Федеральное государственное бюджетное учреждение «Новосибирский научно-
advertisement
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Новосибирский научноисследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Васильев Игорь Анатольевич КОРРЕКЦИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ В МОДЕЛИ НАРУШЕНИЙ ВЕНОЗНОГО КРОВОТОКА 14.01.18. – нейрохирургия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: д.м.н., проф. Ступак Вячеслав Владимирович Научный консультант: чл.-корр. РАМН, д.м.н., проф. Черных Елена Рэмовна Новосибирск – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 4 ГЛАВА 1. КЛИНИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА: ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И НОВЫЕ СТРАТЕГИИ ЛЕЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) .............................................................................................. 11 1.1. ПАТОГЕНЕЗ НАРУШЕНИЙ ЦЕРЕБРАЛЬНОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ ............................ 11 1.2. НАРУШЕНИЕ ВЕНОЗНОГО КРОВОТОКА ПРИ УДАЛЕНИИ МЕНИНГИОМ В ОБЛАСТИ СРЕДНЕЙ ТРЕТИ ВЕРХНЕГО САГИТТАЛЬНОГО СИНУСА .................................. 20 1.3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ СОСУДИСТЫХ ПОРАЖЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА ........................................................................................................................... 26 1.4. МСК В ЛЕЧЕНИИ ОЧАГОВЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ............................................................................. 29 1.4.1. Регенеративный ответ в ЦНС как новая мишень в лечении повреждений головного мозга ............................................................................... 29 1.4.2. МСК как перспективные кандидаты для клеточной терапии повреждений головного мозга ............................................................................... 30 1.4.3. Влияние МСК на неврологическое восстановление в моделях ишемического инсульта ......................................................................................... 33 1.4.4. Механизмы, лежащие в основе эффекта МСК ........................................ 34 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................................... 37 2.1. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ ....................................................................................... 37 2.2. МЕТОДИКА МОДЕЛИРОВАНИЯ ОЧАГОВОГО НАРУШЕНИЯ ВЕНОЗНОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ........... 39 2.3. ХАРАКТЕРИСТИКА СФОРМИРОВАННЫХ ГРУПП ..................................................... 41 2.4. ОЦЕНКА ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА, ИНДУЦИРОВАННЫХ НАРУШЕНИЕМ ВЕНОЗНОГО КРОВОТОКА ....................................................................... 45 2.4.1. Оценка неврологического статуса животных......................................... 46 3 2.4.2. Электрофизиологическая активность головного мозга крыс ................ 48 2.4.3. Магнитно-резонансная томография головного мозга крыс ................... 49 2.4.4. Морфологическое исследование головного мозга ..................................... 50 2.5. ГЕНЕРАЦИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ..................................... 51 2.6. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ............................... 52 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ........................... 53 3.1. МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОЗДАННОЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ОЧАГА НАРУШЕНИЯ ВЕНОЗНОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА........................................................................ 53 3.1.1. Характеристика общего состояния и неврологических выпадений при самопроизвольном восстановлении функции головного мозга животных ............................................................................................................... 53 3.1.2. Характеристика морфологических изменений головного мозга при моделировании нарушения венозного кровотока................................................ 60 3.2. ВЛИЯНИЕ МСК НА ВОССТАНОВЛЕНИЕ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ВЫПАДЕНИЙ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОЧАГОВОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА, ВЫЗВАННОМ НАРУШЕНИЕМ ВЕНОЗНОГО КРОВОТОКА ..................................... 76 3.3. ВЛИЯНИЕ МСК НА ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ГОЛОВНОГО МОЗГА В МОДЕЛИ ОЧАГОВОГО НАРУШЕНИЯ ВЕНОЗНОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ.............. 83 3.4. ВЛИЯНИЕ МСК НА ХАРАКТЕР МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В МОДЕЛИ ОЧАГОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА, ИНДУЦИРОВАННОГО НАРУШЕНИЕМ ВЕНОЗНОГО КРОВОТОКА ....................................................................... 89 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................................. 98 ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 103 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ..................................................................... 103 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ......................................................................................... 106 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................... 107 4 ВВЕДЕНИЕ Поражение головного мозга (ПГМ) в результате нарушения мозгового кровообращения представляет серьезную медико-социальную проблему и наносит огромный экономический ущерб обществу, поскольку является причиной экстренной госпитализации, длительной инвалидизации и в развитых странах занимает третье место среди причин смертности взрослого населения после онкологических заболеваний и сердечной патологии [19, 24, 49, 70, 119]. Лидирующая позиция в структуре сосудистых заболеваний головного мозга принадлежит ишемическим инсультам, которые встречаются в 70–80% случаев, 20–30% приходится на долю геморрагических инсультов и 5 % в структуре цереброваскулярных патологий занимают субарахноидальные кровоизлияния [23]. Наряду с нарушениями артериального кровообращения, серьезную проблему – в связи со сложностью диагностики, недостаточной изученностью патогенеза и отсутствием эффективных методов лечения – представляют нарушения венозного кровотока, обусловленные венозными кровоизлияниями, тромбозами мозговых вен и тромбозами синусов. В последнее время этой патологии было посвящено немало работ [22, 32, 41, 57, 61, 79, 98, 121, 122, 145, 146, 196, 215, 221]. Вместе с этим, развитие очаговых церебрально-васкулярных нарушений может быть следствием осложнений хирургического лечения парасагиттальных менингиом, локализованных в средней и задней трети верхнего сагиттального синуса (ВСС) [15, 22, 45]. Это связано с тем, что удаление парасагиттальных менингиом данной локализации нередко ведет к травматизации впадающих в синус крупных венозных коллекторов и развитию обширного венозного инфаркта мозга. Все это нередко приводит у больного к развитию нового или к углублению уже имеющегося неврологического дефицита. Развитие парезов и параличей в конечностях приводит к значительному снижению качества жизни. Об этом свидетельствует тот факт, что после удаления менингиом, растущих из верхнего 5 сагиттального синуса, большое число больных остаются инвалидами. Так, по данным Габибова [15], только 50% больных через 5 лет после операции были практически здоровы и трудоспособны, 15% являлись инвалидами, но могли обслуживать себя, а остальные оставались глубокими инвалидами. Согласно исследованиям [15, 33] до 50% (28,8–47,5%) больных после операции имеют неврологические нарушения, а 18,6% – остаются глубокими инвалидами [7, 45, 78]. Отсутствие эффективных методов лечения при данных поражениях головного мозга побуждает искать новые терапевтические подходы, направленные на стимуляцию процессов репарации нервной ткани. Особая роль в этом направлении отводится клеточным технологиям. Долгое время считалось, что центральная нервная система (ЦНС) не способна к репарации. Однако экспериментальные исследования последних лет показали, что процессы репарации могут наблюдаться в поврежденной ткани ЦНС, причем эти процессы во многом обусловлены образованием новых сосудов, генерацией новых нервных клеток и в значительной степени – реорганизацией нейронной сети (нейропластичность) [224]. Более того, многочисленные экспериментальные исследования показали эффективность клеточной терапии при коррекции неврологических нарушений в моделях повреждения головного мозга сосудистого генеза [1, 85, 113, 206]. Среди различных типов клеток наибольшее внимание в последнее время привлекают стимулировать мезенхимальные ангиогенез, стромальные активировать клетки нейральные (МСК), способные стволовые клетки, оказывать нейротрофическую поддержку и модулировать процессы воспаления [14, 144, 211, 228, 229, 232]. Однако ограниченность моделей ПГМ мозга сосудистого генеза, среди которых основной является окклюзия среднемозговой артерии, а также отсутствие ясности в отношении оптимальных сроков и путей введения клеток, существенно тормозят развитие клеточных технологий и их трансляцию в клиническую практику. 6 Исходя из вышесказанного, была сформулирована цель настоящего исследования. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Разработать экспериментальную модель очагового церебрального поражения, индуцированного нарушением венозного кровотока, и на основании комплексных исследований оценить влияние мезенхимальных стромальных клеток на морфо-функциональное восстановление головного мозга. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: 1. Разработать модель очагового поражения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровотока, и оценить характер повреждений головного мозга, тяжесть неврологических расстройств и эффективность их спонтанного восстановления. 2. В стромальных разработанной клеток на модели исследовать восстановление влияние мезенхимальных неврологического дефицита в зависимости от путей и сроков проведения клеточной терапии. 3. Провести сравнительную оценку электрофизиологических параметров головного мозга путем регистрации сомато-сенсорных вызванных потенциалов до и после оперативного вмешательства в группах животных с самопроизвольным восстановлением неврологического дефицита и с трансплантацией мезенхимальных стромальных клеток. 4. В рамках разработанной модели провести сравнительную характеристику патогистологических изменений головного мозга у экспериментальных животных после трансплантации мезенхимальных стромальных клеток и в группах с самопроизвольным восстановлением. НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые показано, что облитерация верхнего сагиттального синуса в средней трети путем его полной биполярной коагуляции с одновременной коагуляцией корковых вен в теменно-височной области у крыс моделирует выраженное ПГМ, которое характеризуется тяжелым неврологическим дефицитом с доминированием очаговых расстройств, сочетающихся в остром 7 периоде с общемозговой симптоматикой, и низким уровнем спонтанного восстановления. Установлено, что морфологическим субстратом церебрального повреждения является зона омертвения (некроза) головного мозга, который развивается на фоне выраженного отека и нарушения микроциркуляции в венозном русле по смешанному типу (стазы, тромбозы, кровоизлияния), и впоследствии подвергается рубцовому замещению с кистозной дегенерацией. Формирование очага отека на фоне выключения венозного кровотока при сохранении артериального кровообращения с последующим образованием в зоне повреждения кистозной полости подтверждается также данными магнитнорезонансной томографии (МРТ). На основе полученных экспериментальных данных разработан новый способ очагового повреждения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровообращения «Способ моделирования ишемического поражения головного мозга» Патент № 2 432 619 РФ. Авторы Ступак В.В., Васильев И.А., Самохин А.Г. В разработанной оригинальной модели очагового нарушения церебрального венозного кровотока продемонстрирована безопасность и эффективность трансплантации МСК с целью коррекции неврологического дефицита. Установлено, что трансплантация животным МСК в разработанной модели не вызывает локальных или системных осложнений и приводит к достоверному улучшению неврологических функций. Положительный эффект трансплантации МСК проявляется при внутривенном и локальном их введении, как в остром, так и в подостром периодах. При этом наиболее эффективным режимом является внутривенное введение клеток и проведение терапии в остром периоде, начиная с 1-х суток с момента формирования очага венозной ишемии. Клиническая эффективность трансплантации МСК подтверждается данными электрофизиологического обследования. У животных контрольной группы снижение амплитуды сомато-сенсорных вызванных потенциалов (ССВП) в послеоперационном периоде носит выраженный и стойкий характер. У крыс с 8 трансплантацией МСК с 14-х суток наблюдается возрастание амплитуды ССВП, а к 21-м суткам – восстановление электрофизиологической активности практически до исходного уровня. На основании исследований морфологических изменений головного мозга животных после трансплантации МСК установлено, что позитивный эффект внутривенного введения клеток ассоциирован с активацией ангиогенеза, подавлением деструктивного отека, дистрофических изменений и воспаления и более эффективной организацией поврежденной ткани (образование компактного глиомезодермального рубца с меньшей кистозной дегенерацией). ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Разработанная модель тяжелых очаговых ПГМ позволяет оценить безопасность и эффективность различных фармакологических и клеточных воздействий. Данный способ приближен к патогенезу повреждений, связанных с развитием венозного инфаркта, возникающих после травматизации крупных венозных коллекторов и венозных синусов после удаления парасагиттальных менингиом. Выявленный позитивный эффект трансплантации МСК на восстановление неврологического дефицита у экспериментальных животных в разработанной модели очагового обоснованием для ишемического поражения дальнейшего продвижения головного мозга клеточных является технологий в клиническую практику. Морфо-функциональные данные в виде ССВП и МРТ-исследования головного мозга свидетельствуют о целесообразности их использования в клинической практике для объективизации эффектов клеточной терапии при очаговых повреждениях головного мозга. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. Моделирование поражений головного мозга венозного характера путем биполярной коагуляции верхнего сагиттального синуса с последующей коагуляцией корковых вен в левой теменно-височной области приводит к 9 развитию тяжелого неврологического дефицита с доминированием очаговых расстройств и низким уровнем спонтанного восстановления. 2. Морфологическим субстратом в разработанной модели является очаг некроза головного мозга с последующим замещением зоны повреждения рубцовой тканью с кистозной дегенерацией. 3. Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток в разработанной модели является эффективным методом восстановления неврологического дефицита с наилучшим клиническим эффектом при использовании внутривенного режима введения и проведения терапии в ранние сроки, что подтверждается данными клинических, электрофизиологических и морфологических исследований. Основные положения работы доложены на: Всероссийской научной школе-конференции МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, 2010 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Цивьяновские чтения», НИИТО, Новосибирск, 2010 г.; Заседании ассоциации нейрохирургов г. Новосибирска. 2011 г.; VII Сибирском физиологическом съезде, г. Красноярск, 2012 г.; VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Цивьяновские чтения», НИИТО, Новосибирск 2013 г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21-а научная работа, в том числе 4 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК России. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 страницах, содержит 32 рисунка, 10 таблиц, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка использованной литературы, содержащего 241 источник, из них 85 на русском и 156 на иностранных языках. Личный вклад автора Автор лично провел все 100% оперативных вмешательств на животных по моделированию очагового поражения головного мозга венозного характера и 10 отработал методику забора клеточного материала. Все 100% клинического материала, полученные в эксперименте, проанализированы и статистически обработан автором самостоятельно. 11 Глава 1. КЛИНИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА: ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И НОВЫЕ СТРАТЕГИИ ЛЕЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Патогенез нарушений церебрального кровообращения Нарушения венозного кровообращения в головном мозге, вызванные преимущественно тромбозом или сдавлением церебральных венозных синусов, крайне трудны для диагностики в связи с небольшой распространенностью и отсутствием характерной симптоматики поражения. И поэтому механизмы нарушений венозной гемоциркуляции остаются во многом неизученными. Единственным крупным исследованием тромбоза церебрального венозного синуса является завершенное в 2004 году исследование (International Studyon Cerebral Veinand Dural Sinus Thrombosis) [212], охватившее 624 пациента в 89 центрах Европы. Анализируя патологические факторы, вызывающие нарушения мозгового венозного кровообращения, важно отметить, что многие из них известны как причины расстройства кровообращения в артериальном русле. Это подтверждает взаимосвязь и взаимозависимость артериального и венозного компонентов мозгового кровообращения. Раннее возникновение очага некроза в какой-либо области мозга при сосудистых заболеваниях объясняли закрытием соответствующего сосуда. При этом в тех наблюдениях, в которых причина образования инфаркта была неясна, чаще всего формирование его считали результатом эмболии мозгового сосуда. Несколько позже было установлено, что параллелизм между анатомическими изменениями мозга и его сосудов отмечается только в небольшом проценте наблюдений. Основные положения о сосудистой мозговой недостаточности разработаны Corday et al., Denny-Brown [115, 118]. Согласно этой теории, в развитии инфаркта 12 мозга имеют значение не только местные условия кровообращения в мозге (анатомическое состояние сосудов, степень развития коллатерального кровообращения, особенности ангиоархитектоники), но и экстрацеребральные факторы. Среди последних главными являются состояние сердечно-сосудистой системы, кровопотери, перераспределение крови с отвлечением ее от головы. Каждый из факторов может выявить уже имеющуюся недостаточность снабжения кровью мозга, при этом полная закупорка просвета сосуда не является обязательным условием для возникновения инфаркта. Еще ранее в экспериментальных исследованиях [27, 30] было показано, что в развитии очаговых изменений в головном мозге при перевязке крупной артерии большое значение имеют величина системного артериального давления и состояние коллатерального кровообращения. В 60-х годах прошлого века были уточнены отдельные положения концепции сосудистой мозговой недостаточности [82, 83, 190, 191]. Было установлено, что у лиц со стенозом внечерепных и внутричерепных отделов артерий мозга повторные неврологические нарушения могут быть обусловлены преходящим внезапным уменьшением кровотока в той или иной области мозга. Сосудистая мозговая недостаточность в самой общей форме определяется как состояние диспропорции между потребностью и возможностями обеспечения головного мозга полноценным кровоснабжением. Возникновение мозговой недостаточности происходит на фоне неполноценности кровоснабжения мозга вследствие изменений в его сосудистой системе и при дополнительном уменьшении притока крови к мозгу под влиянием экстрацеребральных факторов. В участках мозга с критическим уровнем кровоснабжения требуется усиление мозгового кровотока вдвое в связи с повышением в них неврональной активности [2]. До настоящего времени причина возникновения разных видов инфарктов точно не установлена. Остается открытым вопрос о том, почему при одинаковых условиях в одних случаях возникают белые, а в других красные или смешанные 13 инфаркты [241]. Существуют различные объяснения, но ни одно из них не является исчерпывающим. Чаще всего белые инфаркты возникают при очень слабо развитом коллатеральном кровообращении. Причины его недостаточности могут быть разными: быстрое наступление недостаточности кровоснабжения, вследствие чего коллатерали не успевают развиться, низкий уровень артериального давления, патологические изменения стенок сосудов [27, 30]. Большинство исследователей считают, что в патогенезе красных инфарктов важную роль играют повышенное артериальное давление и хорошо развитое коллатеральное кровообращение [126]. Некоторые авторы полагают, что возникновение геморрагических инфарктов возможно лишь при неполном или кратковременном закрытии просвета сосуда с последующим восстановлением кровотока [108]. Многие авторы [12] придают значение повышению проницаемости сосудов, находящихся в ишемизированной зоне. Немаловажную роль, как в развитии ишемии, так и восстановлении кровотока, играет фактор внезапности. Верещагин и Колтовер [12] наблюдали развитие обширных геморрагических инфарктов в полушариях мозга в зонах смежного кровообращения при внезапном распрямлении двусторонних перегибов сонных и позвоночных артерий в связи с восстановлением кровотока в них. В редких случаях в механизме развития красных инфарктов ведущим является прекращение или значительное затруднение венозного оттока [53, 138]. Обращает на себя внимание то, что красные инфаркты развиваются только в сером веществе мозга, а при смешанных инфарктах геморрагические участки располагаются также лишь в сером веществе мозга. Этот факт подчеркивает значение в патогенезе инфарктов (помимо приведенных выше факторов) местных условий, в основном ангиоархитектоники. Серое вещество гораздо богаче сосудами, чем белое, при этом в нем особенно обильна сеть мелких сосудов, в которых легче (а потому и чаще) возникают процессы дистонии с последующими диапедезными кровоизлияниями. Кроме того, в сером веществе более высок 14 уровень процессов обмена, поэтому любое нарушение его питания скорее всего выявляется в этих образованиях мозга. Расхождение во взглядах на патогенез инфаркта мозга, с одной стороны, свидетельствует о сложности и многообразии патогенетических факторов, непосредственно вызывающих их развитие; с другой стороны, эта разноречивость может быть объяснена неоднородностью материалов, анализируемых авторами, и не всегда достаточно полным исследованием мозга и его сосудов, особенно магистральных. Например, сосудистой мозговой инфарктов мозга, недостаточностью. Moossy недостаточности исключил Другие все авторы отрицающий [195], при анализе наблюдения [81, 99], не с роль механизма патогенеза развития острой сердечной исследовав состояние экстракраниальных отделов магистральных артерий головы, делают вывод о преимущественной роли механической закупорки внутричерепных сосудов в возникновении очаговых некрозов мозга. Регуляторные процессы мозгового кровообращения могут реализовываться лишь при компенсации изменений кровенаполнения в полости черепа. Особую важность при этом имеет связь изменений объемов артериальной, венозной крови и спинномозговой жидкости в полости черепа. Большая часть крупных мозговых сосудов непосредственно соприкасается с циркулирующим ликвором, формирует единую систему, постоянно изменяющую свой объем. В исследованиях, при которых одновременно регистрировалось ликворное, артериальное и венозное давление, обнаружена более тесная корреляция между венозным и ликворным, чем между артериальным и ликворным давлениями [117]. Это связано с тонкостью стенок вен мозга, их слабым собственным тонусом и нахождением в ликворной среде, что способствует взаимодействию колебаний венозного и ликворного давления [6]. На значительное снижение ликворного давления реагируют прежде всего мозговые вены: они максимально дилатируются [147]. Однако полной идентичности ликворного и венозного давления нет, а их взаимосвязь не является жесткой. 