005009528

На правах рукописи
005009528
Суббот Анастасия Михайловна
TOLL-LIKE РЕЦЕПТОР ОПОСРЕДОВАННАЯ АКТИВАЦИЯ КЛЕТОК
КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В СОЗДАНИИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
ДЛЯ О Ф Т А Л Ь М О Л О Г И И
03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология
14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
2 5 .Я Н 3 2012
Москва-2011
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего профессионального образования «Российский
национальный исследовательский медицинский университет им Н.И.
Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития
Российской Федерации»
Научные руководители:
доктор биологических наук,
профессор
Антохин Александр Иванович,
кандидат медицинских наук,
доцент
Павлюк Александр Сергеевич
Официальные оппоненты:
академик РАМН,
доктор медицинских наук,
профессор
Ярыгин Владимир Никитич
доктор медицинских наук
Чекнёв Сергей Борисович
Ведущая организация: Государственный научный центр Институт
иммунологии Федерального Медико-биологического Агентства Российской
Федерации
Защита состоится «20» февраля 2012 года в 14.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.072.04 при ГОУ НПО РГМУ Росздрава по
адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им
Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ по адресу: 117997, г. Москва, ул.
Островитянова, д. 1
Автореферат разослан «19» января 2012 года
Ученый секретарь диссертационного совета
д.м.н., профессор
Леонова Л. В.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
Повреждения эндотелия роговицы, являются одними из наиболее тяжелых
и трудно поддающихся консервативной терапии, использование клеточной
терапии (КТ) и, в частности, технологий персонализированной клеточной
терапии (ПКТ), в которых для лечения пациента используются его собственные
клетки (Patel S.A., King С.С., Lim Р.К. et al., 2010), могло бы стать хорошим
решением, позволяющим
избежать пересадки роговицы.
Традиционными
источниками материала для КТ являются костный мозг, пуповинная кровь,
жировая ткань. Периферическая кровь относится к более доступным ресурсам.
Лиганды
толл-подобных
рецепторов
(TLR)
являются
высокоэффективными стимуляторами клеток, так как они запускают процессы
синтеза цитокинов, острофазовых белков, ферментов воспаления, изменяют
уровень экспресии молекул адгезии и костимуляторных молекул, приводят к
перестройке цитоскелета. TLR играют одну из главных ролей в процессах
регенерации после травмы (Rakoff-Nahoum S., Medzhitov R., 2008). Поэтому
использование толл-лайк рецептор опосредованной активации клеток при
разработке клеточных технологий является перспективным
направлением,
требующим активного изучения. Данная работа направлена на изучение
активации клеток периферической крови человека через систему толл-лайк
рецепторов
в
составе
клеточного
продукта
для
проведения
персонализированной клеточной терапии поврежденного эндотелия роговицы.
Важнейшим требованием при проведении КТ является характеристика и
стандартизация клеточного продукта (КП), а использование нового метода
лечения возможно только после детальной расшифровки основных механизмов
его
действия.
эффективность
Принято
любой
считать,
клеточной
что
механизмами
терапии
являются:
обусловливающими
а)
заместительный
механизм, когда введенные клетки физически заполняют собой дефект ткани,
восстанавливая её функцию, и б) трофический, когда введенные в зону
повреждения компоненты клеточного препарата продуцируют биологически
4
активные вещества и/или модулируют активность клеток тканевой ниши путем
паракринных или контактных воздействий. Вышеизложенное подтверждает
необходимость определить цитокиновый профиль клеточного препарата
выяснить содержание
-
цитокинов и факторов роста, которые могут играть
центральную роль в механизмах реализации его терапевтических эффектов, а
также оценить влияние условий получения КП на концентрацию этих веществ,
и охарактеризовать его клеточный состав.
Цели и задачи
Целью
работы
стало
изучение
процессов
толл-лайк
рецептор-
опосредованной активации клеток при получении клеточного препарата из
периферической крови человека для персонализированной клеточной терапии
эндотелиальных поражений роговицы.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1.
Получить клеточный препарат на основе активированных лигандом толлподобных
рецепторов
3
типа
-
комплексом
полиА:У
клеток
периферической крови человека.
2.
Охарактеризовать состав полученного клеточного препарата:
1)
исследовать
содержание
и
соотношение
основных
лейкоцитарных
клеток
моноцитарного
популяций;
2)
определить
наличие
прогениторных
происхождения.
3.
Определить содержание цитокинов в полученном клеточном препарате у
здоровых доноров и больных с эндотелиальными поражениями роговицы.
4.
Оценить
влияние
стимулятора
-
полиА:У
и условий
процессинга
клеточного препарата на его цитокиновый профиль.
5.
Изучить клиническую эффективность применения клеточного препарата
для лечения больных с эндотелиальными поражениями роговицы.
Научная новизна исследования
Степень научной новизны определяют следующие результаты впервые
предпринятых исследований:
5
•
Исследование активации клеток лигандом толл-лайк рецепторов 3 типа полиА'.У в препарате для клеточной терапии.
•
Разработка аутологичного клеточного продукта на основе лейкоцитов
периферической крови человека без использования в процессе получения
неразрешенных к клиническому применению препаратов.
•
Характеристика цитофенотипа полученных клеточных препаратов
•
Характеристика цитокинового профиля клеточных препаратов у здоровых
доноров и больных с эндотелиальными поражениями роговицы.
•
Оценка клинической эффективности применения клеточного препарата на
основе активированных полиА:У клеток крови для лечения больных с
эндотелиальными поражениями роговицы.
