инновационные фиксаторы и красители для мазков крови
advertisement
А.Г. МИХЕЕВ ИННОВАЦИОННЫЕ ФИКСАТОРЫ И КРАСИТЕЛИ ДЛЯ МАЗКОВ КРОВИ, КОСТНОГО МОЗГА, ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ И ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ КЕМЕРОВО 2011 УДК 611. 012: [616 – 076.1+ 616-092.4] ББК 54.11 М 41 Михеев Анатолийй Георгиевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии Кемеровской государственной медицинской академии Рецензенты: Заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии Сибирского государственного медицинского университета, доктор медицинских наук, профессор С.В. Логвинов (г. Томск) Зав. кафедрой патологической анатомии Кемеровской государственной медицинской академии, доктор медицинских наук, профессор П.С.Демко А.Г.Михеев Инновационнные фиксаторы и красители для мазков крови, костного мозга, других цитологических и гистологических препаратов В монографии обобщен 40-летний опыт изучения информативности гематологических и гистологических препаратов при использовании как стандартных реагентов, так и инновационных фиксаторов и красителей. 2 Излагаются новые методы окраски клеток крови и всех типов тканей в цитологических и гистологических препаратах. Описываются важные преимущества новых реагентов по сравнению с существующими. Большинство из описываемых новых реагентов прошли успешные испытания в десятках клинических лабораторий Кемерово, Томска, Новосибирска, Волгограда, Екатеринбурга и др. 5 новых реагентов использовались при выполнении десяти кандидатских и трех докторских диссертаций. Приведенные результаты могут быть полезными для врачей-лаборантов клинических лабораторий различных лечебных учреждений, для гистологических лабораторий патологоанатомических бюро и сотрудников ВУЗов и НИИ, занимающихся исследованиями клеток крови и всех типов тканей в цитологических и гистологических препаратах. Предисловие Морфология любой клетки крови, костного мозга, цитологических и гистологических препаратов зависит от качества фиксации препарата, концентрации и свойств красящего раствора. В последние 20 лет в продажу поступают гематологические фиксаторы и красители невысокого качества. Главной причиной этого является производство гематологических фиксаторов и красителей в наши дни по рецептам, разработанным в 1891 – 1905 годах. 3 Для фиксации мазков крови, костного мозга, цитологических препаратов используют метанол, абсолютный этанол, жидкость Никифорова (смесь равных частей спирта и эфира), метаноловый раствор эозина-метиленового синего по Май-Грюнвальду, метаноловый раствор эозина-метиленового синего типа Лейшмана, фиксатор-краситель Райта (Справочник по клиническим лабораторным методам исследования /Под ред. Е.А.Кост.- 2-е изд.- М.: Медицина, 1975.-393с.; Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. Изд. Медицина, София, 1963.- 874 с.; Позов С.А., Коломасов И.И.. Способ окраски мазков крови. Патент № 2081404, опубл. 1997 06. 10; Трухачев В.И. и соавт. Способ окраски мазков крови. Патент № 2304776, опубл. 2007 08. 20.). Известные аналоги имеют массу недостатков. Абслютный этанол и смесь Никифорова, не только неудовлетворительно сохраняют цитоплазматические и ядерные структуры клеток крови и различных тканей, но и требуют очень длительной фиксации (30 мин.). Общепризнанно, что наилучшим фиксатором является метанол. Однако наши исследования (Михеев А.Г. Зависимость цитохимических показателей лейкоцитов от их морфологических особенностей в сравнительном аспекте и при анафилаксии. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук, Новосибирск, 1996) показали, что при фиксации метанолом растворяется специфическая зернистость базофильных гранулоцитов, неудовлетворительно сохраняется зернистость нейтрофилов и тучных клеток. 