15 В синусах твердой мозговой оболочки кровяное давление ниже ликворного, а в мозговых венах оно несколько превышает ликворное. В свою очередь ликворное давление превышает артериальное и определяет выраженность венозного компонента пульсовых колебаний спинномозговой жидкости. Колебания внутричерепного давления вызывают быстрые изменения объема венозных сосудов, но до определенных пределов мало влияют на приток артериальной крови в полость черепа. Регулирующая роль венозной системы определяется главным образом ее участием в активном перераспределении давления в сосудистой системе мозга [38]. При этом адекватность компенсаторных механизмов регуляции кровенаполнения мозга зависит от возможностей перераспределения объемов крови в полости черепа и позвоночного канала в максимально короткий срок [55]. Регуляция мозгового кровотока представляет собой сложный процесс поиска оптимального варианта изменения кровообращения для каждой комбинации экзогенных и эндогенных воздействий, а сложность такой системы позволяет предположить, что ведущую и организующую роль в этом процессе играет нервный механизм [39]. В развитии тромбоза синуса участвуют два патогенетических механизма. Первый – это окклюзия церебральных вен, вызывающая отек головного мозга и нарушение венозного кровообращения. Отек может быть цитотоксическим, т. е развивающимся вследствие ишемического повреждения нейронов с нарушением межклеточного транспорта и некрозом тканей мозга, и вазогенным, возникшим вследствие повреждения гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) и проникновения плазмы крови в межклеточное пространство. Вторым звеном патогенеза является развитие внутричерепной гипертензии вследствие окклюзии крупных венозных синусов. В норме цереброспинальная жидкость транспортируется из желудочков мозга через субарахноидальное пространство на основание и конвекситальную поверхность головного мозга, абсорбируется в паутинных сплетениях и оттекает в ВСС. Вследствие тромбоза происходит повышение венозного давления, в результате чего нарушается абсорбция цереброспинальной жидкости, 16 сопровождающаяся внутричерепной гипертензией и формированием синустромбозов [17]. Трудности прижизненной диагностики нарушений венозного кровообращения явились причиной ложного представления о низкой частоте встречаемости этой патологии. Однако, в последние годы, становится очевидным, что при нарушениях мозгового кровообращения наиболее важное патогенетическое значение имеют два фактора: недостаточность притока крови к тканям мозга и недостаточность (задержка) венозного оттока. Эти два процесса тесно взаимосвязаны, так как при нарушении кровообращения в артериях мозга в той или иной степени страдает и венозный отток. Равным образом патология вен мозга приводит к нарушению артериальной гемодинамики и метаболизма мозга [9]. До последних лет изучение венозного компонента мозгового кровообращения значительно отставало от исследований артериальной гемодинамики, хотя венозная система мозга – это высокоорганизованная рефлексогенная зона, ответственная за развитие сложных и имеющих важнейшее физиологическое значение компенсаторных реакций, обеспечивающих постоянство мозгового кровотока. Поскольку из общего объема крови около 70% находится в венозном русле, понятна важная роль механизмов, регулирующих венозный отток, в частности от головного мозга. Венозный застой может возникать, как одно из проявлений сосудистой патологии мозга. Рядом авторов показано, что если в артериоле наступает спазм, то в соответствующих капиллярах происходит не опустошение, а заполнение венозной кровью, и клинические симптомы будут обусловлены не ишемией, а стазом [9, 26, 170, 231, 236]. Закупорка артерии тромбом или эмболом может привести к быстрому отеку мозговой ткани и нарушению оттока крови из мозговых вен, вследствие их сдавливания. Кровь из этих вен проникает в область инфаркта. В последние годы особое значение в формировании внутричерепного венозного застоя придается дистонии и гипотонии церебральных вен. Выявленная богатая иннервация вен мозга доказывает наличие сложных нервнорефлекторных 17 механизмов регуляции венозного тонуса. В развитии венозной циркуляторной дистонии ведущее значение может иметь нарушение центральной регуляции, в частности тонуса вазомоторного центра, его возбудимости и реактивности, приводящее к повышению венозного давления. Вместе с тем, для формирования венозного застоя имеют значение и такие периферические факторы, как изменение транскапиллярного обмена, нарушение микроциркуляции, состояние клапанного аппарата венозной системы [11, 31, 50]. В таких случаях развивается гиперволемический тип венозной гипертонии. Первичным звеном патогенеза при этой форме венозного застоя является нарушение двустороннего тока жидкости ткань-кровь и кровь-ткань. Преобладает переход жидкости и белка из ткани в кровь, что способствует увеличению объема венозной крови. Венозный застой в свою очередь может приводить к вторичным мозговым нарушениям. При затруднении интракраниального венозного оттока и повышении давления в венозной системе мозга наступает компенсаторное сужение мозговых артерий, показывая взаимозависимость уровней сосудистого тонуса и давления в венозной и артериальной системах головного мозга [38, 51]. В дальнейшем была выявлена возможность замедления не только венозного оттока, но и артериального притока при выраженном внутричерепном венозном застое [3]. Подобные реакции артериального русла на венозный застой являются защитным механизмом, предохраняющим мозг от избыточного кровенаполнения в условиях замедленного оттока, но, в то же время, компенсаторные возможности такого механизма защиты имеют свои пределы, после чего возникает субкомпенсация или декомпенсация мозгового венозного кровообращения с развитием своеобразного комплекса клинических проявлений. Не менее сложен патогенез застойно-гипоксических интракраниальных венозных нарушений, связанных с тромбозом вен и синусов твердой мозговой оболочки и другой интракраниальной патологией. Таким образом, венозный отток, это не пассивный процесс, зависящий только от гидродинамических и гидростатических факторов. 18 Как обоснованно считает Холоденко [77], венозная энцефалопатия в большинстве случаев не является самостоятельной нозологической формой, а возникает как осложнение других заболеваний при нарушении интракраниального венозного оттока, при этом важно, что клинические и субъективные проявления венозной энцефалопатии часто оказываются более выраженными, чем основное заболевание. Интракраниальный венозный застой с отеком мозга часто развивается при церебральных опухолях. При этом в патогенезе венозных расстройств имеют значение непосредственное сдавление определенного участка венозного русла опухолью, дислокация мозга и сдавление большой мозговой вены и других основных венозных магистралей. Особенно рано развивается повышение внутричерепного давления при опухолях задней черепной ямки, что связано с затруднением оттока крови через яремные вены. Если в онкологический процесс вовлечены полушария большого мозга, нарушение венозного оттока чаще всего связано с реакцией венозных отделов сердечно-сосудистой системы на мозговой опухолевый процесс. Выявляемые изменения свидетельствуют об общей венозной недостаточности, вызываемой интракраниальными расстройствами регуляции нормальных веномоторных реакций организма [6, 46]. Не менее сложен патогенез застойно-гипоксических интракраниальных венозных нарушений, вызванных тромбозом вен и синусов твердой мозговой оболочки, что заканчивается их грубыми структурными нарушениями, прежде всего вследствие расстройств иннервации стенок сосудов с перивенозными кровоизлияниями. Развивающаяся мозговая патология в этих случаях связана с сочетанным воздействием гемодинамических, гуморальных и рефлекторных факторов, что приводит к нарастанию внутричерепного ликворного давления, снижению насыщения крови кислородом и замедлению мозгового кровотока [42]. К гемодинамическим факторам относится затруднение оттока из полости черепа. Гипоксия и гиперкапния приводят к сосудорасширяющему эффекту с повышением проницаемости стенок расширенных и атоничных сосудов, затруднением резорбции ликвора в венозную систему и отеком мягких мозговых 19 оболочек. Рефлекторным фактором являются усиленная и извращенная импульсация от проприорецепторов дыхательных мышц и интерорецепторов, изменение функционального состояния дыхательного центра и других стволовых структур [40, 43]. Анализ данных литературы свидетельствует о том, что патогенез дисциркуляторной венозной патологии весьма сложен. Многие звенья его развития, особенно динамика ультраструктурных изменений и соответственно метаболизма мозговых структур, изучены недостаточно и в чем-то гипотетичны. Многие возникающие проблемы определяются, прежде всего, уровнем наших знаний о функции, метаболизме и структурно-клеточных особенностях, возникающих при венозных повреждениях мозга. Детальное изучение этой проблемы может иметь важное практическое значение для рационального выбора фармакологических средств, разработки эффективных лечебных мероприятий при различных формах расстройств мозгового венозного кровообращения. Выраженные морфологические изменения вен мозга при внутричерепном венозном застое наблюдали Leu, Vogt, Pfrunder, Wu, Mansfield, Mannick [179, 237]. По их мнению, именно рассеянность этих изменений и обусловливает многоочаговость, полиморфность неврологических проявлений. Богатые компенсаторные возможности системы кровоснабжения объясняют тот факт, что признаки затруднения венозного оттока, даже при длительном его существовании, могут быть мало выраженными или отсутствовать. Только при явлениях декомпенсации или при внезапном развитии венозного застоя выявляются его характерные симптомы; некоторые из них отмечены еще Говерсом, впоследствии они были более детально описаны рядом авторов, изучавших венозную патологию мозга [21, 77]. В этиологии вторичных венозных энцефалопатий большую роль играет фактор венозного застоя в мозге вследствие разнообразных причин, воздействующих на интра- и экстракраниальные пути оттока венозной крови. 20 1.2. Нарушение венозного кровотока при удалении менингиом в области средней трети верхнего сагиттального синуса Феликс Плетер (Felix Plater) был первым, кто описал экстрацеребральное образование, напоминающее менингиому, еще в 1614 году. Официально термин «менингиома» был предложен Кушингом (Harvey William Cushing, 1869–1939) в 1922 г. [116]. пересматривается. Гистологическая Подобному классификация пересмотру менингиом подвергается и постоянно классификация парасагиттальных менингиом (ПСМ). И хотя сам термин также предложен Кушингом [116], определение вплоть до настоящего времени трактуется неоднозначно [15, 28, 62, 181]. Данные опухоли располагаются вдоль верхнего сагиттального синуса, а также имеют рост из его стенок, способны прорастать просвет синуса, распространяться в одну или обе стороны, формируя частичную или полную обтурацию и вызывая, тем самым, венозные нарушения. Среди первичных внутричерепных опухолей головного мозга у взрослых менингиомы занимают второе место, составляя от 18 до 34 % [47, 67, 132]. ПСМ встречаются в 18–38 % наблюдений [5, 15, 16, 25, 37, 48, 67, 103, 104, 112, 116, 132, 137, 151, 174, 239]. По данным Российского научноисследовательского института им. проф. А.Л. Поленова частота встречаемости менингиом ВСС у женщин в 3 раза превышает таковую у мужчин [80]. ПСМ в зависимости от места их локализации принято разделять на менингиомы передней, средней или задней третей ВСС [204]. По данным ряда авторов встречаемость менингиом передней трети ВСС составляет от 18,4 до 31,5 %, средней трети – от 55,0 до 67,2 % и задней трети – от 11,2 до 14,4 % [78]. Подобное распределение менингиом относительно ВСС приводят и другие авторы [5, 65], которые наблюдали менингиомы вдоль средней трети верхнего продольного синуса в 55,0%, вдоль передней – в 31,5% и вдоль задней трети – в 13,5% случаев. Неврологические нарушения в виде двигательных расстройств у больных с ПСМ наблюдаются на догоспитальном этапе и наиболее часто (у 87,7 % больных) 21 выявляются при менингиомах средней трети ВСС. У пациентов с менингиомами передней и задней трети эти нарушения выявляют редко – в 7,7 и 9,6 % случаев соответственно [80]. Габибов [15] выделяет три формы роста менингиом: шаровидная, инфильтративная и смешанная. При шаровидной форме роста менингиома имеет небольшой по площади матрикс. При инфильтративной форме роста новообразование может поражать не только обширные участки твёрдой мозговой оболочки, синус, серповидный отросток, кости, но иногда и мягкие ткани головы. При смешанной форме роста менингиом возможности радикального удаления новообразования определяются степенью выраженности инфильтративного компонента, обширностью поражения верхнего продольного синуса и серповидного отростка. Важной особенностью менингиом ВСС является вовлечение опухолью в свой рост костей свода черепа, а именно – образование узураций, эндостоза или гиперостоза. На долю таких локальных изменений в костях свода черепа, по данным ряда авторов, приходится от 16,0 до 30,0 % случаев, а в отдельных публикациях их доля достигает 40,0–43,6 % от общего числа ПСМ [15, 110]. ПСМ, в зависимости от степени вовлечения ВСС в опухолевый процесс, подразделили на 6–8 типов поражения синуса [107, 184, 220]. Можаев [37] предложил 5 вариантов поражения синуса менингиомой. При I варианте опухоль поражает один наружный листок стенки синуса, при II – оба листка или его угол, при III – прорастает одну или две стенки синуса, частично окклюзируя его просвет и распространяясь на серповидный отросток, при IV – прорастает две или три стенки синуса, полностью облитерируя его просвет, распространяется на серповидный отросток, имеет одностороннюю локализацию, при V варианте опухоль окклюзирует синус, прорастая все его стенки, серповидный отросток и имеет двустороннее распространение. распространена в нашей стране. Эта классификация наиболее 22 Тактика лечения зависит от варианта анатомического строения ВСС и крупных дренирующих вен, а также от локализации и направления роста опухоли в пределах ВСС [16, 37, 68, 72]. Основным методом лечения ПСМ является хирургический. Техника удаления ПСМ достаточно хорошо изучена и описана [15, 29, 44, 59, 67, 73, 74, 75, 76, 94, 178, 183, 239]. Использование микрохирургической техники при удалении менингиом головного мозга значительно увеличивает процент радикального удаления опухолей, уменьшает количество послеоперационных осложнений в виде усугубления неврологического дефицита и позволяет значительно снизить послеоперационную летальность. Основная задача хирургического лечения ПСМ состоит не только в радикальном удаление самой опухоли, но и в сохранении как ранее существовавших, так и развившихся под влиянием опухоли дополнительных путей венозного оттока [52]. Значимое участие экстрацеребральных вен в коллатеральном венозном кровообращении мозга обусловило необходимость как предоперационного планирования с целью выбора оптимального доступа, так и разделения операции у ряда больных с ПСМ на отдельные этапы [52]. В качестве критерия физиологической дозволенности объёма каждого этапа хирургического вмешательства могут быть использованы данные клинико-физиологического контроля [8, 69] и, в частности, динамика изменений электроэнцефалографии (ЭЭГ) в ходе операции, которые позволяют получить важную информацию, отражающую выраженность перестроек венозного церебрального кровотока. Особое внимание, по мнению многих нейрохирургов [15, 16, 20, 64, 74], должно уделяться кожному разрезу, поскольку при обтурации синуса кровоток в значительной степени компенсируется через покровы головы. Срединный Sобразный разрез при двусторонней локализации менингиом считается оптимальным [20, 180]. При удалении менингиом ВСС важным является степень и целесообразность резекции ВСС в том или ином случае [109]. Так, резекция даже полностью окклюзированного ВСС в его передней трети может привести к 23 глубоким перестройкам венозного кровообращения головного мозга и, тем самым, вызвать развитие грубой неврологической симптоматики в послеоперационном периоде. Наиболее достоверным доказательством того, что состояние венозного кровотока является одним из главных факторов, обеспечивающих нормальное функционирование жизненно важных центров головного мозга, является тот факт, что даже малейшее отклонение в сбалансированности венозного оттока при хирургическом лечении менингиом и нарушение целостности ВСС приводят к тяжелым осложнениям в послеоперационном периоде, проявляющимся двигательными нарушениями разной степени выраженности [7]. При полной окклюзии ВСС возможно резецировать облитерированный участок с обязательным сохранением компенсаторных вен впереди и кзади от места окклюзии [182, 220]. Но даже в случаях полной обтурации просвета ВСС, особенно кзади от Роландовых вен, резекция его может приводить к развитию тяжёлых неврологических выпадений и даже к летальным исходам [15, 52]. До сих пор не существует четкой хирургической стратегии при инвазии менингиомы в ВСС. Значительные трудности заключаются в лечении пациентов и с проходимым ВСС. Хирургу в момент операции порой трудно принять решение об удалении той части опухоли, которая находится в полости синуса. Для этого существует две хирургические стратегии: максимальное безопасное удаление опухоли за пределами синуса и агрессивная хирургическая резекция части синуса с последующей его реконструкцией [101, 107, 173, 177, 182, 223]. С целью восстановления физиологического оттока венозной крови через пророщенный опухолью ВСС и предупреждения развития грубых неврологических осложнений в раннем послеоперационном периоде были разработаны различные способы коллатерального шунтирования типа «by pass» или пластического восстановления резецированного участка синуса [107, 124]. Послеоперационная летальность после операций по поводу ПСМ, проведенных в 1956–1962 годах, по данным Габибова [15] составляла 9,3 %. В настоящее время этот показатель составляет от 1,1 % до 3,0 % [16, 66]. Анализ 24 летальных исходов, выполненный на материале РНХИ им. проф. А.Л. Поленова, показал, что нарушения венозного оттока вследствие одномоментного выключения из мозгового кровообращения большого количества венозных интракраниальных и экстрацеребральных коллекторов, является основной причиной не только послеоперационной летальности среди больных с ПСМ, но и развития грубого неврологического дефицита. Об этом свидетельствуют результаты оперативного лечения менингиом ВСС. Так, например, в работе Боровковой и др. [60] показано, что основным грозным осложнением в послеоперационном периоде являются грубые стойкие двигательные расстройства. По данным этой работы частота инвалидизации таких больных отмечается в 28,8–47,5 % случаев. Исследованиями Габибова [15] показано, что только 50 % больных через 5 лет после операции были практически здоровыми и трудоспособными, 15 % остаются инвалидами, но могут обслуживать себя, а 35 % из общего числа прооперированных остаются глубокими инвалидами. Можаев [37] сообщает, что только 48 % больных после операции были здоровыми, 35 % больных остаются инвалидами, но могут себя обслуживать, 17 % больных остаются глубокими инвалидами. По данным работы Тиглиева и др. [67] полная реадаптация больных с возвращением их к работе в рамках прежней профессии наблюдалась у 26,9 %, оперированных до 1981 года, у 45,8 % – до 1986 года и 79,1 % оперированных после 1987 года. Принимая во внимание то, что двигательные нарушения после удаления ПСМ по данным авторов составляют практически 50,0 %, поиск новых способов лечения очаговых поражений головного мозга остается весьма актуальной задачей и в настоящее время. Подходы к лечению неврологических нарушений после удаления менингиом. Как было отмечено выше, практически половина больных после хирургического удаления менингиом ВСС имеет неврологические нарушения, что ведет к снижению качества жизни самих пациентов и создает серьезные 25 проблемы для родственников, которые за ними ухаживают. На сегодняшний день подходы к лечению данного рода пациентов немногочисленны и включают как консервативные, так и хирургические методы. К терапевтическим методам относятся комплексная медикаментозная терапия (ноотропная, нейрометаболическая, дезагрегационная) с курсами восстановительной терапии, включающей ЛФК и массаж. Неудовлетворенность результатами консервативного лечения очаговой церебральной ишемии послужила причиной поиска альтернативных, главным образом, хирургических методов коррекции мозгового кровообращения. Одним из предложенных методов хирургического лечения таких патологий было применение сальника. Экспериментальные исследования показали, что сальник приобретает пластичность, свойство абсорбировать жидкость и микрочастицы, способность к сращению с травмированной и воспаленной поверхностью, к гемостазу, к врастанию и реваскуляризации, к фагоцитозу и иммунологическому реагированию [10, 192, 219]. Экспериментальные исследования доказывают, что между трансплантированным сальником и подлежащим головным мозгом развиваются сосудистые анастомозы, через которые открывается дополнительный источник церебрального кровоснабжения [33, 131, 136, 142, 205]. Экспериментальные исследования также свидетельствуют, что сальник может обеспечить регионарный кровоток мозговой ткани на уровне 75 % от нормального [149]. Рядом авторов описано применение трансплантации сальника при лечении очаговой церебральной неврологического исследованиях ишемии дефицита после [139]. вышеперечисленных Однако, литературных [33, 71, 139, трансплантации 149, 240]. сальника как свидетельствуют данных, трансплантация Снижение отмечено в результаты сальника не позволяет эффективно купировать неврологический дефицит. Кроме этого, применение большого сальника является дополнительной инвазивной 26 манипуляцией, которая увеличивает продолжительность операции и сказывается на общем состоянии пациента. 1.3. Экспериментальные модели сосудистых поражений головного мозга Моделирование повреждений головного мозга на экспериментальных животных является важным экспериментальным методом нейрохирургических исследований, поскольку позволяет изучать патогенез цереброваскулярных расстройств, обосновать новые терапевтические стратегии и оценить безопасность и клиническую эффективность разработанных приемов лечения. На данный период времени описано много разнообразных методик по формированию церебральной ишемии головного мозга (ИГМ) у животных, что является бесценным вкладом в изучение патогенеза ИГМ. Доминирующими в экспериментальных работах являются искусственно вызванные нарушения мозгового кровообращения артериального характера, в том числе и глобальная ишемия головного мозга. Имеются отдельные экспериментальные работы по формированию поражений головного мозга, индуцированных смоделированным нарушением и венозного кровотока. Так, например, Минакина [34, 35] предложила способ формирования глобальной ишемии мозга (ГИШ) у мышей. Для получения ГИШ мышам вводили внутрисердечно 50 мкл 0,5 М водного раствора калия хлорида, который угнетал автоматизм и сократительную способность миокарда вплоть до остановки сердца. Данная модель, по мнению автора, открывает новые подходы для лечения глобальной ишемии мозга и крыс. В работе Багметова [4] описывается модель преходящей тотальной ишемии головного мозга. Животным (крысам) под наркозом производилось десятиминутное пережатие общих сонных артерий в сочетании с гипотонией (50 мм. рт. ст.), вызванной путем геморрагии методом кровопускания. Тотальная преходящая ишемия головного мозга сопровождается характерными изменениями кровотока в коре головного мозга. В результате окклюзии общих сонных артерий 27 и кровопускания имело место значительное уменьшение локального мозгового кровотока. Трофименко и др. [36] предложили модель церебральной ишемии у крыс посредством коагуляции средней мозговой артерии (СМА). Оригинальная методика авторов заключалась в следующем: производилось выделение и перевязка шелковой нитью правой общей сонной артерии, далее выполняли разрез кожи по ходу скуловой кости (около 2,5 см) справа. Осуществляли подход к овальному отверстию и отверстию зрительного бугра. В данной области накладывали фрезевое отверстие диаметром 3 мм, обнажали место расположения СМА, последнюю пережигали. После чего восстанавливали топографию мышц и мягких тканей. Ишемическое повреждение создавали необратимой окклюзией левой ветви СМА и подходящей к ней вены с одновременной перевязкой ипсилатеральной сонной артерии [54] для стабилизации размера области поражения. Трепанацию осуществляли на латеральной стороне лобной кости с левой стороны в зоне расположения центрального ствола СМА. Далее проводили необратимую окклюзию левой ветви СМА проксимальнее места ее бифуркации на фронтальную и париетальную ветви, а также рядом расположенной мозговой вены до ее пересечения с артерией. Сразу после коагуляции перевязывали сонную артерию лигатурой. Известен способ моделирования фокальной ишемии у наркотизированных крыс путем лигирования СМА через трепанационное отверстие, выполненное в том месте, где артерия пересекает носовую расщелину [225]. Описана модель экспериментального геморрагического инсульта у крыс [84, 135]. Под общим наркозом животное фиксировали на спине и проводили катетеризацию правой бедренной артерии. Далее животное фиксировали в стереотаксической установке, проводили разрез кожи головы, скальпирование черепа и накладывали фрезевое отверстие диаметром 1,0 мм по координатам 0,2 мм кпереди и 3 мм вправо от брегмы. Затем проводили забор 1 мл крови из бедренной артерии животного. Введение аутологичной крови осуществляли на глубину 5,5 мм 28 при помощи иглы с закругленным концом, после чего иглу извлекали и рану ушивали. Данная методика является проверенным и широко используемым методом изучения течения геморрагического инсульта. Существует ряд способов формирования очагового поражения головного мозга венозного характера [87, 111, 213]. После трепанации черепа тромбоз ВСС головного мозга у крыс индуцировали методом нанесения хлорного железа. При этом сразу после применения хлорного железа на ранних стадиях формировался цитотоксический отек головного мозга, а затем вазогенный отек, связанный с реканализацией ВСС. Настоящая экспериментальная модель, по мнению авторов, проста и легко выполнима. Описана модель нарушения венозного кровообращения путем окклюзии корковых вен и средней трети верхнего сагиттального синуса у домашних свиней. В среднею треть ВСС вводили баллон, управляемый с помощью катетера, закрывая полностью просвет синуса, после чего проводили дополнительные инъекции 1 мл фибринового клея в ВСС, что приводило к обструкции мостовых и корковых вен. Все эти изменения были подтверждены данными ангиографии [203]. Похожая модель окклюзии ВСС была предложена Wang et al. [88]. Тромбоз у крыс вызывался медленными инъекциями тромбогенного агента в ВВС с помощью микрокатетера, развитие тромбоза подтверждалось МРТ и, по данным авторов, окклюзия сохранялась в течение 4 недель. Предложен еще один способ тромбоза ВСС у крыс путем эмболизации последнего самодельным пластиковым трансплантатом, который вводился в просвет синуса [133]. Каждый пластиковый трансплантат имел длину 0,4 см, с наибольшим диаметром конического переднего сегмента 0,12 см, а задний сегмент постепенно утончался и уплощался до ширины 0,2 см и длины 0,1 см. По данным авторов, новая модель тромбоза ВСС является легко воспроизводимой и достоверной. Все вышеперечисленные способы формирования очага поражения головного мозга как артериального, так и венозного характера, имеют один общий недостаток – формирование нестойкой неврологической симптоматики, которая в течение недельного времени практически регрессирует. Нам же, с 29 целью изучения влияния МСК на восстановление функции головного мозга при очаговом его поражении, обусловленном венозной ишемией, необходима экспериментальная модель, вызывающая у крыс развитие стойкого и грубого неврологического дефицита. 1.4. МСК в лечении очаговых повреждений головного мозга у экспериментальных животных 1.4.1. Регенеративный ответ в ЦНС как новая мишень в лечении повреждений головного мозга На протяжении длительного времени считалось, что поврежденная нервная ткань не восстанавливается. Тем не менее, исследования 2-х последних десятилетий показали, что ЦНС также подвержена репаративной регенерации, хотя и в меньшей степени, чем другие ткани. Во-первых, выяснилось, что в головном мозге присутствуют нейральные стволовые клетки, которые сосредоточены в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и зубчатой извилине гипокампа [156, 202,]. При повреждении головного мозга эти клетки могут мигрировать в зону повреждения и дифференцироваться в нейроны и глиальные клетки [134, 176]. Во-вторых, стало очевидно, что важнейшим механизмом репарации является реорганизация нейронной сети – т.е. изменение количества и длины нейритов и установление новых синаптических связей – явление, получившее обязательным название компонентом нейропластичности репарации [216]. является Кроме того, восстановление гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и образование новых сосудов за счет ангио- и васкулогенеза [172, 238]. Способность ЦНС к репарации позволила предположить, что репаративный её ответ при сосудистых повреждениях головного мозга может являться новой мишенью терапевтических воздействий. Поэтому за последние годы произошло существенное смещение интереса от исследований в области нейропротекции к исследованиям нейрорегенеративных 30 подходов, среди которых наибольший интерес представляют клеточные технологии. Перспективы использования клеточных технологий связывают, прежде всего, с тем, что данный подход может расширить терапевтическое окно. Вторым моментом является то, что клеточная терапия может быть одновременно направлена против нескольких мишеней, что позволит повысить результативность лечения. 