Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский
advertisement
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Минздрава России На правах рукописи Виноградская Ирина Сергеевна Морфометрический анализ митохондрий при наследственно обусловленных состояниях скелетной мышечной ткани 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология 14.03.02 – патологическая анатомия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: д.м.н., проф. В.В. Глинкина, д.м.н., проф. В.С. Сухоруков Москва – 2014 СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .......................... 6 ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................. 8 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................... 15 1.1 МОРФОЛОГИЯ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ............................. 15 1.1.1 Ультраструктура поперечнополосатого мышечного волокна............... 15 1.1.2 Митохондриальная сеть скелетных мышечных волокон ...................... 23 1.1.2.1 Строение митохондрий ................................................................... 23 1.1.2.2 Роль митохондрий в регуляции миогенеза ..................................... 25 1.1.2.3 Митохондрии мышечного волокна ................................................. 27 1.1.2.4 Особенности структурной организации митохондрий в мышечных волокнах ........................................................................................ 27 1.2 МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ПРИ ВРОЖДЕННОЙ МИОПАТИИ ЦЕНТРАЛЬНОГО СТЕРЖНЯ И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ МИОПАТИИ............................................................... 29 1.2.1 Ультраструктурные изменения скелетных мышечных волокон при врожденной миопатии центрального стержня ................................................... 29 1.2.2 Ультраструктурные изменения скелетных мышечных волокон при митохондриальной миопатии .............................................................................. 31 1.2.3 1.3 Изменение митохондрий при различной патологии клеток .................. 33 ПОВЫШЕНИЕ ЧИСЛА И РАЗМЕРОВ МИТОХОНДРИЙ, КАК МЕХАНИЗМ ТКАНЕВОЙ АДАПТАЦИИ............................................................ 36 1.3.1 Роль митохондрий в компенсации патологических процессов в скелетной мышечной ткани ................................................................................. 36 1.3.2 Роль изменения числа митохондрий на их функциональное состояние .............................................................................................................. 38 1.3.3 Митохондриальная динамика ................................................................. 39 1.3.3.1 Молекулярные механизмы митохондриальной динамики ............ 41 1.3.3.2 Слияние митохондрий ..................................................................... 41 2 1.3.3.3 Деление митохондрий ..................................................................... 43 1.3.3.4 Саркоплазматическая сеть и митохондрии .................................... 45 1.3.3.5 Роль митохондриальной динамики в скелетной мышечной ткани. Скорость митохондриальной динамики и уровень белков слияния/деления ............................................................................................... 48 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................. 50 2.1 Материал для исследования. Группы обследованных пациентов............... 50 2.2 Методы исследования .................................................................................... 51 2.2.1 Биохимические исследования ................................................................. 52 2.2.2 Морфологические исследования ............................................................ 53 2.2.2.1 Гистоферментохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) по Нахласу и др. ........................................................... 54 2.2.2.2 Электронно-микроскопическое исследование............................... 54 2.2.2.3 Морфометрический анализ ............................................................. 55 2.2.3 Статистическая обработка данных ......................................................... 56 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ....................................................................................... 58 3.1 ГИСТОФЕРМЕНТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ПАЦИЕНТОВ.......................................................................................................... 58 3.1.1 Гистоферментохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы у больных врожденной миопатией центрального стержня ...... 58 3.1.2 Гистоферментохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы у больных митохондриальной миопатией................................. 58 3.2 ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ПАЦИЕНТОВ .......................................... 60 3.2.1 Электронно-микроскопическое исследование скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатией центрального стержня ........................ 60 3.2.2 Электронно-микроскопическое исследование скелетной мышечной ткани больных митохондриальной миопатией .................................................. 66 3 3.3 МОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МИТОХОНДРИЙ В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ПАЦИЕНТОВ .......................................... 73 3.3.1 Морфометрические характеристики митохондрий в различных участках мышечного волокна при врожденной миопатии центрального стержня ................................................................................................................. 73 3.3.2 Соотношение между морфометрическими показателями митохондрий при врожденной миопатии центрального стержня ............................................ 80 3.3.3 Соотношение морфометрических показателей с функциональными показателями при врожденной миопатии центрального стержня..................... 82 3.3.4 Морфометрические характеристики митохондрий в различных участках мышечного волокна при митохондриальной миопатии ..................... 88 3.3.5 Соотношение между морфометрическими показателями митохондрий при митохондриальной миопатии ....................................................................... 94 3.3.6 Соотношение морфометрических показателей с функциональными показателями при митохондриальной миопатии ............................................... 96 3.4 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ МОРФОМЕТРИЧЕКСИХ ПАРАМЕТРОВ ИЗМЕНЕНИЯ МИТОХОНДРИЙ В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ У БОЛЬНЫХ ВРОЖДЕННОЙ МИОПАТИЕЙ ЦЕНТРАЛЬНОГО СТЕРЖНЯ И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ МИОПАТИЕЙ ..... 98 3.4.1 Сравнение морфометрических показателей митохондрий у больных врожденной миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией ............................................................................................................. 98 3.4.2 Сравнительный анализ выявленных корреляционных взаимосвязей между морфометрическими показателями митохондрий у больных врожденной миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией ........................................................................................................... 101 3.4.3 Сравнительный анализ выявленных корреляционных взаимосвязей между морфометрическими и функциональными показателями митохондрий у больных врожденной миопатией центрального стержня и у больных митохондриальной миопатией .......................................................................... 103 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ................... 109 4.1 Морфометрические характеристики митохондрий мышц при врожденной миопатии центрального стержня.......................................................................... 109 4 4.2 Морфометрические характеристики митохондрий мышц при митохондриальной миопатией ............................................................................. 115 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ...................................................................................................... 120 ВЫВОДЫ ................................................................................................................ 120 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ .............................................................. 122 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................... 123 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ АТФ – аденозин 5’-трифосфат АДФ – аденозиндифосфат Tп – тропонин Тm – тропомиозин Тц – терминальные цистерны RRF- «ragged-red fibres» («рванные» красные волокна) RYR1 – Ryandine receptor 1 Drp1 - dynamin - related protein 1 Mff - Mitochondrial fission factor hFis1 - Mitochondrial fission 1 protein in humans MiD49/MID51 -Mitochondrial dynamics protein 49/Mitochondrial dynamics protein 51 MIEF 1 - mitochondrial elongation factor 1 MTP18 – Mitochondrial protein in humans 18 OPA1 - Optic atrophy 1 Mfn1 / Mfn2 – mitofusin 1/2 MIB – митофузин связывающий белок PARL - Presenilin-associated rhomboid-like MAM - mitochondria-associated ER membrane NCAM – neural cell adhesion molecule (молекула адгезии нервных клеток) TAZ – gene Tafazzin PGC-1a / 1β– proliferator – activated receptor gamma coactivator 1 alpha/ 1 beta BAX – Bcl2 –associated x protein BAK – Bcl2 homologous antagonist/killer ГТФ – гуанозинтрифосфат ЭПС – эндоплазматическая сеть мтДНК – митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота 6 РНК – рибонуклеиновая кислота мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота цАМФ – аденозин 3’, 5’- циклический монофосфат Ca2+ – ионы кальция TRAP1 – tumor necrosis factor receptor – associated protein 1 ЛДГ – лактатдегидрогеназа НАД – никотинамиддинуклеотид НАД2 – восстановленный никотинамиддинуклеотид СДГ – сукцинатдегидрогеназа 7 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Выбор инструментов исследований в любой области знаний является центральной проблемой. Это особенно актуально в области медицины и здравоохранения, где правильная диагностика играет ключевую роль в выборе стратегии и тактики лечения, а впоследствии определяет его успешность. Нервно-мышечные генетическими заболевания, дефектами миопатии, в особенности, составляют обусловленные большую группу наследственных заболеваний человека, приводящие к инвалидности и фатальному исходу у детей и взрослых. Дифференциальная диагностика этих заболеваний остается трудной, в силу недостаточно специфичных проявлений и большого клинического сходства состояний, обусловленных разными генетическими дефектами. Большой интерес в исследованиях патогенетических механизмов миопатий привлекают митохондрии. Свидетельством универсальной роли митохондрий в патогенезе различных заболеваний мышц является исследование, проведенное J Muller-Hocker и соавт. [Muller-Hocker J et al., 1986]. Было показано, что ослабление-сопряжение окислительного фосфорилирования тесно, но не обязательно связано с пролиферацией митохондрий. В ряде исследований [Sukhorukov, 1998, 2006, 2011] было высказано предположение, что при определенных формах заболеваний увеличение числа и размеров митохондрий могут влиять на клиническую картину заболевания, но до сих пор остается открытым вопрос о компенсаторной роли увеличения митохондрий и возможности этих органеллы влиять на снижение степени тяжести заболевания. Так же по-прежнему остается неясным вопрос: какова роль изменения числа митохондрий при врожденной миопатии, так как довольно часто в скелетной мышечной ткани выявляются признаки митохондриальных нарушений в виде увеличения их числа. Врожденные миопатии являются редкими, клинически и генетически гетерогенными заболеваниями. Среди них первое место по частоте 8 занимает врожденная миопатия центрального стержня, относящаяся к так называемым «немитохондриальным» заболеваниям, поэтому в качестве группы сравнения было выбрано заболевание, вызываемое первичным поражением митохондрий, а именно митохондриальная миопатия, сходная по светооптическим гистоферментохимическим характеристикам с миопатией центрального стержня. Митохондриальные состояний, болезни связанных с составляю генетически большую группу патологических детерминированными нарушениями клеточной биоэнергетики их частота встречаемости варьирует от 1:5000 до 1:10000 населения [Schaefer A.M. et al., 2008; Chinnery P.F., et al., 2012; Bannwarth S., et al., 2013]. Связь с развитием миопатий различной степени тяжести определяет особый интерес к структурной реорганизации митохондрий в мышцах. На сегодняшний день организация митохондриона в зрелых мышечных волокнах человека практически не изучена. В литературе отсутствует описание таких параметров как количество, размер и форма митохондрий. Глубокое понимание энергетических процессов клетки, несомненно, требует комплексного подхода, сочетающего исследования биоэнергетики и митохондриальной биохимии с анализом морфологии митохондрий. Основным дифференциально-дигностическим маркером этих заболеваний является гистохимическая диагностика с выявлением активности различных ферментов, главным образом митохондриальных. Однако, среди врожденных заболеваний, встречаются и такие у которых гистохимические критерии мышц сходны. В связи с этим необходима разработка новых морфометрических маркеров для диагностики мышечных биоптатов при вышеперечисленных заболеваниях. Точная морфологическая оценка параметров митохондрий в скелетной мышечной ткани при адаптационных процессах особенно актуальна на современном этапе развития клинической миологии, когда ещё отсутствуют генетические методы лечения подавляющего большинства нервно-мышечных заболеваний. Анализ морфометрических параметров митохондрий при патологических 9 состояниях мышечной ткани в сопоставлении с другими клинико-лабораторными показателями больных может помочь при разработке неспецифических терапевтических подходов в лечении различных заболеваний мышц. В соответствии с вышесказанным целью исследования было поставлено определение морфометрических параметров митохондрий при патологических состояниях скелетной мышечной ткани и возможности их использования для диагностики нервно-мышечных заболеваний. Задачи исследования: 1. Определить морфометрические ультраструктурные характеристики митохондрий в межмиофибриллярных и субсарколеммальных участках волокон поперечнополосатой скелетной мышечной ткани у больных врожденной миопатией центрального стержня и оценить наличие корреляционных связей между полученными показателями. 2. Определить корреляционные связи между выявленными морфометрическими показателями митохондрий мышечной ткани при миопатии центрального стержня с клинико-лабораторными показателями тяжести заболевания и активности энергетического метаболизма. 3. Определить морфометрические ультраструктурные характеристики митохондрий в межмиофибриллярных и субсарколеммальных участках волокон поперечнополосатой скелетной мышечной ткани у больных митохондриальной миопатией и оценить наличие корреляционных связей между полученными показателями. 4. Определить морфометрическими корреляционные показателями связи между митохондрий выявленными мышечной ткани при митохондриальной миопатии с клинико-лабораторными показателями тяжести этого заболевания и активности энергетического метаболизма. 5. Сопоставить полученные морфометрические показатели состояния митохондрий скелетной мышечной ткани при миопатии центрального стержня и при митохондриальной миопатии, а также оценить возможный объём 10 адаптационных и патологических процессов при изменении указанных показателей. 6. Выявить диагностически значимые морфометрические критерии состояния митохондрий, позволяющие эффективно использовать их для оценки компенсаторных и патологических процессов в скелетной мышечной ткани при различных нервно-мышечных заболеваниях у детей. Научная новизна В настоящем исследовании впервые проведена полноценная морфометрическая ультраструктурная характеристика параметров митохондрий в межмиофибриллярных и субсарколеммальных участках волокон поперечнополосатой скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией. Впервые охарактеризованы количественные и качественные параметры митохондрий и подтверждена гипотеза компенсаторной роли изменения их числа при наследственно обусловленных состояниях скелетной мышечной ткани. Продемонстрированы энергетического аппарата различия в мышц при компенсаторных механизмах митохондриальной и при немитохондриальной миопатиях. В частности, оценена эффективность повышения количества митохондрий в мышечной ткани при названных заболеваниях. Морфометрические параметры митохондрий были сопоставлены друг с другом, в результате чего, были установлены механизмы поддержания удельного объёма митохондриальной популяции в поперечнополосатой скелетной мышечной ткани больных центральным стержнем и митохондриальной миопатией. С помощью корреляционного анализа впервые выявлена взаимосвязь между морфометрическими параметрами митохондрий с клинико-лабораторными показателями тяжести заболевания и активностью энергетического метаболизма при данных заболеваниях. Впервые проведена сравнительная оценка морфометрических показателей состояния митохондрий в скелетной мышечной ткани больных миопатией 11 центрального стержня и митохондриальной миопатией. На основании полученных данных разработаны дополнительные маркеры для дифференциальной диагностики и расшифровки патогенеза этих двух групп тяжелых заболеваний. Впервые предложен показатель «Энергетической обеспеченности мышечного волокна», выражающий соотношение удельного объёма митохондрий к удельному объёму миофибрилл, который может быть применён для оценки компенсаторных митохондриальных изменений в скелетной мышечной ткани при нервно - мышечных заболеваниях у детей. Практическая значимость работы Проведенное исследование, послужило экспериментальным обоснованием применения комплексного подхода, сочетающего гистоферментохимическое, электронно-микроскопическое, морфометрическое, клинико-биохимические исследования для понимания энергетических процессов клетки, адаптационных потенциалов тканевых биоэнергетических реакций и роли увеличения числа митохондрий в снижении степени тяжести заболевания. Предложенные критерии оценки морфометрической диагностики адаптационных изменений митохондрий при наследственно обусловленных состояниях скелетной мышечной ткани помогают четко определить необходимый объём морфологических исследований, а также повысить качество результатов патоморфологического исследования биопсийного материала. Внедрение результатов исследования в практику Разработанные диагностические критерии морфометрической оценки параметров митохондрий скелетной мышечной ткани у больных миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией внедрены в практическую и научно-методическую деятельность психоневрологического отделения № 2 НИКИ педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России, а также в курс лекций на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. 12 Апробация работы Материалы работы доложены и обсуждены на совместном заседании кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России и научно-исследовательской лаборатории общей патологии Научно-исследовательского клинического института педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Основные положения диссертации доложены на XI Российском Конгрессе «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2012), на XX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2013), на XXI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2014), на ХIII Международном конгрессе по нервно-мышечным заболеваниям (Франция-Ницца, 2014). Публикации По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ в отечественной и зарубежной научной медицинской, и биологической печати. Личный вклад автора Основные результаты получены при непосредственном участие автора в планировании и проведении экспериментов. Автор принимал личное участие в гистологической обработке материала для гистохимического и электронномикроскопического анализа. Автор самостоятельно провел сбор, обработку и статистический анализ полученных данных, самостоятельно сформулировал основные положения диссертации, выводы и представил практические рекомендации. Степень тяжести заболевания у больных детей оценивалась совместно с клиницистами НИКИ педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России. Автор лично провел анализ морфологического материала из архива НИЛ общей патологии за период с 1998 года. Объём и структура работы Диссертация состоит из глав введения, обзора литературы, материала и 13 методов исследования, собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов и приложения. Работа содержит список литературы из 204 ссылок (27 отечественных и 177 иностранных авторов), 55 рисунков, 2 таблиц, 6 графиков. Общий объём диссертации составил 146 страницы. 14 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 МОРФОЛОГИЯ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ 1.1.1 Ультраструктура поперечнополосатого мышечного волокна Основным элементом скелетной мышечной ткани является поперечнополосатое мышечное волокно (миосимпласт). У взрослого человека диаметр мышечного волокна колеблется от 10 до 100 мкм, а, площадь поперечного сечения мышечного волокна варьирует от 300 мкм2 до 5000 мкм2, и длина может достигать 20 см (рис. 1). У новорожденных детей диаметр мышечного волокна 7-8 мкм, в 2 года достигает 10-14 мкм, а в 5 лет уже 15-20 мкм. Количество мышечных волокон в отдельных мышцах человека варьирует в широких пределах [Huddart, 1975]. Так, в четырехглавой мышце бедра (m.quadriceps femoris) около 1,7 млн. мышечных волокон. Известно, что чем больше волокон содержит мышца, тем больше её сократительная сила. Каждое мышечное волокно окружено тонкой соединительнотканной оболочкой – эндомизием (endomysium). Волокна объединяются в пучки, которые окружены перимизием (perimysium). Мышца в целом покрыта плотной оболочкой – эпимизием (epimysium). В некоторых мышцах одиночные волокна имеют такую же протяженность, как и вся мышца, но в большинстве случаев они короче и часто располагаются под углом к продольной оси мышцы [Шубникова, 2001, Dubowitz, Sewry, 2007]. Каждое поперечнополосатое (исчерченное) мышечное волокно покрыто клеточной мембраной (сарколеммой), которая окружает саркоплазму. Сарколемма участвует в проведении стимулирующих мышцу импульсов как вдоль, так и поперек волокна. Снаружи сарколемма покрыта толстой базальной мембраной, в которую вплетаются ретикулярные волокна [MacLennan, 1975]. Мышечные волокна состоят из миосимпластической части и мелких уплощенных клеток миосателлитоцитов. Миосимпластическая часть мышечного волокна включает саркоплазму и от нескольких сотен до нескольких тысяч ядер, лежащих под сарколеммой. Ядра миосимпластов имеют удлиненно - овальную форму, длиной 15 до 10-20 мкм, ориентированы вдоль волокна и располагаются на расстоянии около 5 мкм друг от друга [Sandow, 1970]. Сократительный аппарат мышечного волокна представлен миофибриллами, которые располагаются отделяются друг от продольно в центральной части саркоплазмы друга рядами вытянутых митохондрий и и цистерн саркоплазматической сети. Миофибриллы имеют вид нитей диаметром от 1 до 2 мкм (рис.1). Рис.1. Строение скелетных мышечных волокон [Зильбернагль, Деспопулос, 2012]. Телофрагмы (Z-линии) подразделяют каждую миофибриллу на исчерченные участки длиной примерно 2 мкм, называемые саркомерами (рис.2). Таким образом, саркомер (миомер) представляет собой участок миофибриллы расположенной между двумя телофрагмами (Z-линиями) и включающий A- диск и две половины I-дисков – по одной половине с каждой стороны. В расслабленной мышце длина саркомера 2-3 мкм, при сокращении длина укорачивается до 1,5 мкм. Структура саркомера представлена упорядоченной системой толстых и тонких нитей (миофиламентов). Толстые нити (миофиламенты) образованы упорядоченно упакованными молекулами фибриллярного белка миозина, который сосредоточен в А-диске. Тонкие нити (миофиламенты) содержат сократительный белок актин, а также два регуляторных белка - тропонин и тропомиозин (рис. 2). Примерно 2000 актиновых филаментов связаны посередине с Z-диском. Таким образом, половина актинового филамента проецируется на два ближайших саркомера (рис.2). Участок саркомера, ближайший к Z-диску, содержит только 16 актиновые филаменты, которые формируют так называемую светлую (изотропную) полоску (I-диск) (рис.2). По всей ширине I-диска располагается белок небулин в виде удлиненных нитей, отвечающий за поддержание длины тонких филаментов и обеспечивает их объединение с Z-линией [Гусев, 2000]. Участок, где актиновые и миозиновые филаменты перекрываются, называется темной (анизотропной) полоской (A-диск) (рис.2). Более светлый участок A-диска, свободный от тонких волокон - называется H-полоской, содержит только миозиновые филаменты (примерно 1000 на саркомер). В составе H-полоски имеется менее выраженная мезофрагма (М-линия), образованная фибриллярным белком миомезином, который «сшивает» концы миозиновых миофиламентов (рис.2) [Гусев, 2000]. Рис.2. Строение саркомера [Зильбернагль, Деспопулос, 2012]. Актиновые филаменты прикреплены к сарколемме с помощью белка дистрофина, который присоединяется к саркогликанам на сарколемме. Мерозин связывает саркогликаны с коллагеновыми фибриллами внеклеточного матрикса. Изменение этих белков ведет к миодистрофии (Дюшенна, Лейдена и к врожденным мышечным дистрофиям) - дегенерации мышечных волокон и снижению их силы [Зильбергальд, Деспопулос, 2012]. Моторный белок миозин, образующий толстые нити, обладает большим 17 разнообразием [Кубасова, Цатурян, 2011]. Каждый миозиновый филамент состоит из пучка примерно в 300 молекул миозина II (рис.2). Молекула миозина имеет вид нити длиной 150 нм и толщиной 2 нм. В составе молекулы миозина находится 6 полипептидных цепей: две тяжелые цепи с молекулярной массой 200000 -250000 каждая и четыре легкие цепи с молекулярной массой 20000 каждая. Эти цепи прочно ассоциированы друг с другом нековалентной связью [Гайтон, 2008]. Молекула миозина имеет две глобулярные головки, соединенные подвижной шейкой (головка и шейка = субфрагмент S1 [Кубасова, Цатурян, 2011]; структура образуется после протеолиза) с палочкообразным хвостом (две спирально закрученные a-субъединицы = субфрагмент S2) (рис.3). Каждая головка содержит двигательный домен с нуклеотидсвязывающим карманом (для АТФ или АДФ+ФH) и актинсвязывающий участок. Миозиновая головка, функционирует, как фермент АТФ-аза, расщепляет АТФ и использует энергию расщепления для мышечного сокращения. В каждой шейке тяжелой молекулы (220 кДа) локализованы две легкие белковые цепи: одна из них – регуляторная (20 кДа), а другая – основная (17 кДа). Рис.3. Молекула миозина II [Зильбернагль, Деспопулос, 2012]. Молекула миозина может сгибаться, как на шарнирах, в месте соединения тяжелого меромиозина с легким и в области прикрепления головки. Стержневые части молекул миозина собраны в пучки (численностью до 200 и более). Такие пучки, соединены зеркально концами друг с другом в области М-линии и 18 формируют толстые нити. Конформационные изменения в районе головки и шейки позволяют миозиновой головке наклоняться при взаимодействии с актином [Кубасова, Цатурян, 2011; Зильбергальд, Деспопулос, 2012]. Актиновая нить состоит из трех белковых компонентов: актина, тропомиозина и тропонина. Актин был открыт Бруно Штраубом в 1948 г. Этот белок способен активировать гидролиз АТФ, катализируемый миозином. Молекула актина – глобулярный белок (G-актин), состоящий из одного полипептида, который поляризуется с другими молекулами актина. К каждой молекуле G-актина прикреплена 1 молекула АДФ, с которой взаимодействуют поперечные мостики миозиновых нитей, обеспечивающие мышечное сокращение [Гайтон, 2008]. Четыреста этих глобулярных молекул, полимеризуясь, образуют Fактин. Молекула F-актина имеет вид двух скрученных нитей толщиной 7 нм вариабельной длины. Молекулы F-актина формируют актиновый филамент (рис.2, рис.4), который расположен рядом с равным ему по длине белком небулином [Зильбернагль, Деспопулос, 2012]. Таким образом, все нити актина в саркомере имеют постоянную длину - около 1 мкм, а также правильную ориентацию при этом плюс-концы располагаются в Z-диске, а минус-концы в центральной части саркомера. Вследствие такой упаковки нити актина, расположены в левой и правой части саркомера и имеют противоположную направленность [Гусев, 2000]. Актиновая нить также содержит другой белок – тропомиозин (рис.2). Молекула тропомиозина (Tm) состоит из двух скрученных между собой aльфаспиралей и имеет вид длиной слабо изогнутой спирали [Кубасова, Цатурян, 2011]. Примерно 4-7% всех белков миофибрилл приходится на долю тропомиозина [Березов, Коровкин, 2000]. Соседние молекулы тропомиозина (40 нм каждая), соединены между собой «хвост к голове», спирально оплетают спираль F-актина, и приблизительно через каждые 40 нм к ним прикреплена молекула тропонина (рис.4) [Frye, et all, 2010]. Тропонин (Tn) – глобулярный белок, который показал активность, похожую на активность тропомиозина. В скелетной мышце взрослых животных и человека тропонин составляет около 2% от всех миофибриллярных белков [Березов, Коровкин, 2000]. В настоящее время известно, что каждая 19 молекула тропонина состоит из трех субъединиц: Tn-I, Tn-C, Tn-T. Тропонина -С (Tn-C) имеет два регуляторных центра связывания Cа2+ на N-конце, тропонина- I (Tn-I) предотвращает скольжение филаментов в состоянии покоя и служит ингибитором актомиозиновой Mg-АТФазы, препятствуя связыванию миозина с актином, когда ионы кальция не связаны с тропонином C [Филатов и др., 1999, Schachat, Brandt, 2013]. Тропонина -Т (Tn-T) взаимодействует с Tn-C, Tn- I и с тропомиозином (рис.4). Считают, что этот комплекс прикрепляет тропомиозин к актину. Таким образом, высокое сродство тропонина к иону Cа2+, инициирует процесс сокращения мышц [Гайтон, 2008]. Следовательно, повышенная концентрация Cа2 в цитоплазме насыщает Cа2 связывающие сайты тропонина С, отменяя ингибиторный эффект тропомиозина на скольжение филаментов, препятствуя высокоаффинному связыванию актина и миозина II [Соловьева и др., 2006]. Не все сайты актина могут быть доступны для связывания миозина. Из литературных данных известно, что только 25-43% S1-головки миозина прочно связаны с тонкими нитями, следовательно, подразумевается, что только 14-21% сайтов актина будут заняты [Linari,1998, Smith, 1996]. При низкой концентрации Cа2+, тропонин I ингибирует связывание миозина с актином, и мышца остается расслабленной [lehman, 2000, 2001]. Актиновые и миозиновые нити удерживаются на месте с помощью нитевидных молекул титина (тайтина). Упругие молекулы титина образуют каркас, удерживающий актиновые и миозиновые нити в положении, обеспечивающем нормальную работу сократительного аппарата саркомера [Гайтон, 2008]. Титин представляет собой белок с эластическим свойствами, длина титина более 1000 нм, он состоит примерно из 30 000 аминокислот (>3000 КДа). Эта самая длинная известная полипептидная цепь составляет около 10% общей мышечной массы (рис.2) [Зильбернагль, Деспопулос, 2013]. В настоящее время известно несколько изоформ титина (тайтина) N2A, M2BA, N2B [Вихлянцев, Подлубная, 2012]. В районе полосы - А каждого саркомера титин расположен около миозинового филамента и помогает удерживать его в центре саркомера. 