Новые методики в лечении мышечной дистрофии Дюшена
advertisement
Проект для родителей Мышечные дистрофии Сообщество помощи лицам, страдающим мышечной дистрофией Дюшенна Достижения в лечении мышечной дистрофии Дюшенна. Дополнено в марте-апреле 2008 Это новый вид исследовательского отчѐта, который автор статьи, Günter Scheuerbrandt, немецкий биохимик, подготовил для вас, мальчики и юноши, страдающие мышечной дистрофией Дюшенна, и ваших близких, всех кто хочет узнать о работе учѐных и врачей в многочисленных исследовательских лабораториях по всему миру над созданием эффективных методов лечения мышечной дистрофии Дюшенна. В моих ранних сообщениях, и особенно в последним из них, подготовленном к конференции в Цинциннати в июле 2006, в Лондоне в 2006 и в Филадельфии 2007 (www.duсhenn-information.eu), приводится более подробная информация о результатах исследований, обнародованных на этих научных мероприятиях. Но поскольку результаты отдельных исследований, выполненных ранее, не освещались на этих научных мероприятиях, автор обобщил их в своѐм сообщении, дополнив новой информацией, прежде всего с конференции ActionDuchenne’s, которая проходила в Лондоне в ноябре 2007, а также включил данные из недавних публикаций. Ссылки на отдельные наиболее важные публикации приводятся в конце некоторых разделов. Информация в основном тексте соответствует состоянию на март-апрель 2008. При поступлении новой информации, я планирую обновление документа, в первую очередь после конференции Parent Project <Проект для родителей> в Филадельфии в июле 2008; через несколько месяцев информация будет доступна на английском, испанском и немецком. Как сообщалось ранее, все мои публикации, в том числе и та, которую Вы читаете, это не научные обзоры с большим количеством непонятных слов, поскольку я пытался написать понятным для вас языком о том, что происходит в лабораториях. Это сообщение, как и предыдущие, включает только данные научных исследований. Однако, я попытаюсь также включить в последующие редакции сообщения информацию о новых медицинских манипуляциях и видах социальной помощи с учѐтом данных более поздних публикаций. В разделах "выводы", я привожу только имена и фамилии руководителей лабораторий, однако, у них есть коллеги, постдоки и студенты, работающие в одной команде вместе с ними над проектами, описанными здесь, однако, перечислить их всех невозможно. Все руководители лабораторий, работы которых описаны в сообщении, имели возможность оценить посвящѐнные им разделы и внести в них исправления, что было крайне важным, почти все они воспользовались этой возможностью. Таким образом, удалось достигнуть снижения количества ошибок или совсем избежать их. Свои вопросы об исследованиях направляйте в письменном виде на английском, французском и немецком по электронной почте. Я попытаюсь ответить на них, но только на английском или немецком. Это сообщение подготовлено как часть работы TREAT-NMD, организации Европейского Союза со штабквартирой в университете Ньюкасал-апон-Тайн, Великобритания, двух головных организаций по изучению болезни Дюшенна PPMD в Миддлтауне, Огайо, США, и ActionDuchenne в Лондоне, Великобритания. Введение Как гены вырабатывают белки. Гены являются функциональными единицами генетического материала дезоксирибонуклеиновой кислоты, ДНК. Структура этой молекулы, похожая на скрученную лестницу, двойная спираль. Каждое звено лестницы состоит из четырѐх различных молекул небольшого размера, нуклеотидных оснований: аденина, гуанина, тимидина, и цитозина (A, G, T, C). В связи со структурными особенностями, звенья могут содержать только два вида комбинаций, пары оснований A-T и G-C. Если, например, GGCTTAATCGT - последовательность этих оснований является одной стандартной последовательностью, противоположной ей является последовательность CCGAATTAGCA, таким образом обе последовательности комплементарны друг другу: -GGCTTAATCGT||||||||||| -CCGAATTAGCAЭта последовательность оснований, генетический код, является генетической информацией для развития и поддержания жизнедеятельности живого организма, которая передаѐтся из поколения в поколение. Большинство генов являются инструкцией по биосинтезу белка. В ядре клетки, структура активных генов экспрессируется, она копируется- происходит транскрипция - <перезапись> на другой носитель генетической информации, пре матричную рибонуклеиновую кислоту или пре-мРНК, которая также называется транскриптом. Большинство генов состоит из активных или кодирующих областей, экзонов, которые хранят информацию о белках, и которые значительно длиннее интронов, которые содержат не только ―генетический баласт‖. Предполагается, что они несут важную информацию о регуляции