4 Цель разработки инновационных фиксаторов и красителей – повысить информативность клеток крови, костного мозга и цитологических препаратов, обеспечив высококачественную фиксацию и окраску цитолазматических и ядерных структур всех типов клеток. Инновационные реагенты обеспечивают высококачественную фиксацию и окраску цитоплазматических и ядерных структур всех типов клеток и тканевых элементов различных типов тканей. Дело в том, что все реагенты для изготовления гематологических и гистологических препаратов выпускаются на химических производствах, сотрудники которых не знают ни гематологии, ни гистологии. Поэтому в течение последних ста лет составы гематологических и гистологических красителей не изменились. Автор с 1967 г. занимается разработкой модифицированных гематологических фиксаторов и красителей, цитохимического выявления различных ферментов и новых методов изготовления гистологических препаратов. Модифицированные автором составы гематологических фиксаторов и красителей защищены 23 удостоверениями на рацпредложения, выданными КемГМА, 7 рацпредложениями отраслевого значения выданными в Москве, принятыми к внедрению Минздравом РСФСР. Михееву4 А.Г.присвоено звание и выдан нагрудный знак «Лучший рационализатор Кузбасса» Многие усовершенствованные гематологические и 5 цитохимические методики опубликованы в 4 номерах журнала «Лабораторное дело», в двух номерах журнала «Архив анатомии, гистологии и эмбриологии», «Архив патологии», в двух номерах журнала «Folia Haematologika». В работе показаны высокие качества фиксации и окраски различных типов клеток и тканевых структур всех типов тканей с помощью нового поколения инновационных реагентов. Низкое качество окраски клеток крови и костного мозга очень часто встречается не только в отечественных гематологических атласах, но и зарубежных (Вольфганг Кюннель, 2005;. . Руководство по гистологии. В 2 т. Т 1. – СПб.: Спец Лит, 2001. – 495 с.: ил. Козинец Г.И., З.Г.Шишканова, Т.Г.Сарычева, Ю.К.Новодержкина, О.А.Дягилева, Д.Д.Проценко. Клетки крови и костного мозга: Атлас. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – 203 с.:ил. Поэтому данная работа может быть полезной для клинической лабораторной диагностики, гистологических лабораторий патологоанатомических бюро, морфологических лабораторий ВУЗов и НИИ морфологического профиля. Глава 1 СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ФИКСАТОРОВ И КРАСИТЕЛЕЙ 1.1 Гематологические фиксаторы 6 В качестве гематологических фиксаторов до сих пор во всем мире используются метаноловые растворы эозина-метиленового синего по Май-Грюнвальду и типа Лейшмана, которые были разработаны в 1901 и 1902 годах. В 1902 г. американский патолог J.H.Wright предложил новый метод окраски мазков крови, который до сих пор широко используется в США и других странах. Анализ многочисленных цветных микрофотографий клеток крови и костного мозга в американских источниках и атласах [8,9,10,11,12, 13] показывает, что метод Райта имеет ряд существенных недостатков (плохо выявляются метахроматические структуры – гранулы базофилов и тучных клеток, а также зернистость нейтрофильных лейкоцитов на различных стадиях созревания и др.). Во многих литературных источниках (Роскин Г.И.,1954;.Кост Е.А.1975; Семченко В.В. и соавт.,2006) рекомендуется проводить фиксацию мазков крови после их высушивания метиловым или этиловым спиртом, а первые два автора – еще и в смеси Никифорова. Нами было установлено, что даже метанол, признанный во всем мире наилучшим фиксатором, имеет ряд серьезных недостатков: не сохраняет специфическую зернистость нейтрофилов и базофилов человека и полностью растворяет зернистость базофилов кролика. Фиксация мазков крови этанолом и смесью Никифорова плохо сохраняет структуру хроматина и зернистости нейтрофилов, не позволяет идентифицировать в препаратах базофильные гранулоциты человека. Фиксация мазков крови парами фенола по Сюткину 7 (1961) давала неудовлентоворительные результаты. Испытание способа фиксации мазков крови по Яхонтовой (1959) показало низкие качества фиксации цитоплазматических и ядерных структур. Нами установлено, что только усложнение состава различных красителей и новых химреактивов в оптимальной молярной обеспечивают хорошую фиксацию всех цитоплазматических и ядерных структур клеток. Мы обнаружили, что наилучшее качество фиксации цитоплазматических и ядерных структур обеспечивают растворы метанола, содержащие основные тиазиновые красители, эозин, дополнительные химреактивы, растворимые в метаноле и компоненты буферных смесей. Следует отметить, что в составе фиксатора основные тиазиновые красители и эозин находятся в строго определенных молярных соотношениях. Иное соотношение характерно для буферных компонентов Созданный нами фиксатор испытан в течение 5 лет. Название фиксатора ФМ-5. Данный фиксатор применялся в клинических лабораториях нескольких десятков лечебных учреждений г. Кемерово, Новосибирска, Томска, Волгограда, Красноярска и др. 1.2. Различные типы гематологических красителей В 1891 г. русский врач Д.