Научно-практическая значимость
Исследован результат активации клеток лигандом толл-лайк рецепторов 3
типа - полиА:У в препарате для клеточной терапии, что раскрывает механизмы,
обеспечивающие терапевтическую эффективность применения данного КП для
лечения
эндотелия
роговицы.
Предложен
метод
персонализированной
клеточной терапии на основе разработанного аутологичного КП для лечения
эндотелиапьных
поражений
роговицы,
который
показал
высокую
эффективность при клинических испытаниях. Полученные данные о клеточном
составе и цитокиновом профиле КП позволят подойти к вопросу увеличения
эффективности и расширения сферы применения.
Положения, выносимые на защиту
1.
Исследованы механизмы активации клеток лигандом толл-лайк рецепторов
3 типа - полиА:У в препарате для клеточной терапии. Установлено, что в
клеточном препарате содержится широкий спектр цитокинов, который
складывается из цитокинов, выделенных при стимуляции клеток полиА:У
(интерлейкиныт!, -6, ФНО-а, ИФ-а), спонтанно синтезированных в процессе
получения клеточного препарата (интерлейкин-8), предсуществующих в
свежеполученной сыворотке и плазме крови (ТСР-Р1, РООР-АВ, Т0Р-Р2,
УЕОР).
6
2.
Изучен клеточный состав препарата на основе активированных полиА:У
клеток крови:
a.
в лейкоцитарный состав клеточного препарата входят гранулоциты,
моноциты и лимфоциты, при этом доля гранулоцитарной фракции увеличена
по сравнению с цельной кровью в 1,5 раза,
b.
соотношение
лимфоцитарных
субпопуляций
-
Т-хелперов,
Т-
цитотоксических, Ж-клеток соответствует их содержанию в цельной крови,
однако, содержание В-лимфоцитов снижено на 80%,
c.
в клеточном препарате присутствует минорная популяция клеток с
фенотипом прогениторной популяции моноцигарного
происхождения
-
С014/С034'°".
3.
Изучены особенности цитокинового состава клеточного препарата у
больных
герпетическим
кератитом
и
послеоперационной
буллезной
кератопатией.
4.
Разработана технология получения аутологичного клеточного препарата на
основе активированных лигандом толл-лайк рецепторов 3 типа - полиА:У
лейкоцитов пациента для проведения персонализированной клеточной терапии
в офтальмологаи.
5.
Применение разработанного клеточного препарата для лечения поражений
эндотелия роговицы приводит к выраженному терапевтическому эффекту.
Внедрение результатов исследования
Методы и результаты представленной диссертации внедрены в научноисследовательскую и клиническую работу НИИ глазных болезней РАМН,
включены в образовательный план на кафедре глазных болезней Первого
Московского
Государственного
Медицинского
Университета
им.
И.М.Сеченова.
Апробация работы
Основные
практической
положения
конференции
Медико-Биологического
работы
доложены
коллектива
на
сотрудников
совместной
кафедры
факультета РНИМУ им. Н.И.Пирогова,
научнобиологии
кафедры
7
иммунологии
РНИМУ
им.
Н.И.Пирогова,
группы
морфологической
диагностики, консервации тканей и клеточных технологий НИИ ГБ РАМН и
отделения Прогноза эффективности консервативного лечения ФГУ МНИИ
онкологический институт им. П.А.Герцена Росздрава (г. Москва, сентябрь
2011), всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и
регенеративная
медицина»
(Москва,
октябрь
2010), III
Международном
симпозиуме «Актуальные вопросы клеточных технологий» (Москва, сентябрь
2010), 9-м Съезде офтальмологов России (Москва, июнь 2010), Всероссийской
конференции «Глаукома: реальность и перспективы» (Москва, сентябрь 2008),
Всероссийском Иммунологическом Конгрессе (г. Санкт-Петербург, июль 2008),
Всероссийской конференции «Современные методы диагностики лечения
заболеваний роговицы и склеры» (г. Москва, сентябрь 2007).
Публикации
Материалы диссертации полностью представлены в 11 научных работах, из
них в изданиях рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской
Федерации - 6 работ.
Объём и структура работы
Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста и состоит
из введения, обзора литературы, главы, описьшающей материал и методы
исследования,
главы
собственных
экспериментальных
исследований,
заключения, выводов, библиография включает в себя 238 работ: 64 источников
отечественной и 174 - иностранной литературы. Диссертация иллюстрирована
8 таблицами и 15 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
Материалы и методы исследования
Протокол исследования был одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО
РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ. У всех включенных в
исследование людей было получено информированное добровольное согласие.
Доноры
В исследование были включены 55 человек - 30 здоровых доноров, 10
человек с диагнозом послеоперационная буллезная кератопатия и 15 человек с
диагнозом герпетический кератоиридоциклит.
Активатор клеток
В
качестве
активатора
клеток
использовали
разрешенный
к
внутриглазному введению раствор препарата Полудан (ЗАО «Верофарм», РФ),
который представляет собой комплекс полиадениловой и полиурациловой
кислот (полиА:У), является структурным аналогом двухспиральной вирусной
РНК и лигандом Толл-подобных рецепторов 3 типа.
Подсчет
ядросодержащих
клеток
и
эритроцитов
и
оценка
жизнеспособности
Концентрацию ядросодержащих клеток в пробах КП определяли в камере
Горяева после лизиса эритроцитов раствором уксусной кислоты («Реахим», РФ).