активности генов. После транскрипции, интроны удаляются из пре-мРНК, а экзоны сшиваются с образованием матричной РНК, мРНК, которая образует комплекс с рибосомами, структурами, находящимися в цитоплазме клетки, основная функция которых — биосинтез белка. В состав рибонуклеиновой кислоты, РНК, входит основание U, урацил, вместо сходного основания T <тимин> ДНК. Местами сплайсинга являются отдельные последовательности, находящиеся внутри экзонов, на границах экзонов и интронов, которые имеют важность для правильного удаления последовательностей, не несущих информации, которая используется в биосинтезе белка - интронов в пре-мРНК. Процесс сплайсинга осуществляется сплайсосомами, комплексами, состоящими из нескольких белков и низкомолекулярной РНК. В матричной РНК, каждые три последовательных основания, за исключением трѐх, кодоны, триплеты или «генетические слова», соответствуют одной из 20 различных аминокислот, согласно генетическому коду. Между кодонами нет промежутков. В рибосомах информация генетического кода матричной РНК считывается и переводится в язык белков, которые состоят из аминокислот, их строительных блоков, чаще нескольких тысяч. Этими тремя упомянутыми исключениями являются UAA, UAG и UGA, которые служат стоп-кодонами, отвечающими за прекращение синтеза белка на рибосомах. Ген и белок дистрофина. Мышечные дистрофии Дюшенна и Беккера вызываются мутациями или повреждением гена дистрофина, несущего информацию о различных формах белка - дистрофина. Ген состоит из 2,220,223 оснований, это самый большой из известных генов человека. Только 11,058 оснований, 0.5%, в 79 экзонах гена дистрофина участвуют в кодировании последовательности из 3,685 аминокислот, образующих нормальную структуру дистрофина в мышечных клетках. Размер гена и белка дистрофина. Длина двойной спирали гена дистрофина составляет 0.75 мм. Наряду с другими, по меньшей мере, 20,488 генами человека, она находится в клеточном ядре, диаметр которого около 0.01 мм, что возможно только благодаря плотной укладке генетического материала. Молекула белка дистрофина при полной его длине значительно короче гена, еѐ длина составляет 125 нанометров (= 0.000125 мм), если 8,000 молекул выстроить в прямую линию друг за другом - получится цепочка длиной один сантиметр. А в одном грамме мышечной ткани содержится 114 миллиард молекул дистрофина. Это может помочь в понимании задачи учѐных: для того, чтобы остановить или замедлить течение заболевания, восстановить более или менее нормальное функционирование мышц, необходимо восстановить около 30% нормального количества дистрофина, выработка которого нарушается при повреждении гена. Новый белок не обязательно должен иметь форму, полностью соответствующую оригинальному белку, он может быть короче, но должен обладать необходимыми функциональными характеристиками. После чего миллиарды и миллиарды новых молекул дистрофина возвращаются в каждый грамм мышечной ткани, которой у ребѐнка несколько килограмм! Роль дистрофина. Дистрофин необходим для обеспечения механической стабильности мышечных клеток. Он расположен на внутренней поверхности мембран миоцитов. Один из его концов, C-концевая часть, связанна с группой других белков мембраны, образуя дистрофин-гликопротеиновый комплекс, а другой конец, N-концевая часть, контактирует со структурами, участвующими в мышечном сокращении, находящимися внутри мышечной клетки. Центральная часть дистрофина, основной домен, состоит из складчатых последовательностей аминокислот, которые несколько раз меняют свое направление. Если длина молекулы дистрофина меняется под действием мышечного сокращения, еѐ складчатая структура играет роль пружины, которая может поглощать энергию. Таким образом, дистрофин передаѐт механическую энергию, которая образуется при сокращении актин-миозиновых комплексов на мембраны миоцитов и структуры, находящиеся за их пределами, соединительные ткани и сухожилия, и служит структурой, позволяющей не подвергать их избыточной механической нагрузке. У дистрофина также есть несколько других функций: он формирует сложную структуру дистрофингликопротеиновых комплексов и место для нахождения многих других белков. Он также регулирует сложные процессы, такие как поддержание необходимого количества кальция в клетках и контроль роста мышц. Многие детали этого интересного взаимодействия между различными компонентами живых клеток остаются неизученными. У мальчиков, страдающих болезнью Дюшенна, снижено количество дистрофина в мышечных волокнах или полностью отсутствует. При потере защитного и структурного действия белка, мышечное сокращение приводит к повреждению мышечных мембран, что приводит к поступлению больших количеств кальция