Л.Романовский разработал новый метод окраски мазков крови, который был усовершенствован в 1905 г. немецким химиком 8 Giemsa. Помимо метода Романовского описаны другие способы окраски мазков: по Май Грюнвальду и Лейшману (Роскин Г.И. (1954), Кост Е.А.,1975). Схема окраски одинаковая. В горизонтальном положении на мазок помещают 15-20 капель метанолового раствора Май-Грюнвальда или Лейшмана. Через 3-5 минут на каждый мазок добавляют по 15-20 капель дистиллированной воды. Через 5-10 минут мазок промывают и высушивают. Несмотря на простоту обработки, эти методы не дают постоянных результатов. Знакомство с ТУ производства красителя Романовского, фиксаторов Май-Грюнвальда и Лейшмана показало, что более чем за полувековой период они не изменились. Нами обнаружено, что в течение последних 60 лет постоянно повторяется одна и та же ошибка: в документе ТУ 6-09-349-75 производства концентрированного раствора красителя Романовского: наряду с указанием количества сухого красителя Романовского объема метанола и глицерина отсутствует дозировка сухого красителя азура 2. Поэтому на различных заводах по производству концентрированного красителя Романовского количество сухого азура 2 добавляют по своему усмотрению. Именно этим объясняются различные красящие свойства и несоответствия рН, необходимые для окраски различными партиями красителя Романовского. В качестве рабочего раствора красителя чаще всего используют концентрированный раствор Романовского, который перед употреблением разводят дистиллированной водой или буфером. Разведение 9 проводят в соотношении 1-3 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды (Роскин Г.И.,1954, Семченко В.В. и др., 2006). Перед окраской мазки фиксируют 2-3 мин. в метиловом спирте, время окраски составляет 20-30 мин. Для лучшей окраски используют фосфатный буфер с рН 6,8-7,0, разведенный в 10-20 раз дистиллированной водой. Все вышеуказанные авторы рекомендуют проводить окраску только свежеприготовленным рабочим раствором красителя Романовского. Кост Е.А.(1975) использует рабочий раствор красителя из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Время окраски мазков крови у вышеперечисленных авторов составляет 30-40 мин. Следует отметить, что рабочие растворы красителя Романовского нестойкие, поэтому ежедневно требуется готовить свежий рабочий раствор красителя. При использовании рабочего раствора красителя Романовского наилучшие результаты дают фиксаторы метаноловый раствор эозина-метиленового синего по Май-Грюнвальду и типа Лейшмана. Фиксация 96 % этиловым спиртом не выявляет нейтрофильную и базофильную зернистость лейкоцитов человека, неудовлетворительно окрашивает гетеро-и эухроматин. При фиксации этанолом цитологических препаратов, полученных из различных органов, смываются все микроорганизмы на поверхности и между клетками. При фиксации по Май-Грюнвальду или Лейшману, хорошо сорхраняются и окрашиваются микроорганизмы. Нами разработан новый гематологический краситель КМ-5. В смеси метанола и глицерина 10 растворены три вида тиазиновых красителей, эозин, дополнительные хиимреактивы и компоненты буферных смесей, растворяющиеся в метаноле. Тиазиновые красители, эозин и ждополнительные химреактивы взяты в строго определенных оптимаоьных молярных соотношениях. Данный краситель неоднократно использовался в работе клинических лабораторий больниц, поликлиник, тубдиспансеров, Кардиоцентра Кемерово, а также в Новосибирске, Томске, Красноярске, Волгограде и др. Отличия красителя КМ-5 от существующих. 1. 2. 3. Для приготовления рабочего раствора красителя требуется всего 2,5 – 3 мл красителя КМ-5 на 100 мл дистиллированной воды. Существующие красители используют в 3,5 – 4 раза больше концентрированного красителя. Не требуется готовить буферный раствор для приготовления рабочего раствора красителя т.