20 Нити титина присоединены к толстым филаментам по всей длине и, продолжаясь в I-диски, прикрепляют концы толстых филаментов к Z-линиям, образуя тайтинтелетониную связь. Титин прикреплен С-концом к М-диску, а N-концом - к Zлинии. Таким образом, нити титина связывают М - и Z-линии, и, благодаря своей эластичности, препятствуют перерастяжению мышцы. Они образуют внутри саркомера решетчатую структуру, и поддерживают упорядоченное взаимное расположение системы толстых и тонких миофиламентов. Молекулы титина в районе полосы-I гибкие и функционируют в качестве «эластичных тяжей», которые противодействуют пассивному сокращению мышцы и влияют на скорость ее укорачивания [Benichou, Givli, 2011; Зильбернагль, Деспопулос, 2013]. Рис.4. Строение тонкой нити (актинового филамента) [Улумбекова, Челышева, 2009]. Сарколемма формирует Т-систему поперечных трубочек (впячиваний), которые расположенных перпендикулярно миофибриллам (рис.5). Саркоплазматический ретикулум образует закрытые полости, несвязанные с внеклеточным и внутриклеточным пространствами. Большинство этих полостей располагается вдоль миофибрилл и разделяется на два отдела: терминальные цистерны (ТЦ), контактирующие с трубочками Т-системы (ТТ), и продолговатые трубочки, расположенные в центральной части саркомеров (рис.5) [Рубцов, 2000]. Конечные участки Т-трубочек проникают в промежуток между двумя терминальными цистернами саркоплазматической сети, формируя вместе с ними особые структуры - триады (рис.5) [Хэм, Кормак, 1983]. Структурная гетерогенность саркоплазматического ретикулума определяется различными функциями его отделов: продольные цистерны поглощают Са2+, а терминальные 21 цистерны способны к выбросу Са2+ в ответ на деполяризацию сарколеммы. Мембраны терминальных непосредственно соединены цистерн с саркоплазматического ретикулума мембранами Т-трубочек посредством, так называемых соединительных ножек (СН) [Рубцов, 2000]. Рис. 5. Схема строения мышечного волокна [Рубцов , 2000]. Выделение Са2+ происходит после того, как волна деполяризации с поверхности сарколеммы по Т-трубочкам распространяется вглубь волокна. В области триад возбуждение передается на мембрану саркоплазматической сети и вызывает повышение ее проницаемости. Это приводит к быстрому выделению из ее элементов ионов кальция. Обратный транспорт Са2+ осуществляется благодаря деятельности кальциевых насосов в мембране саркоплазматической сети, уменьшение концентрации кальция приводит к расслаблению мышечного волокна [Рубцов, 2000]. Энергетический аппарат мышечных волокон представлен митохондриями и трофическими включениями, содержащими вещества, расщепление которых служит источником энергии. Энергия, необходима для осуществления мышечной работы запасается в мышечных волокнах в виде АТФ и фосфокреатинина– 22 энергоемких фосфатных соединений. 1.1.2 Митохондриальная сеть скелетных мышечных волокон 1.1.2.1 Строение митохондрий Известно, что митохондрии играют ключевую роль в энергообеспечении всех клеток организма человека и участвуют в различных метаболических процессах. Митохондрии выполняют жизненно важные для каждой клетки функции, однако, их основная роль - образование молекул АТФ в биохимических циклах клеточного дыхания. Накопленная энергия в последующем трансформируется в механическую (в мышечной ткани), в биоэлектрическую (в нервной и мышечной тканях) и другие виды энергии. Для полноценного функционирования митохондрии необходимо около 3000 генов, только 37 из них кодируется мтДНК, остальные ядерной. Примерно 3% из необходимых митохондрии генов (около 100) задействованы для генерирования АТФ, более 95% (около 2900) – вовлечены в другие функции, необходимые для роста, развития и созревания тканей, в частности в процессы дифференцировки клетки [Dabke et.al. 2012]. Также основными биохимическими процессами, происходящими в митохондриях, являются: цикл трикарбоновых кислот, карнитиновый цикл, окисление жирных кислот, транспорт электронов в дыхательной цепи и окислительное фосфорилирование [Дадали, 1996]. Митохондрии играют определенную роль в регуляции апоптоза, образовании стероидов, регуляции внутриклеточного распределения кальция [Scheffler, 2001]. В последнее время стало известно, что митохондрии играют важную роль в метаболизме железа [Richardson et al., 2010], участвуют в сигнальных путях клетки [Tait, Green, 2012], а также в передаче сигналов к клеточной гибели и аутофагии. Ограниченный внутренней мембраной матрикс митохондрий представляет собой относительно гомогенную структуру с умеренной электронной плотностью. Содержимое матрикса – это субстраты и ферменты цикла Кребса и некоторых 23 других этапов энергетического метаболизма (цитратсинтетаза, изоцитратдегидрогеназа, фумараза, малатдегидрогеназа, аконитаза и др.), (от 2 до 10) копий митохондриальной дезоксирибонуклеиновой кислоты (мтДНК), митохондриальные рибосомы, рибонуклеиновая кислота (РНК) и ферменты, участвующие в экспрессии митохондриального генома. Каждая молекула мтДНК содержит около 17000 пар нуклеотидов [Naviaux, 2003]. Генетический код мтДНК отличен от ядерного кода всех млекопитающих, так и бактериального. Так кодон АУА (аденин-урацил-аденин) кодирует метионин вместо изолейцина; кодоны АГА (аденин-гуанин-аденин) и АГГ (аденин-гуанин-гуанин), обычно кодирующие аргинин, в митохондриях являются стоп-кодонами; кодон УГА (урацил-гуанинаденин), стандартно являющийся стоп-кодоном, кодирует триптофан. Все белки, синтезируемые митохондриальной трансляционной системой, локализованы на внутренней мембране митохондрий [Литвинова и др., 2014]. Внутренняя мембрана митохондрий – уникальная структура, определяющая выполнение всех основных митохондриальных функций. Толщина внутренней мембраны около 7 нм для нее характерно наличие крист, обращенных в матрикс, поэтому общая поверхность внутренней мембраны в несколько раз превышает поверхность наружной мембраны [Palade, 1953]. Кристы необходимы для регулирования динамического распределения белков и липидов, а также растворимых метаболитов субкомпартментами. между Морфология крист отдельными связана митохондриальными с митохондриальными функциями [Nabi, 2011]. Более 10% всех фосфолипидов внутренней мембраны составляет кардиолипин. Важнейшей специфической составляющей внутренней мембраны являются ферментные комплексы дыхательной цепи и метаболизма АТФ, состоящие, по меньшей мере, из 60 полипептидных цепей [Hatefi, 1985]. Молекулы дыхательных ферментов свободно передвигаются в плоскости мембраны, поэтому нет необходимости в их структурно упорядоченной цепочке. Межмембранное пространство имеет ширину 10-20 нм. По составу малых молекул его содержимое близко содержимому гиалоплазмы. Здесь находятся несколько ферментов, использующих выходящей из матрикса АТФ для 24 фосфорилирования других нуклеотидов. Наружная мембрана имеет толщину около 7 нм. Мембрана содержит большое количество молекул транспортного белка порина и благодаря этому почти свободно пропускает молекулы массой до 5000 дальтон, в том числе и белки [Ernster, Schatz, 1981]. Количество и размеры митохондрий, как и их крист, варьируют в разных клетках и тканях [Fawcett, 1966; Munn, 1974]. Митохондрии подразделяются на два ультраструктурных типа: митохондрии с ламеллярными (пластинчатыми) кристами, характерные для большинства тканей, и с тубуловезикулярными кристами, характерные для стероид-продуцирующих клеток. Количество крист зависит от интенсивности митохондриальной тканевого ультраструктуры энергообмена. отражает Вариабельность вариабельность состояния энергетического обмена в этих органеллах [Hackenbrock,1966; Green, 1973]. 1.1.2.2 Роль митохондрий в регуляции миогенеза Недавние исследования показали, что митохондрии могут участвовать в регуляции миогенеза [Wagatsuma, Sakuma, 2013]. Во время миогенеза увеличивается митохондриальная масса, объём, количество мтДНК и активность митохондриальных ферментов. В различных тканях было выявлено, что функции митохондрий и их активность тесно связаны с клеточной дифференцировкой [Brunk, Yaffe, 1976; Hamai,et al., 1997; Seyer et al., 2011]. Недавно было показано, что при дифференцировке миобластов, активность митохондриальных ферментов резко возрастает [Moyes et al., 1997; Barbieri et al., 2011]. Кроме того, регенерация мышц сопровождается повышением активности митохондриальных ферментов [Duguez et al., 2002; Wagatsuma et al., 2011]. Митохондриальный биогенез – жизненно важный процесс в образовании и деградации органелл [Hood, 2001; Terman et al., 2010], охватывает синтез липидов и белков в митохондриях, сборку дыхательной цепи, репликацию мтДНК [Kim et al., 2007; Hock, Kralli, 2009]. Этот сложный процесс требует координированной экспрессии ядерных и митохондриальных геномов [Ryan, Hoogenraad, 2007]. В настоящее время известно более 1000 различных белков в митохондриях 25 млекопитающих [Calvo, Mootha, 2010]. Большинство митохондриальных белков кодируется ядерным геномом и синтезировано на цитоплазматических рибосомах [Goffart, Wiesner, 2003; Ryan, Hoogenraad, 2007]. В то время как меньшая часть их кодируется и синтезируется в митохондриях. Митохондриальный геном содержит 37 генов, кодирующих 13 генов (иРНК), участвующих в окислительном фосфорилировании, 22 гена транспортные РНК (тРНК) и 2 гена рибосомальные РНК (рРНК) (по одному гену для 12S и 16S рРНК), которые необходимы для синтеза митохондриальных белков [Anderson et al., 1981; Shanske, 1992]. В клетке человека около 10 000 копий мтДНК [Сухоруков, 2011]. Митохондриальный биогенез контролируется коактиваторами митохондрий: рецептором гена коактиватор-1 альфа (PGC-1a), PGC-1β [Lin et al., 2002] и КНР [Anderson et al., 1981; Lin et al., 2002]. Эти коактиваторы регулируют экспрессию митохондриальных генов. Авторы экспериментально показали, что митохондриальный биогенез стимулирует регенерацию мышц [Duguez et al., 2002]. Активация скоординированной митохондриального экспрессии биогенеза транскрипционных происходит коактиваторов за счет PGC-1a, транскрипционных факторов и ядерных рецепторов [Duguez et al., 2002]. Благодаря современным методам было выявлено, что митохондрии играют существенную роль в регуляции миогенеза и регенерации мышц. Миогенин, cMyc, кальценеврин были идентифицированы, как молекулы митохондриальной мишени, которые регулируются активностью ферментов митохондрий. Известно, что именно эти гены играют ключевую роль в регулировании миогенеза [Yeilding et al.,1998]. Новый взгляд на роль митохондрий в регуляции миогенеза инициировал новое представление об этих органеллах. В экспериментальных работах на трансгенных мышах было показано, что экспрессия PGC-1a в скелетных мышцах сохраняет функции митохондрий, нервно-мышечные синапсы и целостность мышц при старении [Wenz et. Al, 2009], митохондриальная генная терапия может эффективно применяться при лечении травм и патологии мышц [Jash, Adhya, 2012]. 26 1.1.2.3 Митохондрии мышечного волокна Структура митохондрий отличается тканевой специфичностью, которая в первую очередь зависит от метаболических особенностей конкретных клеток. Морфологические различия касаются внутренней организации органелл - формы и числа крист, плотности матрикса и т.д. [Kuznetsov, 2009]. Кроме того, морфология митохондрий изменяется и в ходе клеточной дифференцировки. Размеры митохондрий, как и форма, тоже очень непостоянны. Поэтому нужно с осторожностью относиться к прямой экстраполяции результатов, полученных в клеточных культурах, на зрелые специализированные клетки in vivo, а также с одних клеточных типов на другие. Это обстоятельство приобретает особую важность, когда речь идет о высокоспециализированных мышечных тканях. Например, для большинства метаболически активных клеток выявлена тенденция к объединению митохондрий [Skulachev, 2001], а для метаболически неактивных клеток характерны фрагментированные органеллы [Collins, 2002]. Миобласты и зрелые мышечные волокна демонстрируют существенные различия, как в организации митохондрий, так и в уровнях экспрессии и функциях белков митохондриальной динамики [Bloemberg, 2012]. 1.1.2.4 Особенности структурной организации митохондрий в мышечных волокнах Зональная гетерогенность В зависимости от локализации митохондрий в мышечных волокнах человека принято выделять три популяции митохондрий: субсарколеммальную, околоядерную и межмиофибриллярную, которые отличаются по уровню ключевых ферментов и морфологии [Picard et al., 2012]. Межмиофибриллярные митохондрии специализированы на энергоснабжении миозина и АТФазы саркоплазматической сети. Здесь самая строгая пространственная организация митохондрий. В субсарколеммальной и перинуклеарной участках митохондриальная сеть менее упорядочена и ее элементы, помимо основной 27 функции, вовлечены во внутриклеточные сигнальные пути. Субсарколеммальные митохондрии также участвуют в поддержании ионного гомеостаза, а перинуклеарные – в процессах транскрипции и трансляции [Долгов и др., 2007]. Субсарколеммальные и околоядерные популяции имеют более низкий окислительный потенциал, производят больше активных форм кислорода и более устойчивы к повышению концентрации ионов кальция, чем межмиофибриллярные митохондрии [Adhihetty, 2005]. В сердечной мышце человека субсарколлемальные митохондрии содержат пластинчатые кристы, а межмиофибриллярные митохондрий в основном трубчатые кристы [Hoppel et al., 2009]. Субсарколеммальные митохондрии более чувствительны к изменениям генома, чем межмиофибриллярные [Barbieri et al., 2014]. Межмитохондриальные контакты Функциональное и структурное единство митохондриальной системы жизненно необходимо для мышечных волокон, которые отличаются высоким энергопотреблением, и в момент сокращения требуют предельной синхронизации в работе всего многоядерного симпласта. Между митохондриями в поперечнополосатых мышечных тканях были обнаружены соединения, названные межмитохондриальными контактами. Они функционируют по принципу клеммконтактов, превращая митохондриальный ретикулум в кооперативную сеть «электрических кабелей», которые обеспечивают синхронное поступление АТФ ко всем саркомерам мышечного волокна [Skulachev, 2001; Bakeeva et al., 1978]. 28 1.2 МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ПРИ ВРОЖДЕННОЙ МИОПАТИИ ЦЕНТРАЛЬНОГО СТЕРЖНЯ И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ МИОПАТИИ 1.2.1 Ультраструктурные изменения скелетных мышечных волокон при врожденной миопатии центрального стержня Нервно-мышечные заболевания, в частности, обусловленные генетическими дефектами миопатии являются наиболее частыми и нередко фатальными наследственными заболеваниями человека. Только при одном заболевании – врожденной миопатии центрального стержня заболеваемость составляет от 3 до 6 на 100000 человек. Врожденные структурные миопатии являются группой редких, клинически и генетически гетерогенных заболеваний скелетномышечной ткани, с разными типами наследования и многообразия вариантов течения. Общими клиническими проявлениями, как правило, являются мышечная гипотония, атрофия мышц, структурные аномалии скелета [Сухоруков, Харламов, 2010]. Мышечная гипотония обычно преобладает в мышцах тазового пояса и проксимальных отделах ног. Мышцы плечевого пояса и рук поражаются в меньшей степени [Shy, Magee, 1956; Dubowitz, 1986]. Среди них первое место по частоте занимает врожденная миопатия «центрального стержня», наследуемая по доминантному типу и аллельная по отношению к злокачественной гипертермии, впервые описана Shy и Magee в 1956 году. Она вызывается мутацией в гене рианодинового рецептора (RYR1) на 19 хромосоме (локус q13.1). Диагноз врожденной миопатии центрального стержня ставится на основании мышечной биопсии в сочетании с характерными клиническими чертами [Quinlivan et al., 2003]. Существенным отличием патологических изменений при этом является отсутствие в группе врожденных структурных миопатий изменений, характерных для миодистрофии – в первую очередь, некрозов мышечных волокон с замещением их соединительной тканью. Мышечная ткань при неспецифических методах гистологической окраски может выглядеть практически нормальной. Тем не менее, важно отметить, по крайней мере, один неспецифический признак, 29 очень характерный для большинства структурных миопатий – миогенную атрофию мышечных волокон, при которой внутри каждого пучка определяется различие их размеров [Сухоруков, Харламов 2010]. Для миопатии центрального стержня характерной особенностью является наличие в скелетном мышечном волокне так называемых «стержней» функционально обособленных зон в центре мышечных волокон, в которых отмечается резкое снижение или отсутствие практически всех видов ферментной активности. При этом периферическая зона волокна остается относительно нормальной и функционирует [цит. по Engel, Franzini-Armstrong, 2004]. Как правило «стержни» единичны и встречаются в центре мышечного волокна, но иногда их может быть несколько в пределах одного волокна. Помимо «стержневых» участков, часто наблюдается изменение размера миофибрилл и увеличение размеров ядер в мышечном волокне. «Стержневые» участки, содержащие плотно упакованные и дезорганизованые миофибриллы лишены нормальных митохондрий и саркоплазматического ретикулума, а так же в них изменена система Т-трубочек и понижено содержание гликогена [Hayashi, Miller, 1989]. Центральные участки («стержни») скелетных мышечных волокон были разделены на два типа. Структурированные «стержни», в которых сохраняются основные черты саркомеров, хотя они и не характеризуются обычными соотношениями с нормальными саркомерами за пределами «стержневой» зоны и друг с другом. В частности, они укорочены, по сравнению с периферическими саркомерами. Миофибриллы в них более плотно упакованы, а Z-полоски могут быть утолщены или могут быть волнистыми. Неструктурированные «стержни» характеризуются утратой основных черт саркомеров в результате дегенерации миофибрилл. Структурированные и неструктурированные «стержни» при данной патологии могут быть одновременно обнаружены в скелетномышечной ткани [Engel, Franzini-Armstrong, 2004]. Пока не ясно, на какой стадии заболевания появляются «стержни» и от чего зависит скорость развития данного патологического процесса. В доступной 30 литературе отсутствует подробное описание ультраструктурных изменений мышечных волокон и их компонентов (в частности митохондрий) у пациентов с болезнью «центрального стержня». 1.2.2 Ультраструктурные изменения скелетных мышечных волокон при митохондриальной миопатии Митохондриальные обусловленная миопатии генетическими, – гетерогенная структурными, группа заболеваний, биохимическими дефектами митохондрий. Особенностью этих заболеваний является двойное генетическое кодирование внутри митохондриальных белков электронно-транспортной цепи генами ядерной и митохондриальной ДНК. Так как все митохондрии достаются новому организму только от цитоплазмы яйцеклетки, эти заболевания являются или спорадическими или наследуются с нарушением законов Менделя – «внеядерное» или «цитоплазматическое» наследование по материнской линии [Sligh et al., 2000]. Для митохондриальных болезней характерна гетероплазмия – смесь нормальной и мутантной ДНК в одной митохондрии, клетке, ткани или органе. Примерно 25% здоровых людей наследуют смесь дикого типа мтДНК и мутантные варианты [Masucci et al., 1995; Payne et.al. 2013]. При этом нормальная ДНК («дикого» типа) может компенсировать патологический эффект мутации. Одна и та же мутация может мозаично и в различном соотношении быть представлена в разных органах и тканях. Фенотип клетки предопределяется соотношением нормальных и мутировавших мтДНК. Минимальное, критическое число изменений мтДНК, необходимое для возникновения серьезных нарушений энергетического обмена и дисфункции конкретного органа или ткани, называется пороговым. Факторами влияющими на пороговый эффект являются энергетические потребности конкретных тканей и органов, а также их чувствительность к нарушениям окислительных процессов и возраст. Разные ткани и органы зависят от митохондриальной активности в разной степени. На первом месте стоят нервные элементы, сердечная и скелетная мышечные ткани, почки, эндокринные железы и печень [Сухоруков, 2011]. В зависимости от 31 степени повреждения функцональности клеток симптомы могут включать потерю контроля движения, мышечную слабость, болевые синдромы, трудности глотания и желудочно-кишечные расстройства, замедление роста, болезни сердца и тд. [Naviaux, 2003]. В основе митохондриальных заболеваний могут быть сотни первичных биохимических дефектов [Ленинжер, 1985; Luft, 1994; Северин Алейникова, 2000, основные изученные звенья патогенеза связаны с нарушением следующих реакций: окисления пирувата до ацетил-КоА с помощью пируватдегидрогеназного комплекса, состоящего из 3 различных ферментов, нескольких регуляторных пептидов, 5 коферментов; окисления ацетил-КоА до углекислого газа и образования восстановленных носителей электронов NADH и FADH - этот процесс состоит из 9 последовательных реакций цикла Кребса, являющегося общим конечным путем окисления белков, жиров и углеводов; реокисления восстановленного коэнзима Q ферментами электронно-транспортной цепи внутренней митохондриальной мембраны. Высвобождаемая при этом энергия используется для синтеза АТФ из АДФ и фосфатов; транспорта свободных жирных кислот через мембрану митохондрии в виде эфиров карнитина; окислительного дезаминирования аминокислот с последующим поступлением их углеродного скелета в цикл Кребса. Реакции цикла Кребса, так же как и процессы переноса электронов и окислительного фосфорилирования, происходят в матриксе митохондрии или на внутренней поверхности ее внутренней мембраны. Базовый уровень энергетического метаболизма обеспечивается за счет аэробных процессов, одним из ключевых ферментов которых является сукцинатдегидрогеназа (СДГ), полностью кодируемая ядерными генами. Достаточно однородная скелетная мышечная ткань является идеальной моделью для морфологической диагностики митохондриальных заболеваний. Она способна подавать выраженной сигналы пролиферации «митохондриального и гипертрофии дистресса» митохондрий. посредством Известно, что митохондриальная дисфункция, вызванная мутациями митохондриальной ДНК, 32 играет огромную роль в потере массы скелетной мышцы, что приводит к саркопении [Shah et al., 2009]. При митохондриальной миопатии для скелетной мышечной ткани характерна миогенная атрофия волокон. Типы мышечных волокон распределены мозаично, соотношение А и I дисков в норме. В ряде волокон отмечаются участки сегментарного некроза ткани. При всех вариантах митохондриальной миопатии у детей выявляются также умеренные признаки повышения регенеративной активности мионов по интраволоконному типу. В мышцах повышено количество липидных включений в субсарколеммальных участках и небольшое количество липидных включений обнаружено вблизи отдельных митохондрий. Энергетическая недостаточность миона запускает процессы компенсаторного увеличения пула митохондрий и может стимулировать некоторые механизмы регенерации. Известно, что изменения митохондриальной активности являются важным фактором, контролирующим рост миобластов и регулирующим миогенез [Rochard et al., 1996]. Такая регенерация может иметь важнейшее значение при описываемых нами патогенетических процессах. В 1963 г. описали феномен RRF («ragged» red fibers «рванных» или «шероховатых» красных волокон) – мозаично разбросанных скелетно-мышечных волокон с увеличенным скоплением митохондрий под сарколеммой и между миофибриллами [Engel, Cunningham, 1963]. Предположения о репаративном характере изменений при образовании аномальных митохондрий (RRF) было высказано и в работе Heuss et al. (1995), изучавших распределение молекул адгезии нервных клеток (NCAM) в мышцах больных митохондриальными миопатиями. В работе было показано, что экспрессия NCAM может отражать компенсаторно-регенераторные тенденции аномальных скоплений митохондрий (RRF). Вероятно, NCAM играет роль в разрастании аномальных митохондрий и эти возрастания могут компенсировать биохимический дефект [Heuss et al., 1995]. 