1.2. Возможности иммуноцитохимического метода

1.2.
Возможности иммуноцитохимического метода определения
субпопуляционного состава лимфоцитов пациентов с
доказанным отсутствием пролиферативного синдрома.
В ретроспективный анализ данных ИЦХ были включены образцы
крови, рандомизированные по времени поступления, вне зависимости от
причины, вызвавшей необходимость иммунологического обследования.
Было выявлено, что включение в контрольные карты данных по
периферической
крови
пациентов
онкогематологического
профиля
приводит к нарушению критериев оценки контрольных карт. Нам
представлялось
целесообразным
определить
границы
применения
иммуноцитохимического метода для разработки алгоритма выбора
метода ИФТ в зависимости от клинической ситуации. Поэтому в первую
очередь в исследование были включены группы пациентов: с доказанным
отсутствием пролиферативного синдрома и с локальной формой
лимфопролиферации
периферическую
без
экспансии
кровь.
патологических
Распространенность
клеток
в
хронических
лимфопролиферативных заболеваний максимальна в средней и старшей
возрастных группах. Соответственно и группа сравнения должна была
включать пациентов аналогичного возраста. С целью формирования
однородной
группы
сопоставления
были
разработаны
критерии
включения в исследование:
• принадлежность к средней и старшей возрастным группам;
• доказанное отсутствие пролиферативного синдрома;
• отсутствие признаков сердечно-сосудистой, дыхательной и почечной
недостаточности;
• наличие
природы.
длительно
текущего
заболевания
невоспалительной
По совокупности этих требований в исследование было включено
30 пациентов, длительно страдающих варикозной болезнью вен нижних
конечностей (ВБВНК) и изучены иммуноморфологические аспекты
развития трофических нарушений до появления язвенных нарушений
целостности
кожных
покровов.
Полученые
данные
иммунограмм
сопоставлены с допустимым для популяции разбросом значений. По
выраженности трофических нарушений мягких тканей нижней трети
голени пациенты были разделены на три равные группы: без нарушения
трофики
(I);
с
отеком
дистальных
отделов
конечности,
гиперпигментацией и индурацией мягких тканей (II); с выраженными
явлениями липодерматосклероза в нижней трети голени (III). Для
выявления
степени
лабильности
показателей
иммуноцитограмммы
пациентам с максимально выраженными нарушениями трофики была
проведена функциональная проба, которой для пациентов, страдающих
ВБВНК, является ортостатическая нагрузка.
Выраженность
определена
по
включавшего
хронической
данным
дуплексное
венозной
недостаточности
клинико-инструментального
ангиосканирование,
была
обследования,
радиоизотопную
и
рентгеноконтрастную флебографию. Было выявлено, что проходимость
глубоких вен сохранна у всех пациентов, а ортостатическая и
динамическая
венозная
гипертензия
обусловлены
однотипными
нарушениями флебодинамики, в частности, рефлюксом крови вследствие
несостоятельности клапанного аппарата глубоких, поверхностных и/или
перфорантных вен.
По данным лабораторного обследования основные показатели
периферической крови, а также их усредненные значения у всех
пациентов не выходили за пределы популяционной нормы (табл. 27).
Таблица 27
Некоторые показатели клинического анализа крови больных ВБВНК
Клинико-лабораторные показатели
Нормативные значения
Мin-max
ж
м
Эритроциты, х1012/л
4,1-5,1
4,5-5,9
4,0-4,6
Гемоглобин, г/л
123-153
140-175
128-148
177-393
136-380
206-272
9
Тромбоциты, х10 /л
Лейкоциты, х109/л
4,4-9,3
4,9-6,5
Лимфоциты, %
25-40
23,9-38,9
Эозинофилы, %
2-4
1,0-6,4
50-70
55,7-66,9
2-8
3,0-5,0
Сегментоядерные нейтрофилы, %
Моноциты, %
СОЭ, мм/час
25-30
15-20
4,1-23,5
При морфологическом исследовании было выявлено, что даже при
отсутствии клинических признаков нарушения трофики нижней трети
голени, у больных I группы в медиальном слое венозной стенки
развивалась гипертрофия гладкомышечных клеток с разрастанием пучков
коллагеновых и эластиновых волокон. Во II и особенно III группе
преобладал диффузный склероз с атрофией эластического компонента
интерстиция во всех слоях венозной стенки, облитерация капилляров
венозной стенки, фиброэластоз венозных клапанов с укорочением
створок. Независимо от локализации вены, ни в одном из образцов не
обнаружено нарушений общей структурной организации венозной
стенки, участков дезорганизации или массовой гибели клеток, а также
нарушений целостности эндотелия и повреждений самих эндотелиальных
клеток. Ультраструктурные изменения по типу апоптоза имели место в
фибробластах и гладко-мышечных клетках средней оболочки большой
подкожной вены. Помимо типичных для этого феномена признаков, на
начальных
этапах
рассматриваемого
процесса
было
обнаружено
формирование щелевидных инвагинаций от плазмалеммы, которые
постепенно погружались в толщу цитоплазмы вплоть до околоядерной
области. Объем цитоплазмы при этом резко уменьшался, в конечном
счете, обнажалась значительная часть ядра, которое нередко было
подвергнуто резкой деформации.