к. растворяется на дистиллированной воде. Существующие красители требуют приготовления буфера. Рабочий раствор красителя можно использовать в течение 5-10 дней после приготовления. Существующие красители нестойкие, требуется ежедневно готовить рабочие растворы красителя. 11 4. Обеспечивает высокое качество окраски препаратов: дифференцированно окрашивает все типы специфическое зернистости гранулоцитов (базофильной эозинофильной, нейтрофильной, а многих животных – псевдоэозинофильной), гиаломер тромбоцитов и цитоплазму лимфоцитов окрашивает в голубой цвет, хорошо окрашивает гетерохроматин и эухроматин, в молодых клетках окрашивает ядрышки в голубой цвет. Глава 2 2.1 ИНФОРМАТИВНОСТЬ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ИННОВАЦИОННЫХ ФИКСАТОРОВ И КРАСИТЕЛЕЙ При использовании фиксатора ФМ-5 и красителя КМ-5 требуется минимальное количество операций: 1. Фиксация мазков крови 3-5 мин. в вертикальном положении в стеклянной или пластиковой емкости с хорошо закрываемой пробкой. 2. Удаление стекол из фиксатора и без промывки погружение в рабочий раствор красителя КМ-5 на 8-12 минут. Рабочий раствор красителя готовят путем смешивания 2,5 – 3 мл красителя КМ-5 и 12 100 мл дистиллированной воды. Этот раствор сохраняет красящие свойства в течение 5 – 10 дней после приготовления. Чем чище предметные стекла и посуда для окраски, тем дольше сохраняются красящие свойства рабочего раствора. Время окрашивания удлиняется на 0,5 минуты за каждый день хранения рабочего раствора красителя после его приготовления. 3. Промывка мазков в течение 2-5 сек. и высушивание на воздухе. Промывка проводится в смеси, состоящей из 100 мл дистиллированной воды и 3-4 мл воды, взятой из горячего крана. Дело в том, что вода из горячего крана имеет щелочную реакцию и сдвигает рН дистиллированной воды в нейтральную сторону. Необходимо отметить что свежеперегнанная дистиллированная вода имеет кислую реакцию и не подходит для приготовления рабочего раствора красителя. Если хранить свежую дистиллированную воду в стеклянной посуде, закрытой любой довольно плотной пробкой, то через 7-10 суток хранения рН воды сдвигается в нейтральную сторону благодаря химическому составу стекла. Такая вода подходит для приготовления рабочего раствора красителя. Первичные и вторичные гранулы в псевдоэозинофилах кролика впервые были описаны Bainton и Farquhar в 1966 г. Первичные или азурофильные 13 гранулы они обнаружили в промиелоцитах костного мозга. Они отличались крупными размерами (0,8 мкм в диаметре) и высокой электронной плотностью. Цитохимическими методами в первичных гранулах выявлены многочисленные лизосомальные ферменты. На стадии миелоцита вышеуказанные авторы обнаружили две популяции гранул: первичные и вторичные, которые количественно преобладали. Вторичные гранулы меньше первичных (0,5 мкм), окружены мембраной и заполнены мелкозернистым веществом низкой электронной плотности. Во вторичных гранулах была выявлена высокая активность щелочной фосфатазы. Авторы нашли, что в сегментоядерных псевдоэозинофилах кролика 86 % составляют вторичные гранулы и 14% первичные. Однако необходимо отметить, что подсчет гранул проводился не в сегментоядерных псевдоэозинофилах периферической крови, а в зрелых псевдоэозинофилах красного костного мозга кролика. Начиная с 1983 года, во всех учебниках по гистологии приводимые цифры процентного содержания первичных и вторичных гранул в нейтрофилах человека не отличались от данных, полученных на кролике. Нами свыше 30 лет проводилось изучение морфологии клеток крови кроликов как в эксперименте, так и в контроле. В периферической крови зрелые псевдоэозинофилы содержали в цитоплазме исключительно вторичные гранулы: крупные, круглой формы, интенсивно окрашенные эозином в ярко красный цвет. В псевдоэозинофилах периферической крови никогда не встречалось ни одной азурофильной гранулы. Значит в 14 крови кролика в псевдоэозинофилах полностью отсутствуют первичные гранулы. Единичные первичные гранулы в псевдоэозинофилах кролика мы наблюдали в мазках крови, полученных у семидневных крольчат. Это свидетельствует, что вскоре после рождения в псевдоэозинофилах сохраняются немногочисленные первичные гранулы, а позднее они полностью исчезают. При использовании инновацинных фиксаторов и красителей