1.2.3 Изменение митохондрий при различной патологии клеток Митохондрии способны изменять форму, размер, местоположение и 33 численность внутри живой клетки. При различной патологии клеток митохондрии первыми подвергаются изменениям: происходит конденсация и их набухание, в матриксе появляются митохондриальные включения, что может указывать на функциональное напряжение и кислородное голодание клетки. Все это ведет к тяжелой деструкции митохондрий и гибели клетки [Струков, Серов, 1995]. Внутреннее пространство митохондрий уплотняется, происходит деформация крист и потеря митохондриальных гранул, гомогенизация матрикса, и появление в нем хлопьевидного материала, очагов обызвествления, происходят разрывы наружной мембраны митохондрий. Размеры митохондрий колеблются от гигантских митохондрий до резко редуцированных форм. Гигантские митохондрии образуются за счет слияния митохондрий и их гипертрофии и обнаруживаются только при патологии, также могут встречаться митохондрии различной формы: извитые, каплеобразные, сигарообразные. Число митохондрий в клетках крайне вариабельно. Увеличение числа митохондрий, наблюдается при гипертрофии, пролиферации и трансформации клеток, особенно после повреждения ткани, усиливается процесс окислительного фосфорилирования. Уменьшение числа митохондрий наблюдается при старении клеток, их атрофии [цит. по Струков, Серов, 1995]. В зависимости от функционального состояния ткани в митохондриях меняется форма крист: встречаются трубчатые, пластинчатые и треугольные [Fawcett, 1966; Munn, 1974]. При усилении активности митохондрий появляются пластинчатые кристы. Активные митохондрии имеют больше крист, обеспечивающих большую поверхность для распределения дыхательных комплексов. При понижении функциональной активности происходит деформация и агрегация крист. Форма числа крист так же отражает пониженную или повышенную активность митохондрий. Увеличение числа крист митохондрий свидетельствует о возрастающих функциональных потребностях клетки [Струков, Серов, 1995]. Например, у пациентов, страдающих синдромом Барта, появляются увеличенные митохондрии с полностью дезорганизованной внутренней мембраной [Bione et al., 1996]. Синдром Барта, относится к митохондриальным 34 заболеваниям, связан с мутацией гена Tafazzin (TAZ) [Bione et al., 1996], который участвует в биосинтезе митохондриальных фосфолипидов, таких как кардиолипин [Xu et al., 2006], что свидетельствует о решающем значении некоторых фосфолипидов для поддержания ультраструктуры митохондрий. Возрастные изменения функциональной активности митохондрий могут играть важнейшую роль в физиологии целостного организма [Cоhen, 2001]. При биологическом старении происходит снижение тканевого потребления кислорода и базальных уровней метаболизма (в частности уровня окислительного фосфорилирования). Заметно уменьшается поток электронов через I-III и II-III ферментные комплексы внутренней митохондриальной мембраны [Shoffner et al., 1991; Boffoli et al., 1996; Desai et al., 1996; Muller-Hocker et al., 1996]. С возрастом внутренняя мембрана утрачивает инвагинации, что связано с изменениями АТФ-синтазы, также с возрастом уменьшается количеством пор в мембране митохондрий, она становится более гладкой. Выше описанные нарушения структурной организации митохондрий приводят к снижению эффективности энергетических центров и к нарушению обмена веществ [Daum et al., 2013]. Кроме того, вероятно на накопление мутаций mtДНК с возрастом непосредственно влияет снижение физической активности [Brierley et al., 1996]. Митохондрии со слабой системой репарации могут представлять собой один из главных источников клеточной дисфункции. Свои предположения Tritschler и Medori (1993) подкрепляют наблюдениями, в соответствии с которыми продолжительность жизни коррелирует с ультраструктурными изменениями в митохондриях мышц, с нарушением митохондриального дыхания, с повышением дефицита цитохромоксидазы и с увеличением процента делеций в митохондриальном геноме. С возрастом значительно повышается чувствительность тканей к действию митохондриальных ингибиторов, что показано, например, в отношении некоторых отделов мозга [Bossi et al., 1993]. 35 1.3 ПОВЫШЕНИЕ ЧИСЛА И РАЗМЕРОВ МИТОХОНДРИЙ, КАК МЕХАНИЗМ ТКАНЕВОЙ АДАПТАЦИИ 1.3.1 Роль митохондрий в компенсации патологических процессов в скелетной мышечной ткани Большой интерес в исследованиях патогенетических механизмов миопатий привлекают энергетические клеточные органеллы - митохондрии. При морфологическом исследовании мышечных биоптатов пациентов с нервномышечными заболеваниями довольно часто имеются признаки митохондриальных нарушений в виде увеличения количества митохондрий в мионах и изменений их активности [Сухоруков, 1998]. Свидетельством универсальной роли митохондрий в патогенезе различных заболеваний мышц является исследование, проведенное Müller-Höcker J. с соавторами [Müller-Höcker, 1983]. На основании этого исследования гистохимическим методом было установлено нарушение сопряжения процесса окислительного фосфорилирования в 28% случаев. Наиболее резко эти нарушения были выявлены при митохондриальных миопатиях и при мышечной дистрофии Дюшенна. В меньшей степени их обнаруживали при нейрогенной атрофии. В 92% всех случаев с ослаблением «сопряжения» наблюдалось увеличение количества митохондрий. В 20% от всех случаев с повышенной митохондриальной пролиферацией, включающих 19 случаев с диффузной митохондриальной миопатией и трех случаев при прогрессирующей наружной офтальмоплегии не отмечалось активации фермента АТФ-азы. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что ослабление сопряжения окислительного фосфорилирования тесно, но не обязательно, связано с пролиферацией митохондрий. Оно наблюдается, как при митохондриальных миопатиях, так и при других заболеваниях мышц с различным патогенезом. Хорошо известно, что митохондриальная дисфункция может иметь место при врожденных мышечных дистрофиях и являться одним из определяющих признаков течения в различных звеньях патогенеза данного заболевания [Merlini, Bernardi, 2008]. Увеличение числа митохондрий может быть результатом 36 дискоординации окислительных процессов, развитием нарушений многих функций, в регуляции которых митохондрии играют существенную роль. В первую очередь речь идет о повышении уровня свободных радикалов, переизбытке митохондриальных белков теплового шока, окислительном стрессе, снижении защиты против кальция [Luft, 1994; Ibi et al., 1996]. Однако естественное предположение о том, что увеличение числа митохондрий необходимо для повышения энергетического потенциала ткани давно высказывается в разных работах. Визнер с соавторами [Wiesner et. al., 1999] подтвердили это предположение, экспериментально подсчитав с помощью электронного микроскопа количество митохондрий в кардиомиоцитах крысы при дефиците карнитина. Они выяснили, что при снижении энергообеспечения кардиомиоцитов плотность митохондрий повышается на 74%. Авторы заключили, что недостаток обеспечения энергией приводит к пролиферации митохондрий, как к компенсаторному механизму. На основании ряда специально проведенных исследований можно предположить, что митохондриальная пролиферация действительно является репарационным потенциалом этих органелл и играет важную роль в адаптационных процессах [Sukhorukov, 2008]. Увеличение числа митохондрий может оказывать компенсирующее действие на работу мышечной ткани. При морфологическом исследовании мышечных биоптатов пациентов, постоянно подверженных длительной гипоксии, наоборот, происходит уменьшение содержания митохондрий в мышечных волокнах и обнаруживается скопление липофусцина, что подтверждает полную деградацию митохондрий [Hoppeler et al., 2011]. При тканевой гипоксии происходит одновременное снижение дыхательного контроля и кальций-аккумулирующей способности митохондрий. Потеря митохондриями способности аккумулировать кальций приводит к тому, что попавший в клетку кальций ими не удаляется. Это, в свою очередь, приводит к активации целого комплекса кальций-зависимых ферментных систем, включая фосфолипазы, системы биосинтезов, протеинкиназы. Метаболизм в клетках вначале активируется, а затем дезорганизуется. Согласно 37 современным представлениям именно повреждение митохондрий оказывается переломным моментом, определяющим необратимость клеточных изменений при воздействии неблагоприятных факторов. Уменьшение числа этих органелл и/или их функциональная неполноценность могут оказаться главной причиной последующей гибели клетки. Так, пролиферация митохондрий является важным адаптационным механизмом при различной патологии мышечной ткани, включая врожденные миопатии. Увеличение числа митохондрий обеспечивает компенсаторную реакцию мышечной ткани в условиях функциональной недостаточности. 1.3.2 Роль изменения числа митохондрий на их функциональное состояние Митохондрии модифицируются являются в очень зависимости динамичными от органеллами, энергетических которые потребностей и метаболических условий [Bereiter – Hahn 1990; Karbowski, Youle, 2003; Mannella 2008; Benard et al., 2007; Soubannier, McBride, 2009]. Адаптационная перестройка в структуре этой системы достигается балансом между несколькими взаимосвязанными процессам: биогенезом и митофагией, слиянием и делением митохондрий, а также их движением внутри клетке, которое обеспечивается цитоскелетом. Процессы слияния и деления формируют важный механизм клеточной адаптации и во многом определяют судьбу клетки, поскольку между морфологией митохондрий и их функциональной состоятельностью существует тесная взаимосвязь [Karbowski, Youle, 2003; Bossy-Wetzel et al., 2003; Chan, 2006]. Митохондрии регулируют многие клеточные процессы: продукцию АТФ, реакцию окислительного стресса, регуляцию кальциевого потока, клеточное старение и апоптоз. В недавних работах было показано, что все эти процессы зависят от слияния и деления митохондрий [Chen, Chan, 2005; Parone et al., 2008; Soubannier, McBride, 2009; Picard et al., 2012]. Так, при повышении регуляции механизмов слияния митохондрий [Sugioka et al., 2004; Ong et al., 2010] и при 38 уменьшении их деления [Ong et al., 2010], происходит снижение апоптотических сигналов. Интересно, что блокировка деления митохондрий предотвращает выработку активных форм кислорода (АФК) в условиях гипергликемии [Yu et al., 2006]. И наоборот, чем больше митохондрий делятся, тем сильнее сигналы к апоптозу. Кроме того, если усилены процессы деления митохондрий, то в таких клетках происходит многочисленное образование активных форм кислорода [Karbowski, Yole, 2003]. Продемонстрировано, что митохондрии включены в несколько сигнальных внутриклеточных каскадов через белки (прежде всего ГТФазы, киназы и фосфатазы), обеспечивающие взаимную связь между митохондриальной сетью и остальной частью клетки. Благодаря этим белкам митохондриальная динамика и функция тесным образом вовлечены в регуляцию обмена веществ, контроль клеточного цикла, развитие, противовирусные ответы клеток и многие другие процессы [McBride et al., 2006]. Вот, почему нарушения в структуре митохондриального комплекса клетки часто ассоциированы с тяжелой патологией [Onq, Hausenloy, 2010; Jazbutyte, 2010; Merzetti, Staveley, 2013]. Хотя митохондриальная динамика лишь недавно стала темой исследований в области физиологии и патологии «зрелых» скелетных мышц, она вызывает особый интерес. характеризуются Высокоспециализированные большими энергетическими мышечные запросами и волокна уникальной многоядерной структурной организацией, которая ограничивает движение митохондрий и исключает митозы. Таким образом, понимание роли увеличения числа митохондрий и их динамики исключительно важно при изучении механизмов патогенеза мышечных заболеваний. 1.3.3 Митохондриальная динамика Митохондриальная динамика - относительно новая концепция. Чаще всего этим термином обозначают изменения в морфологии и локализации митохондрий, которые обеспечиваются двумя разнонаправленными процессами - слиянием и фрагментацией (или делением) этих органелл [Liesa et al., 2009]. 39 Феномен митохондриального деления был известен давно, и ему отводилась роль обеспечения дочерних клеток митохондриями после митоза, однако слияние митохондрий известно лишь в 1972 году [Kimberg, Loeb, 1972; Wakabayashi, Green, 1977]. В настоящее время динамика названных процессов признана наиболее значимой характеристикой не только делящихся, но и интерфазных клеток, включая высокодифференцированные клетки таких стационарных тканей, как нервная и поперечно-полосатые мышечные ткани. На сегодняшний день расшифрованы основные молекулярные механизмы и регуляторные пути, управляющие динамикой митохондрий и очевидна ее разносторонняя роль в митохондриальной и клеточной физиологии. Интерфазное деление органелл, как один из способов митохондриального биогенеза, обеспечивает растущие энергетические потребности клетки, например, в условиях стресса или при высокой функциональной нагрузке. Оно также контролирует качество митохондрий и мтДНК, поскольку фрагментация позволяет избирательно уничтожать путем аутофагии (митофагии) те органеллы, чьи нуклеоиды содержат мутации [Frazier et al., 2006; Benard, Karbowski, 2009], а также митохондрии с низким мембранным интенсивном потенциалом, делении [Twig, Hyde, количество 2008]. которых возрастает С другой стороны, при быстрая фрагментация может приводить к частичной потере мтДНК, дыхательным дефектам и увеличению уровня АФК, провоцируя развитие апоптоза [Suen et al., 2008]. Слияние митохондрий регулирует их количество и морфологию, а также является механизмом контроля над обновлением и качеством митохондриальной популяции в течение интерфазы путем «перемешивания» мтДНК, белков и других жизненно важных веществ этих органелл [Ono et al., 2001; Sato et al., 2006]. 40 1.3.3.1 Молекулярные механизмы митохондриальной динамики Молекулярные механизмы слияния и деления митохондрий, а также контролирующие их сигнальные пути, оказались довольно консервативны [Okamoto, Shaw, 2005; Kuznetsov, 2009]. В разных филогенетических группах, как и в разных клеточных типах, используются очень похожие сценарии, которые могут быть применимы и к скелетной мышечной ткани человека. Как слияние, так и разделение митохондрий контролируют белковые комплексы, связанные с митохондриальными мембранами. Главными среди них оказались ГТФ-азные белки семейства динаминов. Это Drp1, опосредующий деление, а также митофузины (Mfn1, Mfn2) и ОРА1, участвующие в слиянии митохондрий. Оба процесса являются многоступенчатыми и находятся под контролем множества дополнительных регуляторных факторов [Ishihara et al., 2004]. Мутации в генах, кодирующих эти белки, являются причиной различных наследуемых заболеваний, в том числе наследственных мышечных дистрофий [Liesa et al., 2009]. 1.3.3.2 Слияние митохондрий При объединении двух митохондрий происходит координированное слияние сначала наружных мембран, которое опосредуется митофузинами [Santel, Fuller, 2001; Legros, 2002], а затем при помощи ОРА1 сливаются внутренние мембраны [Alexander et al., 2000]. Их трансмембранные домены закрепляются либо в наружных (митофузины) либо во внутренних (ОРА1) митохондриальных мембранах. Внемембранные домены типа «coiled-coil» образуют гомоолигомерные (Mfn1 - Mfn1, Mfn2 - Mfn2 или OPA1 - OPA1) или гетероолигомерные (Mfn1 - Mfn2) связи, которые обеспечивают физическое сближение мембран двух соседних органелл. ГТФ-азные домены этих белков ответственны за гидролиз ГТФ. Это необходимо, чтобы завершить слияние сближенных мембран [Koshiba et al., 2004; Chan, 2006; Chen et al., 2003; Nakamura et al., 2006]. 41 Митофузины (Mfnl/2) – совместно работающие белки. В клетках, где мутантные формы Mfn2 лишены ГТФазной активности, митохондрии не могут пройти процесс слияния даже после сближения [Olichon et al., 2006]. Эти «белки слияния» являются многофункциональными и вовлечены также в регуляцию других важных митохондриальных функций. Так, в клетках, которые не экспрессируют Mfnl/2, нарушается не только морфология митохондрий, но и их подвижность [Nakamura et al., 2006; Eura et al., 2006]. Снижение уровня Mfn2 приводит к нарушению окислительного фосфорилирования [Orrenius et al., 2012]. Mfn2 также необходим для формирования контактов митохондрий с саркоплазматической сетью. Его избыток приводит к нарушению поступления кальция из ЭПС в митохондрии [Rizzuto et al, 2009], что особенно важно для мышечных волокон. Известно несколько митофузин-связывающих белков, в различной степени вовлеченных в контроль митохондриальной динамики, в том числе про-апоптотические белки Bax и Bak [Parone et al., 2006]. Митофузин связывающий белок (MIB), член суперсемейства дегидрогеназ/редуктаз средней цепи, находится преимущественно в цитозоле. Известно, что подавление MIB ведет к образованию продолговатой митохондриальной сети, показано, что MIB регулирует фрагментацию митохондрий [Eura et al., 2006]. Влияние ОРА1 на морфологию митохондриальной сети неоднозначно. Оно модифицируется в зависимости от его количества, ГТФазной активности и Сконцевой структуры этого белка [Chen et al., 2005]. ОРА1 существует в нескольких формах, определяющихся альтернативным сплайсингом кодирующей его мРНК. В результате протеолиза в митохондриях образуются разные по длине изоформы ОРА1. Короткие формы слабее прикреплены к внутренней мембране митохондрий, чем длинные, у которых сохраняется гидрофобный домен. Установлено, что различные варианты этого белка оказывают разное влияние на морфологию и мембранный потенциал митохондрий [Satoh et al., 2003]. Было также показано, что экспрессия определенных форм ОРА1 органоспецифична [Okamoto, Shaw, 2005]. 42 Кроме участия в митохондриальной динамике, ОРА1 вовлечен в поддержание структуры крист путем образования особых комплексов. При «нокауте» этого белка кристы становятся бесформенными, а между двумя мембранами появляется значительное пространство. Этот процесс сопровождается протеолизом интегральной мембраной протеазы Presenilinassociated rhomboid-like (PARL), расположенной во внутренней мембране митохондрий, выходом цитохрома С в цитоплазму и завершается клеточной гибелью [Frezza et al., 2006; Hoppins et al., 2011; Malka et al., 2005; Cipolat et al., 2006]. Предположительно, ОРА1 принимает также участие в синхронизации слияния внешних и внутренних мембран, поскольку установлено, что между митофузинами и OPA1 возможны молекулярные взаимодействия [Guillery et al., 2008]. Кроме того, известна одна из изоформ ОРА1, способная взаимодействовать и с внешней мембраной митохондрий [Satoh et al., 2003]. Однако механизм синхронизации остается пока неизвестным. 1.3.3.3 Деление митохондрий Ключевым белком деления митохондрий в клетках млекопитающих считается цитозольный белок Drp1 (dynamin-related protein 1) [Smirnova et al., 2001; Ingerman et al., 2005]. Из цитозоля он переносится на поверхность митохондрий с использованием цитоскелета и обнаруживается на линии будущей перетяжки [Varadi et al., 2004; De Vos et al., 2005]. Олигомеры Drp1 путем ГТФ зависимой самосборки формируют кольцо, которое при гидролизе ГТФ сжимается и моделирует перетяжку, после чего белок постепенно диссоциирует обратно в цитозоль [Ingerman et al., 2005; Schmid, Frolov, 2011; Yoon et al., 2001; Ferguson, De Camilli, 2012]. Поскольку Drp1 не имеет трансмембранного домена, то для его закрепления на поверхности митохондрий необходимы рецепторы. В составе наружной митохондриальной мембраны у млекопитающих обнаружено несколько Drp1связывающих белков. Наиболее изученными являются Mitochondrial fission factor 43 (Mff) и Mitochondrial fission 1 белок, который у человека получил название hFis1 (рис.6.). Рис.6. Модель митохондриального деления и слияния у млекопитающих [по Hom, Sheu, 2009]. Mff – главный кандидат на роль обязательного рецептора для Drp1. Его «нокаут» приводит к удлинению митохондрий [Gandre-Babbe, Van der Bliek, 2008] и уменьшает количество Drp1 на их поверхности [Dikov, Reichert, 2011]. Предположительно, Mff выполняет функции не только рецептора Drp1, но и служит адапторным белком, который инициирует олигомеризацию захваченного Drp1 в спиральные комплексы [Dikov, Reichert, 2011; Otera et al., 2010]. hFis1 имеет обращенный в цитозоль домен в виде пучка α – спиралей, обеспечивающих взаимодействие с Drp1 и способствующих его олигомеризации [Jofuku et al., 2005]. Роль hFis1 при делении митохондрий неоднозначна. Наряду с многочисленными работами о его участии в этом процессе, показано, что митохондриальная локализация Drp1 возможна и в отсутствие hFis1 [Yoon, et al., 2003; Lee, et. al., 2004]. Установлено также, что hFis1 распределен в митохондриальной мембране равномерно, поэтому остается неясным, как он участвует в локальном захвате Drp1. Выдвигаются предположения, что: либо перед связыванием с Drp1 рецептор должен быть активирован и эта активация идет избирательно, либо, по аналогии с дрожжами, связывание Drp1 и hFis1 осуществляют специальные адапторные белки, пока неизвестные для клеток позвоночных [Smirnova et al., 2001; Otera et al., 2010; Yoon, et al., 2003; Loson et al., 44 2013]. Можно предположить, что эти два рецептора связываются с Drp1 независимо друг от друга. И хотя Mff отводится ведущая роль [Otera et al., 2010], функциональная значимость этих двух рецепторов, по-видимому, может быть различна для разных видов клеток, а также зависеть от того, какие сигнальные пути были активированы в момент эксперимента. Обнаружены еще два белка наружной мембраны, участвующие в локализации Drp1 на митохондриях. Это Mitochondrial dynamics protein 49 (MiD49) и MiD51, известный также как mitochondrial elongation factor 1 (MIEF1). Рецепторный комплекс Mid49/51 выступает как конкурент Fis1 и Mff , который захватывает и инактивирует Drp1 [ Zhao et al., 2011; Loson et al., 2013]. Комплекс MiD49/51 может также взаимодействовать с Fis1. В этом случае Drp1связывающая функция комплекса ослабляется, способствуя делению митохондрий [Palmer et al., 2011]. Полагают, что активность этого комплекса зависит от физиологического состояния клетки и регулирует митохондриальную динамику [Dikov, Reichert, 2011; Loson et al., 2013]. На сегодняшний день, очевидно, что регуляция мембранной локализации Drp1 - сложный многовариантный механизм, который еще предстоит до конца расшифровать. Механизмы разделения внутренней митохондриальной мембраны также остаются пока неизвестными. Предполагаемые участники этого процесса - белок OPA1, участвующий в слиянии [Olichon et al., 2006], и митохондриальный белок человека MTP18 [Tondera et al., 2004; Tondera et al., 2005]. MTP18 - интегральный белок внутренней мембраны митохондрий, очевидно «заякоренный» также и в наружной мембране. Полагают, что он вовлечен в митохондриальное рекрутирование Drp1 [Tondera et al., 2004; Tondera et al., 2005]. 1.3.3.4 Саркоплазматическая сеть и митохондрии Хорошо известно, что Ca2+ является важнейшим посредником для передачи сигналов внутри клетки и регулирует множество клеточных реакций, включая и 45 скольжение миофиламентов при сокращении мышечных клеток. Основным кальциевым депо в поперечнополосатых мышечных тканях является гладкая эндоплазматическая (саркоплазматическая) сеть. Однако митохондрии также активно участвуют в процессе кальциевого гомеостаза, накапливая и выбрасывая ионы Ca2+, причем скорость их транспорта находится в зависимости от мембранного потенциала органелл и концентрации этих ионов в цитозоле [Gunter et al., 2004]. В сердечной мышце такая способность митохондрий имеет важное значение в регуляции уровня цитоплазматического кальция и, в частности, может определять степень постишемического повреждения миокарда [Холмухамедов, 2008]. В «зрелых» волокнах скелетных мышц (в отличие от кардиомиоцитов) участие митохондрий в изменении концентрации свободного цитозольного кальция незначительно. В расслабленных волокнах митохондриальный кальций составляет всего около 5% от общего содержания в клетке [Somlyo et al., 1986]. Причиной этого является низкое Са2+ сродство митохондриальных транспортеров кальция, которые остаются неактивны пока мышца не сокращается. Выброс в цитозоль ионов Са2+ из саркоплазматической сети во время мышечного сокращения стимулирует кальциевый поток внутрь органелл и приводит к быстрому их накоплению в матриксе. Повышение концентрации Са2+ в матриксе митохондрий, в свою очередь, активирует ключевые ферменты дыхательной цепи и приводит к увеличению продукции АТФ [Kunz, 2001; Territo et al., 2001]. Таким образом, основная физиологическая роль кальциевого митохондриального транспорта заключается в активации энергетического обмена. Следует также подчеркнуть, что Са2+-активация митохондриального синтеза АТФ строго скоординирована с Са2+-активацией мышечного сокращения. Описанный механизм предполагает, что поток кальция внутрь митохондрий обеспечен только в тех участках цитоплазмы, где колебания в уровне цитозольных ионов Са2+ максимальны. Установлено, что в кальциевый транспорт, главным образом, вовлекаются участки митохондрий, расположенные в непосредственной близости с Са2+ каналами саркоплазматической сети [Seppet et al., 2001; Hajnoczky 46 et al., 2001]. Оказалось также, что наружная митохондриальная мембрана и мембрана саркоплазматической сети формируют зоны контакта, получившие название MAM (mitochondria-associated ER membrane). Благодаря МАМ эти две органеллы не только совместно регулируют поток кальция, но и обмениваются липидами [Rieusset, 2011]. Такая функциональная связь должна иметь решающее значение для общей физиологии мышечного волокна. Наружная мембрана митохондрий составляет около 20% МАМ. В зоне контакта две органеллы сближаются до расстояния 10-25 нм и удерживаются несколькими белковыми комплексами, включая и гетерокомплексы митофузинов [Rizzuto, 2009; Rieusset, 2011]. Связи между митофузинами саркоплазматической сети и митофузинами наружной митохондриальной мембраны регулируют количество контактных точек. Таким образом, белки митохондриального слияния оказываются непосредственными участниками функционального кооперирования саркоплазматической и митохондриальной сетей. Недавно было также продемонстрировано участие саркоплазматической сети и в процессе митохондриального деления. Трубочки саркоплазматической сети опоясывают митохондрии и в некоторых случаях существенно их пережимают. Было выявлено, что в местах такого контакта обнаруживается белок Drp1. Таким образом, саркоплазматическая сеть участвует в определении места перетяжки материнской митохондрии [Friedman, 2011]. Интересно, что фосфорилированный Drp1 остается неактивным в цитозоле, но его активность может модулироваться кальцием через активацию кальцинейрина, который участвует в митохондриальной локализации Drp1 путем дефосфорилирования этого белка. Такой механизм может иметь особенное значение в скелетных мышечных волокнах, где кальций циклически поступает в цитозоль из полостей саркоплазматической сети [Cribbs et al., 2007; Cereghetti et al., 2008]. 