САМОЙЛЕНКОВА НАДЕЖДА СЕРГЕЕВНА ЗАЩИТНЫЙ ЭФФЕКТ
advertisement
На правах рукописи САМОЙЛЕНКОВА НАДЕЖДА СЕРГЕЕВНА ЗАЩИТНЫЙ ЭФФЕКТ ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ ПРИ ФОКАЛЬНОЙ ИШЕМИИ МОЗГА; РОЛЬ АТФ-ЗАВИСИМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ 03.00.13 – физиология 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 1 Работа выполнена на кафедре нормальной и патологической физиологии ГУНУ факультета фундаментальной медицины (заведующий – профессор В.Б. Кошелев) МГУ имени М.В. Ломоносова, в лаборатории функциональной морфо-химии (заведующий – профессор Р.М. Худоерков) ГУ НИИ неврологии РАМН. НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук, профессор, Владимир Борисович заведующий кафедрой нормальной и Кошелев патологической физиологии ГУНУ факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова Рудольф Михайлович Худоерков доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией функциональной морфо-химии ГУ НИИ неврологии РАМН ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор, Рубен Симонович руководитель лаборатории цереброваскулярных Мирзоян расстройств ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН Владимир Иванович Торшин доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Российский государственный медицинский университет, кафедра фундаментальной и прикладной физиологии медико-биологического факультета Защита диссертации состоится 25 февраля 2008 года в 15ч 30мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д.1, строение 12, ауд. М-1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова Автореферат разослан 23 января 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук 2 Б.А. Умарова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Ежегодно в России регистрируется около 460 тысяч возникающих вновь цереброваскулярных заболеваний, среди которых ишемический инсульт занимает лидирующее место (Верещагин Н.В., Суслина З.А., 2003). Смертность от инсультов в России – одна из наиболее высоких в мире (Гусев Е.И. и др., 2007). В связи с этим изучение патогенеза и способов коррекции инсульта представляется важным как с теоретической, так и с практической точки зрения. Известно, что устойчивость мозга к дефициту кровоснабжения может повышаться в результате прекондиционирования, вызванного короткими эпизодами ишемии/реперфузии или гипоксии, кратковременной гипотермией и другими умеренными стрессорными воздействиями, способными активировать эндогенные защитные механизмы (Kitagawa K. et al., 1990, 1991; Nishio S. et al., 1999; Власов Т.Д. и др., 2004; Sharp F.R. et al., 2004). Процесс прекондиционирования включает в себя, по крайней мере, две фазы: острую, защитный потенциал которой начинает проявляться в пределах нескольких минут и обусловлен различными посттрансляционными изменениями, и отсроченную (Самойлов М.О. и др., 2001). Протекторный эффект второй фазы развивается в течение часов, он может продолжаться несколько суток и недель и обычно требует синтеза белков de novo (Steiger H.J., Hanggi D., 2007). Механизмы протекторного действия прекондиционирования весьма разнообразны. Они сопряжены с активацией системы оксида азота (Manukhina E.B., 2006), транскрипционных факторов, таких как HIF-1, NFκB, JNK, CREB (Semenza G.L., 2000; Hossmann K.A., 2006), что в конечном итоге приводит к увеличению мощности систем транспорта и утилизации кислорода, систем антиоксидантной защиты, уменьшению дисфункции эндотелия, митохондриальной дисфункции (Dirnagl U. et al., 2003; Racay P. et al., 2007). Прекондиционирование уменьшает эксайтотоксичность глутамата, увеличивает выброс тормозных медиаторов, ограничивает кальциевую перегрузку клеток в очаге ишемии (O’Duffy A.E. et al., 2006). Прекондиционирование также влияет на период постишемической реперфузии. При этом отмечается ограничение повреждающих эффектов активных форм кислорода, постишемического воспалительного процесса, уменьшается проницаемость микрососудов, вазомоторная дисфункция, активируются системы репарации ДНК (Gidday J.M., 2006; Li N. et al., 2007). Во время прекондиционирования синтезируются ростовые (VEGF, NGF) и нейротрофические факторы (BDNF), белки теплового шока, антиапоптотические белки (Bcl-2) (Dirnagl U. et al., 2003; Rybnikova E. et al., 2006; Marini A.M. et al., 2007). Развивается гипотеза, что ишемическое прекондиционирование репрограммирует ответ генома на последующую жесткую ишемию (Stenzel-Poore M.P. et al., 2007). По поводу того, какая из фаз играет более значимую роль в развитии «ишемической толерантности» мозга, в литературе встречаются противоречивые мнения. Некоторые авторы отмечают преимущественную роль 3 отсроченной фазы (Barone F.C. et al., 1998), в отличие от сердца, где запуск защитных механизмов происходит достаточно быстро (Kirino T., 2002). Другие исследователи наблюдают развитие устойчивости мозга к последующей ишемии уже через полчаса после окончания прекондиционирования (PerezPinzon M.A. et al., 1997). Как правило, в этих работах ишемическое прекондиционирование мозга моделируют различными способами. В данной работе мы обнаружили способ ишемического прекондиционирования, который проявляет свой защитный эффект в обе фазы развития толерантности мозга. Интригующим с точки зрения патогенеза и сравнительно мало изученным является феномен дистантного прекондиционирования, суть которого состоит в том, что кратковременные эпизоды ишемии одного органа (брыжейки, нижней конечности), повышают устойчивость сердца или мозга к тяжелым ишемическим повреждениям (Huda R. et al., 2005; Петрищев Н.Н. и др., 2006). Наибольшее развитие концепция данного типа прекондиционирования получила при изучении сердца (Wolfrum S. et al., 2002), однако этот феномен установлен и при моделировании глобальной ишемии мозга (Власов Т.Д. и др., 2004; Rehni A.K. et al., 2007). В связи с этим, предстояло разработать максимально стандартизированную модель фокального ишемического инсульта и сопоставить эффективность протекторного действия дистантного, ишемического и нормобарического гипоксического прекондиционирования. Анализируя стадию реализации защитных эффектов прекондиционирования, многие исследователи обращают внимание на значительную роль АТФ-зависимых К+-каналов (К+АТФ-каналы) (O’Rourke B., 2000; Lin Y.F. et al., 2004; Raval A.P. et al., 2007). Реализацию их защитного потенциала связывают с гиперполяризацией мембраны вследствие их открытия, активацией системы оксида азота, антиапотатическими механизмами (Takashi E. et al., 1999; Hossmann K.A., 2006). Каналы этого типа располагаются на плазматической мембране нервных клеток, на внутренней мембране митохондрий, широко представлены в эндотелии и гладкомышечных клетках мозговых сосудов. Все их изоформы способны принимать участие в реализации защитного эффекта прекондиционирования. Однако в настоящее время большинство исследований направлено на изучение роли митохондриального пула К+АТФ-каналов (Horiguchi T. et al., 2003; Nakagawa I. et al., 2005; Миронова Г.