вторичные гранулы нейтрофилов человека очень мелкие, окрашиваются эозином в бледный розовый цвет и заполняют всю цитоплазму (рис.1 - 2). В сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилах крови человека первичные (азурофильные) гранулы не выявляются. В мазках красного костного мозга человека в промиелоцитах очень много ярких первичных гранул. Bainton, Farquhar, (1968) с помощью цитохимической реакции на щелочную фосфатазу обнаружили очень высокую активность данного фермента во вторичных гранулах зрелых псевдоэозинофилов костного мозга кролика. Они считали щелочную фосфатазу маркером вторичных гранул кролика. Начиная с 1983 г. во всех учебниках по гистологии и многих монографиях указывается, что щелочная фосфатаза содержится во вторичных гранулах нейтрофилов человека. У здоровых людей щелочная фосфатаза определяется только в 10% - 30 % нейтрофилов. В преобладающем большинстве нейтрофилов она отсутствует. В 60-х годах ХХ века появляется огромное количество работ, посвященных аллергической 15 альтерации лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, клеток различных тканей. Доказано, что аллергическая альтерация клеток связана с влиянием аллергена на сенсибилизированные клетки. Для определения аллергической альтерации лейкоцитов использовали лизис лейкоцитов в камере Горяева. Повреждение лейкоцитов определяли нейтральным красным, и трипановым синим. Определяли содержание гистамина, освобождаемого лейкоцитами при альтерации этих клеток. Однако в литературе отсутствуют сведения о морфологических критериях аллергической альтерации различных клеток крови. Главная причина этого- низкое качество окраски цитоплазматических и ядерных структур клеток крови с помощью стандартных красителей 16 Рис.1. Два егментоядерных нейтрофила с очень мекими вторичными гранулами и тромбоциты Рис.2. Четыре сегментоядерных нейтрофила. Рис. 3. Палочкоядерный нейтрофил с очень мелкими и слабооксифильными вторичными гранулами и тромбоциты Рис.4 Эозинофилил с четырьмя ядерными сегментами и тромбоциты 17 Рис. 5. Нейтрофил с большим базофильным беззернистым участком цитоплазмы (внизу) и тень Боткина – Гумпрехта Рис.6. Нейтрорфил с очень большим беззернистым базофильным участком цитоплазмы и выход эозинофильных гранул из клетки в момоент приготовления мазка. Рис.7. Нейтрофилы имеют по два беззернистых участка цитоплазм Рис.8. Нейтрофил с большим базофильным беззернистым участком цитоплазмы 18 Рис. 9. Базофил крови человека. Рис. 10. Базофил периферической крови человека. Метахроматическая окраска специфических гранул базофилов человека имеет различные размеры и неодинаковую интенсивность. Рис. 12. Нейтрофил с двумя Рис. 11. Моноцит с аутобазофильными беззернистыми озеткообразованием. участками цитоплазмы 19 Рис. 13. Малый лимфоцит Рис.14. Лимфоцит с азурофильными гранулами Рис. 16. Мазок красного костного мозга кролика. Первичные гранулы- темнофиолетовые, вторичные – розово- коричневые Рис. 15. Базофил, палочкоя дерный и сегментоядерные нейтрофилы человека. 20 Рис. 18. Мазок красного Рис. 17.Эозинофил крови человека костного мозга белой крысы Рис. 19. Моноцит крови чело века с вакуолизацией цитоплазмы 21 22 У малого лимфоцита человека имеется небольшое круглой формы ядро, содержащее гетерохроматин, вокруг которого располагается узкий ободок слабо базофильной цитоплазмы (рис. 12). Часть лимфоцитов за счет наличия на их мембране молекул адгезии участвует в ауторозеткообразовании (рис. 21). Очень редко встречаются в крови человека средние лимфоциты, у которых имеется большое количество вакуолей на периферии цитоплазмы (рис. 14). Среди лимфоцитов человека 0,6 – 1 % составляют клетки с азурофильными гранулами (рис. 15). Рис. 13. Малый лимфоцит. Ув. 100х10. Рис. 16. Отпечаток красного костного мозга кролика. Первичные гранулы крупные круглые темно-фиолетового цвета. Вторичные гранулы мельче окрашиваются в неяркий касно=коричневый цвет. Рис. 18. Мазок красного костного мозга белй крысы. Самая крупная (гтигантская) клетка – мегакариоцит. Рис. 21. Лимфоцит, участвующий в ауторозеткообразовании. Ув. 100х10. Рис. 19. Моноцит с вакуолизацией цитоплазмы и ядра в крови больного сепсисом. Ув. 100х10. Рис.20. Нейтрофильный палочкоядерный лейкоцит с токсикогенной зернистостью у больного сепсисом. Ув. 100х10 На рис. 5,7, 8, и12 представлены нейтрофилы человека имеющие один или несколько беззернистых базофильных участков цитоплазмы У практически здоровых людей беззернистые участки цитоплазмы встечаются редко – от 3 до 10 % на 100 нейтрофилов. Появление беззернистых участков цитоплазмы в нейтрофилах свидетельствует о повышении их функциональной активности. 