1.4.2. МСК как перспективные кандидаты для клеточной терапии повреждений головного мозга Выявленное участие НСК в репарации ЦНС послужило основой для экспериментальных исследований, которые в первую очередь были сосредоточены на стволовых клетках (СК). В настоящее время по происхождению СК разделяются на эмбриональные и соматические. Первые выделяют из внутреннего слоя бластоцисты, вторые – из органов и тканей человека (постнатальные СК) или плода (фетальные СК). СК у взрослого человека присутствуют во всех органах и тканях, в том числе ЦНС. Среди них наиболее доступными и изученными являются СК костного мозга, обеспечивающие регенеративный резерв организма [96]. Костный мозг содержит как минимум три типа предшественников – гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), МСК и эндотелиальные предшественники (ЭП). ГСК дают начало всем типам клеток крови, ЭП – клеткам эндотелиального ряда, МСК дифференцируются в клетки мезенхимальных тканей. Среди них МСК привлекают особое внимание в качестве кандидатов для клеточной терапии при повреждениях ЦНС в силу ряда их биологических свойств [208]. МСК были впервые обнаружены отечественным исследователем А.Я. Фриденштейном и описаны как адгезивные клетки костного мозга, способные к самообновлению. Свое название они получили благодаря возможности дифференцировки в различные виды клеток (остеоциты, адипоциты, хондроциты и др.) в рамках мезенхимальной линии [140]. Хотя впервые эти 31 клетки были выявлены в костном мозге, впоследствии выяснилось, что МСК могут быть выделены из жировой ткани, скелетных мышц, пульпы зуба, плаценты, амниотической жидкости, вартонова студня и пуповинной крови [171, 197, 209]. Предполагается также, что в организме нативные формы МСК могут быть представлены периваскулярными перицитами, локализованными во всех органах и тканях, а периваскулярные ниши являются естественным микроокружением для МСК в различных тканях [198, 199]. В 2006 году Международное общество по клеточной терапии предложило три «минимальных» критерия для идентификации МСК. Первый – это адгезия к пластику и фибробластоподобная морфология; второй – характерный иммунофенотип, т.е. более 95 % МСК должны нести на поверхности стромальные маркеры CD105, CD73 и CD90 и менее 2 % – экспрессировать линейные маркеры гемопоэтических клеток (CD45), стволовых кроветворных клеток (CD34) и линейные маркеры лимфоцитов или моноцитов; и третий – способность к трилинейной дифференцировке в остеобласты, хондробласты и адипоциты [193]. Исследование биологической активности МСК показало, что МСК обладают целым рядом привлекательных свойств [102, 189]: 1) относительно легко выделяются из различных тканей; 2) быстро разращиваются в культуре in vitro; 3) обладают низкой способностью к спонтанной дифференцировке при экспансии ex vivo; 4) способны мигрировать в очаг повреждения/воспаления, что позволяет использовать не только локальный, но и системный (внутривенный) путь введения клеток; 5) иммунологически интертны, что дает возможность использовать не только аутологичные, но и аллогенные МСК; 6) обладают противовоспалительной, иммуносупрессивной активностью; 7) секретируют множество трофических факторов, способных стимулировать рост различных клеток и обладающих противовоспалительной, антиапоптотической и антифибротической активностями; 32 8) характеризуются достаточно высокой пластичностью и могут в определенных условиях дифференцироваться в клетки тканей экто- и мезодермального происхождения. Способность МСК к миграции в зону повреждения обусловлена экспрессией этими клетками различных хемокинов и хемокиновых рецепторов. Основными факторами, которые сопровождают любое повреждение и обеспечивают миграцию МСК, являются воспаление и гипоксия [105, 152, 200]. Клетки в зоне повреждения продуцируют различные цитокины, хемокины и ростовые факторы, которые привлекают МСК через взаимодействие с соответствующими рецепторами на поверхности клеток. Ключевая роль в миграции МСК отводится взаимодействию хемокинового рецептора CXCR4 на МСК с его лигандом SDF-1 [128, 175]. В адгезии МСК к эндотелию принимают участие молекулы E- and P-selectin, CD44, и VCAM-1 [185]. Миграция МСК в зону повреждения может также опосредоваться через взаимодействие высвобождаемого апоптотическими и некротическими клетками фактора роста гепатоцитов (HGF) с рецептором c-Met на МСК [148]. Иммуносупрессорные свойства МСК были впервые обнаружены по способности этих клеток ингибировать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов. Впоследствии было показано, что МСК также подавляют функции В-лимфоцитов и способствуют генерации регуляторных Т-клеток. Супрессорная активность МСК опосредуется с вовлечением самых разнообразных механизмов – продукцией имммуносупрессивных факторов (IL-6, TGF-b, HGF, IL-10, PGE-2, NO), индукцией IDO и появлением на МСК ингибиторных молекул B7-H1, индуцирующих гибель Т-клеток при взаимодействии с PD1-лигандом, а также генерацией регуляторных Т-клеток [158]. Особо следует отметить способность МСК продуцировать исключительно большое количество растворимых факторов, включающих плейотропные ростовые и нейротрофические факторы, колониестимулирующие факторы, иммунорегуляторные цитокины, хемокины, металопротеиназы и их ингибиторы, а также белки внеклеточного матрикса [208, 224]. 33 1.4.3. Влияние МСК на неврологическое восстановление в моделях ишемического инсульта Основной целью экспериментальных исследований МСК в моделях инсульта явилась оценка безопасности и переносимости клеточной терапии и оценка клинического эффекта. Обобщенные в недавних обзорах результаты доклинических исследований МСК [123, 150, 210] позволили заключить, что внутривенное [228], интраартериальное и интрацеребральное введение МСК в модели окклюзии СМА [164, 227] является безопасным и не вызывает тяжелых токсических реакций и осложнений. При этом введение МСК сопровождается улучшением функционального восстановления, что проявляется повышением моторной активности, улучшением поведенческих реакций и когнитивных функций [89, 127, 153, 227, 228]. Важно наблюдается отметить, как при что восстановление неврологических функций интрацеребральном/внутрижелудочковом, так и внутрисосудистом введении клеток [165, 228, 234]. Более того, в ряде исследований было показано, что внутривенное введении клеток является более эффективным по сравнению с интрацеребральной имплантацией МСК [168]. Еще одним важным моментом является тот факт, что функциональное улучшение наблюдалось как при введении МСК в остром периоде (на 1–2-е сутки после окклюзии СМА, так и в более отдаленные сроки, – соответствующие подострой (через 1 неделю) и хронической (через 1 мес.) стадиям инсульта [141, 163, 226]. Исследования на животных также продемонстрировали, что МСК способны мигрировать в зону повреждения и этот процесс зависит от экспрессии хемокина SDF-1, экспрессируемого астроцитами, нейронами и эндотелиальными клетками в зоне микроокружения [226]. Причем миграция и интеграция МСК в зоне повреждения обнаруживается не только при интрацеребральном, внутривенном или интраартериальном введении [13, 63, 161, 162]. но и 34 1.4.4. Механизмы, лежащие в основе эффекта МСК Механизмы, посредством которых трансплантируемые клетки улучшают неврологическое восстановление, окончательно не ясны. Ранние экспериментальные исследования объясняли позитивный клинический эффект способностью МСК дифференцироваться в нервные клетки [92, 93]. Действительно, в 1997 г. Eglitis et al. [130] впервые сообщили о возможности нейрональной дифференцировки МСК мозга in vivo. Позднее были опубликованы результаты исследования, в котором клетки костного мозга генетически маркировали зеленым флюоресцентным белком, а затем трансплантировали облученным мышам. Мозговые срезы окрашивались специфическими антителами против различных нервных клеток (антителами против нейрон-специфической энолазы для выявления нейронов; антителами против глиофибриллярного кислого белка (GFAP) для выявления астроцитов; антителами к карбоангидразе II (CaII) для идентификации олигодендроцитов и ионизированной кальций-связывающей адаптерной молекулой 1 (Iba1) – для выявления клеток микроглии). Через 12 недель после прямой инъекции пересаженные клетки окрашивались антителами против GFAP, Caii и Iba1, а через 24 недели они экспрессировали только Iba1. На основании этих данных авторы сделали заключение, что стволовые клетки костного мозга способны дифференцироваться в олигодендроциты, астроциты и микроглию при воздействии на них мозговой микросреды [120]. Также в экспериментальных исследованиях была продемонстрирована возможность дифференцировки трансплантированных МСК в нейрогенном и глиальном направлениях в головном мозге. Так, меченные зеленым флуоресцентным белком GFP МСК при внутривенном введении мигрировали в зону пенумбры, после чего часть этих клеток начинала экспрессировать нейрогенный маркер NeuN, а часть – глиальный фибриллярный кислый белок GFAP. На этом основании авторы предположили, что введенные МСК могут дифференцироваться в нейроны и глиальные клетки [91, 169]. 35 Однако незначительное количество интегрированных в очаге повреждения МСК, быстрый клинический эффект и возможность в ряде исследований получить его при замене трансплантируемых клеток их факторами позволили предположить, что клеточное замещение вряд ли является ведущим механизмом функционального восстановления. Кроме того, многие последующие исследования, выполненные с привлечением конфокальной микроскопии, не смогли воспроизвести феномен трансдифференцировки МСК, и интерпретировали предшествующие результаты как технические артефакты. Поэтому сегодня неврологическое улучшение связывают в большей степени с трофическим и иммуномодулирующим эффектами МСК [91]. Трофическая поддержка при повреждениях ЦНС направлена на обеспечение нейропротекции, стимуляцию нейрорегенерации и ангиогенеза и опосредуется с участием широкого спектра цитокинов и ростовых факторов при их взаимодействии с нервными, эндотелиальными и иммунными клетками. МСК продуцируют нейтротрофические (BDNF, GDNF, NGF, IGF-1, нейротрофины 4/5), плеотропные ростовые (HGF, PDGF, FGF-2, SCF, PDGF, ВМР, TGF-β, SDF), колониестимулирующие (G-CSF, GM-CSF, M-CSF) и ангиогенные факторы (VEGF, ANG1, ANG-2, bFGF, IL-6, MCP-1), иммунорегуляторные цитокины (IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-11, IL-13, TNF-a, IFN-γ), хемокины (MCP-1, IL-8, MIP-1β, RANTES), металопротеиназы и их ингибиторы, а также белки внеклеточного матрикса (коллаген, фибронектин, ламинин, перлекан, декорин). Среди них многие факторы способны оказывать антиапоптотический эффект; активировать миграцию, пролиферацию и дифференцировку нейральных стромальных клеток, нейритогенез и синаптогенез, усиливать ангиогенез и способствовать восстановлению гематоэнцефалического барьера [155, 157, 187, 214, 218]. Иммуномодулирующий эффект направлен на ограничение воспалительного ответа, который при избыточной выраженности или длительной персистенции может оказывать нейротоксический эффект на ткани мозга [143, 211]. Поскольку меньшее воспалительное микроокружение способствует репаративной 36 нейрорегенерации, иммуномодуляция является еще одним механизмом позитивного эффекта МСК на неврологическое восстановление. Действительно, экспериментальные исследования в моделях окклюзии средне-мозговой артерии показали, что введение МСК сопровождается снижением экспрессии маркеров апоптоза в зоне повреждения и улучшением выживаемости нервных клеток [153, 154, 160, 166, 229]. Многочисленными исследованиями также показано, что трансплантация МСК в модели ишемического инсульта активирует нейрорегенерацию (активацию нейральных стволовых клеток, нейрито/синаптогенез) и ангиогенез [106, 153, 154, 160, 186, 233]. Кроме того, внутривенное введение МСК крысам с очаговой ишемией головного мозга, как в острую, так и хроническую фазу приводит к уменьшению размеров глиального рубца [141, 188]. Схожие данные получены авторами [125], которые показали снижение количества нейрокана и усиление аксонального роста в зоне пенумбра у крыс с очаговой ишемией после трансплантации. Важно отметить, что в силу отсутствия адекватных и хорошо воспроизводимых моделей нарушений венозного кровотока, эффективность МСК в восстановлении нервной ткани при повреждениях венозного генеза остается неизученной. Согласно рекомендациям STEPS-I (“Stem Cell Therapies as an Emerging Paradigm in Stroke”), одним из препятствий на пути трансляции клеточных технологий в клиническую практику является недостаточное количество экспериментальных моделей сосудистых расстройств, приближенных по патогенезу к повреждениям головного мозга у человека [222]. С этой точки зрения разработка новых моделей сосудистых повреждений головного мозга, характеризующихся тяжестью неврологических расстройств и низким уровнем естественного восстановления, и исследование возможностей применения МСК для купирования неврологического дефицита в указанных моделях является актуальной научно-практической задачей, решение которой может ускорить клиническое внедрение новых методов лечения в области нейрохирургии. 37 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Объект исследования Для экспериментальных исследований было отобрано 97 белых крыс породы Wistar с массой тела от 210 до 220 граммов. Возраст животных находился в пределах 3–4 месяца. Они содержались в условиях вивария Новосибирского НИИТО, в клетках по 2 особи. Животные получали пищу 3 раза в день, питьевая вода находилась в клетках круглосуточно. Чистка клеток и мойка посуды производилась ежедневно в моечном отделении вивария. Животные были распределены по группам и сериям в соответствии с целями и задачами исследования (таблица 1). Все исследования выполнялись с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации. В частности, содержание лабораторных животных и экспериментальные конвенцией по работы защите проводилось в соответствии позвоночных животных, с Европейской используемых для экспериментальных и других научных целей и приказом Министерства Здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных экспериментальных животных». форм работы с использованием 38 Серия Таблица 1 – Распределение экспериментальных животных по сериям и группам № группы Кол-во животных 1 8 2 8 3 16 S2 S3 S4 Всего Исследуемые группы Контрольные группы S1 1 8 2 8 3 6 4 6 5 6 6 6 1 6 2 8 3 8 1 3 97 Тип хирургического вмешательства коагуляция верхнего сагиттального синуса коагуляция корковых вен в теменно-височной области коагуляция сагиттального синуса + коагуляция корковых вен в левой теменновисочной области. трепанация + моделирование ПГМ трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера трепанация + моделирование ПГМ трепанация + моделирование ПГМ трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера резекционная трепанация трепанация + моделирование ПГМ трепанация + моделирование ПГМ трепанация + моделирование ПГМ Клеточная терапия Время введения клеток Путь введения клеток - - - - - - - - - - - - - - - + 1 сутки в/в + 7 сутки в/в + 1 сутки местно + 7 сутки местно - - - - - - + 1 сутки в/в - - - 39 2.2. Методика моделирования очагового нарушения венозного кровообращения головного мозга у экспериментальных животных Операции по моделированию очаговых ПГМ, обусловленных нарушением венозного кровотока, проводились в условиях экспериментальной операционной с соблюдением правил асептики и антисептики. В качестве анестезиологической поддержки использовалось внутрибрюшинное введение раствора кетамина (125мг/кг). Операционное поле экспериментального животного выбривалось от краниовертебрального перехода до линии глаз по длине и на уровне ушных раковин по ширине. Животное фиксировалось на операционном столике. Зону операционного поля обрабатывали 70% этиловым спиртом двукратно и изолировали с помощью стерильных салфеток, прикрепляемых к коже цапками. При выполнении инструментарий и операций операционная использовался оптика с микрохирургический пятикратным увеличением (бинокулярная лупа, Carl Zeiss, Germany). Выполнялся дугообразный разрез мягких тканей в левой теменно-височной области с заходом за среднюю линию. Кожно- апоневротический лоскут отводился, прошивался двумя лигатурами и фиксировался на держалках. Височная мышца выделялась и отводилась в сторону кожно-апоневротического лоскута, кость скелетировалась. Используя шаровидный бор, в левой теменной области с помощью стоматологической электродрели накладывалось фрезевое отверстие, после чего проводилась резекционная трепанация черепа в левой теменной-височной области с заходом за среднюю линию на 0,2–0,4 см, обнажая тем самым ВСС. Трепанация осуществлялась с использованием разработанного нами оригинального инструмента, на который получен патент РФ «Устройство для резекционной трепанации черепа» Патент № 2467714 РФ, авторы Васильев И.А., Самохин А.Г., Ступак В.В., Кузьмин А.В. Дальнейшие манипуляции на головном мозге выполнялись в зависимости от методики формирования очага нарушения венозного кровообращения. 40 Для отработки оптимальной модели очагового поражения мозга венозного характера была сформирована серия S1 животных, состоящая из 3-х экспериментальных групп. Суммарное число крыс в серии S1 составляло 32 (таблица 2). Таблица 2 – Распределение экспериментальных животных серии S1 по группам при отработке модели очагового поражение мозга венозного характера Группа Кол-во животных 1 8 2 8 3 16 Всего Вид хирургического вмешательства трепанация + коагуляция верхнего сагиттального синуса трепанация + коагуляция корковых вен в левой теменно-височной области трепанация + коагуляция верхнего сагиттального синуса + коагуляция корковых вен в левой теменно-височной области 32 В первой группе животных серии S1 крысам проводилась только биполярная коагуляция в средней трети ВСС. Подобная манипуляция приводила к отеку головного мозга, что проявлялось резким напряжением твердой мозговой оболочки в зоне трепанации и исчезновением пульсации мозга. В проекции коагулированного ВСС укладывался серджисел с целью профилактики кровотечения. У животных второй группы серии S1 дополнительно иссекалась твердая мозговая оболочка в левой теменно-височной области на площади 1,0 см2 и выполнялась только прецизионная биполярная коагуляция венозных корковых сосудов на площади 1,0–1,0 см2. Это приводило к формированию умеренно выраженного отека головного мозга в зоне трепанационного дефекта. Головной мозг в зоне дефекта твердой мозговой оболочки от мягких тканей отграничивали пластинкой серджисела. В третьей группе животных серии S1 формирование очага нарушения венозного кровообращения проводилось путем сочетанного выключения из кровотока ВСС (облитерация с помощью биполярной коагуляции) в средней его трети и последующей прецизионной коагуляцией венозных корковых сосудов в 41 левой теменно-височной области на площади 1,0–1,0 см2 биполярным пинцетом. Все это приводило к выраженному диффузному отеку головного мозга и значительному пролабированию его в костный дефект. Теменно-височная область, а так же проекция коагулированного ВСС от мягких тканей была ограничена пластинкой серджисела. В завершении операции всем крысам на мягкие ткани накладывали послойно швы. В течение 48-и часов животных содержали при температуре воздуха 32 °С для предотвращения переохлаждения. В дальнейшем крысы содержались в стандартных условиях вивария. Итак, возникающие макроскопические изменения головного мозга при различных методиках формировании очагового повреждения его у крыс убедили нас в том, что именно сочетанное выключение из кровотока ВСС и коагуляция корковых вен в левой теменно-височной области является наиболее оптимальным и приводит в нем к максимальным морфологическим изменениям. 2.3. Характеристика сформированных групп Все животные второй серии S2 были разделены на две контрольные группы (16 крыс) и четыре группы исследования (24 животных), таблица 3. У животных первой контрольной группы формировался по разработанной оригинальной методике очаг нарушения венозного кровообращения путем выключения из кровотока ВСС биполярной коагуляцией в средней его трети и последующей прецизионной коагуляцией венозных корковых сосудов в левой теменно-височной области на площади 1,0–1,0 см2. После формирования очага нарушения венозного кровообращения левая теменно-височная область, а так же проекция коагулированного ВСС была изолирована от мягких тканей пластинкой серджисела. Операцию заканчивали накладыванием на мягкие ткани черепа швов, которые были проклеены коллодием. 42 Таблица 3 – Распределение животных серии S2 по группам Исследуемые группы Контрольные группы № группы Кол-во животных Хирургическое вмешательство Клеточная терапия Время введения клеток Путь введения клеток 1 8 трепанация + моделирование ПГМ – – – 2 8 трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера – – – 3 6 трепанация + моделирование ПГМ + 1 сутки в/в 4 6 трепанация + моделирование ПГМ + 7 сутки в/в 5 6 трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера + 1 сутки местно 6 6 трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера + 7 сутки местно Итого 40 Согласно данным литературы внутривенный путь введения клеток является одним из наиболее доступных и наименее инвазивных способов доставки клеток. Наличие сигналов хоминга в острый и подострый периоды обеспечивает направленную миграцию клеток в зону повреждения [175]. Однако недостатком внутривенного способа введения является относительно небольшое количество клеток, интегрированных в зоне повреждения. С этой точки зрения местное введение МСК позволяет доставить большее количество клеток в очаг, но при этом, оно будучи инвазивным, может обладать дополнительным повреждающим действием. Для проверки данной гипотезы у животных второй контрольной группы серии S2 исследовалось влияние инородного тела – полихлорвинилового катетера – на сформированный очаг нарушения венозного кровообращения головного мозга. Через этот катетер, имплантированный под кожу животного, предполагалось местное введение МСК. Для этого, после выполнения основного этапа операции, дополнительно к височной мышце подшивался 43 полихлорвиниловый катетер длинной 1,5–2,0 см, центральный конец которого подводился к очагу поражения мозга. С целью предотвращения инфицирования катетера его проксимальный конец заводился под кожно-апоневротический лоскут. Рана зашивалась наглухо. Спустя 7 дней проводилась реоперация и катетер удалялся. В качестве анестезиологической поддержки использовалось внутрибрюшинное введение раствора кетамина (125 мг/кг). Зона операционного поля обрабатывалась 70% этиловым спиртом двукратно и изолировалась с помощью стерильных салфеток, прикрепляемых к коже цапками. Далее под пятикратным увеличением снималась часть швов, разводились края раны, выделялся и удалялся полихлорвиниловый катетер. Кожа ушивалась вторичными швами, которые были проклеены коллодием. Данные животные были контрольными по отношению к животным групп исследования № 5 и № 6 серии S2. У животных серии S2, предназначенных для экспериментов (группы 3–6, всего 24 особи – см. таблицу 3), изучалось влияние трансплантации МСК на восстановление функции головного мозга после формирования очага нарушения венозного кровообращения. Животным групп № 3 и № 4 серии S2 проводили экспериментальное ПГМ по разработанной методике – путем выключения с помощью биполярной коагуляции из кровотока средней трети ВСС и последующей прецизионной коагуляцией венозных корковых сосудов в левой теменно-височной области на площади 1,0–1,0 см2. После этого теменно-височная область, а так же проекция зоны коагулированного ВСС с помощью пластинки серджисела изолировалась от мягких тканей, а на кожу накладывались швы, которые были проклеены коллодием. В дальнейшем животным группы № 3 серии S2 в хвостовую вену проводилась трансплантация МСК (2х106 клеток/животное) на 1-е сутки, а крысам группы № 4 – на 7-е сутки (2х106 клеток/животное) с момента ПГМ. В группах исследования № 5 и № 6 этой же серии изучалось влияние местного введения МСК через полихлорвиниловый катетер. После 44 моделирования нарушения церебрального венозного кровообращения к височной мышце подшивался полихлорвиниловый катетер по методике, описанной для контрольной группы № 2 серии S2. Далее в группе № 5 на следующие сутки, а в группе № 6 на 7-е сутки после моделирования нарушения церебрального венозного кровообращения проводилось однократное введение МСК (2х106 клеток/животное) через имплантированный катетер также по описанной ранее методике для контрольной группы № 2 серии S2. Для объективной инструментальной оценки функционального состояния мозга у 22 оперированных животных при естественном и индуцированным восстановлении функции головного мозга путем введения МСК, регистрировались корковые ССВП. Эти животные образовали 3-ю серию экспериментов S3. Она состояла из 3-х групп (таблица 4). Таблица 4 – Распределение животных серии S3 по группам при регистрации ССВП № группы Кол-во животных Характер хирургического вмешательства Клеточная терапия 1 6 Резекционная трепанация - 2 8 трепанация + моделирование ПГМ - 3 8 трепанация + моделирование ПГМ в/в на 1 сутки Всего 22 С целью объективизации функционального состояния головного мозга у 22-х оперированных крыс, входящих в серию S3, регистрировались корковые ССВП. У 14-и оперированных крыс групп № 1 и № 2 серии S3 с естественным восстановлением функции головного мозга регистрировались в динамике корковые соматосенсорные вызванные потенциалы (ССВП). У 6-и крыс группы № 1 данной серии проводилась только резекционная трепанация черепа с сохранением целостности твердой мозговой оболочки. 45 Коагуляции корковых вен и пересечения верхнего сагиттального синуса не проводилось, на кожу накладывались швы. В группе № 2 8-и крысам по нашей методике формировали очаговое повреждение головного мозга венозного характера путем коагуляции верхнего сагиттального синуса с последующей коагуляцией корковых вен в левой теменновисочной области и исследовали динамику самопроизвольного восстановления неврологического дефицита. В группе № 3 у всех 8-и животных после моделирования нарушение церебрального венозного кровообращения путем коагуляции верхнего сагиттального синуса в средней трети и корковых вен в левой теменно-височной области, на 1-е сутки с момента постановки эксперимента вводили внутривенно МСК. Все животные в течение первой недели послеоперационного периода получали антибактериальную терапию в виде Sol. Enroxili 5 % – 0,05 мг 1 раз в сутки внутримышечно. Кормление животных осуществлялось сбалансированной смесью «Нутрикомп» через пипетку. Крысам, не способным принимать пищу самостоятельно или через пипетку, проводили инъекции физиологического раствора в дозировке 3–4 мл/сут. На 7-е, 14-е либо 21-е сутки после моделирования ПГМ животные выводились из эксперимента путем ингаляционного введения летальной дозы диэтилового эфира. 