Д. и др., 2007). В настоящем исследовании мы постарались ответить на вопрос, какова роль плазмалеммальных и митохондриальных К+АТФ-каналов в реализации защитных эффектов прекондиционирования. Целью настоящего исследования являлась оценка роли К+АТФ-каналов в реализации протекторного эффекта различных типов прекондиционирования на головной мозг крыс с моделью фокального ишемического инсульта. Для достижения цели решались следующие задачи: 1) оценка эффективности острой и отсроченной фаз нормобарического гипоксического, ишемического и дистантного прекондиционирования; 4 2) оценка уровня белка S100β как маркера ишемического повреждения в сыворотке крови животных, подвергавшихся и не подвергавшихся прекондиционированию, в острую стадию развития ишемического инсульта и на стадии сформированного глиального рубца; 3) оценка влияния К+АТФ-каналов на размер области поражения мозга, выживаемость нейронов в перифокальной зоне очага поражения и поведенческие реакции крыс; 4) сравнение эффективности неспецифического блокатора К+АТФ-каналов глибенкламида и ингибитора митохондриальной изоформы 5гидроксидеканоата. Научная новизна работы. В настоящей работе впервые дана сравнительная характеристика эффективности обеих фаз трех различных типов прекондиционирования на модели фокальной ишемии головного мозга. На этапе изучения роли К+АТФ-каналов в реализации защитного эффекта прекондиционирования проведена морфологическая оценка количества глиальных и нервных клеток в перифокальной области очага поражения, соответствующей зоне «ишемической полутени» на ранних этапах развития инсульта. Показано, что отмена прекондиционирования за счет блокады К+АТФканалов препятствует выживаемости нейронов, что впоследствии выражается в увеличении нейроглиального показателя на границе глиального рубца. Морфологические данные сопоставлены с размерами зоны некроза, формирующейся на начальной стадии ишемического процесса. Важно, что физиологические и морфологические исследования выполнены на одних и тех же животных, такой подход делает правомочным сравнение ранних и отставленных последствий ишемического инсульта. Практическая значимость работы. Ишемический инсульт – одна из тяжелейших форм сосудистых поражений мозга, занимающая одно из первых мест в структуре общей смертности населения и являющаяся лидирующей причиной инвалидизации. В связи с этим поиск способов коррекции инсульта представляется важным для фундаментальной и практической медицины. Прекондиционирование является одним из потенциальных терапевтических подходов к защите мозга в клинической неврологии у больных, подверженных гипертоническим кризам, эпилептическим припадкам, инфарктам миокарда, у входящих в группу риска новорожденных, а также при подготовке к различным операциям. Кроме того, понимание механизмов этого феномена может дать основу для создания фармакологических препаратов, предназначенных для предупреждения последствий ишемического поражения мозга. Основное положение, выносимое на защиту. Блокирование К+АТФ-каналов нивелирует протекторное действие отсроченной фазы нормобарического гипоксического и ишемического типов прекондиционирования на головной мозг крыс, увеличивая размер зоны инфаркта и нейроглиальный показатель на 5 границе глиального рубца, препятствуя выживанию нейронов в зоне «ишемической полутени». Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационной работы были представлены на Международной научно-практической конференции МГУ-СУНИ «Человечество и окружающая среда» (Москва, 2004); на IV Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005); на IV и V Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2005, 2007); на конгрессе «VIII World Congress of the International Society for Adaptive Medicine» (Москва, 2006); на Объединенном пленуме российского и московского научных обществ патофизиологов (Москва, 2006); на ХХ Съезде физиологического общества И.П. Павлова (Москва, 2007); на Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 90-летию член-корр. АМН СССР, профессора Н.Ю. Беленкова (Нижний Новгород, 2007); на IV Всероссийской школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, МГУ, 2008). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в ведущих рецензируемых журналах и 9 тезисов. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Список литературы включает источников. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводили на самцах белых беспородных крыс с массой тела 250-300 г. Животных содержали в стандартных условиях: 12-часовой световой режим, постоянная вентиляция, групповое содержание, неограниченный доступ к пище и воде, температура в помещении поддерживалась в пределах 20-22ºС. После транспортировки животные адаптировались к новым условиям не менее 7 дней. Протокол эксперимента по изучению влияния острой и отсроченной фаз прекондиционирования на размер очага поражения головного мозга Эксперимент был посвящен изучению защитного эффекта острой и отсроченной фаз различных типов прекондиционирования на размер очага поражения головного мозга крыс, перенесших окклюзию левой ветви средней мозговой артерии (ОСМА). Экспериментальные животные были разбиты на пять групп: 1. ОСМА – крысы, перенесшие окклюзию средней мозговой артерии. 6 2. НГП – проведение до ОСМА нормобарического гипоксического прекондиционирования. 3. ИП – проведение до ОСМА ишемического прекондиционирования. 4. ДП – проведение до ОСМА дистантного прекондиционирования. 5. ложнооперированный контроль для группы ДП. Операцию по необратимой ОСМА проводили через 1 час (острая фаза), 24 и 72 часа (отсроченная фаза) после прекондиционирования этими способами. Оценку размера области поражения левого полушария головного мозга осуществляли через 72 часа после моделирования инсульта при помощи окрашивания срезов мозга 2,3,5-трифенилтетразолий хлоридом (Horiguchi T. et al., 2003). В программе Auc7 планиметрически измеряли размер инфаркта, оценивали процентное отношение суммы площадей поражённой ткани к сумме общей площади коры левого полушария мозга. Протокол эксперимента по измерению нейроспецифического белка S100β в сыворотке крови крыс Эксперимент был посвящен оценке концентрации маркера нейродегенеративных процессов белка S100β у крыс, подвергавшихся фокальному ишемическому инсульту и разным типам прекондиционирования. Животные были распределены в 4 группы: 1. К – контроль, представленный интактными животными. 2. ОСМА – крысы, перенесшие окклюзию средней мозговой артерии. 3. НГП – проведение за сутки до ОСМА нормобарического гипоксического прекондиционирования. 4. ИП – проведение за сутки до ОСМА ишемического прекондиционирования. Концентрацию белка S100β измеряли методом твердофазного неконкурентного иммуноферментного анализа специфичного к двум различным эпитопам на молекуле белка при помощи стандартного тестового набора CanAg S100 EIA (США) через 72 часа и на 40 сутки после моделирования инсульта в сыворотке, полученной из крови, взятой из яремной вены. Протокол эксперимента по изучению роли К+АТФ-каналов в процессе прекондиционирования Основной эксперимент был разбит на две серии, в каждой из которых исследовали один тип прекондиционирования: нормобарическое гипоксическое прекондиционирование (НГП) или ишемическое прекондиционирование (ИП). Через 24 часа после проведения прекондиционирования моделировали фокальную ишемию головного мозга. Через 72 часа после инсульта анализировали размер сформированной зоны некроза методом магниторезонансной томографии (МРТ). На 7 сутки после ОСМА тестировали крыс для оценки поведенческих реакций. На 21 сутки после фокальной ишемии животных декапитировали для проведения морфологического исследования. На 7 границе образовавшегося глиального рубца, или в перифокальной зоне очага поражения, оценивали нейроглиальный показатель. Для изучения роли К+АТФ-каналов в процессе прекондиционирования использовали внутрибрюшинное введение их неселективного блокатора глибенкламида (Glib, glibenclamide, Sigma) и ингибитора митохондриальной изоформы 5-гидроксидеканоата (5-HD, Sigma). Животные были распределены в 5 групп: 1. ОСМА – крысы, перенесшие окклюзию средней мозговой артерии. 