракция натрия возросла при этом с 0,38 ± 0,03% до 1,69 ± 0,12% (р < 0,05), что намного превышает прирост этого показателя в контрольных опытах с одним допамином и свидетельствует о значительно более выраженном угнетении реабсорбции этого иона в канальцах почек. Одновременно под влиянием допамина наблюдалась также более выраженная калийуретическая реакция с приростом калийуреза в 6,95 раза по сравнению с исходным уровнем. Отношение натрий/калий мочи при этом существенно не изменилось. Результаты опытов представлены в таблице 3.9. Следовательно, предварительное угнетение активности почечной тканевой РАС у наркотизированных крыс с помощью эналаприла, лозартана или алискирена значительно усиливает диуретический, натрийуретический и калийуретический эффекты дофаминомиметика допамина. В механизме формирования этих почечных эффектов ведущее значение имеет потенцирование ингибиторами РАС 64 Таблица 3.9 - Влияние алискирена на показатели ионорегулирующей функции почек наркотизированных крыс при действии допамина [M±m, n = 10] Контроль Алискирен + допамин Клиренс инулина мкл/мин/100 г 210,5 ± 3,22 345,4 ±9 ,02 * Диурез мкл/мин/100 г 1,98 ± 0,07 13,0 ± 0,74 * Выделение натрия мкмоль/мин/100 г 0,115 ± 0,012 0,826 ± 0,101 * Экскретируемая фракция натрия, % 0,38 ± 0,03 1,69 ± 0,12 * Выделение калия мкмоль/мин/100 г 0,103 ± 0,012 0,716 ± 0,036 * 1,18 ± 0,09 1,25 ± 0,18 Показатель Отношение натрий/калий в моче Примечание: контроль – значения показателей до введения крысам допамина, получавшим предварительно алискирен в течение 7 дней (4 мг/кг/сутки, внутрь). * р < 0,05 (критерий Вилкоксона). 65 прямого угнетающего действия этого препарата на процесс реабсорбции ионов натрия в почках. В целом, данные, полученные при фармакологическом анализе роли нейрогуморальных систем в механизме действия дофаминомиметика допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс, свидетельствуют о том, что ингибитор циклооксигеназы диклофенак натрия и ингибитор калликреина контрикал не влияют на формирование почечных эффектов этого препарата. Предварительное угнетение активности почечной тканевой РАС с помощью ингибитора АПФ эналаприла, антагониста АТ1-ангиотензиновых рецепторов лозартана или прямого ингибитора ренина алискирена потенцирует прямое ингибирующее влияние допамина на реабсорбцию натрия в почках крыс и значительно увеличивает его диуретическое, натрийуретическое и калийуретическое действие. Результаты этих экспериментов предполагают, что почечные простагландиновая и калликреин-кининовая системы не участвуют в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек. Тканевая РАС почек прямо вовлекается в механизм формирования почечных эффектов допамина, выполняя функцию модулятора, который препятствует избыточной потере почками воды и электролитов при назначении этого препарата. Материалы данного раздела опубликованы в следующих изданиях: 1. Ландарь, Л.Н. О роли нейрогуморальных систем в действии допамина на ионорегулирующую функцию почек / Л.Н.Ландарь, О.Б.Кузьмин // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2013. – Т. 76. – № 6. – С. 18-21. 2. Ландарь, Л.Н. Влияние алискирена и эналаприла на формирование диуретического и натрийуретического эффекта кардиотоника допамина в почках/ Дни молодежной науки: материалы II Всероссийской конференции с международным участием молодых ученых и студентов. – Оренбург: Изд-во ГБОУ ВПО «ОрГМА», 2013. – С. 59. 3. Ландарь, Л.Н. Взаимодействие ингибиторов простагландиновой и ренинангиотензиновой систем с допамином в почке крысы / Л.Н.Ландарь, О.Б.Кузьмин 66 // Материалы Московского международного форума кардиологов 2013. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2013. – № 12. – С. 103-104. 4. Ландарь, Л.Н. Участие ренин-ангиотензиновой системы в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс / Л.Н.Ландарь, О.Б.Кузьмин // Материалы Московского международного форума кардиологов и терапевтов 2014. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2014. – № 13. – С. 21. 5. Ландарь, Л.Н. Влияние ингибиторов ренин-ангиотензиновой системы на эффекты дофамина в почке крысы / Л.Н.Ландарь, О.Б.Кузьмин, Н.В.Бучнева // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2014. – Т. 77. – № 7. – С. 16-19. 3.5. Взаимодействие допамина с петлевым диуретиком фуросемидом в почке крыс с моделью сердечной недостаточности Фуросемид, торасемид и другие петлевые диуретики широко применяются для лечения отечного синдрома у больных ХСН и восстановления функции почек при остром кардиоренальном синдроме, возникающем у пациентов с острой декомпенсированной сердечной недостаточностью. Однако фармакологические особенности совместного влияния допамина и препаратов этого ряда на ионорегулирующую функцию почек при ХСН во многом остаются неясными. Петлевые диуретики обладают мощным диуретическим и салуретическим действием, причиной которого является избирательное угнетение активности Na +K+-2Cl¯-котранспортера, осуществляющего симпорт этих ионов через апикальные мембраны клеток ТВКПГ [2, 48]. Действие допамина на почки связано преимущественно с возбуждением почечных D1-дофаминовых рецепторов клеток проксимальных канальцев, которые опосредуют его ингибирующее влияние на ионные механизмы, обеспечивающие реабсорбцию натрия в этом сегменте нефрона. Исходя из этого, можно ожидать, что допамин, тормозящий транспорт ионов в проксимальном канальце, может усиливать диуретический и натрийуретический эффекты петлевых диуретиков благодаря увеличению доставки нереабсорбирован- 67 ного натрия к месту действия этих препаратов в ТВКПГ. Для уточнения характера фармакодинамического взаимодействия допамина и петлевых диуретиков в почках мы исследовали влияние допамина и его комбинации с фуросемидом на показатели ионорегулирующей функции почек крыс с ЭСН, вызванной длительным комбинированным действием на сердце избыточной физической нагрузки и больших доз адреномиметика фенилэфрина [6, 20]. С целью более точной оценки эффектов исследуемых лекарственных препаратов при ХСН мы первоначально изучили влияние допамина на показатели ионорегулирующей функции почек интактных крыс, а затем исследовали реакцию почек крыс на допамин и его сочетание с фуросемидом у животных с моделью сердечной недостаточности. Введение допамина интактным крысам не оказывало заметного влияния на величину диуреза, но вызывало характерную натрийуретическую реакцию. Выделение натрия с мочой достоверно возросло с 37,4±6,60 до 62,6±6,95 мкмоль/4,5 ч/100 г (р < 0,05), то-есть в 1,67 раза, и было связано в основном с угнетением в почках реабсорбции этого иона, так как экскреция креатинина с мочой, отражающая величину СКФ, при этом существенно не изменилась. Допамин не оказывал также достоверного влияния на выделение почками калия, но почти в 2 раза увеличивал к концу наблюдения отношение натрий/калий мочи, что подтверждает известные данные о преимущественном действии этого препарата на транспорт натрия в канальцах почек (таблица 3.10). Предварительная оценка функционального состояния почек животных с моделью сердечной недостаточности показала, что у них формируется характерный для ХСН дефект реабсорбции натрия, который проявляется в замедлении его выведения из организма. Благодаря этому уровень экскреции натрия с мочой после 0,6% солевой нагрузки у крыс с ЭСН упал с исходных 37,4±6,60 до 18,2±4,48 мкмоль/4,5 ч/100 г (р < 0,05), что составляет более 50% от уровня натрийуреза, отмеченного в контрольных опытах с интактным животными. У крыс с моделью сердечной недостаточности наблюдалось также достоверное уменьшение выделения с мочой креатинина, которое косвенно указывает на участие снижения СКФ в 68 Таблица 3.10 - Влияние допамина и его комбинации с фуросемидом на показатели ионорегулирующей функции почек крыс с моделью сердечной недостаточности (M±m) Интактные крысы Крысы с моделью СН Показатель Контроль n = 10 Допамин n = 10 Контроль n = 10 Допамин n = 10 Фуросемид n = 10 Допамин + фуросемид n = 10 Диурез мл/4,5 ч/100 г 1,81±0,17 1,95±0,19 1,32±0,18 1,51±0,20 2,11±0,14 * 2,92±0,27 ** Экскреция креатинина мкмоль/4,5ч/100 г 10,1±1,82 13,7±2,50 4,85±0,40 4,42±0,63 15,9±2,75 * 23,1±2,97 Экскреция натрия мкмоль/4,5ч/100 г 37,4±6,60 62,6±6,95 * 18,2±4,48 39,4±8,20 * 130,5±14,8 * 190,5±16,3** Экскреция калия мкмоль/4,5ч/100 г 66,2±13,7 43,2±8,35 37,6±7,71 38,2±9,95 45,9±3,57 51,3±5,96 Отношение натрий/калий в моче 0,77±0,12 1,59±0,16 * 0,39±0,07 1,05±0,09 * 2,92±0,25 * 3,93±0,36 ** Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с контролем, ** - р < 0,05 по сравнению с результатами, полученными при введении крысам одного фуросемида (критерий Манна-Уитни); n – количество экспериментальных животных. СН – сердечная недостаточность. 