47 1.3.3.5 Роль митохондриальной динамики в скелетной мышечной ткани. Скорость митохондриальной динамики и уровень белков слияния/деления Любое изменение морфологии митохондрий в скелетномышечной ткани, может нанести функциональный урон [Joubert et al., 2008; Piquereau et al., 2012]. Именно поэтому встает вопрос о роли митохондриальной динамики в скелетной мышечной ткани. К сожалению, количество работ по исследованию митохондриальной динамики в «зрелых» мышечных волокнах человека очень невелико, и нам не удалось найти информации об интенсивности этого процесса в скелетных мышцах. Показано, что митохондриальные движения в сердечных клетках резко ограничены [Beraud et al., 2009; Hom, Sheu, 2009], a цикл слияния / деления длиться у «взрослых» кардиомиоцитов в течение 14-16 дней [Chen et al., 2011]. Замедленная митохондриальная динамика предполагает и низкий уровень белков слияния/деления, однако этот показатель в мышцах оказывается неожиданно высоким [Piquereau et al., 2013]. Более того, его снижение существенно сказывается на состоянии митохондрий. Эксперименты на мышах с генетически обусловленным дефицитом различных белков, участвующих в митохондриальной динамике, демонстрируют очевидные изменения в морфологии мышечных митохондрий и серьезные негативные последствия для миокарда в условиях стресса [Piquereau et al., 2012; Papanicolaou et al., 2011]. Интересно, что эффект дефицита Mfn2 и OPA1 на кардиомиоциты приводит к формированию парадоксально крупных сердечных митохондрий [Piquereau et al., 2012; Papanicolaou et al., 2011]. Авторы полагают, что архитектурная организация мышечных клеток может влиять на способ действия этих белков. Эти факты позволяют предположить, что белки слияния/деления помимо митохондриальной динамики участвуют также в регуляции других процессов, важных для клеток поперчено-полосатых мышечных тканей. Например, Mfn2 обнаруживается в мембране саркоплазматической сети и, таким образом 48 обеспечивает ее физическую связь с митохондриями [De Brito, Scorrano, 2008; Dorn, Maack, 2013]. OPA1 участвует в прикреплении мтДНК к внутренней мембране митохондрий и содействует репликации и распределению мтДНК [Elachouri et al., 2011], а также может поддерживать структуру крист [Frezza et al., 2006]. Связь с развитием миопатий и мышечных дистрофий различной степени тяжести определяет особый интерес к структурной реорганизации мышечной митохондриальной сети. Глубокое понимание энергетических процессов клетки, несомненно, требует биоэнергетики и комплексного митохондриальной подхода, биохимии сочетающего с анализом исследование морфологии митохондрий. Спектр известных нам белков и сигнальных путей, вовлеченных в процессы митохондриального слияния и деления, стремительно растет, а в результате расширяется круг нерешенных в этой области проблем. Тем не менее, очевидно, что митохондриальная динамика - это одна из фундаментальных адаптационных систем клетки. Ее нарушения ассоциированы с «тяжелой» патологией и процессами старения, а белки митохондриальной динамики рассматриваются как перспективная фармакологическая мишень [Piquereau et al., 2013]. В настоящее время известен ряд регуляторных белков, контролирующих динамику митохондрий. Наиболее изученными среди них являются ц-АМФ стимулирующие протеинкиназы, Е3-убиквитинлигаза и фактор деления митохондрий – Mitochondrial Fission Factor (MFF) [Chang, Blackstone 2007; Cribbs, Strack 2007; Benard, Karbowski, 2009]. Ведущими механизмами активации белков митохондриальной динамики являются фосфорилирование [Chang, Blackstone, 2007] и убиквитинирование этих белковых молекул [Karbowski et al., 2007; Nakamura et al., 2006; Yonashiro et al., 2006; Park et al., 2010]. При изучении патологии, ассоциированной с дисбалансом митохондриальной динамики, выявляется все больше факторов, вовлеченных в контроль численности и морфологии митохондрий. Примерами могут служить белок саксин, киназа LRRK2, мутантная форма белка хантингтина, белок TRAP1 (tumor necrosis factor 49 receptor-associated protein 1), [Cechetto, Gupta, 2000], белки Bnip3, участвующие в процессах апоптоза и аутофагии, [Landes et al., 2010] и другие. Таким образом, количество и морфология митохондрий, определяемые балансом между процессами деления и слияния этих органелл, представляют собой динамичные необходимым параметры, функциональным позволяющие нагрузкам. клетке адаптироваться Контроль к митохондриальной динамики осуществляется сложной многоуровневой системой, включающей различные внутриклеточные сигнальные пути, регулирующие также и другие клеточные функции. На сегодняшний день все выше упомянутое очень далеко от полного понимания механизмов этого контроля. Нарушения митохондрий скелетных мышечных волокон негативно сказываются на энергетическом обмене мышц. Эти нарушения выявляются не только при митохондриальных миопатиях, но и при других заболеваниях мышц, в том числе при врожденных структурных миопатиях, врожденных и прогрессирующих мышечных дистрофиях. Изучение этих процессов представляет не только теоретический интерес, но и может помочь в разработке неспецифических терапевтических подходов при различных заболеваниях мышц. В заключение можно констатировать, что рассматриваемая нами проблема, несомненно, актуальна на современном этапе развития клинической миологии, когда еще отсутствуют специфические генетические методы лечения подавляющего большинства наследственных нервно-мышечных заболеваний. Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материал для исследования. Группы обследованных пациентов Работа основана на комплексном морфологическом изучении биоптатов четырехглавой мышцы бедра больных, находившихся на лечении в отделениях психоневрологии, а также врожденных и наследственных заболеваний Научноисследовательского клинического института педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России. В работе было обследовано 39 пациентов, из них: 21 пациент в возрасте от 4 до 27 лет, средний возраст составил 13,7±1,1 с 50 диагнозом врожденная миопатия «центрального стержня» и 18 пациентов в возрасте от 4 месяцев до 16 лет, средний возраст составил 9,9±0,75 с диагнозом митохондриальная миопатия. Биопсии у здоровых людей не проводились, в связи с относительной серьезной инвазивностью хирургической процедуры взятия биопсии. Исследование было ограничено сравнением показателей, полученных при биопсии скелетных мышц у детей с различными заболеваниями: врожденной миопатией «центрального стержня» и митохондриальной миопатией. Клиническими критериями отбора пациентов служили: данные анамнеза, клинического осмотра лабораторных исследований (исследования сахарной кривой, концентраций пирувата и лактата в сыворотке крови, уровня креатинина, общего и ионизированного кальция в периферической крови и тд.). Окончательным определяющим фактором для включения больного в группу исследования служили результаты патоморфологического анализа биоптата скелетной четырехглавой мышцы бедра, выданные научно-исследовательской лабораторией общей патологии научно-исследовательского клинического института педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России. Ограниченное количество обследованных больных объясняется тем, что эти наследственные болезни относятся к категории орфанных заболеваний. Так, частота встречаемости болезни центрального стержня варьирует по разным данным от 3 до 6 на 100000 человек. Частота митохондриальных болезней еще мало изучена. 2.2 Методы исследования В соответствии с поставленными задачами в работе были использованы биохимические и морфологические методы исследования. 51 2.2.1 Биохимические исследования Биохимические исследования были проведены в Научно-исследовательском клиническом институте педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России. Из результатов проведенных биохимических исследований были проанализированы следующие пировиноградной кислот (Ммоль/л), показатели: уровень концентрация молочной креатинина и (Ммоль/л), лактатдегидрогеназы (ЛДГ Ед/л) и концентрация общего кальция (Ммоль/л) в крови. Биохимический анализ крови был проведен натощак. В качестве нормы показателей крови использовали данные, представленные в руководстве для врачей Н.Д. Ющука, Ю.Я. Венгерова (2009), полученные в клинико- диагностической лаборатории (зав. лаборатории Акапова Т.В.) НИКИ педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова. Биохимические параметры крови исследовали на автоматическом анализаторе «Финпипет» (Финляндия). Определение уровня молочной и пировиноградной кислот в крови проводили с помощью энзиматического метода Rollinghoff (1967) натощак и после стандартной нагрузки глюкозой (из расчета 1,75 г/кг массы тела, но не более 50 г) на 60 и 180 минутах. Принцип определения молочной кислоты основан на ее дегидрировании лактатдегидрогеназой (ЛДГ) в присутствии никотинамиддинуклеотида восстановленного (НАД). По количеству никотинамиддинуклеотида образовавшегося (НАДН), определенного спектрофотометрически, судили о содержании молочной кислоты, т.к. реакция проходит стехиометрически – 1 моль НАД на 1 моль молочной кислоты дает 1 моль НАДН. Принцип определения пировиноградной кислоты основан на ее восстановлении под влиянием лактатдегидрогеназы (ЛДГ) до молочной кислоты. При этом на восстановление 1 моль пирувата расходуется 1 моль НАДН и по изменению оптической плотности реакционной смеси при длине волны 340 нм можно судить об убыли НАДН, и, следовательно, о концентрации пировиноградной кислоты. 52 Определение креатина в крови осуществлялось энзиматическим методом. Энзиматический метод количественного определения креатинина состоит из серии сопряженных ферментативных реакций, включая превращение креатинина в креатин под действием фермента креатинкиназы, превращение креатина в саркозин под действием креатининамидиногидролазы (креатиназы) и последующие окисление саркозина под действием саркозиноксидазы (СОД) с образованием перекиси водорода. В присутствии пероксидазы (ПОД) перекись водорода образует окрашенное соединение, что делает возможным ее количественное определение при длине волны 550 нм4. Содержащийся в пробе эндогенный креатин удаляется под действием креатиназы и саркозиноксидазы в процессе предварительной инкубации. 2.2.2 Морфологические исследования Морфологические исследования биоптатов четырехглавой мышцы бедра были проведены с помощью следующих методов: 1) Гистоферментохимического выявления активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) по Нахласу и др; 2) Электронно-микроскопического исследования; 3) Морфометрического анализа. Таблица 1. Норма биохимических показателей [Ющук, Венгеров,2009]. Показатели Норма Лактатдегидрогеназа (ЛДГ), Е/л 225-450 Кальций общий, ммоль/л 2,02-2,6 Креатинин, ммоль/л 35-100 Молочная кислота (лактат), ммоль/л 1,0-1,7 Пировиноградная кислота (пируват), 0,05-0,09 ммоль/л 53 2.2.2.1 Гистоферментохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) по Нахласу и др. Для морфологического подтверждения диагноза миопатии «центрального стержня» и митохондриальной миопатии гистоферментохимически выявляли активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) по Нахласу и др. (1957). СДГ основной энергетический фермент, катализирует окисление янтарной кислоты, позволяет с высокой степенью достоверности судить о функциональной активности всего митохондриального аппарата. Локализуется на внутренней мембране митохондрий. Материал погружали в среду для заливки в жидкий азот фирмы Sigma и затем в жидкий азот, где производилось их замораживание. Далее замороженный материал помещали в криостат, где осуществляли приготовление криостатных срезов толщиной 12 мкм. Приготовление основного раствора сукцината осуществлялось следующим образом: смешивались равные объемы 0,2М фосфатного буфера (рН = 7,6) и 0,2М сукцината натрия. Затем добавляли 10 мл основного раствора сукцината к 10 мл водного раствора нитросинего тетразолия (1мг/мл). Инкубация срезов проводилась при температуре 37°С в полученной смеси в течении 20 минут. Далее осуществлялась промывка физраствором (0,9% NaCl). После этого осуществлялась фиксация в 10% формалине в течение 10 минут. А затем промывали в 15% спирте и помещали в глицерин-желатин [Пирс, 1962]. Анализ и фотосъемка светомикроскопических препаратов производились на световом микроскопе Nikon eclipse 80i. Оценка выраженности изменений гистофизиологической активности проводилась по балльной системе [Сухоруков, 1998]. 2.2.2.2 Электронно-микроскопическое исследование Для электронно-микроскопического исследования мышц проводили префиксацию ткани, взятой всегда в строго определенном месте (четырехглавая 54 мышца бедра) размером не более 1мм3 в 2.5%-ном растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (рH=7.4) при 0°С. После отмывки ткани фосфатным буфером (рH=7.4) проводили фиксацию 1%-ным раствором четырехокиси осмия в течение часа при 2-4°С. Затем ткань обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50, 70, 96 и 100%). Заливку ткани производили в эпоновую смолу после трехкратной обработки ацетоном по методике Лафта [Luft, 1961]. Срезы получали на ультратоме фирмы REICHERT Nr. 321850/E и контрастировали цитратом свинца по методике Рейнольдса [Reynolds, 1963]. Исследование проводили на трансмиссионном электронном микроскопе JEOL JEM-100B. Степень тяжести заболевания у больных детей оценивалась клиницистами Научно-исследовательского клинического института педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России при помощи различных тестов мышечной активности. 2.2.2.3 Морфометрический анализ Для каждого пациента было изготовлено 5 блоков. С каждого блока были приготовлены ультратонкие срезы. Для ультраструктурного анализа были отсняты митохондрии, располагающиеся под сарколеммой и между миофибриллами мышечных волокон при разных увеличениях от х 6000 до х 50000. Морфометрический анализ проводился путем подсчета митохондрий, разделенных на две популяции в зависимости от их места расположения в мышечном волокне: под сарколеммой (субсарколеммальная популяция митохондрий) и между миофибриллами (межмиофибриллярная популяция митохондрий) с помощью компьютерной программы для микрофотометрии «Image J.» при увеличении х 10000. С каждого блока проанализировано не менее 20 полей зрения. 55 Определяли относительное количество митохондрий их размерные характеристики, такие как площадь, периметр, максимальный и минимальный диаметры Фере; показатели формы – фактор «эллипс», «округлость»; среднюю электронно-оптическую плотность и удельный объём митохондрий. Определяли среднюю площадь триад, саркоплазматических цистерн и Т-трубочек. Параллельно определяли удельный объём миофибрилл. В процессе работы нами был предложен показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна», равный отношению удельного объёма митохондрий к удельному объёму миофибрилл. Для сравнительной оценки качества RRF мы применяли следующую 4-х балльную систему: 1 балл - только умеренное субсарколеммальное скопление метки; 2балла - умеренные межмиофибриллярные и умеренные субсарколеммальные скопления метки 3 балла - умеренные межмиофибриллярные и грубые субсарколеммальные скопления метки 4 балла - грубые межмиофибриллярные и грубые субсарколеммальные скопления метки. 2.2.3 Статистическая обработка данных Определяли средние значения и стандартные ошибки среднего для абсолютных показателей. Абсолютные показатели при условии нормального распределения сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок, при распределении, отличном от нормального, использовали тест Манна-Уитни. Результаты наблюдений представлены в виде среднего значения ± ошибки среднего значения (M ± m), где М – выборочное среднее, m – стандартная ошибка среднего. Для определения нормальности распределения изучаемых признаков также был рассчитан коэффициент Шапиро-Уилка [Реброва, О.Ю., 2003]. Поскольку распределение большинства признаков оказалось отличным от нормального, то, 56 для статистической обработки были применены непараметрические методы [Платонов, 2000]. Для выявления взаимосвязей между изучаемыми признаками и продолжительностью воздействия возмущающих факторов был проведен ранговый корреляционный анализ Спирмена. Вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (R) – непараметрический аналог коэффициента корреляции Пирсона, рекомендуемый для интервальных и порядковых переменных, не подчиняющихся нормальному распределению [Платонов, 2000]. Различия считались статистически значимыми при p<0,05. Статистическая обработка данных выполнена с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ "STATISTICA 6.0". 57 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1 ГИСТОФЕРМЕНТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ПАЦИЕНТОВ 3.1.1 Гистоферментохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы у больных врожденной миопатией центрального стержня Была проведена митохондриального дегидрогеназы. гистоферментохимическая фермента При этом скелетной оценка мышечной наблюдалась ткани значительная активности – сукцинат- гетерогенность распределения метки по центральным и периферическим участкам скелетных мышечных волокон. При болезни центрального стержня активность сукцинатдегидрогеназы была выявлена в периферических участках мышечных волокон, тогда как в центральных участках наблюдалось значительное снижение активности или отсутствие этого фермента (Рис.7). Это может указывать на то, что периферические участки энзиматически активны в отличие от центральных участков мышечных волокон. 3.1.2 Гистоферментохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы у больных митохондриальной миопатией Анализ полученных препаратов показал, что при гистоферментохимической оценке активности сукцинатдегидрогеназы у 16 из 18 пациентов, обнаруживались участки мышечных волокон с повышенной активностью фермента (феномен RRF), главным образом в периферических участках, а у некоторых больных и в центральных участках мышечных волокон (рис.8). 58 Рис.7. Скелетная мышечная ткань пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 21 год. Гистохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы по Нахласу и др. Ув. х100. Стрелкой показаны «стержневые» зоны с полным отсутствием ферментативной активности в центральных участках мышечных волокон. 10 мкм Рис.8. Скелетная мышечная ткань пациента с митохондриальной миопатией. Возраст 5 лет. Гистохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы по Нахласу и др. Стрелками показана активность фермента в мышечных волокнах. 59 3.2 ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ПАЦИЕНТОВ 3.2.1 Электронно-микроскопическое исследование скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатией центрального стержня Для более глубокого и детального анализа использовали метод электронномикроскопического анализа скелетной мышечной ткани в различных участках мышечных волокон. Проведенный анализ позволил выявить значительные ультраструктурные изменения волокон поперечнополосатой скелетной мышечной ткани, затрагивающие все её компоненты: миофибриллы, саркомеры, митохондрии, саркотубулярные комплексы, Т-трубочки, саркоплазматические цистерны (триады). При ультраструктурном анализе скелетной мышечной ткани у больных врожденной миопатией центрального стержня в центральных участках мышечных волокон были выявлены атрофические изменения пучков миофиламентов, очаги дезориентации и их расщепление (рис.9, рис.10). Такие деструктивные участки, как правило, сопровождались вакуолизацией и деструкцией митохондрий (рис.11), а также деструкцией т-трубочек, саркоплазматических цистерн (триад) (Рис.12, рис.13). У некоторых миофиламентов с пациентов расширением была обнаружена центральных грубая пространств дезориентация между ними, заполненных мелкогранулярным материалом на фоне вакуолизации и деструкции митохондрий (рис.14). В центральных участках со слабо выраженными вышеописанными ультраструктурными изменениями или с полным их отсутствием, были выявлены митохондрии с электронно-плотным матриксом без межмитохондриальных контактов (рис.14). 60 Рис.9. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 14 лет. Ув. х 15000. Стрелкой показан участок расщепление пучков миофиламентов. Рис.10. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 21 лет. Ув. х 10000. Участок дезориентации миофиламентов после расщепления их пучков. 61 3 1 2 3 Рис.11. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 6 лет. Ув. х 10000. 1-участок расщепленных пучков миофиламентов; 2- участок дезориентации миофиламентов после расщепления их пучков; 3 – вакуолизация и деструкция митохондрий. Рис.12.Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 8 лет. Ув. х 15000 Стрелками показаны триады с признаками деструкции. 62 Рис. 13. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 18 год. Ув. х 15000. Стрелками обозначены дезорганизованные триады. Рис.14. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 10 лет. Ув. х 8000. Стрелкой показано расширенное цитозольное пространство, детритом. заполненное 63 Рис.15. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 12 лет. Ув. х 15000. Стрелкой показаны электронно-плотные митохондрии. В периферических (субсарколеммальных) участках часто, хотя и не всегда, выявлялись многочисленные скопления митохондрий с электронно-плотным матриксом (рис.15), в отличие от центральных (межмиофибриллярных) участков мышечных волокон (рис.16). При этом признаков изменения миофиламентов и других ультраструктур в субсарколеммальных участках не обнаружено (рис.17). Небольшой сдвиг компонентов периферических саркомеров в соседних пучках относительно друг друга может быть связан с сокращением мышц. Могут встречаться гипертрофированные митохондрии. 64 Рис.15. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 10 лет. Ув. х 6000. Участок скопления митохондрий с электронно-плотным сарколеммой мышечного волокна. матриксом под Рис.16. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 15 лет. Ув. х 8000. Центральный участок мышечного волокна без многочисленного скопления митохондрий. 65 Рис.17. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 10 лет. Ув. х 6000. Стрелкой показано скопление митохондрий с электронно-плотным матриксом под сарколеммой мышечного волокна. 3.2.2 Электронно-микроскопическое исследование скелетной мышечной ткани больных митохондриальной миопатией При митохондриальной миопатии в отличие от миопатии центрального стержня ультраструктурные изменения затрагивают главным образом митохондрии. Так под сарколеммой мышечных волокон были выявлены участки с многочисленным скоплением митохондрий с электронно-плотным матриксом (рис.18), участки с массовым набуханием митохондрий с признаками деструкции крист (рис.19), липидные включения и гликоген (рис.20). Между миофибриллами были обнаружены крупные, удлиненные митохондрии (рис.21), группы митохондрий с частым расположением в виде цепочек или других своеобразных комплексов (рис.22), гипертрофированные митохондрии с деструкцией наружной мембраны и плотности матрикса, также встречаются многочисленные липидные включения и вторичные лизосомы (рис.23, рис.24). 66 Рис.18. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с митохондриальной миопатией. Возраст 10 лет. Ув. х 10000. Стрелкой показано скопление митохондрий с электронно-плотным матриксом под сарколеммой мышечного волокна. Рис.19.Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента митохондриальной миопатией. Возраст 9 лет. Ув. х 15000. Стрелкой показаны набухшие митохондрии с признаками деструкции крист. с 67 1 Рис.20. Электронограмма скелетной мышечной ткани митохондриальной миопатией. Возраст 10 лет. Ув. х 10000. 1 – липидные включения. пациента с Матрикс большинства межмиофибриллярных митохондрий просветлен и увеличен в объёме, видны электронно-прозрачные зоны, лишенные крист, межмембранное пространство сжато. Такую ультраструктуру митохондрий связывают с нарушениями сопряжения процессов окисления и фосфолирования (рис.25, рис.26). Также под сарколеммой мышечных волокон могут в небольшом количестве встречаться увеличенные митохондрии с электронно-прозрачным матриксом, лишенным крист (рис.27). Отметим, что у некоторых пациентов в центральных участках мышечных волокон были выявлены незначительные разрастания соединительной ткани. В таких участках на фоне истончения и атрофии миофибрилл, обнаружены измельченные митохондрии с нечеткими контурами, участками лизиса крист (рис.28). 68 Рис.21. Электронограмма скелетной мышечной ткани митохондриальной миопатией. Возраст 13 лет. Ув. х 50000. Обнаружена крупная удлиненная митохондрия. пациента с Рис.22. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента митохондриальной миопатией. Возраст 14 лет. Ув. х 10000. Наблюдаются группы митохондрий с расположением в виде цепочек. с 69 Рис.23. Электронограмма скелетной мышечной ткани митохондриальной миопатией. Возраст 17 лет. Ув. х 20000. Стрелкой показана вакуолизация и деструкция митохондрий. пациента с Рис.24. Электронограмма скелетной мышечной ткани митохондриальной миопатией. Возраст 9 лет. Ув. х 10000. пациента с Стрелкой показаны липидные включения. 70 Рис.25. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с митохондриальной миопатией. Возраст 7 лет. Ув. х 40000. Межмиофибриллярная митохондрия с электронно-прозрачными зонами матрикса, лишенными крист. Рис.26. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с митохондриальной миопатией. Возраст 6 лет. Ув. х 20000. Стрелкой показана межмиофибриллярная митохондрия с электронно-прозрачным участком матрикса, лишенным крист. 71 Рис.27. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с митохондриальной миопатией. Возраст 6 лет. Ув. х 20000. Стрелкой показаны субсарколеммальные митохондрии с электронно-прозрачными зонами, лишенными крист. Рис.28. Электронограмма скелетной мышечной митохондриальной миопатией. Возраст 9 лет. Ув. х 10000 Стрелкой показано разрастание соединительной ткани. ткани пациента с В центральных участках мышечных волокон были так же, как и при миопатии центрального стержня выявлены атрофические изменения пучков миофиламентов, очаги дезориентации и их расщепление (рис.29). 72 Рис.29. Электронограмма скелетной мышечной ткани митохондриальной миопатией. Возраст 14 лет. Ув. х 10000. Участок атрофии и расщепление пучков миофиламентов. пациента с 3.3 МОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МИТОХОНДРИЙ В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ПАЦИЕНТОВ 3.3.1 Морфометрические характеристики митохондрий в различных участках мышечного волокна при врожденной миопатии центрального стержня В нашей работе была проведена комплексная морфометрическая оценка электронно-микроскопических изображений поперечнополосатых мышечных волокон у 21 больного с врожденной миопатией центрального стержня (рис.30). Полностью полученные результаты приведены в приложении (приложение, табл.1). Анализ полученных параметров показал, что митохондрии представляют собой относительно округлые структуры (среднее значение округлости 73 митохондрий 0,8 ± 0,008 в относительных единицах), со средней площадью 0,13 ± 0,009 мкм2, периметром 1,37 ± 0,05 мкм, средним максимальным диаметром Фере 0,5 ± 0,02 мкм и минимальным диаметром Фере 0,29±0,01 (приложение, табл.1). Рис.30. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 7 лет. Ув. х.6000. Введенный нами показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна», представляющий собой соотношение удельного объема митохондрий к удельному объему миофибрилл, составил в среднем 0,187 ± 0,03. Количество и размер митохондрий различались в зависимости от их локализации в мышечном волокне (рис.31). Относительное количество митохондрий в субсарколеммальных участках, более, чем в двое превышало соответствующее значение межмиофибриллярных участков мышечного волокна (рис.32; приложение, табл.1). По размерам межмиофибриллярные митохондрии были достоверно меньше, чем субсарколеммальные (рис.31, рис.33, рис.34, рис.35, рис.36; приложение, табл.1). В связи с этим имеется существенное различие в значениях удельного объёма митохондрий (рис.37; приложение, табл.1). Было выявлено, что показатель удельного объёма миофибрилл, также различался в зависимости от участка мышечного волокна. Так, в субсарколеммальном участке среднее значение удельного объёма миофибрилл составило 49,39 ± 5,40 %, а в 74 межмиофибриллярном участке 93,32 ± 0,64 %. 1 2 Рис.31. Электронограмма скелетной мышечной ткани пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 12 лет. Ув. х 8000. 1-Межмиофибриллярные митохондрии; 2 – субсарколеммальные митохондрии. Так как, под сарколеммой мышечных волокон локализуется больше по количеству и объёму митохондрий, чем между миофибриллами, то очевидно, что и энергетическая мощность в этих участках будет больше, чем в центральных участках мышечных волокон. Среднее значение показателя «энергетической обеспеченности мышечного волокна» в субсарколеммальном участке 0,34± 0,05, а в межмиофибриллярном 0,04 ± 0,02 (рис.38; приложение, табл.1). При этом форма органелл существенно не отличается друг от друга в разных участках мышечного волокна (рис.39; приложение, табл.1). Также не выявлено различий в средней электронно-оптической плотности субсарколеммальных и межмиофибриллярных митохондрий (рис.40; приложение, табл.1), что может свидетельствовать о вероятном сходстве их функциональных состояний. 