2. НГП или ИП – проведение нормобарического гипоксического или ишемического прекондиционирования за сутки до ОСМА соответственно. 3. НГП+5-HD или ИП+5-HD – внутрибрюшинная инъекция 5- HD в дозе 40 мг/кг (растворитель 0,9% NaCl) за полчаса до НГП или ИП. 4. НГП+Glib или ИП+Glib – внутрибрюшинная инъекция Glib в дозе 20 мг/кг (растворитель диметилсульфоксид (DMSO)) за полчаса до НГП или ИП. 5. НГП+инсулин или ИП+инсулин – контрольные группы, которые ввели из-за способности Glib снижать в крови концентрацию глюкозы посредством увеличения выброса инсулина. В этих группах животным за 4 часа до НГП или ИП внутрибрюшинно вводили смесь препаратов инсулина (500МЕ/70кг, 10МЕ/мл 0,9% NaCl). Доза была подобрана экспериментально так, что уровень глюкозы в крови крыс этих групп был сравним с соответствующими группами НГП+Glib и ИП+Glib в период прекондиционирования. В объем смеси, вычисленный по весу животного, входили 1/3 разведенного препарата инсулина короткого действия (“Инсуран Р”, производство ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова) и 2/3 разведенного препарата длинного действия (“Протафан НМ”, “НовоНордиск”). Протокол эксперимента по изучению влияния глибенкламида на параметры работы сердечно-сосудистой системы В связи со свойством вводимого внутрибрюшинно Glib блокировать К+АТФканалы клеток различных органов, возникла необходимость предварительно оценить его влияние на системные параметры, в частности, на функционирование сердечно-сосудистой системы крыс. В опыте участвовало 2 группы животных: 1. DMSO – контрольные крысы, которым по весу внутрибрюшинно вводили растворитель глибенкламида диметилсульфоксид. 2. Glib – животные, которым внутрибрюшинно вводили глибенкламид из расчета 20 мг/кг. Через имплантированный в брюшную аорту катетер крыс подключали к установке для регистрации гемодинамических параметров. Животные адаптировались в течение часа, затем еще час проводили запись исходных значений среднего артериального давления (АДср.) и частоты сердечных сокращений (ЧСС). Внутрибрюшинно вводили Glib или DMSO и осуществляли запись в режиме суточного мониторинга. На следующие сутки регистрировали АДср. и ЧСС в течение часа. 8 Методы, использованные в эксперименте Модели нормобарического гипоксического, ишемического и дистантного прекондиционирования Гипоксическое прекондиционирование проводили в режиме интервальной нормобарической тренировки. Животных строго индивидуально помещали в проточную камеру, в которую с помощью гипоксикатора «Эверест-01» подавали газовую смесь с 10% содержанием кислорода. Предъявляли 4 эпизода экзогенной гипоксии по 10 минут с 5-минутными интервалами. Ишемическое прекондиционирование головного мозга осуществляли путем попеременной окклюзии правой и левой общих сонных артерий на 5 минут с 5-минутной реперфузией. В течение 50 минут проводили 10 эпизодов ишемии, по 5 с каждой стороны. Для этого животным под общей анестезией (хлоралгидрат (ХЛГ), 400 мг/кг внутрибрюшинно) отпрепаровывали сонные артерии и подводили под них стеклянные крючки так, чтобы происходило прекращение кровотока. Дистантное прекондиционирование создавали при помощи 5-минутной окклюзии брыжеечной артерии с последующей 5-минутной реперфузией. Животных наркотизировали (ХЛГ, 400 мг/кг), под отпрепарованную брыжеечную артерию подводили стеклянный крючок до прекращения кровотока. Таким образом осуществляли 5 эпизодов ишемии. Поскольку операция полостная, для этих крыс был необходим дополнительный ложнооперированный контроль, представленный животными, находившимися в покое в течение 40 минут после препаровки брыжеечной артерии. Модель локального ишемического инсульта Для моделирования ишемии головного мозга использовали модификацию методики, разработанной Chen et al. в 1986 году. Ишемическое повреждение создавали необратимой окклюзией левой ветви средней мозговой артерии (СМА) и подходящей к ней вены с одновременной перевязкой ипсилатеральной сонной артерии для стабилизации размера области поражения. Животных наркотизировали (ХЛГ, 400 мг/кг), под левую сонную артерию подводили лигатуру. Трепанацию осуществляли на латеральной стороне лобной кости с левой стороны в зоне расположения центрального ствола средней мозговой артерии. Под бинокулярной лупой Olympus при помощи электрокоагуляции прибором «Фотек Е-80» проводили необратимую окклюзию левой ветви средней мозговой артерии проксимальнее места ее бифуркации на фронтальную и париетальную ветви, а также рядом расположенной мозговой вены до ее пересечения с артерией. Сразу после коагуляции перевязывали лигатуру, на которой находилась сонная артерия. Оценка размера зоны инфаркта методом магниторезонансной томографии (МРТ) Размер зоны инфаркта оценивали у наркотизированных (ХЛГ, 400 мг/кг) животных методом ЯМР (спектрометр BioSpec 70/30 USR (Bruker)) с напряженностью магнитного поля 7 Тесла, что соответствует резонансной частоте протонов 300 МГц. МРТ позволяет отследить изменения активности 9 отдельных областей мозга (в основном по изменению интенсивности кровоснабжения) непосредственно в ходе опыта. Для получения изображения использовали два режима. Тripilot основан на быстром томографическом методе градиентного эха FLASH и предназначен для быстрого измерения объекта и получения изображения, которое служит в качестве ориентира при установке геометрических параметров срезов последующих измерений. Основное изображение получали в режиме, основанном на томографическом быстром методе спинового эха RARE (период повторения сканов (TR) = 2113,5 мс, эффективное время эха (Eff.TE) = 50,0 мс). В результате измерения с мозга крысы получали 14 срезов толщиной 1,5 мм с периодичностью 2 мм. Область поражения рассчитывали планиметрически в программе ImageJ. Оценивали процентное отношение суммы площадей поражённой ткани к сумме общей площади коры левого полушария мозга. Морфологический метод оценки нейроглиального показателя в перифокальной зоне очага поражения На этапе проведения морфологического исследования по оценке нейроглиального показателя в перифокальной области очага поражения (граница глиального рубца), характеризующего количество нейроглиальных клеток, приходящихся на один нейрон, в эксперимент была введена группа интактных животных. Животных декапитировали под легким эфирным наркозом. Скальпелем головной мозг делили на 4 части, вычленяя область, содержащую визуально определяемый глиальный рубец. Полученные фрагменты в течение 2,5 часов фиксировали в смеси Карнуа. При помощи аппарата-лаборанта АТ-4 осуществляли стандартную проводку для подготовки к заливке в парафин. С парафинового блока, содержащего нужный участок мозга с глиальным рубцом, на микротоме Leica получали срезы толщиной 7 мкм. Срезы окрашивали по методу Ниссля 0,1% раствором крезилового фиолетового в дистиллированной воде (Буреш Я. и др., 1991). Нейроглиальный показатель оценивали в перифокальной зоне очага поражения в области пятого слоя коры головного мозга под световым микроскопом Leica при увеличении 40× в одинаковых по размеру (0,087 мм2) полях зрения для каждой группы животных. Выбор полей зрения осуществлялся визуально на границе глиального рубца. Каждая группа состояла из 3 животных, количество клеток оценивали на 12-18 срезах мозга, на одном срезе выбирали 1-2 поля зрения (всего 54 поля зрения в каждой группе). Подсчет нейронов и нейроглиальных клеток в исследуемых полях зрения осуществляли при помощи программы Qwin. Измерение концентрации глюкозы в крови экспериментальных животных Уровень глюкозы измеряли в цельной крови, взятой шприцем из яремной вены крыс, участвовавших в исследовании. Для определения концентрации использовали глюкометр One Touch® Basic® и тестовые полоски к этому прибору (Life Scan, Johnson & Johnson, США). 