Оценку жизнеспособности клеток проводили после окрашивания их раствором
трипанового синего («ПанЭко», РФ). Для подсчета эритроцитов пробы разбавляли
физиологическим раствором.
Изготовление и световая микроскопия тонких мазков
Мазки делали из КП и проб венозной крови. Полученные мазки высушивали на
воздухе, фиксировали и окрашивали по Романовскому - Гимзе. Содержание
основных популяций клеток крови - гранулоцигов, моноцитов и лимфоцитов в КП
и периферической крови оценивали с помощью световой микроскопии на
микроскопе
Биолам
(«Ломо»,
РФ).
Оценивалось
процентное
содержание
лимфоцитов, гранулоцитов и моноцитов, также рассчитывался индекс «КПУкровь»,
9
как отношение процентного содержания популяции в КП к процентному
содержанию популяции в периферической крови.
Проточная цитофлюориметрия
Цитофенотип КП и клеточный состав периферической крови также
исследовали на проточном цитофлюориметре BD FACSAria («BD biosciences»,
США). Содержание гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов в КП и пробах
периферической
крови определяли
по параметрам
прямого и бокового
светорассеивания. В рамках определенной по этим параметрам популяции
лимфоцитов
препарата
проводили
по
флюорохромы
оценку
экспрессии
указаны
субпопуляционного
поверхностных
в
скобках):
состава
маркеров
CDM
(РЕ)
клеточного
(использованные
-
моноциты,
CD3(FITC)/CD4(PerCP) - Т-хелперы, CD3(FITC)/CD8(PE) - Т-цитотоксические,
CD19(АРС) - В-лимфоциты, CD16(PE)/CD56(APC) - NK- клетки.
Окраска с использованием усилителя флюоресценции слабого сигнала FASER
Определение популяции клеток с фенотипом CD 14/34'"* проводили в 10 пробах
клеточного препарата и мононуклеарных клетках крови, выделенных на фиколле. В
каждой группе были следующие образцы: 1) окрашенные на CD14/34 с усилением
FASER (Fluorescence Amplification by Sequential Employment of Reagents); 2)
окрашенные на CD14/34 без усиления; 3) окрашенные только вторичными
антителами; 4) неокрашенные. Окраску с усилением FASER проводили в три этапа:
сначала клетки окрашивали первичными антителами, затем добавляли вторичные
антитела, коньюгированные с флюорохромами, после этого использовали усилитель
флюоресценции слабого сигнала FASER (Miltenyl biotech, Германия). Усиливали
флюоресценцию по каналу CD34 -
РП"С. Клетки фиксировали в растворе
параформапьдегида и анализировали на проточном цитофлюориметре.
Получение контрольных образцов
Механизмы активации клеток под влиянием полиА:У изучали, сравнивая
цитокиновый спектр КП с цитокиновым
спектром «контрольного»
КП,
инкубированного в тех же условиях, но без добавления стимулятора. Влияние
процессов
коагуляции
крови
на
концентрацию
цитокинов
выясняли,
10
анализируя пробы плазмы и сыворотки крови, собранные через 45 мин после
взятия крови. Для изучения вклада синтетической активности лейкоцитов в
формирование
цитокинового
профиля
КП
определяли
концентрацию
цитокинов в образцах с лизированными клетками (3 млн/мл). Лизис клеток
проводили путем двукратного замораживания-оттаивания. Исследовали лизаты
стимулированных
лейкоцитов
КП,
нестимулированных
лейкоцитов
«контрольного» КП и свежевыделенных лейкоцитов в плазме.
Культура МНК
Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли на градиенте плотности фиколла.
Кровь получали от здоровых доноров и больных герпетическим кератитом. МНК
ресуспендировапи в среде RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и
рассевали по лункам в концешрации 1x10® клеток/мл. В три «опытные» лунки для
каждого донора добавляли раствор полиА:У (40мкг/мл), в три «контрольные» раствор Хенкса (ООО НПП «ПанЭко», РФ). Клетки культивировали при +37°С и
5% концентрации СОг в течение 24 часов, после чего собирали супернатанты для
последующего исследования методом ИФА.
Определение цитокинов и факторов роста методом иммуноферментного
анализа
В сывороточной части КП и «контрольного» КП, плазме и сыворотке крови
определяли концентрацию провоспалительных (ИЛ-1, -2, -6, -8, ФНО-а, ИФ-а, у),
противовоспалительных
(ИЛ-4, -10) и иммунорегуляторных
(ИЛ-17)
цитокинов, а также факторов роста, регулирующих функции клеток эндотелия
роговицы (TGF-pi, TGF-ß2, b-FGF, PDGF-AB, VEGF). В образцах клеточных
лизатов оценивали концентрацию ИЛ-8 и ФНО-а. В супернатантах 24 часовых
культур МНК определяли концентрацию ИФ-у, ИЛ-4 и ФНО-а.
Определение
проводили
с
использованием
наборов
реагентов
для
иммуноферментного анализа согласно протоколам фирм-производителей: для ИЛ-1,
-2, -4, -6, -8, -10, -17, ИФ-а, -у, ФНО-а, VEGF-ЗАО «Векгор-Бест», РФ; для TGF-ßl
и TGF-ß2 - «Bender Medsystems», Австрия; для b-FGF - «Biosourse», США; для
PDGF-AB - «R&D systems», Великобритания. Результаты регистрировали на
и
иммуноферментном анализаторе Униплан, (ЗАО «Пикон», РФ) при длине волны
450 нм.