69 механизме задержки натрия в организме. Одновременно у таких животных по сравнению с интактными крысами отмечалась достаточно выраженная антикалийуретическая реакция, которая сопровождалась уменьшением отношения натрий/калий мочи с 0,77±0,12 до 0,39±0,07 (р < 0,05). Дальнейшие эксперименты показали, что функциональный сдвиг, возникающий при действии допамина в почках крыс с ЭСН, принципиально не отличается от реакции почек интактных животных на этот препарат. Как и в контрольных опытах, не было отмечено достоверных изменений в величине диуреза и экскреции с мочой креатинина, свидетельствующее об отсутствии достаточно выраженных сдвигов в объеме клубочковой фильтрации. Выделение почками натрия в этих условиях достоверно выросло в 2,16 раза, но в абсолютном значении примерно соответствовало приросту экскреции этого иона почками, отмеченного в экспериментах на интактных крысах. Количество теряемого с мочой калия при этом практически не изменилось, в то время как отношение натрий калий мочи возросло с 0,39±0,07 до 1,05±0,09 (р < 0,05). Введение фуросемида животным с ЭСН вызывало ответную реакцию почек, характерную для петлевых диуретиков. Под влиянием этого препарата развивалась диуретическая реакция, которая сопровождалась значительным приростом натрийуреза, выделения креатинина и резким увеличением индекса натрий/калий мочи. После назначения фуросемида уровень потери натрия с мочой возрос с 18,2±4,48 до 130,5±14,8 мкмоль/4,5 ч/100 г (р < 0,05), то-есть примерно в 7,17 раза по сравнению с данными контрольных экспериментов. Добавление к фуросемиду допамина существенно усиливало его диуретическое и натрийуретическое действие. Выделение почками натрия при совместном применении обоих препаратов возросло дополнительно еще в 1,46 раза по сравнению с величиной прироста натрийуреза, наблюдавшегося после введения одного фуросемида. Поскольку при этом не было отмечено достоверных изменений в экскреции креатинина, можно полагать, что прирост натрийуреза, возникавшего при добавлении допамина к фуросемиду, был обусловлен в основном дополнительным угнетением реабсорбции натрия в почечных канальцах. Потеря калия с мочой в этих условиях также воз- 70 росла, но изменения в величине калийуреза не были достоверными. Отношение натрий/калий мочи при совместном применении допамина и фуросемида у крыс с ЭСН, также как и в опытах с одним допамином, выросло с 2,92±0,25 до 3,93±0,36 (р < 0,05), что указывает на преимущественное увеличение экскреции почками натрия по сравнению с калием. Таким образом, введение допамина крысам с ЭСН, вызванной совместным воздействием на сердце избыточной физической нагрузки и больших доз адреномиметика фенилэфрина, не оказывает существенного влияния на величину диуреза и экскрецию почками калия, но вызывает выраженную натрийуретическую реакцию, которая сопровождается увеличением отношения натрий/калий мочи. Добавление дофаминомиметика к фуросемиду усиливает диуретический, натрийуретический и, в меньшей степени, калийуретический эффекты этого диуретика у животных с моделью сердечной недостаточности, способствуя дополнительному приросту величины индекса натрий/калий мочи. Материалы данного раздела опубликованы в следующих изданиях: 1. Ландарь, Л.Н. Взаимодействие допамина с петлевыми диуретиками в почке крыс с моделью сердечной недостаточности / Л.Н.Ландарь, О.Б.Кузьмин, М.О.Пугаева // Материалы Российского национального конгресса кардиологов 2011. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2011. – № 6 [Приложение 1]. – С. 175. 2. Ландарь, Л.Н. Влияние допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс с моделью сердечной недостаточности // Сибирский медико-биологический конгресс: материалы I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. – Барнаул: Изд-во ГБОУ ВПО «АГМУ», 2011. – С. 36-37. 3. Ландарь, Л.Н. Влияние допамина на диуретический и натрийуретический эффекты фуросемида у крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2011. – № 16. – С. 292-294. 4. Ландарь, Л.Н. Фармакодинамическое взаимодействие кардиотоника допамина с фуросемидом в почке крыс с экспериментальной сердечной недостаточно- 71 стью // Инновации в современной фармакологии: материалы IV съезда фармакологов России. Москва: Фолиум. – 2012. – С. 114. 72 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Допамин, лекарственный препарат из группы дофаминомиметиков, оказывает благоприятное влияние на гемодинамику и ионорегулирующую функцию почек у пациентов с кардиогенным шоком и острой сердечной недостаточностью различного происхождения, включая лиц с острой декомпенсированной ХСН [24, 44]. Фармакологические эффекты, развивающиеся в почках при назначении допамина, отражают функциональное значение почечной дофаминергической системы, которая совместно с простагландиновой и калликреин-кининовой системами почек непосредственно участвует в регуляции водно-солевого гомеостаза организма, препятствуя задержке натрия и жидкости, возникающей при избыточном потреблении поваренной соли или гиперактивности СНС, РААС и других сосудосуживающих нейрогуморальных систем. Благоприятное действие небольших «почечных» доз допамина на ионорегулирующую функцию почек хорошо изучено и связано с прямой стимуляцией D 1дофаминовых рецепторов, которые располагаются в гладкой мускулатуре почечных сосудов, клубочковых артериолах, клетках ЮГА, продуцирующих ренин, клетках проксимальных канальцев и других сегментов нефрона. При их возбуждении возрастает СКФ и развивается выраженная диуретическая реакция, которая сопровождается значительным увеличением выделения с мочой ионов натрия и других электролитов. Диуретический и салуретический эффекты этого дофаминомиметика обусловлены, прежде всего, прямым угнетением реабсорбции натрия в проксимальных канальцах, которое возникает в ответ на подавление активности Na+/H+-обменника 3 типа, локализованного в апикальных мембранах канальцевых клеток [27], и Na+, K+-АТФ-азы, осуществляющей активный транспорт этих ионов через их базолатеральные мембраны [47, 99]. Вместе с тем, в формирование почечных эффектов допамина могут включаться нейрогуморальные системы почек, которые участвуют в регуляции транс- 73 порта натрия и других ионов в различных сегментах нефрона. Прежде всего, это касается циркулирующей и почечной тканевой РАС, которые обеспечивают поддержание в почках уровня реабсорбции натрия, необходимого для сохранения адекватного объема циркулирующей крови и системного АД. Не исключено, что в механизм, реализующий действие допамина на ионорегулирующую функцию почек, могут вовлекаться почечные простагландиновая и калликреин-кининовая системы, которые не