На правах рукописи Комлева Юлия Константиновна НЕЙРОГЕНЕЗ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
advertisement
На правах рукописи Комлева Юлия Константиновна НЕЙРОГЕНЕЗ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА В УСЛОВИЯХ ОБОГАЩЕННОЙ СРЕДЫ 14.03.03 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Кемерово – 2013 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук, доцент Салмина Алла Борисовна Шестакова Людмила Анатольевна Официальные оппоненты: Попонникова Татьяна Владимировна – доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» Минздрава России, проректор по научной и лечебной работе, профессор кафедры неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики Григорьев Евгений Валерьевич – доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечнососудистых заболеваний" Сибирского отделения РАМН, заместитель директора по научной и лечебной работе, ведущий научный сотрудник лаборатории критических состояний Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение неврологии» Российской академии медицинских наук «Научный центр Защита состоится «___» ___________ 2013 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.035.02 при ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России по адресу: 650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России Автореферат разослан «___» ___________ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Разумов Александр Сергеевич 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования и степень ее разработанности Болезнь Альцгеймера (БА) является нейродегенеративным расстройством и наиболее распространенной формой деменции у пожилых людей. Нейродегенеративные процессы при БА сопровождаются нарушениями нейрогенеза. Тем не менее, молекулярные механизмы, вовлеченные в патологический нейрогенез болезни Альцгеймера, еще не полностью изучены [Mu Y. et al., 2011]. Вследствие большой частоты и особой тяжести последствий, болезнь Альцгеймера признана одной из главных медицинских и социальноэкономических проблем современного цивилизованного мира. Социальное бремя проблем, связанных с хронической нейродегенерацией, будет продолжать неуклонно возрастать по мере старения населения [«Alzheimer’s Disease International World Alzheimer Report, 2012»]. В контексте формирования социального поведения, процессы нейрогенеза, синаптогенеза, апоптоза, нейрон-глиального сопряжения, миграции клеток определяют то, как нейрональные сигналы распознаются и интегрируются в специфических регионах мозга. Одним из ключевых механизмов такой интеграции является активность лимбической системы, функционирование которой принципиально отличается в развивающемся, зрелом и стареющем мозге [Robinson G.E., 2008]. Детально были изучены генетические факторы, модулирующие функции мозга и его дисфункцию, но средовые параметры получили гораздо меньше внимания [Mayeux R., 2003, Nithianantharajah J., 2006]. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании механизмов, которые опосредуют поведенческие, клеточные и молекулярные эффекты обогащенной среды (ОС), остается много нерешенных вопросов [van Praag H., 2000, Li S. et al., 2013]. Признанным является факт наличия существенных различий в функционировании клеток нейрональной и глиальной природы в зрелом и стареющем мозге и, соответственно, в патогенезе заболеваний центральной нервной системы [Verret L. et al., 2007]. При различных возраст-зависимых заболеваниях процессы нейрогенеза, апоптоза и нейропластичности подвергаются нарушению. Соответственно, рассмотрение нейродегенеративной патологии, исследование зрелого и стареющего мозга требует пристального 4 внимания. В связи с этим актуально изучение механизмов нейрогенеза, лежащих в основе организации интегративной функции мозга при реализации сложных форм поведения в норме и при самой распространенной нейродегенеративной патологии – болезни Альцгеймера [Winner B., 2011]. Таким образом, существует потребность в создании экспериментально подтвержденной концепции формирования и развития пластичности головного мозга в ответ на действие внешних средовых факторов, приводящих к изменению сложных форм социального поведения при нейродегенерации и старении центральной нервной системы. Цель исследования: охарактеризовать особенности нейрогенеза, апоптоза и реализации интегративных функций головного мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера и при физиологическом старении в условиях обогащенной среды. Задачи исследования: 1. Изучить сложные формы поведения при пребывании экспериментальных животных (крыс) в обогащенной среде в различные периоды онтогенеза и у животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера. 2. Исследовать процессы апоптоза при пребывании экспериментальных животных в обогащенной среде в различные периоды онтогенеза и у животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера. 3. Изучить процессы нейрогенеза при пребывании экспериментальных животных (крыс) в обогащенной среде в различные периоды онтогенеза и у животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера. 