2.4. Оценка повреждений головного мозга, индуцированных нарушением венозного кровотока Оценка повреждений головного мозга, индуцированных нарушением венозного оттока, проводилась на основании комплексных исследований, включающих клинико-неврологические проявления, нейрофизиологический контроль ССВП и нейровизуализационные данные МРТ головного мозга. Наряду с оценкой неврологического статуса и его динамики оценивался внешний вид 46 животных, контролировалась потеря массы тела, состояние волосяного покрова, наличие или отсутствие трофических нарушений. После выведения животных из эксперимента проводились морфологические исследования ткани головного мозга. 2.4.1. Оценка неврологического статуса животных В соответствии с планом исследования, оценку неврологического статуса животных проводили на 1-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки после моделирующих воздействий. Состояние животных анализировали с помощью модифицированной нами шкалы оценки тяжести неврологических нарушений (ОТНН) [228] (таблица 5). По шкале ОТНН Chen итоговый балл формируется как сумма баллов за каждый из четырех групп тестов, оценивающих, соответственно, двигательную активность, чувствительность, способность к равновесию, отсутствие нормальных рефлексов и патологических движений. Суть нашей модификации этой шкалы заключалась во введении в нее двух дополнительных тестов, характеризующих мышечный тонус животных и их способность к самостоятельному приему пищи. В результате этого максимальная выраженность неврологического дефицита по модифицированной шкале достигала 26 баллов. Перед проведением тестов животному предоставлялась полная свобода: оно извлекалось из клетки и помещалось на стол размерами 90х160 см; процедура занимала 3–4 мин. Тяжесть неврологического дефицита в исследуемых группах выражалась в виде среднего балла ОТНН и ошибки среднего. Кроме того, при анализе определялся показатель, характеризующий степень снижения неврологического дефицита, рассчитанный по формуле [1 – (ОТНН на 7-е, 14-е или 21-е сутки)/(ОТНН на 1-е сутки))] x 100. 47 Таблица 5 – Модифицированная шкала оценки тяжести неврологических нарушений у крыс Тесты Баллы Максимальный балл Тесты на двигательную активность При поднятии крысы за хвост 3 Сгибание передних конечностей 1 Сгибание задних конечностей 1 Поворот головы более чем на 10 градусов за 30 секунд 1 Передвижение крысы по полу 3 Нормальное передвижение 0 Отсутствие способности двигаться прямолинейно 1 Передвижение с поворотом в паретичную сторону 2 Падение в паретичную сторону при движении 3 Тесты на чувствительную активность 2 Реакция опоры (визуальный и тактильный тест) 1 Проприорециптивный тест (глубокая чувствительность, 2 смещение лапы к краю стола для стимуляции мышц конечностей) Тест балансирования на приподнятой перекладине 6 Баланс с устойчивой позой 0 Плотное обхватывание краев перекладины 1 Зажимание перекладины и соскальзывание одной конечности с 2 перекладины Зажимание перекладины и соскальзывание двух конечностей с 3 перекладины или вращение (> 60 сек) Падение, несмотря на попытки балансировать (> 40 секунд) 4 Падение, несмотря на попытки балансировать (> 20 секунд) 5 Не может подняться, нет способности к балансировке 6 Отсутствие рефлексов и аномальные движения 4 Рефлекс ушной раковины (потряхивание головой при 1 прикосновении к слуховому проходу) Корнеальный рефлекс (моргание глазом при легком 1 прикосновении к роговице) Шумовой рефлекс (двигательная реакция в ответ на короткий 1 шумовой эффект) Судороги, миоклонии, миодистонии 1 Тонус конечностей, хвоста 2 нормальный 0 высокий 1 низкий (вялый) 2 6 Питание самостоятельно (принимает все виды пищи) 0 самостоятельно (только жидкая пища) 2 принудительное питание (через пипетку) 3 отказ от приема пищи 6 Максимальное количество баллов 26 Примечание: 20–26 баллов – выраженное повреждение, 10–19 – умеренное повреждение, 1–9 – легкое повреждение. 48 2.4.2. Электрофизиологическая активность головного мозга крыс Для оценки функционального состояния мозга регистрировались ССВП на стимуляцию нервов передних конечностей с помощью электромиографа «Нейропак-2» (NIHON KOHDEN Corp., Япония). Полоса пропускания усилителя 1–500 Гц, чувствительность 2,5 мкВ/деление, эпоха анализа – 50 мсек, динамический диапазон амплитуд, при выходе за пределы которого сигналы подвергаются резекции, – 25 мкВ, среднее число усреднений для выделения устойчивого потенциала 200. Перед регистрацией ССВП крыс наркотизировали кетамином (125 мг/кг) интраперитонеально. Стимулирующие электроды, изготовленные с использованием малых хирургических игл, вводили подкожно в дистальную часть тыльной поверхности передней конечности, при этом анод располагали непосредственно над суставом, а катод – на 7–8 мм проксимальнее. Подобное расположение электродов приводило к стимуляции нервов, являющихся аналогом срединного нерва у человека [18]. Частота стимуляции составляла 3 цикла/сек, интенсивность стимулирующего тока, достаточная для вызова видимых движений, от 1,2 до 2,9 мА. Для регистрации ССВП использовали игольчатые электроды, специально переделанные из концентрических электродов для игольчатой миографии, при этом внутренние проводники подсоединялись к входам усилителя, а наружные к входу «земля» прибора, таким образом достигалось экранирование от электромагнитных помех. Активные отводящие электроды вводились под скальп гемисферы, контралатеральной стимулируемой конечности, на 4–5 мм латеральнее сагиттальной линии и на 1–2 мм кзади от линии, соединяющей уши животного, а референтные – по сагиттальной линии в лобной области [217]. Заземляющий электрод располагался на хвосте животного. Оценка нейрофизиологических показателей включала измерение амплитуды (в мкВ) и латентности (в мс) компонентов ССВП. Регистрация ССВП проводилась перед операцией, на 7-е, 14-е и 21-е сутки после формирования очага нарушения венозного кровообращения. 49 2.4.3. Магнитно-резонансная томография головного мозга крыс МРТ подопытных животных проводилась на расположенном в Центре коллективного пользования «SPF–виварий» ИЦиГ СО РАН сверхвысокопольном томографе «BioSpec 117/16» (Bruker, Germany) с напряженностью основного магнитного поля 11,7 Тл. В соответствии с планом исследования МРТ выполнялась несколько раз: до хирургической процедуры, на 3-е, 8-е, 14-е и 23-и сутки после нее. При проведении МРТ для синтеза различных видов изображений применялись несколько импульсных последовательностей. Изображения, полученные при помощи метода спинового эха RARE (быстрые импульсные последовательности с усилением релаксационного контраста), наиболее близки к Т2–взвешенным изображениям, а изображения, полученные при помощи импульсной последовательности FISP-3D, по характеристикам сигнала наиболее близки к протон-взвешенным (Pd–взвешенным). Церебральная МР-ангиография сосудов головного мозга выполнялась с использованием импульсной последовательности FLASH-TOF-2D-flow compensation (метод времяпролетной ангиографии). При помощи программного обеспечения томографа ParaVision 5.0. и функции 3D MIP (3d representation by Maximum Intensity Projection) реконструировались объемные изображения сосудов с матрицей 256 пикселей по каждой из трех осей. Позиционирование использованием животного входящего в проводили комплект стереотипически, оборудования с томографа специализированного стола типа «кроватка» (позиция животного – на животе) с водяным подогревом. Данное исследование проведено всем 3-м животным серии S4 (см. таблицу 1). 50 2.4.4. Морфологическое исследование головного мозга Головной мозг животных, содержащий участок повреждения, выдерживался в 10 % растворе нейтрального забуференного формалина не менее 2-х суток. Затем препарат обезвоживали в серии спиртов с возрастающей концентрацией и заключали в смесь парафина и воска. С помощью микротома готовили срезы толщиной 5–7 мкм. Срезы головного мозга изготавливали во фронтальной и сагиттальных плоскостях. Для изучения морфоцитоархитектоники срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином и заключали в канадский бальзам. Обозначение и размерность стереологических параметров, использованных в работе, приведены согласно рекомендациям Международного стереологического общества [56, 58]. Оценку гистологических препаратов производили методом световой микроскопией под увеличением 100–300. Макро- и микроскопическую картину поврежденного участка и приграничной области головного мозга оценивали на 1-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки после моделирования повреждения головного мозга. Морфологические исследования включали анализ дистрофических изменений, оценку характера рубцовой ткани и новообразования сосудов. Количественный подсчет различных структурных элементов нервной ткани (макрофагов, волокнистых астроцитов, отношения площади капилляров к площади вен) производили в 4-х полях зрения под увеличением 100–300 с вычислением их среднего числа. Для проведения иммуноморфологического исследования использовали методические рекомендации фирмы-производителя («Abcam», Англия). Перед проведением иммуногистохимического исследования приготовленные срезы депарафинизировали и производили демаскировку антигенов тканей в PT Link модуле (Dako, Дания) в цитратном буфере (pH 6,0), блокировали эндогенную пероксидазу 3%-м раствором Н2О2 и проводили протеиновый блок сывороткой. Далее инкубировали полученные срезы с первичными антителами (клон Vim, DAKO Дания). Для иммунного окрашивания использовали полимерную систему 51 детекции с пероксидазной меткой Великобритания). Заключительным гематоксилином. Микроскопическую Novolink этапом Polymer докрашивали картину («Novocastra», ядра поврежденного клеток участка и приграничной области головного мозга оценивали на 1-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки после моделирования повреждения головного мозга. 2.5. Генерация мезенхимальных стромальных клеток МСК получали из суспензии клеток костного мозга, аспирированных из бедренных костей животных, при культивировании прилипающей фракции в питательной среде DMEM (Sigma), содержащей 15 % эмбриональной телячьей сыворотки (ICN), при 37 °С в атмосфере 5 % СО2 до получения конфлюентного слоя. Пассирование МСК осуществляли с использованием 0,25 % раствора трипсина и 0,02 % раствора ЭДТА. МСК, использованные для введения животным, соответствовали Минимальным критериям, разработанным Комитетом по стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии (Dominici, 2006). Жизнеспособность вводимых клеток, определяемая по окраске трипановым синим, во всех экспериментах превышала 93 %. МСК использовали для введения животным (рисунок 1). Рисунок 1 – Мезенхимальные стромальные клетки, сгенерированные из прилипающей фракции клеток костного мозга крысы. Окраска по Романовскому-Гимзе. 52 МСК вводили животным на 1-е и 7-е сутки в количестве 2х106 клеток/животное после моделирования разработанного очагового ПГМ либо внутривенно через хвостовую вену, предварительно погрузив хвост животного до основания в теплую воду (температура до 38,0–38,5 ºС), либо местно (через установленный катетер) числом 2х106 клеток/животное. 2.6. Статистическая обработка полученных результатов Для анализа данных использовался стандартный пакет программ Statistica 6.0. Данные были представлены в виде среднего значения со стандартной ошибкой среднего. Для сравнения межгрупповых показателей использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни для независимых выборок и PКЗ – критерий знаков для зависимых выборок. Различия рассматривали как статистически значимые при значении уровня достоверности р<0,05. 53 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Морфо-функциональная характеристика созданной экспериментальной модели очага нарушения венозного кровообращения головного мозга Очередным этапом дальнейшего исследования стала характеристика неврологических расстройств и возможность их самопроизвольного восстановления, наблюдаемых после моделирования очагового повреждения головного мозга вследствие нарушения венозного кровотока. Второй важной задачей явилось исследование морфологических изменений, лежащих в основе неврологических расстройств, по данным МР-томографического и гистологического исследований. 3.1.1. Характеристика общего состояния и неврологических выпадений при самопроизвольном восстановлении функции головного мозга животных До проведения повреждающего воздействия все интактные животные при визуальном обследовании характеризовались параллельной установкой стоп передних и задних лап; приподнятым положением головы, задней части туловища и хвоста; нормальным тонусом мышц тазового пояса, направленным на поддержание устойчивости туловища, координированностью движения, немедленным ответом на болевое и тактильное раздражение (в виде отдергивания раздражаемого участка и движения в сторону от самого раздражителя, либо попытке избавиться от раздражителя усилиями передних и задних лап при продолжительном раздражении). Анализ результатов оперативного вмешательства в группе животных № 1 серии S1 показал, что выключение из кровотока только ВСС путем его облитерации с помощью биполярной коагуляции характеризовалось для крыс относительно удовлетворительной животные этой в группе переносимостью. выживали и, начиная Все с оперированные первых суток 54 послеоперационного периода, самостоятельно принимали пищу и воду, что в совокупности с данными неврологического статуса позволяло оценить их состояние как средней степени тяжести. Оценка степени неврологического дефицита у животных этой группы показала, что в первые сутки после проведения эксперимента у всех особей развивались неврологические нарушения, проявляющиеся в виде легкого тетрапареза в лапах и атаксии. При этом сумма баллов по модифицированной шкале ОТНН составила 13,00 ± 0,67, что свидетельствовало об умеренной выраженности неврологического дефицита. К 7-м суткам очаговость неврологических нарушений существенно снижалась до 4,00 ± 0,69 баллов, соответствуя легкой степени выраженности. В дальнейшем (на 14-е и 21-е сутки) у животных неврологический дефицит практически полностью регрессировал, при этом, средние показатели значений неврологических выпадений составили, соответственно, 1,90 ± 0,22 и 1,00 ± 0,10 балла (рисунок 2). Балл ОТНН ( услов. един) 25 20 15 Гр 1 Гр 2 10 Гр 3 * 5 * * 0 * Сутки 1 Сутки 7 Сутки 14 * * Сутки 21 Рисунок 2 – Выраженность неврологических нарушений при экспериментальных нарушениях мозгового кровотока венозного характера в различные сроки наблюдения у животных первой серии. По оси абсцисс – сумма баллов неврологического дефицита по модифицированной шкале ОТНН; по оси ординат – сроки наблюдения. * – PU <0,05 – различия между группами 3 и 1, 3 и 2 достоверны. У крыс группы № 2 первой серии, у которых моделировалось нарушение венозного кровотока путем коагуляции корковых вен в левой височной области, в 55 раннем послеоперационном периоде развивалась очаговая неврологическая симптоматика, проявляющаяся в виде легкого правостороннего гемипареза, гиперестезии и неспособности к самостоятельному приему пищи в течение первых суток. Как видно (рисунок 2) исходный суммарный балл неврологического дефицита достоверно не отличался от такого в первой группе серии S1 и составлял 14,10 ± 0,35. Оценка выраженности неврологических расстройств в динамике наблюдения выявила снижение выраженности неврологической симптоматики вплоть до ее исчезновения. Так, уже на 7-е сутки суммарный балл по шкале ОТНН уменьшился до 7,80 ± 0,35, а к 14-м суткам – до 3,10 ± 1,07 баллов. Спустя три недели после операции он достиг минимального значения – 1,00 ± 0,09 балл. Погибших животных в этой группе не было. В третью группу серии S1 вошли 16 выживших крыс (50 % от общего количества). У всех этих животных оперативное вмешательство сразу же приводило к тяжелому состоянию и возникновению грубых неврологических нарушений. Сразу оговоримся, что в эксперимент не вошли погибшие животные и крысы, у которых общее состояние соответствовало средней степени тяжести. Их клинические результаты и морфо-функциональные данные не учитывались. На первые сутки послеоперационного периода у выживших животных наблюдался тетрапарез во всех конечностях, наиболее выраженный и доходящий в ряде случаев до гемиплегии на контрлатеральной стороне от повреждения мозга, а также повышение тонуса мышц в паретических конечностях и хвосте. Эта симптоматика сочеталась с развитием гипостезии и грубым нарушением координации движений. Наряду с очаговыми расстройствами, у крыс имелась выраженная общемозговая неврологическая симптоматика в виде выраженной вялости и сонливости и неспособности к самостоятельному приему пищи. Суммарный балл неврологических нарушений по шкале ОТНН в 1-е сутки в этой группе значительно превышал аналогичный показатель у животных первых двух групп, 56 составляя 22,20 ± 0,13, что свидетельствовало о наличии тяжелой степени неврологического дефицита (рисунок 2). Общее состояние всех животных 3-й группы на протяжении первой недели послеоперационного периода оставалось тяжелым, что требовало проведения принудительного кормления. Дальнейшее наблюдение за животными 3-й группы серии S1 и оценка неврологической симптоматики показало незначительное снижение балла ОТНН. Выраженный неврологический дефицит регистрировался через неделю с момента проведения операции (21,00 ± 0,10 балл). На 14-е сутки балл ОТНН продолжал оставаться близким к категории тяжелых повреждений (19,00 ± 0,10 баллов). Лишь к 21-м суткам с момента проведения операции отмечено снижение балла ОТНН до 15,70 ± 0,30. К этому сроку неврологические выпадения стабилизировались, отчетливого регресса неврологической симптоматики в дальнейшем не отмечено: у животных формировался особый стереотип в движениях, приеме пищи, воды. Двигательные нарушения на контралатеральной стороне были более выражены. Крысы становились не способными двигаться прямолинейно – периодически наблюдалось движение с поворотом в паретичную сторону. При оценке теста при поднятии животного за хвост отсутствовало сгибание передних и задних конечностей. К этому сроку, согласно шкале ОТНН, их состояние расценивалось как умеренное повреждение. Анализируя полученные результаты очаговой и общемозговой неврологической симптоматики животных в трех группах, можно констатировать, что созданная модель локального очагового венозного поражения головного мозга у животных в группе №3 серии S1 не только приводит к тяжелому общему состоянию животных, но и вызывает развитие выраженного стойкого неврологического дефицита. После экспериментальной отработки на крысах оригинальной модели очага нарушения венозного кровообращения головного мозга, в соответствии поставленными задачами, в дальнейшем исследовалось влияние МСК на динамику восстановления функции поврежденного головного мозга. 57 С целью изучения влияния МСК на морфо-функциональное состояние головного мозга с очагом нарушения венозного кровообращения использованы два способа трансплантации МСК – внутривенный и местный. Местная трансплантация МСК предполагала введение клеток через полихлорвиниловый катетер, подведенный к очагу поражения мозга. Для изучения степени травматичности данного пути введения клеток проведены две серии экспериментов на животных (таблица 3). Восьми крысам группы № 1 серии S2 формировали только очаговое повреждение мозга по разработанной нами методике и оценивали результаты самопроизвольного восстановления утраченных церебральных функций. Полученные результаты сопоставлены с данными самостоятельного восстановления неврологического дефицита, имеющимися у животных группы № 2 серии S2, которым также формировался аналогичный очаг венозного нарушения кровообращения, но с дополнительным введением под кожу полихлорвинилового катетера, через который планировалась трансплантация клеток. На 1-е сутки после оперативного вмешательства у выживших животных первой и второй групп серии S2 суммарный средний балл неврологических нарушений по шкале ОТНН был одинаков и составлял 22,20 ± 0,10 и 22,50 ± 0,20 баллов соответственно (таблица 6), что свидетельствовало о наличии у всех крыс тяжелой степени неврологического дефицита. В дальнейшем общее состояние всех животных на протяжении первой недели послеоперационного периода оставалось тяжелым, требовало ухода и принудительного кормления. К 7-м суткам послеоперационного периода в группе № 1 состояние крыс улучшалось, при этом регистрировалось достоверное снижение балла оценки тяжести неврологического дефицита (PКЗ=0,013), однако степень восстановления утраченных функций составляла, по сравнению с первыми сутками наблюдения, всего (9 ± 1) %. Из 8-и животных к этому сроку только две особи имели ОТНН менее 20 баллов, т.е. перешли в категорию умеренного неврологического дефицита. Положительная динамика проявлялась у них в виде разрешения 58 правосторонней гемиплегии до глубокого гемипареза. В то же время оставшиеся животные сохраняли признаки тяжелых неврологических расстройств. Таблица 6 – Выраженность неврологических расстройств по шкале ОТНН у животных серии S2 Группы Кол-во животных 1 8 2 8 Методика эксперимента 1-е сутки (баллы) 7-е сутки (баллы) 14-е сутки (баллы) 21-е сутки (баллы) Трепанация + 22,20 ± 0,10 20,20 ± 0,40* 18,40 ± 0,40* 15,70 ± 0,30* моделирование ПГМ Трепанация + моделирование ПГМ 22,50 ± 0,20 20,40 ± 0,30* 19,40 ± 0,40* 16,50 ± 0,20* + установка катетера Всего 16 Примечание: представлены средние значения (M ± m) балла ОТНН в динамике послеоперационного периода; * – P<0,05 – различия по сравнению с состоянием на 1 сутки и между группами достоверны. Несмотря на реоперацию, направленную на удаление полихлорвинилового катетера, к 7-м суткам животные второй группы характеризовались схожими изменениями в виде уменьшения очаговой неврологической симптоматики и также достоверным (PКЗ=0,013), но весьма умеренным по выраженности на (9 ± 1) % самостоятельным восстановлением утраченных функций. Снижение балла ОТНН ниже 20 в этой группе отмечалось только у одного животного. Следует отметить, что у животных обеих групп к концу 1-й недели была зарегистрирована потеря массы тела и обеднение волосяного покрова. К концу второй недели отмечалось дальнейшее улучшение состояния подопытных крыс. Положительная неврологическая динамика у животных 1-й группы серии S2 проявлялась частичным восстановлением движения и чувствительности в конечностях на гомолатеральной стороне (у 6 из 8 животных) и повышением активности животных по сравнению с предшествующим периодом. Тем не менее, 3-м животным по-прежнему требовался дополнительный уход в виде вспомогательного кормления. Во второй группе животные были несколько менее активными, положительная неврологическая динамика отмечалась у 4-х из 8-и животных и проявлялась восстановлением силы в 59 конечностях и объема движений на гомолатеральной стороне и регрессом чувствительных нарушений на контралатеральной стороне. Все это приводило к умеренному снижению балла ОТНН. Характерно, что восстановление неврологического статуса во второй группе было менее выраженным. И хотя различия между баллом ОТНН в 1-й и 2-й группах серии S2 на 14-е сутки были недостоверны, они проявлялись в виде достаточно выраженной тенденции (PU=0,066). К 21-м суткам наблюдалось дальнейшее снижение балла ОТНН до 15,70 ± 0,30 в 1-й группе и до 16,50 ± 0,20 баллов во 2-й группе. К этому сроку неврологические выпадения в обеих группах стабилизировались, особой положительной динамики не было отмечено: у животных складывался определенный стереотип в движениях, приеме пищи, воды. При этом двигательные нарушения на контралатеральной стороне по-прежнему были более выражены. Неврологические моторные нарушения у животных проявлялись отсутствием способности двигаться прямолинейно – периодически имело место движение с поворотом в паретичную сторону. При поднятии животного за хвост отсутствовали сгибания передних и задних конечностей. У животных 2-й группы отмечались более выраженные нарушения двигательной активности. Если в 1-й группе двигательная активность на гомолатеральной стороне у 4-х животных составляла 2 балла, у 4-х – 3 балла, а на контрлатеральной стороне – 4 балла, то во второй группе двигательные расстройства на гомолатеральной стороне у большинства животных (6 из 8-и) соответствовали 3-м баллам, а на контралатеральной стороне – 5-и баллам. В целом, состояние животных обеих групп в соответствии с бальной оценкой по ОТНН к 21-у дню характеризовалось как умеренное повреждение. Таким образом, моделирование нарушения венозного кровотока у крыс в виде коагуляции верхнего сагиттального синуса в средней трети и корковых вен в левой теменно-височной области индуцирует выраженное повреждение головного мозга, которое проявляется в виде тяжелого общего состояния животных и 60 очагового неврологического дефицита, характеризуется низким уровнем естественного восстановления. Наличие степени неврологических выпадений и их динамика при самопроизвольном восстановлении утраченных функций и их статистическая обработка убедительно свидетельствует о том, что присутствие хлорвинилового катетера под мягкими тканями головы крысы не оказывает существенного негативного влияния на степень и темп восстановления неврологического дефицита. 3.1.2. Характеристика морфологических изменений головного мозга при моделировании нарушения венозного кровотока Для изучения характера и верификации морфологических повреждений, возникающих у экспериментальных животных при моделировании нарушений венозного кровотока, и их дальнейшей трансформации были проведены МРТ и гистологические исследования головного мозга животных. 3.1.2.1. МРТ-исследования головного мозга крыс Для проведения МРТ головного мозга крыс были отобраны 3 животных серии S4, которые обследовались до и после моделирования нарушения венозного кровотока. Томографическое обследование животных проводилось до операции, на 2-е, 8-е, 14-е и 23-и сутки после хирургического вмешательства. Всего у этих животных было последовательно проведено 11 МРТ-исследований. Исследование головного мозга 2-х животных до моделирования нарушения венозного кровотока (рисунок 3) показало, что на МР-томограммах, полученных при помощи импульсных последовательностей FISP и RARE в аксиальных и коронарных плоскостях, структуры мозга симметричны, форма и размеры их не изменены. Патологических изменений интенсивности сигнала в веществе мозга не выявлено. 61 а1 б1 а2 б2 а3 б3 а4 а5 Рисунок 3 – МРТ головного мозга интактных крыс: а – животное № 1; б – животное №2. а1, а2, б1, б2 – МРТ томограммы, полученные в FISP и RARE режимах; а3, а4, а5 – изображения, полученные при помощи импульсной последовательности TOF и реконструированные объемные церебральные МР-ангиограммы. 