23 Глава 3 МЕТОДЫ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ И ИХ ИНФОРМАТИВНОСТЬ 3.1. Общепринятые методы изготовления гистологических препаратов Методы изготовления гистологических препаратов за последние 50 лет практически не изменились (Роскин Г.И., 1951; Семченко В.В. и др., 2006). После забора материала для гистологического исследования его сразу же необходимо поместить в раствор фиксатора. Чаще всего для фиксации материала патологоанатомами, судебно-медицинскими экспертами и экспериментаторами различного профиля используется формалин. При этом на свету формалин содержит следы муравьиной кислоты, которую необходимо нейтрализовать карбонатом кальция или карбонатом магния. В итоге образуется нейтральный формалин. Концентрированный формалин перед употреблением разводят изотоническим раствором хлорида натрия или холодной водопроводной водой в соотношении 1:9. Формалиновый фиксатор проникает в ткань со скоростью 2 мм/ч. Поэтому нежелательно забирать гистологический материал толще 5 мм, а длина и ширина кусочка может быть гораздо больше. Объем фиксирующей жидкости 24 должен превышать объем гистологического материала в 15 – 30 раз. После формалиновой фиксации материал промывают в холодной проточной водопроводной воде в течение 1-2 суток. Обезвоживание материала проводят в спиртах возрастающей концентрации: 50%, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % и 100 %. Продолжительность экспозиции в каждой порции спирта зависит от его концентрации и общего объема обезвоживаемого материала. Пропитывание органическими растворителями (бензол, толуол, ксилол, хлороформ). Пропитывание смесью расплавленного парафина и бензола, толуола или ксилола в термостате при температуре 37 градусов – 5-6 часов. Пропитывание расплавленным парафином в термостате при 56 градусах – в трех порциях по 1 часу. Заливка в парафин. Изготовление парафиновых срезов на микротоме и монтирование их на предметные стекла. Депарафинирование срезов с помощью бензола, толуола или ксилола. Проведение срезов по спиртам нисходящей концентрации до воды. Окраска срезов гематоксилином, а затем эозином. Быстрое обезвоживание срезов в спиртах возрастающей концентрации. Просветление срезов в ксилоле. Заключение срезов в бальзам, полистирол или новые импортные среды. 25 Нами обнаружено, что в процессе фиксации и промывки гистологического материала формалином происходит растворение ряда структур: гранул тучных клеток, зернистости базофильных гранулоцитов, вышедших из крови в соединительную ткань и др. 3.2.ИННОВАЦИОННЫЙ СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Мы разработали универсальный фиксаторкраситель, который в процессе фиксации гистологического материала дифференцированно окрашивает все клетки крови на различных стадиях созревания, иммунокомпетентные клетки и структурные элементы всех типов тканей. На первый вариант фиксатора-красителя в 1968 г. А.Г.Михееву выдано удостоверение на рационализаторское предложение КГМИ. В 1973 г. фиксатор-краситель был опубликован в журнале «Архив патологии». С тех пор фиксаторкраситель применялся при выполнении 6 кандидатских и 4 докторских диссертаций на кафедре гистологии и 4 кандидатских диссертаций на других кафедрах КГМИ. В последние 4 года А.Г.Михеевым был усовершенствован состав фиксатора-красителя: была повышена концентрация двух красителей, сделано оптимальным молярное соотношение основных и кислых красителей, дополнительно введено два новых химреактива. 26 Схема обработки гистологического материала при использовании инновационного ФИКСАТОРА- КРАСИТЕЛЯ 1. Гистологический материал помещают в фиксатор-краситель на 1-3 суток при температуре 2-4 градуса Цельсия. Соотношение объема гистологического материала и фиксатора-красителя должно быть от 1:20 до 1:30. Минимальная сторона кусочка ткани должна быть около 5 мм, остальные могут быть в несколько раз больше. 