4. Исследовать особенности влияния обогащенной среды на экспрессию белка нейропластичности (Arc3.1), белка межкклеточных контактов астроцитов (Cx43) и белка синаптических контактов (PSD95) в исследуемых группах животных. Научная новизна Установлены новые особенности реализации интегративных функций мозга (контроль сложных форм поведения) при действии обогащенной среды. Обогащенная среда на когнитивные функции поврежденного мозга (животные с экспериментальной болезнью Альцгеймера) или стареющего мозга (физиологическое старение) выраженного влияния не оказывает, однако обогащенная среда позитивно влияет на сохранение социальной памяти и 5 социального интереса при физиологическом старении и экспериментальной болезни Альцгеймера. Впервые показано, что при экспериментальной болезни Альцгеймера происходит значительное подавление апоптоза в миндалине мозга, которое сопровождается торможением ранних процессов нейрогенеза и уменьшением количества постмитотических нейронов. При физиологическом старении происходит интенсификация апоптоза в миндалине мозга, которая сочетается с относительно высокой долей прогениторных клеток и уменьшением количества постмитотических нейронов. Впервые установлены новые механизмы влияния обогащенной среды на нейрогенез и синаптогенез при физиологическом старении и экспериментальной болезни Альцгеймера. Убедительно показано, что обогащенная среда эффективно запускает апоптоз и ранние этапы пролиферации клеток, но не может повлиять на более поздние события, связанные с приобретением клеткой нейронального, а не глиального фенотипа при экспериментальной модели болезни Альцгеймера. Впервые продемонстрированы особенности экспрессии Arc3.1 и Cx43 в клетках коры, гиппокампа и миндалины мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера и физиологическом старении, в том числе в условиях обогащенной среды. Теоретическая значимость исследования Установлены клеточно-молекулярные механизмы действия обогащенной среды на нейрогенез головного мозга при физиологическом старении и экспериментальной болезни Альцгеймера, а также закономерности апоптоза и нейрогенеза в структурах лимбической системы (миндалина, гиппокамп). Практическая значимость исследования Установленные механизмы повреждения и восстановления клеток головного мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера, в том числе при действии обогащенной среды, могут стать основой при разработке новых нейрофармакологических стратегий и протоколов нейрореабилитации. Выявленные дифференциальные диагностические признаки в миндалине мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера и физиологическом старении создают основу для разработки новых методов для оценки разных по этиологии механизмов хронической нейродегенерации. Методология и методы исследования Работа носит экспериментальный характер. Для решения поставленных 6 задач проведено нейропсихическое тестирование, иммуногистохимическое исследование препаратов мозга, вестерн-блоттинг. Объект исследования – крысы – самцы линии Wistar, предмет исследования – оценка процессов апоптоза, нейрогенеза, синаптогенеза при различных условиях. Достоверность полученных данных подтверждена методами математической статистики. Основные положения, выносимые на защиту 1. Старение и интрацеребральное введение бета-амилоида разнонаправленно нарушают процессы нейрогенеза, синаптогенеза и апоптоза клеток коры и лимбической системы мозга. При моделировании болезни Альцгеймера происходит торможение ранних процессов нейрогенеза, тогда как при физиологическом старении отмечается относительно высокая доля прогениторных клеток. 2. Миндалина головного мозга является структурой, чувствительной к повреждающему действию бета-амилоида, что позволяет использовать ее для регистрации событий, характеризующих нейротоксичность (экспрессия маркеров апоптоза) и нейропластичность (экспрессия маркеров нейрогенеза и синаптогенеза, экспрессия генов раннего реагирования) в контексте дифференцировки изменений, вызванных физиологическим старением и обусловленных развитием экспериментальной болезни Альцгеймера. 3. Обогащенная среда восстанавливает процессы нарушенного нейрогенеза, апоптоза и синаптогенеза, а также экспрессию белков астроглиальных контактов при физиологическом старении и экспериментальной болезни Альцгеймера. 