МОНОЦИТАРНЫЙ ХЕМОТАКСИЧЕСКИЙ БЕЛОК-1 (МСР-1) КАК ФАКТОР ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ АТЕРОГЕНЕЗЕ.
advertisement
На правах рукописи КУХТИНА НАДЕЖДА БОРИСОВНА МОНОЦИТАРНЫЙ ХЕМОТАКСИЧЕСКИЙ БЕЛОК-1 (МСР-1) КАК ФАКТОР ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ АТЕРОГЕНЕЗЕ. РАЗРАБОТКА ПЕПТИДНОГО ИНГИБИТОРА МСР-1. 14.00.06 – Кардиология 03.00.25 – Гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунологии НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс» МЗ и СР РФ. Научные руководители: Академик РАН, РАМН Чазов Евгений Иванович Доктор биологических наук Красникова Татьяна Леонидовна Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Аронов Давид Меерович Доктор медицинских наук, профессор Мазуров Алексей Владимирович Ведущая организация: Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Защита состоится 30 сентября 2009 года в ч. на заседании диссертационного совета (Д 208.073.01) по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ и СР РФ (121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д.15а). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «РКНПК» МЗ и СР РФ. Автореферат разослан 2009 года Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н. В.Е.Синицын 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проявляющийся проблемы. клинически как Атеросклероз ишемическая коронарных болезнь сосудов, сердца (ИБС), представляет собой наиболее распространенную причину смерти у населения развитых стран. Атеросклероз - многофакторное заболевание, одним из патогенетических звеньев которого является воспаление. Накопление мононуклеарных лейкоцитов в стенке артерии приводит к локальной продукции цитокинов, активных форм кислорода, протеолитических ферментов и других факторов, которые могут вызвать размягчение атеросклеротической бляшки и возникновение острого коронарного синдрома. Для лечения больных ИБС с целью восстановления кровотока в стенозированных коронарных артериях широко применяют транслюминальную баллонную ангиопластику со стентированием. Воспалительная реакция, возникающая в ответ на повреждение сосуда при выполнении ангиопластики, способствует рестенозированию – повторному сужению просвета сосуда. Подавление миграции и пролиферативной активности клеток в области повреждения сосуда значительно повышает эффективность стентирования сосудов. Миграция лейкоцитов в очаг воспаления осуществляется под действием хемотаксических цитокинов – хемокинов, представляющих собой семейство гликопротеиновых молекул небольшой массы (8-10 кДа), классифицируемых по расположению в структуре консервативных цистеиновых аминокислотных остатков. Одним из основных хемокинов для моноцитов/макрофагов и активированных Т-лимфоцитов является моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1). Результаты исследований свидетельствуют о том, что МСР-1 - один из ведущих хемокинов при атерогенезе, так как ингибирование МСР-1 или его рецептора у экспериментальных животных приводит к значительному подавлению развития атеросклеротических повреждений. МСР-1 вырабатывается моноцитами/макрофагами, эндотелиальными и гладкомышечными клетками. Он не обнаружен в нормальной сосудистой стенке, однако его экспрессия 3 значительна в атеросклеротических бляшках в богатых макрофагами областях, прилегающих к липидному ядру, и в зонах инфаркта миокарда. В настоящее время ведется активный поиск лекарственных средств, действие которых направлено на ограничение миграции лейкоцитов, в частности, антагонистов МСР-1. Исследуются противовоспалительные свойства ингибирующих МСР-1 моноклональных антител, мутантных рекомбинантных форм МСР-1, ингибиторов вирусной природы и коротких пептидов молекулярной структуры МСР-1. Пептиды представляют собой наиболее безопасные соединения, и разработка пептидных антагонистов МСР-1 является одним из наиболее перспективных направлений. Цель исследования: изучение роли хемокина МСР-1 в атерогенезе и рестенозировании сосудов и разработка противовоспалительного пептидного препарата – фрагмента МСР-1, ингибирующего миграцию лейкоцитов. Задачи исследования: 1. Проанализировать экспрессию хемокинов, цитокинов и факторов роста в атеросклеротических бляшках коронарных артерий больных ИБС. Исследовать клеточный состав атеросклеротических бляшек, оценить экспрессию клетками хемокиновых рецепторов. 2. Определить концентрацию хемокина МСР-1 в плазме крови больных со стабильной и нестабильной стенокардией. 