Оценка клинического эффекта применения КП
Под
наблюдением
в НИИ
ГБ
РАМН
находилось
50 человек
с
послеперационной буллезной кератопатией (ПБК), развившейся через 1-4
месяцев
после
операции
и
137
пациентов
диагнозом
герпетический
кератоиридоциклит (ГК). У всех пациентов до введения КП, несмотря на
активно проводимое консервативное лечение, тенденции к выздоровлению не
наблюдалось.
Всем
больным
проводили
общеофтальмологическое
исследование и прижизненную конфокальную микроскопию роговицы.
Послеоперационная буллезная
кератопатт
Оценка
эффективности
лечения
проводилась
Критериями
выздоровления
считали
устранение
снижение
отека
стромы
роговицы,
по
исходу
роговичного
исчезновение
булл,
лечения.
синдрома,
нормализацию
внутриглазного давления и повышение остроты зрения.
Герпетический
кератоиридоциклит
В группу, получавшую интракамеральное введение КП вошли 64 человека,
контрольную группу составили 73 пациента, получавшие в качестве лечения
интракамеральные
инъекции
Полудана.
Оценка
эффективности
лечения
проводилась по сравнению с результатом в контрольной группе. Критериями
выздоровления считали устранение роговичного синдрома, снижение отека
стромы
роговицы,
резорбцию
инфильтрации
роговицы,
экссудативных
наложений на её задней поверхности, нормализацию внутриглазного давления
и повышение остроты зрения.
Статистический анализ
Для статистического анализа данных использовали программу BioStat
(AnalystSoft
распределения
Inc.).
Полученные
критериями
данные
проверяли
Шапиро-Уилка,
на
нормальность
Колмогорова-Смирнова
и
Д'Агостино. При нормальном распределении, для оценки различия средних
значений в парных выборках использовали парный двухвыборочный тест
12
Стьюдента. Для независимых выборок - непарный двухвыборочный тест
Стьюдента. При отклонении распределения от нормального использовали
непараметрический критерий Уилкоксона для парных сравнений и критерий
Манна-Уитни для независимых выборок. Различия считали достоверными при
р<0,05.
13
Результаты и обсуждение
Методика выделения клеток
Получение клеточного препарата осуществляли следующим образом: 200
ЕД Полудана растворяли в 2,0 мл воды для инъекций и переносили в
стерильную пробирку на 10 мл. Из локтевой вены донора в пробирку с
раствором стимулятора набирали 8 мл крови и инкубировали 4 часа при
температуре 37°С - за это время происходила коагуляция крови, частичная
ретракция фибринового сгустка, синтезировались цитокины. На следующем
этапе выделяли лейкоциты, которые не попали в сгусток - пробирку со
свернувшейся кровью центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин
(центрифуга Е1т! СМ-6М), после чего собирали образовавшуюся светлую
полосу из лейкоцитарных клеток, обводя иглой шприца вокруг фибринового
сгустка.
Вместе
с
лейкоцитами
захватывалась
сыворотка
и
некоторое
количество эритроцитов.
Таким образом, в состав клеточного препарата входят несколько важных
компонентов: клетки периферической крови сывороточная часть состоящая
из
лейкоциты и эритроциты,
процессированная аутологичная сыворотка (ПАС),
сыворотки
крови,
раствора
полиА:У
и
цитокинов,
синтезированных клетками крови.
Характеристика состава клеточного препарата
Количество ядросодержащга
клеток
Концентрация ядросодержащих клеток в исследованных образцах КП
непосредственно после их получения составила (1,6±1,0)х10®клеток/мл. Объём
полученного
из
8
мл
крови
клеточного
продукта
позволял
провести
концентрирование клеток центрифугированием и отбором соответствующего
количества супернатанта (ПАС) и довести концентрацию клеток в препарате до
3x10^ клеток/мл. Жизнеспособность ядросодержащих клеток составляла 7090%. Предложенный метод выделения клеток путём их сбора на границе
сгустка свернувшейся крови позволяет получить аутологичный продукт для
14
клеточной терапии с достаточно высоким содержанием
жизнеспособных
клеточных элементов, активированных уже в процессе получения.
Количество эритроцитов в КП составило (0,76±0,43) х10® кл/мл. Малое
содержание эритроцитов позволяет избежать прокрашивания роговицы при
интракамеральном введении и побочных эффектов от продуктов распада
гемоглобина.
Содержание лейкоцитарных популягщй и лимфоцитарных
Методами
микроскопии
и
цитофлюориметрии
субпопуляций
по
показателям
светорассеяния было показано, что в клеточных препаратах соотношение
гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов несколько отличается от соотношения
в цельной крови - содержание мононуклеарной фракции снижено в 1,5 раза и
увеличена доля гранулоцитов. Показатели процентного содержания были
разными в зависимости от метода оценки - при оценке в мазках гранулоцитов и
моноцитов наблюдалось больше, чем при цитофлюориметрическом анализе,
однако
индекс
«КП/кровь»,
отражающий
изменение
содержания
этих
популяций в КП по сравнению с кровью, был одинаковым.
Таблица
1. Содержание популяций лимфоцитов в КП и крови по
результатам проточной цитометрии,
Клеточная
Кровь, %
п=10.