4. Изменения когнитивных функций и сложных форм поведения при физиологическом старении и экспериментальной болезни Альцгеймера корригируются обогащенной средой, что сопровождается изменением экспрессии маркера нейропластичности (Arc3.1) в гиппокампе мозга. Степень достоверности результатов Все научные положения и выводы обоснованы применением системного анализа поставленной проблемы, современных методов нейробиологии, достоверной выборкой исследуемых животных, большим объемом фактического материала, который подвергнут адекватному статистическому анализу. Внедрение результатов исследования Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и 7 токсикологической химии, научный процесс НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО «Красноярский гоcударственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Апробация материалов диссертации Материалы диссертации доложены и обсуждены на Школе молодых ученых «Экспериментальные модели заболеваний ЦНС» в рамках Пленума проблемной комиссии Фундаментальные вопросы нейронаук научного совета РФ по неврологии (Красноярск, 2011); на Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые – медицине»: Аспирантские чтения 2011 (Самара, 2011); на видеоконференции Красноярск-Барнаул, посвященной современным исследованиям в области нейронаук и клеточных технологий (Красноярск, 2011); на Международной интернет-конференции «Медицина в ХХ веке: тенденции и перспективы», посвященной 70-летию КрасГМУ и 91-ой годовщине открытия гормона инсулина (Красноярск, 2012); на научной конференции «Сложные системы в экстремальных состояниях», СФУ (Красноярск, 2012); на VII Сибирском физиологическом съезде (Красноярск, 2012); на VII Российско-японском семинаре по нейронаукам в рамках Всероссийской научно-практической конференции педиатров (Красноярск, 2012); на научно-практической конференции «Комплексные методы в биомедицинских исследованиях: от молекул до поведения» (Москва, 2013); на XXVI Международном Симпозиуме BRAIN'13 (XXVIth International Symposium on Cerebral Blood Flow, Metabolism and Function & XIth International Conference on Quantification of Brain Function with PET) (Шанхай, Китай, 2013); на 12 FELASA SECAL Congress: Animal Research: Better Science from Fever Animals (Барселона, Испания, 2013). Публикации по теме диссертации По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук. Объем и структура работы Материал диссертации изложен на 179 страницах машинописного текста, иллюстрирован 30 рисунками, 18 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, глав: материал и методы, результаты собственных 8 исследований, обсуждения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 288 источников, в том числе 6 отечественных и 282 зарубежных. Личный вклад автора Автор лично выполнил все этапы работы: тестирование сложных форм поведения животных, моделирование болезни Альцгеймера, забор материала для исследования, проведение иммуногистохимического исследования, вестерн-блоттинга. Диссертант провел статистическую обработку и анализ полученного материала, поиск и критический анализ литературы по теме диссертации. Работа поддержана грантами федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» «Молекулярные механизмы нейрон-глиального сопряжения и организации интегративных функций мозга при реализации сложных форм поведения в норме и при патологии» (доп. соглашение № 8061), 2012-2013 гг.; Индивидуальный грант студентов и аспирантов «Молекулярные механизмы влияния факторов окружающей среды на нейрогенез головного мозга в норме и при болезни Альцгеймера», ККФПНиНТД (доп. соглашение №13/12), 2012 г. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Исследование выполнялось на базе кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, Научноисследовательском институте молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО «Красноярский гоcударственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы «Интегративные нейронауки» (гос. регистрационный № 01200902286). Исследование одобрено локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО «КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздравсоцразвития РФ (№35/2011 от 31.10.2011) Объект исследования: крысы линии Wistar, самцы. Возраст животных, экспериментальные группы и дизайн исследования представлены на рисунке 1. Исследования на животных проводили в соответствии с соблюдением принципов гуманности, изложенных в Директиве Европейского сообщества (2010/63/ЕС). 9 Нейроповеденческое тестирование ПКЛ 2 день Социальный тест 3 день ОП 1 день n=24 n=12 n=12 7 месяцев n=24 ВЛМ 4-7 день 21 месяц n=12 n=12 n=12 n=12 60 дней Нейроповеденческое тестирование ОП 1 день ПКЛ 2 день Социальный тест 3 день ВЛМ 4-7 день 9 2А (БА СУ) 3А (ЛО СУ) 1А (ИК СУ) 2Б (БА+ОС) 3Б (ЛО+ОС) 1Б (ИК ОС) 9 месяцев ОП 1 день Апоптоз TUNEL 4Б (ФС ОС) 23 месяца 10 дней Нейроповеденческое тестирование ПКЛ Социальный 2 день 3 день Эвтаназия животных Иммуногистохимия Нейрогенез Синаптогенез Астроциты Pax6, Ngn2, NeuroD1, NeuN 4А (ФС СУ) PSD95 Cx43 ВЛМ 1-4 день Вестерн-блоттинг Arc3.1 ОП – Открытое поле, ПКЛ – Приподнятый крестообразный лабиринт, ВЛМ Водный лабиринт Морриса, БА экспериментальная модель болезни Альцгеймера, ЛО ложно-оперированные животные, ИК интактный контроль, ФС физиологическое старение, СУ стандартные условия, ОС обогащенная среда, 1А4Б группы экспериментальных животных (соответствия экспериментальных групп на рисунке). Рисунок 1 – Экспериментальные группы и дизайн исследования 10 Моделирование болезни Альцгеймера осуществляли интрагиппокампальным введением бета-амилоида по стереотаксическим координатам мозга в СА1 зону. Бета-амилоид 1-42 (Sigma-Aldrich, USA) растворяли в PBS (фосфатно-солевом буфере) до концентрации 2 мкг/мкл с последующей агрегацией в термостате при 37ºС в течение 7 дней. 5 мкл бетаамилоида