2. Из фиксатора-красителя окрашенный гистологический материал помещают в сухие марлевые мешочки, завязывают и прикрепляют этикетки. Марлевые мешочки с материалом помещают в 5 свежих порций бензола: 1-я – на 10 сек., 2-я – на 20 сек., 3-я – на 5 мин., 4-я – на30 мин., 5-я на - 1 час. 3. Пропитывание материала в смеси бензола и парафина в термостате при температуре 37 градусов в течение 2-3 часов. 4. Пропитывание в трех порциях парафина в термостате при 56 градусах: 1-я порция-30 мин., 2-я порция-30 мин., 3-я порция -1 час. 5. Заливка в парафин. 6. Изготовление парафиновых срезов и монтирование их на предметные стекла. 7. Депарафинирование в двух порциях ксилола по 5 мин. в каждой. 27 8. Первое предметное стекло со срезами из каждого кусочка заключают в бальзам, полистирол или импортную среду. При просмотре препарата под микроскопом определяют степень окраски структур кислыми и основными красителями. Если степень окраски хорошая, не проводят никаких дополнительных операций. Если морфологические структуры препарата недокрашены кислыми красителями и перекрашены основными, то проводят дифференцировку срезов. 9. Для дифференцировки окраски срезов готовят смесь, состоящую из ксилола и ацетона в объемных соотношениях: 7:3, 5:5, 3:7. 1-у смесь используют, когда препараты слабо перекрашены основными красителями, а 3-ю – когда сильно перекрашены кислыми красителями. Время дифференцировки колеблется от 2 до 10 минут, что определяется опытным путем в каждом конкретном случае. 10. После дифференцировки препараты просветляют в двух порциях ксилола по 5 минут в каждой и заключают. 3.3. ПОВЫШЕНИЕ ИНФОРМАТИВНОСТИ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ИННОВАЦИОННОГО ФИКСАТОРА-КРАСИТЕЛЯ В гистологических срезах после фиксации и окраски инновационным реагентом дифференцированно окрашиваются все типы тканей. Четко выявляются клетки крови на различных стадиях созревания. В 28 соединительной ткани определяются тканевые нейтрофилы и эозинофилы (вышедшие из крови в ткань). Только наша методика позволяет обнаружить базофильные ганулоциты, вышедшие из крови в соединительную ткань и тучные клетки без специальной окраски. Окраска гистологического материала одновременно с фиксацией позволяет определять функциональной состояние ряда клеток. Если в клетке изменяется рН, это отражается на окраске цитоплазмы. Инновационный способ изготовления гистологических препаратов, в отличие от всех существующих, позволяет в полном объеме изучать тканевый гранулоциты всех трех типов: эозинофильных, нейтрофильных и базофильных. Во многих учебниках по гистологии и даже в гистологической номенклатуре, изданной в России, тучные клетки называют тканевыми базофилами. Однако во всей международной литературе их называют тучными клетками. Пока базофильный гранулоцит находится в кровяном русле, его называют циркулирующим базофилом. Когда базофильный гранулоцит выходит из циркуляции в соединительную ткань, его правомерно называть тканевым базофилом, который, безусловно, не является тучной клеткой. Благодаря дифференцированной окраске иммунокомпетентных клеток, новый метод изготовления гистологических препаратов очень информативным является при изучении аллергических реакций. 29 Рис. 24. Изменение тканей после имплантации полиоксиалканоатной пленки Рис. 25. Нейрон головного мозга кошки Рис. 26. Большое количество тучных клеток с в соединит. ткани и ворруг сосуда 30 Рис. 28. Новообразованный лимфатический узел через 1 месяц после имплантации ксеноперикарда Рис. 27. Срез красного костного мозга кролика с двумя мегкариоцитами. Рис. 29. Две тучные клетки в эндомизии на продольном раззезе. 31 Рис. 30. Скопления клеток инородных тел вблизи имплантата ксеноперикарда 32 Рис. 33. Огромная клетка инородных тел с десятками ядер после имплаптации ксеноперикарда Рис. 31. Поперечный срез через переднюю брюшную стенку белой крысы. 