10 Метод регистрации и расчета гемодинамических параметров сердечнососудистой системы крыс Регистрацию гемодинамических параметров осуществляли кровавым способом. Для этого наркотизированным (ХЛГ, 400 мг/кг) животным в брюшную аорту через левую бедренную артерию имплантировали катетер РЕ10, посредством которого на следующие сутки их подсоединяли к датчику давления. Сигнал, поступающий от датчика, оцифровывался с частотой 1000 Гц. Оцифровку, запись и обработку сигнала осуществляли с помощью многоканальной системы для регистрации артериального давления у крыс TAM-A и программного обеспечения Haemodyn (Hugo Sachs Elektronik), которое позволяет on-line рассчитывать с кривой системного артериального давления среднее АДср. и ЧСС. Оценка поведенческой активности крыс Для изучения поведенческих реакций экспериментальных животных проводили тестирование в «Приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ)» и «Открытом поле (ОП)». Регистрировали стандартные параметры, оцениваемые в этих тестах (Граф А.В., 2005). Статистическая обработка данных Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи пакетов программ «Excel» и «SPSS 13.0» для Windows. Данные представлены на гистограммах и в таблицах в виде средних значений + стандартное отклонение (SD), n – объем выборки. При сравнении характеристик массивов данных применяли тест One-Way ANOVA с последующим попарным сравнением тестом Duncan’а и непараметрический критерий Mann-Whitney (U-критерий) для независимых выборок с поправкой на множественность сравнений. Различия признавались значимыми при допустимой вероятности ошибки < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние острой и отсроченной фаз различных типов прекондиционирования на размер инфаркта коры левого полушария Анализ размера области инфаркта на окрашенных ТТХ срезах мозга проводили через 72 часа после моделирования локального ишемического инсульта, т.к. на этот момент уже полностью сформирована зона некроза. У крыс из группы ОСМА ко времени проведения оценки область поражения составила в среднем 20,8+10,0% от общего объема коры левого полушария. Это сравнимо с данными других авторов, изучавших сходную модель ишемии головного мозга (Barone F.C. et al., 1998; Wilson B.C. et al., 2006). Место ОСМА было выбрано таким образом, чтобы поражение локализовалось в сенсомоторной области коры головного мозга, не затрагивая подкорковые структуры, что позволяет избежать влияния на эффекты прекондиционирования нарушений регуляции вегетативных функций организма: терморегуляции, регуляции артериального давления, дыхания и т.п. 11 Обнаружено, что из использованных нами типов прекондиционирования наиболее выраженным защитным эффектом обладает ишемический тип (табл.1). Ишемия-реперфузия сонных артерий привела к уменьшению размера области некроза в 3,7; 3,8 и 3,7 раза по сравнению с группой ОСМА, будучи проведенной за 1, 24 и 72 часа до моделирования инсульта соответственно (табл.1). Также протекторное действие оказала выполненная за 24 часа до инсульта нормобарическая гипоксия. Под ее влиянием размер инфаркта снизился в 2,2 раза по сравнению с крысами из группы ОСМА (табл.1). В случае, когда ишемию моделировали через 1 или 72 часа после НГП, зона поражения между этими двумя группами не отличалась. Для осуществления дистантного прекондиционирования использовали модель, которая успешно зарекомендовала себя в работах на сердце (Wolfrum S. et al., 2002). Однако ее применение перед моделированием инсульта не оказало протекторного эффекта на мозг ни в один из исследуемых временных промежутков. Размер области поражения в группе ДП не отличался от такового у ложнооперированных крыс, служащих контролем (табл.1). Таблица 1. Размер инфаркта в зависимости от длительности интервала между окончанием прекондиционирования и моделированием инсульта, выраженный в процентах от общего объема коры ипсилатерального полушария. ОСМА – окклюзия средней мозговой артерии, НГП – нормобарическое гипоксическое прекондиционирование, ИП – ишемическое прекондиционирование, ДП – дистантное прекондиционирование, ДП (л/о) – ложнооперированный контроль к группе ДП. Группа 1 час 24 часа 72 часа ОСМА (n=14) 17,3 + 9,2 17,3 + 9,2 27,2 + 8,9 НГП (n=19) 10,5 + 7,1 7,8 + 3,7 * 21,0 + 9,8 ИП (n=19) 4,7 + 1,9 ** 4,5 + 1,1 ** 7,4 + 3,6 * ДП (n=19) 22,4 + 6,4 11,4 + 5,6 14,4 + 4,1 ДП (л/о) (n=18) 17,3 + 10,4 13,0 + 6,3 16,2 + 6,2 * - p<0,05, ** - p<0,01 отличие от ОСМА. Опираясь на полученный результат, для дальнейших исследований выбрали нормобарический гипоксический и ишемический типы прекондиционирования, проводимые за 24 часа до моделирования фокального инсульта. Изменение концентрации нейроспецифического белка S100β в сыворотке крови экспериментальных животных Формирование очага инфаркта в мозге сопровождается, в том числе, увеличением в крови концентрации синтезируемого астроцитами белка S100β, принадлежащего к группе кислых кальций-связывающих нейроспецифических белков S100 и являющегося одним из маркеров нейродегенеративных процессов, в частности ишемического повреждения (Lynch J.R. et al., 2004). 12 Выбор третьих суток для первого измерения обусловлен, как уже отмечалось выше, полным формированием к этому моменту зоны некроза. Кроме того, при ишемическом характере инсульта уровень основной фракции белков S100 достигает максимума именно на третьи сутки (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). Второе измерение проводили на позднем сроке, когда полностью завершены воспалительные процессы и сформирован глиальный рубец, образующийся в результате деления астроцитов, окружающих зону ишемии (Yasuda Y. et al., 2004). Уровень белка S100β в сыворотке крови интактных животных составил 102,5+71,4 нг/л (n=4) и не превышал значений, упоминаемых в литературных данных (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). Моделирование фокального инсульта (n=6) через трое суток привело к значимому восьмикратному увеличению концентрации S100β. К сороковому дню после операции уровень белка в этой группе животных (n=4) полностью нормализовался (рис.1), что подтверждает окончание процесса клеточной деградации к этому сроку. † нг/л 1200 1000 3 сутки 40 сутки 800 600 400 # 200 0 К НГП ОСМА ИП Рисунок 1. Концентрация белка S100β в сыворотке крови крыс через 72 часа и на 40 сутки после моделирования инсульта. К – интактный контроль, ОСМА – окклюзия средней мозговой артерии, НГП – нормобарическое гипоксическое прекондиционирование, ИП – ишемическое прекондиционирование. † - p<0,05 отличие от К, # - p<0,05 отличие между 3 и 40 сутками внутри группы ОСМА. Предварительное воздействие нормобарического гипоксического (n=6) или ишемического (n=6) типов прекондиционирования не привело к значимому снижению концентрации S100β на третьи сутки после инсульта в сыворотке крови по сравнению с группой ОСМА (рис.1), несмотря на то, что под их воздействием происходит значимое уменьшение зоны поражения мозга (табл.1). Однако значения уровня белка в этих группах не отличались и от результата, полученного у интактных крыс (рис.1). Кроме того, к сороковым суткам у крыс, перенесших НГП (n=4) и ИП (n=4), изменений концентрации по сравнению с третьими сутками также не наблюдали (рис.1). Такой результат может объясняться значительной вариабельностью исследуемого параметра 13 внутри групп животных. При обращении к литературным данным видно, что это предположение не лишено оснований, т.