вводили с каждой стороны гиппокампа в СА1 зону [Li X. et al.,2011]. Оценку признаков БА проводили, начиная с 10 суток [Sipos E. et al., 2007] после оперативного вмешательства. Верификацию модели болезни Альцгеймера осуществили окраской Тиофлавином S. После введения амилоида в ткани головного мозга наблюдались флуоресцирующие амилоидные бляшки зеленого цвета. Исследование сложных форм поведения выполняли с помощью методов оценки общей и поисковой активности (тест «Открытое поле», ОП), тревожности и депрессивности (тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» ПКЛ), когнитивных функций (тест «Водный лабиринт Морриса», ВЛМ), социальной памяти (тест «Социальный пятипопыточный») согласно стандартным протоколам [Drapeau E. et al., 2003; Gould T. D. et al., 2009; Walf A. A., Cheryl A. F., 2007]. Моделирование обогащенной среды проводили по стандартному протоколу [Jankowsky J. L., Xu G., 2003], подразумевающему длительное (60 дней) содержание животных в условиях многостимульной среды. Иммуногистохимическое исследование. Фиксацию головного мозга проводили путем транскардиальной перфузии 4% раствором параформальдегида. Интересующие области мозга вырезали в соответствии со стереотаксичекским атласом [Paxinos G., Watson C., 2006]. Приготовление парафиновых блоков проводили по стандартной методике. Для обзорной оценки препаратов осуществляли окраску гематоксилином и эозином по стандартной методике [Коржевский Д. Э., Гиляров А. В., 2010]. Срезы головного мозга окрасили по стандартному протоколу двойного непрямого метода иммуногистохимии фирмы Abcam. Для изучения нейрогенеза оценивали экспрессию Pax6, Ngn2, NeuroD1, NeuN. Исследование синаптогенеза регистрировали по изменению экспрессии белка PSD95. Изучение межклеточных контактов астроцитов проводили с помощью оценки экспрессии Cx43. Все измерения проводили в гранулярном слое клеток зубчатой извилины, энторинальной коре и базолатеральной миндалине. Исследовали свечение на флуоресцентном микроскопе Olympus 11 CX41. Оценку снимков производили с помощью программы ImageJ. Вычислялся коэффициент CTCF (Corrected total cell fluorescence) в пикселях [Burgess A. et al., 2010]. Результаты представлены в пиксел ×106. Оценку апоптоза методом TUNEL выполняли на парафиновых срезах головного мозга согласно протоколу фирмы-производителя (Apoptag Direct Detection kit, Immunotech, Франция). Определение экспрессии белка-маркера нейропластичности Arc в гиппокампе и миндалине проводили методом вестерн-блоттинга [Mokin M. et al., 2006]. Обрабатывали с помощью программы ScionImage. Статистическая обработка данных. Статистический анализ полученных результатов включал методы описательной статистики и проверки статистических гипотез с использованием программ Stаtplus 2006 Professional Сборка 3.9.0.0, Statistica V.6.0 и пакета анализа программы MS Excel 2010. В пределах каждой выборки определяли нормальность распределения, среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибку среднего. Сравнение средних осуществляли с помощью Т-теста (гетеро- или гомоскедастического), U критерия Манна-Уитни (для порядковых и непараметрических количественных шкал), сравнение групп до и после процедур проводилось с использованием критерия Вилкоксона при уровне значимости р < 0,05. Все результаты представлены в виде M±m, где М – среднее значение, m – ошибка среднего, p – уровень значимости. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изменения сложных форм поведения при моделировании болезни Альцгеймера и физиологическом старении Не выявлено значимых различий в горизонтальной и вертикальной активности и норковом рефлексе у крыс из группы физиологического старения (ФС) (стареющие крысы, 23 месяца) в сравнении с крысами с экспериментальной БА при содержании в стандартных условиях (Рисунок 2). Показано, что введение бета-амилоида вызывает увеличение тревожности у крыс – происходит достоверное снижение времени, проводимого в открытом рукаве в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» как у крыс, содержащихся в обогащенной среде, так и у крыс в стандартных условиях. Вместе с тем, обогащенная среда оказывает протективное воздействие на животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера, проявляющееся в 12 Количество поведенческих актов увеличении времени, проводимого в открытых рукавах животных после обогащенной среды. На стареющих животных (ФС) обогащенная среда оказывает положительное влияние, проявляющееся снижением тревожности. Установлено значимое увеличение времени поиска платформы после моделирования БА у животных, находящихся в условиях обогащенной среды (р<0,05) по сравнению с исходными значениями (крысы 9 месяцев после ОС). ** 80 60 40 * ** 20 * * * * ** ** ** ** 0 ФС СУ ФС ОС БА СУ ** ** БА ОС Горизонтальная активность Вертикальная активность Груминг Норковый рефлекс * – достоверность различий между группами ФС при СУ и ОС, ** – достоверность различий между группами БА при СУ и ОС. Примечание: ОС – обогащенная среда, СУ – стандартные условия, БА – экспериментальная болезнь Альцгеймера, ФС – физиологическое старение