только обладают сосудорасширяющим действием, но и способны оказывать существенное влияние на процессы реабсорбции натрия и калия в дистальных отделах нефрона. Требуют также уточнения некоторые особенности фармакодинамического взаимодействия в почках допамина и петлевых диуретиков, комбинация которых используется у больных декомпенсированной ХСН для преодоления устойчивости к этим препаратам и восстановления нарушенной функции почек. Для выяснения этих вопросов мы провели фармакологический анализ роли простагландиновой, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем почек в механизме действия допамина в почке крысы. В экспериментах на крысах с ЭСН, вызванной длительным комбинированным воздействием на сердце избыточной физической нагрузки и больших доз адреномиметика фенилэфрина, уточнены также особенности фармакодинамического взаимодействия допамина и петлевого диуретика фуросемида. Фармакологический анализ роли нейрогуморальных систем в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек Первоначальные опыты с допамином подтвердили известные данные о том, что небольшие «почечные» дозы этого препарата вызывают у крыс характерную реакцию почек, которая проявляется в увеличении СКФ, диуреза и выделения с мочой ионов натрия и калия. Главную роль в формировании выраженной диуретической и натрийуретической реакции играет прямое угнетение допамином реабсорбции натрия в почечных канальцах, о чем свидетельствует достоверный прирост величины экскретируемой фракции этого иона, выявленный во всех экспериментах. Выяснилось также, что предварительное введение крысам антагони- 74 ста D-дофаминовых рецепторов галоперидола практически полностью устраняет реакцию почек крыс на допамин, что соответствует данным, полученным ранее другими авторами [10, 39], и подтверждает представление о ведущей роли D1дофаминорецепторов, локализованных в гладкой мускулатуре почечных сосудов и клетках почечных канальцев, в механизме дофаминергической регуляции функции почек. Известно также, что допамин может повышать активность простагландиновой [59, 119], калликреин-кининовой [79] и ренин-ангиотензиновой систем [118], которые участвуют в регуляции гемодинамики почек и ионного транспорта в различных сегментах нефрона. Для оценки роли этих нейрогуморальных систем в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек мы исследовали его фармакодинамическое взаимодействие в почках со специфическими ингибиторами синтеза простагландинов, кининов и почечной тканевой РАС. Синтезируемые в почках простагландины играют важную роль не только в поддержании адекватного уровня СКФ и почечной гемодинамики, но и в регуляции реабсорбции натрия в почках. Прежде всего, это касается ПГЕ2, который продуцируется клетками почечных канальцев и действует как аутокринный регулятор транспорта натрия и других ионов в различных отделах нефрона. В собирательных трубках коркового слоя ПГЕ2 специфически возбуждает ЕР2-рецепторы клеточных мембран, активирует внутриклеточный АЦ/цАМФ сигнальный путь и прямо тормозит реабсорбцию натрия, ингибируя активность Na +, K+- АТФ-азы, локализованной в базолатеральных мембранах канальцевых клеток [107]. Особую роль в контроле ионорегулирующей функции почек играет ПГЕ2, который в больших количествах синтезируется интерстициальными клетками мозгового слоя. Благодаря своим свойствам он не только поддерживает адекватный объем медуллярного кровотока, необходимого для нормального функционирования механизма концентрирования мочи, но и одновременно препятствует избыточной стимуляции реабсорбции натрия и воды в медуллярных собирательных трубках и ТВКПГ, возникающей под влиянием гиперактивности СНС, циркулирующей и почечной тканевой РАС [36]. Вполне возможно поэтому, что простагландиновая 75 система почек может по крайней мере частично опосредовать действие допамина на транспорт натрия и других ионов в дистальных сегментах нефрона. Для выяснения этого вопроса мы исследовали влияние ингибитора циклооксигеназы диклофенака натрия, подавляющего синтез ПГЕ2 и других простаноидов, на формирование почечных эффектов допамина. Опыты показали, что диклофенак натрия в дозе 3 мг/кг, существенно ингибирующей образование ПГЕ 2 в почечной ткани [109], сам по себе оказывает угнетающее влияние на функцию почек крыс, характерное для других нестероидных противовоспалительных средств. После введения этого препарата отмечалась умеренная антидиуретическая реакция, которая сопровождалась снижением СКФ и задержкой натрия в организме, что соответствует данным, полученным ранее другими авторами [69]. Однако предварительное подавление диклофенаком натрия синтеза простагландинов в почечной ткани не оказало заметного влияния на реакцию почек на допамин. В этих условиях у дофаминомиметика полностью сохранялось способность увеличивать СКФ и вызывать выраженную диуретическую и натрийуретическую реакцию, связанную с угнетением реабсорбции натрия в почечных канальцах. Одновременно был отмечен характерный прирост выделения почками калия без существенных сдвигов в отношении натрий/калий мочи. В связи с этим имеются основания полагать, что образующиеся в почках простагландины не участвуют в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс. Основные звенья почечной калликреин-кининовой системы располагаются на протяжении двух дистальных отделов нефрона: от macula densa ЮГА до конечной части дистального извитого канальца, а затем от связующего сегмента до начала собирательных трубок коркового слоя. Железистый калликреин, продуцируемый соединительными клетками этих канальцев, генерирует в просвете нефрона и интерстициальной жидкости, омывающей базолатеральные мембраны клеток, кинины, которые действуют локально, так как быстро метаболизируются тканевыми кининазами, преимущественно АПФ, который одновременно выполняет функцию кининазы II, метаболизирующей кинины до неактивных пептидов [116, 117]. 76 Функциональное значение этой нейрогуморальной системы в контроле ионорегулирующей функции почек недостаточно ясно, хотя установлено, что кинины, возбуждая клеточные В2-кининовые рецепторы, могут оказывать прямое ингибирующее влияние на транспорт натрия в собирательных трубках коркового и мозгового вещества почек [74, 124]. Ряд данных указывает также на то, что кинины, образующиеся в почечной тканевой калликреин-кининовой системе, являются, по-видимому, одним из компонентов почечного гуморального механизма, который обеспечивает быструю адаптацию почек к избыточному поступлению в организм ионов калия [42]. Для оценки роли почечной калликреин-кининовой системы в механизме формирования почечных эффектов допамина мы изучили его взаимодействие в почках крыс с ингибитором калликреина контрикалом, который предварительно вводился животным в дозе 6000 АТрЕ, значительно снижающей кининогеназную активность мочи и содержание в ней иммунореактивного калликреина и кининов [100]. В наших экспериментах инъекция крысам этого ингибитора калликреинкининовой системы не оказывала заметного влияния на показатели ионорегулирующей функции почек и не препятствовала их реакции на допамин. На фоне действия контрикала дофаминомиметик вызывал обычную диуретическую реакцию с увеличением СКФ и значительным приростом потери почками ионов натрия и калия, главной причиной которой, как и в контрольных опытах, было угнетение транспорта натрия в почечных канальцах. Результаты этих экспериментов предполагают, что почечная калликреин-кининовая система также не включается в механизм, реализующий действие допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс. Циркулирующая РААС и почечная тканевая РАС являются основными звеньями нейрогуморального механизма, сохраняющего натрий