к. индивидуальные различия концентраций S100β достаточно велики (Park E.S. et al., 2004; Kim J.Y. et al., 2002). Полученный результат еще раз подтвердил, что белок S100β может выступать в качестве биохимического маркера повреждения ткани мозга. В то же время не удалось выявить взаимосвязь между его концентрацией в плазме крови и размером зоны инфаркта на третьи сутки после фокальной ишемии при использовании выбранных моделей прекондиционирования и инсульта. Однако, наблюдая тенденцию к уменьшению уровня белка S100β у крыс из групп НГП и ИП по сравнению с группой ОСМА, учитывая отсутствие отличий этих групп от интактного контроля и вариабельность параметра, можно предположить, что увеличение объема выборки способно в дальнейшем внести ясность в исследуемый вопрос. Влияние глибенкламида на гемодинамические параметры работы сердечно-сосудистой системы крыс Эксперимент по оценке гемодинамических параметров работы сердечнососудистой системы животных осуществлялся в режиме суточного мониторинга. Для представления результата выбраны 3 основные временные точки (табл.2). Это связано с требованиями протокола основного эксперимента, в котором неспецифический блокатор К+АТФ-каналов глибенкламид вводили за полчаса до начала прекондиционирования, а через сутки моделировали фокальную ишемию мозга. Таблица 2. Влияние внутрибрюшинного введения блокатора К+АТФ-каналов глибенкламида (Glib, 20 мг/кг) на гемодинамические параметры работы сердечно-сосудистой системы крыс. DMSO – диметилсульфоксид, растворитель Glib. АДср. (мм рт.ст.) ЧСС (уд./мин) Группа крыс исходный уровень DMSO (n=6) 105,3+ Glib (n=7) 10,0 105,0+6,2 30мин после введения веществ сутки после введения веществ 102,4+9,0 105,4+9,3 105,2+7,1 105,4+7,3 400,7+ 30мин после введения веществ 431,0+ сутки после введения веществ 436,9+ 64,1 51,3 62,5 444,8+ 424,4+ 457,9+ 87,2 88,9 66,8 исходный уровень Полученный результат показал, что несмотря на ингибирование Glib К+АТФканалов цитоплазматической мембраны клеток многих органов, он не оказывает системного влияния на величину АДср. и ЧСС через 30 минут и 14 сутки после внутрибрюшинного введения по сравнению с исходным уровнем этих параметров. Не выявлено отличий от группы крыс, которым вводили растворитель Glib – DMSO (табл.2). Такой результат избавил от необходимости вводить дополнительную контрольную группу животных или регулировать гемодинамические параметры в группе крыс с внутрибрюшинным введением Glib, т.к. в противном случае выход АДср. и ЧСС за пределы нормальных значений мог бы привести к изменению результатов, полученных при проведении прекондиционирования. Изменение концентрации глюкозы в крови экспериментальных животных Поскольку глюкоза является основным энергетическим субстратом мозга и осмотически активным веществом, то было необходимо контролировать изменение ее концентрации под действием Glib, который способствует выбросу инсулина, блокируя К+АТФ-каналы на плазматической мембране β-клеток поджелудочной железы. Измерение содержания глюкозы показало, что у крыс, которым внутрибрюшинно вводили Glib, исследуемый параметр через полчаса значимо уменьшился примерно в 1,5 – 2 раза по сравнению с исходным уровнем (табл.3). ИП НГП Таблица 3. Динамика изменения концентрации глюкозы (ммоль/л) в крови крыс до и после введения блокаторов К+АТФ-каналов 5-гидроксидеканоата (5-HD, 40 мг/кг) и глибенкламида (Glib, 20 мг/кг) или инсулина. ОСМА – окклюзия средней мозговой артерии, НГП – нормобарическое гипоксическое прекондиционирование, ИП – ишемическое прекондиционирование. 30мин после сутки после исходный серия группа введения введения уровень веществ веществ ОСМА (n=8) 3,9 + 0,7 3,3 + 0,6 * # 4,7 + 1,2 НГП (n=9) 4,5 + 1,1 3,5 + 1,2 * # 4,6 + 1,2 5-HD (n=8) 4,3 + 1,1 3,5 + 0,6 * # 4,9 + 1,4 3,7 + 0,7 * Glib (n=8) 4,4 + 1,4 * 2,2 + 0,5 4,0 + 0,9 # инсулин(n=7) 4,2 + 0,8 # 1,6 + 0,7 ОСМА(n=10) 3,6 + 0,6 4,0 + 0,6 * # 5,0 + 1,1 ИП (n=9) 3,3 + 0,8 3,8 + 0,9 * # 5,0 + 1,5 5-HD (n=11) 3,3 + 0,4 3,7 + 0,7 * # 4,7 + 0,8 4,2 + 1,8 * Glib (n=11) 3,5 + 0,6 * 2,8 + 0,6 4,4 + 0,7 # инсулин(n=7) 3,3 + 0,3 # 1,7 + 0,9 * - p<0,05 отличие от групп животных, которым за полчаса до НГП или ИП вводили Glib (выделены жирным шрифтом). # - p<0,05 отличие от групп животных, которым за 4 часа до НГП или ИП вводили инсулин (выделены жирным шрифтом). 15 Таким образом, эти животные подвергались нормобарическому гипоксическому или ишемическому прекондиционированию на фоне пониженной концентрации глюкозы в крови. По этой причине в эксперимент была введена контрольная группа крыс, содержание глюкозы в крови которых понижали при помощи внутрибрюшинной инъекции инсулина. Его введение через 4 часа приводило к стойкому уменьшению концентрации глюкозы в 2 – 2,5 раза по сравнению с исходным уровнем (табл.3). В остальных группах, в том числе и у крыс, которым вводили блокатор митохондриальных К+АТФканалов 5- HD, уровень глюкозы значимо не изменялся. Через сутки в крови животных, принадлежащих группам с инъекциями Glib или инсулина, произошло восстановление концентрации глюкозы до исходных значений (табл.3). В остальных группах изменений по сравнению с результатами предыдущих измерений не наблюдали. Это обеспечило одинаковые условия при проведении операции по необратимой ОСМА во всех экспериментальных группах. Описание результатов тестов по оценке поведения в сериях с изучением роли К+АТФ-каналов в процессе нормобарического гипоксического и ишемического прекондиционирования Тесты по оценке поведения проводили на 7 сутки после моделирования фокальной ишемии, т.к. это один из значимых этапов в ходе патологического процесса развития инсульта, характеризующийся началом астроглиальной пролиферации, достижением необратимого уровня гемореологических нарушений, максимально выраженной инфильтрацией макрофагами зоны ишемии и др. (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). Результаты, полученные в тестах «ПКЛ» и «ОП», описаны до представления данных по оценке области поражения, поскольку в обеих сериях эксперимента с использованием разных типов прекондиционирования в них не было выявлено физиологически значимых изменений регистрируемых параметров между экспериментальными группами животных. Так, ни само прекондиционирование, ни отмена его эффектов блокаторами К+АТФ-каналов (см. ниже) не влияли на двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность и уровень тревожности, регистрируемые в этих тестах. Это может быть объяснено тем, что компенсаторные возможности мозга крысы чрезвычайно велики. Известно, что различные зоны, сходные морфологически, могут брать на себя функции вышедших из строя областей. В нашем случае поражение локализовалось в передней теменной области коры, чьи функции способна выполнять задняя лобная область и некоторые другие отделы мозга (Светухина В.