3. Получить короткие пептидные фрагменты последовательности МСР-1. Протестировать полученные пептиды в моделях миграции лейкоцитов in vitro и in vivo. Выбрать целевой пептид с наиболее выраженными ингибиторными свойствами. 4. Проанализировать противовоспалительные свойства целевого пептида в моделях подкожного воспаления у грызунов и приматов, а также при баллонной ангиопластике сонных артерий крыс. Научная новизна. Проведен анализ атеросклеротических бляшек коронарных артерий и интимы аорты больных ИБС, полученных в ходе 4 операций эндартерэктомии шунтирования. Получены коронарных оригинальные артерий данные и об аортокоронарного экспрессии мРНК цитокинов/хемокинов, в частности, хемокина МСР-1 и новые данные об экспрессии хемокиновых рецепторов клетками, выделенными из атеросклеротических бляшек коронарных артерий больных ИБС. Выявлено достоверное повышение концентрации МСР-1 в плазме крови больных ИБС с нестабильной стенокардией по сравнению с больными со стабильной стенокардией. Протестировано 15 пептидных фрагментов аминокислотной последовательности МСР-1 по влиянию на миграцию лейкоцитарных клеток в условиях in vitro. На основе анализа выбран целевой пептид – фрагмент Сконцевого домена 65-76 МСР-1 (PX). Показано, что РХ препятствует накоплению лейкоцитов в области подкожного воспаления и подавляет формирование неоинтимы на ранних сроках после проведения баллонной ангиопластики сонных артерий у экспериментальных животных. Впервые показано участие С-концевого домена хемокина МСР-1 в миграции клеток. Практическая значимость. Полученные в ходе выполнения работы данные, в частности, об экспрессии цитокинов/хемокинов и рецепторов хемокинов в атеросклеротических бляшках коронарных артерий человека, способствуют атерогенеза. более глубокому Получен новый пониманию пептидный молекулярных фрагмент 65-76 механизмов С-концевой последовательности МСР-1 (PX), подавляющий миграцию лейкоцитов in vitro и in vivo в очаг воспаления. Данный пептид может найти применение в терапии больных с хроническими воспалительными заболеваниями, а также в кардиологии у больных ИБС при возникновении острого коронарного синдрома (ОКС) и при стентировании коронарных артерий. Внедрение результатов исследования в практику. Безопасность действия полученного пептида РХ (условное название «Инграмон») показана в 5 исследованиях на добровольцах. В настоящее время в НИИ клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ проводится клиническое исследование II фазы по протоколам: 1) «Применение препарата «Инграмон» при проведении стентирования коронарных артерий у пациентов со стенозирующим атеросклерозом коронарных артерий», 2) «Применение препарата «Инграмон» у больных с ОКС без подъема сегмента ST на ЭКГ». Апробация диссертационной работы состоялась 7 июля 2009 года на межинститутской конференции НИИ клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова и НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ. Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 статей, 5 тезисов, получено 2 патента на изобретение. Статьи и тезисы опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, 3 глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы, включающего в себя источников. Диссертация изложена на рисунков. страницах, содержит таблиц и МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследование были включены 23 пациента с ИБС (II-III ФК). Группу с нестабильной стенокардией (НС) составили 12 пациентов, у которых длительность обострения заболевания не превышала 20 суток. В группу со стабильной стенокардией напряжения (ССН) включено 11 пациентов, у которых толерантность к физическим нагрузкам не менялась на протяжении как минимум 3 месяцев. Каждому пациенту выполняли многопроекционную коронароангиографию. Наличие гемодинамически значимого стеноза (50% и более), по крайней мере, в одной из магистральных коронарных артерий подтверждали у каждого пациента. Все пациенты получали аспирин (100 мг/сут) и плавикс (75 мг/сут), -блокаторы, за исключением одного в группе с НС, ингибиторы АПФ принимали 6 пациентов в группе с НС и 7 пациентов в группе 6 с ССН, статины – 10 пациентов с НС и 8 – с ССН, нитраты назначали по показаниям. Больные ИБС с ССН и НС были сопоставимы по основным клинико-ангиографическим показателям (Таб. 1 и 2). Таблица 1. Характеристика пациентов, включенных в исследование. Показатель Мужской пол Возраст, годы Курение Артериальная гипертензия Уровень глюкозы в крови, ммоль/л Уровень холестерина в крови, ммоль/л Нестабильная стенокардия (n = 12) 12 (100%) 53,2 ± 6,9 5 (42%) Стабильная стенокардия напряжения (n = 11) 8 (73%) 51,7 ± 13,7 6 (55%) 6 (50%) 5 (45%) 5,49 ± 0,72 5,18 ± 0,95 6,54 ± 0,79 5,64 ± 1,13 Таблица 2. Данные коронароангиографии. Гемодинамически значимое поражение: одной коронарной артерии двух коронарных артерий трех коронарных артерий Поражение ствола левой коронарной артерии Среднее количество пораженных артерий Нестабильная стенокардия Стабильная стенокардия напряжения 6 (50%) 4 (33%) 2 (17%) 6 (55%) 2 (18%) 3 (27%) 2 (17%) 2 (18%) 1,8 ± 0,9 2,0 ± 1,2 Образцы интимы коронарных сосудов и аорт человека. Образцы интимы коронарных артерий и аорт человека получали в ходе операций эндартерэктомии коронарных артерий и аортокоронарного шунтирования пациентов, страдающих ИБС, ССН (хирургическое отделение ИКК РКНПК). Сегменты артерий заключали в среду для замораживания O.C.T. Compound Tissue-Tek®, помещали в жидкий азот и хранили при температуре -70°C или отмывали в стерильном физиологическом растворе, погружали в раствор RNAlater® и хранили при 4°C. Иммуногистохимический анализ. Готовили гистологические срезы толщиной 6 мкм. Окрашивание и визуализацию проводили по стандартной 7 методике для замороженных образцов. Визуализацию антигенов проводили с применением специфических мышиных антител к антигенам человеческих лейкоцитов CD45, CD68, CD11c и CD4. Контрольные срезы инкубировали с 10% раствором сыворотки. В качестве субстрата для визуализации антигенов использовали ДАБ и Н2О2. Для типирования лейкоцитов у яванских макаков использовали мышиные МкАт к антигенам человека CD11c (маркер моноцитов/макрофагов) и CD45 (общий лейкоцитарный антиген); у крыс для визуализации поверхностных клеточных антигенов использовали мышиные МкАт к фактору фон-Виллебранда (vWF) и к моноцитам/макрофагам (ED1). Клеточные ядра окрашивали гематоксилином Майера. Выделение РНК. Из образцов коронарных артерий и интимы аорт выделяли РНК с применением коммерческого набора для фенольной экстракции РНК «РИБО-золь-А» в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрацию полученной РНК определяли спектрофотометрически. Реакция обратной транскрипции. Для получения кДНК проводили реакцию обратной транскрипции с использованием коммерческого набора «РЕВЕРТА». В качестве затравок для инициации реакции использовали смесь случайных гексануклеотидов. Инкубацию проводили в течение 30 минут при 37°C. Полученную кДНК хранили при -70°C до проведения анализа. Полуколичественная полимеразная цепная реакция в «реальном времени». При помощи ПЦР в «реальном времени» исследовали экспрессию мРНК генов MIP-1α, MIP-1β, I-309, ИЛ-4, 10, -13, IP-10, MCP-1, -2, -3, MIG, ITAC, RANTES, ФНО-, SDF-1. Данные об экспрессии каждого гена цитокина/хемокина выражали по отношению к уровню экспрессии гена домашнего хозяйства β2-микроглобулина. ПЦР проводили с использованием коммерческого набора «АмплиСенс-200-1» и интеркалирующего красителя SybrGreen в термоциклере Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Австралия). Выделение и иммунофенотипирование клеток из образцов интимы аорты. Образцы сосудов больных с ИБС обрабатывали коллагеназой I типа 8 согласно описанному ранее методу (Bonanno E et al., 2000). Полученную клеточную суспензию окрашивали при помощи коктейля МкАт, специфичных к антигенам зрелых лейкоцитов (lin1), МкАт к CD4, CD8, CD11c, рецептору MCP1 CCR2 и контрольными иммуноглобулинами. Связывание антител с клетками анализировали на поточном цитофлюориметре FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems) с использованием программного обеспечения CellQuest. Измерение концентрации МСР-1 в плазме крови пациентов с НС и ССН. Концентрацию МСР-1 измеряли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора Biosource (США). Выделение моноцитов/макрофагов из периферической крови. Мононуклеарные клетки выделяли из венозной крови здоровых доноров методом центрифугирования в градиенте плотности Histopaque (Boyum, 1968). Обогащенную моноцитами суспензию клеток получали с помощью центрифугирования в ступенчатом градиенте перколла по описанному ранее методу (Al-Sumidaie et al., 1984). Полученная суспензия клеток (4 млн/мл) содержала 74 ± 10% моноцитов. Жизнеспособность клеток составляла не менее 96%. Оценка миграции клеток in vitro в модифицированной микрокамере Бойдена. Изучение миграции клеток проводили с использованием микрокамеры Бойдена (Falk W et al., 1980). В качестве хемокина использовали МСР-1 (50 нг/мл для моноцитов и 100 нг/мл для клеток ТНР-1) (R&D Systems, США). Клетки и раствор хемокина разделяли мембраной с размером пор 5 мкм для моноцитов и 8 мкм для клеток