в организме для поддержания адекватного объема циркулирующей крови и системного АД. Большинство биологических эффектов ангиотензина II, основного эффекторного пептида РАС, связано с возбуждением в почках АТ1-ангио-тензиновых рецепторов, локализованных в гладкой мускулатуре сосудов, клетках канальцев и других 77 структурах почечной ткани. В проксимальных канальцах почек ангиотензин II, в противоположность допамину, оказывает прямое стимулирующее влияние на реабсорбцию натрия, повышая активность апикального Na+/H+-ионообменника 3 типа, в также Na+, K+-АТФ-азы и Na+/HCO3¯-котранспортера, переносящих эти ионы через их базолатеральные мембраны [55, 113]. В последнее время установлено, что он способен прямо повышать проницаемость эпителиальных Na+- каналов и увеличивать реабсорбцию этого в собирательных трубках и других дистальных сегментах нефрона, чувствительных к действию альдостерона [75, 125]. Можно было поэтому ожидать, что подавление активности РАС с помощью ее специфических ингибиторов окажет существенное влияние на формирование почечных эффектов допамина. С этой целью мы изучили взаимодействие этого препарата в почках крыс с ингибитором АПФ эналаприлом, антагонистом АТ1-ангиотензиновых рецепторов лозартаном и прямым ингибитором ренина алискиреном, которые назначались животным внутрь соответственно в дозах 1, 1 и 4 мг/кг/сутки в течение 7 дней до постановки эксперимента. Первоначальные эксперименты с эналаприлом, который снижает уровень ангиотензина II в плазме крови, почечной ткани и ослабляет его действие на транспорт натрия в нефроне [29, 67], показали, что предварительное назначение этого препарата весьма заметно увеличивает чувствительность почек крыс к допамину. Назначение эналаприла резко усиливало выраженность диуретического эффекта дофаминомиметика с соответствующим увеличением выделения почками натрия и калия. Если в контрольных опытах с дофамином прирост натрийуреза составил 2,15 раза, то на фоне предварительного подавления активности почечной РАС эналаприлом величина этого показателя возросла в 3,15 раза. В этих условиях был отмечен также резкий прирост величины экскретируемой фракции натрия, указывающий на более выраженное угнетение реабсорбции этого иона в почечных канальцах. Весьма похожие результаты были получены и в экспериментах с антагонистом АТ1-ангиотензиновых рецепторов лозартаном, который, блокируя рецепторы этого подтипа в различных структурах почечной ткани, существенно 78 угнетает активность почечной тканевой РАС [84, 123]. Предварительное подавление активности РАС алискиреном, который по механизму своего действия отличается от эналаприла и лозартана, еще больше повышало чувствительность почек крыс к допамину. При совместном применении прямого ингибитора ренина и дофаминомиметика величина диуреза выросла в 6,57 раза, потеря натрия с мочой в 7,18 раза и экскреции почками калия в 6,95 раза. Прирост экскретируемой фракции натрия составил 4,45 раза, что намного превышает данные, полученные в экспериментах с одним допамином. Таким образом, предварительное подавление активности почечной тканевой РАС различными по механизму действия ингибиторами этой системы весьма значительно усиливает угнетающее влияние допамина на реабсорбцию натрия в почках крыс и резко увеличивает выраженность его диуретического, натрийуретического и калийуретического действия. В связи с этим имеются основания полагать, что почечная тканевая РАС прямо вовлекается в механизм действия допамина на ионорегулирующую функцию почек, играя роль модулятора, препятствующего избыточной потере жидкости и электролитов с мочой. В целом, результаты фармакологической оценки роли почечных нейрогуморальных систем в действии дофаминомиметика допамина на ионорегулирующую функцию почек свидетельствуют о том, что ингибитор циклооксигеназы диклофенак натрия и ингибитор калликреина контрикал не влияют на реакцию почек крыс в ответ на дофамин. Эти данные предполагают, что простагландиновая и калликреин-кининовая системы почек не участвуют в формировании его почечных эффектов. Ингибитор АПФ эналаприл, антагонист АТ1-ангиотензиновых рецепторов лозартан и прямой ингибитор ренина алискирен резко усиливают диуретический, натрийуретический и калийуретический эффекты допамина. Результаты этих экспериментов указывают на то, что почечная тканевая РАС прямо включается в механизм действия допамина на ионорегулирующую функцию почек, выполняя функцию модулятора, препятствующего избыточной потере воды и электролитов с мочой при действии этого препарата. 79 Взаимодействие допамина с петлевым диуретиком фуросемидом в почке крыс с моделью сердечной недостаточности В опытах на крысах с ЭСН мы исследовали особенности взаимодействия в почках допамина с петлевым диуретиком фуросемидом, комбинация которых используется для восстановления функции почек при остром кардиоренальном синдроме и рефрактерности к диуретикам у лиц с декомпенсированной ХСН. Эксперименты выполнены на животных с моделью сердечной недостаточности, вызванной длительной избыточной физической нагрузкой и введением больших доз адреномиметика фенилэфрина. Эта модель отличается формированием характерного для застойной ХСН дефекта реабсорбции натрия в почках, который проявляется в увеличении его реабсорбции в почечных канальцах и замедлении выведения из организма после солевой нагрузки [3]. Проведенные опыты показали, что функциональный сдвиг, возникающий в почках после введения допамина крысам с ЭСН, принципиально не отличается от реакции почек интактных животных на этот препарат. В обоих случаях наблюдалась диуретическая реакция, которая сопровождалась достоверным приростом выделения почками натрия. Однако животные с ЭСН оказались более чувствительными к действию допамина, чем интактные крысы. Экскреция натрия с мочой при действии допамина у крыс с моделью ХСН возросла в 2,16 раза, в то время как прирост выделения этого иона с мочой у интактных животных составил всего 1,67 раза. Поскольку дофаминомиметик в обеих группах крыс не оказывал существенного влияния на экскрецию почками креатинина, отражающую величину СКФ, имеются основания полагать, что его выраженный натрийуретический эффект связан с прямым угнетением реабсорбции натрия в почечных канальцах. У крыс с ЭСН допамин вызывал также прирост индекса натрий/калий мочи в 2,69 раза, что значительно превосходит аналогичный эффект, наблюдавшийся под влиянием этого препарата у интактных животных. Фуросемид, торасемид и другие петлевые диуретики обладают мощным диуретическим, натрийуретическим и калийуретическим действием, в основе которого лежит прямое угнетение активности белка-переносчика, осуществляющего 80 симпорт Na+-K+-2Cl¯ через апикальные мембраны клеток ТВКПГ [2, 48]. Поскольку специфический ингибирующий эффект допамина на транспорт натрия в нефроне локализован преимущественно в проксимальном канальце, следовало ожидать, что этот препарат будет усиливать диуретический и другие эффекты петлевых диуретиков за счет увеличения доставки нереабсорбированного в этом отделе натрия к месту действия этих препаратов в ТВКПГ. Эксперименты на крысах с ЭСН подтвердили, что фуросемид вызывает выраженный диуретический эффект, который сопровождается резким увеличение потери натрия с мочой в 7,17 раза по сравнению с данными контрольных опытов. Добавление допамина к фуросемиду существенно усиливало его диуретическое и натрийуретическое действие. Выделение почками натрия при совместном назначении дофаминомиметика и петлевого диуретика возросло еще в 1,46 раза по сравнению с приростом натрийуреза, возникавшим после введения одного фуросемида. Поскольку при этом не было отмечено достоверных сдвигов в экскреции почками