62 На МР-томограммах, полученных при помощи импульсной последовательности TOF (рисунок 3 а3, б3) и на реконструированных объемных церебральных МР-ангиограммах (рисунок 3 а4, а5) визуализируется кровоток по всем экстра- и интракраниальным артериям, синусам твердой мозговой оболочки и венам. На 2-е сутки после моделирования нарушений венозного кровотока головного мозга по нашей оригинальной методике на изображениях в аксиальных и коронарных плоскостях в области верхнего сагиттального синуса и над левым полушарием мозга визуализировался гемостатический материал (рисунок 4). а1 а2 б1 б2 в1 Рисунок 4 – МРТ головного мозга на 2-е сутки после хирургического вмешательства. Изображения получены в режимах RARE и FISP: а – животное № 1; б – животное № 2; в – животное № 3. 63 Мозговое вещество левого полушария пролабирует через трепанационное отверстие в среднем на 6–7 мм. Срединные структуры смещены влево на 2–3 мм. В пролабирующем в трепанационное отверстие и прилежащем к коагулированным участкам синуса веществе мозга выражены признаки отека. Объем зоны отека варьируется от 0,1 до 1,6 см3 и в среднем составляет 0,9 см3 (рисунок 4 а1, б1, в1). На МР-томограммах, полученных при помощи импульсной последовательности TOF, и на реконструированных объемных церебральных МРангиограммах кровоток по синусам твердой мозговой оболочки и венам отчетливо не визуализируется (рисунок 5 а1, б1, в1) Кровоток по экстра- и интракраниальным артериям сохранен, выражены признаки их полнокровия (рисунок 5 а2, б2, в2). а1 а2 б1 б2 в1 в2 Рисунок 5 – Церебральная МР-ангиография головного мозга на 2-е сутки после хирургического вмешательства: а – животное № 1; б – животное № 2; в – животное № 3. 64 На 8-е сутки послеоперационного периода исследования удалось выполнить не у всех 3, а лишь у 2 животных, так как одно погибло из-за тяжелого состояния на 5-е сутки эксперимента. У животного № 1 в области верхнего сагиттального синуса и над левым полушарием мозга визуализировался гемостатический материал. Мозговое вещество левого полушария пролабировало через трепанационное отверстие, но в несколько меньшей степени – в среднем на 3,5–4,5 мм. Срединные структуры не были смещены. В пролабирующем в трепанационное отверстие и прилежащем к коагулированным участкам синуса веществе мозга признаков отека не наблюдалось (рисунок 6 а1, а2). У животного № 2 отек вещества мозга, прилежащего к участкам синуса, сохранялся (рисунок 6 б1, б2). Кровоток по синусам твердой мозговой оболочки и венам отчетливо не визуализировался. Кровоток по экстра- и интракраниальным артериям сохранился, были отчетливо выражены признаки их полнокровия (рисунок 7). По сравнению с результатами церебральной МР-ангиографии на 8-е сутки незначительно уменьшилось количество визуализированных вен среднего и малого калибра. а1 а2 б1 б2 Рисунок 6 – МРТ головного мозга на 8-е сутки после хирургического вмешательства. Изображения, полученные в режимах FISP и RARE: а – животное № 1; б – животное № 2. 65 а1 б1 а2 б2 а3 б3 Рисунок 7 – Церебральная МР-ангиография головного мозга на 8-е сутки после хирургического вмешательства. а – животное № 1, б – животное № 2. На 14-е сутки послеоперационного периода в области верхнего сагиттального синуса визуализировался гемостатический материал (рисунок 8). Сохранялось пролабирование мозгового вещества левого полушария – в среднем на 3,4–4,5 мм. Срединные структуры не были смещены (рисунок 8 а2, б2). В веществе мозга, пролабирующем в трепанационное отверстие, и в расположенных рядом с ним участках, определялась неправильной формы полость, заполненная жидкостью с сигналом, идентичным сигналу ликвора (рисунок 8 а1, б1). Размеры кистозной полости варьировали от 0,1 до 1,0 см 3, составляя в среднем 0,6 см3. 66 а1 а2 б1 б2 Рисунок 8 – МРТ головного мозга на 14-е сутки после хирургического вмешательства. Изображения получены в режимах FISP и RARE. а – животное № 1, б – животное № 2. При церебральной МР-ангиорграфии (рисунок 9) кровоток по экстра- и интракраниальным артериям был сохранен. По сравнению с результатами МРангиографии на 14-е сутки появился участок отсутствия кровотока по одной из крупных вен левого полушария мозга (рисунок 9 а1). а1 а2 б1 б2 Рисунок 9 – Церабральная МР-ангиография головного мозга на 14-е сутки: а – животное № 1; б – животное № 2. 67 На 23-и сутки после хирургического вмешательства (рисунок 10) в области верхнего сагиттального синуса визуализировался гемостатический материал. Мозговое вещество левого полушария пролабировало через трепанационное отверстие на 3–4мм (рисунок 10 а1, б1). Срединные структуры не были смещены (рисунок 10 а2, б2). В веществе мозга, пролабирующем в трепанационное отверстие, и в расположенных рядом с ним участках определялась неправильной формы полость, заполненная жидкостью с сигналом, идентичным сигналу ликвора (рисунок 10 а1, а2, б1, б2). По сравнению с результатами МРТ на 14-е сутки размеры полости увеличились в среднем до 1,0 см3. У животного № 1 определялись признаки сообщения полости с левым желудочком. а1 а2 б1 б2 Рисунок 10 – МРТ головного мозга на 23-е сутки после хирургического вмешательства. Изображения, полученные в режимах FISP и RARE. а – животное № 1, б – животное № 2. При ангиографии на 23-и сутки (рисунок 11) кровоток по синусам твердой мозговой оболочки и венам отчетливо не визуализировался. Кровоток по экстра- и интракраниальным артериям сохранялся. По сравнению с результатами МРангиографии на 14-е сутки увеличилось количество участков крупных вен левого полушария мозга, кровоток по которым не визуализировался (рисунок 11 а1). 68 У крысы 2 (рисунок 11 б1) по сравнению с предыдущим исследованием определялось значительное уменьшение количества мелких вен. а1 б1 а2 б2 а3 б3 Рисунок 11 – Церебральная МР-ангиография головного мозга на 23-и сутки после хирургического вмешательства. а – животное № 1, б – животное № 2. Таким образом, по данным МРТ исследования головного мозга экспериментальных животных установлено, что моделирование нарушений венозного кровотока путем облитерации с помощью биполярной коагуляции верхнего сагиттального синуса и последующей коагуляцией венозных корковых сосудов в левой теменно-височной области приводит к выключению кровотока по синусам твердой мозговой оболочки и венам головного мозга, сохраняющемуся до 23-х суток. При этом кровоток по экстра- и интракраниальным артериям не изменяется. 69 Это сопровождается развитием выраженного отека головного мозга в области хирургического вмешательства, прилежащего к коагулированным участкам синуса и пролабирующего в трепанационное отверстие, с последующим (спустя две недели с момента травмы) формированием интрацеребральной ликворной кисты в зоне очага повреждения мозга на фоне сохраняющегося его отека. 3.1.2.2. Гистологическое исследование головного мозга при экспериментальном нарушении венозного кровотока При создании экспериментальной модели острого нарушения венозного кровотока головного мозга оценивалась степень выраженности морфологических изменений, позволяющих оценить характерологические особенности повреждения ткани мозга (инфаркта) на разных стадиях его развития (1-е, 7-е, 14-е, 21-е сутки). Моделирование повреждения венозного кровотока у всех исследуемых экспериментальных животных приводило к развитию достаточно однотипных повреждений ткани мозга (в силу единого патогенетического фактора), которые классифицировались как участки полного или неполного некроза. При этом морфологические особенности повреждения мозговой ткани в различных участках позволяли идентифицировать все три формы инфаркта, включая белый, красный или смешанный. Анализ структурно-клеточных показателей в поврежденной нервной ткани животных контрольной группы продемонстрировал, что нарушение гемодинамики в используемой модели приводило к развитию прогрессирующих дистрофических и некробиотических изменений в поврежденной ткани мозга с образованием очага омертвения, характеризующегося определенным набором морфологических изменений в виде зональности его строения и стадийности изменений в динамике. 70 Патологические изменения головного мозга на 1-е сутки. Макроскопически: у всех животных после выполнения коагуляции ВСС с последующей коагуляцией корковых вен в левой теменно- височной области определялся очаг венозного стаза, который характеризовался отеком левой теменно-височной области (размерами 1,0х1,0 см) и пролабированием мозгового вещества в трепанационного отверстие. Микроскопически: визуализировался очаг, центр которого представлял зону полного разрушения ткани с формированием дезинтеграции и морфологическими изменениями клеток нейронов и глии. Очаг повреждения был представлен инфильтрацией выраженной (рисунок 12 а). перифокальной Тяжелые лимфоидно-лейкоцитарной структурные изменения в микроциркуляторном русле проявлялись в виде деформации капилляров, набухания эндотелия, расширения его базальных слоев, приводящих к повышенной сосудистой проницаемости, диапедезными кровоизлияниями в веществе мозга и перифокальной зоне (рисунок 12 б). а б Рисунок 12 – Контрольная группа. 1-е сутки: а – очаг повреждения мозговой ткани с выраженной перифокальной лимфоидно-лейкоцитарной инфильтрацией. Увеличение 200; б – множественные диапедезные кровоизлияния в перифокальной зоне очага повреждения. Увеличение 100. Окраска гематоксилином и эозином. В перифокальной зоне наблюдался выраженный перифокальный отек и дистрофические изменения нейронов по ишемическому типу, клетки тени, пикноморфные и гиперхромные нейроны (рисунок 13). 71 Рисунок 13 – Выраженный отек, тяжелые дегенеративно-дистрофические изменения нейронов по ишемическому типу (в перифокальной зоне очага повреждения). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 300. Таким образом, некротическая стадия инфаркта мозга – это стадия аутолиза с характерными, типичными признаками некроза. Патологические изменения головного мозга на 7-е сутки исследования. Макроскопически: у животных в месте нанесения повреждения головного мозга мозговая ткань характеризовалась дряблой консистенцией в очаге некроза, вещество мозга было набухшим, бледным, границы инфаркта визуализировались нечетко и плохо контурировались, дефект ткани составлял около 0,9х1,0см. Сохранялось умеренное пролабирование мозгового вещества. Микроскопически: в пограничной и перифокальной зонах очага повреждения наблюдалась пролиферация глиальных клеток на границе с инфарктом. В зоне повреждения выявлено большое количество гемосидерофагов, зернистые шары (рисунок 14). Выявлены скопления гиперплазированных глиальных клеток в пограничной и перифокальной зонах. В демаркационной зоне на границе с инфарктом увеличено число и плотность клеток глии (рисунок 15). Процессы альтерации в этом периоде преобладали над репаративными изменениями. Гипоксическое состояние приводило к дезинтеграции, отеку и набуханию нервной ткани. 72 Рисунок 14 – Пролиферация клеток глии. Лейкоцитарная инфильтрация в перифокальной зоне очага повреждения. Гемосидерофаги в центральной зоне. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200. а б Рисунок 15 – Очаги повреждения: а – гиперплазированные глиальные клетки в перифокальной и пограничной зонах; б – клетки глии в демаркационной зоне. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200. Патологические изменения головного мозга на 14-е сутки исследования. Макроскопически: на 14-е сутки наблюдалось формирование ликворной кисты размерами 0,4х0,9х1,0 см, были визуализированы единичные очаги некроза по периферии очага повреждения, размеры дефекта ткани составляли около 0,9х1,0 см. 73 Микроскопически: в очаге повреждения ткани головного мозга наблюдалось нарастание репаративных изменений, дальнейшая резорбция некроза и активация макрофагальной функции (рисунок 16). . Рисунок 16 – Макрофогальная резорбция некротизированной нервной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200. В дальнейшем имели место пролиферация кровеносных сосудов и формирование петель из новообразованных сосудов, которые особенно отчетливо выявлялись к 14-м суткам (рисунок 17). а б Рисунок 17 – Контрольная группа. 14-е сутки: а – врастание сосудистых петель в очаг повреждения. б – петли новообразованных сосудов пограничной зоны, врастающих в очаг повреждения. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200. На этом фоне в зоне повреждения происходили начальные процессы кистозной дегенерации ткани мозга (рисунок 18). 74 Рисунок 18 – Образование мелких кистовидных полостей в веществе мозга. Иммуногистохимическая реакция. Увеличение 300. Патологические изменения головного мозга на 21-е сутки исследования. Макроскопически: участков некроза не обнаружено, признаков воспаления не выявлено, кистозная полость (размерами 0,7х0,8х1,0 см) содержала ксантохромный ликвор. Сохранился дефект ткани размерами около 0,9х0,9 см. Микроскопически: на 21-е сутки зона некроза была замещена рубцовой тканью cо значительной кистозной дегенерацией мозговой ткани (рисунок 19). Рисунок 19 – Формирование кист разных размеров в зоне очага повреждения Окраска гематксилином и эозином. Увеличение 300. 75 На 21-е сутки отмечено уменьшение интенсивности отека вещества мозга. В незначительном количестве были выявлены клетки, измененные по ишемическому типу, геморрагический компонент минимального уровня был представлен геморрагиями из мелких артерий, вен и капилляров, как диапедезными, так и в результате разрывов их стенок. Определялся гиломезензхимальный рубец с формирование кист разного размера (рисунок 20). Рисунок 20 – Формирование глиомезенхимального рубца в зоне очага повреждения. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200. Таким образом, экспериментальное повреждение головного мозга путем искусственного нарушения венозного кровотока характеризуется развитием зоны некроза с последующей резорбцией некротических масс, формированием, начиная с 14-х суток с момента повреждения, глиального рубца и кистозной дегенерацией этой зоны. Характерной особенностью данной модели является развитие отека и выраженные нарушения микрогемоциркуляции с развитием тромбозов, стаза в сосудах и кровоизлияниями разной степени выраженности, что свидетельствует о сложности патогенеза инфаркта в модели очаговых повреждений головного мозга, вызванного нарушением венозного кровотока. Суммируя полученные результаты, можно констатировать, что экспериментально разработана модель ишемического поражения головного мозга у крыс венозного характера путем последовательной коагуляции верхнего сагиттального синуса и корковых вен в левой теменной области, отвечающая 76 условиям цели и задач данной работы. Об этом, в первую очередь, свидетельствуют клинические проявления в виде возникновения выраженных очаговых неврологических расстройств на фоне тяжелой общемозговой симптоматики с низким уровнем спонтанного восстановления вплоть до 21-х суток. Во-вторых, получены данные нейровизуализации (МРТ) и гистологические результаты, подтверждающие выключение венозного кровотока в головном мозге и формирование в нем очага повреждения в виде инфаркта с развитием зоны некроза, сопровождающееся выраженным отеком головного мозга в области хирургического вмешательства с последующей резорбцией некротических масс (спустя две недели с момента травмы) и формированием в зоне очага повреждения мозга глиального рубца и выраженной кистозной дегенерации. На основе полученных экспериментальных данных нами получен патент РФ «Способ моделирования ишемического поражения головного мозга». Патент № 2 432 619 РФ, авторы Ступак В.В., Васильев И.А., Самохин А.Г. Поэтому созданная модель, сочетающая коагуляцию ВСС с последующей коагуляцией корковых вен головного мозга у крыс в левой теменно-височной области, будет использована в дальнейшей нашей работе. 3.2. Влияние МСК на восстановление неврологических выпадений крыс при экспериментальном очаговом повреждении головного мозга, вызванном нарушением венозного кровотока Согласно восстановление данным функции литературы головного трансплантация мозга и МСК улучшает умеренно-выраженного неврологического дефицита при экспериментальной окклюзии средней мозговой артерии [13, 14, 63]. Однако возможности клеточной терапии при искусственном ПГМ вследствие нарушения венозного кровотока, выполненного по разработанной оригинальной модели, имеющем характер выраженных общемозговых и 77 неврологических расстройств, ранее не оценивались. Поэтому настоящий раздел работы посвящен оценке влияния МСК на восстановление возникающих неврологических выпадений в рамках разработанной оригинальной модели формирования нарушения венозного кровотока головного мозга у крыс. Для этого были проведены исследования на 24-х крысах групп № 3, 4, 5 и 6 серии S2, направленные на изучение сравнения эффективности действия МСК на сформированный очаг венозного нарушения церебрального кровообращения при различных путях доставки клеток и в зависимости от сроков их использования. При исследовании изучалась динамика восстановления неврологических выпадений у животных после местной и внутривенной трансплантации МСК костного мозга на первые и седьмые сутки после моделирования венозных повреждений головного мозга. Через сутки после хирургического вмешательства у всех животных данных исследовательских групп наблюдалась выраженная однотипная неврологическая симптоматика, которая проявлялась грубым тетрапарезом и повышением тонуса мышц хвоста. Выраженность двигательных расстройств на контрлатеральной стороне была выше и у части животных достигала уровня гемиплегии. Наряду с очаговыми выпадениями у животных имелась выраженная общемозговая симптоматика в виде вялости, сонливости, неспособности к самостоятельному приему пищи. Тяжесть неврологических нарушений у животных групп № 3 и № 4 серии S2, которым внутривенно вводили МСК, на 1-е и 7-е сутки послеоперационного периода была равна соответственно 21,50 ± 0,40 и 22,30 ± 0,60 баллов (рисунок 21). Таким образом, после формирования в головном мозге очага нарушения венозного кровообращения животные данных групп были сопоставимы между собой и с группами контроля № 1 и № 2 серии S2 по тяжести неврологических выпадений и общему состоянию. 78 21 сутки Группа 1 14 сутки Группа 3 7 сутки 0 20 40 60 80 % Рисунок 21 – Относительные показатели уменьшения выраженности неврологического дефицита у экспериментальных животных между группами № 1 и № 3 серии S2. Однако в дальнейшем регресс моторных нарушений в группах с использованием трансплантации клеток был более выраженным по сравнению с первой группой контроля серии S2. Об этом свидетельствовал тот факт, что средний балл ОТНН у животных 3-й группы с внутривенным введением МСК через 1 сутки с момента травмы, на 7-е, 14-е и 21-е сутки был достоверно ниже, чем у животных первой контрольной группы: (18,30 ± 0,50 vs 20,20 ± 0,40, PU=0,001); 12,00 ± 0,70 vs 18,40 ± 0,40, PU=0,002 и 5,50 ± 1,70 vs 15,70 ± 0,30, PU=0,002, соответственно. Эти различия также ярко проявлялись и при сравнении относительных показателей уменьшения неврологического дефицита в группах исследования по сравнению с контролем. Темп снижения относительного числа случаев неврологического дефицита у животных 3-й группы в 1,5–2,5 раза превышал те же величины контрольной группы (рисунок 21). Так, в 3-й группе исследования относительные показатели неврологического дефицита у животных к 7-м суткам уменьшились на (15,0 ± 2,0) % против (9,0 ± 1,0) % в группе контроля, PU =0,027, к 14-м суткам – на (44,0 ± 3,2) % против (17,0 ± 1,0) % в группе контроля, PU=0,002, а к исходу 3-й недели эти данные снизилась на (75,0 ± 5,0) % против (30,0 ± 2,0) %; PU=0,002. При этом состояние животных к последнему сроку наблюдения в группе 3 соответствовало легким неврологическим повреждениям. 79 В группе № 4, где МСК вводились крысам в хвостовую вену на 7-е сутки после операции, существенное снижение балла ОТНН по сравнению с контролем регистрировалось на 14-е (13,30 ± 1,20 vs 18,40 ± 0,40; PU=0,003) и 21-е сутки (9,10 ± 0,90 vs 15,60 ± 0,30; PU=0,002). Однако сумма баллов ОТНН в группе № 4 на 21-е сутки была в 1,5 раза выше, чем в группе № 3 (9,10 ± 0,86 против 5,50 ± 1,10; PU=0,033). То есть регресс неврологического дефицита к концу третьей недели послеоперационного периода у животных 3-й группы был более выраженным, чем в группе № 4 (рисунок 22). * * * * # * Рисунок. 22 – Влияние внутривенного введения МСК на выраженность неврологических нарушений у животных при экспериментальном очаговом повреждении головного мозга, вызванном нарушением венозного кровообращения. * – PU<0,05 – различия по сравнению с контролем достоверны, # – PU<0,05 – различия между группами достоверны. Более заметное восстановление животных 3-й группы, по сравнению с группой 4 проявлялось также и в том, что крысы, которым МСК вводили внутривенно на 1-е сутки, быстрее (уже через 2–3 суток после операции) восстанавливали способность к самостоятельному приему пищи. 80 Анализ неврологического статуса в группах исследования № 5 и № 6 серии S2 с местным введением МСК через полихлорвиниловый катетер в зону очага поражения показал, что на 1-е сутки послеоперационного периода средние значения суммы баллов ОТНН в группе исследования и контроля № 2 той же серии не различались (рисунок 23). В тоже время через 14 суток и на 21-е сутки неврологический дефицит в группах с локальным введением МСК был менее выраженным и состовлял на 14 сутки в группе №5 14,50 ± 1,57 и в группе №6 14,40 ± 1,64 vs 19,40 ± 0,40 в группе контроля. Соответственно на 21-е сутки уровень неврологического дефицита в группе №5 и №6 состовлял 7,20±1,32 и 9,9±0,97 vs 16,50 ± 0,20 в контрольной группе. Балл ОТНН ( услов. един). 25 20 * 15 Гр 2 * * Гр 5 Гр 6 10 5 * 0 Сутки1 Сутки 7 Сутки 14 Сутки 21 Рисунок 23 – Влияние местного введения МСК на выраженность неврологических нарушений в модели очагового повреждения головного мозга, венозного характера. * – PU<0,05 – различия по сравнению с контролем достоверны, различия между группами не достоверны. Дальнейший анализ влияния сроков локального введения МСК на интенсивность неврологического восстановления выявил, что показатели ОТНН в группе животных № 6 на 7-е и 14-е сутки были схожими с таковыми у крыс 81 группы № 5. Однако уменьшение относительного числа случаев неврологических расстройств к 21-м суткам у животных группы № 6 было менее выраженным – (54,0 ± 3,9) % против (68,0 ± 6,0) % у животных 5-й группы; PU=0,04. Как и в группах с внутривенным введением МСК, восстановление к самостоятельному приему пищи у животных 5-й группы с ранним местным введением МСК в очаг поражения регистрировалось раньше, чем у животных группы № 6, где клеточная терапия начиналась лишь на 7-е сутки с момента травмы. Сравнение результатов локального и системного способов трансплантации клеток показало, что достоверных различий в динамике восстановления неврологического статуса зарегистрировано не было (таблица 7). Хотя животные с внутривенным введением МСК (на 1-е сутки) характеризовались тенденцией к более выраженному восстановлению неврологических выпадений на 21-е сутки – по сравнению с группой животных, которым МСК (на 1-е сутки) вводили местно. Таблица 7 – Балльные оценки тяжести неврологических нарушений у экспериментальных животных серии S2 Группы Кол-во животных 3 6 4 6 5 6 6 6 Вид хирургических манипуляций трепанация + моделирование ПГМ с введением МСК на 1-е сутки в/в трепанация + моделирование ПГМ с введением МСК на 7-е сутки в/в трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера с введением МСК на 1-е сутки местно трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера с введением МСК на 7-е сутки местно 1-е сутки 7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки 21,50 ± 0,38 18,30 ± 0,48 12,00 ± 0,65 5,50 ± 1,08* 22,30 ± 0,56 22,40 ± 0,99 13,30 ± 1,19 9,07 ± 0,87 22,00 ± 0,54 18,70 ± 0,89 14,50 ± 1,57 7,20 ± 1,32 21,40 ± 0,85 18,10 ± 1,25 14,40 ± 1,64 9,90 ± 0,97 Итого 24 Примечание: * PU <0,05 – различия между группами № 3 и № 4 достоверны. 82 Полученные данные впервые продемонстрировали способность МСК корригировать неврологические нарушения у крыс с грубым неврологическим дефицитом в модели очагового поражения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровотока, характеризующегося низким уровнем спонтанного восстановления. У животных, получивших клеточную терапию, степень неврологического дефицита, по сравнению с группой контроля, снижалась от исходного уровня к окончанию эксперимента более чем в 3 раза – на (54,0–75,0) %. К 21-у дню наблюдения состояние экспериментальных животных после клеточной трансплантации соответствовало уровню легких неврологических расстройств, которые проявлялись сохранением высокого тонуса в мышцах хвоста, отсутствием сгибания конечностей при поднятии животного за хвост. У животных контрольной группы к окончанию эксперимента степень неврологических выпадений снижалось лишь на (14,0–17,0) % и их состояние соответствовало умеренному уровню неврологических расстройств. Анализ эффективности клеточной терапии в зависимости от сроков введения МСК показал, что эффект клеток, вводимых на первые сутки послеоперационного периода, был статистически значимо выше, чем при введении клеток на 7-е сутки. На примере крыс групп № 3 и № 5 это проявлялось более выраженным снижением тяжести состояния по шкале ОТНН, включая быстрое восстановление животных к самостоятельному приему жидкой пищи и регресс неврологической симптоматики в виде нарастания силы и объема движений в конечностях. Сравнение двух способов введения клеток не выявило преимуществ местного введения МСК в очаг поражения. Более того, животные с этим путем введения клеток характеризовались тенденцией к менее эффективному восстановлению утраченных функций мозга, по сравнению с группой животных с внутривенным введением. Можно полагать, что само по себе местное введение МСК через установленный катетер является повреждающим воздействием на головной мозг в виде возникающего дополнительного гидродинамического давления при иньекции клеточной суспензии. Кроме этого, неблагоприятные 83 последствия, как нам представляется, могут быть обусловлены и премедикацией животных, проведением в дальнейшем реоперации в виде разведения краев кожной раны, выделением проксимального конца катетера с последующим его удалением и повторным ушиванием раны после введения клеток. Высокие показатели клинического эффекта, наблюдаемого при внутривенном введении МСК, позволяют предполагать, что в указанные сроки МСК быстрее мигрируют в зону повреждения и для их введения не требуется дополнительной локальной имплантации клеток. В итоге, экспериментальными исследованиями на крысах с очаговым повреждением головного мозга венозного характера установлено, что для коррекции возникающего неврологического дефицита наиболее технически простым и эффективным является раннее внутривенное введение МСК – на 1-е сутки с момента повреждающего воздействия. Данный путь внутривенной доставки клеток, по сравнению с местным введением, представляется более предпочтительным. 