ТНР-1. Время миграции составляло 1 час для моноцитов и 3 часа для ТНР-1. Промигрировавшие клетки фиксировали и окрашивали красителем Гимза. Мембрану сканировали на сканере HP ScanJet 5300C и анализировали с использованием программного обеспечения SigmaGel. Данные выражали в относительных 9 единицах, представляющих собой отношение клеточной миграции в опыте к контрольной величине, полученной при отсутствии хемоаттрактанта. «Air pouch» (воздушный мешок) у мышей. В спинной области самцов гибридных мышей F1CBA/Lac × C57B1/6 (25 г, 7-9 нед., питомник «Столбовая»), создавали полость при помощи 2-кратного подкожного введения стерильного воздуха. На 7 сутки мышам вводили в полость 1 мл рекомбинантного мышиного МСР-1 (JE/CCL2) (100 нг/мл) или 1 мл раствора МСР-1(JE) + РХ, раствора ЛПС (1 мкг/мл) или ЛПС + РХ. Контрольным животным в полость вводили 1 мл стерильного физиологического раствора. Через 4 ч полости промывали раствором Версена, лаважную жидкость отбирали, подсчитывали количество клеток в камере Нойбауэра. Типирование моноцитов/макрофагов проводили при помощи МкАт (клон F4/80) и поточного цитофлюориметра. В экспериментах при подборе оптимальной ингибирующей дозы пептида в «воздушный мешок» инъецировали ЛПС в указанной выше концентрации. РХ вводили внутримышечно в диапазоне концентраций от 0,1 мкг/мл до 1,0 мг/мл. Подкожное воспаление у крыс и приматов. В работе использовали самцов линейных крыс Wistar (масса 300-400 г, 2,5-3 мес., питомник «Столбовая») и самцов яванских макаков (Macacus fascicularis) (масса 2,5-3 кг, 2,5-3 года, ГУ НИИ Медицинской Приматологии РАМН). В спинную область животных подкожно вводили ЛПС: 2 мкг/кг для крыс и 3,3 мкг/кг для обезьян. РХ вводили внутримышечно крысам в концентрации 40 мкг/кг или двукратно внутривенно обезьянам (сразу после введения ЛПС и через 4 ч) в концентрации 33 мкг/кг. Контрольным животным вводили РХ, стерильный физиологический раствор или смесь аминокислот, входящих в состав РХ (33 мкг/кг). Препараты готовили через 24 ч, фиксировали и окрашивали красителем Гимза или МкАт. Количество клеток считали не менее чем в 10 полях зрения. Баллонная ангиопластика общих сонных артерий крыс. Левую общую сонную артерию крыс Wistar деэндотелизировали при помощи 3 пассажей эмболоэктомического баллонного катетера 10 Фогарти-2F (Baxter, США). Опытным животным вводили 1 раз в сутки внутримышечно 10 мкг РХ в 100 мкл физиологического раствора, контрольным - 100 мкл физиологического раствора. Через 4, 7, 14 и 28 суток после операции левую общую сонную артерию и контралатеральный контрольный сосуд иссекали. Фрагменты сосудов погружали в среду для замораживания O.C.T. Compound Tissue Teck®, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70˚C. Морфометрический анализ. Морфометрический анализ гистологических срезов сонных артерий (измерение площади неоинтимы, медии и просвета сосуда) проводили с помощью программного обеспечения Optimas 6.1. Анализ параметров клеточного иммунитета крыс. Общее количество лейкоцитов подсчитывали в камере Нойбауэра по стандартной методике после лизиса эритроцитов в 5% уксусной кислоте. Анализ субпопуляций лимфоцитов проводили при помощи цитофлюориметрии в потоке с использованием мышиных МкАт, специфичных к антигенам лимфоцитов крыс CD3, CD4, CD8, NKR-p1A, а также контрольных Ig мыши. Статистический анализ. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента и критерий Манна-Уитни с минимальным уровнем значимости р=0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ атеросклеротических бляшек коронарных артерий и аорт больных ИБС. Во всех проанализированных образцах бляшек обнаружены очаговые скопления мононуклеарных лейкоцитов. Для подтверждения результатов морфологического анализа образцы сосудов окрашивали МкАт к антигенам лейкоцитов. Иммуногистохимический анализ выявил участки скопления CD45+клеток (лейкоцитов), в том числе моноцитов/макрофагов (CD11c+) и CD4+ Т-клеток (Рис. 1). 