Клеточный
«КП/кровь»
препарат, %
популяция
Т-хелперы
42±7,35
42±8,97
1
Т-цитотоксические
17±5,3
17±5,19
1
В-клетки
7±2,85
1,5±0,65
0,21
NK-клeтки
16±9,1
18±5,24
1,13
Из таблицы 1 видно, что Т-хелперы и Т-цитотоксические присутствуют в
КП в тех же пропорциях что и в периферической крови, содержание КК-клеток
изменено незначительно, тогда как содержание В-лимфоцитов снижено почти в
5 раз.
15
Клетки с поверхностной экспрессией
€014/34'""
Установлено, что в КП клетки с поверхностной экспрессией СВ14/34'°"
составляют 1,5±0,8 % от моноцитов (0,072±0,04 % от всех лейкоцитов). В
моноцитарной фракции периферической крови клетки с таким фенотипом
выявлены в количестве 2,73±0,95 % от моноцитов. Это значительно меньше,
чем в работе Р. Romagnani (2005) - от 0,6% до 8,5% всех лейкоцитов, при этом
мы не наблюдали массивного сдвига моноцитарного гейта в область С034
положительных значений, как было описано авторами. Возможно, такая
разница обусловлена разными условиями пробоподготовки.
Цитокиновый профиль КП и влияние на него условий процессинга
Результаты определения цитокинов и факторов роста у здоровых доноров
представлены в таблице 2.
Таблица 2. Концентрация цитокинов и факторов роста в клеточных
препаратах и образцах клеточных лнзатов (пг/мл, М±5с1, в скобках - число
наблюдений)
Образцы
ИФ-7
ИЛ-4
ИЛ-8
ФИО-а
ИЛ-1
ил-6
ИФ-а
ТСР-Р1
ТСГ-Р2
РОСГ-АВ
УЕСГ
ЬГСР
10,8
14,7
389
272»
91'
559*
26,29»
35,6
8,2
7,8
214
0,011
±8,9
±7,4
±120
±102
±35
±120
±7,43
±14,6
±5,4
±2,9
±148
±0,019
(7)
(6)
(8)
(22)
(15)
(13)
(25)
(32)
1,2
17,12
38,6
9,3
11,4
260
0,005
±2,53
±4,86
±18,5
±5,8
±2,7
±181
±0,010
(10)
(9)
(14)
(13)
(8)
(15)
(32)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
КП,
сыв. часть
11Коптролышй»
КП, сыв. часть
(13)
(9)
(14)
(21)
6,26
19,38
368
0,71
±5,23
±7,73
.±88
±0,83
(16)
(7)
(15)
(15)
-
-
±11
и/о
(12)
КП,
311
сыв.часть+.
лизат
стим.
лейкоцитов
225
'
±66
(5)
(5)
297"
145»«
±23
±69
(5)
(5)
«Контрольный»
КП, сыв.часть+
лизат нести,\и
-
-
лейкоцитов
Плах»а+
лизат
лейкоцитов
-
-
47
33
±14
±16
(5)
(5)
н/о - концентрация не определяется;
- - измерение не проводилось;
16
достоверное различие с контрольным КП (р<0,05)
**-достоверное различие с плазмой (р<0,05)
Как видно из таблицы 2, в сывороточной части КП присутствовали в
высокой концентрации цитокины ФНО-а, ИЛ-1,-6,-8, ИФ-а, уровень ИЛ-4, ИФу и TGF-ßl, TGF-ß2, PDGF-AB, VEGF был в пределах того, что регистрируется
в сыворотке. В сывороточной части «контрольного» КП присутствовала
высокая концентрация ИЛ-8, уровень ИЛ-4, ИФ-у, TGF-ßl, TGF-ß2, PDGF-AB,
VEGF был также в пределах сывороточного, концентрации ИЛ-1, -6 и ФНО-а
были на минимальном уровне, содержание ИФ-а было меньше, чем в
сывороточной части КП. Таким образом, добавление стимулятора полиА:У при
получении КП приводило к TLR-опосредованной активации клеток и синтезу
провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ-1,-6 и ИФ-а. На уровень ИЛ-4, -8,
ИФ-у и факторов роста добавление стимулятора не влияло.
В свежеполученной плазме и сыворотке крови присутствовали такие же
концентрации ИФ-у и ИЛ-4 и факторов роста TGF-ßl, TGF-ß2, PDGF-AB,
VEGF, как в сывороточной части «контрольного» КП.
На
основании
полученных
результатов
можно
заключить,
что
цитокиновый профиль КП формируется за счет цитокинов:
1.
выделенных в ответ на стимуляцию полиА:У(ИЛ-1 ,-6, ФНО-а, ИФ-а);
2.
спонтанно синтезированных за время инкубации (ИЛ-8),
3.
предсуществующих в плазме и сыворотке крови (TGF-ßl, PDGF-AB, TGFß2, VEGF, ИФ-у и ИЛ-4).
В образцах лизатов лейкоцитов в плазме концентрация ИЛ-8 была выше,
чем в бесклеточной плазме, из чего можно заключить, что этот цитокин
предсуществует в депонированной форме в лейкоцитах периферической крови.
В сывороточной части КП концентрация ИЛ-8 была выше, чем в лизате
лейкоцитов в плазме. Это значит, что его наличие в КП обусловлено не только
высвобождением депонированного ИЛ-8, но и синтезом этого цитокина de novo
во
время
инкубации.
Концентрация
ИЛ-8
в
лизате
стимулированных
лейкоцитов КП не отличалась от концентрации в лизате нестимулированных
17
лейкоцитов «контрольного» КП. Что подтверждает то, что стимуляция клеток с
помощью полиА:У не влияет на синтез лейкоцитами ИЛ-8, и увеличение его
концентрации в КП инициируется другими условиями процессинга. Различия в
концентрации ИЛ-8 между образцами сывороточной части КП и лизатом
лейкоцитов КП отсутствовали, что свидетельствует о том, что через 4 ч
инкубации синтез этого цитокина завершен.