креатинина, следует полагать, что увеличение потери натрия с мочой, наблюдавшееся при добавлении допамина к фуросемиду, было обусловлено дополнительным угнетением реабсорбции натрия в почечных канальцах. Потеря калия с мочой в этих условиях также возросла, но изменения в величине калийуреза не были достоверными. Отношение натрий/калий мочи при совместном назначении животным с ЭСН допамина и фуросемида, также как и в опытах с одним допамином, достоверно возросло, что указывает на преимущественный прирост выделения почками натрия по сравнению с калием. Таким образом, допамин у крыс с ЭСН, вызванной избыточной физической нагрузкой и большими дозами адреномиметика фенилэфрина, вызывает выраженную натрийуретическую реакцию, которая сопровождается приростом отношения натрий/калий мочи. Добавление дофаминомиметика к фуросемиду усиливает диуретический, натрийуретический и, в меньшей степени, калийуретический эффекты этого диуретика у животных с моделью сердечной недостаточности, способствуя дополнительному увеличению отношения натрий/калий мочи. 81 Дальнейшие перспективы разработки темы связаны с выяснением особенностей действия на ионорегулирующую функцию почек пероральных дофаминомиметиков, которые совместно с ингибиторами РАС могут быть использованы для повышения эффективности лечения отечного синдрома у больных ХСН. 82 ВЫВОДЫ 1. Допамин вызывает у наркотизированных крыс умеренную диуретическую, натрийуретическую и калийуретическую реакцию, основной причиной которой является угнетение реабсорбции натрия в почках. Предварительное введение животным антагониста дофаминовых рецепторов галоперидола устраняет реакцию почек крыс на допамин. 2. Предварительное назначение наркотизированным крысам ингибитора синтеза простагландинов диклофенака натрия не оказывает существенного влияния на реакцию почек в ответ на допамин. 3. Предварительное введение наркотизированным крысам ингибитора калликреин-кининовой системы контрикала не препятствует формированию в почках эффектов, возникающих при действии допамина. 4. Предварительное назначение крысам ингибитора ангиотензин I- превращающего фермента эналаприла, антагониста ангиотензиновых рецепторов лозартана или прямого ингибитора ренина алискирена, угнетающих активность ренин-ангиотензиновой системы, усиливает диуретическое, натрийуретическое и калийуретическое действие допамина. 5. Допамин у крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью, вызванной избыточной физической нагрузкой и большими дозами адреномиметика фенилэфрина, вызывает выраженную натрийуретическую реакцию, которая сопровождается приростом отношения натрий/калий мочи. Добавление дофаминомиметика к фуросемиду усиливает у животных с моделью сердечной недостаточности усиливает диуретический, натрийуретический и, в меньшей степени, калийуретический эффекты диуретика, способствуя дополнительному увеличению отношения натрий/калий мочи. 83 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Экспериментальные данные об отсутствии влияния ингибитора циклооксигеназы диклофенака натрия, ингибитора калликреина контрикала на реакцию почек в ответ на дофаминомиметик допамин и потенцировании ингибитором ангиотензин I-превращающим ферментом эналаприлом, антагонистом ангиотензиновых рецепторов лозартаном и прямым ингибитором ренина алискиреном диуретического действия допамина рекомендуется учитывать при их совместном назначении в клинике. Данные о способности допамина значительно усиливать диуретическое и натрийуретическое действие петлевого диуретика фуросемида при экспериментальной сердечной недостаточности с существенным дополнительным приростом отношения натрий/калий мочи рекомендуется учитывать при комбинированном применении этих лекарственных препаратов у пациентов с хронической сердечной недостаточностью. Допамин в дозе 1-3 мкг/кг/минуту внутривенно, вызывающий у людей выраженную диуретическую реакцию, рекомендуется использовать для потенцирования диуретического действия фуросемида у больных хронической сердечной недостаточностью с отечным синдромом. 84 Список сокращений АГ – артериальная гипертония АД – артериальное давление Анг – ангиотензин АПФ – ангиотензин I-превращающий фермент АРП – активность ренина плазмы крови АТ-рецепторы – ангиотензиновые рецепторы АД – диастолическое АД ИБС – ишемическая болезнь сердца ККС – калликреин-кининовая система ОПН – острая почечная недостаточность ОСН – острая сердечная недостаточность ОПСС – общее периферическое сопротивление сосудов ПГ-система – простагландиновая система ПГЕ2 – простагландин Е2 ПГG2 – простагландин G2 ПГI2 – простагландин I2 (простациклин) ПГН2 – простагландин Н2 ПГF2α – простагландин F2α ПК – проксимальный каналец ПНП – предсердный натрийуретический пептид РААС – ренин-ангиотензин-альдостероновая система РАС – ренин-ангиотензиновая система САД – систолическое АД СКФ – скорость клубочковой фильтрации СНС – симпатическая нервная система СТ – собирательные трубки 85 ТВКПГ – толстое восходящее колено петель Генле ЦНС – центральная нервная система ХПН – хроническая почечная недостаточность ХСН – хроническая сердечная недостаточность ЦОГ – циклооксигеназа ЧСС – частота сердечных сокращений ЭСН – экспериментальная сердечная недостаточность ЮГА – юкстагломерулярный аппарат NO – оксид азота 86 Список литературы 1. Берхин, Е.Б. Влияние дофамина и его сочетания с фуросемидом на мочеотделение у крыс // Фармакология и токсикология. – 1985. – Т. 48, № 2. – С. 89-92. 2. Брюханов, В.М., Зверев, Я.Ф. Побочные эффекты современных диуретиков / В.М. Брюханов, Я.Ф.Зверев. – Новосибирск: ЦЭРИС, 2003, С. 12-114. 3. Бучнева, Н.В. Влияние β-адреноблокаторов третьего поколения на ионорегулирующую функцию почек крыс с моделью сердечной недостаточности / Н.В. Бучнева, О.Б. Кузьмин // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2012. – Т. 75, № 11. – С. 7-9. 4. Гублер, Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов / Е.В. Гублер. – Ленинград: Медицина, 1978. – 296с. 5. Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях: EST № 123 от 18 марта 1986 г. Страсбург, 1986. – 15 с. 6. Инчина, В.И. Состояние миокарда в модельной ситуации активации гипертензивных механизмов / В.И. Инчина, В.В. Столярова, Г.Г. Гарькин и др. // Второй конгресс по патофизиологии. М. – 2000. – С.68. 7. Капаладзе, Р.А. Регламентация экспериментов на животных – этика, законодательство, альтернативы // Успехи физиологических наук. – 1998. – Т. 29, № 4. – С. 619-623. 8. Кузьмин, О.Б. Роль калликреин-кининовой системы и простагландинов в действии дофамина на кровоток и транспорт натрия в почке крысы / О.Б. Кузьмин, Р.А. Крюкова // Физиологический журнал. – 1985. – Т. 71, № 5. – С. 619-623. 9. Кузьмин, О.Б. Роль калликреин-кининовой системы и простагландинов в действии дофамина на кровоток и транспорт натрия в почке крысы / О.Б. Кузьмин, Р.А. Крюкова // Физиологический журнал. – 1985. – Т. 71, № 5. – С. 619-623. 87 10. Кузьмин, О.Б. Влияние дофамина на кровоток в различных зонах коркового и мозгового слоев почек крыс / О.Б. Кузьмин, А.Н. Косарев // Физиологический журнал. – 1988. – Т. 74, № 5. – С. 719-724. 11. Кузьмин, О.Б. Влияние дофамина и его комбинации с фуросемидом на транспорт натрия в почке крысы / О.Б. Кузьмин, А.Н.Косарев //Фармакология и токсикология. – 1988. – Т. 51, № 2. – С. 89-91. 12. Кузьмин, О.Б. Нефропротективная терапия гипертензивных больных с хронической болезнью почек: есть ли в ней место для β-адреноблокаторов третьего поколения и агонистов Iı–имидазолиновых рецепторов / О.Б.Кузьмин, М.О.Пугаева, В.В.Жежа // Нефрология. – 2006. – Т. 10, № 2. – С.18-27. 13. Кузьмин, О.Б. Гипертоническая нефропатия / О.Б.Кузьмин. – Оренбург: Изд-во ОрГМА, 2010. – 181с. 14. Наточин, Ю.