По данным иммунологического исследования количественная
представленность различных популяций лимфоцитов периферической
крови у всех пациентов ВБВНК была в пределах популяционной нормы
(табл.28).
Таблица 28
Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови пациентов
ВБВНК
Лимфоциты
Нормативные
Группа I
Группа II
Группа III
значения
Мin-max, %
+
60-85
61,2-78
64,5-78,7
56,5-70,3
CD4+
25-55
38,0-48,4
35,2-57,0
30,7-42,1
CD8+
15-35
20,6-29,6
22,0-31,6
15,8-35,4
7-20
9,7-14,4
7,2±16,8
7,2-14,3
8-20
6-17,4
7,8-17,2
7,8-18,6
13-24
9,6-25,4
9,8-17,8
7,4-18,6
10-23
20,5-30,1
15,9-26,7
20,6-27,0
CD3
C22+
CD56
+
CD25
+
HLA-Dr
+
При сопоставлении данных пациентов с различной выраженностью
трофических нарушений были выявлены достоверные различия (p<0,05) в
содержании CD3+ и CD4+ лимфоцитов между группами II и III (рис.15).
90,0
*
80,0
70,0
*
60,0
50,0
CD3
40,0
CD4
30,0
20,0
10,0
0,0
I
II
III
* - различия достоверны при p<0,05.
Рис. 15. Относительное содержание CD3+ и CD4+ лимфоцитов у
пациентов ВБВНК без нарушения трофики (I группа), с отеком
дистальных отделов конечности (II группа) и липодерматосклерозом
нижней трети голени (III группа).
Информативность данных ИФТ лимфоцитов периферической
крови
была
подтверждена
корреляционным
анализом,
благодаря
которому выявлены различия взаимосвязи между иммунологическими
показателями при разной степени выраженности нарушенй в венозном
русле
нижних
конечностей.
Представлены
только
корреляционные связи при р≤0,05 и при р≤0,001 (табл. 29).
значимые
Таблица 29
Фрагмент корреляционной матрицы исследования пациентов ВБВНК
Показатель 1
Показатель 2
Группа I
Группа II
Группа III
CD4+
CD8+
-0.75
-
-
CD4+
CD25+
0,63
-
-
CD4+
CD4+/CD8+
0,88
0.92
-
CD8+
CD4+/CD8+
-0,95
-0,72
-
CD22+
CD25+
0,71
-
-
0,64
-
-
-
0,92
0,69
-
0,82
-
CD25
CD3
+
CD3
+
+
+
CD4 /CD8
СD4
+
+
+
CD4 /CD8
+
Возраст
CD56+
-
-0,69
-
Возраст
CD4+/CD8+
-
-
0,82
CD3+
CD56+
-
-
0,68
CD3+
HLA-DR,DP,DQ+
-
-
0,68
+
-
-
0,76
CD56
+
HLA-DR,DP,DQ
Было выявлено, что в I группе больных ВБВНК снижение
содержания
Т-лимфоцитов
хелперов
(CD4+)
было
обратно
пропорционально увеличению содержания цитотоксических лимфоцитов
(CD8+), а увеличение CD4+ не только обуславливает увеличение
иммунорегуляторного индекса, но и связано с увеличением CD25+
лимфоцитов. Увеличение количества клеток, экспрессирующих альфацепь рецептора интерлейкина 2 (CD25+) было связано с увеличением
содержания В-лимфоцитов (CD22+) и иммунорегуляторного индекса
СD4+/CD8+.