75 мкм2 Рис.32. Среднее относительное количество митохондрий на единицу площади в различных участках мышечного волокна поперечнополосатой мышцы больных врожденной миопатией центрального стержня. Суб/меж митохондрии - относительное количество митохондрий на площади 14764, 19 мкм2 скелетной мышечной ткани. Рис.33. Среднее значение площади митохондрий в скелетной мышечной ткни больных врожденной миопатией центрального стержня, по оси ординат – среднее значение площади митохондрий в мкм2. 76 мкм мкм Рис.34. Среднее значение периметра митохондрий в скелетной мышечной ткани обследованных больных врожденной миопатией центрального стержня, по оси ординат – среднее значение периметра митохондрий в мкм. Рис.35. Средний максимальный диаметр Фере митохондрий в скелетной мышечной ткани обследованных больных врожденной миопатией центрального стержня, по оси ординат – среднее значение максимального диаметра Фере митохондрий в мкм. 77 мкм Рис.36. Среднее значение минимального диаметра Фере митохондрий в скелетной мышечной ткани обследованных больных врожденной миопатией центрального стержня, по оси ординат – среднее значение минимальный диаметра Фере митохондрий в мкм. % Рис.37. Среднее значение удельного объёма митохондрий в скелетной мышечной ткани обследованных больных врожденной миопатией центрального стержня, по оси ординат – удельный объём митохондрий в процентах (%). 78 Рис.38. Показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна» у обследованных больных врожденной миопатией центрального стержня. Рис.39. Значение Фактор «круг» (приближенность митохондрий к округлой форме) в скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатии центрального стержня, по оси ординат - степень приближенности значения радиуса к 1.0. 79 От.ед. Рис.40. Среднее значение электронно-оптической плотности митохондрий в скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатией центрального стержня, по оси ординат – относительная электронно-оптическая плотности митохондрий (в относительных единицах). 3.3.2 Соотношение между морфометрическими показателями митохондрий при врожденной миопатии центрального стержня Относительное количество митохондрий, как в субсарколеммальной, так и в межмиофибриллярной популяции митохондрий отрицательно коррелирует с размерами этих органелл: - с площадью митохондрий в субсарколеммальной (R=-0,43; достоверность p<0,05), а в межмиофибриллярной популяции митохондрий (R=-0,46; достоверность p<0,05); - с периметром митохондрий в субсарколеммальной и в межмиофибриллярной популяции митохондрий (R=-0,40 и R=-0,51; достоверность p<0,05, соответственно); - с максимальным диаметром Фере митохондрий в субсарколеммальной и в межмиофибриллярной популяции митохондрий (R=-0,48, R=-0,54; достоверность p<0,05, соответственно). Таким образом, при уменьшении размеров митохондрий происходит 80 увеличение их числа (приложение, график 1). Мы предполагаем, что это происходит вследствие пролиферации митохондрий. Удельный объём митохондрий положительно коррелирует с размерами этих органелл в обеих популяциях митохондрий: - с площадью митохондрий (R=0,61; достоверность p<0,05 и R=0,51; достоверность p<0,05 в субсарколеммальной и межмиофибриллярной популяциях митохондрий, соответственно); - с периметром митохондрий (в субсарколеммальной популяции R=0,60; достоверность p<0,05, а в межмиофибриллярной популяции R=0,46; достоверность p<0,05); - с максимальным диаметром Фере митохондрий (в субсарколеммальной и межмиофибриллярной популяциях R=0,63 и R=0,42; достоверность p<0,05). Так, чем больше удельный объём митохондрии, тем они больше по размеру. При анализе формы митохондрий также были обнаружены достоверные корреляционные связи с размерами этих органелл, причем выраженность этих корреляций была однотипна в обеих популяциях митохондрий. Фактор «эллипс» (приближенность к эллипсоидной форме) митохондрий резко положительно коррелирует с размерами этих органелл: - с площадью митохондрий в субсарколеммальной и межмиофибриллярной популяциях (R=0,98; достоверность p<0,05 и R=0,95; достоверность p<0,05 митохондрий, соответственно) (приложение, график 2); - с периметром митохондрий (в обеих популяциях коэффициент корреляции составил R=0,97; достоверность p<0,05); - с максимальным диаметром Фере митохондрий (в субсарколеммальной и в межмиофибриллярной популяциях R=0,98 и R=0,97; достоверность p<0,05, соответственно). Таким образом, чем крупнее митохондрии, тем они более вытянутой формы. Удельный объём митохондрий при болезни центрального стержня, также коррелирует с формой органелл: чем больше их удельный объём, тем чаще митохондрии принимают форму, приближенную к эллипсу. Так, фактор «эллипс» 81 митохондрий положительно коррелирует с удельным объёмом митохондрий в субсарколеммальной популяции митохондрий (R=0,66; достоверность p<0,05, приложение, рис.2), а в межмиофибриллярной популяции митохондрий (R=0,48; достоверность p<0,05). Обнаружена «энергетической положительная обеспеченностью корреляция мышечного между волокна» показателем и размерными характеристиками межмиофибриллярных митохондрий (с площадью R=0,55; достоверность p<0,05, с периметром R=0,49; достоверность p<0,05; с максимальным диаметром Фере R=0,55; достоверность p<0,05). То, что вытянутые митохондрии были более крупными, объясняет и положительная корреляция между «энергетической обеспеченностью мышечного волокна» и фактором «эллипс» (R=0,51; достоверность p<0,05). Были выявлены корреляционные связи между количественными характеристиками митохондрий и площадью цистерн саркоплазматической сети. В субсарколеммальных участках площадь цистерн саркоплазматической сети положительно коррелирует с относительным количеством митохондрий (R=0,71; достоверность p<0,05), но не зависит от формы этих органелл. Оказалось, что в межмиофибриллярных участках площадь цистерн саркоплазматической сети коррелирует не только с относительным количеством митохондрий (R=0,57; достоверность p<0,05), но и с их формой (с фактором «круг» R=-0,57; достоверность p<0,05). 3.3.3 Соотношение морфометрических показателей с функциональными показателями при врожденной миопатии центрального стержня Из данных корреляционного анализа, известно, что относительное количество межмиофибриллярных митохондрий отрицательно коррелирует с концентрацией лактата (до нагрузки R=-0,77; достоверность p<0,05, спустя час после нагрузки R=-0,60; достоверность p<0,05 и спустя три часа после нагрузки R=-0,69; достоверность p<0,05) (приложение, граф.3). Однако между удельным объёмом митохондрий и уровнем лактата в крови 82 установлены корреляционные связи противоположной направленности для обеих популяций митохондрий. В межмиофибриллярной популяции удельный объём митохондрий умеренно отрицательно коррелирует с показателем лактата спустя час и три часа после нагрузки глюкозой (R=-0,66, R=-0,60; достоверность p<0,05, соответственно) (приложение, граф.3). В субсарколеммальной популяции митохондрий удельный объём митохондрий положительно коррелирует с показателем лактата в крови до нагрузки глюкозой (R=0,70; достоверность p<0,05), но через час после нагрузки между этими показателями была уже установлена отрицательная корреляция (R=-0,66; достоверность p<0,05). Была выявлена корреляционная взаимосвязь между относительным количеством митохондрий и концентрацией пирувата в периферической крови. В межмиофибриллярной популяции митохондрии была выявлена положительная корреляция (коэффициент корреляции по двум точкам: до нагрузки R=0,60; достоверность p<0,05, через час после нагрузки R=0,47; достоверность p<0,05). В субсарколеммальной популяции митохондрий была выявлена положительная корреляция (коэффициент корреляции по двум точкам: до нагрузки R=0,60; достоверность p<0,05, через час после нагрузки R=0,57; достоверность p<0,05). В межмиофибриллярной популяции митохондрий определена выраженная отрицательная корреляция между относительным числом митохондрий и коэффициентом «лактат/пируват» (коэффициент корреляции по трём точкам: до нагрузки R=-0,88; достоверность p<0,05, через час после нагрузки R=-0,60; достоверность p<0,05 и спустя три часа после нагрузки R=-0,65; достоверность p<0,05). В субсарколеммальной популяции митохондрий выявлена положительная корреляция между относительным количеством митохондрий и коэффициентом «лактат/пируват» (коэффициент корреляции до нагрузки R=0,64; достоверность p<0,05 и через три часа после нагрузки R=0,94; достоверность p<0,05). В субсарколеммальной популяции митохондрий выявлена достоверная положительная корреляция между относительным количеством митохондрий и уровнем креатинина в крови (R=0,82; достоверность p<0,05), а в межмиофибриллярной популяции митохондрий корреляционных взаимосвязей 83 между этими переменными выявлено не было. Следует также отметить, что удельный объём митохондрий коррелирует с уровнем креатинина в крови. Интересным оказывается тот факт, что в двух рассматриваемых нами популяциях митохондрий выявляются противоположные корреляции между этими параметрами. Была обнаружена достоверная отрицательная корреляция в межмиофибриллярной популяции митохондрий (R=0,56; достоверность p<0,05), а в субсарколеммальной популяции была выявлена достоверная положительная корреляция между этими переменными (R=0,46; достоверность p<0,05). Удельный объём митохондрий связан с содержанием общего и ионизированного кальция положительной корреляцией в субсарколеммальной популяции (R=0,40; и R=0,40; достоверность p<0,05, соответственно), а в межмиофибриллярной популяции достоверной положительной корреляцией (R=0,72; и R=0,55, достоверность p<0,05, соответственно). Наиболее значимым представляется отрицательная корреляция между относительным количеством, удельным объёмом, размерами, эллипсоидностью субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести заболевания пациентов (R=-0,80; R=-0,76; R=-0,72; R=-0,86, достоверность p<0,05, соответственно) (приложение, рис.5). Однако в межмиофибриллярной популяции митохондрий корреляционных взаимосвязей не выявлено. Интересным оказался тот факт, что фактор «эллипс» митохондрий положительно достоверно коррелирует с уровнем лактата в периферической крови у больных центральным стержнем в субсарколеммальной популяции митохондрий до нагрузки глюкозой (R=0,90; достоверность p<0,05), а через три часа после нагрузки (R=0,46; достоверность p<0,05). Также в субсарколеммальной популяции митохондрий была выявлена положительная корреляция между фактором «эллипс» митохондрий и коэффициентом «лактат/пируват» через три часа после нагрузки глюкозой (R=0,42; достоверность p<0,05) и между фактором «круг» митохондрий и коэффициентом «лактат/пируват» до нагрузки (R=0,60; достоверность p<0,05) и 84 через час после нагрузки (R=0,82; достоверность p<0,05). Фактор «эллипс» митохондрий положительно коррелирует с уровнем креатинина в крови больных врожденной миопатией центрального стержня в субсарколеммальной популяции митохондрий (R=0,50; достоверность p<0,05). Также выявлена достоверная положительная корреляция между фактором «эллипс» субсарколеммальных митохондрий и концентрацией общего кальция в крови (R=0,42; достоверность p<0,05) и уровнем лактатдегидрогеназы (R=0,53; достоверность p<0,05). Однако, фактор «круг» межмиофибриллярных митохондрий положительно коррелирует с концентрацией общего кальция в крови (R=0,71; достоверность p<0,05). Наиболее значимым представляется, выявленная отрицательная корреляция между фактором «эллипс» субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести заболевания (R=-0,86; достоверность p<0,05). Показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна» достоверно положительно коррелирует с коэффициентом «лактат/пируват» до нагрузки в субсарколеммальной популяции (R=0,48; достоверность p<0,05), но через час после нагрузки эта корреляция становится отрицательной (R=-0,41; достоверность p<0,05), а через три часа снова положительная корреляция (R=0,40; достоверность p<0,05). В межмиофибриллярной популяции митохондрий выявлена достоверная отрицательная корреляция между этими переменными до нагрузки (R=-0,48; достоверность p<0,05), а через три часа после нагрузки (R=0,71; достоверность p<0,05). Между показателем «энергетической обеспеченности мышечного волокна» и уровнем креатинина в крови выявлены достоверные противоположные корреляции в двух рассматриваемых популяциях митохондрий. В субсарколеммальной популяции была выявлена положительная корреляция (R=0,63; достоверность p<0,05) (приложение, рис.6), а в межмиофибриллярной популяции обнаружена отрицательная корреляция (R=-0,56; достоверность p<0,05). 85 Показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна» связан с концентрацией общего кальция в крови умеренной положительной корреляцией в субсарколеммальной популяции (R=0,42; достоверность p<0,05), а в межмиофибриллярной популяции выявлена положительная корреляция между этими переменными (R=0,64; достоверность p<0,05). Важно отметить, что показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна» отрицательно коррелирует со степенью тяжести заболевания в субсарколеммальной популяции митохондрий (R= -0,43; достоверность p<0,05) (приложение, рис.6). Показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна» в субсарколеммальных участках отрицательно коррелирует с объёмом миофибрилл (R= -0,71; достоверность p<0,05). Таким образом, чем больше энергетическая мощность мышечного волокна, тем меньше удельный объём миофибрилл. Следовательно, энергетическая мощность мышечного волокна больше зависит от объёма митохондрий, а не от объёма миофибрилл в этом участке. Об этом свидетельствует выявленная положительная корреляция между этим показателем и удельным объёмом митохондрий (R=0,53; достоверность p<0,05), которая указывает на то, что энергетическая мощность мышечного волокна лучше всего охарактеризована удельным объёмом митохондрий. Размеры митохондрий в субсарколеммальной популяции митохондрий достоверно положительно коррелируют с уровнем лактата в периферической крови. Такие показатели, как площадь, периметр и максимальный диаметр Фере митохондрий положительно коррелируют с уровнем лактата в периферической крови до нагрузки (R=1,0, R=0,90, R=0,90; достоверность p<0,05, соответственно). Однако среднее значение площади, периметра и максимального диаметра Фере митохондрий отрицательно коррелируют с уровнем лактата через час после нагрузки глюкозой (R=-0,93, R= -0,86, R=-0,77; достоверность p<0,05) и через три часа после нагрузки глюкозой (R=0,30, R=0,46, R=0,46; достоверность p<0,05, соответственно). В межмиофибриллярной популяции коэффициент корреляции между площадью, периметром митохондрий и уровнем лактата до нагрузки 86 составил (R=0,60, R=0,47; достоверность p<0,05). Оказалось, что площадь, периметр митохондрий отрицательно коррелируют с уровнем лактата в периферической крови через час после нагрузки (R=-0,50, R=-0,42; достоверность p<0,05) и через три часа после нагрузки (R=-0,46, R=-0,50; достоверность p<0,05). В субсарколеммальной популяции митохондрий были выявлены положительные корреляции между размерами митохондрий (площадь, периметр и максимальным диаметром Фере митохондрий) и уровнем пирувата в крови до нагрузки (R=0,85, R=0,90, R=0,90; достоверность p<0,05, соответственно), через три часа после нагрузки между площадью митохондрий и уровнем пирувата в крови (R=0,89; достоверность p<0,05), а также между периметром, максимальным диаметром Фере и уровнем пирувата в крови (R=0,67, R=0,67; достоверность p<0,05, соответственно). В межмиофибриллярной популяции была выявлена отрицательная корреляция между площадью, периметром митохондрий и уровнем пирувата в крови до нагрузки (R=-0,42, R=-0,30; достоверность p<0,05), через час после нагрузки (R=-0,43, R=-0,37; достоверность p<0,05), но уже через три часа была выявлена положительная корреляция между этими переменными (R=0,51; достоверность p<0,05). Размеры митохондрий достоверно коррелируют с содержанием уровня креатинина в крови: - с площадью митохондрий в субсарколеммальной популяции (R=0,41; достоверность p<0,05), а в межмиофибриллярной популяции (R=-0,44; достоверность p<0,05); - с периметром митохондрий в субсарколеммальной популяции (R=0,39; достоверность p<0,05), а в межмиофибриллярной популяции (R=-0,59; достоверность p<0,05). Площадь митохондрий положительно коррелирует с содержанием уровня кальция в периферической крови пациентов. Эта связь характерна для всех митохондрий, однако, в несколько большей степени выражена в субсарколеммальной популяции (коэффициент корреляции площади митохондрий с уровнем общего кальция составил R=0,56; достоверность p<0,05, а с уровнем 87 ионизированного кальция R=0,45; достоверность p<0,05). В межмио- фибриллярной популяции (коэффициент корреляции площади митохондрий с уровнем общего кальция в крови R=0,46; достоверность p<0,05, а с уровнем ионизированного кальция в крови R=0,41; достоверность p<0,05). Отметим, что в субсарколеммальной популяции митохондрий степень тяжести заболевания выражено отрицательно коррелирует с размерами митохондрий (площадью, периметром и максимальным диаметром Фере R=-0,72, R=-0,86, R=-0,86; достоверность p<0,05, соответственно). Также важно отметить, что в межмиофибриллярной популяции митохондрий между размерами органелл и степенью тяжести заболевания достоверных корреляций не установлено. 3.3.4 Морфометрические характеристики митохондрий в различных участках мышечного волокна при митохондриальной миопатии Была проведена комплексная морфометрическая оценка электронномикроскопических изображений поперечнополосатых мышечных волокон у 18 пациентов с диагнозом митохондриальная миопатия. Полностью полученные результаты приведены в приложении (приложение, табл.1). В результате морфометрического анализа было выявлено, что митохондрии представляют собой относительно округлые структуры (среднее значение округлости митохондрий 0,78 ± 0,008 в относительных единицах). Были установлены размерные параметры митохондрий в скелетной мышечной ткани больных митохондриальной миопатией: средняя площадь 0,1 ± 0,008 мкм 2, средний периметр 1,30 ± 0,05 мкм, средний максимальный диаметр Фере 0,49 ± 0,018 мкм и средний минимальный диметр Фере 0,29 ±0,09 мкм (приложение, табл.1). Введенный нами показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна» составил в среднем 0,27 ± 0,122. Следует отметить, что количество и размер митохондрий различались в зависимости от их локализации в центральных (межмиофибриллярных) или в периферических (субсарколеммальных) участках мышечных волокон (рис.41). 88 Количество органелл под сарколеммой, более, чем втрое превышало соответствующее значение между миофибриллами (рис.41; приложение, табл 1.). Размерные характеристики межмиофибриллярных митохондрий меньше, чем субсарколеммальных (рис.42, рис.43, рис.44, рис.45; приложение, табл.1). Соответственно в субсарколеммальном участке удельный объём митохондрий (рис.46) и среднее значение удельного объёма миофибрилл в межмиофибриллярных участках составило 81,94 ± 5,96 %, а в субсарколеммальном 38+75 ± 6+65%. Следовательно, показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна» значительно больше, чем в межмиофибрилляном (рис.47; приложение, табл.1). При этом форма органелл существенно не отличается друг от друга в разных зонах мышечного волокна (рис.48; приложение, табл.1). Также не выявлено различий в средней оптической плотности субсарколеммальных и межмиофибриллярных митохондрий (рис.49; приложение, табл.1). 0,76 0,50 0,27 Рис.41. Среднее относительное количество митохондрий на единицу площади в различных участках мышечного волокна поперечнополосатой мышцы больных митохондриальной миопатией. Суб/меж митохондрии - относительное количество митохондрий на площади 8626, 994 мкм2 скелетной мышечной ткани. 89 мкм2 Рис.42. Среднее значение площади митохондрий в скелетной мышечной ткани мкм обследованных больных митохондриальной миопатией, по оси ординат – среднее значение площади митохондрий в мкм2. Рис.43. Среднее значение периметра митохондрий в скелетной мышечной ткани обследованных больных митохондриальной миопатией, по оси ординат – среднее значение периметра митохондрий в мкм. 90 мкм мкм Рис.44. Средний значение максимального диаметра Фере митохондрий в скелетной мышечной ткани обследованных больных митохондриальной миопатией, по оси ординат – среднее значение максимального диаметра Фере митохондрий в мкм. Рис.45. Среднее значение минимального диаметра Фере митохондрий в скелетной мышечной ткани обследованных больных митохондриальной миопатией, по оси ординат – среднее значение минимального диаметра Фере митохондрий в мкм. 91 % Рис.46. Среднее значение удельного объёма митохондрий в скелетной мышечной ткани обследованных больных митохондриальной миопатией, по оси ординат – удельный объём митохондрий в процентах (%). Рис.47. Показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна» у обследованных больных митохондриальной миопатией. 92 Отн.ед. Рис.48. Значение Фактор «круг» митохондрий в скелетной мышечной ткани больных митохондриальной миопатией, по оси ординат - степень приближенности значения радиуса к 1.0. Рис.49. Среднее значение оптической плотности митохондрий в скелетной мышечной ткани больных митохондриальной миопатией, по оси ординат – относительная плотности митохондрий (в относительных единицах). 93 3.3.5 Соотношение между морфометрическими показателями митохондрий при митохондриальной миопатии При митохондриальной миопатии между показателями удельного объёма митохондрий и «энергетической обеспеченности мышечного волокна» достоверных корреляционных связей не выявлено. В субсарколеммальных участках выявлена отрицательная корреляция между показателем «энергетической обеспеченности мышечного волокна» и удельным объёмом миофибрилл (R= -0,62; достоверность p<0,05), а в межмиофибриллярных (R= -0,82; достоверность p<0,05). Удельный объём митохондрий резко положительно коррелирует с относительным количеством митохондрий в межмиофибриллярной популяции митохондрий (R=0,91; достоверность p<0,05). Также удельный объём митохондрий положительно коррелирует с размерами этих органелл в обеих популяциях митохондрий: - с площадью митохондрий (в субсарколеммальной популяции R=0,45; достоверность p<0,05, а в межмиофибриллярной R=0,52; достоверность p<0,05); - с периметром митохондрий (в субсарколеммальной популяции R=0,48; достоверность p<0,05, а в межмиофибриллярной R=0,62; достоверность p<0,05); - с максимальным диаметром Фере митохондрий (в субсарколеммальной популяции и в межмиофибриллярной популяциях R=0,45, R=0,63; достоверность p<0,05). - с минимальным диаметром Фере митохондрий (в межмиофибриллярной популяции R=0,47; достоверность p<0,05). Ранговый корреляционный анализ показал, что при митохондриальной миопатии между относительным количеством митохондрий и их размерами достоверных корреляционных взаимосвязей не выявлено. Кроме того в межмиофибриллярном участке показатель относительной электронной плотности митохондрий отрицательно коррелирует: - с относительным количеством митохондрий (R=-0,52; достоверность 94 p<0,05), - с их размерами (площадью R=-0,45; достоверность p<0,05, периметром R=-0,49; достоверность p<0,05 и максимальным диаметром Фере R=-0,50; достоверность p<0,05), - с удельным объёмом митохондрий (R=-0,53; достоверность p<0,05). Фактор «круг» достоверно положительно коррелирует с относительной электронной плотностью митохондрий межмиофибриллярной популяциях R=0,82, (в субсарколеммальной и в R=0,92; достоверность p<0,05, соответственно). Размеры митохондрий во всех участках мышечного волокна связаны с формой этих органелл: чем крупнее митохондрии, тем в большей степени они соответствуют эллипсу. Степень вытянутости митохондрий соотносится с размерными характеристиками органелл. Для межмиофибриллярного участка мышечного волокна степень положительной корреляции оказалась выше (R=0,93; достоверность p<0,05 для площади, R=0,97; достоверность p<0,05 для периметра и для максимального, и минимального диаметра Фере R=0,99, R=0,90; достоверность p<0,05), чем в субсарколеммальном участке (для площади R=0,55; достоверность p<0,05, для периметра R=0,80; достоверность p<0,05, а для максимального и минимального диаметра Фере R=0,98, R=0,89; достоверность p<0,05). Как следствие для межмиофибриллярной популяции митохондрий с фактором «эллипс» положительно коррелирует и удельный объём митохондрий (R=0,60; достоверность p<0,05), и показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна» (R=0,62; достоверность p<0,05). Поскольку в межмиофибриллярном участке площадь распределена, в основном, между тремя компонентами - митохондриями, миофибриллами и триадами, то очевидно, что должна быть положительная корреляция между показателем «энергетической обеспеченности мышечного волокна» и размерными характеристиками органелл (с площадью R=0,67; достоверность 95 p<0,05, с периметром R=0,69; достоверность p<0,05, с максимальным и минимальным диаметром Фере R=0,65, R=0,63; достоверность p<0,05). 3.3.6 Соотношение морфометрических показателей с функциональными показателями при митохондриальной миопатии При анализе субсарколеммальной популяции митохондрий была установлена достоверная отрицательная корреляция между относительным количеством митохондрий и уровнем лактата в периферической крови до нагрузки (R=-0,40; достоверность p<0,05), через час после нагрузки (R=-0,50; достоверность p<0,05), а через три часа после нагрузки (R=-0,55; достоверность p<0,05). Корреляционных взаимосвязей между относительным количеством митохондрий и концентрациями пирувата в периферической крови не обнаружено. Выявлена выраженная количеством и положительная удельным объёмом корреляция между субсарколеммальных относительным митохондрий с концентрацией креатинина в крови больных митохондриальной миопатией (R=0,67, R=0,64; достоверность p<0,05, соответственно). Эти же показатели в центре мышечного волокна с концентрацией креатинина достоверно не коррелируют. Концентрация ЛДГ в крови отрицательно корреллирует с удельным объёмом субсарколеммальных митохондрий (R=-0,61; достоверность p<0,05). Не выявлено достоверных корреляционных связей между относительным количеством, удельным объёмом митохондрий и степенью тяжести заболевания в исследованных участках мышечного волокна. Под сарколеммой мышечных волокон выявлены достоверные отрицательные корреляции между площадью, периметром, максимальным диаметром Фере, минимальным диаметром Фере митохондрий и уровнем пирувата в периферической крови: до нагрузки митохондрий (R=-0,43, R=-0,50, R=-0,62, R=-0,52; достоверность p<0,05, соответственно), спустя час после 96 нагрузки (R=-0,53, R=-0,69, R=-0,77, R=-0,60; достоверность p<0,05), а спустя три часа после нагрузки (R=0,87, R=0,52, R=0,62, R=0,72; достоверность p<0,05 соответственно). Однако между миофибриллами мышечного волокна корреляционных взаимосвязей не обнаружено. Была выявлена положительная корреляции между площадью, периметром митохондрий и коэффициентом «лактат/пируват» до нагрузки глюкозой (в субсарколеммальной популяции R=0,52, R=0,50; достоверность p<0,05, а в межмиофибрилярной популяции R=0,46; R=0,51; достоверность p<0,05, соответственно), через час после нагрузки глюкозы в субсарколеммальной популяции (R=0,40, R=0,40; достоверность p<0,05, соответственно), а через три часа после нагрузки только в субсарколеммальной популяции была установлена отрицательная корреляция (R=-0,53, R=-0,47; достоверность p<0,05, соответственно). Размер митохондрий также достоверно коррелирует с показателем ЛДГ (коэффициент корреляции ЛДГ с периметром в субсарколеммальной зоне равен R=-0,66, достоверность p<0,05 с площадью R=-0,57, достоверность p<0,05 с диаметром Фере митохондрий R=-0,61, достоверность p<0,05). В межмиофибриллярной популяции митохондрий корреляционной связи между этими переменными не выявлено. Между показателем «энергетической обеспеченности мышечного волокна» субсарколеммальных участков и уровнем креатинина в крови установлена положительная корреляция (R=0,68; достоверность p<0,05). Следует отметить, что в межмиофибриллярных участках корреляции между данными показателями не установлено. 