11 а б в г Рисунок 1. Иммуногистохимический анализ атеросклеротической бляшки коронарной артерии человека. Окрашивание срезов контрольными иммуноглобулинами (а), антителами (коричневый цвет) к CD11с (б), CD45 (в) и CD4 (г). Ядра окрашены гематоксилином Майера, ×600. При помощи ПЦР в реальном времени практически во всех исследованных образцах атеросклеротических бляшек коронарных артерий и интимы аорты без макроморфологических изменений выявили экспрессию мРНК индуцибельных (воспалительных) хемокинов MIG, I-309, MCP-3, а также ИЛ-13 и SDF-1 (Рис. 2). Экспрессия конститутивного хемокина SDF-1 в интиме аорты и бляшках может быть обусловлена его участием в репарации поврежденной артериальной стенки (Xiao Q et al., Ранее 2007). ИЛ-13 рассматривали как противовоспалительный цитокин (Minty A et al., 1993). В настоящее время считают, что длительное действие ИЛ-13 оказывает провоспалительное действие из-за активации неспецифических факторов транскрипции, приводящих в свою очередь к усилению секреции хемокинов МСР-1, -2, -3, -5, MIP-1α, -1β и -2 (McCaffrey TA et al., 2000). В проанализированных образцах атеросклеротических бляшек, помимо указанных выше хемокинов и цитокинов, была обнаружена экспрессия хемокина МСР-1, MIP-1, и провоспалительного цитокина ФНО-, которые не были обнаружены в образцах «неизмененной» интимы аорты. Полученные нами результаты показали, что: 1) более чем в половине атеросклеротических бляшек коронарных артерий обнаружена мРНК хемокина МСР-1, 2) у пациентов с ИБС 12 интима артерий без макроморфологических изменений может являться участком развивающегося воспаления. Рисунок 2. Анализ экспрессии мРНК цитокинов/хемокинов в интиме «неизмененных» артерий и артерий с атеросклеротическими бляшками (данные представлены как процент образцов с выявленной экспрессией цитокина по отношению ко всем образцам в группе). Образцы атеросклеротических бляшек подвергались обработке коллагеназой с последующим иммунофенотипированием выделенных клеток (Рис. 3). Рисунок 3. Иммунофенотипирование клеток, выделенных из атеросклеротических бляшек (показаны результаты одного из 4 независимых экспериментов). Из образцов бляшек (n = 4) были выделены лейкоциты, в основном Тклетки (CD3+), 48-50% из которых являлись Т-хелперными клетками 13 (CD3+CD4+). Рецепторы хемокина МСР-1 CCR2 обнаружены на 12-40% Тхелперов. Полученные данные могут свидетельствовать о хемотаксисе клеток в атеросклеротическую бляшку под действием МСР-1. Для дополнительной оценки участия хемокина МСР-1 в патогенезе атеросклероза и ОКС мы определили концентрацию МСР-1 в крови больных ИБС с нестабильной стенокардией (НС) и у больных со стабильной стенокардией напряжения (ССН). Измерение концентрации МСР-1 в плазме крови пациентов с ИБС со стабильной и нестабильной стенокардией. По данным нашего исследования концентрация МСР-1 оказалась достоверно выше в плазме крови у пациентов с НС по сравнению с больными с ССН (Рис. 4). Рисунок 4. Концентрация МСР-1 в плазме у пациентов с ИБС. * - р < 0,0001. Выраженность межгрупповых различий позволяет предполагать, что определение концентрации МСР-1 в плазме крови пациентов с ИБС в комплексе с другими показателями может использоваться для дифференциальной диагностики НС и ССН. На основании данных об участии МСР-1 в атерогенезе этот хемокин рассматривается как мишень для терапевтического воздействия. С этой целью в нашей работе совместно с сотрудниками лаборатории синтеза пептидов НИИЭК РКНПК (под рук. к.х.н. Беспаловой Ж.Д.) был получен ряд коротких пептидов – фрагментов структуры МСР-1. 14 Разработка и получение новых противовоспалительных препаратов пептидной природы на основе структуры хемокина МСР-1. Структура МСР1 была проанализирована с помощью компьютерных программ Peptide Companion, позволяющих предсказывать линейные эпитопы в белках, включая метод предсказания гидрофильных участков аминокислотной цепи, метод оценки поверхностной доступности и метод учета встречаемости различных сочетаний аминокислотных остатков в уже известных антигенных детерминантах. После проведенных расчетов было выбрано несколько потенциально «активных» фрагментов последовательности МСР-1 и осуществлён их синтез посредством автоматического твердофазного метода с использованием Fmoc-технологии. Синтезированные пептиды тестировали in vitro по их влиянию на миграцию моноцитарных клеток в камере Бойдена. В результате был выбран пептидный фрагмент 65-76 C-концевой последовательности МСР-1 (РХ), обладавший максимальной ингибирующей активностью (РХ подавлял миграцию клеток ТНР-1 и моноцитов крови на 60% и 50% соответственно) (Рис. 5). Рисунок 5. Влияние пептида РХ на МСР-1-стимулированную миграцию промоноцитарных клеток ТНР-1 и моноцитов крови. Данные представлены как среднее трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение. За 100% принята миграция клеток в присутствии МСР-1. 