В. Физиология почки: формулы и расчеты / Ю.В.Наточин. – Л.: Наука, 1974. – 59с. 15. Макшеев, А.К. К методике исследования фильтрационной функции почек / А.К.Макшеев, Б.М.Мирзоев, Ю.В.Вельтищев // Бюлл. эксп. биол. – 1963. – Т. 55, №4. – С. 121-124. 16. Национальные рекомендации ВНОК и ОССН по диагностике и лечению ХСН // Журнал Сердечная недостаточность. – 2009. – Т. 10, № 2. – С. 64-106. 17. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации «Об утверждении правил лабораторной практики» № 267 от 19 июня 2003 г. М., 2003. – 22 с. 18. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. – М.: Медиасфера, 2002. – 312с. 19. Рябов, С.И., Наточин, Ю.В. Функциональная нефрология / С.И.Рябов, Ю.В. Наточин. – СПб.: Лань, 1997. – С. 45-76. 20. Саликова, С.П. Структурный анализ миокарда крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью при культивировании in vitro / С.П.Саликова, С.В.Пресняков, Фуад Мухаммед Фарек // Морфология. – 2002. – Т.121, №2-3. – С.128-129. 88 21. Чазова, И.Е. Прямой ингибитор ренина алискирен – новые возможности защиты почек при артериальной гипертонии / И.Е. Чазова, В.В. Фомин, Е.М. Пальцева // Клиническая нефрология. – 2009. – Т. 1, № 1. – С. 44-49. 22. 2013 ACCF/AHA Guideline for management of heart failure: a report of the American College of Cardiology Foundation / American Heart Association Task Force of Practice Guidelines // www.ncbi.nlm.nih/pubmed : PMID 23741058. 23. Asqhar, M. Activation of dopamine D(1)-like receptor causes phosphorilation 0f alpha(1)-subunits of Na+), K+-АTP-ase in the renal proximal tubules / M. Asqhar, T. Hussain, M.T. Lochanwala // Eur. J. Pharmacol. – 2001. – Vol. 411, N. 1-2. – P. 6166. 24. Aziz, E.F. Continuous infusion of furosemide combined with low-dose dopamine compared to intermittent boluses in acutely decompensated heart failure is less nephrotoxic and carries a lower readmission at thirty days // Hellenic J. Cardiol. – 2011. – Vol. 32, N. 3. – P. 227-235. 25. Badzynska, B. Opposed effects of Pg E2 on perfusion of rat renal cortex and medulla: interaction with the renin-angiotensin system / B. Badzynska, I. Sadovski // Exper. Physiol. – 2008. – Vol. 23, N. 8. – P.1299 – 1302. 26. Beaulieu, J-M. The physiology, signaling and pharmacology of dopamine receptors /J-M. Beaulieu, R. Gainetdinov // Pharmacol Rev. – 2011. – Vol. 63, N. 1. – P. 182217. 27. Bobulescu, I.A. Acute regulation of renal Na+/H+ exchanger NHE 3 by dopamine: role protein phosphorilase 2A / I.A. Bobulescu, H. Quimones, B.M. Gisler // Am J. Physiol. Renal. – 2010. – Vol. 298, N. 5. –P. F1205-F1213. 28. Bovalet, J.P. Segmental synthesis and action of prostaglandins along the nephron / J.P. Bovalet, P. Pradelles, N. Forman // Am. J. Physiol. – 1987. – Vol. 253, N. 3, Pt2. –P. F377-F387. 29. Brown, N.J., Vanghan D.E. Angiotensin-converting enzyme inhibitors / N.J. Brown, D.E. Vanghan // Circulation. – 1998. – Vol. 97, N. 14. – P. 1411-1420. 89 30. Campean, V. Key enzymes for renal prostaglandins synthesis: site-specific expression of in rodent kidney (rat, mouse) / V. Campean [et al.] // Am. J. Physiol. – 2003. – Vol. 285, N. 1. – P. F19-F32. 31. Carey, R.M. Renal dopamine system. Paracrine regulator of sodium homeostasis and blood pressure // Hypertension. – 2001. – Vol. 38, N. 2. – P. 297-302. 32. Carey, R.M. Newly recognized components of the renin-angiotensin system: potential roles in cardiovascular and renal regulation / R.M. Carey, H.M. Siragy // Endocrin. Rev. – 2003. – Vol. 24, N.3. – P.261-271. 33. Carey, R.M. The Intrarenal renin-angiotensin and dopaminergic systems: control of renal sodium excretion and blood pressure // Hypertension. – 2013. – Vol. 61, N. 3. – P. 673-680. 34. Carlos, J. Characterization of renin-angiotensin system enzyme activities in cultured mouse podocyte / J. Carlos [et al.] // Am. J. Physiol. Renal. – 2007. – Vol. 293, N. 1. – P. F398-F407. 35. Chapparell, M.C. Nonclassical renin-angiotensin system and renal function // Comp. Physiol. – 2012, Vol. 2. – N. 4. – P. 2737-2752. 36. Chen, Y. Increased dietary NaCl induces renal medullary Pg E2 production and natriuresis via the EP2 receptor / Y. Chen, M. Zhao, W. He et al. // Am. J. Physiol. Renal. – 2008. – Vol. 295, Т. 3. – P. F818- F825. 37. Cheng, H. F., Harris R.C. Cyclooxygenases, the kidney and hypertension / H.F. Cheng, R.C. Harris // Hypertension. – 2004. – Vol. 43, N. 3. – P. 525-530. 38. Chuang-Ming Hao, Breyer M. Physiological regulation of prostaglandins in the kidney / Chuan- Ming Hao, M. Breyer // Annu Rev. Physiol. – 2008. – Vol. 70. – P. 357377. 39. Costa, M.A. Vascular and renal effects of dopamine during extracellular volume expansion: role of the nitric oxide pathway // Life Sci. – 2006. – Vol. 78, N. 14. – P. 1543-1549. 40. Dooley, R. Aldosterone-induced ENaC and basal Na+/K+-ATP-ase traffing via protein kinase IIIβ signaling in M1 cortical collecting duct cells / R. Dooley [et al.] // Mol. Cell Endocrinol. – 2013. – Vol. 372, N. 1-2. – P. 86-95. 90 41. Duchene, I., Ahluwalia A. The kinin B(1) receptor and inflammation: new approach for cardiovascular disease / I. Duchene, A. Ahluwalia // Curr. Opin. Pharmacol. – 2009. – Vol. 2, N. 2. – P.125-131. 42. El Moghrabi, S. Tissue kallikrein permits early renal adaptation to potassium load / S. El Moghrabi, P. Houillier, N. Picard et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2010. – Vol.107, N.30. – P.13526 -13531. 43. Fan, Y.Y. Augmentation of intrarenal angiotensin II levels in uninephrectomized aldosterone salt treated hypertensive rats: renoprotective effects of an ultrahigh dose of olmesartan / Y.Y. Fan, R. Baba, Y. Nagai // Hypertens. Res. – 2006. – Vol. 29, N. 2. – P. 169-178. 44. Giamouzis, G. Impact of dopamine infusion on renal function in hospitalized heart failure patients: results of the Dopamine in Acute Decompensated Heart failure (DAD-HF) Trial / G. Giamouzis [et al.] // J.Card. Fail. – 2010. – Vol. 16, N. 12. – P. 922-930. 45. Gildea, J.J. Caveolin-1 and dopamine mediated internalization of Na-K ATP-ase in human renal proximal cell / J.J. Gildea [et al.] // Hypertension. – 2009. – Vol. 54, N. 5. – P. 1070-1076. 46. Gildea, J.J. Dopamine and angiotensin as renal counterregulatory systems controlling sodium balance // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. – 2009. – Vol. 18, N. 1. – P. 2832. 47. Gildea, J.J. Dopamine and angiotensin type 2 receptors cooperatively inhibit sodium transport in human renal proximal tubuke cells / J.J. Gildea [et al.] // Hypertension. – 2012. – Vol. 60, N. 2. – P. 396-403. 48. Gimenez, L. Molecular mechanisms of furosemide-sensitive Na-K-2Cl cotransporters // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. – 2006. – Vol. 15, N. 5. – P. 517-523. 49. Grider, J. Effect of bradykinin on NaCl transport in the medullary thick ascending limb of the rat / J. Grider [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 1995. – Vol. 287, N. 1. – P.101-104. 91 50. Grider, J.S. Dopamine D1 receptor-dependent inhibition of NaCl transport in the rat ascending limb: mechanism of action / J.S. Grider, C.E. Ott, B.A. Jackson // Eur. J. Pharmacol. – 2003. – Vol. 473, N. 2-3. – P. 185-190. 51. Harris, R.C. Cyclooxyqenase-2 is associated with macula dense of rat kidney and increases with salt restriction / R.C. Harris, I.A. McKenna, Y. Akai et al. // J. Clin. Invest. – 1994. – Vol. 94, N. 12. – P. 2504 – 2510. 52. Harrison-Bernard, L.M. Immunohistochemical localization of Ang II AT1 receptors in adult rat kidney using monoclonal antibody / L.M. Harrison-Bernard [et al.] // Am. J. Physiol. – 1997. – Vol. 273, N. 1. – P. F170-F177. 