Рисунок 2 – Результаты поведения крыс в тесте «Открытое поле» Кроме того, значимое снижение времени поиска платформы обнаружено у интактных животных в возрасте 9 месяцев, подвергшихся экспозиции обогащенной среды по сравнению с животными аналогичного возраста без обогащения (р<0,05). Однако полученные данные позволяют сделать вывод, что обогащенная среда стимулирует когнитивную функцию у интакных крыс, на поврежденный мозг (экспериментальная модель болезни Альцгеймера) обогащенная среда выраженного влияния не оказывает. Также не было обнаружено значительного влияния на когнитивные функции в стареющем мозге крыс (ФС). В тесте «Социальный пятипопыточный» отмечено снижение социального интереса и социальной памяти у группы физиологического старения и животных с моделью болезни Альцгеймера. При этом улучшения в социальном 13 распознавании были зафиксированы во всех группах после воздействия обогащенной среды. В случае физиологического старения крыс достоверно снижена не только социальная память, что проявляется не отличающимся временем распознавания нового самца (пятая попытка) от предыдущего, но и достоверно значимо снижается социальный интерес по сравнению с особями из обогащенной среды. ОС достоверно увеличивает время, потраченное на знакомство с новой особью после четырех попыток (Рисунок 3). Выявлено значимое увеличение времени, потраченного на контакт с пятой особью, в группе после ОС при моделировании болезни Альцгеймера. сек. 160 140 120 100 80 60 40 20 0 * * * 1 2 3 ФС ОС 4 5 ФС СУ *– р<0,05 Примечание: ОС – обогащенная среда, СУ – стандартные условия; 1-4 – первая подсаживаемая особь; 5 – новая особь Рисунок 3 Время контакта крыс в возрасте 23 месяцев, содержащихся в стандартных условиях и в обогащенной среде Таким образом, обогащенная среда эффективно корригирует нарушения интегративных функций мозга (реализация сложных форм поведения, но не когнитивные функции) у животных с экспериментальной моделью болезни Альцгеймера и при физиологическом старении. Изменения процессов апоптоза и нейрогенеза в головном мозге крыс при нейродегенерации и действии обогащенной среды Установлено, что у животных с экспериментальной БА происходит значительное уменьшение апоптоза в миндалине мозга, которое вместе с тем сопровождается снижением количества митотически активных клеток и 14 уменьшением количества постмитотических клеток (NeuN+). При этом в группе физиологического старения происходит интенсификация апоптоза в миндалине, которая сочетается с относительно высокой долей прогениторных клеток и уменьшением количества постмитотических клеток. В связи с этим данные показатели могут являться дифференциально диагностическими признаками изменений в миндалине при физиологическом старении (усиление апоптоза и ранних этапов нейрогенеза) и болезни Альцгеймера (подавление апоптоза и ранних этапов нейрогенеза) при общем снижении количества постмитотических нейронов (Рисунок 4). К о э ф ф и ц и е н т 10 8 6 C T C F 4 2 0 Гиппокамп Кора Миндалина 1А 1Б 4,44 4,94 4,54 3,86 3,72 4,84 2А 2Б 3А 3Б Группы животных 6,86 3,92 4,74 3,68 8,17 9,47 6,56 8,79 1,63 6,51 6,68 4,43 Гиппокамп Кора 4А 4Б 7,35 9,58 7,12 4,66 6,76 8,14 Миндалина Рисунок 4 – Коэффициенты интенсивности экспрессии позитивного материала в различных регионах мозга TUNEL- Выявлено, что обогащенная среда при экспериментальной модели болезни Альцгеймера эффективно запускает апоптоз в миндалине (CTCF увеличивается до 6,51±0,04×106 пиксел, р<0,001) и ранние этапы пролиферации (Pax6) во всех исследуемых структурах (CTCF 3,04±0,08×106 пиксел, р<0,001 в гиппокампе; CTCF 3,42±0,12×106 пиксел, р<0,001 в миндалине; CTCF 4,79±0,14×106 пиксел, р<0,001 в коре), но не может повлиять на более поздние события, связанные с приобретением клеткой нейронального, а не глиального фенотипа (Ngn2/NeuroD1), однако увеличивает количество NeuN+ клеток во всех исследуемых структурах. При физиологическом старении ОС незначительно увеличивает апоптоз в миндалине (CTCF 8,14±0,06×106 пиксел, р<0,001), подавляет ранние этапы дифференцировки прогениторных клеток (снижение маркера NeuroD1 в гиппокампе и миндалине) и увеличивает количество постмитотических клеток. Иными словами, это означает, что в 15 отличие от болезни Альцгеймера, при физиологическом старении обогащенная среда мало активна в отношении апоптоза и митотически активных клеток миндалины. Интенсивность экспрессии маркеров нейрогенеза в гиппокампе и миндалине головного мозга экспериментальных животных представлена в таблице 1 и таблице 2. Таблица 1 – Коэффициенты интенсивности экспрессии маркеров нейрогенеза в гиппокампе головного мозга крыс Группы животных Маркер нейрогенеза БА СУ БА ОС ФС СУ ФС ОС 2А 2Б 4А 4Б Pax6 1,25±0,47 3,04±0,08 2,03±0,10 3,06±0,08 Ngn2 1,66±0,11 2,39±0,06 2,54±0,08 3,04±0,08 NeuroD1 3,21±0,19 2,14±0,14 4,33±0,16 2,05±0,09 NeuN 3,07±0,10 6,297±0,23 2,70±0,12 3,71±0,11 Примечания: достоверность различий: для маркера Pax6 р*2А-2Б<0,001; р*2А-4А<0,001; р*2Б-4Б=0,860; р*4А-4Б<0,001 для маркера Ngn2 р*2А-2Б<0,001; р*2А-4А<0,001 р*2Б-4Б<0,001; р*4А-4Б<0,001 для маркера