97 3.4 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ МОРФОМЕТРИЧЕКСИХ ПАРАМЕТРОВ ИЗМЕНЕНИЯ МИТОХОНДРИЙ В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ У БОЛЬНЫХ ВРОЖДЕННОЙ МИОПАТИЕЙ ЦЕНТРАЛЬНОГО СТЕРЖНЯ И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ МИОПАТИЕЙ 3.4.1 Сравнение морфометрических показателей митохондрий у больных врожденной миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией Сравнительный морфометрический анализ двух групп обследованных больных с врожденной миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией показал, что в обеих группах митохондрии представлены относительно округлыми структурами с одинаковыми средними показателями размера: средней площадью (0,1±0,008(0,009) мкм2) и максимальным диаметром Фере (0,5 ±0,018(0,02) мкм (рис.50, рис.51,рис.52, рис.53). Рис.50. Электроннограмма: субсарколеммальные митохондрии в скелетной мышечной ткани у больных миопатией центрального стержня. Возраст 13 лет. Увл. Х 50000. 98 Отн.ед. мкм2 Рис.51. Сравнение параметров среднего значения фактора «круг» митохондрий в скелетной мышечной ткани у пациентов с миопатией центрального стержня и с митохондриальной миопатией (в относительных единицах). ц/ст – больные врожденной миопатией центрального стержня, мх/миоп – больные митохондриальной миопатией. Рис.52. Средняя площадь митохондрий в скелетной мышечной ткани больных миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией (мкм2). ц/ст – больные врожденной миопатией центрального стержня; мх/миоп – больные митохондриальной миопатией. 99 мкм Рис.53. Средний максимальный диаметр Фере митохондрий в скелетной мышечной ткани больных миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией (мкм). ц/ст –врожденной миопатией центрального стержня, мх/миоп –митохондриальной миопатией. Были выявлены отличия в показателях «энергетической обеспеченности мышечного волокна». При врожденной миопатии центрального стержня этот показатель составил 0,187±0,03, а при митохондриальной миопатии составил 0,27±0,122 (рис.54). Рис.54. Сравнение среднего значения показателя «энергетической обеспеченности мышечного волокна» больных миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией. ц/ст– больные врожденной миопатией центрального стержня, мх/миоп – больные митохондриальной миопатией. 100 В обеих обследованных группах размеры межмиофибриллярных митохондрий, оказались меньше, чем субсарколеммальных. При центральном стержне средняя площадь митохондрий составила в субсарколеммальной популяции 0,15±0,02 мкм2, а в межмиофибриллярной популяции 0,11±0,009 мкм2. При митохондриальной миопатии в субсарколеммальной популяции средняя площадь составила 0,12±0,015 мкм2, а в межмиофибриллярной популяции 0,09±0,007 мкм2. На рисунке 55 приведены показатели дельта (∆) - разницы между значениями переменных средних площадей субсарколеммальных и межмиофибриллярных митохондрий, что демонстрирует более выраженный размерный полиморфизм митохондрий у больных центральным стержнем. 3.4.2 Сравнительный анализ выявленных корреляционных взаимосвязей между морфометрическими показателями митохондрий у больных врожденной миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией При сравнении данных анализа ранговой корреляции в обеих группах больных (врожденной миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией) были выявлены общие взаимосвязи между морфометрическими параметрами митохондрий при наследственно обусловленных состояниях скелетной мышечной ткани. Так, размерные характеристики митохондрий независимо от зоны мышечного волокна достоверно коррелируют с формой этих органелл, как при врожденной миопатии центрального стрежня, так и при митохондриальной миопатии: чем крупнее митохондрии, тем в большей степени они вытянутые. В соответствии с этим, в межмиофибриллярных участках мышечных волокон (поскольку в них только три компонента) прослеживается положительная корреляция между удельным объёмом митохондрий и степенью эллипсоидности, однако при митохондриальной миопатии корреляция выше (R=0,60, достоверность p<0,05), чем при врожденной миопатии центрального стержня (R=0,48, 101 мкм2 достоверность p<0,05). 0,03 Рис.55. Дельта разница средней площади (∆S) митохондрий между значениями переменных субсарколеммальных и межмиофибриллярных митохондрий у больных врожденной миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией (мкм2). Дельта разница средней площади (∆S) при центральном стержне составила 0,04 мкм2, а при митохондриальной миопатии (∆S) составила 0,03 мкм2. ц/ст – больные врожденной миопатией центрального стержня, мх/миоп – больные митохондриальной миопатией. Из такой взаимосвязи логично вытекает и сходная для этих заболеваний корреляция между формой органелл и показателем «энергетической обеспеченности мышечного волокна»: чем больше митохондрий эллипсоидной формы, тем выше энергетическая обеспеченность мышечного волокна. Были обнаружены отличия в корреляционных взаимосвязях между показателями относительного количества митохондрий и их размерами. Так при врожденной миопатии центрального стержня имелись достоверные отрицательные корреляции между количеством митохондрий и их размерами в различных участках мышечного волокна. Однако у больных митохондриальной миопатией достоверных корреляционных связей между этими параметрами не выявлено. Т.е в скелетной мышечной ткани больных центральным стержнем 102 увеличения числа митохондрий происходит вследствии их пролиферации. 3.4.3 Сравнительный анализ выявленных корреляционных взаимосвязей между морфометрическими и функциональными показателями митохондрий у больных врожденной миопатией центрального стержня и у больных митохондриальной миопатией При сравнении корреляционных взаимосвязей между показателями относительного количества митохондрий и уровнем лактата в периферической крови были выявлены существенные отличия в двух группах больных. Во-первых, имелись отличия в направленности корреляционных взаимосвязей данных параметров, прежде всего это касается митохондрий, располагающихся под сарколеммой мышечного волокна. Так, при митохондриальной миопатией была выявлена отрицательная корреляция (коэффициент корреляции между относительным количеством митохондрий и лактатом в периферической крови составил до нагрузки R=-0,40; достоверность p<0,05, через час после нагрузки глюкозой R=-0,50; достоверность p<0,05, спустя три часа после нагрузки R=-0,55; достоверность p<0,05). Кроме того, у больных миопатией центрального стержня данная корреляция обнаружена в межмиофибриллярных митохондриях (коэффициент корреляции до нагрузки глюкозой R=-0,77; достоверность p<0,05 и спустя час, и три часа после нагрузки глюкозой, составляли соответственно R=0,60, R=-0,69; достоверность p<0,05). При этом установлена корреляционная связь между относительным количеством митохондрий и концентрацией пирувата в периферической крови у больных врожденной миопатией центрального стержня в обоих участках мышечных волокон, а у больных митохондриальной миопатией такой корреляционной связи не выявлено. В корреляционных взаимосвязях межу относительным количеством митохондрий и коэффициентом «лактат/пируват» при указанных заболеваниях были обнаружены существенные отличия. Так, относительное количество 103 субсарколеммальных митохондрий у больных миопатией центрального стержня положительно коррелирует с коэффициентом «лактат/пируват» до нагрузки R=0,64; достоверность p<0,05, через три часа после нагрузки глюкозой R=0,94; достоверность p<0,05. Также у пациентов с врожденной миопатией центрального стержня, были количеством выявлены отрицательные межмиофибриллярных корреляционные митохондрий и связи между коэффициентом «лактат/пируват» до нагрузки R=-0,88, достоверность p<0,05, через час после нагрузки R=-0,60 достоверность p<0,05 и спустя три часа после нагрузки R=-0,65 достоверность p<0,05. Тогда как у пациентов с диагнозом митохондриальная миопатия таких корреляционных связей не выявлено. При ранговом корреляционном анализе резких отличий в корреляции между относительным количеством субсарколеммальных митохондрий и уровнем креатинина в указанных заболеваниях не выявлено. Для данной корреляционной пары была установлена характерная положительная корреляция, как у пациентов с диагнозом центральный стержень, так и у пациентов с митохондариальной миопатией (R=0,82; достоверность p<0,05, R=0,60; достоверность p<0,05, соответственно). При статистическом анализе у больных митохондриальной миопатией наблюдалась отрицательная корреляция между концентрацией ЛДГ в крови и удельным объемом субсарколеммальных митохондрий (R=-0,61, достоверность p<0,05). Однако, корреляционных при связей врожденной между миопатии удельным центрального объёмом стержня субсарколеммальных митохондрий и показателем активности ЛДГ в крови не выявлено. При врожденной миопатии центрального стержня относительное количество и удельный объём межмиофибриллярных митохондрий положительно коррелирют с уровнем ЛДГ в крови (R=0,60, достоверность p<0,05; и R=0,56, достоверность p<0,05, соответственно). Были выявлены существенные отличия в корреляционных взаимосвязях между относительным количеством митохондрий и степенью тяжести заболевания при указанных формах миопатий. Так, корреляционная взаимосвязь между этими 104 параметрами наблюдалась только при врожденной миопатии центрального стержня. При этом имелась резко отрицательная корреляция между количеством субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести заболевания (R=-0,86; достоверность p<0,05). Однако в межмиофибриллярных митохондриях такой корреляции выявлено не было. При врожденной миопатии центрального стержня были обнаружены положительные корреляционные взаимосвязи между относительным количеством митохондрий и площадью триады (в субсарколеммальной популяции митохондрий R=0,67, достоверность p<0,05; в межмиофибриллярной популяции R=0,57, достоверность p<0,05). Однако при митохондриальной миопатии были выявлены отрицательные корреляционные взаимосвязи между этими параметрами, причем, только в межмиофибриллярной популяции (R=-048, достоверность p<0,05). Размеры субсарколеммальных митохондрий положительно коррелируют с уровнем лактата в периферической крови до нагрузки глюкозой в обеих группах больных с названными выше заболеваниями. Кроме того наблюдались существенные отличия в корреляциях между размерами митохондрий и уровнем лактата в периферической крови после часа и трех часов нагрузки. При врожденной миопатией центрального стержня размерные характеристики субсарколеммальных митохондрий (площадь, периметр и максимальным диаметр Фере) отрицательно коррелируют с уровнем лактата через час после нагрузки (R=0,93, R= -0,86, R=-0,77; достоверность p<0,05) и положительно коррелируют через три часа после нагрузки (R=0,30, R=0,46, R=0,46; достоверность p<0,05, соответственно), а в межмиофибриллярной популяции была выявлена отрицательная корреляция, как через час, так и через три часа после нагрузки. В группе больных митохондриальной миопатией достоверных корреляций между размерными характеристиками митохондрий и уровнем лактата не выявлено. Обращает на себя внимание положительная корреляция между размерами субсарколеммальных митохондрий (площадь, периметр) и уровнем пирувата в крови у больных врожденной миопатией центрального стержня (R=0,85, R=0,90; 105 достоверность p<0,05, соответственно), а в межмиофибриллярной популяции была выявлена слабая отрицательная корреляция между этими переменными (R=0,40, R=-0,30; достоверность p<0,05). В тоже время при митохондриальной миопатии была выявлена отрицательная корреляция между размерами субсарколеммальных митохондрий и уровнем пирувата в крови, а между межмиофибриллярными митохондриями и уровнем пирувата в крови достоверной корреляции не установлено. При врожденной миопатии центрального стержня размеры субсарколеммальных митохондрий положительно коррелируют с содержанием креатинина крови, а в межмиофибриллярной популяции достоверные корреляции между этими показателями не выявляются. При митохондриальных миопатиях достоверной корреляция между размерами митохондрий и содержанием креатинина в крови обнаружено не было. Определенным своеобразием характеризуются корреляции между размерами митохондрий и уровнем лактатдегидрогеназы в указанных выше двух группах больных. При митохондриальных миопатиях площадь, периметр и диаметр отрицательно коррелируют с уровнем лактатдегидрогеназы (R=-0,57; R=0,66, R=0,61; достоверность p<0,05 соответственно). Не наблюдалось корреляционной связи между этими переменными в межмиофибриллярной популяции митохондрий. При врожденной миопатии центрального стержня достоверных корреляционных взаимосвязей не установлено. При миопатии центрального стержня размерные характеристики субсарколеммальных митохондрий отрицательно коррелируют со степенью тяжести заболевания. При этом со степенью тяжести заболевания коррелирует площадь, периметр и максимальный диаметр Фере митохондрий (R=-0,72, R=0,86, R=-0,86; достоверность p<0,05, соответственно). Однако в межмиофибриллярных митохондриях корреляции между их размерами и степенью тяжести заболевания выявлено не было. При митохондриальной миопатии в результате анализа всех участков мышечного волокна корреляционных взаимосвязей между этими переменными не наблюдалось. 106 В двух исследованных группах больных было выявлено, что форма митохондрий взаимосвязана с показателями уровней лактата и пирувата в крови. В результате сравнительного анализа были обнаружены существенные отличия в корреляционных взаимосвязях этих показателей. При миопатии центрального стержня фактор «эллипс» субсарколеммальных митохондрий положительно коррелирует с уровнем лактата крови (R=0,90; достоверность p<0,05). При митохондриальной миопатии фактор «эллипс» субсарколеммальных митохондрий отрицательно коррелирует с уровнем пирувата (R=-0,58, достоверность p<0,05), однако с лактатом корреляционных взаимосвязей не установлено. Существенные отличия при сравнительном анализе были выявлены в корреляционных взаимосвязях между формой митохондрий и показателем креатинина крови в двух группах больных. Так при врожденной миопатии «центрального стержня» фактор «эллипс» субсарколеммальных митохондрий положительно коррелирует с показателем креатинина крови митохондрий (R=0,50; достоверность p<0,05). При митохондриальных миопатиях корреляционных взаимосвязей между формой субсарколеммальных митохондрий и показателем креатинина крови не обнаружено. Необходимо отметить, что в двух группах больных с указанными выше миопатиями существуют отличия во взаимосвязях между формой митохондрий и уровнем кальция крови. При врожденной миопатии центрального стержня фактор «круг» межмиофибриллярных митохондрии положительно коррелируют с уровнем в общего кальция крови (R=0,71, достоверность p<0,05), а субсарколеммальных митохондриях корреляционной связи не выявлено. При митохондриальных миопатиях корреляции между этими параметрами не обнаружено. Степень тяжести заболевания у больных миопатией центрального стержня отрицательно коррелирует с фактором «эллипс» субсарколеммальных митохондрий (R=-0,86, достоверность p<0,05) и положительно коррелирует с фактором «круг» субсарколеммальных митохондрий (R=0,72, достоверность p<0,05). 107 Показатель «энергетического обеспечения мышечного волокна» у больных миопатией центрального стержня положительно коррелирует с уровнем креатинина крови. При этом были выявлены противоположные корреляции в двух рассматриваемых популяции популяциях определяется митохондрий. умеренная достоверность p<0,05), а отрицательная корреляция в Так, положительная межмиофибриллярной (R=-0,56, достоверность в субсарколеммальной корреляция (R=0,63, популяции выявлена p<0,05). Однако при митохондриальной миопатии обнаружена положительная корреляция между показателем «энергетического обеспечения мышечного волокна» и уровнем креатинина крови в субсарколеммальном участке (R=0,68; достоверность p<0,05). Следует отметить, что в межмиофибриллярном участке корреляции между данными показателями выявлено не было. 108 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 4.1 Морфометрические характеристики митохондрий мышц при врожденной миопатии центрального стержня По нашему мнению энергетическая мощность мышечного волокна на морфологическом уровне может быть лучше всего охарактеризована показателем удельного объёма митохондрий, поскольку он отражает общий размер всего митохондриона мышечного волокна. Митохондрион оказался очень динамичной системой, которая модифицируется в зависимости от энергетических потребностей и метаболических условий [Bereiter-Hahn, 1990; Mannella, 2008; Soubannier et all., 2009]. При патологии скелетной мышечной ткани возрастают энергетические запросы, требующие увеличения размеров всего митохондриона мышечного волокна. Это может быть достигнуто тремя путями: увеличением числа митохондрий (пролиферацией), увеличением размеров митохондрий (гипертрофией) и одновременно, и за счет пролиферации, и за счет гипертрофии. При врожденной миопатии центрального стержня явное предпочтение отдаётся второму механизму – гипертрофии митохондрий. О чем ясно свидетельствует высокая степень положительной корреляции между удельным объёмом митохондрий и их размерами, а также отсутствие корреляционной зависимости между удельным объёмом митохондрий и их относительным количеством в мышечных волокнах. Т.е. увеличение общего размера митохондриона достигается, в первую очередь, за счёт увеличения размеров митохондрий. Кроме того, увеличение размеров органелл сопровождается их удлинением, более крупные митохондрии имеют вытянутую, эллипсоидную форму. Об этом свидетельствует положительная корреляция между фактором «эллипс» и размерами митохондрий. Таким образом, можно предположить, что в качестве ведущего компенсаторного механизма используется гипертрофия с формированием вытянутых форм митохондрий. 109 В то же время, следует обратить внимание на умеренную отрицательную корреляцию между относительным количеством митохондрий и их размерами, обнаруженную для обеих популяций митохондрий. Таким образом, при уменьшении размеров митохондрий происходит увеличение их числа. Мы предполагаем, что это происходит вследствие пролиферации митохондрий. Возможно, новые митохондрии могут далее вступать на путь гипертрофии. Это также может свидетельствовать о том, что вероятно происходит и процесс слияния митохондрий. Таким образом, существует достаточно эффективный механизм регуляции митохондриальной динамики (слияния и деления). Из литературы известно, что митохондриальная динамика формирует важный механизм клеточной адаптации, и во многом определяет судьбу клетки, поскольку между морфологией митохондрий и их функциональной состоятельностью существует тесная взаимосвязь [Karbowski et al., 2003; Chen et al., 2005; Chan 2006; Liesa et all., 2009]. Поскольку в межмиофибриллярном участке площадь распределена, в основном, между тремя компонентами - митохондриями, миофибриллами и триадами, то очевидно, что должна быть положительная корреляция между показателем «энергетической обеспеченностью мышечного волокна» и размерными характеристиками органелл. Относительное количество митохондрий положительно коррелирует с площадью цистерн саркоплазматической сети в области триады (особенно в субсарколеммальных участках). По всей видимости, это можно объяснить общим повышением метаболической активности в названных участках мышечных волокон. Возможно, сократительной это повышение активностью и напрямую более связано интенсивной с увеличенной деятельностью саркоплазматической сети в ответ на возбуждение триады. Из литературных данных известно, что саркоплазматическая сеть и митохондрии контактно взаимодействуют, осуществляя обмен липидами и кальцием. Более того, обнаружены структурные соединения (tethers) между наружной мембраной 110 митохондрий и высвобождающими кальций «триадами» мышечного волокна [Boncompagni, Protasi, 2007]. Это позволяет с большей долей уверенности говорить о функциональной взаимосвязи упомянутых структур, обеспечиваемой, в первую очередь, колебанием концентрации кальция. Кроме того, известно, что кальциевые разряды в мышцах коррелируют с количеством и активностью митохондрий, которые способны подавлять высвобождение кальция [Isaeva, Shirokova, 2003, 2005]. Недавно было показано, что саркоплазматическая сеть также участвует и в делении митохондрий. Трубочки саркоплазматической сети опоясывают митохондрии и в некоторых местах существенно их пережимают. В местах такого контакта был обнаружен белок Drp1. Таким образом, саркоплазматическая сеть участвует в определении места перетяжки материнской митохондрии [Westermann, 2008]. Полученные нами результаты выявили существенные различия между корреляционными показателями, связывающими значение концентрации молочной кислоты в периферической крови до и после нагрузки глюкозой с относительным числом и удельным объемом митохондрий, расположенных в центре мышечного митохондрии при волокна этом и под сарколеммой. демонстрировали Межмиофибриллярные достоверную отрицательную корреляцию их числа и удельного объёма с показателями концентрации молочной кислоты до нагрузки и после нагрузки глюкозой, т.е. повышенное количество молочной кислоты в организме связано с меньшим количеством и удельным объёмом митохондрий в центре мышечного волокна. Это может объясняться относительной недостаточностью митохондриальной активности в условиях пониженного количества этих органелл, и соответствующим повышением концентрации молочной кислоты, как биохимическим проявлением этой недостаточности. В то же время, уровень концентрации молочной кислоты до нагрузки глюкозой связан выраженной положительной зависимостью с удельным объёмом субсарколеммальных митохондрий. Однако после часа нагрузки глюкозой выявляется отрицательная корреляция между этими переменными. Мы 111 объясняем это тем, что увеличение удельного объёма митохондрий, располагающихся под сарколеммой мышечных волокон, имеет компенсаторное значение и носит вторичный по отношению к тканевому энергодефициту (сопровождающийся повышением уровня молочной кислоты), характер. Обнаруженная положительная корреляционная связь между числом митохондрий и уровнем пирувата в крови указывает на то, что увеличенное количество митохондрий успешно справляется с повышением концентрации пирувата спустя час после нагрузки глюкозой. Большой интерес, по нашему мнению, представляют выявленные соотношения между формой митохондрий и концентрацией молочной кислоты в крови у больных врожденной миопатий центрального стержня. Обнаруженные в субсарколеммальной популяции митохондрий соотношения (положительная корреляция «эллипсоидности» с уровнем молочной кислоты до и через три часа после нагрузки) можно объяснить следующим образом: что более вытянутые митохондрии в большей степени, обеспечивают реакцию ткани в ответ на повышение уровня молочной кислоты. Показатель уровня молочной кислоты, как показывают выявленные нами другие корреляции, обратно пропорционален числу митохондрий. Таким образом, базовый уровень молочной кислоты в крови пациентов с миопатией центрального стержня в большей степени зависит от количества митохондрий (что подтверждается соответствующими коэффициентами корреляции), тогда как степень функциональной активности органелл в большей степени «отвечает» за реакцию ткани на повышение уровня глюкозы. Т.е. степень функциональной активности митохондрий, выражающаяся в их относительной «эллипсоидности», в большей степени связана с адаптационным потенциалом тканевых биоэнергетических реакций. Субсарколеммальные митохондрии эллипсоидной формы, представляют собой более эффективный в функциональном отношении пул и их число связано положительной корреляцией с коэффициентом «лактат/пируват» после нагрузки глюкозой. В то же время, чем больше округлых митохондрий в субсарколеммальном участке, тем коэффициент «лактат/пируват» после нагрузки 112 меньше. Таким образом, наши данные подтверждают предположение о том, что округлые митохондрии являются менее функционально эффективными в отношении выполнения своих основных функций [Picard et.al., 2012, Cury et al, 2013]. Возможно, что округлые митохондрии являются относительно «молодыми органеллами», только что образовавшимися после почкования новых органелл. Взаимоотношение показателя фактор «эллипс» субсарколеммальных митохондрий с другими биохимическими показателями, также подтверждает гипотезу о большой эффективности эллипсоидных органелл. При этом данная форма «эллипс» митохондрий связана сильной отрицательной корреляцией со степенью тяжести заболевания. Выше сказанное свидетельствует о том, что увеличение количества эллипсоидных органелл под сарколеммой мышечных волокон является важным компенсаторным механизмом при заболеваниях мышц «немитохондриального» генеза. Интересным оказался тот факт, что в межмиофибриллярной популяции фактор «круг» митохондрий связан положительной корреляцией с концентрацией общего кальция в крови (R=0,71, достоверность p<0,05), но в субсарколеммальной популяции корреляционной связи между этими переменными не выявлено. Все это может ещё раз указывать на то, что в разных участках мышечного волокна располагаются разные типы митохондрий, и они выполняют разные функции. В разных работах, проведенных на кардиомиоцитах млекопитающих, было высказано предположение, что митохондрии в зависимости от их места расположения, обладают разной функциональной активностью [Твердохлеб, 1996]. Полученные данные показывают, что наиболее чёткие отличия межмиофибриллярных и субсарколеммальных популяциях в митохондрий выявлены между коэффициентом лактат/пируват и показателем «энергетического обеспечения мышечного волокна». В связи, с чем указанный показатель может эффективно использоваться для оценки компенсаторных митохондриальных изменений в мышечной ткани. Этот же показатель отрицательно коррелирует со степенью тяжести заболевания и положительно коррелирует с биохимическими 113 параметрами (содержанием креатинина и общего кальция в крови). Размеры митохондрий достоверно объединены корреляционными связями с показателями уровня пирувата, однако величина и направление этой связи различаются в субсарколеммальных и межмиофибриллярных митохондриях, что свидетельствует о принципиальных функциональных различиях митохондрий в двух рассматриваемых участках. При миопатии центрального стержня выявлена отрицательная корреляция между удельным объёмом, размерными характеристиками межмиофибриллярных митохондрий и уровнем креатинина в крови, тогда как между этими же показателями в субсарколеммальной популяции была выявлена положительная корреляция. Эти данные также подтверждают предположения о функциональном различии межмиофибриллярных и субсарколеммальных митохондрий. Креатинин - это продукт необратимого превращения креатина, являющегося продуктом распада фосфокреатина, отдающего свою фосфатную группу для восстановления концентрации АТФ в мышцах. Концентрация креатина определяется в организме в первую очередь его содержанием в мышечной ткани. Синтез фосфокреатина энергозависим и напрямую связан с активностью митохондрий. Таким образом, уровень креатинина крови в определенной степени отражает интенсивность энергообмена и в частности митохондриальную активность в мышечной ткани. Наши результаты показывают, что уровень креатинина напрямую связан с удельным нашими объёмом субсарколеммальных митохондрий. Т. е. в соответствии с предыдущими предположениями это отражает адаптационную способность субсарколеммальных митохондрий. Обнаруженная положительная корреляционная связь, между удельным объёмом митохондрий их размерами, фактором «круг» в мышце с уровнем кальция в крови, может объясняться активностью митохондрий при стимуляции АТФ-зависимых кальциевых каналов сарколеммы, выводящих кальций во внеклеточную жидкость. Следовательно, чем больше объём митохондрий в мышцах, тем более активно выводится кальций из мышечных волокон. Наиболее значимым представляется выявленные резко отрицательные 114 корреляции между количеством, удельным объёмом, эллипсоидностью, размерами субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести заболевания. Мы считаем, что это свидетельствует, о том, что увеличение количества, размеров и удельного объёма митохондрий имеет очевидный компенсаторный эффект и напрямую связан с более легким течением заболевания. Следует особенно подчеркнуть, что выявленная корреляция имеет отношение в первую очередь к субсарколеммальным митохондриям. Этот факт, наряду свыше приведенными результатами, касающимися функциональных различий между межмиофибриллярными и субсарколеммальными популяциями митохондрий, явно свидетельствует о том, что реабилитационный (адаптационный) потенциал системы энергообмена мышечной ткани напрямую связан именно с субсарколеммальной популяцией митохондрий. Очевидно, размеры митохондрий могут увеличиваться с достаточной компенсаторной эффективностью. Причем это компенсаторная активность их роста, строго специфична в отношении субсарколеммальных митохондрий. 