53. Harrison-Bernard, L.M. Intrarenal AT1 receptor and ACE binding in Ang II-induced hypertensive rats / L.M. Harrison-Bernard, J. Zhuo, H. Kobori // Am. J. Physiol. – 2002. – Vol. 282, N. 1. – P. F19-F28. 54. Haulika, I. Angiotensin peptides and their pleiotropic effects / I. Haulika, W. Bild, D.N. Serban // J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst. – 2005. – Vol. 6, N. 1. – P. 121-131. 55. He, P. Activation of Na+ / H+ exchanger NHE3 by angiotensin II is mediated by inositol 1, 4, 5,- triphosphat (IP3) receptor- binding protein released with IP3 and Ca2+/calmodulin–dependent protein kinase II / P. He, I. Klein, C.C. Yun C.C. // J. Biol. Chem. – 2010. – Vol. 285, N. 36. – P. 27869-27878. 56. Hebert, R.L. Bradykinin B2 type receptor activation regulates fluid and electrolyte transport in the rabbit kidney / R.L. Hebert [et al.] // Peptides. – 2005. – Vol. 26, N. 8. – P.1308-1316. 57. Herman, M.B. Regulation of renal proximal tubule Na-K-ATP-ase by prostaglandins / M.B. Herman [et al.] // Am. J. Physiol. Renal. – 2010. – Vol. 298, N. 5. – P. F1222F1234. 58. Hillmeister, P. The kallikrein-kinin system / P. Hillmeister P, P.B. Persson // Acta Physiol. (Oxf.). – 2012. – Vol. 206, N. 4. – P. 215-219. 59. Horton, R. Effect of dopamine on renal blood flow, prostaglandins, renin and electrolyte excretion / R. Horton [et al.] //Am. J. Hypertens. – 1990. – Vol. 3, N. 6, Pt2. – Р. 108S-111S. 92 60. Hu, M.C. Chronic regulation of renal Na+/H+-exchanger NHE3 by dopamine: translational, and posttranslational mechanisms / M.C. Hu [et al.] //Am. J. Physiol. Renal. – 2013. – Vol. 304, N. 9. – P. F1169-F1180. 61. Hus-Cithazel, A. Multiple crosstalk between angiotensin II, bradykinin and insulin signaling in the cortical thick ascending limb of rat kidney / A. Hus-Cithazel [et al.] // Endocrinology. – 2010. – Vol.151, N. 7. – P. 3881-3184. 62. Katori, M. Role of the kallikrein-kinin system in the salt-sensitive hypertension / M. Katori, M. Majima // Hypertension. – 2004. – Vol. 44, N. 6. – P.1112-1117. 63. Kemp, B.A. Intrarenal angiotensin III is the predominant agonist for proximal tubule angiotensin type 2 receptor / B.A. Kemp [et al.] // Hypertension. – 2012. – Vol. 60, N. 2. – P. 387-395. 64. Kim, S.M. Low plasma renin and reduced renin secretory responses to acute stimuli in conscious Cox-2 deficient mice / S.M. Kim [et al.] // Am. J. Physiol. Renal. – 2007. – Vol. 292, N. 1. – P. F415-F422. 65. Kobori, H. The intrarenal renin-angiotensin system: from physiology to the pathobiology of hypertension and kidney disease / H. Kobori [et al.] // Pharmacol. Rev. – 2007. – Vol. 59, N. 3. – P. 251-287. 66. Komhoff, M. Localization of cyclooxygenase-1 and -2 in adult and fetal human kidney: implication for renal function / M. Komhoff [et al.] // Am. J. Physiol. Renal. – 1997. – Vol. 272, N. 1. – P. F460-F468. 67. Komina, N. Effect of combining an ACE inhibitor and angiotensin II receptor blocker on plasma and kidney tissue angiotensin II levels / N. Komina, S. Khang, L.M. Wead // Am. J. Kidney Dis. – 2002. – Vol. 39, N. 2. – P. 159-164. 68. Kurtz, A. Cellular control of rennin secretion / A. Kurtz, C. Wagner // J. Exp. Biol. – 1999. – Vol. 202, N. 3. – P. 219-225. 69. Lauridsen, T.G. Increased renal sodium absorption by inhibition of prostaglandin synthesis during fasting in healthy men. A possible role of epithelial sodium channels / T.G.Lauridsen, H. Vase, J. Starklint // BMC Nephrol. – 2010. – Vol. 11. – 28 (Abstract). 93 70. Leeb-Lundberg, L.M. International union of pharmacology. XLV. Classification of the kinin receptor family: from molecular mechanisms to pathophysiological consiquenses / L.M. Leeb-Lundberg [et al.] // Pharmacol. Rev. – 2005. – Vol. –57, N. 4. – P.27-77. 71. Levinson, P.D. Endocrine, renal and hemodynamics response to graded dopamine infusions in normal man / P.D. Levinson [et al.] // J. Clin. Endpcrinol. Metab. – 1985. – Vol. 60, N. 5. – P. 821-826. 72. Li, N. The role of angiotensin converting enzyme 2 in the generation of angiotensin 1-7 by rat proximal tubules / N. Li, [et al.]. // Am. J. Physiol. – 2005. – Vol. 288, N.2. – P. F353-F362. 73. Liebau, M.C. Functional expression of renin- angiotensin system in human podocytes / M.C. Liebau [et al.] // Am. J. Physiol. Renal. – 2006. – Vol. – 290, N. 3. – P. F710-F719. 74. Mamenko, M. Salt-dependent inhibition of epithelial Na+ channel-mediated sodium reabsorption in the aldosterone-sesnsitive distal nephron by bradykinin / M.Mamenko, O.Zaika, P.A.Doris // Hypertension. – 2012. – Vol. 60, N. 5. – P. 12341241. 75. Mamenko, M. Angiotensin II increased activity of the epithelial Na+ channel (ENaC) in distal nephron additively to aldosterone / M. Mamenko, O. Zaika, D. Ilatovskaya // J. Biol. Chem. – 2012. – Vol. 287, N. 1. – P. 660-671. 76. Mamenko, M. Direct regulation of ENaC by bradykinin in the distal nephron. Implicatuin for renal sodium handling / M. Mamenko, O. Zaika, O. Pochynyuk // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. – 2014. – Vol. 23, N. 2. – P. 122-129. 77. Matsubara, H. Tissue-specific expression of human angiotensin II AT1 and AT2 receptors and cellular localization of subtype mRNAs in adult human renal cortex using in situ hybridization / H. Matsubara [et al.] // Nephron. – 1998. – Vol. 80, N. 1. – P. 25-34. 78. Maurel, A. Vesicular monoamine transporter mediates dopamine secretion in rat proximal tubular cells / A. Maurel [et al.] // Am.J. Physiol. Renal. – 2007. – Vol. 292, N. 6. – P. F1592-F1598. 94 79. Mc, Grath B. Effect of dopamine on renal function in the rat isolated perfused kidney / B. Mc Grath [et al.] // Clin Exp. Pharmacol. Physiol. – 1985. – Vol. 12, N. 4. – P. 343-352. 80. Miyata, N. Distribution of angiotensin AT1 and AT2 receptors subtypes in the rat kidney / N. Mivata [et al.] // Am. J. Physiol. – 1999. – Vol. 277, N. 2. – P. F434-446. 81. Naray-Feyes, A. Regulation of sodium transport in mammalian collecting ducts cell by aldosterone-induced kinase SGK1: structure/function studies / A. Naray-Feyes [et al.] // Moll. Cell Endocrinol. – 2004. – Vol. 217, N. 1-2. – P. 197-202. 82. Natz, B. Kinins modulate the sodium-dependent autoregulation of renal medullary blood flow / B. Natz, K. Berger, C. Rosler, P.B. Persson // Cardiovasc. Res. – 1998. – Vol. 40, N. 3.- P.573-579. 83. Navar, L.G. Paracrine regulation of the renal circulation / L.G. Navat [et al.] // Physiol. Rev. – 1996. – Vol. 76, N. 2. – P. 425-536. 84. Navar, L.G. Renal responses to AT1 receptor blockade / L.G. Navar, M. HarrisonBernard, J.D. Imig // A. J. Hypertens. – 2000. – Vol. 13, N. 1, Pt 2. – P. 45S-54S. 85. Navar, L.G. Intrarenal angiotensin II and hypertension / L.G. Navar, H. Kobori, M.C. Prieto-Carrasguero // Hypertens. Res. – 2003. – Vol. 5. – N. 1. – P. 135-143. 86. Navar, L.G. Why are angiotensin concentrations so high in the kidney / L.G. Navar, A. Nishiyama // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. – 2004. – Vol. 13, N. 1. – P. 107115. 87. O’Connel, D.P. Localization of dopamine D1A receptor protein in the rat kidney / D.P. O’Connel [et al.] // Am. J. Physiol. – 1995. – Vol. 268, N. 6. – P. F1185-F1197. 88. O’Connel, D.P. Detection dopamine D1A subtype specific mRNA in the rat kidney in situ hybridization / D.P. O’Connel [et al.] // Am. J. Physiol. – 1998. – Vol. 271, N.1. – P. F232-F241. 89. O’Connel, D.P. Expression of the dopamine D3 receptor protein in the rat kidney / D.P. O’Connel [et al.] // Hypertension. – 1998. – Vol. 32, N. 5. – P. 886-895. 90. Olsen, N.V. Effects of dopamine on renal hemodynamics, tubular function and sodium excretion in normal humans // Dan. Med. Bull. – 1995. – Vol. 75, N. 3. – P. 282297. 