NeuroD1 р*2А-2Б<0,001; р*2А-4А<0,001; р*2Б-4Б=0,579; р*4А-4Б<0,001 для маркера NeuN р*2А-2Б<0,001; р*2А-4А=0,039; р*2Б-4Б<0,001; р*4А-4Б<0,001 Таблица 2 – Коэффициенты интенсивности экспрессии маркеров нейрогенеза в миндалине головного мозга крыс Группы животных Маркер нейрогенеза БА СУ БА ОС ФС СУ ФС ОС 2А 2Б 4А 4Б Pax6 2,37±0,06 3,42±0,12 5,73±1,80 4,94±0,06 Ngn2 5,50±0,05 4,66±0,32 7,02±0,22 5,87±0.22 NeuroD1 7,18±0,24 5,17±0,17 6,69±0,08 5,72±0,19 NeuN 5,76±0,08 7,06±0,09 2,99±0,067 3,83±0,12 Примечания: достоверность различий: для маркера Pax6 р*2А-2Б<0,001; р*2А-4А<0,001 р*2Б-4Б<0,001; р*4А-4Б<0,001 для маркера Ngn2 р*2А-2Б=0,041; р*2А-4А<0,001; р*2Б-4Б=0,013; р*4А-4Б<0,001 для маркера NeuroD1 р*2А-2Б<0,001 р*2А-4А=0,05; р*2Б-4Б=0,047; р*4А-4Б<0,001 для маркера NeuN р*2А-2Б<0,001; р*2А-4А<0,001; р*2Б-4Б<0,001; р*4А-4Б<0,001 Введение бета-амилоида в ткань мозга вызывает стимуляцию нейрогенеза и изменение выживаемости клеток, на этом фоне эффекты дополнительного фактора (ОС) более выражены. Это согласуется с данными о том, что любое запоминание (в т.ч. социальное) обязательно сопровождается усилением 16 нейрогенеза и, соответственно, апоптоза, необходимого для синаптической консолидации памяти, миграцией клеток-предшественников для системной консолидации памяти [Abrous D.H. et al., 2005] В группе экспериментальной модели болезни Альцгеймера при воздействии обогащенной среды зарегистрировано дополнительное снижение экспрессии Ngn2/NeuroD1 в миндалине, что может свидетельствовать о снижении нейрональной дифференцировки и развитии клеток по глиальному пути. При физиологическом старении ОС менее эффективна (и даже, напротив, подавляет экспрессию ранних маркеров нейрогенеза в миндалине) в плане интенсификации процессов нейрогенеза и апоптоза, чем можно объяснить особенности реализации сложных форм поведения (социальное поведение, социальное распознавание) при действии обогащенной среды. Таким образом, обогащенная среда эффективно стимулирует нейрогенез и апоптоз в случае экспериментальной модели болезни Альцгеймера. Обогащенная среда у стареющих крыс (ФС) подавляет ранние этапы дифференцировки прогениторных клеток и апоптоз. Изменение процессов синаптогенеза в головном мозге крыс при нейродегенерации и при действии обогащенной среды Установлено снижение экспрессии белка постсинаптической плотности (PSD95) в гиппокампе и коре, и увеличение в миндалине при экспериментальной болезни Альцгеймера, что свидетельствует о дезорганизации синаптогенеза и подавлении апоптоза для сохранения уже сформировавшихся синапсов (Dong J, 2013). В стареющем мозге (при ФС) увеличение экспрессии PSD95 зафиксировано в коре, но не в гиппокампе и миндалине. Обогащенная среда стимулирует образование новых контактов, проявляющееся по увеличению PSD95. Это также соотносится с данными, полученными при исследовании нейрогенеза, поскольку ОС стимулирует образование постмитотических нейронов. Этому же соответствует увеличение экспрессии PSD95 у ложно-оперированных животных после обогащенной среды по сравнению с ложно-оперированными животными, находящимися в стандартных условиях. Синаптогенез в коре и гиппокампе (но не в миндалине), подавленный при экспериментальной модели БА, восстанавливается после обогащения, а при физиологическом старении ОС увеличивает экспрессию PSD95 во всех исследуемых структурах. 17 Таким образом, подавленный при экспериментальной болезни Альцгеймера апоптоз в миндалине сопровождается сохранностью и даже увеличением экспрессии PSD95, но запуск апоптоза под действием ОС не влияет на синаптогенез, вследствие приобретения клетками астроглиального фенотипа. В случае физиологического старения ОС эффективно увеличивает экспрессию PSD95, что соответствует ее слабому влиянию на апоптоз и начальные этапы нейрогенеза (Таблицы 3, 4). Особенности экспрессии коннексинов – маркеров астроглиальных контактов при нейродегенерации и при действии обогащенной среды Зафиксировано снижение экспрессии Cx43 (белка-маркера астроглиальных межклеточных контактов) в гиппокампе и коре, но не в миндалине у животных с экспериментальной моделью болезни Альцгеймера. При этом в стареющем мозге при физиологическом старении отмечено снижение экспрессии Cx43 во всех исследуемых регионах. Обогащенная среда оказывает стимулирующее влияние на уровень экспрессии Cx43 во всех группах (Таблицы 3, 4). Таблица 3 – Коэффициенты интенсивности экспрессии белков-маркеров межклеточных контактов в гиппокампе головного мозга крыс Группы животных Маркер БА СУ БА ОС ФС СУ ФС ОС 2А 2Б 4А 4Б PSD95 1,43±0,14 4,61±0,15 3,04±0,10 5,05±0,09 Cx43 2,88±0,090 6,10±0,15 2,72±0,07 4,88±0,12 Примечания: достоверность различий: для маркера PSD95 р*2А-2Б<0,001; р*2А-4А<0,001 р*2Б-4Б=0,048; р*4А-4Б<0,001 для маркера Cx43 р*2А-2Б<0,001; р*2А-4А<0,001 р*2Б-4Б<0,001; р*4А-4Б<0,001 Таблица 4 – Коэффициенты интенсивности экспрессии белков-маркеров межклеточных контактов в миндалине головного мозга крыс Группы животных Маркер БА СУ БА ОС ФС СУ ФС ОС 2А 2Б 4А 4Б PSD95 6,92±0,21 6,89±0,38 2,93±0,08 5,28±0,29 Cx43 8,78±0,09 10,61±0,13 