Во второй группе увеличение относительного содержания Тлимфоцитов (CD3+) происходило за счет возрастания относительного
содержания
Т-лимфоцитов
хелперов
(CD4+)
и,
соответственно,
иммунорегуляторного индекса.
В III группе – возрастание относительного содержания Т-лимфоцитов
(CD3+), в свою очередь, сопровождалось увеличением количества
натуральных киллеров (CD56+) и активированных лимфоцитов (HLADR,DP,DQ+).
Была выявлена определенная зависимость между возрастом
больных и содержанием отдельных популяций лимфоцитов. В частности,
во II группе отмечено снижение содержания CD56+ лимфоцитов с
увеличением возраста пациентов. В третьей группы выявлено возрастание
значения иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+) при увеличении
возраста больных.
Уровень
надежности
корреляционых
связей
основных
субпопуляций лимфоцитов периферической крови значительно выше в I и
II группах по сравнению с III группой, что может быть связано с
разнонаправленным характером морфофункциональных изменений у
пациентов с выраженной функциональной недостаточностью венозного
русла нижних конечностей. Причины тех или иных корреляционных
связей исследуемых признаков можно обсуждать в контексте патогенеза
развития трофических нарушений при ВБВНК, но с точки зрения
настоящего
исследования,
их
выявление
свидетельствует
об
информативности данных, полученных иммуноцитохимическим методом.
Фактически, нами показана информативность данных, полученных
иммуноцитохимическим методом у пациентов с доказанным отсутствием
пролиферативного синдрома на примере пациентов ВБВНК. В частности,
с
помощью
иммуноцитохимического
метода
выявлены
различия
взаимодействия иммунокомпетентных клеток при разной степени
выраженности трофических нарушений.
Для
подтверждения
иммуноцитохимического
предположения
метода
нами
об
информативности
проведено
дополнительное
исследование по оценке динамики иммунологических показателей крови
при выраженном нарушении трофики нижних конечностей в ответ на
функциональную нагрузку. При ВБВНК в качестве функциональной
нагрузки принято использовать 30-минутную ортостатическую пробу,
результаты которой отражают степень сохранности компенсаторных
механизмов сосудистого русла. По результатам иммунологического
обследования относительное и абсолютное содержание различных
популяций лимфоцитов, а также их усредненные значения у всех
обследованных пациентов до и после ортостатической нагрузки не
выходили за пределы популяционной нормы (табл. 30).
Таблица 30
Некоторые показатели иммунограммы больных ВБВНК
Лимфоциты
До ортостатической
После ортостатической нагрузки
нагрузки
М±σ, %
CD3+
63,4 ± 5,1*
69,6 ± 4,9*
CD4+
36,4 ± 8,1*
42,4 ± 8,2*
CD8+
25,6 ± 5,4
26,8 ± 6,5
CD22+
10,7 ± 2,6
11,8 ± 2,7
CD56+
13,2 ± 7,1
11,2 ± 6,3
CD25+
13,0 ± 5,3
13,1 ± 4,4
HLA-DR,DP,DQ+
23,8 ± 5,4
22,1 ± 6,7
* различия между группами достоверны (р< 0,05)
При сопоставлении показателей клинического анализа крови с
данными иммунограммы у пациентов с ВБВНК до ортостатической
нагрузки был выявлен ряд значимых функциональных особенностей
(табл.31).
Таблица 31
Сопоставление клинических показателей с данными иммунограммы у
пациентов ВБВНК до ортостатической нагрузки
Клинический
Содержание лимфоцитов, %
показатель
Длительность
заболевания
Масса тела
Моноциты
Лейкоциты
Гемоглобин
Коэффициент
корреляции при p<0,05
CD22 +
- 0,79
CD25 +
0,68
CD8
+
0,81
CD8
+
- 0,69
CD8
+
0,72
Цветной показатель
CD4 + /CD8 +
- 0,72
СОЭ
CD4 + /CD8 +
- 0,73
Было выявлено, что до ортостатической нагрузки
• при
увеличении
общего
содержания
лейкоцитов
происходит
уменьшение относительного содержания цитотоксических CD8+
лимфоцитов;
• с увеличением количества моноцитов и уровня гемоглобина
возрастает количество цитотоксических лимфоцитов CD8+;
• при длительном течении заболевания происходит уменьшение
количества В-лимфоцитов (CD22+);
• при нарастании массы тела увеличивается содержание лимфоцитов,
несущих на своей поверхностной мембране рецептор к α-цепи
интерлейкина 2 (CD25+).