3.3. Влияние МСК на электрофизиологическую активность головного мозга в модели очагового нарушения венозного кровообращения С целью объективизации функционального состояния головного мозга у 22-х оперированных животных, входящих в серию S3 регистрировались корковые ССВП. Серия состояла из 3-х групп: 1) контрольная группа № 1 из 6-и животных, которым проводилась только резекционная трепанация черепа с сохранением целостности твердой мозговой оболочки; 2) группа № 2, где 8-и животным по нашей методике кровообращения формировали головного мозга только и очаговое исследовали нарушение динамику венозного спонтанного восстановления неврологического дефицита; 3) группа № 3, в которой у 8-и крыс после моделирования нарушения церебрального венозного кровообращения по оригинальной методике, на 1-е сутки с момента постановки эксперимента вводили внутривенно МСК. 84 Регистрация ССВП осуществлялась до проведения ПГМ, на 7-е, 14-е и 21-е сутки с момента проведения операции. Электрофизиологическое обследование интактных животных показало (рисунок 24 а), что наиболее высокоамплитудными (в диапазоне от 9 до 18 мкВ) компонентами регистрируемых ССВП были негативные отклонения с латентностью максимума во временном диапазоне 8,5–11,0 мс. При этом межполушарные различия амплитуд и показателей латентности ССВП в 82 % случаев (18 из 22) не превышали 10 %. Электрофизиологическое обследование животных группы хирургического контроля № 1 серии S3 после выполнения резекционной трепанации черепа не выявило выраженных изменений показателей ССВП (рисунок 24 б, в). а б в Рисунок 24 – Пример регистрации ССВП у животного № 3 1-ой группы серии S3: а – ССВП до оперативного вмешательства; б – через 7 суток; в – через 21 сутки после трепанации. Верхние кривые ССВП в оперированном полушарии, нижние – в контрлатеральном полушарии. 85 Анализ средних значений амплитуды и латентности потенциалов у животных этой группы показал (рисунок 25), что на 7-е сутки после операции снижение амплитуды ССВП на стороне повреждения является незначительным. При этом задержка ССВП также не отличалась от исходного уровня, составляя 10,20 ± 0,19 мс (до операции 10,10 ± 0,35 мс; p>0,05). К исходу 21-х суток исследуемые показатели ССВП у животных 1-й группы полностью соответствовали исходным значениям (рисунок 24). 12 амплитуда (мкВ) 10 8 6 4 # *# *# 2 0 исходно 7-е сут 14-е сут 21-е сут исходно 7-е сут 14-е сут 21-е сут а 12 амплитуда (мкВ) 10 8 6 4 2 0 б ♦ 1 группа, ■ 2 группа ▲ 3 группа. Рисунок 25 – Динамика амплитуды ССВП животных серии S3 на поврежденной (а) и интактной (б) сторонах. 1-я группа – резекционная трепанация, 2-я – очаговое повреждение без введения клеток, 3-я – трансплантация МСК. * PU <0,05 – различия между 2-й и 3-й группами, # PU <0,05, – различия между 1-й и 2-й группами достоверны (U – критерий Манна-Уитни). 86 Моделирование сопровождалось у очагового них повреждения выраженной животным неврологической группы и № 2 общемозговой симптоматикой. У большинства особей этой группы (6 из 8-и) при обследовании на 7-е и 14-е сутки регистрировалось статистически значимое снижение амплитуды ССВП на оперированной стороне (в 3–4 раза), которое сохранялось в течение трех недель наблюдения. При этом среднее значение амплитуды ССВП составляло к 21-м суткам 3,40 ± 1,33 мкВ (p<0,05; рисунок 25, 26). а б в Рисунок 26 – ССВП у животного № 1 2-й группы серии S2: а – ССВП до оперативного вмешательства; б – через 14 суток и в – через 21 сутки после формирования очагового повреждения мозга. Снижение амплитуды ССВП на поврежденной стороне регистрировалось на 7-е, 14-е и 21-е сутки у всех 8-и животных. Лишь у двух крыс этой группы наблюдалось незначительное спонтанное восстановление амплитуды ССВП к 21-м суткам. Кроме того, у 5-и из 8-и животных на 14-е сутки по сравнению с исходными значениями отмечалось снижение ССВП в интактном полушарии (рисунок 25 б), 87 что обусловило тенденцию к снижению средних значений амплитуды ССВП на 14-е (с 7,20 ± 1,19 до 5,30 ± 2,22 мкВ; p>0,05) и 21-е (6,30 ± 0,96 мкВ; p>0,05) сутки. Моделирование очагового повреждения приводило также к увеличению задержки ССВП с 9,20 ± 0,99 мс до 11,00 ± 1,14 мс, p>0,05 (различия не достоверны). Подобно второй, у животных 3-й группы на 7-е сутки после операции выявлялось выраженное снижение амплитуды ССВП (с 8,00 ± 0,97 до 2,20 ± 1,42 мкВ; p<0,05) и незначительное увеличение задержки основных компонентов ССВП (с 11,20 ± 1,42 до 12,60 ± 1,37 мс; p>0,05) (рисунок 25 а). Однако введение МСК в первые сутки после операции приводило к значимому увеличению амплитуды ССВП к 14-м суткам у большинства особей (6 из 8-и) (рисунок 25 а). К этому сроку среднее значение амплитуды практически не отличалось от исходного показателя (7,90 ± 2,00 мкВ по сравнению с 8,00 ± 0,97 мкВ до операции). В итоге к 21-м суткам у всех животных амплитуды ССВП практически полностью восстанавливались. На рисунке 27 представлены ССВП одного из животных третьей группы при наблюдении в динамике на протяжении 21-х суток. Суммируя полученные данные, можно заключить, что отсутствие выраженных изменений ССВП у животных 1-й группы серии S3 подтверждает сохранность функциональной активности головного мозга при выполнении трепанации. Формирование кровотока локального ассоциируется с ПГМ вследствие выраженными нарушения изменениями венозного регистрируемых потенциалов в течение всего срока (21 сутки) наблюдения. Наибольшая выраженность изменений ССВП на стороне поражения и незначительность этих изменений на интактной стороне являются дополнительными аргументами в пользу очагового характера моделируемого повреждения. Тем не менее, наличие изменений ССВП в контралатеральном полушарии у 5-и из 8-и животных может отражать тяжесть процесса, обусловливающего у ряда животных вовлечение в патологический процесс интактного полушария. 88 а б в г Рисунок 27 – ССВП у животного № 6, 3-й группы серии S3: а – до оперативного вмешательства; б – через 7 суток; в – через 14 суток и г – через 21 сутки после формирования нарушения венозного кровообращения. Наконец, улучшение показателей ССВП на фоне трансплантации МСК свидетельствует о позитивном эффекте МСК на восстановление функциональной активности головного мозга в виде значительного увеличения амплитуды ССВП к 14-м суткам эксперимента у большинства животных, с полным восстановлением амплитуд к 21-м суткам. Полученные в данном исследовании результаты свидетельствуют о том, что моделирование локального повреждения головного мозга, обусловленного нарушением венозного кровотока, ассоциируется с изменением электрофизиологической активности головного мозга у экспериментальных животных. Динамика ССВП при самопроизвольном восстановлении и на фоне трансплантации МСК существенно различалась, что свидетельствует, с одной стороны, о невысокой скорости естественного восстановления функционального 89 состояния коры головного мозга в данной модели, а с другой стороны – об эффективности клеточной терапии в коррекции функциональной активности головного мозга при очаговых поражениях. Вышесказанное убеждает в перспективности использования ССВП с целью оценки эффективности клеточной терапии. 3.4. Влияние МСК на характер морфологических изменений в модели очагового повреждения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровотока Для оценки возможного уровня позитивности механизма МСК на восстановление венозного неврологического кровотока проведен дефицита при сравнительный модельных анализ нарушениях морфологических изменений поврежденного головного мозга в случаях с самопроизвольным его восстановлением (контроль) и с восстановлением, обусловленным трансплантацией МСК. Согласно данным литературы, механизмы действия трансплантируемых МСК связывают в первую очередь с их паракринными эффектами, направленными на стимуляцию ангио- и нейрогенеза, предупреждение гибели нервных клеток и подавление воспаления [224]. Поэтому морфологические исследования были нацелены на анализ показателей, прямо или косвенно характеризующих эти процессы. В частности, оценивалась объемная плотность формирующихся кровеносных капилляров – как характеристика ангиогенеза, соотношение площади среза кровеносных капилляров к площади среза вен – как косвенный признак деструктивного отека и проницаемости сосудов. При исследовании цитоархитектоники производили подсчет волокнистых астроцитов, фибробластов и макрофагов (характеризующих воспалительный и репаративный процессы). 90 Изменения головного мозга на 7-е сутки исследования. Макроскопически: отмечается незначительное пролабирование мозгового вещества в трепанационный дефект. Микроскопически: в очаге повреждения наблюдается макрофагальная реакция с элиминацией продуктов распада, пролиферация фибробластов, формирование рыхлой соединительной ткани, увеличение астроцитарной глии, внедрение сосудов из демаркационной зоны (рисунок 28). а б Рисунок 28 – Макрофагальная реакция и начало организации зоны повреждения: а – элиминация продуктов распада макрофагами; б – формирования рыхлой соединительной ткани с пролиферацией сосудов. Окрашено гематоксилин-эозином. Увеличение 200. Объемная плотность кровеносных капилляров в площади среза в группе с внутривенным введением МСК на 1-е сутки с момента поражения мозга составляла 24,50 ± 2,70 и достоверно превышала таковую у крыс контрольной группы № 1 серии S2 (16,30 ± 1,40). Объемная плотность кровеносных капилляров в группе с местным введением клеток в очаг поражения мозга на 1-е сутки составляла 19,50 ± 0,30 и также превышала соответствующий показатель в группе контроля. При этом анализируемый показатель в группе с внутривенным введением МСК был достоверно выше (p<0,05), чем при локальном введении клеток в эти же сроки. Отношение площади среза кровеносных капилляров к площади среза вен (индекс К/В) в группе контроля № 1 серии S2 составило 0,72 ± 0,19, тогда как в группе № 3 с внутривенным введением МСК на 1-е сутки данный показатель был в практически в 2, 5 раза выше и составлял 1,78 ± 0,67 (p<0,05). В то же время 91 введение МСК в зону повреждения головного мозга у животных группы № 5 серии S2 не приводило к возрастанию индекса К/В: данный показатель оставался на уровне контрольной группы – 0,66 ± 0,19. Абсолютное и относительное количества клеточных элементов демаркационной зоны (на границе с инфарктом) при разных способах введения МСК представлены в таблице 8. Таблица 8 – Абсолютное и относительное содержание клеток на границе с инфарктом на 7-е сутки (М ± m), N (%). В/в введение Локальное введение МСК МСК (1-е сут, гр. 3) (1-е сут, гр. 5) 12,80 ± 2,29 21,70 ± 3,78 10,10 ± 1,22 Волокнистые астроциты (21,50 ± 2,90) (32,60 ± 1,90*) (18,60 ± 0,10) 5,00 ± 2,20 12,50 ± 3,12 7,12 ± 1,59 Фибробласты (10,14 ± 4,88) (17,44 ± 1,23*) (12,33 ± 3,65) 7,56 ± 3,42 8,61 ± 1,52 10,84 ± 2,84 Макрофаги (14,60 ± 2,56) (15,05 ± 2,59) (19,70 ± 3,44) Примечание: (N) – численная плотность клеток на 105 мкм2 площади среза зоны; * – отличие величин значений по сравнению с контрольной группой достоверно Исследуемый параметр Контрольная группа Группа животных № 3 серии S2 с внутривенным введением МСК на 1-е сутки характеризовалась достоверно большим содержанием волокнистых астроцитов и фибробластов. Группа № 5 той же серии с местным введением МСК на 1-е сутки не отличалась от контрольной группы по содержанию других клеточных популяций. Таким образом, внутривенное введение МСК на 1-е сутки повышало интенсивность ангиогенеза, снижало выраженность отека, способствовало более активному формированию рубца и оказывало цитопротективный эффект на 7-е сутки. Аналогичные эффекты при локальном введении МСК на 1-е сутки проявлялись с меньшей степенью выраженности, либо не регистрировались вообще, что могло быть обусловлено, по нашему мнению, повреждающим действием катетера. 92 Изменения головного мозга на 14-е сутки исследования. Макроскопически: на 14-е сутки в области поврежденного головного мозга сформировалась кистозная полость размерами (0,4х0,7х0,9) см, заполненная ликвором, участки некроза не определялись. Микроскопически: на 14-е сутки в зоне повреждения наблюдалось формирование кистозной полости, ограниченной нежным глиомезенхимальным пролифератом (рисунок 29). а б Рисунок 29 – Организация очага повреждения группа № 3 серии S2: а – формирующаяся стенка дна кистозной полости, отграничивающаяся нежной глиомезенхимальной капсулой; б – глиомезенхимальная капсула на границе с очагом повреждения. Иммуногистохимическая реакция. Увеличение 200. Патологические изменения головного мозга в контрольной группе характеризовались дальнейшей резорбцией некроза и нарастанием репаративных изменений с пролиферацией глиальных элементов, разрастанием фибробластов, интенсивной продукцией аргирофильной волокнистости и нарастанием численной плотности волокнистых астроцитов. Объемная плотность капилляров в зоне среза в этой группе составила 16,90 ± 1,50. В то же время аналогичный показатель в 3-й группе был достоверно выше – 21,60 ± 0,90 (p<0,05). У животных с внутривенным и местным введением МСК на 7-е сутки (группы № 4 и № 6) этот показатель составлял 19,40 ± 1,70 и 17,60 ± 1,90 соответственно; в группе № 5 (с введением МСК в зону повреждения на 1-е сутки) плотность кровеносных капилляров была равной 16,90 ± 2,30 (рисунок 30). 93 Рисунок 30 – Интенсивность ангиогенеза в группах с трансплантацией МСК и у животных контрольной группы на 14-е сутки. Представлены средние значения и ошибка среднего показателя объемной плотности кровеносных сосудов. * – P<0,05 – различие между группами достоверно. Отношение площади среза капилляров к площади среза вен в контрольной группе составило 0,76 ± 0,04. В группах № 3 и № 4 индекс К/В был выше (1,20 ± 0,05 и 1,20 ± 0,10). В группах № 5 и № 6 данный показатель составлял соответственно 0,78 ± 0,04 и 0,67 ± 0,03, незначительно отличаясь от уровня в контрольной группе (p<0,05). Числовые значения клеточных субпопуляций в области принекротической зоны инфаркта представлены в таблице 9. Таблица 9 – Абсолютное и относительное содержание различных клеток на границе с инфарктом на 14-е сутки (М ± m), N (%) В/в ведение Местное В/в введение Местное МСК введение МСК МСК ввдение МСК (1-е сут, гр. 3) (1-е сут, гр. 5) (7-е сут, гр. 4) (7-е сут, гр. 6) Волокнистые 14,23 ± 1,18 24,22 ± 2,19 12,60 ± 2,31 20,70 ± 2,72 14,90 ± 2,85 астроциты (23,30 ± 3,55) (38,30 ± 0,64*) (21,45 ± 1,44) (31,74 ± 0,85*) (24,12 ± 3,42) 10,23 ± 2,67 16,50 ± 2,55 11,42 ± 2,49 13,50 ± 1,36 10,84 ± 0,99 Фибробласты (16,35 ± 2,34) (25,28 ± 2,89) (17,22 ± 0,26*) (21,30 ± 0,87*) (16,47 ± 2,56) 8,36 ± 2,90 4,61 ± 1,47 9,93 ± 2,44 6,33 ± 0,87 8,94 ± 1,49 Макрофаги (13,22 ± 1,46) (9,27 ± 1,83) (16,83 ± 1,29) (11,42 ± 3,12) (13,79 ± 2,38) Примечание: (N) – численная плотность клеток на 105 мкм2 площади среза зоны; * – отличие величин значений между группами достоверно Исследуемый Контрольная параметр группа 94 Как видно, внутривенное введение МСК как на 1-е, так и на 7-е сутки ассоциировалось с большим относительным содержанием в периинфарктной зоне волокнистых астроцитов и фибробластов. При локальном введении МСК эти эффекты были минимальны. Изменения головного мозга на 21-е сутки исследования. Макроскопически: кровоизлияний в полость и признаков воспаления выявлено не было. Умеренно пролабирующая кистозная полость размерами (0,3х0,7х0,8) см прозрачная, имеется четкая граница между зонами интактного и поврежденного головного мозга. Микроскопически: в зоне повреждения сформировался компактный глиомезодермальный рубец с небольшим количеством кист (рисунок 31). а б Рисунок. 31 – Морфологические изменения зоны повреждения на 21-е сутки: а – глиомезодермальный рубец компактного типа. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200; б – образование рубца на месте очага повреждения. Иммуногистохимическая реакция. Увеличение 200. На этой стадии исследования было отмечено уменьшение плотности капиллярных сосудов как в контрольной группе (14,96 ± 2,54), так и группах с трансплантацией МСК. Так данный показатель в 3-й, 4-й, 5-й и 6-й группах составил соответственно 11,40 ± 2,10; 13,90 ± 1,20; 16,80 ± 2,50 и 14,20 ± 3,30. Напротив, индекс соотношения площади среза капилляров к площади среза вен в контрольной группе по сравнению с предшествующим периодом несколько возрос, что свидетельствует о дальнейшем уменьшении отека. При этом 95 существенных различий в индексе К/В между контрольной группой и группами с трансплантацией МСК не наблюдалось. Так, индекс К/В в группе № 3 составлял 0,98 ± 0,20, в группе № 4 – 1,10 ± 1,10, в группе № 5 – 1,30 ± 1,10 и в группе № 6 – 1,20 ± 0,80. Данные, характеризующие клеточный состав в зоне организации, представлены в таблице 10. Таблица 10 – Клеточный состав зоны организации на 21-е сутки (М ± m), N (%) В/в ведение Местное В/в введение Местное МСК введение МСК МСК ввдение МСК (1-е сут, гр. 3) (1-е сут, гр. 5) (7-е сут, гр. 4) (7-е сут, гр. 6) Волокнистые 25,11 ± 0,35 35,11 ± 1,69 22,33 ± 1,57 29,43 ± 1,97 24,93 ± 3,18 астроциты (34,50 ± 2,13) (41,25 ± 1,24*) (29,14 ± 1,56) (38,90 ± 0,66) (33,85 ± 3,09) 19,22 ± 1,38 28,50 ± 1,25 17,92 ± 2,56 23,50 ± 1,36 18,02 ± 1,25 Фибробласты (29,43 ± 2,84) (35,19 ± 1,30) (26,38 ± 3,43) (32,84 ± 1,19) (27,43 ± 1,38) 4,22 ± 1,82 1,21 ± 1,74* 5,86 ± 1,66 2,11 ± 1,97* 4,19 ± 2,68 Макрофаги (9,02 ± 1,67) (2,89 ± 0,96)* (10,56 ± 2,23) (4,32 ± 2,27)* (8,11 ± 1,67) Примечание: (N) – численная плотность клеток на 105 мкм2 площади среза зоны; * – отличие величин значений между группами достоверно Исследуемый Контрольная параметр группа Глиомезодермальный рубец состоял из волокнистых астроцитов (рисунок 32) и фибробластов. Количество макрофагов снижено. Рисунок 32 – Группа №3, серии S2. Пролиферация астроглии в перифокальной зоне очага. Иммуногистохимическая реакция. Увеличение 200. 96 Введение МСК на 1-е сутки приводит к более эффективному очищению очага повреждения и формированию компактного глиомезенхимального рубца с менее выраженной кистозной дегенерацией к 21-м суткам. Зона повреждения замещена глиомезенхимальными структурами. При местном введении МСК подобных проявлений не было выявлено. Таким образом, исследование цитоархитектоники головного мозга у животных с внутривенной трансплантацией МСК свидетельствует о меньшей интенсивности воспалительного процесса и более эффективной репарации к 21-м суткам. Полученные результаты позволяют утверждать, что моделирование повреждений головного мозга путем коагуляции верхнего сагиттального синуса в средней трети и последующая коагуляция венозных корковых сосудов приводят к развитию инфаркта по смешанному типу с резорбцией некротической ткани и формированию глиального рубца с выраженной кистозной дегенерацией. Причиной развития некроза в разработанной модели является нарушение мозгового кровотока, которое морфологически проявляется выраженными нарушения микрогемоциркуляции с тромбозом, стазами в сосудах и кровоизлияниями разной степени выраженности. Отслеживание динамики изменений в процессе исследований показало, что введение МСК в остром периоде первой некротической стадии улучшает в последующем состояние микроциркуляции, о чем свидетельствовала большая плотность кровеносных капилляров к 7-м суткам у исследуемых животных по сравнению с группой контроля. Причем внутривенное введение МСК приводило к возрастанию данного показателя в 1,5 раза, тогда как непосредственное введение клеток в зону поражения через катетер – только в 1,2 раза. На 14-е сутки объемная плотность кровеносных сосудов в группе с внутривенным (на 1-е сутки) введением МСК также превышала данный показатель в контрольной группе. Другой характерной особенностью патологических изменений при транспланатации МСК были более высокие показатели отношения площади среза кровеносных капилляров к площади среза вен на 7-е сутки (группа № 3), по 97 сравнению с контрольной группой, что указывало на уменьшение деструктивного отека и сосудистой проницаемости на фоне внутривенного введения МСК. Начиная с 7-х суток помимо резорбции некротических масс, отмечалось нарастание репаративных процессов с пролиферацией глиальных элементов и фибробластов. Сравнение количественных параметров клеточных элементов мозга, участвующих в процессе организации зоны повреждения, показало, что эффект трансплантации МСК, особенно при внутривенном режиме введения, характеризовался на 7-е и 14-е сутки нарастанием клеточной массы, прежде всего волокнистых астроцитов, и фибробластов, непосредственно участвующих в формировании рубцовой ткани. Количество этих клеток особенно интенсивно нарастало и преобладало в группе № 3, достигая максимума на 21-й день исследования и превышая соответствующий показатель для клеток астроцитарного ряда в контроле в 1,6 раза. Схожие закономерности наблюдались и у животных с внутривенным введением МСК на 7-е сутки. Отсутствие подобных закономерностей при введении МСК в зону повреждения объясняется, по-видимому, непосредственным травмирующим воздействием катетера, что, скорее всего, и являлось причиной активации процессов альтерации, поддержания воспаления и менее эффективной репарации, в частности замедления организации тканевых структур. Введение МСК в первые сутки, возможно, решает проблему ограничения очага поражения и размеров принекротической зоны в сторону ее уменьшения (через подавление воспалительного процесса), что ускоряет процесс резорбции некротических масс, улучшает метаболические, и репаративные процессы тканей мозга, а так же дает основание для благоприятного прогноза. Кроме того, введение МСК на 1-е сутки позволяет добиться более раннего и эффективного усиления ангиогенеза. В свою очередь, введение МСК в подостром периоде (на 7-е сутки) оказывает стимулирующий эффект на процесс организации поврежденной нервной ткани, снижает выраженность дистрофических изменений и возможно, ограничивает воспалительный ответ на этапе организации поврежденной ткани. 98 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Цереброваскулярная патология вследствие нарушения венозного кровотока представляет серьезную проблему в связи со сложностью диагностики, недостаточной изученностью патогенеза и отсутствием эффективных методов лечения. При хирургическом удалении ПСМ, особенно локализованных в средней трети ВСС, нарушения венозного кровотока, которые приводят к развитию венозного инфаркта и сопровождаются выраженным неврологическим дефицитом, регистрируются приблизительно в 50 % случаев. Причем половина пациентов так и не восстанавливается полностью даже после реабилитационной терапии [15]. Поэтому разработка новых методов лечения цереброваскулярных расстройств продолжает оставаться насущной проблемой, и сегодня большие надежды возлагаются на клеточную терапию. Действительно, многочисленные экспериментальные исследования показали способность различных типов стволовых клеток улучшать неврологический статус в модели ишемического инсульта [85, 90, 113, 123, 235]. Однако вопрос о терапевтической эффективности клеточной терапии при нарушениях венозного кровотока остается открытым в силу отсутствия адекватных экспериментальных моделей данной патологии. С этой точки зрения разработка новой модели повреждения головного мозга вследствие нарушения венозного кровотока является важным результатом настоящей работы и имеет несомненное научно-практическое значение. Суть разработанного нового способа заключается в последовательной коагуляции и пересечении ВСС с последующей коагуляцией корковых вен в левой теменно-височной области. Данное хирургическое вмешательство приводит к выключению венозного кровотока в головном мозге и формированию в нем очага повреждения, что подтверждается данными МР-томограмм, полученных при помощи импульсных последовательностей FISP и RARE в аксиальных и коронарных плоскостях и на реконструированных объемных церебральных МРангиограммах. Разработанный способ (что подтверждено МРТ-изображениями) 99 обеспечивает выключение кровотока по синусам твердой мозговой оболочки и венам головного мозга, сохраняющееся до 23-х суток. При этом кровоток по экстра- и интракраниальным артериям сохраняется. Это сопровождается развитием в области хирургического головного мозга, прилежащего к вмешательства выраженного отека коагулированным участкам синуса и пролабирующего в трепанационное отверстие, с последующим (спустя две недели с момента травмы) формированием интрацеребральной ликворной кисты в зоне очага повреждения мозга на фоне сохраняющегося его отека. По данным гистологичекого исследования данный тип моделирования нарушения венозного церебрального кровотока приводит к развитию инфаркта головного мозга с формированием зоны некроза с последующей резорбцией некротических масс, формированием начиная с 14-х суток с момента повреждения глиального рубца и кистозной дегенерацией этой зоны. Характерной особенностью данной модели является развитие отека и выраженных нарушений микрогемоциркуляции с развитием тромбозов, стаза в сосудах и кровоизлияний разной степени выраженности. Формирование очагового повреждения мозга клинически проявляется возникновением выраженных неврологических расстройств: на фоне тяжелой общемозговой симптоматики возникают грубые очаговые расстройства в виде параплегий на гетеролатеральной стороне от повреждения и грубых парезов на гомолатеральной стороне. Неврологические выпадения в разработанной модели носят характер тяжелого неврологического дефицита и характеризуется низким уровнем спонтанного восстановления вплоть до 21-х суток с момента повреждения мозга в отличие от большинства моделей окклюзии среднемозговой артерии. Согласно данным литературы основным подходом при экспериментальном моделировании нарушений венозного кровотока является окклюзия ВСС, индуцированная путем лигирования венозного синуса, введения тромбогенного материала, эмболизации или индукции тромбоза с помощью FeCl3 или фотохимической обработки [86, 111, 129, 194]. Однако эти подходы имеют ряд 100 недостатков, что обусловлено гибелью животных вследствие разрушения структуры синуса, низкой воспроизводимостью модели, серьезными осложнениями в результате повреждения ткани мозга и сосудов, высокой скоростью перфузии эмболов (в случае эмболизации) и большими материальными и временными использования затратами данных [159, моделей. 