15 В первичной структуре МСР-1 C-концевая последовательность 65-76, соответствующая РХ, выделена красным цветом: H-Ala-Gln-Pro-Asp-Ala-IleAsn-Ala-Pro-Val-Thr-Cys-Cys-Tyr-Asn-Phe-Thr-Asn-Arg-Lys-Ile-Ser-Val-Gln-ArgLeu-Ala-Ser-Tyr-Arg- Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Arg-Cys-Pro-Lys-Glu-Ala-Val-Ile-Phe- Lys-Thr-Ile-Val-Ala-Lys-Glu-Ile-Cys-Ala-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Val-Gln-AspSer-Met-Asp-His-Leu-Asp-Lys-Gln-Thr-Gln-Thr-Pro-Lys-Thr-OH. В предыдущих исследованиях утверждалось, что C-концевой домен хемокина МСР-1 не имеет функционального значения в стимуляции клеточной миграции (Han KH et al., 1999), и пептиды из этой области не конкурируют с МСР-1 при взаимодействии с рецепторами клеток ТНР-1 (Steitz SA et al., 1998). Полученный нами пептид РХ значительно подавлял МСР-1-опосредованную миграцию клеток ТНР-1 и моноцитов крови. Ингибирующая активность РХ оказалась сопоставима с активностью пептида последовательности 51-62 МСР1, который описан в литературе как наиболее эффективный пептидный ингибитор миграции моноцитарных клеток in vitro (Reckless J et al., 2001). Таким образом, мы впервые получили данные о возможном участии C-концевой части молекулы МСР-1 в клеточной миграции. Для выявления ингибирующей активности РХ in vivo мы провели серию экспериментов с использованием нескольких моделей воспаления у экспериментальных животных. Действие РХ на миграцию лейкоцитов в модели «аir pouch» (воздушный мешок) у мышей. Введение рекомбинантного мышиного МСР-1 (JE) в воздушный мешок у мышей сопровождалось усилением миграции моноцитов в полость мешка. Содержание клеток (тыс.) в лаваже в присутствии хемокина по сравнению с контролем составляло 210 ± 73 против 100 ± 56, соответственно. Одновременное введение МСР-1 и РХ приводило к снижению числа моноцитов в лаваже (96 ± 43 клеток) (Рис. 6а). Инъецирование в сформированный воздушный мешок ЛПС сопровождалось миграцией в полость мешка гранулоцитов, которые в контроле отсутствовали. Совместное введение 16 ЛПС и РХ приводило к снижению количества гранулоцитов в лаважной жидкости (n = 7 для каждой группы) и составляло в контрольной группе – 83 ± 43, с ЛПС – 1778 ± 870, с ЛПС + РХ – 970 ± 446 (Рис. 6б). Рисунок 6. а. РХ ингибирует MCP-1(JE)–индуцированную миграцию моноцитов в «воздушный мешок» у мышей (n = 5 для каждой группы). б. РХ ингибирует ЛПС-индуцированную миграцию гранулоцитов в «воздушный мешок» у мышей (n = 7 для каждой группы). Концентрация рекомбинантного мышиного МСР-1 - 100 нг/мл, ЛПС - 1 мкг/мл, РХ - 1мкг/мл, * - р < 0,05. # - p = 0,056. В следующей серии экспериментов подбирали минимальную ингибирующую дозу РХ. Для этого в «воздушный мешок» вводили ЛПС. РХ вводили внутримышечно в диапазоне доз от 0,1 мкг/мл до 1,0 мг/мл. Ингибирующий эффект РХ сохранялся в диапазоне концентраций: 0,001-0,010,1 мг/мл. Таким образом, минимальная ингибирующая концентрация РХ составила 1 мкг/мл (40 мкг/кг). При этом количество гранулоцитов в лаважной жидкости мешка снижалось практически одинаково ~ на 40-50% (Рис. 7). 17 Рисунок 7. Внутримышечное введение РХ подавляет ЛПС- стимулированный хемотаксис гранулоцитов в «воздушный мешок» у мышей (n=5 в каждой группе). За 100% принято среднее количество клеток у животных, которым не вводили РХ. Таким образом, РХ эффективно подавлял миграцию моноцитарных и гранулоцитарных лейкоцитов в «воздушный мешок» у мышей при одновременном введении хемоаттрактанта и РХ в полость «воздушного мешка» и при внутримышечном введении РХ. Действие РХ на миграцию лейкоцитов в очаг подкожного воспаления у крыс. В зоне ЛПС-индуцированного воспаления присутствовали фибробласты, гранулоциты и моноциты (Рис. 8в). Лейкоцитарные клетки отсутствовали при введении физиологического раствора (Рис. 8а) или РХ (Рис. 8б). При введении ЛПС и РХ количество гранулоцитов и моноцитов снижалось приблизительно на 70 и 25%, соответственно (Рис. 8г). Количество фибробластов достоверно не отличалось ни в одной из групп. а б в 18 г Рисунок 8. Внутримышечное введение РХ подавляет подкожное воспаление у крыс. Представлены характерные результаты одного из трех независимых экспериментов (n = 4 для каждой из групп). Окрашивание по Романовскому-Гимза. Увеличение ×100. Действие РХ на развитие подкожного воспаления у приматов. У яванских макаков через 24 часа после инъекции ЛПС в очаге воспаления накапливались главным образом гранулоциты и единичные моноциты. Количество лейкоцитов в поле зрения в группе с введением ЛПС (n = 6) составляло 90 ± 10 против 50 ± 24 в группе с введением РХ (n = 5), т.е. РХ подавлял миграцию лейкоцитов в зону воспаления (Рис. 9 и 10). Количество фибробластов в группах достоверно не отличалось. Контрольная смесь аминокислот, составляющих РХ, никак не влияла на миграцию клеток. а в б г д Рисунок 9. Внутривенное введение РХ подавляет подкожное воспаление у приматов. Окрашивание препаратов красителем Гимза. Увеличение ×100. 