Кишечник трески - Беломорская биологическая станция им. Н
advertisement
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова Биологический факультет Кафедра физиологии человека и животных Исследование механизмов холинергического сокращения гладкой мускулатуры кишечника трески Руководитель: Тарасова О.С. Работу выполнили: Моргунова Г.В. (2011) Максимчик П.В. Новодережкина Е.А (2012) Каримова В.М. Швецова А.А. (2013) Москва 2013 Механизмы сокращения гладкой мышцы под действием ацетилхолина Ацетилхолин Н-холинорецепторы M-холинорецепторы (М1, М2(Gi), М3(Gq), М4, М5) Са2 Са2+-кальмодулин миозин Фосфатаза легких цепей миозина ЛЦМ20 ЛЦМ – регуляторные легкие цепи миозина Сокращение Киназа легких цепей миозина +кальдесмон Доступный актин Механизмы сокращения гладкой мышцы под действием ацетилхолина Ацетилхолин Н-холинорецепторы M-холинорецепторы (М1, М2(Gi), М3(Gq), М4, М5) Са2 Rho-киназа Са2+-кальмодулин миозин Фосфатаза легких цепей миозина ЛЦМ20 ЛЦМ – регуляторные легкие цепи миозина Сокращение Киназа легких цепей миозина +кальдесмон Доступный актин 4-DAMP Н-холинорецепторы метоктрамин Ацетилхолин пирензепин Механизмы сокращения гладкой мышцы под действием ацетилхолина M-холинорецепторы (М1, М2(Gi), М3(Gq), М4, М5) фасудил Са2 атропин Rho-киназа Са2+-кальмодулин миозин Фосфатаза легких цепей миозина ЛЦМ20 ЛЦМ – регуляторные легкие цепи миозина Сокращение Киназа легких цепей миозина +кальдесмон Доступный актин Цель работы: определить тип холинорецепторов, участвующих в сокращении под действием ацетилхолина, и выявить роль Rhoкиназного пути в холинергическом сокращении гладкой мускулатуры кишечника трески. Задачи: - исследовать зависимость величины сократительного ответа от концентрации АХ и подобрать оптимальную концентрацию. - исследовать изменение сократительного ответа на АХ при блокаде: всех типов М-холинорецепторов атропином, М1-холинорецепторов пирензипином, М2-холинорецепторов метактрамином, М3холинорецепторов 4-DAMP. - исследовать влияние ингибитора Rho-киназы фасудила на величину сократительного ответа при действии ацетилхолина. Методика Объект: Беломорская треска средних размеров 20-25см (n=26). Препарат: продольная полоска гладкой мускулатуры (длина 1-1,5 см, ширина в одну складку). Установка: АЦП Компьютер с ПО Power Graph (откалибр) изотонический датчик Физиологический раствор для трески Исследуемое вещество насос υ=7мл/мин 100 С, регистрация сокращения в изотоническом режиме Обработка результатов 5 мин mean фон 5 мин mean сокращение mean cокращение - mean фон = mean контроль mean cокращение опыт - mean фон опыт = mean опыт mean опыт * 100% mean контроль Сравнение контрольной и опытной групп проводилось в программе Statistica по критерию Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Концентрационная зависимость действия ацетилхолина на гладкую мускулатуру кишечника трески Величина сократительной реакции, в % от реакции на АХ-4 АХ -7 1.4 ± 4.2 АХ-6 21.3 ± 10.1 АХ-5 53.4 ± 12.7 АХ-4 100 5 мин АХ-7 WASH АХ-6 WASH АХ-5 WASH АХ-4 WASH Протокол эксперимента 5 мин АХ -5 10 мин 5 мин WASH 5 мин 5 мин 5 мин АХ -5 WASH вещество Time-control: 5 мин АХ -5 15 мин WASH 5 мин АХ -5 15 мин WASH Атропин в концентрации 10-6М блокирует холинергическую передачу сигнала Вторая реакция, % от контроля 120.0 100.0 80.0 60.0 контроль атропин 10-6 (n=5) 40.0 20.0 * 0.0 * p<0,05 по критерию Манна-Уитни -20.0 5 мин АХ-5 (n=8) Атр-6 Атр-6+АХ-5 Атр-6 Блокатор М1-холинорецепторов пирензепин в концентрации 10-6М уменьшает сократительный ответ гладкой мускулатуры трески на 30% Вторая реакция, % от контроля 120.0 100.0 * 80.0 контроль 60.0 (n=8) пирензепин 10-7 (n=6) пирензепин 10-6 (n=6) 40.0 20.0 * p<0,05 по критерию Манна-Уитни 0.0 5 мин АХ-5 WASH Пир-7 Пир-7+АХ-5 Пир-6 Пир-6+АХ-5 М2-холинорецепторы не участвуют в передаче сигнала в гладкой мускулатуре кишечника трески Вторая реакция, % от контроля 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 контроль (n=8) метоктрамин 10-6 (n=5) 40.0 * p<0,05 по критерию 20.0 Манна-Уитни 0.0 5 мин АХ-5 WASH Мет-7 Мет-7+АХ-5 Мет-6 Мет-6+АХ-5 Градуальное уменьшение сократительного ответа на ацетилхолин при блокаде М3-холинорецепторов с помощью 4-DAMP в разных концентрациях Вторая реакция, % от контроля 120.0 100.0 * 80.0 контроль 4-DAMP 10-8 (n=8) 40.0 * 4-DAMP 10-7 (n=6) 20.0 0.0 * p<0,05 по критерию Манна-Уитни -20.0 4-DAMP-8 АХ-5 (n=8) 60.0 WASH 4-DAMP-8 + АХ-5 4-DAMP-7 4-DAMP-7 + АХ-5 Cродство блокаторов к различным типам рецептров Тип Мхолинорецептора рК (для млекопитающих) пирензипин метактрамин 4-DAMP М1 7,8-8,5 7,1-7,8 8,6-9,2 М2 6,3-6,7 7,8-8,3 7,8-8,4 М3 6,7-7,1 6,3-6,9 8,9-9,3 Блокада Rho-киназы приводит к уменьшению сокращения гладкой мускулатуры кишечника трески Вторая реакция, % от контроля 120.0 100.0 80.0 * 60.0 контроль (n=8) фасудил 10-5 (n=9) 40.0 20.0 * p<0,05 по критерию Манна-Уитни 0.0 АХ-5 WASH Фас-5 Фас-5 + АХ-5 Фас-5 WASH Выводы: 1. В присутствии блокатора М-холинорецепторов атропина в концентрации 10-6М происходит полное ингибирование сокращения гладкой мускулатуры кишечника трески под действием ацетилхолина (р=0,001). 2. В присутствии блокатора М1-холинорецепторов пирензепина в концентрации 10-7М различий не наблюдаем, а в концентрации 10-6М происходит статистически значимое снижение амплитуды сокращения на 30% (р=0,021). 3. В присутствии блокатора М3-холинорецепторов 4-DAMP в концентрации 10-8М, 10-7М происходит статистически значимое снижение амплитуды сокращения на 21.3% и 86% соответственно (р<<0,01). 4. М2-холинорецепторы не участвуют в передаче сигнала при холинергическом сокращении. 5. В присутствии ингибитора Rho-киназы фасудила в концентрации 10-5М происходит статистически значимое уменьшении амплитуды сокращения на 52.6% (р<<0,01). СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!