Одновременно были выявлены достоверно значимые корреляции
некоторых
показателей
красной
крови
(гемоглобина,
цветового
показателя и скорости оседания эритроцитов) с фенотипической
характеристикой
пула
лимфоцитов,
циркулирующих
в
области
нарушения трофики:
• при увеличении цветного показателя и СОЭ снижается соотношение
CD4+/CD8+ за счет увеличения относительного содержания CD8+
лимфоцитов;
• увеличение СОЭ и ЦП происходит параллельно со снижением
иммунорегуляторного индекса.
После ортостатической нагрузки взаимосвязь клинических и
иммунологических
показателей
становилась
недостоверной.
Ортостатическая нагрузка, оказывая дозированное воздействие на
сосудистое
русло
в
области
липодерматосклероза,
приводила
к
изменению соотношения популяций лимфоцитов, циркулирующих в
области нарушения трофики (табл.32).
Таблица 32
Сопоставление клинических показателей с данными иммунограммы у
пациентов ВБВНК после ортостатической нагрузки
Клинический
показатель
Возраст
Возраст
Коэффициент
Содержание лимфоцитов, %
корреляции при p<0,05
CD56+
0,87
+
HLA-DR, DP, DQ
0,70
+
Возраст
CD8
Масса тела
CD22+
0,80
0,84
В целом, при корреляционном анализе показателей иммунограммы
после ортостатической нагрузки было выявлено, что
• с
увеличением
относительного
возраста
содержания
пациентов
происходит
натуральных
киллеров
увеличение
(СD56+),
цитотоксических лимфоцитов (CD8+), активированных лимфоцитов
(HLA-DP,DQ,DR+). Содержание именно этих популяций значительно
выше у пациентов с более поздним началом ВБВНК по сравнению с
пациентами, у которых заболевание манифестировало в относительно
молодом возрасте;
• у пациентов с исходно
более высокой массой тела после
ортостатической нагрузки увеличивается содержание В-лимфоцитов
в периферической крови, полученной из большой подножной вены в
области нарушения трофики.
Было проведено сопоставление иммунограмм по результатам ИФТ
лимфоцитов периферической крови из очага трофических нарушений до и
после ортостатической нагрузки (табл.33).
Таблица 33
Сопоставление иммунограмм больных ВБВНК до и после
ортостатической нагрузки (фрагмент корреляционной матрицы)
Содержание лимфоцитов, %
Коэффициент
после нагрузки
корреляции*
CD3+
СD3+
0,66
CD4+
CD4+
0,80
CD3+
CD4+
0,78
CD25+
CD22+
0,70
HLA-DR,DP,DQ+
CD4+
0,66
CD4+/CD8+
0,78
до нагрузки
CD56+
* уровень достоверности p<0,05
Выявленные корреляции могут быть расценены следующим
образом:
• при исходно повышенном количестве CD3+ и CD4+ их содержание
еще более возрастает после ортостатической нагрузки;
• при исходно повышенном количестве CD25+ лимфоцитов происходит
увеличение содержания В-лимфоцитов CD22+;
• чем выше исходный уровень HLA-DR,DP,DQ+ лимфоцитов (до
нагрузки), тем значительнее увеличивается содержание CD4+ клеток;
• чем выше исходное содержание натуральных киллеров CD56+, тем
значительнее увеличивается ИРИ (CD4+/CD8+).
Достоверная разница в изменении содержания лимфоцитов была
выявлена для клеток, экспрессирующих маркеры CD3+ и CD4+ (рис. 16):
90
Количество лимфоцитов, %
80
*
До нагрузки
После нагрузки
70
60
*
50
40
30
20
10
0
CD3
CD4
CD8
CD22
CD56
CD25
HLA-DR
Маркеры лимфоцитов
Рис. 16. Изменение относительного содержания различных субпопуляций
лимфоцитов в ответ на ортостатическую нагрузку.
В результате проведения функциональной пробы ортостатической
нагрузкой выявлена достоверная разница относительного содержания
лимфоцитов, позитивных по экспрессии CD3+ и CD4+. Статистически
значимыми считались различия, для которых вероятность реализации
нулевой гипотезы не превышала 0,05. Вероятность реализации нулевой
гипотезы для CD3+ и CD4+ лимфоцитов в двух группах составила 0,025 и
0,009 % соответственно.