М., 1962). Для выявления физиологической значимости защитного эффекта прекондиционирования необходим дальнейший подбор поведенческих тестов и сроков их проведения, способных выявить имеющие смысл отличия, воспроизводимые от эксперимента к эксперименту. 16 Серия I: Результаты, полученные в опытах с использованием нормобарического гипоксического прекондиционирования Оценка размера области поражения коры левого полушария мозга Размер области инфаркта, оцениваемый на изображениях, полученных методом МРТ (рис.2), у крыс из группы ОСМА (n=8) составил 18,8+3,3% от общего объема коры левого полушария (рис.3), что соответствует полученным ранее результатам (табл.1). А Б зона некроза зона некроза Рисунок 2. Различия размера очага поражения в группах ОСМА (А) и НГП (Б). Воздействие интервальной нормобарической гипоксии за 24 часа до моделирования инсульта значимо уменьшило размер зоны некроза коры головного мозга до 7,9+1,0% (n=9) по сравнению с крысами из группы ОСМА (рис.3), что еще раз подтверждает защитный эффект НГП на головной мозг, подвергшийся ишемии. Внутрибрюшинная инъекция блокаторов К+АТФ-каналов 5-HD или Glib полностью отменила протекторный эффект нормобарического гипоксического прекондиционирования на размер области поражения, что подтверждает участие каналов этого типа в реализации защитного эффекта отсроченной фазы прекондиционирования. Зона некроза в группах НГП+5-HD (n=8) или НГП+Glib (n=8) составила в среднем 17,8+2,4% и 20,5+3,9% соответственно и не отличалась от значений, полученных в группе ОСМА (рис.3). У животных из группы НГП+инсулин (n=7) область инфаркта составила 15,8+2,9% от общего объема коры левого полушария (рис.3) и не отличалась по размеру от групп ОСМА и НГП. Такой результат дает возможность предположить, что снижение в крови животных концентрации глюкозы за счет инсулина не играет существенной роли в отмене защитного эффекта прекондиционирования, хотя и может оказывать влияние на его процесс (см. ниже). 17 % 25 ** ** ** 20 15 10 5 0 ОСМА НГП НГП+5-HD НГП+Glib НГП+инсулин Рисунок 3. Область поражения коры головного мозга, выраженная в процентах от общего объема коры ипсилатерального полушария. ОСМА – окклюзия средней мозговой артерии, НГП – нормобарическое гипоксическое прекондиционирование, 5HD – 5-гидроксидеканоат, Glib – глибенкламид. ** - p<0,01 отличие от НГП. Оценка нейроглиального показателя в перифокальной области очага поражения левого полушария мозга Количество нейронов и нейроглиальных клеток подсчитывали в области пятого слоя коры, содержащего крупные пирамидные нейроны, в перифокальной зоне очага поражения, которая располагается на границе глиального рубца и соответствует зоне «ишемической полутени», которая во время формирования инфаркта испытывает недостаток кровоснабжения, однако патологические процессы развиваются в ней медленнее, чем в ядре ишемии. Современные терапевтические подходы направлены на сохранение жизнеспособности клеток именно в этой зоне (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). Материал для проведения морфологического исследования был взят на 21 сутки после ОСМА, поскольку формирование глиального рубца к этому времени уже полностью завершено. Для анализа был выбран нейроглиальный показатель, т.к. нейроглиальным отношениям придается большое значение в функциональной активности мозга (Худоерков Р.М. и др., 2007) и этот параметр является морфологическим признаком физиологических и патологических изменений в ЦНС (Блинков С.М., Глезер И.И., 1964). У интактных животных нейроглиальный показатель в области пятого слоя коры составил 0,9+0,08 глиальных клеток на один нейрон (рис.4). Моделирование фокального инсульта привело к тому, что через 21 сутки после ОСМА нейроглиальный показатель в перифокальной зоне очага поражения вырос в среднем до 1,8+0,3 глиальных клеток на нейрон (рис.4). Предварительное воздействие нормобарического гипоксического 18 прекондиционирования снизило значение этого параметра по сравнению с группой ОСМА до 1,2+0,2 (рис.4) глиальные клетки на один нейрон, однако восстановления до значения, полученного у интактных крыс, не произошло. Использование блокаторов К+АТФ-каналов 5-HD и Glib, а также инсулина нивелировало эффект нормобарической гипоксии на этот показатель. У животных из групп НГП+5-HD, НГП+Glib или НГП+инсулин нейроглиальный показатель значимо возрос по сравнению с группой НГП и соответственно равен 1,5+0,2, 1,7+0,3 и 1,6+0,2 глиальные клетки на один нейрон (рис.4). Кроме того, у крыс из группы с инъекцией инсулина снижение нейроглиального соотношения по сравнению с группой ОСМА также оказалось значимым, что свидетельствует о частичной отмене действия прекондиционирования и наряду с отсутствием изменения размера области некроза подтверждает предположение об умеренном влиянии полученного снижения концентрации глюкозы на процесс прекондиционирования. количество глиальных клеток на нейрон 3 †† 2,5 ** 2 ** ** # ** †† 1,5 1 0,5 0 К ОСМА НГП НГП+5-HD НГП+Glib НГП+инсулин Рисунок 4. Нейроглиальный показатель в перифокальной зоне очага поражения в области пятого слоя коры головного мозга (размер поля зрения 0,087 мм2, увеличение 40×). К – интактный контроль, ОСМА – окклюзия средней мозговой артерии, НГП – нормобарическое гипоксическое прекондиционирование, 5-HD – 5-гидроксидеканоат, Glib – глибенкламид. ** - p<0,01 отличие от НГП, # - p<0,05 отличие от ОСМА, †† - p<0,01 отличие от К. На рисунке 5 видно, что двукратное увеличение нейроглиального показателя в результате моделирования инсульта в сравнении с интактным контролем связано с меньшим количеством нейронов в перифокальной зоне очага поражения и большим количеством глиальных клеток. Такой результат вполне ожидаем, если учесть, что на месте очага ишемии образуется глиальный рубец, формирующийся астроцитами. Эти клетки выполняют опорную функцию, заполняя пустоты, образовавшиеся в результате гибели нейронов, 19 количество клеток в поле зрения деление которых невозможно. При этом тенденция к восстановлению нейроглиального показателя до значений, характерных для интактных крыс, в результате проведения нормобарической гипоксии связана с большей сохранностью нейронов в перифокальной зоне очага поражения, но не с изменением количества нейроглии по сравнению с группой ОСМА (рис.5). Блокирование К+АТФ-каналов при помощи 5-HD и Glib и введение инсулина привели к значимому уменьшению количества нейронов в исследуемых полях зрения по сравнению с крысами, перенесшими НГП, отменяя влияние прекондиционирования на сохранность нервных клеток. В то же время отличий между этими группами по количеству нейроглии на границе рубца выявлено не было (рис.5). 