95 91. Olsen, N.V. Effects of acute beta-adrenoceptor blockade with metoprolol on the renal response to dopamine in normal humans / N.V. Olsen [et al.] // Brit J. Clin. Pharmacol. – 1995. – Vol. 37, N. 4. – P. 347-353. 92. Ozono, R. Localization of the dopamine D1 receptor protein in the human heart and kidney / Ozono R. [et al.] // Hypertension. – 1997. – Vol. 30. – N. 3. – P. 725-729. 93. Ozono, R. Expression of subtype 2 angiotensin II AT2 receptor protein in the rat kidney / Ozono R. [et al.] // Hypertension. – 1997. – Vol. 30, N. 5. – P. 1238-1246. 94. Paul, M. Physiology of local renin-angiotensin systems / M. Paul [et al.] // Physiol. Rev. –2006. – Vol. 86, N. 2. – P. 447-503. 95. Padia, S.H. Conversion of renal angiotensin II to angiotensin III is critical for AT@ receptor mediated natriuresis in rats / S.H. Padia [et al.] // Hypertension. – 2008. – Vol. – 51, N. 2. – P. 460-465. 96. Padia, S.H. Mechanisms of dopamine D1 and angiotensin AT2 receptor interaction in natriuresis / S.H. Padia [et al.] // Hypertension. – 2012. – Vol. 59, N. 2. – P. 437-445. 97. Ragsdale, N.V. Selective peripheral dopamine 1 receptor stimulation. Differential responses to sodium loading and depletion in humans / N.V. Ragsdale [et al.] // Hypertension. – 1990. – Vol. 150, N. 16. – P. 914-921. 98. Sakoda, M. Aliskiren inhibits intracellular angiotensin II levels without affecting (pro)renin receptor signals in human podocytes / M. Sakoda, A. Ishihara, A. Kurauchi-Mito // Am J. Hypertens. – 2010. – Vol. 23, N. 5. – P. 575-580. 99. Salyer, S. Dopamine regulation of Na+-K+-ATP-ase requires the PDZ-2 domain of sodium hydrogen factor-1 (NHERF-1) in opossum kidney cells / S. Saluer, N. Lesovsky, E.G. Weinman // J. Am. Physiol. Cell . – 2011. – Vol. 300, N. 3. – P. C425-C434. 100. Sato, S. The effect of aprotinin (a serine protease inhibitor) on renal function and rennin release / S. Sato, V. Kher, A.G. Scicli // Hypertension. – 1983. – Vol. 5, N. 6. – P. 893-899. 101. Siragy, H.M. Evidence that Intrarenal dopamine acts as a paracrine substance in the renal tubule / H.M. Siragy [et al.] // Am. J. Physiol Renal. – 1989. – Vol. 257, N. 3. – P. F469-F477. 96 102. Siragy, H.M. Sustained hypertensivity to angiotensin II and its mechanism in mice lacking the subtype 2 (AT2) angiotensin receptor / H.M. Siragy [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – Vol. 96, N. 11. – P. 6506-6510. 103. Siragy, H.M. The angiotensin II type 2 receptor and kidney // J. Renin Angiotensin Aldosteron Syst. – 2010. – Vol. 11, N. 1. – P. 33-36. 104. Sharma, J.N. Pharmacological target and prototype therapeutics in the kallikreinkinin system / J.N. Sharma, G.J. Al-Sherif // The Scientific World Journal. – 2006. – Vol. 6, N. 8. – P. 1247-1261. 105. Schnermann, J. Juxtaglomerular cell complex in the regulation of renal salt excretion / J. Schnermann [et al.] // Am J. Physiol. – 1998. – Vol. 274, N. 2, Pt 2. – P. F263-F279. 106. Schnermann, J. Tubular control of renin synthesis and secretion / J. Schnermann J., J.P. Briggs // Pflures. Arch. – 2013. – Vol. 465, N. 1. – P. 39-51. 107. Schrerer, P. Indomethacin and sodium retention in the rat: role of inhibition of prostaglandin E2 synthesis / P. Schrerer [et al.] // Clin. Sci. – 1992. – Vol. 83, N. 2. – P. 307-311. 108. Sirvitas, S. H. Blockade of renal medullary bradikinin B2 receptors increases tubule sodium reabsorption in rats fed a normal salt diet / S.H. Sirvitas, D.W. Ploth, W.R. Fitzgibbon // Am. J. Physiol. Renal. – 2008. – Vol. 295, N. 3. – P. F811-F817. 109. Tegeder, I. Effects of selective and unselective cyclooxygenase inhibitors on prostanoid release from various rat organs / I. Tegeder, W. Neupert, H. Guhring, G. Geisslinger // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2000. – Vol. 292, N. 3. – P. 1161- 1168. 110. Tornel, I. Role of kinins in the control of renal papillary blood flow, pressure natriuresis and arterial pressure / I. Tornel [et al.] // Circ. Res. – 2000. – Vol. 6, N. 3. – P. 589- 595. 111. Trivedi, M. Dopamine recruits D1A receptors to Na-K-ATP-ase-rich calveolar plasma membranes in rat renal proximal tubule / M. Trivedi [et al.] // Am. J. Physiol. Renal. – 2004. – Vol. 287, N. 5. – P. F921-F931. 97 112. Vaidyanathan, S. Clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of aliskiren / S. Vaidyanathan, V. Jarugula, H.A. Dieterich // Clin Pharmacokinet. – 2008. – Vol. 47, N. 8. – P. 515-531. 113. Valles, P. Angiotensin II and renal tubular ion transport / P. Valles, J. Wysocki, D. Battle // Sci. World J. – 2005. – Vol. 29, N. 5. – P. 680-690. 114. Van Der Lubbe, N. Angiotensin II induces phosphorylation of thiazide-sensitive, sodium chloride cotransporter independent aldosterone / N. Van Der Lubbe, C.H. Lim, R.A. Fenton et al. // Kidney Int. – 2011. – Vol. 79, N. 1. – P. 66-76. 115. Veles, I.C. Characterization of renin- angiotensin system enzyme activities in cultured podocytes / I.C. Veler., A. M. Bland, I. Arthur et al. // Am. J. Physiol. Renal. – 2007. – Vol. – 293, N.1. – P. F398 – F407. 116. Vio, C.P. Localization of components of renal kallikrein-kinin system in the kidney: relation to renal function / C.P. Vio, S. Loyola, V. Velarde // Hypertension. – 1992. – Vol. 19, N. 2, Suppl. 1. – P.10-16. 117. Vio, C.P. Cellular and functional aspects of the renal kallikrein-kinin system in health and disease / C.P. Vio [et al.] // Biol. Res. – 1998. – Vol. 31, N. 3. – P. 305312. 118. Yamaguchi, I. Dopamine D1A-receptors and renin release in rat juxtaglomerular cells / I. Yamaguchi [et al.] // Hypertension. – 1997. – Vol. 29, N. 4. – P. 962-968. 119. Yoshimura, M. Role of renal nerves and dopamine in prostaglandin E release from kidney of rats // Agents Action Suppl. – 1987. – Vol. 22. – P. 93-103. 120. Yingst, D.R. Angiotensin II directly stimulates activity and alters the phosphorylation of Na-K-ATP-ase in rat proximal tubule a rapid time course / D.R. Yingst [et al.] // Am. J. Physiol. Renal. – 2004. – Vol. 287, N. 4. – P. F713-F721. 121. Wang, Z.Q. Selective inhibition of the renal dopamine subtype D1A receptor induces antinatriuresis in conscious rat / Z.Q. Wang, R.A. Felder, R.M. Carey // Hypertension. – 1999. – Vol. 33, N. 1. – P. 504-510. 122. Wang, Z.Q. Intrarenal dopamine production and distribution in the rat / Z.Q. Wang [et al.] // Hypertension. – 1997. – Vol. 29, N. 5. – P. 564-570. 98 123. When, Z.Z. Angiotensin II receptor blockers attenuates intrarenal renin-angiotensin system and podocytes injury in rats with myocardial infarction // Plos. One. – 2013. – Vol. 8, N. 6. – e67242. 124. Zaika, O. Bradykinin acutely inhibits activity of epithelial Na+ channel in mammalian aldosterone-sensitive distal nephron / O. Zaika, M. Mamenko, R.G Neil // Am. J. Physiol. Renal. – 2011. – Vol. – 300, N.5. – P. F1105 – F1115. 125. Zaika, O. Direct activation of ENaC by angiotensin II: recent advances and new insights / O. Zaika, M. Mamenko, A. Staruschenko // Curr. Hypertens. Rep. – 2013. – Vol.15, N.1. – P. 17-24. 126. Zaika, O.L. Direct inhibition of basolateral Kir4.1/5.1 channels in cortical collecting duct by dopamine / O.L. Zaika, M. Mamenko, O.Polygin // Am. J. Physiol. Renal. – 2013. – Vol. 305, N.9. – P. F1277 – F1287. 127. Zhang, M-Z. Intrarenal dopaminergic system regulates renin expression / M-Z. Zhang [et al.] // Hypertension. – 2009. – Vol. 53, N.3. – P. 228-234. 128. Zhang, M-Z. Intrarenal dopamine deficiency leads to hypertension and decreased longevity in mice / M-Z. Zhang [et al.] // J. Clin. Invest. – 2011. – Vol. 121, N. 7. – P. 2845-2854.