4.2 Морфометрические характеристики митохондрий мышц при митохондриальной миопатией Обнаруженная достоверная положительная корреляция между показателем «энергетической обеспеченности мышечного волокна» и удельным объёмом митохондрий, свидетельствует, о том, что при митохондриальной миопатии увеличение энергетической мощности мышечного волокна сопровождается пропорциональным увеличением объёма митохондрий во всех участках мышечного волокна. Выявлена отрицательная корреляция между показателем «энергетической обеспеченности мышечного волокна» и удельным объёмом миофибрилл. В отличие от миопатии «центрального стержня», при митохондриальной миопатии увеличение объёма митохондрий в субсарколеммальной и межмиофибриллярном участке достигается только за счёт увеличения размеров 115 митохондрий (т.е. гипертрофии). Это подтверждает выявленная положительная корреляция между удельным объёмом митохондрий и их размерами в обеих популяциях. В межмиофибриллярной популяции митохондрий обнаружена отрицательная корреляция между размерами митохондрий и их электроннооптической плотностью. Это можно объяснить тем, что увеличение размеров митохондрий в большей степени связано с увеличением объёма матрикса, а не с разрастанием крист. Рост крист непосредственно связан с интенсивностью клеточного дыхания. Из литературы известно, что по скорости потребления кислорода по Чансу выделяют 5 метаболических (функциональных) состояний митохондрий. При этом митохондрии с темным плотным матриксом с более развитыми кристами являются наиболее активными, а со светлым матриксом и слабо развитыми кристами - менее активными. Набухание митохондрий, сопровождаемое понижением оптической плотности, наступает и в отсутствие АДФ в состоянии покоя митохондрий. При добавлении АДФ стимулируется окислительное фосфорилирование. Цикл блокируется разобщителями окислительного фосфорилирования [Волькенштейн, 1978]. Кроме этого была выявлена положительная корреляция между размерами и формой фактор «эллипс» этих органелл. Таким образом, также как и при миопатии центрального стержня, чем больше удельный объём митохондрий, тем они становятся крупнее и принимают эллипсоидную форму. Однако установленная отрицательная корреляция между относительным количеством межмиофибриллярных митохондрий и относительной электронной плотностью митохондрий указывает на то, что в межмиофибриллярных участках мышечных волокон мало функционально активных митохондрий. Также в межмиофибриллярной популяции митохондрий обнаружена отрицательная корреляция между размерами митохондрий и их электронно– оптической плотностью. Это, очевидно, позволяют сделать вывод о том, что эллипсоидность характерна для менее функционально активных органелл в этом участке. Таким образом, с увеличением размеров митохондрий форма этих 116 органелл меняется от округлой к эллипсоидной форме с более светлым матриксом и с менее развитыми кристами. Следовательно, можно предположить, что мышечное волокно может обслуживаться малым количеством мелких округлых митохондрий. Выявленные нами соотношения между округлой формой митохондрий и степенью тяжести заболевания подкрепляет нашу гипотезу, основанную на предположении, что округлые митохондрии является более функционально активными и это объясняет выявленная отрицательная корреляция между этими переменными. положительной Также это предположение корреляционной связью подтверждается между выраженной эллипсовидной формой митохондрий их размерами и показателем «энергетической обеспеченности мышечного волокна» в межмиофибриллярном участке. Положительная корреляция между удельным объёмом митохондрий и фактором «эллипс» в межмиофибриллярной популяции митохондрий указывает на то, что гипертрофия происходит также за счёт удлинения митохондрий, что говорит о возможном слиянии митохондрий. Мы предполагаем, что возможно в основе гипертрофии лежит слияние митохондрий, а не биогенез. Из литературы известно, что для митохондриальной миопатии характерна гетероплазмия – смесь нормальной и мутантной мтДНК в одной митохондрии, в клетке, в том или ином органе. При этом нормальная ДНК «дикого типа» может компенсировать патологический эффект мутации [Masucci et al.1995, Payne et.al. 2013]. Возможно, что митохондрии с мутантными нуклеоидами сливаются, увеличиваются в размерах и становятся более удлиненными, эллипсоидной формы. В нашей работе было показано, что эллипсоидные митохондрии с более светлым матриксом, являются менее функционально эффективными органеллами. Кроме того, известно, что слияние митохондрий регулирует их количество и морфологию, а также является механизмом контроля над обновлением и качеством митохондриальной популяции в течение интерфазы путём «перемешивания» мтДНК, белков и других молекул этих органелл [Ono et al., 2001; Sato et al., 2006 ]. Можно заключить, что возможно, происходит декомпенсация вследствие 117 того, что увеличение удельного объёма митохондрий происходит за счёт гипертрофии и слияния. Выявленная отрицательная корреляция между числом субсарколеммальных (но не межмиофибриллярных) митохондрий и концентрациями лактата в периферической крови больных митохондриальной миопатией, очевидно, свидетельствуют о том, что число органелл именно в этом участке может варьировать и играть, таким образом, существенную роль в реализации обмена глюкозой. По всей видимости, большее количество субсарколеммальных митохондрий более эффективно осуществляет этот метаболизм и соответственно сопровождается меньшими концентрациями лактатка. Учитывая, что последний параметр в нашем исследовании оценивался в периферической крови, а также то, что митохондриальная миопатия во всех исследованных случаях сопровождалась другими органными нарушениями (мозга, органов чувств и т.д.), можно предположить, что в численности митохондрий в субсарколеммальных участках мышц, может иметь адаптационное значение для всего организма при полисистемной митохондриальной недостаточности. Отмеченное различие между субсарколеммальными и межмиофибриллярными митохондриями у больных митохондриальными миопатиями, выявляется в том, что только у первых из них отмечается выраженная взаимосвязь между числом, удельным объёмом митохондрий и уровнем креатинина в крови. Следовательно, количество субсарколеммальных (но не межмиофибриллярных) митохондрий влияет на интенсивность энергообмена в мышце. Нами показано, что удельный объём субсарколеммальных митохондрий отрицательно коррелирует с активностью лактатдегидрогеназы в крови. Очевидно, этот факт также следует объяснять с позиции вышеприведенной гипотезы об адаптационном значении увеличения объёма митохондрий в субсарколеммальных участках. В контексте настоящего обсуждения, важно отметить, что количество митохондрий во всех участках мышечного волокна не было связано достоверным соотношением со степенью тяжести заболевания. Считаем, это принципиальной 118 особенностью митохондриальных миопатий, при которых число данных органелл с одной стороны не определяется жестко патологическим процессом, составляющим основу большинства нозологических форм. С другой стороны, адаптационная вариабельность этого показателя в отличие от «немитохондриальных» заболеваний не является достаточно эффективной, чтобы воздействовать на тяжесть заболевания в целом. Размеры митохондрий при митохондриальных миопатиях связаны корреляцией с содержанием пирувата и лактата в крови больных. Эта связь с коэффициентом «лактат/пируват» является положительной (т.е. прямо обратно пропорционально содержанию пировиноградной кислоты). Такие взаимоотношения прослеживаются в обеих популяциях митохондрий до нагрузки глюкозой. Обращает на себя особое внимание, что через три часа эта корреляция между субсарколеммальными митохондриями и коэффициентом «лактат/пируват» резко изменяется, приобретая отрицательное значение. Сопоставляя эти данные с приведенным выше обсуждением по поводу соотношения плотности функционального состояния митохондрий, можно предположить, что более крупные и светлые органеллы менее эффективно справляются с метаболизмом глюкозы. В то же время обнаруженная нами отрицательная корреляция между размерами митохондрий и коэффициентом «лактат/пируват» через три часа после нагрузкой глюкозой, объясняется резким появлением положительной корреляции размеров этих органелл с концентрацией пирувата. Вероятно, установленный факт является доказательством значительного истощения митохондрий через определенное время после нагрузки в условиях митохондриального заболевания. Предположения о компенсаторной роли увеличения числа субсарколеммальных митохондрий в мышцах у больных митохондриальными миопатиями также находят свое подтверждение при анализе взаимоотношения введенными нами показателя» энергетического обеспечения мышечного волокна» с концентрациями креатинина. 119 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В последние годы стремительно растет число больных наследственными нервно-мышечными заболеваниями (в частности митохондриальной миопатией). В связи, с чем необходимы новые методы дифференциальной диагностики данных заболеваний. Морфологическим исследованиям при диагностике миопатий придают особое значение. Впервые был проведен полноценный морфометрический анализ митохондрий в скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатии центрального стержня и митохондриальной миопатией. В заключение можно сказать, что данные нашего исследования свидетельствуют о большой информативности морфометрического метода в оценке адаптационных изменений митохондрий при наследственно обусловленных состояниях скелетной мышечной ткани. В проведенной работе доказана компенсаторная роль изменения числа и размеров митохондрий в скелетной мышечной ткани, которая напрямую связанна со снижением степени тяжести заболевания при наследственных нервномышечных заболеваниях. Проведенный морфометрический анализ митохондрий важен как в теоретическом отношении (для гистологической характеристики адаптационных изменений митохондрий при функциональном напряжении клетки, так и для патологических изменений этих органелл при наследственных нарушениях энергообмена), а также и в практическом отношении – данные могут быть использованы в качестве дополнительных критериев дифференциальной диагностики врожденных нервно-мышечных заболеваний. ВЫВОДЫ 1. При врожденной миопатии центрального стержня количество и размеры митохондрий в межмиофибриллярных и субсарколеммальных участках мышечных волокон существенно различаются между собой, в то время как форма и электронная плотность этих органелл в вышеуказанных участках одинаковы; Выявлена достоверная отрицательная корреляция между размерами митохондрий и их количеством, при этом удельный объём митохондриальной популяции в большей степени зависит от размеров отдельных органелл, а не от их количества. 120 2. Относительное количество митохондрий в мышечном волокне при врожденной миопатии центрального стержня связано положительными корреляциями с метаболической активностью мышечной ткани; при этом увеличение числа митохондрий в большей степени характерно для относительно эффективной компенсации тканевого энергообмена, а повышение размеров органелл происходит на фоне его декомпенсации. 3. Количество митохондрий в периферических участках мышечного волокна у больных миопатией центрального стержня положительно коррелирует с базовыми биохимическими показателями энергообмена; в то же время степень функциональной активности митохондрий, выражающаяся в их относительной эллипсоидности, больше обусловливает адаптационный потенциал тканевых биоэнергетических реакций и эффективность тканевого ответа на повышение концентрации глюкозы в организме. 4. При врожденной миопатии центрального стержня, увеличенные субсарколеммальные скопления митохондрий, имеют компенсаторную природу; повышение размеров этих органелл под сарколеммой и в меньшей степени увеличение их количества в этих участках достоверно коррелирует со снижением степени тяжести заболевания. 5. При митохондриальной миопатии морфометрические характеристики митохондрий во многом изменены за счет набухания и деструкции, наиболее сохранными очевидно являются относительно мелкие и округлые органеллы; при этом отрицательная корреляция между размерами и количеством митохондрий в мышечном волокне не выявляется, что свидетельствует о нарушении механизма поддержания объёма митохондриальной популяции за счёт координации процессов пролиферации и роста этих органелл. 6. Корреляционный анализ морфометрических характеристик митохондрий и клинико-лабораторных показателей при митохондриальной миопатии показывает, что увеличение удельного объёма субсарколеммальных митохондрий в условиях полисистемной митохондриальной недостаточности имеет адаптационное значение для всего организма; в то же время в отличие от миопатии «центрального 121 стержня» удельный объём митохондрий в мышечном волокне при митохондриальной миопатии не связан достоверным соотношением со степенью тяжести заболевания, то есть адаптационная вариабельность этого показателя в отличие от «немитохондриальных» заболеваний не является достаточно эффективной, чтобы воздействовать на тяжесть заболевания в целом. 7. Предложенный нами показатель «энергетического обеспечения мышечного волокна», выражающий соотношение удельного объема митохондрий к удельному объёму миофибрилл и отрицательно коррелирующий со степенью тяжести заболевания, может эффективно использоваться для оценки компенсаторных митохондриальных изменений в мышечной ткани при различных нервномышечных заболеваниях у детей ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При диагностике наследственно обусловленных заболеваний скелетной мышечной ткани следует учитывать полученные в работе взаимосвязи между морфометрическими параметрами митохондрий и клинико-лабораторными показателями, позволяющие значительно уменьшить число проводимых биопсий мышечной ткани пациентов. 2. В целях дифференциальной диагностики биопсийного материалы скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией для оценки компенсаторных митохондриальных изменений в мышечной ткани может быть эффективно применен предложенный в работе показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна». 3. Полученные данные могут быть использованы в медицинских и биологических исследованиях механизмов тканевой адаптации, а также смогут применяться в качестве диагностических маркеров в неврологической практике при оценке характера течения нервно-мышечных заболеваний. 4. Материалы исследования могут быть включены в лекционные курсы для студентов в вузах медицинского и биологического профиля по специальностям гистология, эмбриология, цитология и патологическая анатомия. 122 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: учебник 3-е изд., перераб. И доп. – М.: Медицина, 1998. С.704. 2. Волькенштейн М.В. Общая биофизика. – М.: Наука, 1978. С.590. 3. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Новые изоформы тайтина (коннектина) и их функциональная роль в поперечно-полосатых мышцах млекопитающих: факты и предположения. // Успехи биологической химии. 2012. Т.52. С. 239-280. 4. Гайтон А.К., Хол Д.Э. Медицинская физиология. // Пер с англ. - М.: Логосфера. 2008. С. 1296. 5. Гусев Н.Б. Молекулярные механизмы мышечного сокращения // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6. № 8. С. 24-32. 6. Дадали Л. Митохондриальные болезни. // Российский медицинский журнал. 1996. № 5. С.19-21. 7. Долгов М.А., Косарев А.В. Взаимодействие эластического и гидродинамического компонентов в процессе сокращения и расслабления мышечного волокна. // Вестник ОГУ. 2007. Т . 12. с. 106 – 112. 8. Зильбернагль С., Деспопулос А. Наглядная физиология. // Пер с англ. – М.: Бином. Лаборатория знаний. 2013. С. 408. 9. Кубасова Н. А., Цатурян А. К. Молекулярный механизм работы актин- миозинового мотора в мышце. // Успехи биологической химии. 2011. Т.51. С. 233-282. 10. Ленинджер А. Основы биохимии: в 3-х. Т. // Пер. с англ.- М.: Мир. 1985. С.320. 11. Литвинова Н.А., Воронкова А.С., Сухоруков В.С. Патогенные точечные мутации митохондриальной ДНК. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2014. Т.59. № 2. С.29-34. 12. Рубцов А.М. Роль саркоплазматического ретикулума в регуляции сократительной активности мышц. // Соросовский обозревательный журнал. 2000. Т. 6. № 9. С. 17-24. 123 13. Северин Е.С., Алейников Т.Л., Осипов Е.В. / Биохимия. М: Медицина. 2000. С.164. 14. Соловьева О.Э., Кацнельсон Л.Б., Коновалов П.В., Мархасин В.С. Математическое моделирование электрических и механических явлений в миокарде // Современные проблемы биомеханики. М: МГУ. 2006. № 11. C. 131– 151. 15. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. // М.: Медицина. 1995. С. 688. 16. Сухоруков В.С. Гетерогенность и клинико-морфологическая неоднородность митохондриальной патологии у детей. // Автореф. дис. д-ра мед. наук. М. 1998. с. 37. 17. Сухоруков В.С. Очерки митохондриальной патологии. // М.: ИД « МЕДПРАКТИКА –М». 2011. 288 С. 18. Сухоруков В.С., Харламов Д.А. Врожденные миопатии. // Москва. ООО Пресс- Арт. 2010. 155с. 19. Сухоруков В.С., Харламов Д.А. Дифференциальная диагностика врожденных миопатий. // Нервно-мышечные болезни. 2011. №1. С. 13-21. 20. Твердохлеб И.В. Гетерогенность миокарда и ее развитие в нормальном кардиомиогенезе. // Днепропетровск. 1996. С.75. 21. Тихонов А.Н. молекулярные моторы. Часть 2. Молекулярные основы биологической подвижности. // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 6. С. 17-24. 22. Улумбекова Э.Г., Чалышева Ю.А. Гистология, эмбриология, цитология. 2009. С. 480. 23. Филатов В. Л., Катруха А. Г., Буларгина Т. В., Гусев Н. Б. Тропонин: строение, свойства и механизм функционирования // Биохимия. 1999. Т. 64. С. 1155– 1174. 24. Холмухамедов Э.Л. Роль митохондрий в обеспечении нормальной жизнедеятельности и выживания клеток млекопитающих. Пущино: ИТЭБ РАН. 2008. 124 25. Хэм А., Кормак Д. Гистология. // Пер. с англ. - М.: Мир.1983. Т.2. С.106-151. 26. Шубникова Е.А. Мышечные ткани. // М.: Медицина. 2001. С. 240. 27. Ющук Н.Д., Венгерова Ю.Я. Инфекционные болезни: национальное руководство. // М.: ГЕОТАР – Медиа. 2009. С. 1040. 28. Adhihetty P.J., Ljubicic V., Menzies K.J., Hood D.A. Differential susceptibility of subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria to apoptotic stimuli. // Am J Physiol Cell Physiol. 2005. V. 289. P. 994–1001. 29. Alexander C., Votruba M., Perch U.E., Thiselton D.L., Mayer S., Moore A., Rodriguez M., Kellner U., Leo-Kottler B., Auburger G., Bhattacharya S.S., Wissinger B. OPA1, encoding a dynamin-related GTPase, is mutated in autosomal dominant optic atrophy linked to chromosome 3q28. // Nat. Genet. 2000. V. 26. № 2. P. 211–215. 30. Anderson S., Bankier A. T., Barrell B. G. et al. Sequence and organization of the humanmitochondrial genome. // Nature 1981. V. 290. № 5806. P. 457–465. 31. Bakeeva L.E., Chentsov Yu S., Skulachev V.P. Mitochondrial framework (reticulum mitochondriale) in rat diaphragm muscle. // Biochim Biophys Acta. 1978. V. 501. № 3. P. 349–369. 32. Barbieri E., Battistelli L.,Casadei et al. Morphofunctional and biochemical approaches for studying mitochondrial changes during myoblasts differentiation. // Journal of aging research. 2011. V.2011. P.16. 33. Barbieri E., Sestili P., Vallorani L., Guescini M., Calcabrini C., Giacchini A.M., Giosue A., Lucertini F., Piccoli G., Stocchi V. Mitohormesis in muscle cells: a morpholoqical, molecular, and proteomic approach. // Muscles ligaments Tendons J. 2013. V.3. № 4. P.254-266. 34. Benard G., Bellance N., James D., Parrone P., Fernandez H., Letellier T., Rossignol R. Mitochondrial bioenergetics and structural network organization. // J. Cell Sci 2007. Vol. 120. N 5. P. 838- 848. 35. Benard G., Karbowski M. Mitochondrial fusion and division: Regulation and role in cell viability. // Semin Cell Dev Biol. 2009. V. 20. №. 3. P. 365-374. 125 36. Benard G., Karbowski M. Mitochondrial fusion and division: regulation and role in cell viability. // Semin Cell Dev Biol. 2009. V. 20. №. 3. P. 365-374. 37. Benichou I., Givli S. The hidden ingenuity in titin structure // Appl.Phys. Lett. 2011. V. 98. P. 091904. 38. Beraud N., Pelloux S., Usson Y., Kuznetsov A.V., Ronot X., Tourneur Y., Saks V. Mitochondrial dynamics in heart cells: very low amplitude high frequency fluctuations in adult cardiomyocytes and flow motion in non beating Hl-1 cells. // J. Bioenerg. Biomembr. 2009. V. 41. № 2. P. 195–214. 39. Bereiter - Hahn J. Behavior of mitochondria in the living cell. // Int. Rev. Cytol. 1990. Vol. 122. P. 1-63. 40. Bloemberg D. Examining the Role of Apoptotic Cell Signalling and Mitochondrial Fission During Skeletal Muscle Differentiation. // Thesis requirement for the degree of Master of Science in Kinesiology. Waterloo, Ontario, Canada. 2012. 87 p. 41. Boffoli D., Scacco S.C., Vergari R., Persio M.T., Solarino G., Laforgia R., Papa S. Ageing is associated in females with a decline in the content and activity on the b-c1 complex in skeletal muscle mitochondria. // Biochim Biophys Acta. 1996. V. 1315. № 1. P.66-72. 42. Bossi S.R., Simpson J.R., Isacson O. Age dependence of striatal neuronal death caused by mitochondrial dysfunction. // Neuroreport. 1993. V. 4. P.73-76. 43. Bossy-Wetzel E., Barsoum M.J., Godzik A., Schwarzenbacher R. Lipton S.A. Mitochondrial fission in apoptosis, neurodegeneration and aging. // Curr Opin Cell Biol. 2003. V. 15. № 6. P. 706-16. 44. Brierley E.J., Johnson M.A., James O.F., Turnbull D.M. Effects of physical activity and age on mitochondrial function. // QJM. 1996. V.89. № 4. P.251-258. 45. Brunk C.F., Yaffe D. The reversible inhibition of myoblast fusion by ethidium bromide (EB). // Experimental Cell Research.1976. V.99. № 2. P.310-318. 46. Calvo S. E., Mootha V. K. The mitochondrial proteome and human disease. // Annual Review of Genomics and Human Genetics 2010. V. 11. P. 25–44. 47. Cechetto J. D. Gupta R.S. Immunoelectron microscopy provides evidence that tumor necrosis factor receptor –associated protein 1 (TRAP-1) is a mitochondrial 126 protein which also localizes at specific extramitochondrial sites. // Exp. Cell Res. 2000. V. 260. № 1. P.30-39. 48. Cereghetti G.M., Stangherlin A., Martins de Brito O., Chang C.R., Blackstone C., Bernardi P., Scorrano L. Dephosphorylation by calcineurin regulates translocation of Drp1 to mitochondria. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. V.105. № 41. P. 15803– 15808. 49. Chan D.C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2006. V. 22. № 10. P. 79–99. 50. Chang C.R., Blackstone C. Cyclin AMP-depended protein kinase phoshorylation of Drp1 regulates its GTPase activity and mitochondrial morphology. // J. Biol. Chem. V.282. P. 21583-21587. 51. Chen H., Chan D.C. Emerging functions of mammalian mitochondrial fusion and fission. // Hum Mol Genet. 2005. V.14. № 2. P. 283-289. 52. Chen H., Chomyn A., Chan D.C. Disruption of fusion resultsin mitochondrial heterogeneity and dysfunction. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. № 28. P. 26185– 26192. 53. Chen Q. Mitochondrial encephalomyopathy. Report of a case. // Chung Hua Shen Ching shen ko tsa chih. 1990. V. 23. № 1. P.38-40. 54. Chen Y., Liu Y., Dorn G.W. Mitochondrial fusion is essential for organelle function and cardiac homeostasis. // Circ. Res. 2011. V.109. № 12. P. 1327–1331. 55. Cipolat S., Rudka T., Hartmann D., Costa V., Serneels L., Craessaerts K., Metzger K., Frezza C., Annaert W., D’Adamio L., Derks C., Dejaegere T., Pellegrini L., D’Hooge R., Scorrano L., De Strooper B. Mitochondrial rhomboid PARL regulates cytochrom c release during apoptosis via OPA1-dependent cristae remodeling. // cell. 2006. V. 126. № 1. P.163-175. 56. Cohen B.H. Mitochondrial cytopathy in adults: what we know so far. // Cleveland clin J MED.2001. V. 68. № 7. P.625-642. 57. Collins T. J., Berridge M. J., Lipp P., Bootman, M. D. Mitochondria are morphologically and functionally heterogeneous within cells. // EMBO J. 2002. V.21. № 7. P. 1616–1627. 127 58. Cribbs J.T., Strack S. Reversible phosphorylation of Drp1 by cyclic AMP-dependent protein kinase and calcineurin regulates mitochondrial fission and cell death. // EMBO Rep. 2007. V. 8. № 10. P. 939–944. 59. Cribbs J.T., Strack S. Reversible phosphorylation of Drp1 by cyclic AMP-dependent protein kinase and calcineurin regulates mitochondrial fission and cell death. // EMBO Rep. 2007. V. 8. № 10. P. 939–944. 60. Cury D.P., Dias F.J., Sosthenes M.K., Ogava K., Pereira Da Silva M.C., Mardegan Issa J.P., Lyomasa M.M. Watanabe L. // Microscopy research and technique. 2013. V.76.N.2. P.184-195. 61. Dabke P., Rao P. Diagnostic Challenges in mitochondrial disease. // Int J. Health rehabil sci. 2012. V.1. №1.P. 25-31. 62. Daum B., Walter A., Horst A., Osiewacz H.D., Kuhlbrandt W. Age-dependent dissociation of ATP synthase dimmers and loss of inner – membrane cristae in mitochondria. // Proc Natl Acad Sci USA. 2013. V. 110. № 38. P. 15301-15306. 63. De Brito O.M., Scorrano L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. // Nature. 2008. V. 456. № 7222. P. 605–610. 64. De Vos K.J., Allan V.J., Grierson A.J., Sheetz M.P. Mitochondrial function and actin regulate dynamin-related protein 1-dependent mitochondrial fission. // Curr. Biol. 2005. V.15. № 7. P. 678–683. 65. Desai V. G., Weindruch R., Hart R.W., Feuers R.J. Influences of age and dietary restriction on gastrocnemius electron transport system activities in mice. // Arch Biochem Byophys. 1996. V 333. № 1. P.145-151. 66. Dikov D., Reichert A.S. How to split up: lessons from mitochondria. // The EMBO Journal. 2011. V.30. № 14. P. 2751–2753. 67. Dorn G.W., Maack C. SR and mitochondria: calcium cross-talk between kissing cousins. // J. Mol. Cell Cardiol. 2013. V.55. 42–49. 68. Dubowitz V. The floppy infant. In Child development and Learning Behaviour. // Gustav Fischer Verlag. 1986. P.293-299. 69. Dubowitz V., Sewry C.A. Muscle biopsy. // Saunders, Elsevier 2007. P. 611. 128 70. Duguez S., Feasson l., Denis C., Freyssenet D. Mitochondrial biogenesis during skeletal muscle regeneration. // American Journal of Physiology. 2002. V.282. № 4. P. 802-809. 71. Ebashi S. Third component participating in the superprecipitation of “natural” astomyosin. // Nature. 1963. V.200. P.1010. 72. Elachouri G., Vidoni S., Zanna C., Pattyn A., Boukhaddaoui H., Gaget K., Yu-Wai- Man P., Gasparre G., Sarzi E., Delettre C., Olichon A., Loiseau D., Reynier P., Chinnery P.F., Rotig A., Carelli V., Hamel C.P., Rugolo M., Lenaers G. OPA1 links human mitochondrial genome maintenance to mtDNA replication and distribution. // Genome Res. 2011. V.21. № 1. P. 12–20. 73. Engel A.G., Franzini- Armstrong C. Myology. Third edition. // McGrawHill. 2004. P.1203-1238, 1473 – 1533. 74. Engel W.K., Cunningham G.G. Rapid examination of muscle tissue: An improved trichrome stain method for fresh frozen biopsy sections. // Neurology. 1963. V. 13. P. 919-926. 