120 † 100 80 ** ** ** †† ** 60 40 20 0 нейроглия К ОСМА НГП нейроны НГП+5-HD НГП+Glib НГП+инсулин Рисунок 5. Количество клеток глии и нейронов в перифокальной зоне очага поражения в области пятого слоя коры головного мозга (размер поля зрения 0,087 мм2, увеличение 40×). К – интактный контроль, ОСМА – окклюзия средней мозговой артерии, НГП – нормобарическое гипоксическое прекондиционирование, 5-HD – 5гидроксидеканоат, Glib – глибенкламид. ** - p<0,01 отличие от НГП, † - p<0,05, †† - p<0,01 отличие от К. Серия II: Результаты, полученные в опытах с использованием ишемического прекондиционирования Оценка размера области поражения коры левого полушария мозга Во второй серии изучали роль К+АТФ-каналов в защитном эффекте ишемического прекондиционирования. Размер зоны некроза коры головного мозга в группе ОСМА (n=10) составил 15,0+2,4% от общего объема коры левого полушария (рис.6). Кратковременная попеременная окклюзия сонных артерий за 24 часа до моделирования фокальной ишемии значимо снизила значение этого параметра до 8,2+3,9% (n=9) по сравнению с группой ОСМА 20 (рис.6), что соответствует полученным ранее данным о протекторном эффекте отсроченной фазы этого типа прекондиционирования (табл.1). % 25 20 ** ** 15 ** *# ИП+Glib И П+инсулин 10 5 0 ОСМА ИП ИП+5-HD Рисунок 6. Область поражения коры головного мозга, выраженная в процентах от общего объема коры ипсилатерального полушария. ОСМА – окклюзия средней мозговой артерии, ИП – ишемическое прекондиционирование, 5-HD – 5гидроксидеканоат, Glib – глибенкламид. * - p<0,05, ** - p<0,01 отличие от ИП, # - p<0,05 отличие от ОСМА. Как и в предыдущей серии, защитное действие ишемии-реперфузии сонных артерий на головной мозг перенесших инсульт крыс было нивелировано блокадой К+АТФ-каналов посредством введения 5-HD или Glib. Область поражения в группах ИП+5-HD (n=11) и ИП+Glib (n=11) составила 15,7+4,0% и 13,1+2,5% соответственно (рис.6). От результата, полученного в группе ОСМА, эти показатели не отличались. В группе ИП+инсулин сформировалась зона инфаркта размером 12,0+3,2% (n=7). В отличие от первой серии, где не выявили отличий группы НГП+инсулин от остальных групп, в данном случае полученное значение размера области поражения значимо выше, чем в группе ИП, и меньше, чем у крыс из группы ОСМА (рис.6). Это вновь указывает лишь на частичную отмену защитного эффекта прекондиционирования и поддерживает наше мнение, что уменьшение концентрации глюкозы в той степени, в которой ее снижает использованная доза инсулина и, вероятно, глибенкламид, играет не столь существенную роль в феномене прекондиционирования. Оценка нейроглиального показателя в перифокальной области очага поражения левого полушария мозга Морфологические изменения, наблюдаемые на границе сформированного к 21 суткам после инсульта глиального рубца, в этой серии эксперимента имеют ту же направленность, что и в предыдущей. Нейроглиальный показатель 21 количество глиальных клеток на нейрон в области пятого слоя коры в группе интактных животных составил 0,9+0,08 глиальных клеток на один нейрон (рис.7). Фокальная ишемия привела к его значимому увеличению до 1,8+0,3 глиальных клеток на нейрон (рис.7). Предварительная ишемия-реперфузия сонных артерий уменьшила нейроглиальное соотношение по сравнению с группой ОСМА до 1,4+0,3 глиальные клетки на один нейрон (рис.7). Однако, как и в первой серии, это больше, чем в группе интактных животных. Использование блокаторов К+АТФканалов привело к увеличению нейроглиального показателя в группах ИП+5HD и ИП+Glib по сравнению с группой ИП до 1,8+0,3 и 2,3+0,5 глиальные клетки на один нейрон соответственно (рис.7). Инъекция инсулина также повысила этот параметр по сравнению с группой ИП до 1,6+0,2 глиальные клетки на нейрон, но снизила его по сравнению с крысами из группы ОСМА (рис.7). ** 3 †† 2,5 ** 2 # ** ** †† 1,5 1 0,5 0 К ОСМА ИП ИП+5-HD ИП+Glib И П+инсулин Рисунок 7. Нейроглиальный показатель в перифокальной зоне очага поражения в области пятого слоя коры головного мозга (размер поля зрения 0,087 мм2, увеличение 40×). К – интактный контроль, ОСМА – окклюзия средней мозговой артерии, ИП – ишемическое прекондиционирование, 5-HD – 5-гидроксидеканоат, Glib – глибенкламид. ** - p<0,01 отличие от ИП, # - p<0,05 отличие от ОСМА, †† - p<0,01 отличие от К. Наблюдаемые изменения в значениях нейроглиального показателя объясняются теми же причинами, что и в серии с использованием в качестве прекондиционирования нормобарической гипоксии. На рисунке 8 наглядно показано наличие большего количества нейронов в перифокальной зоне очага поражения в группе ИП по сравнению с остальными четырьмя экспериментальными группами. При этом число нейроглиальных клеток, сформировавших глиальный рубец, одинаково. Это объясняет, почему в группе ИП, как и в группе НГП, не происходит восстановления нейроглиального показателя до значения, полученного у интактных животных. Впрочем, полного 22 восстановления этого параметра в группах крыс, подвергавшихся тому или иному типу прекондиционирования, ожидать было нельзя, поскольку животные из этих групп также испытывали недостаток кровоснабжения мозга при моделировании инсульта. количество клеток в поле зрения Влияние блокирования К+АТФ-каналов и уменьшения концентрации глюкозы в крови на значение нейроглиального показателя и сохранность нейронов в перифокальной зоне очага поражения аналогично тому, что наблюдали в первой серии эксперимента. В группах ИП+5-HD, ИП+Glib и ИП+инсулин нейроглиальный показатель (рис.7) увеличился по сравнению с группой ИП за счет снижения количества нейронов на границе глиального рубца (рис.8). Но при этом, как было описано выше, в группе ИП+инсулин нейроглиальное соотношение было уменьшено по сравнению с группой ОСМА (рис.7). Ситуация такая же, которую наблюдали при оценке размера области поражения. Следовательно, мы еще раз убедились, что уровень глюкозы хотя и влияет на процесс прекондиционирования, но не отменяет в полной мере его защитный эффект, как блокада К+АТФ-каналов. 120 † 100 80 †† ** ** ** ** 60 40 20 0 нейроглия К ОСМА ИП нейроны ИП+5-HD ИП+Glib ИП+инсулин Рисунок 8. Количество клеток глии и нейронов в перифокальной зоне очага поражения в области пятого слоя коры головного мозга (размер поля зрения 0,087 мм2, увеличение 40×). К – интактный контроль, ОСМА – окклюзия средней мозговой артерии, ИП – ишемическое прекондиционирование, 5-HD – 5-гидроксидеканоат, Glib – глибенкламид. ** - p<0,01 отличие от ИП, † - p<0,05, †† - p<0,01 отличие от К. Полученный в обеих сериях морфологический результат хорошо соотносится с данными оценки размеров области поражения. Формирование очага инфаркта за счет фокальной ишемии приводит в результате к образованию глиального рубца, на границе которого наблюдается двукратное увеличение нейроглиального показателя по сравнению с интактным значением этого параметра в аналогичной области мозга. Это происходит не только из-за 23 увеличения количества нейроглии, собственно формирующей глиальный рубец, но и за счет уменьшения числа нейронов в зоне «полутени». Протекторный эффект нормобарической гипоксии или ишемии-реперфузии сонных артерий, на начальных этапах проявляющийся в уменьшении размера очага поражения, в дальнейшем выражается в сохранности большего количества нейронов на границе глиального рубца. Таким образом, можно предположить, что действие прекондиционирования направлено на защиту клеток в этой области, препятствуя увеличению размера инфаркта. Использование неселективного блокатора К+АТФ-каналов глибенкламида полностью нивелировало защитное действие обоих типов прекондиционирования и на размер зоны некроза, и на сохранность нейронов в перифокальной области очага поражения. Ранее было показано отсутствие системного влияния Glib на величину АДср. и ЧСС, которое могло бы играть роль в отмене эффекта прекондиционирование. Однако эта роль в значительной степени могла бы принадлежать способности Glib понижать в крови концентрацию глюкозы. Действительно, установлено, что ее снижение способно влиять на процесс прекондиционирования, поскольку приводит к увеличению нейроглиального