В образцах лизатов лейкоцитов в плазме присутствовал ФНО-а, его
концентрация была выше, чем в бесклеточной плазме. Следовательно, ФНО-а
на момент лизиса был депонирован в лейкоцитах. Во время процессинга
происходило его внутриклеточное накопление за счет синтеза во время
инкубации, о чем свидетельствует его повышенная концентрация в лизатах
лейкоцитов КП (как стимулированных, так и нестимулированных). Отсутствие
достоверных
концентрационных
различий
в
образцах
лизатов
стимулированных и нестимулированных лейкоцитов в КП указывает на то, что
синтез ФНО-а, также как и ИЛ-8 был инициирован условиями процессинга, а
не стимуляцией полиА:У. Следует подчеркнуть, что присутствие стимулятора
обеспечивает высвобождение из клеток вновь синтезированного ФНО-а, так
как в сывороточной части КП концентрация ФНО-а была значительно выше,
чем в сьшороточной части «контрольного» КП. Различия в концентрации ФНОа между сывороточной частью и лизатом стимулированных лейкоцитов КП
отсутствовали, то есть через 4 ч инкубации со стимулятором синтез клетками
этого цитокина и его выделение завершались.
Таким образом, механизм появления ИЛ-8 и ФНО-а в КП следующий - эти
цитокины вьщеляются из внутриклеточных депо за время инкубации, кроме
того, часть синтезируется de novo, при этом полиА:У не влияет на уровень их
синтеза, однако он усиливает высвобождение из клеток синтезированного
ФНО-а.
Концентрации провоспалительных цитокинов и TGF-pl, PDGF-AB и VEGF
в КП на порядок превышают их физиологические концентрации в водянистой
влаге передней камеры глаза, обеспечивающие в норме нерепликативное
18
состояние эндотелиоцитов. Возможно, при интракамеральном введении КП
высокие дозы ФНО-а, ИЛ-6 и ИЛ-1 ослабляют межклеточные контакты между
эндотелиоцитами, чем стимулируют пролиферативную активность эндотелия
роговицы, снимая один из механизмов ингибирования митоза. Повышение
концентрации факторов роста в водянистой влаге передней камеры глаза может
приводить к явлениям, аналогичным полученным в культуре эндотелиоцитов:
PDGF ускоряет заживление раневого дефекта, TGF-pl приводит к стимуляции
пролиферации
клеток,
усилению
продукции
коллагена
и
выработке
эндогенного b-FGF эндотелиоцитами, который, в свою очередь, защищает
клетки от апоптоза, VEGF стимулирует миграцию эндотелиоцитов в зону
повреждения.
Можно
предположить,
наблюдаемому эффекту -
что
эти
процессы
приводят
к
восстановлению барьерной функции эндотелия
роговицы.
Из публикаций в научной периодике известно, что лейкоциты, введенные в
переднюю камеру глаза, находятся там в течение недели. В нашем случае,
начавшиеся in vitro процессы синтеза и продукции цитокинов продолжаются in
vivo, после интракамеральной инъекции КП, таким образом, обеспечивается
пролонгированное локальное высвобождение биологически активных веществ,
обуславливающих клинический эффект ПКТ.
Цитокиновый профиль КП больных ПБК и ГК
Цитокиновый профиль КП у больных ГК отличается от здоровых доноров
более высоким (в 1,3 раза) уровнем ФНО-а, а у больных ПБК - более низкой
концентрацией ИЛ-6 (в 2,3 раза) и ИФ-у (в 38 раз) и более высокой (в 1,6 раз)
концентрацией ИЛ-8.
Продукция цитокинов 24 часовыми культурами МНК
МНК здоровых доноров и больных ГК отвечают на добавление в культуру
полиА:У усилением синтеза ИФ-у. На уровень синтеза ИЛ-4 и ФНО-а полиА:У
не влияет.
В контрольных культурах МНК больных ГК по сравнению с МНК,
полученными от здоровых доноров, повышена концентрация ФНО-а.
19
Отсутствие
значимого
увеличения
ФНО-а
в
культуре
МНК
при
добавлении полиА:У даже через 24 часа свидетельствует о том, что источником
этого цитокина в КП служат клетки гранулоцитарного ряда, а не МНК.
Концентрация ИФ-у, зарегистрированная в стимулированной культуре через 24
часа (193 пг/мл), на порядок превышает измеренную в КП (10,8 нг/мл). Можно
предположить, что после введения КП в переднюю камеру, МНК в составе КП,
продолжают
синтезировать
ИФ-у
и увеличивают
его
концентрацию
в
водянистой влаге, чем достигается противовирусное действие ПКТ при лечении
герпетического кератита.
Клиническая эффективность ПКТ
Послеоперационная буллезная
кератопатт
Среди пациентов с ПБК был отмечен выраженный терапевтический эффект
у 28 человек (в 56% случаев). Этот факт имеет особое значение, так как
начавшаяся ПБК чрезвычайно редко заканчивается самоизлечением.
После
интраоперационного
введения
КП
отмечалось
повышение
прозрачности, значительное снижение отека, исчезновение булл, уменьшение
толщины роговицы, повышение остроты зрения с 0,05 до 0,9.