4,49±0,08 8,33±0,13 Примечания: достоверность различий: для маркера PSD95 р*2А-2Б=0,989; р*2А-4А<0,001 р*2Б-4Б=0,004; р*4А-4Б<0,001 для маркера Cx43 р*2А-2Б<0,001; р*2А-4А<0,001 р*2Б-4Б<0,001; р*4А-4Б<0,001 18 Таким образом, реактивный астроглиоз как важное проявление нейротоксического действия бета-амилоида, нашел свое отражение в миндалине головного мозга при экспериментальной модели болезни Альцгеймера и в группе физиологического старения при воздействии ОС. С учетом данных по экспрессии маркеров нейрогенеза и синаптогенеза, обогащенная среда может оказывать влияние на нейрогенез путем увеличения экспрессии Cx43 радиальной глией. Особенности экспрессии маркера нейропластичности Arc 3.1. Наиболее значимое снижение экспрессии Arc 3.1. зафиксировано в группе животных с экспериментальной моделью БА, при этом ОС нивелирует изменения в гиппокампе. В миндалине экспрессия Arc 3.1. не чувствительна к токсическому действию бета-амилоида или воздействию ОС (Рисунок 5). ИК СУ ЛО СУ БА ОС БА СУ ФС СУ ФС ОС Arc3.1 Actin ИК – интактный контроль, ЛО – ложно-оперированные животные, БА – экспериментальная модель болезни Альцгеймера, ФС – физиологическое старение, ОС обогащенная среда, СУ стандартные условия. Рисунок 5 – Экспрессия Arc 3.1. в гиппокампе животных разных экспериментальных групп Таким образом, при физиологическом старении и экспериментальной болезни Альцгеймера в структурах лимбической системы мозга происходят значимые изменения процессов нейрогенеза, апоптоза, синаптогенеза и межклеточных взаимодействий, ассоциированные с нарушением сложных форм поведения и корригируемые (с разной степенью эффективности) действием обогащенной среды. Полученные данные позволили дополнить схемы патогенеза болезни Альцгеймера и физиологического старения, а также определить точки приложения действия обогащенной среды (Рисунок 6). 19 19 Рисунок 6 – Возможные точки приложения обогащенной среды при болезни Альцгеймера и физиологическом старении 20 Суммируя результаты исследования, можно заключить, что при экспериментальной БА и ФС в коре и гиппокампе происходит торможение ранних этапов нейрогенеза, уменьшение количества зрелых нейронов и их функциональной активности, а также уменьшение клеточной популяции в целом при преобладании процессов апоптоза; обогащенная среда стимулирует экспрессию маркеров нейрогенеза, увеличивает количество синапсов, способствует развитию клеток по глиальному пути и тормозит апоптоз. В миндалине головного мозга отмечено уменьшение клеточной популяции, преобладание процессов апоптоза при сохранении ранних этапов нейрогенеза при физиологическом старении, однако при экспериментальной болезни Альцгеймера экспрессия маркеров раннего нейрогенеза снижена. ОС стимулирует экспрессию ранних этапов нейрогенеза при экспериментальной болезни Альцгеймера, при физиологическом старении подавляет ранние этапы дифференцировки клеток ВЫВОДЫ 1. Реализация сложных форм поведения при пребывании экспериментальных животных в обогащенной среде имеет существенные отличия в зависимости от периода онтогенеза и наличия нейродегенеративных изменений. На когнитивные функции поврежденного мозга (животные с экспериментальной болезнью Альцгеймера) или стареющего мозга (физиологическое старение) обогащенная среда выраженного влияния не оказывает, однако снижает уровень тревожности (при моделировании болезни Альцгеймера время пребывания в открытом рукаве увеличивается с 47,7±11,5 до 115,7±22,62 секунд (р<0,05)), и увеличивает поисковую активность у животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера и при физиологическом старении (достоверное увеличение показателей активности в «Открытом поле», (р<0,05)). Обогащенная среда обеспечивает улучшение показателей адаптации к новой среде, но не снижение исследовательской активности при физиологическом старении. Обогащенная среда позитивно влияет на сохранение социальной памяти и социального интереса у стареющих животных (р<0,05) и при нейродегенерации (р<0,05). 2. У животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера зафиксирована интенсификация апоптоза в коре и гиппокампе и подавление апоптоза в миндалине мозга (CTCF 1,63±0,03×106 пиксел), тогда как физиологическое старение сопровождается увеличением интенсивности апоптоза во всех исследованных регионах мозга. Пребывание животных в обогащенной среде способствует подавлению процессов апоптоза в коре и гиппокампе в 21 стареющем мозге и в гиппокампе мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера. 3. Проявление эффектов обогащенной среды носит регионспецифический характер и отличается от животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера и стареющих крыс. Снижается нейрональная дифференцировка и разнообразие нейронов в гиппокампе и миндалине головного мозга при физиологическом старении и при экспериментальной модели болезни Альцгеймера. Пребывание в обогащенной среде при экспериментальной болезни Альцгеймера приводит к активации ранних этапов нейрогенеза (увеличение маркера Pax6 с CTCF 1,25±0,47×106 до 3,04±0,08×106 пиксел, р<0,001 в гиппокампе, миндалине), но не влияет на более поздние события, связанные с приобретением клеткой нейронального, а не глиального фенотипа. В случае же физиологического старения обогащенная среда подавляет ранние этапы дифференцировки прогениторных клеток (снижает экспрессию NeuroD1 в гиппокампе и миндалине) и увеличивает количество постмитотических клеток. 