19 а. б. контроль ЛПС ЛПС + РХ Рисунок 10. Внутривенное введение РХ подавляет подкожное воспаление у приматов. Иммуногистохимическое окрашивание МкАт (коричневый цвет) к антигенам лейкоцитов CD45 (а) и моноцитов CD11с (б). Увеличение ×100. Таким образом, РХ обладает противовоспалительными свойствами, так как подавляет хемотаксис клеток в ответ на МСР-1(JE) и ЛПС у экспериментальных животных. Экспериментальная баллонная ангиопластика сонных артерий крыс. Баллонное повреждение левой общей сонной артерии выполняли доступом через наружную сонную артерию. Через 4 суток после баллонирования на месте поврежденного интимального слоя в сосудах крыс, получавших только физиологический раствор, наблюдали адгезировавшие клетки крови. В сосудах крыс, получавших РХ, на месте поврежденного интимального слоя первичные скопления клеток практически отсутствовали (Рис. 11). а б 20 Рисунок 11. 4-е сутки после баллонного повреждения сонной артерии крыс. а. Контрольная группа. б. Группа с РХ. Иммуногистохимическое окрашивание МкАт к vWF. Клеточные ядра окрашены гематоксилином Майера. Увеличение 600×. Количество ядер клеток в неоинтиме, площадь неоинтимы и отношение площади неоинтимы к медии были достоверно ниже в группе с РХ по сравнению с контрольной группой. Площадь просвета сосуда и площадь медии не имели достоверных отличий (Рис. 12 и 13). Рисунок 12. Количество ядер клеток в неоинтиме и площадь неоинтимы после баллонного повреждения общих сонных артерий крыс. Белые столбцы – контрольная группа с получением физиологического раствора, серые – группа с получением РХ. * - р < 0,05. 21 Рисунок 13. Площадь просвета сосуда и отношение площади неоинтимы к площади медии после ангиопластики сонной артерии крыс. Белые столбцы – контрольная группа с получением физиологического раствора, серые – группа с получением РХ. * - р < 0,05. Через 7 суток в обеих группах животных люминальную поверхность сосуда покрывали расположенные в несколько слоев клетки, образующие неоинтиму (Рис. 14). В группе с получением РХ площадь неоинтимы, количество ядер клеток в неоинтиме и отношение площади неоинтимы к площади медии были достоверно ниже, а площадь просвета сосуда достоверно больше по сравнению с контрольной группой (Рис. 12 и 13). а б Рис. 14. Формирование неоинтимы через 7 суток после баллонирования сонной артерии крыс. Окрашивание красителем Гимза. а. Контроль. б. Группа с РХ. Увеличение 400×. Через 14 и 28 суток после баллонного повреждения сонной артерии крыс в контрольной группе и группе с получением РХ наблюдали выраженную интимальную гиперплазию. Ни один из указанных выше показателей не имел достоверных отличий. Общее количество лейкоцитов в периферической крови, а также относительное содержание популяций лимфоцитов: Т-клеток, в том числе Тхелперов (CD3+/CD4+), цитотоксических лимфоцитов (CD3+/CD8+) и естественных киллеров (CD3-/NKR-p1A+) достоверных отличий не имели на всех сроках после повреждения сосудов. Полученные данные свидетельствуют о том, что синтетический пептидный C-концевой фрагмент 65-76 МСР-1 РХ не 22 оказывает системного действия на параметры неспецифического и специфического иммунитета. По-видимому, он оказывает локальное действие, подавляя миграцию лейкоцитов в месте повреждения артерии. РХ достоверно подавляет формирование неоинтимы на ранних сроках, когда в данном процессе самыми активными участниками являются лейкоциты. В целом, на основании экспериментов в моделях воспаления у экспериментальных животных нами было показано противовоспалительное действие разработанного пептида РХ. ВЫВОДЫ: 1. В атеросклеротических бляшках коронарных артерий больных ИБС выявлена экспрессия хемокина MCP-1. Лейкоциты, выделенные из образцов атеросклеротических бляшек, экспрессируют рецептор МСР-1 CCR2. 2. Концентрация МСР-1 в плазме крови пациентов с нестабильной стенокардией достоверно повышена по сравнению с пациентами со стабильной стенокардией. 3. Синтетический пептид С-концевой последовательности (65-76) МСР-1 (PX) ингибирует МСР-1-опосредованную миграцию моноцитов человека in vitro в камере Бойдена и в «воздушном мешке» у мышей. 4. PX подавляет подкожное ЛПС-индуцированное воспаление у крыс и приматов. 5. PX препятствует формированию неоинтимы после баллонного повреждения сонных артерий крыс на ранних сроках после вмешательства. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Н.Б. Глазкова, Т.И. Арефьева, О.