Герпеттекий
кератит
Выздоровление в группе после введения КП составило 81%, в контрольной
группе, получавшей инъекции Полудана - 56%. Средняя острота зрения в
опытной группе составила 0,11±0,02 до лечения и 0,б±0,3 после лечения.
20
Заключение
Персонализированная клеточная терапия с использованием аутологичных
клеточных продуктов, открывает новые возможности для лечения широкого
спектра социально значимых заболеваний, в том числе и в офтальмологии,
решая ряд имеющихся на сегодняшний день проблем. Выяснение механизмов
реализации
терапевтического
действия
применяемого
лечения
даст
возможность патогенетически влиять на поврежденные ткани и органы,
лиганды толл-лайк рецепторов являются перспективными активаторами клеток
для
использования
в клеточной
терапии,
поэтому
изучение
процессов
стимуляции клеток через активацию толл-лайк рецепторов является актуальной
задачей клеточной биологии, иммунологии и офтальмологии. Стандартизация
клеточных продуктов и их характеристика позволят более адекватно подобрать
лечение для каждого больного.
В результате работы исследованы процессы активации клеток в препарате
для клеточной терапии полиА:У. Установлено, что в клеточном препарате
содержится широкий спектр цитокинов и факторов роста участвующих в
процессах
регенерации
роговицы,
который
складывается
из
цитокинов,
выделенных при стимуляции клеток полиА:У (ИЛ-1,-б, ФНО-а, ИФ-а), спонтанно
синтезированных в процессе получения клеточного препарата (интерлейкин-8),
предсуществующих в свежеполученной сыворотке и плазме крови (TGF-pi, PDGFAB, TGF-P2, VEGF, ИФ-у и ИЛ-4).
Наличие широкого спектра цитокинов и факторов роста в составе
сывороточной части клеточного препарата - процессированной аутологичной
сыворотке, позволяет рассматривать её в качестве отдельного терапевтического
инструмента.
Разработанный
метод
получения
клеток,
позволяет
выделить
из
небольшого объёма периферической крови пациента достаточное количество
клеток для проведения интраоперационной персонализированной клеточной
терапии эндотелиальных поражений роговицы - интракамерального введения
21
клеточного препарата. Клеточный препарат представляет из себя взвесь
лейкоцитов в процессированной аутологичной сыворотке.
Полученные в результате морфологического и цитофлюорометрического
исследования данные о составе клеточного препарата свидетельствуют о том,
что в его лейкоцитарный состав входят гранулоциты, моноциты и лимфоциты,
при этом доля фанулоцитарной фракции увеличена по сравнению с цельной
кровью в 1,5 раза, соотношение лимфоцитарных субпопуляицй - Т-хелперов, Тцитотоксических, КК-клеток соответствует их содержанию в цельной крови,
содержание В-лимфоиитов снижено на 80%. В клеточном препарате присутствует
минорная популяция клеток с фенотипом прогениторной популяции моноцитарного
происхождения - С014/С034'°". Эти данные имеют важное значение не только
для стандартизации метода клеточной терапии при его тиражировании, но и
открывают перспективы его дальнейшего совершенствования.
Проведенная оценка цитокинового профиля клеточного продукта у
здоровых доноров и больных раскрывает механизмы реализации лечебного
эффекта применения персонализированной клеточной терапии при лечении
эндотелиальных поражений роговицы.
Изученная
клиническая
эффективность
применения
разработанного
клеточного препарата позволяет утверждать, что он может применяться для
лечения эндотелиальных поражений роговицы.
22
ВЫВОДЫ
1.
Исследованы
механизмы
рецепторов 3 типа -
активации
клеток
лигандом
толл-лайк
полиА:У в препарате для клеточной терапии.
Установлено, что:
a. в клеточном препарате содержится широкий спектр цитокинов,
b. стимуляция клеток при помощи полиА:У приводит к повышению
концентрации в клеточном препарате ИЛ-1,-6, ФНО-а, ИФ-а,
c. в процессе получения клеточного препарата спонтанно синтезируется
интерлейкин-8,
d. в свежеполученной сыворотке и плазме крови предсуществуют фаеторы
роста TGF-pl, PDGF-AB, TGF-p2, VEGF, ИФ-у и ИЛ-4,
e. стимуляция клеток при помощи полиА:У и условия инкубации
клеточного препарата не повышают концентрацию TGF-pi, PDGF-AB,
TGF-P2, VEGF, ИФ-у и ИЛ-4 по сравнению с предсуществующим
уровнем.
2.
Изучен клеточный состав препарата на основе активированных полиА:У
клеток крови:
a. в лейкоцитарный состав клеточного препарата входят гранулоциты,
моноциты и лимфоциты, при этом доля фанулоцитарной фракции
увеличена по сравнению с цельной кровью в 1,5 раза,
b. соотношение
лимфоцитарных
субпопуляций
-
Т-хелперов,
Т-
цитотоксических, NK-клеток соответствует их содержанию в цельной
крови, содержание В-лимфоцитов снижено на 80%,
c. в клеточном препарате присутствует минорная популяция (0,072% от
всех лейкоцитов) клеток с фенотипом прогениторной популяции
моноцитарного происхождения - CD14/CD34'°".
3.
По сравнению с содержанием цитокинов в клеточных препаратах, полученных
с использованием крови здоровых доноров, у больных герпетическим
кератитом уровень ФНО-а повышен в 1,3 раза; у больных послеоперационной
буллезной кератопатией значительно (в 38 раз) снижена концентрация
23
интерферона-у
и в 2,3 раза
снижена
концентрация
интерлейкина-6,
концентрация интерлейкина-8 - повышена в 1,6 раз.