33 Рис. 32. Скопление свыше 30 тучных клеток в соединительной ткани при имплантации ксенперикарда 34 Рис. 27. Срез красного костного мозга белой крысы. На снимке 1 мегакариоцит, 6 жировых клеток и масса клеток гранулоцитопоэза. Ув. 40х10. Рис. 25. Нейрон головного мозга кошки. На снимке четко видны ядрышко, субстанция Ниссля, отростки и нейропиль. Ув. 100х10. Рис.26. Тучные клетки в стенке сосуда и соединительной ткани. Ув. 100х10. Рис. 28. Лимфатический узел, образовавшийся в соединительной ткани кожи белой крысы вблизи имплантата. Хорошо развиты мозговые тяжи и мозговые промежуточные синусы. Корковое вещество отсутствует. Ув. 10х10. 29. Две тучные клетки в эндомизии. Рис. 30. Скопление большого количества клеток инородных тел недалеко от имплантата.11 клеток инородных тел располагаются довольно близко друг к другу. Каждая из них содержит до десяти ядер. Ув. 40х10. Рис. 32. Массивная инфильтрация тучными клетками соединительнотканной оболочки вокруг имплантата. Небольшой участок соединительнотканной оболочки содержит более 30 тучных клеток. Ув. 20х10. Рис. 31. Поперечный срез передней брюшной стенки белой крысы. На снимке видны: роговой и ростковый слои эпидермиса, тонкий сосочковый и очень толстый сетчатый слои дермы, все структуры корней волос, мышечная и серозная оболочки. Рис.33. Огромная клетка инородных тел вблизи имплантата ксеноперикарда 35 Заключение Все выпускаемые промышленностью гематологические фиксаторы и красители имеют простой химический состав: два красителя, один или два растворителя. Инновационные фиксаторы и красители включают 4-5 красителей в оптимальном молярном соотношении, дополнительные химреактивы и буферные компоненты. Новые реагенты устойчивы, способны многократно окрашивать препараты до 2-3 недель после приготовления рабочего раствора красителя. Фиксатор-краситель для гистологических препаратов не имеет аналогов. Исключены многие операции: промывка гистологического материала после фиксации, обезвоживание материала в батарее этиловых спиртов возрастающей концентрации, окраска парафиновых срезов, их обезвоживание после окраски. Описанные инновационные реагенты для изготовления гематологических и гистологических препаратов уже нашли применение в клинической лабораторной диагностике и патологоанатомической практике. Кроме повышения информативности гематологических и гистологических препаратов они имеют массу преимуществ по сравнению с известными. Если рабочий краситель Романовского обычно готовят ежедневно, то рабочий раствор красителя из наших реагентов обладает высокой устойчивлостью и сохраняет красящие свойства до 5-10 дней после приготовления. Это экономит не только реактивы, но и время сотрудников клинических лабораторий. Реагенты для изготовления гистологических препаратов сокращают количество операций и ускоряют процесс изготовления препаратов. Этилового 36 спирта требуется в 100 раз меньше по сравнению с традиционными способами. Список литературы 1. Данилов Р.Л., Клишов А.А., Боровая Т.Г. Гистология человека в мультимедиа. Учебник для студентов медицинских вузов. – СПб.: ЭЛБИ – СПб., 2003. – 362 с., илл. 2. Козинец Г.И., З.Г.Шишканова, Т.Г.Сарычева, Ю.К.Новодержкина, О.А.Дягилева, Д.Д.Проценко. Клетки крови и костного мозга: Атлас. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – 203 с.:ил. 3. Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. «Медицина», М.,1975, 383 с. 4. Роскин Г.И. Микроскопическая техника. Изд.-во «Наука», М., 1951, 447с. 5. Семченко В.В.,Барашкова С.А., Ноздрин В.П., Артемьев В.Н. Гистологическая техника – 3-е изд.- ОмскОрел, 2006.- 290 с. 6. Мяделец О.Д. Основы цитологии, эмбриологии и общей гистологии. – М.: Медицинская книга, Н.Новгород: изд-во НГМА, 2002.- 307 с. 7. Руководство по гистологии. В 2 т. Т 1. – СПб.: Спец Лит, 2001. – 495 с.: ил. 8. Андерсон Ш. Атлас гематологии /Под ред. В.П. Сапрыкина. Пер. с англ. И.А.Поповой, В.П.Сапрыкина. – М.: Логосфера, 2007. -608 с.:ил. 37 9 Bainton D.F., Farquhar M.G. Origin of granules in polymorphonuclear leukocytes.// j. Cell. Biol. 1966, 28, 277-301. 10 Кюнель В. Цветной атлас по цитологии, гистологии и микроскопической анатомии /пер. с англ. Е. Погосян. – М.: Аст: Астрель, 2007. - 533 с. 11. Ross M.H., L.J. Romrell, G,J, Kaye. Histology, Williams, Baltimore, London. 1995. S. 823. 12.Хоффбранд В., Дж. Петин. Атлас-справочник «Гематология» /пер. с англ. И.А.Поповой – М.:«Практика».- 2007. – 408 с., 1277 цв. илл. 13. Udritz E, B.Sandoz. Atlas of Haematology Basel, 1998. 492 s. 38 39