201], что ограничивает Проблемой является возможность также частичная реканализация тромбированного синуса. С этой точки зрения разработанная модель очагового повреждения головного мозга имеет ряд преимуществ (тяжесть неврологического дефицита, низкий уровень самопроизвольного восстановления), что в наибольшей степени приближает его симптоматику к патогенезу осложнений, наблюдаемых при удалении ПСМ. Вторым важным результатом, полученным в настоящем исследовании, являются данные о безопасности и терапевтической эффективности МСК в коррекции неврологических нарушений в рамках разработанной модели. Проведенные исследования, по сути, впервые позволили охарактеризовать влияние различных способов трансплантации МСК на восстановление неврологического дефицита, обусловленного нарушением венозного кровотока в головном мозге. Согласно полученным данным, внутривенное и местное введение МСК в остром (на 1-е сутки) и подостром (на 7-е сутки) периодах является безопасным, не вызывает каких-либо серьезных осложнений или побочных реакций и приводит к более эффективному восстановлению неврологических функций у экспериментальных животных по сравнению с животными контрольных групп. Как показали наши исследования, более выраженное неврологическое восстановление на фоне трансплантации МСК обусловлено регрессом двигательных и чувствительных нарушений и максимально проявляется при внутривенном введение клеток на 1-е сутки после формирования модели. Позитивный эффект клеточной терапии на основе МСК наиболее хорошо исследован в модели ишемического инсульта и проявляется усилением 101 двигательной активности, улучшением поведенческих реакций и когнитивных функций животных [89, 226, 228]. Исследования на модели ишемического инсульта также показали, что восстановление неврологического дефицита наблюдается как при интрацеребральном/внутрижелудочковом, так и при внутрисосудистом введении клеток [165, 227, 234], рядом авторов установлено, что эффективность при внутривенном введении клеток превышает таковую при интрацеребральной их имплантации [167]. Кроме того, было показано, что клиническое и морфологическое улучшение выявляются как при введении клеток в ранние сроки (на 1–2-е сутки после окклюзии среднемозговой артерии), соответствующие острому периоду, так и в более поздние сроки, соответствующие подострому – через 1 неделю и отдаленному (через 1 месяц после повреждения мозга) периодам [141, 163, 230]. Эти данные во многом согласуются с полученными нами результатами. При этом нами впервые показана способность МСК купировать грубый стойкий неврологический дефицит, обусловленный нарушением венозного кровотока. Объективизацией позитивного эффекта МСК в разработанной модели являются данные нейрофизиологического обследования. Так, если животные контрольных групп характеризовались выраженным снижением амплитуды ССВП на протяжении всего послеоперационного периода (что свидетельствовало о стойком нарушении функциональной активности головного мозга), то у животных с трансплантацией МСК отмечалась положительная динамика в виде частичного восстановления амплитуды ССВП уже на 14-е сутки и полного восстановление – на 21-е сутки. Следует отметить, что клинический эффект МСК проявлялся достаточно быстро. Так, улучшение неврологического восстановления в группах животных с введением МСК на 1-е сутки послеоперационного периода наблюдалось уже на 7– 14-е сутки, и, следовательно, не могло быть связано с «заместительным» эффектом вследствие дифференцировки МСК в нервные клетки. То есть эффект МСК был, скорее всего, обусловлен паракринными эффектами вводимых клеток. Действительно, рядом авторов в модели ишемического инсульта было показано, 102 что быстро развивающийся эффект клеточной терапии может наблюдаться даже в отсутствии интеграции вводимых клеток в зоне повреждения и обусловлен антиапоптотическим действием МСК, что проявляется уменьшением размера зоны инфаркта [230], активацией ангио-, нейро- и синаптогенеза, ремоделированием (уменьшением рубцовой ткани) [90, 106, 114, 141, 163, 165], а также подавлением воспалительного ответа [97]. Это объясняется способностью МСК продуцировать широкий набора факторов, обладающих нейропротективным эффектом, а также стимулирующих ангио- и нейрогенез [100, 238]. Кроме того, МСК, обладая противовоспалительной, иммуномодулирующей активностями, подавлять способны воспаление и (в антифибротической том числе за счет восстановления ГЭБ) и обеспечивать ремоделирование внеклеточного матрикса [95, 207, 224]. Исследование морфологических изменений головного мозга животных в разработанной модели продемонстрировало, что животные с внутривенным введением МСК отличались от контрольных животных более высокими показателями плотности кровеносных капилляров, отношения площади капилляров к площади вен. Полученные в целом данные свидетельствуют об эффективности МСК в коррекции неврологического дефицита, индуцированного нарушением церебрального венозного кровотока, и обосновывают перспективность дальнейшего развития клеточных технологий в лечении цереброваскулярной патологии. 103 ВЫВОДЫ 1. Разработана новая экспериментальная модель очагового повреждения головного мозга крыс путем коагуляции верхнего сагиттального синуса с последующей коагуляцией корковых вен в левой теменно-височной области, ведущей к нарушению венозного кровообращения, что проявляется в остром периоде нарушением кровообращения венозного характера в виде тяжелого неврологического дефицита с доминированием очаговых расстройств, сочетающихся с общемозговой симптоматикой, и характеризуется низким уровнем спонтанного восстановления. 2. Повреждение головного мозга в разработанной модели характеризуется по данным МРТ формированием зоны отека с последующим образованием интрацеребральной исследования – кистозной полости, формированием а зоны по данным некроза на гистологического фоне нарушений микроциркуляции (развитие тромбозов, стаза и кровоизлияний) с последующей резорбцией некротических масс и формированием глиального рубца с выраженной кистозной дегенерацией. 3. Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток в количестве 2х106 клеток на одно животное, как при внутривенном, так и местном их введении, приводит к достоверному снижению тяжести неврологического дефицита, при этом наиболее выраженный эффект мезенхимальных стромальных клеток регистрируется при использовании внутривенного введения клеток на 1-е сутки после формирования очага нарушения венозного кровотока. 4. В отличие от контрольных животных, состояние которых характеризуется выраженным снижением амплитуды сомато-сенсорных вызванных потенциалов на протяжении всего послеоперационного периода, животные с трансплантацией мезенхимальных стромальных клеток отличаются положительной динамикой сомато-сенсорных вызванных потенциалов на 14-е сутки и полным восстановлением электрофизиологической активности к 21-м суткам. Это подтверждает низкую эффективность спонтанного восстановления функции 104 головного мозга в рамках разработанной модели и свидетельствует об эффективности клеточной терапии. 5. Морфологические изменения внутривенной трансплантацией сравнению контрольной с головного мезенхимальных группой мозга у стромальных характеризуются более животных с клеток по выраженной активацией ангиогенеза, меньшей выраженностью отека, быстрой санацией участков мозга с формированием глиомезедермального рубца. 105 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Разработанная экспериментально модель тяжелого очагового поражения головного мозга венозного характера является основой изучения патогенеза венозных нарушений головного мозга и позволяет исследовать эффективность различных фармакологических и клеточных технологий восстановления утраченных функций мозга при данной патологии. Отсутствие осложнений и положительный эффект МСК на морфофункциональное восстановление головного мозга у экспериментальных животных в оригинальной модели ишемического поражения головного мозга является основанием для дальнейших экспериментальных исследований и клинической апробации МСК в нейрохирургической практике. Исследования ССВП и МРТ головного мозга, наряду с клиническими данными, являются объективными методами, подтверждающими эффективность морфо-функционального восстановления очаговых повреждений головного мозга, и могут быть использованы для мониторирования эффектов клеточной терапии. 106 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВСС Верхний сагиттальный синус ГИШ Глобальная ишемия мозга ГСК Гемопоэтические стволовые клетки ГЭБ Гематоэнцефалический барьер ИГМ Ишемия головного мозга К/В Капилляры к площади среза вен МРТ Магнитно-резонансная томография МСК Мезенхимальные стромальные клетки ОТНН Оценка тяжести неврологических нарушений ПГМ Поражение головного мозга ПСМ Парасагиттальная менингиома СК Стволовые клетки СМА Средняя мозговая артерия ССВП Сомато-сенсорные вызванные потенциалы ЦНС Центральная нервная система ЭП Эндотелиальные предшественники PU критерий Манна-Уитни для независимых выборок PКЗ критерий знаков для зависимых выборок S1, S2, S3, S4 vs Серия 1, Серия 2, Серия 3, Серия 4 Versus – против 107 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Акопян, Ж. А. Функциональная активность эндотелиальных, мезенхимальных и циркулирующих прогениторных клеток при повышенной концентрации глюкозы in vitro и гипергликемии у больных сахарным диабетом : автореф. дис. … канд. мед. наук : 03.01.04 : 03.03.04 / Ж. А. Акопян. – Москва, 2012. – 25 с. 2. Арутюнов, А. И. Строение и функция стабилизирующих конструкций мозговых артерий в свете патогенеза спазма артерий после разрыва аневризм (второе сообщение) / А. И. Арутюнов, М. А. Барон, Н. А. Майорова // Вопр. нейрохирургии. – 1973. – № 3. – С. 3–10. 3. Бабенков, Н. В. Нарушения венозного кровообращения мозга: патогенез, клиника, течение, диагностика (обзор литературы) / Н. В. Бабенков // Журн. невропатологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. – 1984. – Т. 84, № 2. – С. 281–288. 4. Багметов, М. Н. Церебропротекторное действие композиций фенибута и фенотропила и их солей в условиях экспериментальной ишемии головного мозга : автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.25 / М. Н. Багметов. – Волгоград, 2006. – 25 с. 5. Балязин, В. А. Итоги хирургического лечения внутричерепных менингитом за 40 лет / В. А. Балязин, Э. С. Темиров // Вопр. нейрохирургии. – 1999. – № 4. – С. 20–25. 6. Бердичевский, М. Я. Венозная дисциркуляторная патология головного мозга / М. Я. Бердичевский. – Москва : Медицина, 1989. – 224 с. 7. Беставишвили, Ф. И. Неврологическая симптоматика при парасагиттальных менингиомах в связи с нарушением венозного кровообращения / Ф. И. Беставишвили // Журн. неврологии и психиатрии. – 1995. – Т. 95, № 6. – С. 10–15. 108 8. Бестаев, Ф. И. Нарушение венозного кровотока при парасагиттальных менингиомах во время операции : автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.28. / Ф. И. Бестаев. – Москва, 1989. – 23 с. 9. Большаков, О. П. О значении пульсовых колебаний внутренней сонной артерии для венозного кровотока в пазухах твердой мозговой оболочки / О. П. Большаков // Механизмы нейро-гуморальной регуляции вегетативных функций. – Ленинград : Наука, Ленингр. отд-ние, 1970. – С. 12–17. 10. Большой сальник: анатомия, физиология, патология, хирургия, исторический очерк : руководство : пер. с англ. / Р. Аусфилд [и др.] ; под ред. Д. Либерманн-Меффет, Х. Уайта. – Москва : Медицина, 1989. – 335 с. 11. Вальдман, В. А. Заболевания венозной сосудистой системы / В. А. Вальдман. – Ленинград : Медицина, Ленингр. отд-ние, 1967. – 142 с. 12. Верещагин, Н. В. К морфологии и патогенезу патологической извитости и перегибов внутренних сонных и позвоночных артерий / Н. В. Верещагин, А. Н. Колтовер // Арх. патологии. – 1966. – № 12. – С. 11–16. 13. Влияние сроков трансплантации мезенхимных стволовых клеток на репарацию сердечной мышцы крыс после инфаркта / П. В. Кругляков [и др.] // Цитология. – 2005. – Т. 47, № 5. – С. 404–416. 14. Возможности применения клеточной терапии при лечении ишемического инсульта в эксперименте / И. Б. Соколова [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2007. – Т. 11, № 4. – С. 54–62. 15. Габибов, Г. А. Парасагиттальные менингиомы и их хирургическое лечение / Г. А. Габибов. – Москва : Медицина, 1975. – 231 с. 16. Габибов, Г. А. Принципы хирургии парасагиттальных менингиом: современное состояние проблемы / Г. А. Габибов, А. В. Козлов // Вопр. нейрохирургии. – 1994. – № 1. – С. 3–7. 17. Глебов, М. В. Тромбозы церебральных венозных синусов / М. В. Глебов [и др.] // Анналы клинич. и эксперим. неврологии. – 2011. – Т. 5, № 1. – С. 4–10. 109 18. Гнездицкий, В.В. Вызванные потенциалы мозга в клинической практике / В.В. Гнездицкий. – Таганрог: Издательство ТРТУ, 1997. – 252 с. 19. Гусев, Е. И. Ишемия головного мозга / Е. И. Гусев, В. И. Скворцова. – Москва : Медицина, 2001. – 327 с. 20. Диагностика и хирургическое лечение парасагиттальных менингиом : метод. рекомендации / сост.: Г. С. Тиглиев [и др.]. – Ленинград : Изд-во ЛНХИ им. А. Л. Поленова, 1989. – 13 с. 21. Диагностика и этапное лечение дистонических венозных энцефалопатий : метод. рекомендации / сост.: М. Я. Бердичевский [и др.] ; Кубан. мед. ин-т им. Красной Армии, Соч. науч.-исслед. ин-т курортологии и физиотерапии. – Краснодар, 1981. – 22 с. 22. Иванов, А. Ю. Нарушения венозного оттока от головного мозга у больных сосудистой и нейроонкологической патологией : автореф. дис. … д-ра мед. наук : 14.01.18: 14.03.03 / А. Ю. Иванов. – Санкт-Петербург, 2011. – 38 с. 23. Исмагилов, М. Ф. Ишемический мозговой инсульт: терминология, эпидемиология, принципы диагностики, патогенетические подтипы, терапия острого периода заболевания / М. Ф. Исмагилов // Неврол. вестн. – 2005. – Т. 37, вып. 1/2. – С. 67–76. 24. К вопросу клинико-неврологической характеристики инсультов / Л. М. Тибекина [и др.] // Вестн. Санкт-Петерб. ун-та. Сер. 11, Медицина. – 2009. – № 3. – С. 174–179. 25. Камалова, Г. М. Диагностика менингиом полушарий большого мозга на догоспитальном этапе / Г. М. Камалова // Журн. неврологии и психиатрии. – 1997. – Т. 97, № 12. – С. 51–53 . 26. Канарейкин, К. Ф. Нарушения венозного кровообращения / К. Ф. Канарейкин // Сосудистые заболевания нервной системы. – Москва : Медицина, 1975. – С. 437–449. 27. Клосовский, Б. Н. Циркуляция крови в мозгу / Б. Н. Клоссовский. – Москва : Медгиз, 1951. – 372 с. 110 28. Козлов, А. В. Результаты хирургического лечения внутричерепных менингиом (продолженный рост и прогнозирование) : автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.28 / А. В. Козлов. – Москва, 1988. – 24 с. 29. Коновалов, А. Н. Клиника и микрохирургическое лечение менингиом блюменбахова ската / А. Н. Коновалов, У. Б. Махмудов // Вопр. нейрохирургии. – 1986. – № 1. – С. 3–13. 30. Космарская, Е. Н. К вопросу о коллатериальном кровообращении в мозгу / Е. Н. Космарская // Журн. невропатологии и психиатрии. – 1953. – Т. 53, № 9. – С. 702–707. 31. Кулеша, Г. Б. К вопросу о нарушениях венозного кровообращения в мозгу / Г. Б. Кулеша // Материалы научных работ по невропатологии и психиатрии. – Краснодар, 1966. – С. 79–80. 32. Литвиненко, Д. В. Венозное кровообращение головного мозга при травматических дефектах черепа : автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.28 / Д. В. Литвиненко. – Санкт-Петербург, 2006. – 21 с. 33. Микрохирургическая реваскуляризация очагов ишемии головного мозга аутотрансплантатом большого сальника / Г. С. Тиглиев [и др.] // Вопр. нейрохирургии. – 1994, № 3. – С. 34–35. 34. Минакина, Л. Н. Нейропротекторный эффект циклопентиладенозина при глобальной ишемии головного мозга у мышей / Л.Н. Минакина // Фундаментальные исследования. – 2008. –№9. – С60–61. 35. Минакина, Л. Н. Моделирование глобальной ишемии головного мозга / Л. Н. Минакина // Успехи соврем. естествознания. – 2008. – № 12. – С. 53– 54. 36. Моделирование церебральной ишемии посредством коагуляции средней мозговой артерии у крыс / А. И. Трофименко [и др.] // Фундам. исследования. – 2012. – № 2. – С. 215–218. 37. Можаев, С. В. Хирургия менингиом верхнего сагиттального синуса (реконструктивные и реваскуляризирующие операции) : дис. … д-ра мед. наук : 14.00.28 / С. В. Можаев. – Санкт-Петербург, 1993. – 340 с. 111 38. Москаленко, Ю. Е. О роли внутричерепных вен в механизме регуляции мозгового кровотока / Ю. Е. Москаленко, Г. Б. Вайнштейн // Труды Международного симпозиума по регуляции емкостных сосудов. – Москва : Медицина, 1977. – С. 120–129. 39. Москаленко, Ю.Е. Внутричерепная гемодинамика. Биофизические аспекты / Ю. Е. Москаленко, Г. Б. Вайнштейн, И. Т. Демченко. – Ленинград : Наука, Ленингр. отд-ние, 1975. – 202 с. 40. Нарушение венозного оттока из головы при непроходимости верхней полой вены / А. А. Вишневский [и др.] // Венозная патология головного и спинного мозга : (тез. докл. к всерос. науч.-практ. конф.). – Краснодар, 1979. – С. 176–178. 41. Нарушения интракраниального венозного кровообращения при менингиомах парасагиттальной локации / Г. Г. Музлаев [и др.] // Материалы III съезда нейрохирургов России. – Санкт-Петербург, 2002. – С. 146–147. 42. Неймарк, Е. З. К дифференциальной диагностике венозных инсультов / Е. З. Неймарк // Дифференцированное применение психотропных средств в психиатрии и неврологии. Диагностика, клиника и лечение инсультов : материалы Респ. конф. психиатров и невропатологов, июнь, 1971 г. – Львов, 1971. – С. 357– 360. 43. Неймарк, Е. З. Тромбозы внутричерепных синусов и вен / Е. З. Неймарк. – Москва : Медицина, 1975. – 184 с. 44. Некоторые итоги и перспективы хирургического лечения околоселлярных менингиом с применением микрохирургической техники / А. Н. Коновалов [и др.] // Опухоли головного мозга. – Москва, 1975. – С. 130–136. 45. Неодимовый лазер в хирургии церебральных менингиом / В. В. Ступак, С. Г. Струц, М. А.Садовой, А. П. Майоров. – Новосибирск : Наука, 2013. – 267 с. 46. Нестеров, Л. Н. Регионарно-церебральные и системные нарушения гемодинамики при опухолях головного мозга / Л. Н. Нестеров, Ю. И. Кравцов, А. Н. Богданов // Вопр. нейрохирургии. – 1978. – № 2. – С. 19–24. 112 47. Никифоров, Б. М. Опухоли головного мозга / Б. М. Никифоров, Д. Е. Мацко. – Санкт-Петербург [и др.] : Питер, 2003. – 311 с. – (Краткое руководство). 48. Паносян, А. Г. Диагностика и лечение менингиом фалькс– тенториального угла : автореф. дис. … канд. мед. наук : 14.00.28 / А. Г. Паносян. – Москва, 1987. – 23 с. 49. Петрова, О. А. Комплексная реабилитация больных в раннем восстановительном периоде ишемического мозгового инсульта в амбулаторнополиклинических условиях : дис. ... канд. мед. наук : 14.00.13 / О. А. Петрова. – Екатеринбург, 2005. – 187 с. 50. Покалев, Г. М. Нейроциркуляторные дистонии / Г. М. Покалев, В. Д. Трошин. – Горький : Волго-Вят. кн. изд-во, 1977. – 319 с. 51. Регуляция мозгового кровообращения : тр. IV Тбил. симп. по мозговому кровообращению, 19–21 апр. 1978 г. / общ. ред. Г.И. Мчедлишвили. – Тбилиси : Мецниереба, 1980. – 158 с. 52. Рыжий, А. В. Нарушения церебрального венозного кровообращения при опухолях головного мозга супра- субтенториальной локализации : дис. … канд. мед. наук. : 14.00.28 / А. В. Рыжий. – Санкт-Петербург, 2004. – 143 с. 53. Рясина, Т. В. Последствия выключения стриарных вен (экспериментально–морфологическое исследование) / Т. В. Рясина // Арх. патологии. – 1970. – № 3 . – С. 57–61. 54. Самойленкова, Н. С. Защитный эффект прекондиционирования при фокальной ишемии мозга: роль АТФ-зависимых калиевых каналов : автореф. дис. … канд. биол. наук / Н. С. Самойленкова ; Моск. гос. ун-т. – Москва, 2008. – 25 с. 55. Саратиков, А. С. Экспериментальная и клиническая фармакология мозгового кровообращения / А. С. Саратиков, В. В. Белопасов, М. Б. Плотников. – Томск : Изд-во Том. ун-та, 1979. – 248 с. 56. Саркисов, Д. С. Микроскопическая техника : руководство для врачей и лаборантов / Д. С. Саркисов, Ю. Л. Перов. – Москва : Медицина, 1996. – 544 с. 113 57. Семенов, С. Е. Ультразвуковые критерии гемодинамической значимости обструкции брахиоцефальных вен / С. Е. Семенов [и др.] // Клинич. физиология кровообращения. – 2009. – № 3. – С. 42–50. 58. Семченко В. В. Гистологическая техника / В. В. Семченко, С. А. Барашкова, В. Н. Артемьев. – Омск : Омская мед. акад., 2003. –152 с. 59. Современные принципы хирургического лечения менингиом околоселлярной локализации / А.Н. Коновалов [и др.] // Современные проблемы . – Ленинград, 1977. – С. 5–6. 60. Сосудистые нарушения в раннем послеоперационном периоде у больных интракраниальными менингиомами / Ю. С. Боровкова [и др.] // Поленовские чтения : всерос. науч.-практ. конф., 11–13 апр. 2005 г. : материалы конф. – Санкт-Петербург, 2005. – С. 272–273. 61. Стулин, И. Д. Энцефалопатия пробуждения – синдром преходящей венозной дисгемии у флебопатов / И. Д. Стулин [и др. ]. // Клинич. физиология кровообращения. – 2009. – № 3. – С. 33–36. 62. Таубер, А. С. Хирургия головного мозга: клинические лекции / А. С. Таубер. – Санкт-Петербург : Паровая скоропечатня И. А. Богельман, 1898. – 440 с. 63. Терапия экспериментального инфаркта миокарда у крыс с помощью трансплантации сингенных мезенхимных стволовых клеток / П. В. Кругляков [и др.] // Цитология. – 2004. – Т. 46, № 12. – С. 1043–1054. 64. Тиглиев Г.С. О принципах хирургии экстрацеребральных опухолей / Г. С. Тиглиев // Хирургия внутричерепных экстрацеребральных опухолей. – Санкт-Петербург, 1997. – С. 10–22. 65. Тиглиев, Г. С. Основные принципы и техническое обеспечение микрохирургических операций / Г. С. Тиглиев // Хирургия внемозговых опухолей. – Ленинград, 1981. – С. 14–17. 66. Тиглиев, Г. С. Особенности хирургическго лечения базальных менингиом с супра-субтенториальным распространением / Г. С. Тиглиев, М. Ф. Чернов // Вопр. нейрохирургии. – 1998. – № 1. – С. 3–7. 114 67. Тиглиев, Г. С. Внутричерепные менингиомы / Г. С. Тиглиев, А. Н. Кондратьев, В. Е. Олюшин. – Санкт-Петербург, 2001. – 555 с. 68. Тимиргаз, В. В. Результаты хирургического лечения парасагиттальных менингиом : автореф. дис. … канд. мед наук: 14.00.28 / В. В. Тимиргаз. – Москва, 1994. – 20 с. 69. Фадеева, Т. Н. Электрофизиологический контроль в хирургии внутричерепных экстрацеребральных опухолей : автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.28, 14.00.17 / Т. Н. Фадеева. – Санкт-Петербург, 1997. – 22 с. 70. Федоров, В. Н. Некоторые механизмы ишемического повреждения головного мозга в острейшем периоде церебрального инсульта и их коррекция нейропротекторами : дис. ... канд. мед. наук: 14.01.11 / В. Н. Федоров. – Москва, 2012. – 140 с. 71. Хирургическое лечение ишемических инсультов / С. В. Можаев, В. Н. Вавилов, И. Э. Белоусова, А. М. Пономарев // I съезд нейрохирургов Российской Федерации : тез. докл. – Екатеринбург, 1995. – С. 261–262. 72. Хирургическое лечение менингиом верхнего сагиттального синуса (тактика и техника операций) / Г. С. Тиглиев [и др.] // Вопр. нейрохирургии. – 1994. – № 3. – С. 19–21. 73. Хирургическое лечение менингиом области бугорка турецкого седла / А. Н. Коновалов [и др.] // Опухоли хиазмально-селлярной. – Москва, 1976. – С. 10–17. 74. Хирургия внутричерепных экстрацеребральных опухолей : [сб. науч. тр.] / Рос. науч.-исслед. нейрохирург. ин-т им. А. Л. Поленова ; под ред. Г. С. Тиглиева, В.Е Олюшина. – Санкт-Петербург, 1997. – 277 с. 75. Хирургия опухолей основания черепа / А. Н. Коновалов [и др.] ; под ред. А. Н. Коновалова; Ин-т нейрохирургии им. Н. Н. Бурденко Рос. акад. мед. наук. – Москва : НИИ нейрохирургии, 2004. – 371 с. 76. Хирургия основания черепа / А. Н. Коновалов [и др.] // Вопр. нейрохирургии. – 1998. – № 4. – С. 3–9. 115 77. Холоденко, М. И. Расстройства венозного кровообращения в мозгу / М. И. Холоденко. – Москва : Медгиз, 1963. – 228 с. 78. Чернов, С. В. Микрохирургия парасагиттальных менингиом головного мозга с использованием хирургического лазера : дис. … канд. мед. наук: 14.00.28 / С. В. Чернов. – Новосибирск, 2008. – 161 с. 79. Шахнович, А. Р. Неинвазивная оценка венозного кровообращения мозга, ликвородинамики и краниовертебральных объемных соотношений при гидроцефалии / А. Р. Шахнович, В. А. Шахнович // Клинич. физиология кровообращения. – 2009. – № 3. – С. 5–15. 80. Шебзухова, Л. М. Начальные неврологические признаки и их динамика в течении менингиом верхнего сагиттального синуса / Л. М. Шебзухова, В. П.Берснев, Л. Н. Маслова // Практ. неврология и нейрореабилитация. – 2007. – № 1. – С. 34–38. 81. Шефер, Д. Г. Вопросы клиники и патогенеза тромбоза позвоночных и основной артерии / Д. Г. Шефер, З. С. Манелис, Н. А. Чуприянова // Журн. невропатологии и психиатрии. – 1962. – Т. 62, № 11. – С. 1647–1654. 82. Шмидт, Е. В. Новое в понимании механизма нарушений мозгового кровообращения / Е. В. Шмидт // Клинич. медицина. – 1960. – № 6. – С. 12–18. 83. Шмидт, Е. В. Актуальные вопросы в области сосудистой патологии мозга // Вестн. Акад. мед. наук СССР. – 1970. – № 5. – С. 5–11. 84. Экспериментальный геморрагический инсульт: исследование нейропептидов (МИФ, селанк) при внутрибрюшинном введении / В. И. Скворцова [и др.] // Журн. неврологии и психиатрии. – 2009. – Т. 109, № 12, вып. 2 : Инсульт. – С. 62– 66. 85. Ярыгин, К. Н. Нейрогенез в центральной нервной системе и перспективы регенеративной неврологии / К. Н. Ярыгин, В. Н. Ярыгин // Журн. неврологии и психиатрии. – 2012. – № 1. – С. 4–13. 86. A new animal model of cerebral venous infarction: ligation of the posterior part of the superior sagittal sinus in the cat / B. Schaller [et al.] // Swiss Med. Wkly. – 2003. – Vol. 133. – № 29/30. – P. 412–418. 116 87. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes / C. Röttger [et al.] // Neurosurgery. – 2005. – Vol. 57, № 3. – P. 573–580. 88. A new model of reversible superior sagittal sinus thrombosis in rats / J. Wang [et al.] // Brain Research. – Vol. 1181. – P. 118–124. 89. Adipose-derived mesenchymal stem cells markedly attenuate brain infarct size and improve neurological function in rats / S. Leu [et al.] // J. Transl. Med. – 2010. – Vol. 8. – Art. 63. – P. 1–16. 90. Administration of CD34+ cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model / A. Taguchi [et al.] // J. Clin. Invest. – 2004. – Vol. 114, № 3. – P. 330–338. 91. Adrenomedullin enhances therapeutic potency of mesenchymal stem cells after experimental stroke in rats / K. Hanabusa [et al.] // Stroke. – 2005. – Vol. 36, № 4. – P. 853–858. 92. Adult bone marrow stromal cells in the embryonic brain: engraftment, migration, differentiation, and long-term survival / G. Muñoz-Elias [et al.] // J. Neurosci. – 2004. – Vol. 24, № 19. – P. 4585–4595. 93. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons / D. Woodbury [et al.] // J. Neurosci. Res. – 2000. – Vol. 61, № 4. – P. 364–370. 94. Al-Mefty’s Meningiomas / ed. by F. DeMonte, M. W. McDermott, O. AlMefty. – 2nd ed. – New York : Thieme Medical, 2011. – 432 p. 95. An anti-inflammatory effect of murine fetal liver cells in BALB/c mouse contact hypersensitivity model / G. Biziuleviciene [et al.] // Int. Immunopharmacol. – 2007. – Vol. 7, № 6. – P. 744–749. 96. Anderson, D. J. Can stem cells cross lineage boundaries? / D. J. Anderson, F. H. Gage, I. L. Weissman // Nat. Med. – 2001. – Vol. 7, № 4. – P. 393–395. 97. Anti-inflammatory effects of human cord blood cells in a rat model of stroke / M. Vendrame [et al.] // Stem Cells Dev. – 2005. – Vol. 14, № 5. – P. 595 – 604. 117 98. Aqueductal cerebrospinal fluid pulsatility in healthy individuals is affected by impaired cerebral venous outflow / C. B. Beggs [et al.] // J. Magn. Reson. Imaging. – 2013, Nov. 8. – Doi: 10.1002/jmri.24468. 99. Baker, A. B. Cerebrovascular disease. Etiologic factors in cerebral infarction / A. B. Baker, E. Dahl, B. Sandler // Neurology. – 1963. – Vol. 13, № 6. – P. 445–454. 100. Baraniak, P.R. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration / P. R. Baraniak, T. C. McDevitt // Regen. Med. – 2010. – Vol. 5, № 1. – P. 121–143. 