4. Обогащенная среда достоверно увеличивает экспрессию белкапродукта гена раннего реагирования Arc 3.1. в гиппокампе, белка межкклеточных контактов астроцитов Cx43 и белка-маркера синаптогенеза PSD95 в гиппокампе, коре и миндалине мозга (с разной степенью эффективности), нарушенную при физиологическом старении или нейротоксичном действии бета-амилоида. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук 1. Влияние обогащенной среды на поведение зрелых и стареющих крыс / Ю. К. Комлева, С. М. Черепанов, Н. А. Яузина, К. В. Рондова, Д. Д. Гасымлы, А. В. Моргун, Н. В. Кувачева, О. Л. Лопатина, Н. А. Малиновская, А. Б. Салмина // Вестник НГУ. Сер. Биология, клиническая медицина. – 2012. – Т. 10, № 5. – С. 57-62 (0,38 п.л.). 2. Молекулярные механизмы нарушения развития мозга в пренатальном и неонатальном периодах / А. Б. Салмина, Ю. К. Комлева, Н. В. Кувачева, О. Л. Лопатина, А. И. Инжутова, С. М. Черепанов, Н. А. Яузина, Г. А. Морозова, Н. А. Малиновская, Е. А. Пожиленкова, А. В. Моргун,. Т. Е. Таранушенко, М. М. Петрова // Вопросы современной педиатрии. – 2012. – № 6. – С. 14-19 (0,38 п.л). 3. Особенности родительского и исследовательского поведения мышей линии CD-1 при пребывании в условиях обогащенной среды / С. М. Черепанов, Ю. К. Комлева, А. В. Моргун, А. В. Черепанова, А. Б. Салмина // Сибирское медицинское обозрение. – 2012. – №6. – С. 17-21 (0,31 п.л.). 22 4. Эпидемиология болезни Альцгеймера / Н. А. Яузина, Ю. К. Комлева, А. Б. Салмина, М. М. Петрова, Г. А. Морозова, Н. А. Малиновская // Неврологический журнал. – 2012. – № 5. – С. 32-37 (0,38 п.л.). 5. Изменения структурно-функциональной пластичности головного мозга, индуцированные обогащенной средой / Ю.К. Комлева, А.Б. Салмина, С.В. Прокопенко, Л.А. Шестакова, М.М. Петрова, Н.А. Малиновская, О.Л. Лопатина // Вестник РАМН. – 2013. – № 6. – С. 39-48 (0,625 п.л.). 6. Влияние обогащенной среды на ранние этапы развития прогениторных клеток головного мозга у молодых и стареющих крыс / Н. В. Кувачева, А. В. Моргун, Ю. К. Комлева, А. Б. Салмина, Е. Д. Хилажева, О. С. Окунева, А. И. Дробушевская, И. А. Кутищева // Сибирский медицинский журнал. – 2013. – № 5. – С. 47-51 (0,32 п.л.). Материалы конференций 7. Изменение поведения зрелых и стареющих крыс под влиянием обогащенной среды / Ю. К. Комлева, А. В. Моргун, Н. В. Кувачева, Е. А. Пожиленкова, О. Л. Лопатина, Н. А. Малиновская, А. Б. Салмина // Приоритетные направления развития науки и технологий: материалы научн.-техн. конф. – Тула, 2012. – С. 54-56 (0,19 п.л.). 8. Molecular mechanism of adult neurogenesis in enriched environment / Y. Komleva, A. Salmina, A. Morgun, N. Kuvacheva, N. Malinovskaya, A. Chernyh, S. Cherepanov, N. Yauzina // (Abstract Book, Shanghai) http://iscbfm.org/PDFS/44/444ae58a959f-49ab-a58c-d43c2993543c.pdf, Р. 532-533 (0,13 п.л.). 9. Y. Komleva, A. Salmina, A. Chernyh, E. Pozhilenkova, Malinovskaya, N. Kuvacheva, A. Morgun, O. Frolova / CD38 expression as a differentiating marker of agerelated and amyloid-induced changes in the limbic system of the brain // Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. Abstracts of Scientific Papers 12 FELASA SECAL Congress: Animal Research: Better Science from Fever Animals. – 2013. – Vol. 52. – Р. 277 (0,06 п.л.) 10. Перспективы использования тестов для оценки эмоциональности и тревожности у крыс / Ю. К. Комлева, Н. А. Яузина, А. Б. Салмина, Г. А. Морозова, Н. А. Малиновская // VII Сибирский съезд физиологов: материалы съезда. – Красноярск, – 2012. – С. 242-243 (0,13 п.л.) 11. Структурная пластичность мозга при нейродегенерации / Е. В. Шилина, Е. В. Козырева, Н. А. Малиновская, Ю. К. Комлева, Г. А. Морозова // VII Сибирский съезд физиологов: материалы съезда. – Красноярск, – 2012. – С.607-608 (0,13 п.л.). 12. Комлева, Ю.К. Экспериментальные модели болезни Альцгеймера (обзор литературы) / Ю. К. Комлева // 75-ая итоговая студенческая научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 80-летию со дня рождения академика Б.С. Гракова : материалы науч.-практ. конф. – Красноярск: КрасГМУ, 2011. – С. 249-250 (0,13 п.л.). 13. Распространенность болезни Альцгеймера в мире / Н. А. Яузина, Ю. К. Комлева, Г. А. Морозова, Н. А. Малиновская // Молодой организатор здравоохранения: сб. научных статей студентов и молодых ученых, посвященный памяти профессора В.К. Сологуба. – Красноярск, – 2011. – С. 252-256 (0,31 п.л.). 23 БА ВЛМ ОП ОС ПКЛ СУ ФС Аβ СА1 CTCF СПИСОК ИСПОЛЬЗУМЫХ СОКРАЩЕНИЙ – болезнь Альцгеймера – водный лабиринт Морриса – открытое поле – обогащенная среда – приподнятый крестообразный лабиринт – стандартные условия – физиологическое старение – бета-амилоид – область Аммонова рога (гиппокампа) – Corrected total cell fluorescence, общая клеточная флюоресценция