4.
Разработана технология получения аутологичного клеточного препарата на
основе активированных лигандом толл-лайк рецепторов 3 типа - полиА:У
лейкоцитов
пациента для проведения
персонализированной
клеточной
терапии в офтальмологии.
5.
Применение
разработанного
послеоперационной
буллезной
клеточного
кератопатии
препарата
для
лечения
и герпетического
кератита
является эффективным.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Изученная
клиническая
эффективность
применения
разработанного
клеточного препарата позволяет утверждать, что он может применяться для
лечения эндотелиальных поражений роговицы - послеоперационной буллезной
кератопатии и герпетического кератита в случаях неэффективности применения
консервативной терапии.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Аветисов С.Э., Каспаров A.A., Каспарова Евг.А., Павлюк A.C., Фадеева
Л.Л., Каспарова Е.А., Попкова A.M. (Суббот A.M.), Баранов П.Ю., Николаенко
Д.С. Лечение вирусных и невирусных заболеваний переднего отрезка глаза
методом
локальной
экспресс-аутоцитокинотерапии
с
использованием
комплексных клеточных препаратов аутологичных клеток периферической
крови, активированных
полиА:полиУ
// Сборник
научных
статей
«Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры»
Москва, 28-29 сентября 2007, т.2, с. 174-183
2.
Павлюк A.C., Каспаров A.A., Каспарова Е.А., Попкова A.M. (Суббот
А.М). Механизмы терапевтического действия клеточных препаратов на основе
аутологичных лейкоцитов периферической крови при лечении заболеваний
роговицы: репрограммирование иммуноцитокиновой доминанты Thl-Th2 и
продукция факторов роста TGFbl, TGFb2, bFGF // Сборник научных статей
«Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры»
Москва, 28-29 сентября 2007, т.2,с.220-225
24
3.
Павлюк A.C., Ярыгин К.Н., Каспаров A.A., Каспарова Е.А., Суббот
А.М., Каралкин П.А.. Новый метод получения активированных
лейкоцитов периферической крови для интраокулярной клеточной
терапии с использованием лиганда Toll like receptotrs-3 полиА-полиУ //
Материалы Объединенного иммунологического форума / Российский
иммунологический журнал, 2008, Т.2 (11).- №2-3.- С. 115
4.
Павлюк A.C., Каспаров A.A., Каспарова Е.А. Суббот A.M., Баранов
П.Ю. Репрограммирование иммуноцитокиновой доминанты Thl/Th2 с
использованием
лиганда
TLR-3
полиА:полиУ
И
Материалы
Объединенного
иммунологического
форума
/
Российский
иммунологический журнал, 2008, Т.2 (11).- №2-3.- С. 123-124
5.
Павлюк A.C., Каспаров A.A., Каспарова Е.А., Суббот A.M.,
Николаенко Д.С.. Клеточная терапия послеоперационной ранней
буллезной кератопатии аутологичными лейкоцитами периферической
крови преактивированными In Vitro полиА:полиУ // Материалы
Объединенного
иммунологического
форума
/
Российский
иммунологический журнал, 2008, Т.2 (11).- №2-3.- С. 115
6.
Каспарова Е.А., Каспаров A.A., Павлюк A.C., Попкова A.M. (Суббот
A.M.), Баранов П.Ю., Николаенко Д.С. Клеточная технология с применением
аутологичных лейкоцитарных клеток в лечении послеоперационной ранней
буллезной кератопатии // Сборник научных статей «Современные технологии
лечения заболеваний переднего и заднего сегментов глаза», 2008, С.176-183
7.
Суббот A.M., Антохин А.И., Павлюк A.C. Механизмы клеточной терапии
эндотелиальных поражений роговицы // материалы 9-ого съезда офтальмологов
России,-М., 2010.-С. 334
8.
Суббот А.М., Антохин А.И., Павлюк A.C.. Механизмы клеточной
терапии эндотелиальных поражений роговицы // Материалы 1П
международного
симпозиума
«Актуальные
вопросы
клеточных
технологий» / Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2010,
том V, №3, C.50.
9.
Аветисов С.Э., Суббот A.M., Антохин А.И., Каспарова Е.А., Каспаров
A.A., Павлюк A.C. Персонализированная
клеточная терапия в
офтальмологии. I. Метод получения и цитофенотип аутологичного
клеточного
продукта.
Клеточная
трансплантология
и тканевая
инженерия, том VI, №2,2011, с. 38-42.
10. Суббот A.M., Каспарова Е.А., Каралкин П.А. и соавт. Цитофенотип и
цитокиновый профиль клеточных препаратов, использующихся для лечения
поражений эндотелия роговицы // Стволовые клетки и регенеративная
медицина: сб статей / Под редакцией В.А.Ткачука. - М. МАКС Пресс, 2011. с.162-172.
11. Каспарова Е.А., Суббот A.M., Антохин А.И., Павлюк A.C. Клиническая
эффективность персонализированной клеточной терапии заболеваний
эндотелия роговицы //Катаракгальная и рефракционная хирургия, - 2011. - Т.
11, № 2 . - С . 45-49
Заказ № 40-р/01/2012 Подписано в печать 18.01.2012 Тираж 70 экз. Усл. п.лЛ
О О О "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30
J!
WWW. cfr. ru; e-mail: info@cfr. ru