75. Ernster L., Schatz G. Mitochondria: a historical review. // J. Cell Biol. 1981. Т.91. № 3. С. 227-255 76. Eura Y., Ishihara N., Oka T., Mihara K. Identification of a novel protein that regulates mitochondrial fusion by modulating mitofusin (Mfn) ptotein function. // J. Cell Sci. 2006. V. 119. P.4913-4925. 77. Fawcett D.W. Mitochondria. // In: The Cell, its organelles and inclusions: An Atlas of fine structure. W. B. Saunders co.; Philadelphia. 1966. P. 410-486. 78. Fawcett D.W. Mitochondria. In: The cell, its organelles and inclusions: An atlas of fine structure. W.B. Sauders co.; Philadelphia: 1966. P.410-486. 79. Ferguson S.M., De Camilli P. Dynamin, a membrane-remodelling GTPase. // Nat Rev Mol cell boil. 2012. V. 13. № 2. P. 75-88. 80. Frazier A.E., Kiu C., Stojanovski D., Hoogenraad N.J., Ryan M.T. Mitochondrial morphology and distribution in mammalian cells. // Biological Chemistry. 2006. V. 387. № 12. P. 1551–1558. 129 81. Frezza C., Cipolat S., Martins de Brito O., Micaroni M., Beznoussenko G.V., Rudka T., Bartoli D., Polishuck R.S., Danial N.N., De Strooper B., Scorrano L. OPA1 controls apoptotic cristae remodeling independently from mitochondrial fusion. // Cell. 2006. V. 126. № 1. P. 177–189. 82. Friedman J.R., Lackner L.L., West M., DiBenedetto J.R., Nunnari J., Voeltz G.K. ER tubules mark sites of mitochondrial division. // Science. 2011. V.334. № 6054. P. 358–362. 83. Frye J., Klenchin V., Rayment I. Structure of the tropomyosin overlap complex from chicken smooth muscle: insight into the diversity of N-terminal recognition. // Biochemistry. 2010. V. 49 P. 4908-4920. 84. Gandre-Babbe S., Van der Bliek A.M. The novel tail-anchored membrane protein Mff controls mitochondrial and peroxisomal fission in mammalian cells. // Mol Biol Cell. 2008. V. 19. № 6. P. 2402-2412. 85. Goffart S., Wiesner R. J. Regulation and co-ordination of nuclear gene expression during mitochondrial biogenesis. // Experimental Physiology 2003. V. 88. № 1. P. 33–40. 86. Green D.E. Ji S. Tranductional and structural principles of the mitochondrial transducing unit. // Proc Natl Acad Sci (USA). 1973. V.70. P.904-908. 87. Greenfild J.G., Cornman T., Shy G.M. The prognostic value of the muscle biopsy in the “floppy infant”. // Brain. 1958. V. 81. 461 P. 88. Guillery O., Malka F., Landes T., Guillou E., Blackstone C., Lombes A., Belenguer P., Arnoult D., Rojo M. Metalloproteasemediated OPA1 processing is modulated by the mitochondrial membrane potential. // Biol. Cell 2008. V. 100. № 5. P. 315–325. 89. Gunter T.E., Yule D.I., Gunter K.K., Eliseev R.A., Salter J.D. Calcium and mitochondria. // FEBS Lett. 2004. V. 567. № . 1. P.96-102. 90. Hackenbrock C.R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I reversible ultrasturctural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. // J Cell Biol. 1966. V. 30. P. 269-297 130 91. Hajnoczky G., Csordas G., Madesh M., Pacher P. The machinery of local Ca2+ signalling between sarcoendoplasmic reticulum and mitochondria // J Physiol. 2000. 529. №. 1. P. 69–81. 92. Hamai N., Nakamura M., Asano A. Inhibition of mitochondrial protein synthesis impaired C2C12 myoblast differentiation. // Cell Structure and Function. 1997. Vol.22. № 4. P. 421- 431. 93. Hatefi Y. The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system. // Annu Rev Biochem 1985. V.54. P.1015-1069. 94. Hayashi K., Miller R.G., Brownell A.K. Central core disease: Ultrastructure of the sarcoplasmic reticulum and T-tubules. // Muscle Nerve. 1989. V. 12. P. 95-102. 95. Heuss D., Engelhardt A., Gobel H., Neundorfer B. Expression of NCAM (neural cell adhesion molecule) in mitochondrial myopathy. // Clin – Neuropathol. 1995. V. 14. № 6. P. 331-336. 96. Hock M.B., Kralli. Transcriptional control of mitochondrial biogenesis and function. // Annual Review of Physiology. 2009. V. 71. P. 177-203. 97. Hom J., Sheu S.S. Morphological dynamics of mitochondria – a special emphasis on cardiac muscle cells. // J. Mol. Cell Cardiol. 2009. V. 46. № 6. P. 811–820. 98. Hood D.A. “Invited review: contractile activity – induced mitochondrial biogenesis in skeletal muscle”. // Journal of applied Physiology. 2001. V. 90. № 3. P. 11371157. 99. Hoppeler H., Vogt M., Ewald R., Fluck W., Fluck M. // Experimental Physiology. 2011. V. 88. №.1. P.109-119. 100. Hoppins S., Collins S.R., Cassidy-Stone A., Hummel E., Devay R.M., Lackner L.L., Westermann B., Schuldiner M., Weissman J.S., Nunnari J. A mitochondrialfocused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria.// J. Cell Biol. 2011. V.195. № 2. P. 323– 340. 101. Huddart H. The comparative Structure and Function of Muscle. // Oxford. 1975. Pergamon Press. P. 4-48. 131 102. Ibi T., Sahashi K., Ling J., Marui K., Mitsuma T. Immunostaining of mitochondrial heat shock proteins (mtHSPs) in skeletal muscle fibers of mitochondrial cytopathy. Rindsho Skinkeigaku. 1996. V.36. № 1. P.61-64. 103. Ingerman E., Perkins E.M., Marino M., Mears J.A., McCaffery J.M., Hinshaw J.E. Nunnari J. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. // J. Cell Biol. 2005. V. 170. № 7. P. 1021–1027. 104. Isaeva E.V., Shkryl V.M., Shirokova N. Mitochondrial redox state and Ca2+ sparks in permeabilized mammalian skeletal muscle. // Journal of Physiology. 2005 565. Р. 855-872. 105. Isaeva E.V., Shirokova. N. Metabolic regulation of Ca2+ release in permeabilized mammalian skeletal muscle fibres. // Journal of Physiology. 2003. 547. Р. 453-462. 106. Ishihara N., Eura Y., Mihara K. Mitofusin 1 and 2 play distinct roles in mitochondrial fusion reactions via GTPase activity. // J Cell Sci. 2004. V. 117. № 26. P.6535 – 6546. 107. Jash S., Adhya S. Induction of muscle regeneration by RNA-mediated mitochondrial restoration. // FASEB Journal. 2012. V. 26. № 10. P. 4187–4197. 108. Jazbutyte V. Mitochondrial dynamics: molecular mechanisms and the role in the heart. // Minerva Cardioanqiol. 2010. V. 58. № 2. P. 231-239. 109. Jofuku A., Ishihara N., Mihara K. Analysis of functional domains of rat mitochondrial Fis1, the mitochondrial fissionstimulating protein. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V.333. № 2. P. 650–659. 110. Joubert F., Wilding J.R., Fortin D., Domergue – Dupont V., Novotova M., Ventura-Clapier R., Veksler V. Local energetic regulation of sarcoplasmic and myosin ATPase is differently impaired in rats with heart failure. // J. Physiol. 2008. V. 586. № 21. P. 5181–5192. 111. Karbowski M., Youle R.J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. // Cell Death Differ. 2003. V. 10. № 8. P. 870–880. 112. Kim I., Rodriguez – Enriquez S., Lemasters J.J. Selective degradation of mitochondria by mitophagy. // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2007. V. 462. № 2. P. 245-253. 132 113. Kimberg D.V., Loeb J.N. Effects of cortisone administration on rat liver mitochondria. Support for the concept of mitochondrial fusion. // J. Cell Biol. 1972. V. 55. № 3. P. 635–643. 114. Kunz W.S. Control of oxidative phosphorylation in skeletal muscle. // Biochim Biophys Acta. 2001. V.1504. №.1. P. 12–9. 115. Kuznetsov A.V., Hermann M., Saks V., Hengster P., Margreiter R. The cell-type specificity of mitochondrial dynamics. // Int. J. Biochem Cell Biol. 2009. V. 41. № 10. P. 1928–1939. 116. Kuznetsov A.V., Hermann M., Saks V., Hengster P., Margreiter R. The cell-type specificity of mitochondrial dynamics. // Int. J. Biochem Cell Biol. 2009. V. 41. № 10. P. 1928–1939. 117. Landes T., Emorine L.J., Courilleau D., Rojo M., Belenquer P., Armaune – Pelloquin. The BH3-only Bnip3 binds to the dynamine OPA1 to promote mitochondrial fragmentation and apoptosis by distinct mechanisms. // EMBO Rep. V.11. № 6. P.459-465. 118. Lee Y.J., Jeong S.Y., Karbowski M., Smith C.L., Youle R.J. Roles of the mammalian mitochondrial fission and fusion mediators Fis1, Drp1, and Opa1 in apoptosis. // Mol. Biol. Cell 2004. V.15. № 11. P. 5001–5011. 119. Legros F., Lombes A., Frachon P., Rojo M. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins. // Mol. Biol. Cell. 2002. V. 13. № 12. P. 4343–4354. 120. Lehman W., Hatch V., Korman V.L., Rosol M., Thomas L.T., Maytum R., Geeves M.A., Van Eyk J.E., Tobacman L.S., Graig R. Tropomyosin and actin isoforms modulate the localization of Tropomyosin Strands on actin Filaments. // J. mol.biol. V.302. P. 593-606. 121. Lehman W., Rosol M., Tobacman L.S., Craig R. Troponin organization on Relaxed and activated Thin Filaments Revealed by Electron Microscopy and treedimensional reconstruction. // J. Mol. Biol. 2001. V.307. P.739 -744. 122. Liesa M., Palacin M., Zorzano A. Mitochondrial dynamics in mammalian health and disease. // Physiol Rev. 2009. V. 89. № 3. P. 799-845. 133 123. Lin J., Puigserver P., Donovan J., Tarr P., Spiegelman B. M. Peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1 (PGC-1 ), a novel PGC-1-related transcription coactivator associated with host cell factor. // The Journal of Biological Chemistry 2002. V. 277. №. 3. P. 1645–1648. 124. Linari M., Dobbie I., Reconditi M., Koubassova N., Itving M., Piazzesi G., Lombardi V. Elastic bending and active tilting of myosin heads during muscle contraction. // Biophys. J. 1998. V.74. № 5. P. 2459 – 2473. 125. Lindal S.,Lund I., Torbergsen T., Aasly J., Mellgren S.I., Borud O., Monstad P. Mitochondrial diseases and myopathies: a series of muscle biopsy specimens with ultrastructural changes in the mitochondria. // Ultrastruct Pathol. 1992. V. 16. № 3. P.263 – 275. 126. Loson O.C., Song Z., Chen H., Chan D.C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. // Mol Biol Cell. 2013. V. 24. № 5. P.659-667. 127. Luft R. The development of mitochondrial medicine. // Proc Natl Acad Sci USA.1994. V.91. № 19. P. 8731-8738. 128. Luft R. The development of mitochondrial medicine. Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V.91. № 19. P. 8731-8738. 129. MacLennan D. H. Resolution of the calcium transport system of sarcoplasmic reticulum. // Can. J. Biochem. 1975. V. 53. 130. Malka F.O., Guillery C., Cifuentes-Diaz E., Guillou P., Belenguer A., Lombes M. R . 2005. Separate fusion of outer and inner mitochondrial membranes. // EMBO Rep. V. 6. № 9. P. 853-859. 131. Mannella C.A. Structural diversity of mitochondria: functional implications // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008. Vol.1147. N.10. P.171-179. 132. Masucci J.P., Davidson M., Koga Y. et.al. In vitro analysis of mutations causing myoclonus epilepsy with ragged0red fibers in the mitochondrial tRNALysgene: two genotypes produce similar phenotypes. Molecul Cellul Biol. 1995. V.15. N.5. P.2872-2881. 134 133. Merlini L., Bernardi P. Therapy of collagen VI-related myopathies. // Neurotherapeutics. 2008. V.5. № 4. P.613-618. 134. Merzetti E.M., Staveley B.E. Mitochondrial dynamics in degenerative disease and disease models. // Neuroscience Discovery. 2013. V. 1. № 8. P.1-12. 135. Moyes C.D. Mathieu – Costello O.A., Tsuchiya N., Filburn C., Hansford R.G. Mitochondrial biogenesis during cellular differentiation. // American Journal of Physiology.1997. V.272. № 4. P. 1345 – 1351. 136. Müller-Höcker J., Pongratz D., Hubner G. – Focal deficiency of cytochrome c oxidase in skeletal muscle of patients with progressive external ophthalmoplegia. Virchows Arch (A). 1983. V. 402. P. 61-71. 137. Muller-Hocker J., Schafer S., Link T.A., Possekel S., Hammer C. Defects of the respiratory chain in various tissues of old monkeys: a cytochemical – immunocytochemical study. // Mech ageing Dev. 1996. V.86. № 3. P. 197-213. 138. Munn E.A. The Structure of mitochondria. // Academic Press. London. 1974. P. 465. 139. Munn EA. The structure of mitochondria. // Academic Press. London. 1974. P. 465. 140. Nabi I.R. Cellular Domains. // Wiley – Blackwell. All rights reserved. 2011. P87- 113. 141. Nakamura N., Kimura Y., Tokuda M., Honda S., Hirose S. MARCH-V is a novel mitofusin 2- and Drp1-binding protein able to change mitochondrial morphology. // EMBO Rep. 2006. V. 7. № 10. P. 1019 –1022. 142. Naviaux R.K. The spectrum of mitochondrial disease in mitochondrial and metabolic disorders: a primary care physician’s Guide.2nd ed. 2003. 143. Okamoto K., Shaw J.M. Mitochondrial Morphology and Dynamics in Yeast and Multicellular Eukaryotes. // Annu Rev Genet. 2005. V. 39. № 10. P. 503-536. 144. Olichon A., Guillou E., Delettre C., Landes T., Arnaune – Pelloquin L., Emorine L.J., Mils V., Dloyau M., Hamel C., Amati – Bonneau P., et al. Mitochondrial dynamics and disease, OPA1. // Biochim Biophys Acta. 2006. V. 1763. № 5-6. P. 500-509. 135 145. Ono T., Isobe K., Nakada K., Hayashi J.I. Human cells are protected from mitochondrial dysfunction by complementation of DNA products in fused mitochondria. // Nature Genetics. 2001. V. 28. № 3. P. 272–275. 146. Onq S.B., Hausenloy D.J. Mitochondrial morphology and cardiovascular diseas. // Cardiovasc Res. 2010. V. 88. № 1. P. 16-29. 147. Orrenius S., Packer L., Cadenas E. Mitochondrial signaling in health and disease. // CRC Press, Taylor Francis Group. 2012. 300 p. 148. Otera H., Wang C., Cleland M.M., Setoguchi K., Yokota S., Youle R.J., Mihara K. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. // J Cell Biol. 2010. V. 191. № 6. P. 1141-1158. 149. Palade G. An electron microscope study of the mitochondrial structure. // J Histochem Cytochem. 1953. Т.1. P.188. 150. Palmer C.S., Osellame L.D., Laine D., Koutsopoulos O.S., Frazier A.E., Ryan M.T. MiD49 and MiD51, new components of the mitochondrial fission machinery. // EMBO Rep. 2011.V. 12. № 6. P. 565-573. 151. Papanicolaou K.N., Khairallah R.J., Ngoh G.A., Chikando A., Luptak I., O’Shea K.M., Riley D.D., Lugus J.J., Colucci W.S., Lederer W.J., Stanley W.C., Walsh K. Mitofusin-2 maintains mitochondrial structure and contributesto stress-induced permeability transition in cardiac myocytes. // Mol. Cell Biol. 2011. V.31. № 6. P. 1309–1328. 152. Park Yong - Yea., Lee S., Karbowski M., Neutzner A., Youle R.J., Cho H. Loss of MARCH5 mitochondrial E3 ubiquitin ligase induces cellular senescence through dynamin-related protein 1 and mitofusin 1. // J. Cell Sci. 2010. V.123. № 4. P. 619626. 153. Parone P.A., Da Crus S., Tondera D., Mattenberger Y., James D.I. Maechler P. Barja F. Martinou J.C. Preventing mitochondrial fission impairs mitochondrial function and leads to loss of mitochondrial DNA. // PLoS One. 2008. V. 3. № 9. P. 3257. 136 154. Parone.A., James D.I., Da Cruz S., Mattenberger Y., Donze O., Barja F., Martinou J.C. Inhibiting the mitochondrial fission machinery does not prevent Bax/Bak-dependent apoptosis. // Mol. Cell. Biol. 2006. V.26. № 20. P. 7397–7408. 155. Payne B.A., Wilson I.J., Yu-Wai-Man P. et.al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. // Human molecular Genetics. 2013. V.22. N.2. P.384-390. 156. Picard M., Hepple R.T, Burelle Y. Mitochondrial functional specialization in glycolytic and oxidative muscle fibers: tailoring the organelle for optimal function. // Am J Physiol Cell Physiol. 2012. V. 302. № 4. P. 629-641. 157. Piquereau J. Caffin F., Novotova M., Lemaire C., Veksler V., Garnier A., Ventura- Clapier R., Joubert F. Mitochondrial dynamics in the adult cardiomyocytes: which roles for a highly specialized cell. // Front. Physiol. 2013. V. 102. № 4. P. 1-13. 158. Piquereau J., Caffin F., Novotova M., Prola A., Garnier A., Mateo P., Fortin D., Huynh le H., Nicolas V., Alavi M.V., Brenner C., Ventura-Clapier R., Veksler V., Joubert F. Down-regulation of OPA1 alters mouse mitochondrial morphology, PTP function, and cardiac adaptation to pressure overload. // Cardiovasc. Res. 2012.V. 94. № 3. P. 408–417. 159. Richardson D.R., Lane D.J., Becker E.M., Huang M.L., Whitnall M., Suryo Rahmanto Y., Sheftel A.D., Ponka P. Mitochondrial iron trafficking and the integration of iron metabolism between the mitochondrion and cytosol. // Proc Natl Acad Sci USA. 2010. V. 107. № 24. P. 10775- 10782. 160. Rieusset J. Mitochondria and endoplasmic reticulum: Mitochondria–endoplasmic reticulum interplay in type 2 diabetes pathophysiology. // The International Journal of Biochemistry Cell Biology. 2011. V. 43. № 9. P. 1257–1262. 161. Rizzuto R., Marchi S., Bonora M., Aguiari P., Bononi A., De Stefani D., Giorgi C., Leo S., Rimessi A., Siviero R., Zecchini E., Pinton P. . Ca(2+) transfer from the ER to mitochondria: when, how and why. // Biochim Biophys Acta. 2009. V. 1787. N. 11. P. 1342-1351. 162. Rochard P., Cassar- Malek I., Marchal S., Wrutniak C., Cabello G. // Changes in mitochondrial activity during avian myoblast differentiation: influence of 137 triiodothyronine or v-erb A expression. // J cell Physion. 1996. V. 168. № 2. P. 239247. 163. Ryan M.T., Hoogenraad. Mitochondrial – nuclear communications. // Annual review of biochemistry. 2007. V. 76. P. 701-722. 164. Sandow A. Skeletal muscle. // Annu. Rev. Physiol. 1970. V. 32. Р. 87–138. 165. Santel A., Fuller M. T. Control of mitochondrial morphology by a human mitofusin. // J. Cell Sci. 2001. V. 114. № 5. P. 867–874. 166. Sato A., Nakada K., Hayashi J. Mitochondrial dynamics and aging: mitochondrial interaction preventing individuals from expression of respiratory deficiency caused by mutant mtDNA. // Biochimica et Biophysica Acta. 2006. V. 1763. №. 5-6. P. 473–481. 167. Satoh M., Hamamoto T., Seo N., Kagawa Y., Endo H. Differential sublocalization of the dynamin-related protein OPA1 isoforms in mitochondria. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 300. № 2. P. 482–493. 168. Schachat F., Brandt P.W. The troponin I: inhibitory peptide uncouples force generation and the cooperativity of contractile activation in mammalian skeletal muscle. // J. Muscle Res Cell Motil. 2013. V. 34. № 2. P. 83-92. 169. Scheffler I.E. A century of mitochondrial research: achievements and perspectives. // Mitochondrion. 2001. Т.1. № 1. С. 3-31. 170. Schmid S.L., Frolov V.A. Dynamin functional design of a membrane fission catalyst. // Annu Rev Cell Dev Biol. 2011. V. 27. № 10. P. 79-105. 171. Seppet E.K., Kaambre T., Sikk P., Tiivel T., Vija H., Tonkonogi M., Sahlin K., Kay L., Appaix F., Braun U., Eimre M., Saks V.A. Functional complexes of mitochondria with Ca2+,Mg2+-ATPases of myofibrils and sarcoplasmic reticulum in muscle cells. // Biochim Biophys Acta. 2001. V. 1504. №. 2. P. 379–395. 172. Seyer P., Grandemage S., Rochard P. P43-dependet mitochondrial activity regulates myoblast differentiation and slow myosin isoform expression by control of calcineurin expression. // Experimental Cell Research. 2011. V.317. № 14. P.20592071. 138 173. Shah V.O., Scariano J., Waters D., Qaalls C., Morgan M., Pickett G., Doklandy K., Moslley P., Raj D.S. Mitochondrial DNA deletion and sarcopenia. // Genetics in Medicine. 2009. V.11. P.147-152. 174. Shanske S. Mitochondrial encephalomyopathies: defects of nuclear DNA. // Brain Pathol 1992. V.2. P.159-162. 175. Shy G.M.., Magee K.R. A new congenital nonprogressive myopathy. // Brain. 1956. V.79. P. 610-621. 176. Skulachev V.P. Mitochondrial filaments and clusters as intracellular power- transmitting cables. // Trends Biochem. Sci. 2001. V. 26. № 1. P. 23–29. 177. Smirnova E., Griparic L., Shurland D.L., Bliek A.M. Dynamin –related protein Drp1 is required for mitochondrial division in mammalian cells. // Mol Biol Cell. 2001. V. 12. № 8. P. 2245-2256. 178. Smith C.A., Rayment I. X-ray structure of the magnesium (II) ADP vanadate complex of the Dirtyostehum discoideum myosin motor domain to 1 9 A resolution. // Biochemistry. 1996. V.35. P.5404 – 5417. 179. Somlyo A.V., Bond M., Shuman H., Somlyo A.P. Electron-probe X ray microanalysis of in situ calcium and other ion movements in muscle and liver. // Ann N.Y. Acad Sci. 1986. V. 483. P. 229-240. 180. Soubannier V., McBride H.M. Positioning mitochondrial plasticity within cellular signaling cascades. // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1793. № 1. P. 154–170. 181. Soubannier V., McBride H.M. Positioning mitochondrial plasticity within cellular signaling cascades. // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1793. № 1. P. 154–170. 182. Suen D.F., Norris K.L., Youle R.J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. // Genes Dev. 2008. V. 22. № 12. P. 1577-1590. 183. Sugioka R., Shimizu S., Tsujimoto Y. Fzo1 a protein involved in mitochondrial fusion, inhibits apoptosis. // J.Biol. Chem. 2004. V.279. P. 52726 – 52734. 184. Sukhorukov V.S. Energy deficient diathesis as energy metabolism disadaptation in children// Mat of VII World Congress of Int.Soc. For Adaptive Medicine, Moscow. 2006. V.1. №19. P.54. 139 185. Sukhorukov V.S. Mitochondrial proliferation as adaptation mechanism in various diseases. // In : adaptation biology and medicine: health potentials. 2008. V.5. P.295305. 186. Sukhorukov V.S. Quantitative Alterations in Mitochondria: Adaptation Contra Violation In: Adaptation Biology and Medicine // Narosa Publishing House Pvt. Ltd., New Delhi, India. 2011. V. 6. Р. 77-89. 187. Tait S.W., Green D.R. Mitochondria and cell signaling. // J. cell science. 2012. V. 125. № 4. P.807-815. 188. Terman A. Kurz T., Navratil M., Arriaga E.A., Brunk U.T. Mitochondrion turnover and aging of long-lived postmitotic cells: the mitochondrial-lysosomal axis theory of aging. // antioxidants and Redox Signaling.2010. V.12. № 4. P. 503535. 189. Territo P.R., French S.A., Dunleavy M.C., Evans F.J., Balaban R.S. Calcium activation of heart mitochondrial oxidative phosphorylation. Rapid kinetics of mVO2, NADH and light scattering. // J Biol Chem. 2001. V. 276. N. 4. P. 2586– 2599. 190. Tondera D., Czauderna F., Paulick K., Schwarzer R., Kaufmann J., Santel A. The mitochondrial protein MTP 18 contributes to mitochondtial fission in mammalian cells. // Journal of Cell Science. 2005. V. 118. № 14. P. 3049-3059. 191. Tondera D., Santel A., Schwarzer R., Dames S., Giese K., Klippel A., Kaufmann J. Knockdown of MTF18, a novel phosphatidylinositol 3-kinase dependent protein, affects mitochondrial morphology and induces apoptosis. // J Biol Chem. 2004. V. 279. № 30. P. 31544 – 31555. 192. Twig G., Hyde B., Shirihai O.S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. // Biochimica et Biophysica Acta. 2008. V. 1777. №. 9. P. 1092–1097. 193. Varadi A., Johnson-Cadwell L.I., Cirulli V., Yoon Y., Allan V.J., Rutter G.A. Cytoplasmic dynein regulates the subcellular distribution of mitochondria by controlling the recruitment of the fission factor dynaminrelated protein-1. // J. Cell Sci. 2004. V.117. № 19. P. 4389–4400. 140 194. Wagatsuma A., Kotake N., Yamada S. Muscle regeneration occurs to coincide with mitochondrion biogenesis. // Molecular and cellular Biochemistry. 2011. V. 349. № 1-2. P. 139-147. 195. Wagatsuma A., Sakuma K. Mitochondria as a potential regulator of myogenesis. // The scientific world journal. 2013. V.10. № 1155. P.9. 196. Wakabayashi T., Green D.E. Membrane fusion in mitochondria. I. Ultrastructural basis for fusion. // J. Electron Microsc. (Tokyo). 1977. V. 26. № 4. P. 305–320. 197. Wenz T., Rossi S. G.,. Rotundo R. L, Spiegelman B. M., T.Moraes C. Increasedmuscle PGC-1 expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009. V. 106. № 48. P. 20405–20410. 198. Wiesner R.J., Hornung T.V., Garman J.D., Clayton D.A., O’Gorman E., Wallimann T. Stimulation of mitochondrial gene expression and proliferation of mitochondria following impairment of cellular energy transfer by inhibition of the phosphocreatine circuit in rat hearts. // Journal of bioenergetics and biomembranes. 1999. V.31. № 6. P.559-567. 199. Yeilding N. M., Procopio W. N., Rehman M. T., Lee M. F. C-myc mRNA is down-regulated during myogenic differentiation by accelerated decay that depends on translation of regulatory coding elements. // The Journal of Biological Chemistry. 1998. V. 273. № 25. P. 15749–15757. 200. Yonashiro R., Ishido S., Kyo S., Fukuda T., Goto E., Matsuki Y., Ohmura- Hoshino M., Sada K., Hotta H., Yamamura H., et al. A novel mitochondrial ubiquitin ligase plays a critical role in mitochondrial dynamics. // EMBO J. 2006. V.25. P. 3618-3626. 201. Yoon Y., Krueger E.W., Oswald B.J., McNiven M.A. The mitochondrial protein hFis1 regulates mitochondrial fission in mammalian cells through an interaction with the dynamin-like protein DLP1. // Mol. Cell Biol. 2003. V.23. № 15. P. 5409–5420. 202. Yoon Y., Pitts K.R., McNiven M.A. Mammalian dynamin-like protein DLP1 tubulates membranes. // Mol. Biol. Cell. 2001. V. 12. № 9. P. 2894–2905. 141 203. Yu T., Robotham J.L., Yoon Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. // Proc Natl Acad Sci USA. 2006. V.103. P. 2653-2658. 204. Zhao J., Liu T., Jin S., Wang X., Qu M., Uhlen P., Tomilin N., Shupliakov O., Lendahl U., Nister M. Human MIEF1 recruits Drp1 to mitochondrial outer membranes and promotes mitochondrial fusion rather than fission. // EMBO J. 2011. V. 30. № 14. P. 2762-2778. 142 ПРИЛОЖЕНИЕ Таблица 1. Результаты морфометрического исследования параметров митохондрий в скелетной мышечной ткани (M±m). Врожденная миопатия центрального стержня Параметры Субсарколеммальные Межмиофибриллярные Митохондриальная миопатия Субсарколеммальные Межмиофибриллярные Относительное количество митохондрий 1,01±0,09 0,39±0,03 0,76±0,13 0,27±0,03 Площадь, мкм2 0,15±0,08 0,10±0,01 0,12±0,01 0,09±0,007 Максимальный диаметр Фере, мкм 0,56±0,03 0,48±0,02 0,53±0,02 0,46±0,02 Минимальный диаметр Фере, мкм 0,32±0,02 0,26±0,01 0,28±0,01 0,24±0,01 Удельный объём 14,39±1,51 митохондрий, % 3,81±0,26 10,4±2,74 2,64±0,43 Форма «эллипс» 0,54±0,03 0,47±0,02 0,51±0,02 0,44±0,01 Форма «круг» 0,79±0,01 0,79±0,01 0,76±0,01 0,78±0,01 Электроннооптическая плотность 0,93±0,01 0,93±0,03 0,92±0,005 0,93±0,005 Показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна» RRF выраженность 0,34± 0,05 0,04 ± 0,02 0,53±0,24 0,04±0,01 1,63±0,10 1,64±0,09 1,96±013 1,96±0,11 RRF % волокон 37,40±6,10 34,35±5,75 24,16±3,99 24,66±3,44 Примечание: M ± m – среднее значение показателя и его ошибка. 143 мкм2 мкм2 График 1. Корреляционная взаимосвязь морфометрических параметров субсарколеммальных митохондрий у больных миопатией центрального стержня. N У: площадь митохондрий (мкм2); Х: относительное количество митохондрий (N) N У: периметр митохондрий (мкм2); Х: относительное количество митохондрий. мкм2 График 2. Корреляционная взаимосвязь морфометрических параметров субсарколеммальных митохондрий у больных миопатией центрального стержня % У: площадь митохондрий (мкм2); Х: форма митохондрий «эллипс» (отн.ед.). У: форма митохондрий «эллипс» (отн.ед.); Х: Удельный объём митохондрий (%). 144 Ммоль/л Ммоль/л График 3. Корреляционная взаимосвязь морфометрических параметров митохондрий с функциональными показателями у больных миопатией центрального стержня. N N У: концентрация лактата до нагрузки глюкозой; Х: относительное количество межмиоибриллярных митохондрий (N) У: концентрация лактата через час после нагрузки глюкозой (ммоль/л); Х: Относительное количество межмиофибриллярных митохондрий (N) Ммоль/л График 4. Корреляционная взаимосвязь морфометрических параметров митохондрий с функциональными показателями у больных миопатией центрального стержня. % У: концентрация лактата до нагрузки глюкозой; Х: удельный объём межмиофибриллярных митохондрий ( %) % У: концентр. лактата после нагрузки глюкозой (ммоль/л); Х: удельный объём межмиофибр. митохондрий (%). 145 Баллы Баллы График 5. Корреляционная взаимосвязь морфометрических параметров митохондрий с функциональными показателями у больных врожденной миопатией центрального стержня. N У: степень тяжести заболевания (баллы) У: степень тяжести заболевания (баллы); Х: относительное количество митохондрий (N) Х: форма субсарколеммальных митохондрий «эллипс» У: степень тяжести заболевания (баллы); Х: показатель (ЭОМВ) Ммоль/л Баллы График 6. Корреляционная взаимосвязь «энергетической обеспеченности мышечного волокна» с функциональными показателями у больных врожденной миопатией центрального стержня. У: показатель креатинин крови (ммоль/л) Х: показатель ЭОМВ (субсарколеммальный) 146