А. Антонова, Т.Л. Красникова. Действие ингибиторов митоген-активируемых киназ на хемотаксис клеток, стимулированный моноцитарным хемотаксическим белком-1. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2003, 89(1): 43-51. 2. Н.Б. Кухтина, Т.И. Арефьева, А.М. Арефьева, Т.Л. Красникова. Зависимость хемотаксического ответа моноцитарных клеток, стимулированных 23 моноцитарным хемотаксическим белком-1, от состава подложки. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2003, 89(12): 1577-1581. 3. Сидорова М.В., Молокоедов А.С., Арефьева Т.И., Кухтина Н.Б., Красникова Т.Л., Беспалова Ж.Д., Бушуев В.Н. Пептидные фрагменты хемокина МСР-1, их структурные аналоги и их влияние на МСР-1-опосредованную миграцию моноцитарных клеток. Биоорганическая химия, 30(6): 582-93, 2004. 4. Т.Л. Красникова, Т.И. Арефьева, М. Г. Мелехов, Н. Б. Кухтина, М.В. Сидорова, А.С. Молокоедов, В.Н. Бушуев, Ж.Д. Беспалова, Е.И. Чазов. Пептид последовательности 66-77 моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) ингибитор воспаления у экспериментальных животных. Доклады Академии наук, 2005, 404, 4,551-554. 5. Arefieva T.I., Kukhtina N.B., Antonova O.A., Krasnikova T.L. MCP-1 stimulated chemotaxis of monocytic and endothelial cells is dependent on activation of different signaling cascades. Cytokine 2005, 31(6): 439-446. 6. М.В. Сидорова, А.С. Молокоедов, А.А. Азьмуко, Т.И. Арефьева, М.Г.Мелехов, Н.Б.Кухтина, Т.Л.Красникова, Ж.Д. Беспалова, В.Н. Бушуев. Пептидный фрагмент (66-77) моноцитарного белка -1 и его ретро-энантиоаналог ингибируют миграцию клеток in vivo и in vitro. Биоорганическая химия, 2006, 32,2,161-168. 7. С.И. Проваторов, Т.И. Арефьева, Н.Б. Кухтина, Т.К. Люкова, А.М. Арефьева, Т.Л. Красникова. Маркеры воспаления - моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) и С-реактивный белок - в крови пациентов с нестабильной стенокардией и стабильной стенокардией напряжения. Терапевтический Архив, 2006, 6, 66-69. 8. Чазов Е.И., Красникова Т.Л., Беспалова Ж.Д., Кухтина Н.Б., Мелехов М.Г., Арефьева Т.И., Сидорова М.В., Молокоедов А.С., Гвоздик Т.Е., Мартьянов Б.М., Поздеев В.В., Сергиенко В.Б., Бушуева Т.Л. Ингибирование миграции моноцитов и гранулоцитов in vivo пептидом последовательности 65-76 24 моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1). Доклады Академии наук, 2006; 411: 270-272. 9. Chazov EI, Bespalova JD, Arefieva TI, Kukhtina NB, Sidorova MV, Provatorov SI, Krasnikova TL. The peptide analogue of MCP-1 65-76 sequence is an inhibitor of inflammation. Can J Physiol Pharmacol. 2007; 85(3-4): 332-40. 10. Н. Б. Кухтина, П. П. Баштрыков, Беспалова Ж.Д., Сидорова М.В., Т. И. Арефьева, В.О.Соколов, Т. Л. Красникова. Влияние синтетического фрагмента 65-76 МСР-1 на формирование неоинтимы после баллонного повреждения у крыс. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2008, 94(1): 2736. 11. Н.Б. Кухтина, Т.И. Арефьева, А.М. Арефьева, Р.С. Акчурин, Т.Л. Красникова. Экспрессия хемокинов и цитокинов в атеросклеротических бляшках и интиме артерий у больных ИБС. Терапевтический архив, 2008, №4, с.63-69. 12. Kukhtina NB, Bashtrykov PP, Bespalova ZhD, Sidorova MV, Aref’eva TI, Sokolov VO, Krasnikova TL. Effects of synthetic monocyte chemotactic protein – 1 fragment 65-76 on neointima formation after carotid artery balloon injury in rats. Neurosci Behav Physiol. 2009, 39:153-159. 13. Т.Л.Красникова, М.В.Сидорова, Т.И.Арефьева, Н.Б.Кухтина, А.А.Азьмуко, Ж.Д.Беспалова. Разработка нового противовоспалительного пептидного препарата - ингибитора моноцитарного хемотаксического белка-1. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2009, 95(5): 494-506. 25 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ АПФ – ангиотензинпревращающий фермент ДАБ - диаминобензидина тетрахлорид ИБС – ишемическая болезнь сердца ИЛ – интерлейкин КФК - креатинфосфокиназа ЛПС – липополисахарид МкАт – моноклональное антитело НС – нестабильная стенокардия ОКС - острый коронарный синдром ПЦР – полимеразная цепная реакция СРБ – C-реактивный белок ССН - стабильная стенокардия напряжения ФК – функциональный класс ФНО - фактор некроза опухоли IP-10 - индуцированный ИФН-γ белок-10 I-TAC - индуцированный ИФН-γ Т-клеточный α-хемоаттрактант MIG - индуцированный ИФН-γ монокин MIP – макрофагальный воспалительный белок MCP-1 – моноцитарный хемотаксический белок-1 РХ – пептид-10 RANTES – хемокин, регулируемый при активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками SDF – получаемый из стромальных клеток фактор vWF – фактор фон-Виллебранда 26