101. Bederson, J.B. Resection and replacement of the superior sagittal sinus for treatment of a parasagittal meningioma: Technical case report / J.B. Bederson, M.B. Eisenberg // Neurosurgery. – 1995. – Vol. 37, № 5. – P. 1015–1018. 102. Bieback, K. Translating research into clinical scale manufacturing of mesenchymal stromal cells [Electronic resource] / K. Bieback, S. Kinzebach, M. Karagianni // Stem Cells Intern. – 2010. – Vol. 2010. – Art. ID 193519. – P. 1–11. – Mode of access: http://dx.doi.org/10.4061/2010/193519. 103. Black, P. Meningiomas / P. Black // Neuro-oncology: the essentials / ed. by M. Bernstein, M. S. Berger. – New. York.: Thieme Med. Publ., 2000. – P. 384–389. 104. Black, P. M. Parasagittal and falx meningiomas // Meningiomas: a comprehensive text / eds: M. N. Pamir, P. M. Black, R. Fahlbusch. Philadelphia : Saunders Elsevier, 2010. – P. 349–355. 105. Bone marrow mesenchymal stem cells express a restricted set of functionally active chemokine receptors capable of promoting migration to pancreatic islets / V. Sordi [et al.] // Blood. – 2005. – Vol. 106, № 2. – P. 419–427. 106. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats / C. Zhang [et al.] // Neuroscience. – 2006. –Vol. 141, № 2. – P. 687–695. 107. Bonnal, J. Surgery of the superior sagittal sinus in parasagittal meningiomas / J. Bonnal, J. Brotchi // J. Neurosurg. – 1978. – Vol. 48, № 6. – P. 935– 945. 118 108. Boudin, G. Le ramollisement cerebral hemorragiqual'originearterielle / G. Boudin, Y. Barbizet, Cl. Labram // Presse Med. – 1962. – Vol. 70. – P. 1253–1256. 109. Brotchi, J. Meningiomas invading the superior sagittal sinus: surgical experience in 108 cases (comment) / J. Brotchi // Neurosurgery. – 2004. – Vol. 55, № 6. – P. 1273. 110. Cech, D. A. Giant intracranial and extracranial meningioma: case report and review of the literature / D. A. Cech, M. E. Leavens, D. L. Larson // Neurosurgery. – 1982. – Vol. 11, № 5. – P. 694–697. 111. Cerebral venous sinus thrombosis: developing an experimental model / A. K. Srivastava [et al.] // J. Neurosci. Methods. – 2007. – Vol. 161, № 2. – P. 220–222. 112. Chan, R.C. Morbidity, mortality and quality of life following surgery for intracranial meningiomas: a retrospective study in 257 cases / R. C. Chan, G. B. Thompson // J. Neurosurg. –1984. – Vol. 60, № 1. – P. 52–60. 113. Changes in host blood factors and brain glia accompanying the functional recovery after systemic administration of bone marrow stem cells in ischemic stroke rats / M. Yang [et al.] // Cell Transplant. – 2010. – Vol. 19, № 9. – P. 1073–1084. 114. Cord blood rescues stroke–induced changes in splenocyte phenotype and function / M. Vendrame [et al.] // Exp. Neurol. – 2006. – Vol. 199, № 1. – P. 191–200. 115. Corday, E. Cerebral vascular insufficiency; an explanation of some types of localized cerebral encephalopathy / E. Corday, S.F. Rothenberg, T.J. Putman // AMA Arch. Neurol. Psychiatry. – 1953. – Vol. 69, № 5. P. 551–570. 116. Cushing, H. The meningiomas (dural endotheliomas): their source, and favored seats of origin / H. Cushing // Brain. – 1922. – Vol. 45, № 2. – P. 282–316. 117. Davson, H. A note on the distribution of sodium between plasma and aqueous humor, with special reference to the monkey / H. Davson., C. P. Luck // Am. J. Ophthalmol. – 1956. – Vol. 41, № 5. – P. 809–812. 118. Denny-Brown, D. The treatment of recurrent cerebrovascular symptoms and the question of «vasospasm» / D. Denny-Brown // Med. Clin. North. Am. – 1951. – Vol. 35, № 5. – P. 1457–1474. 119 119. Die Fortentwicklung der Neurorehabilitation auf verhaltensneurowissenschaftlicher Grundlage / T. Elbert [et al.] // Der Nervenarzt. – 2003. – Vol. 74, № 4. – P. 334–342. 120. Differentiation of transplanted bone marrow cells in the adult mouse brain / K. Nakano, M. Migita, H. Mochizuki, T. Shimada // Transplantation. – 2001. – Vol. 71, № 12. – P. 1735–1740. 121. Disturbance in venous outflow from the cerebral circulation intensifies the release of blood-Brain barrier injury biomarkers in patients undergoing cardiac surgery / E. Kotlinska-Hasiec [et al.] // J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. – 2013. – Doi:pii: S1053– 0770(13)00283–8. 10.1053/j.jvca.2013.05.008. 122. Doepp, F. Incompetence of internal jugular valve in patients with primary exertional headache: a risk factor? / F. Doepp, J. M. Valdueza, S. J. Schreiber // Cephalalgia. – 2008. – Vol. 28, № 2. – P. 182–185. 123. Doeppner, T. R. Mesenchymal stem cells in the treatment of ischemic stroke: progress and possibilities / T. R. Doeppner, D. M. Hermann // Stem Cells a. Cloning: Advances a. Applications. – 2010. – Vol. 3. – P. 157–163. 124. Donaghy, R. M. P. Surgical management of lesions of the dural venous sinuses / R. M. P. Donaghy // Operative neurosurgical techniques. Indications, methods and results. – 2nd еd. – Orlando, 1988. – P. 863–874. 125. Down-regulation of neurocan expression in reactive astrocytes promotes asxonal regeneration and facilitates the neurorestorative effects of bone marrow stromal cells in the ischemic rat brain / L. H. Shen [et al.] // Glia. – 2008. – Vol. 56, № 16. – P. 1747–1754. 126. Eecken, H. M. The anatomy and functional significance of the meningeal arterial anastomoses of the human brain / H.M. Eecken, R. D. Adams // J. Neuropathol. Exp. Neurol. – 1953. – Vol. 12, № 2. – P. 132–157. 127. Effect of mesenchymal stem cell transplantation on cognitive functions in rats with ischemic stroke / I. B. Sokolova [et al.] // Bull. Exp. Biol. Med. – 2006. – Vol. 142, № 4. – P. 511–514. 120 128. Effect of stromal-cell-derived factor 1 on stem-cell homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy / A. T. Askari [et al.] // Lancet. – 2003. – Vol. 362, № 9385. – P. 697–703. 129. Effects of injecting urokinase via carotid artery in treatment of cerebral venous sinus thrombosis: an experiment with rabbit models / X. Y. Cao [et al.] // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. – 2006. – Vol. 86, № 11. – P. 745–748. 130. Eglitis, M. A. Hematopoietic cells differentiate into both microglia and macroglia in the brains of adult mice / M. A. Eglitis, E. Mezey // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1997. – Vol. 94, № 8. – P. 4080–4085. 131. Encephalo-omental synangiosis in primates following cerebral infarction / E. J. Dev [et al.] // Indian J. Med. Res. – 1984. – Vol. 79. – P. 432–438. 132. Epidemiology of intracranial meningioma / E. B. Claus [et al.] // Neurosurgery. – 2005. – Vol. 57, № 6. – P. 1088–1094. 133. Establishing a new rat model of central venous sinus thrombosis and analyzing its pathophysiological and apoptotic changes / H. Yang [et al.] // J. Neurosci. Methods. – Vol. 203, № 1. – P. 130–135. 134. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain / K. Jin [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2006. – Vol. 103, № 35. – P. 13198–13202. 135. Experimental intracerebral hemorrhage: description of a double injection model in rats / W. Deinsberger [et al.] // Neurol. Res. – 1996. – Vol. 18, № 5. – P. 475– 477. 136. Experimental intracranial transplantation of autogenic omentum majus / M. G. Yaşargil [et al.] // J. Neurosurg. – 1974. – Vol. 40, № 2. – P. 213–217. 137. Factors affecting operative and excess long–term mortality in 935 patients with intracranial meningioma / M. Kallio, R. Sankila, T. akulinen, J. Jaaskelainen // Neurosurgery. – 1992. – Vol. 31, № 1. – P. 2–12. 138. Fazio, C. Red softening of the brain / C. Fazio // J. Neuropath. Exp. Neurol. – 1949. – Vol. 8, № 1. – P. 43– 60. 139. Ferguson, R. L. Preserving and restoring cerebral reserve / R. L. Ferguson // Br. J. Neurosurg. – 1997. – Vol. 11, № 5. – P. 463. 135). 121 140. Friedenstein, A. J. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells / A. J. Friedenstein, I. I. Piatetzky-Shapiro, K. V. Petrakova // J. Embryol. Exp. Morphol. – 1966. – Vol. 16, № 3. – P. 381–390. 141. Gliosis and brain remodeling after treatment of stroke in rats with marrow stromal cells / Y. Li [et al.] // Glia. – 2005. – Vol. 49, № 3. – P. 407–417. 142. Goldsmith, H. S. Salvage of end stage ischemic extremities by intact omentum / H. S. Goldsmith // Surgery. – 1980. – Vol. 88, № 5. – P. 732–736. 143. Griffiths, M. Innate immunity and protective neuroinflammation: new emphasis on the role of neuroimmune regulatory proteins / M. Griffiths, J. W. Neal, P. Gasque // Int. Rev. Neurobiol. – 2007. – Vol. 82. – P. 29–55. 144. Griffiths, M. R. The regulation of the CNS innate immune response is vital for the restoration of tissue homeostasis (repair) after acute brain injury: a brief review [Electronic resource] / M. R. Griffiths, P. Gasque, J. W. Neal // Int. J. Inflam. – 2010. – Vol. 2010. – Art. ID 151097. – P. 1–18. – Mode of access: http://dx.doi.org/10.4061/2010/151097. 145. Guo, X. B. Endovascular Treatment of Chronic, Recurrent Headache Secondary to Chronic Cerebral Venous Sinus Thrombosis) / X. B. Guo, L. J. Song, S.Guan // J. Stroke Cerebrovasc. Dis. – 2013. – Doi:pii: S1052–3057(13)00122–5. 10.1016/j.jstrokecerebrovasdis.2013.04.005. 146. Handley, T.P. Collet-sicard syndrome from thrombosis of the sigmoidjugular complex: a case report and review of the literature / T. P. Handley, M. S. Miah, S. Majumdar S. S. Hussain // Int J. Otolaryngol. – 2010. – Vol. 2010. – Art. ID 203587. – P. 1–5. 147. Hemmer, R. On the therapy of cerebral circulation disorders / R. Нemmer // Med. Welt. – 1960. – Vol. 10, № 37. – P. 1908–1911. 148. Hepatocyte growth factor–mediated attraction of mesenchymal stem cells for apoptotic neuronal and cardiomyocytic cells / S. Vogel [et al.] // Cell. Mol. Life Sci. – 2010. – Vol. 67, № 2. – P. 295–303. 122 149. Herold, S. Studies on cerebral blood flow and oxygen metabolism in patients with established cerebral infarcts undergoing omental transposition / S. Herold, R. S. Frackowiak, G. Neil-Dwyer // Stroke. – 1987. – Vol. 18, № 1. – P. 46–51. 131) 150. Hicks, A. Challenges and possibilities of intravascular cell therapy in stroke / A. Hicks, J. Jolkkonen // Acta Neurobiol. Exp. (Wars). – 2009. – Vol. 69, № 1. – P. 1–11. 151. Huge meningiomas: a review of 93 cases / M. Tuna [et al.] // Skull Base Surgery. – 1999. – Vol. 9, № 3. – P. 227–238. 152. Human bone marrow stromal cells express a distinct set of biologically functional chemokine receptors / M. Honczarenko [et al.] // Stem Cells. – 2006. – Vol. 24, № 4. – P. 1030–1041. 153. Human marrow stromal cell therapy for stroke in rat: neurotrophins and functional recovery / Y. Li [et al.] // Neurology. – 2002. – Vol. 59, № 4. – P. 514–523. 154. Human mesenchymal stem cell transplantation protects against cerebral ischemic injury and upregulates interleukin-10 expression in macacafascicularis / J. Li [et al.] // Brain Research. – 2010. – Vol. 1334. – P. 65–72. 155. Human mesenchymal stem sell subpopulations express a variety of neuroregulatory molecules and promote neuronal cell survival and neuritogenesis / L. Crigler [et al.] // Experimental Neurology. – 2006. – Vol. 198, № 1. – P. 54–64. 156. Human neuroblasts migrate to the olfactory bulb via a lateral ventricular extension / M. A. Curtis [et al.] // Science. – 2007. – Vol. 315, № 5816. – P. 1243– 1249. 157. Human progenitor cells from bone marrow or adipose tissue produce VEGF, HGF, and IGF-I in response to TNF by a p38 MAPK–dependent mechanism / M. Wang [et al.] // Amer. J. Physiol-Reg. – 2006. – Vol. 291, № 4. – P. R880–R884. 158. Immunosuppression by mesenchymal stem cells: mechanisms and clinical applications / S. Ghannam [et al.] // Stem Cell Res. Ther. – 2010. – Vol. 1, № 1. – P. 2– 8. 123 159. Impact of anatomical difference of the cerebral venous system on microcirculation in a gerbil superior sagittal sinus occlusion model / K. Ueda [et al.] // Acta Neurochir. (Wien). – 2000. – Vol. 142, № 1. – P. 75–82. 160. Increasing tPA activity in astrocytes induced by multipotent mesenchymal stromal cells facilitate neurite outgrowth after stroke in the mouse / H. Xin [et al.] // PloS One. – 2010. – Vol. 5, № 2. – P. e9027. 161. Interactions of chemokines and chemokine receptors mediate the migration of mesenchymal stem cells to the impaired site in the brain after hypoglossal nerve injury / J. F. Ji, B. He, S. Dheen, S. Tay // Stem Cells. – 2004. – Vol. 22, № 3. – P. 415– 427. 162. Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury / D. Lu [et al.] // J. Neurotrauma. – 2001. – Vol. 18, № 8. – P. 813–819. 163. Intracarotid transplantation of bone marrow stromal cells increases axon– myelin remodeling after stroke / L. H. Shen [et al.] // Neuroscience. – 2006. – Vol. 137. – P. 393–399. 164. Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice / Y. Li [et al.] // J. Cereb. Blood Flow Metab. – 2000. – Vol. 20, № 9. – P. 1311 – 1319. 165. Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats / J. Chen [et al.] // Circ. Res. – 2003. – Vol. 92, № 6. – P. 692–699. 166. Intravenous bone marrow stromal cell therapy reduces apoptosis and promotes endogenous cell proliferation after stroke in female rat / J. Chen [et al.] // J. Neurosci. Res. – 2003. – Vol. 73, № 6. – P. 778–786. 167. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke / A. E. Willing [et al.] // J. Neurosci. Res. – 2003. – Vol. 73, № 3. – P. 296–307. 124 168. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke / A. E. Willing [et al.] // J. Neurosci. Res. – 2003. – Vol. 73, № 3. – P. 296–307. 169. Intravenously administered bone marrow cells migrate to damaged brain tissue and improve neural function in ischemic rats / J. Wu [et al.] // Cell Transplant. – 2008. – Vol. 16, № 10. – P. 993–1005. 170. Ionescu, M. Cerebral hemodynamic disorders in patients with chronic decompensated respiratory insufficiency. Physiopathogenetic onsiderations. / M. Ionescu // Rev. Ig. Bacteriol. Virusol. Parazitol. Epidemiol. Pneumoftiziol. – 1978. – Vol. 27, № 4. – P. 247–250. 171. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood / K. Mareschi [et al.] // Haematologica. – 2001. – Volo. 86, № 10. – P. 1099–1100. 172. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis / T. Asahara [et al.] // Science. – 1997. – Vol. 275, № 5302. – P. 964 – 967. 173. Iwai, Y. Gamma knife radiosurgery for the treatment of cavernous sinus meningiomas / Y. Iwai, K. Yamanaka, T. Ishiguro // Neurosurgery. – 2003. – Vol. 52, № 3. – P. 517–522. 174. Jaaskelainen, J. Seemingly complete removal of histologically benign intracranial meningioma: Late recurrence rate and factors predicting recurrence in 657 patients. A multivariate analysis / J. Jaaskelainen // Surg. Neurol. – 1986. – Vol. 26, № 5. – P. 461–469. 175. Karp, J. M. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details / J. M. Karp, G. S. Leng Teo // Cell. Stem Cell. – 2009. – № 4. – P. 206–216. 176. Kernie, S.G. Forebrain Neurogenesis after focal ischemic and traumatic brain injury / S.G. Kernie, J.M. Parent // Neurobiology of Disease. – 2010. – Vol. 37, № 2. – P. 267–274. 177. Kondziolka, D. Judicious resection and/or radiosurgery for parasagittal meningiomas: Outcomes from a multicenter review / D. Kondziolka, J. C. Flickinger, B. Perez // Neurosurgery. – 1998. – Vol. 43, № 3. – P. 405–413. 125 178. Lee, J.H. Meningiomas. Diagnosis, treatment and outcome / J.H. Lee. – London : Springer, 2008. – 639 p. 179. Leu, H. J. Morphological alterations of non-varicose and varicose veins. (A morphological contribution to the discussion on pathogenesis of varicose veins) / H. J. Leu, M. Vogt, H. Pfrunder // Basic Res. Cardiol. – 1979. – Vol. 74, № 4. – P. 435– 444. 180. Maxwell, R. E. Parasagittal and falx meningioma / R. E. Maxwell, S. N. Chou // Operative neurosurgical techniques: indications, methods, and results. – 2nd ed. – Orlando, 1988. – P. 563–570. 181. Meningiomas and their surgical management / ed. H. H. Schmidek. – Philadelphia : Saunders, 1991. – 557 p. 182. Meningiomas invading the superior sagittal sinus: Surgical experience in 108 cases / F. DiMeco [et al.] // Neurosurgery. – 2004. – Vol. 55, № 6. – P. 1263–1274. 183. Meningiomas: a comprehensive text / ed. by M. N. Pamir, P.M. Black, R. Fahlbusch. – Philadelphia : Saunders ; Elsevier, 2010. – 773 p. 184. Merrem, G. Parasagittal meningiomas. Fedor Krause memorial lecture / G. Merrem // Acta Neurochir. (Wien). – 1970. – Bd. 23, № 2. – S. 203–216. 185. Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells / B. Ruster [et al.] // Blood. – 2006. – Vol. 108, № 12. – P. 3938–3944. 186. Mesenchymal stem cells promote proliferation of endogenous neural stem cells and survival of newborn cells in a rat stroke model / S. W. Yoo [et al.] // Exp. Mol. Med. – 2008. – Vol. 40, № 4. – P. 387–397. 187. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro / I. A. Potapova [et al.] // Stem Cells. – 2007. – Vol. 25, № 7. – P. 1761–1768. 188. Mesenchymal stem cells transplantation could be beneficial for treatment of experimental ischemic stroke in rats / N. Pavlichenko [et al.] // Brain Research. – 2008. – Vol. 1233. – P. 203–213. 126 189. Mesenchymal stem cells: biological properties and clinical applications / I. García–Gómez [et al.] // Expert Opin. Biol. Ther. – 2010. – Vol. 10, № 10. – P. 1453– 1468. 190. Meyer, A. Neuropathological aspects of anoxia / A. Meyer // Proc. R. Soc. Med. – 1956. – Vol. 49, № 9. – P. 619–622. 191. Meyer, J. The cerebral collateral circulation. I. Factors influencing collateral blood flow / J. Meyer, D. Denny-Brown // Neurology. – 1957. – Vol. 7, № 7. – P. 447–458. 192. Micheau, P. The greater omentum. Its role in reconstructive plastic surgery / P. Micheau //Ann. Chir. Plast. Esthet. – 1995. – Vol. 40, № 2. – P. 192–207. 193. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement / M. Dominici [et al.] // Cytotherapy. – 2006. – Vol. 8, № 4. – P. 315–317. 194. Molecular MRI of cerebral venous sinus thrombosis using a new fibrin – specific MR contrast agent / C. P. Stracke [et al.] // Stroke. – Vol. 38, № 5. – P. 1476– 1481. 195. Moossy, J. Cerebral infarction and intracranial arterial thrombosis. Necropsy studies and clinical implications / J. Moossy // Arch. Neurol. – 1966. – Vol. 14, № 2. – P. 119–123. 196. Müller-Bühl U. Jugularvenenthrombose. Portsystem nicht optimal plaziert / U. Müller-Bühl // MMW Fortschr. Med. – 2010. – Bd. 152, № 14. – S. 5. 197. Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers / H. Goodwin [et al.] // Вiol. Blood Marrow Transplant. – 2001. – Vol. 7, № 11. – P. 581–588. 198. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146. perivascular cells and fibroblasts / D. T. Covas [et al.] // Exp Hematol. – 2008. – Vol. 36. – P. 642–654. 127 199. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo / A. C. Zannettino [et al.] // J Cell Physiol. – 2008. – Vol. 214. – P. 413–421. 200. Multipotential mesenchymal stem cells are mobilized into peripheral blood by hypoxia / G. Y. Rochefort [et al.] // Stem Cells. – 2006. – Vol. 24, № 10. – P. 2202– 2208. 201. Nakase, H. Alterations of regional cerebral blood flow and oxygen saturation in a rat sinus-vein thrombosis model / H. Nakase, A. Heimann, O. Kempski // Stroke. – Vol. 27, № 4. – P. 720–727. 202. Neurogenesis in the adult human hippocampus / P. S. Eriksson [et al.] // Nat. Med. – 1998. – Vol. 4, № 11. – P. 1313 – 1317. 203. Occlusion of the pig superior sagittal sinus, bridging and cortical veins: multistep evolution of sinus-vein thrombosis / G. Fries [et. al.] // J. Neurosurg. – 1992. – Vol. 77, № 1. – P. 127–133. 204. Olivecrona, H. Die parasagittalen meningeome / H. Olivecrona. – Leipzig : Georg Thieme, 1934. – 144 S. 205. Omental transposition or transplantation to the brain and superficial temporal artery-middle cerebral-artery anastomosis in preventing experimental cerebralschemia / G. B. Azzena [et al.] // Acta Neurochirurgica. – 1983. – Vol. 68, № 1/2. – P. 63–83. 206. Optimization of a therapeutic protocol for intravenous injection of human mesenchymal stem cells after cerebral ischemia in adult rats / Y. Omori [et al.] // Brain Res. – 2008. – Vol. 1236. – P. 30–38. 207. Parr, A. M. Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the repair of central nervous system injury / A. M. Parr, C. H. Tator, A. Keating // Bone Marrow Transplantation. – 2007. – Vol. 40, № 7. – P. 609–619. 208. Parr, A. M. Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the repair of central nervous system injury / A. M. Parr, C. H. Tator, A. Keating // Bone Marrow Transplantation. – 2007. – Vol. 40, № 7. – P. 609–619. 128 209. Phinney, D. G. Concise review: mesenchymal stem/multipotent stromal cells: the state of transdifferentiation and modes of tissue repair-current views / D. G. Phinney, D.J. Prockop // Stem Cells. – 2007. – Vol. 25, № 11. – P. 2896–2902. 210. Potential roles of bone marrow stem cells in stroke therapy / R. MendezOtero [et al.] // Regen. Med. – 2007. – Vol. 2, № 4. – P. 417–423. 211. Progenitor cells as remote “bioreactors”: neuroprotection via modulation of the systemic inflammatory response / P. A. Walker [et al.] // World J. Stem Cells. – 2011. – Vol. 3, № 2. – P. 9–18. 212. Prognosis of cerebral vein and dural sinus thrombosis: results of the International Study on Cerebral Vein and Dural Sinus Thrombosis (ISCVT) / J. M. Ferro [et al.] // Stroke. – 2004. – Vol. 35, № 3. – P. 664–670. 213. Radiological and histological changes following cerebral venous sinus thrombosis in a rat model / A. K. Srivastava [et al.] // Neurosci. Res. – 2009. – Vol. 65, № 4. – P. 343–346. 214. Reconstitution of marrow-derived extracellular matrix ex vivo: a robust culture system for expanding large-scale highly functional human mesenchymal stem cells / Y. Lai [et al.] // Stem Cells Dev. – 2010. – Vol. 19, № 7. – P. 1095–1107. 215. Relationship between Trendelenburg tilt and internal jugular vein diameter / S. Clenaghan [et al.]. // Emerg. Med. J. – 2005. – Vol. 22, № 12. – P. 867– 868. 216. Reorganization of motor cortex after controlled cortical impact in rats and implications for functional recovery / M. Nishibe [et al.] // J. of Neurotrauma. – 2010. – Vol. 27, № 12. – P. 2221–2232. 217. Sakatani, K. Somatosensory evoked potentials in rat cerebral cjrtex before and after middle cerebral artery occlusion /K. Sakatani, H. Iizuka, W. Young. // Stroke – 1990. – Vol. 21 – P. 124–132. 218. Schinköthe, T. In vitro secreting profile of human mesenchymal stem cells / T. Schinköthe, W. Bloch, A. Schmidt // Stem Cells Dev. – 2008. – Vol. 17, № 1. – P. 199–206. 129 219. Shimada, Y. Experimental study on effects of omental transposition in cats with spinal cord injury / Y. Shimada // No To Shinkei. – 1995. – Vol. 47, № 9. – P. 863–873. 220. Sindou, M.P. Resection and replacement of the superior sagittal sinus for treatment of a parasagittal meningioma : technical case report (comment) / M. P. Sindou // Neurosurgery. – 1995. – Vol. 37, № 5. – P. 1019. 221. Standing up to the challenge of standing: a siphon does not support cerebral blood flow in humans / E. A. Dawson [et al.] // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. – 2004. – Vol. 287, № 4. – P. R911–914. 222. Stem Cell Therapies as an Emerging Paradigm in Stroke (STEPS): bridging basic and clinical science for cellular and neurogenic factor therapy in treating stroke // Stroke. – 2009. – Vol. 40, № 2. – P. 510–515. 223. Stippler, M. Skull base meningiomas: is there a place for microsurgery? / M. Stippler, D. Kondziolka // Acta Neurochirurgica. – 2006. – Vol. 148, № 1. – P. 1–3. 224. Tate, C. C. Mesenchymal Stromal Cells to Treat Brain Injury [Electronic resource] / C. C. Tate, C. С. Case // Advanced Topics in Neurological Disorders. – 2012. – Chap. 3. – Mode of access: http://cdn.intechopen.com/pdfs/32478/InTechMesenchymal_stromal_cells_to_treat_brain_injury.pdf. 225. The neuroprotective action of dizocilpine (MK-801) in the rat middle cerebral artery occlusion model of focal ischaemia / R. Gill [et al.] // Br. J. Pharmacol. – 1991. – № 103. – P. 2030–2036. 226. Therapeutic benefit of bone marrow stromal cells administered 1 month after stroke / L. H. Shen [et al.] // J. Cereb. Blood Flow Metab. – 2007. – Vol. 27, № 1. – P. 6–13. 227. Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats // J. L. Chen [et al.] // J. Neurol. Sci. – 2001. – Vol. 189, № 1/2. – P. 49–57. 228. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats / J. Chen [et al.] // Stroke. – 2001. – Vol. 32, № 4. – P. 1005–1011. 130 229. Therapeutic effect of mesenchymal stem cells in rats with intracerebral hemorrhage: reduced apoptosis and enhanced neuroprotection / S. P. Wang [et al.] // Molecular Medicine Reports. – 2012. – Vol. 6, № 4. – P. 848–854. 230. Timing of cord blood treatment after experimental stroke determines therapeutic efficacy / J. D. Newcomb [et al.] // Cell Transplant. – 2006. – Vol. 15, № 3. – P. 213–223. 231. Towbin, A. The syndrome of latent cerebral venous thrombosis: its frequency and relation to age and congestive heart failure / A. Towbin // Stroke. – 1973. – Vol. 4, № 3. – P. 419–430. 232. Transplantation of Flk-1+ human bone marrow-derived mesenchymal stem cells promotes behavioral recovery and anti-inflammatory and angiogenesis effects in an intracerebral hemorrhage rat model / X. J. Bao [et al.] // Int. J. Mol. Med. – 2013. – Vol. 31, № 5. – P. 1087–1096. 233. Transplantation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after cerebral ischemia in rats / X. Bao [et al.] // Brain Research. – 2011. – Vol. 1367. – P. 103–113. 234. Treatment of stroke in rat with intracarotid administration of marrow stromal cells / Y. Li [et al.] // Neurology. – 2001. – Vol. 56, № 12. – P. 1666–1672. 235. Treatment with bone marrow mononuclear cells induces functional recovery and decreases neurodegeneration after sensorimotor cortical ischemia in rats / A. Giraidi-Guimaraes [et al.] // Brain Research. – 2009. –Vol. 1266. – P. 108–120. 236. Ultrasonic echo pulsations in range. A study of rise times and delay times / C. O. Jenkins [et al.] // Acta Neurochir. (Wien). – 1971. – Vol. 24, № 1. – P. 1–10. 237. Wu, A. V. Fibrinolytic response of vein wall after venous grafting /A. V. Wu, A. O. Mansfield, J. A Mannick // Surg. Forum. – 1979. – Vol. 30. – P. 202– 204. 238. Xiong Y. Angiogenesis, neurogenesis and brain recovery of function following injury / Y. Xiong, A. Mahmood, M. Chopp // Curr. Opin. Investig. Drugs. – 2010. – Vol. 11, № 3. – P. 298–308. 131 239. Yaşargil, M. G. Microsurgery applied to neurosurgery. – Stuttgart : Georg Thieme ; New York : Acad. Press, 1969. – 230 p. 240. Yonekawa, Y. Experimental intracranial transplantation of the omentum majus in dogs. A tentative new treatment for hydrocephalus and cerebral ischemia / Y. Yonekawa // Nihon Geka Hokan. – 1978. – Vol. 47. – P. 3–17. 241. Zulch, K.-J. Neuropathology of cerebral infarction / K.-J. Zulch, P. Kleihues // Stroke : Thule International Symposia. – Stockholm : Nordiska Bokhandelns, 1967. – P. 57–75.