показателя за счет уменьшения количества нейронов на границе глиального рубца по сравнению с группами НГП и ИП. Но в то же время в обоих случаях нейроглиальное соотношение у крыс с инъекцией инсулина было достоверно ниже, чем в группе ОСМА. Вместе с отсутствием значимого изменения размера зоны инфаркта по сравнению с группой НГП и лишь частичной отменой защитного эффекта ИП такой результат дает возможность предположить, что роль концентрации глюкозы в реализации защитного эффекта прекондиционирования не является ведущей по сравнению с К+АТФ-каналами. В пользу данной точки зрения свидетельствует тот факт, что не влияющий на концентрацию глюкозы в крови 5-гидроксидеканоат приводит к отмене протекторного эффекта НГП и ИП в той же степени, что и глибенкламид, возвращая значения размера зоны инфаркта и нейроглиального показателя к характерным для группы ОСМА. В связи с тем, что 5-HD блокирует К+АТФканалы внутренней митохондриальной мембраны, а Glib ингибирует и их, и К+АТФ-каналы, расположенные на плазмалемме, то эффект первого является составной частью действия второго. Учитывая сходное по эффективности влияние этих соединений на формирование зоны поражения головного мозга и значение нейроглиального показателя на границе глиального рубца, возникает ощущение, что основная роль в этом процессе принадлежит митохондриальной изоформе К+АТФ-каналов, о преимущественной роли которой свидетельствуют факты, полученные в некоторых других исследованиях (Миронова Г.Д. и др., 2007; Horiguchi T. et al., 2003; Lebuffe G. et al., 2003). Несмотря на то, что вклад К+АТФ-каналов плазмалеммы не исключается (Tsai C.H. et al., 2002), можно предположить, что активация К+АТФ-каналов внутренней митохондриальной мембраны является не только необходимым, но и достаточным условием для реализации защитного эффекта прекондиционирования. 24 ВЫВОДЫ 1. Разработана модификация модели фокального ишемического инсульта у крыс, позволяющая воспроизводить стабильный очаг поражения в сенсомоторной области коры головного мозга размером около 20% от общего объема коры одного полушария. Через трое суток после фокального инсульта формирование зоны некроза сопровождается 8-кратным увеличением концентрации нейроспецифического кальций-связывающего белка S100β в сыворотке крови, нормализующейся к сороковому дню после операции, что отражает завершение процессов клеточной деградации к этому сроку. 2. При сравнении эффективности протекторного действия разных типов прекондиционирования обнаружено, что предварительная ишемия-реперфузия сонных артерий привела к уменьшению размера области некроза в 3,7; 3,8 и 3,7 раза по сравнению с контролем, будучи проведенной за 1, 24 и 72 часа до моделирования инсульта. Защитный эффект нормобарической гипоксии обнаружен только через 24 часа после прекондиционирования. Дистантное прекондиционирование оказалось неэффективным в данной модели фокальной ишемии. 3. На клеточном уровне защитное действие гипоксического и ишемического прекондиционирования основывается на сохранении числа нейронов в пределах контрольных значений в перифокальной зоне очага поражения. 4. Различные типы прекондиционирования, а также блокада К+АТФ-каналов неселективным блокатором глибенкламидом и ингибитором митохондриальной изоформы 5-гидроксидеканоатом не оказали физиологически значимого влияния на поведенческие реакции крыс. 5. глибенкламидом или 5Предварительная блокада К+АТФ-каналов гидроксидеканоатом полностью нивелировала протекторное действие гипоксического и ишемического типов прекондиционирования на размер области некроза у крыс с фокальным инсультом, который воспроизводился через 24 часа после прекондиционирования. 6. Блокада К+АТФ-каналов глибенкламидом и 5-гидроксидеканоатом отменяла нейропротекторный эффект гипоксического и ишемического прекондиционирования, увеличивая нейроглиальный показатель в перифокальной области очага поражения, препятствуя сохранности нейронов. Различий в эффектах неселективного блокатора глибенкламида и ингибитора 5-гидроксидеканоата не митохондриальной изоформы К+АТФ-каналов установлено. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Кошелев В.Б. Гаврилова С.А., Кузенков В.С., Анджушева Г.М., Самойленкова Н.С., Крушинский А.Л. Адаптация к гипоксии как способ профилактики нарушений 25 церебральной гемодинамики. // В сб. Международной научно-практической конференции МГУ-СУНИ «Человечество и окружающая среда». Москва, 26-28 октября 2004, С.37-39. 2. Самойленкова Н.С., Гурченко И.Л., Ловать М.Л., Ионова В.Г. Протекторное влияние гипоксического и ишемического прекондиционирования при фокальной ишемии мозга у крыс. // В сб. IV Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 80-летию Института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы функционирования висцеральных систем». Санкт-Петербург, 4-6 октября 2005, С.216217. 3. Самойленкова Н.С., Гурченко И.Л., Гаврилова С.А., Ловать М.Л., Ионова В.Г., Кошелев В.Б. Защитное действие гипоксического прекондиционирования при фокальной ишемии мозга у крыс. // В сб. 4-ой Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция». Москва, 12-14 октября 2005, С.99-100. 4. Самойленкова Н.С., Гурченко И.Л., Гаврилова С.А., Кошелев В.Б. Протекторное влияние острой и отсроченной фаз гипоксического и ишемического прекондиционирования при фокальной ишемии мозга у крыс. // В сб. 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинского научного центра РАН «Биология – наука ХХI века». Пущино, 17-21 апреля 2006, С.161. 5. Koshelev V.B., Gavrilova S.A., Kuzenkov V.S., Samoilenkova N.S., Krushinsky A.L., Reutov V.P. HYPOXIC PRECONDITIONING PROTECTS AGAINST EXPERIMENTAL STROKE. // VIII World Congress of the International Society for Adaptive Medicine (ISAM), Moscow, Russia, 21-24 June 2006, P.47. 6. Samoilenkova N., Gurchenko I., Gavrilova S., Lovat M., Ionova V., Koshelev V. Protective effect of hypoxic and ischemic preconditionig in rat brain with focal ischemia. // FENS Forum 2006. Vienna, Austria, 8-12 July 2006. Vol. 3, A237.33. 7. Самойленкова Н.С., Гаврилова С.А., Дубина А.И., Пирогов Ю.А., Уракова Н.А., Худоерков Р.М., Кошелев В.Б. Феномен гипоксического прекондиционирования и его регуляторные последствия. // В сб. V Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения В.Н.Черниговского «Механизмы функционирования висцеральных систем». Санкт-Петербург, 2007, С.280. 8. Кошелев В.Б., Самойленкова Н.С., Дубина А.И., Гаврилова С.А., Пирогов Ю.А. Гипоксическое прекондиционирование мозга. // В сб. ХХ съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва, 4-8 июня 2007, С. 50-51. 9. Самойленкова Н.С., Гаврилова С.А., Дубина А.И., Пирогов Ю.А., Худоерков Р.М., Кошелев В.Б. Защитное влияние ишемического прекондиционирования на развитие экспериментального инсульта у крыс. // В сб. 3-его международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Украина, 12-20 июня 2007, С. 376. 10. Самойленкова Н.С., Гаврилова С.А., Кошелев В.Б. Защитный эффект гипоксического и ишемического прекондиционирования при локальной ишемии мозга крыс. // Доклады академии наук (ДАН). – 2007. - Т.414, N2. – C.283-285. 11. Самойленкова Н.С., Гаврилова С.А., Дубина А.И., Худоерков Р.М., Пирогов Ю.А., Кошелев В.Б. Роль АТФ-зависимых калиевых каналов в процессе гипоксического и ишемического прекондиционирования у крыс с фокальной ишемией мозга. // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 26