к мышечным волокнам. Избыточное количество кальция активирует отдельные белки, такие как кальпаин, и другие протеазы, которые разрушают белки мышечной ткани и запускают программы гибели клеток - апоптоз. Последствия данной цепи патофизиологических механизмов, такие как воспаление и активация фибробластов, приводят к развитию фиброза, образованию рубцовых изменений, что замедляет регенерацию мышечной ткани и обуславливает характерную клиническую картину поздних стадий болезни Дюшенна. У мальчиков с более медленно прогрессирующей мышечной дистрофией Беккера количество дистрофина меньше нормы, кроме того, длина белка меньше нормальной. Белок сохраняет свои функции, но не может работать также эффективно, как его нормальный аналог. Снижение количества дистрофина нарушает работу не только скелетных мышц, но и гладкой мускулатуры, и миокарда. Поражение сердечной мышцы приводит к развитию кардиомиопатии, слабость гладких мышц приводит к многочисленным последствиям, в том числе к снижению способности кровеносных сосудов к расслаблению, что приводит к дыхательным и другим нарушениям, а также нарушается работа желудочнокишечного тракта вследствие снижения его моторики. Таким образом, поражение только одного гена может приводить к нарушением в различных системах организма. Мутации гена дистрофина. Существует три распространѐнных вида мутаций, которые нарушают функции гена дистрофина: делеции, когда отсутствуют один или более экзонов гена, редупликации, если части гена повторяются, и точечные мутации, если изменяются, включаются в генетический материал или удаляются отдельные пары оснований. Другими видами мутаций являются инверсии и изменения интронов, которые изменяют нормальный характер сплайсинга. Поскольку трѐхнуклеотидные последовательности информационной РНК считываются один за другим без перерывов, эта нормальная рамка считывания продолжает функционировать, если мутации связаны выпадением или дополнительным включением целого кодона. В этом случае, рамка считывания продолжает работать, но синтезируемый дистрофин может быть короче или длиннее нормальной молекулы. Если эти изменения захватывают участки дистрофина, не имеющие критического значения, функция белка может быть частично сохранена, что приводит к развитию мышечной дистрофии Беккера. Однако, если мутация приводит к сдвигу рамки считывания вследствие повреждения одной или двух пар оснований, еѐ функционирование нарушается. Это приводит к изменению правильной аминокислотной последовательности белка с места расположения мутации, что продолжается до достижения стоп-кодона. Неполная молекула дистрофина не может выполнять функции этого белка, она разрушается, что приводит к развитию мышечной дистрофии Дюшенна. Дистрофин в головном мозге. Дистрофин встречается не только в мышечных волокнах, но встречается и в других органах, таких как головной мозг или сетчатка глаза. Молекулярная масса дистрофина, входящего в состав мышечной ткани, составляет 420 Кд, килодальтон (в 420,000 раз тяжелее атома водорода) – это самая крупная из пяти изоформ (белков различного размера). В головном мозге встречается этот нормальный дистрофин, а также четыре его более мелкие изоформы, которые встречаются преимущественно в синапсах, структурах, которые служат для соединения нервных клеток, и в стенках кровеносных сосудов головного мозга, формирующих, так называемый, гематоэнцефалический барьер. Это значит, что дистрофины играют важную роль в соединении между нервами, а также в правильном функционировании гематоэнцефалического барьера, что позволяет поступать в головной мозг только тем веществам, которые необходимы для его нормального функционирования. Ген дистрофина включает семь промоторов, последовательностей, с которых начинается биосинтез белка. Первые три промотора находятся в начале гена, контролирующего синтез нормального белка, другие четыре находятся внутри гена. Наиболее близкий к концу гена промотор запускает синтез более короткой молекулы дистрофина. Это означает, что мутации, возникающие до этого промотора, не нарушают образование и структуру белка, которые синтезируется с участием этого промотора. Например, у мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна с мутациями в первой половине гена, продолжают синтезироваться более короткие изоформы дистрофина, которые встречаются в головном мозге, по сравнению с мутациями последующих участков гена, которые приводят также к развитию симптомов поражения головного мозга, в связи с отсутствием изоформ, специфичных для головного мозга. Этот факт служит объяснением, почему у отдельных мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, есть проблемы с поведением и обучением, а у других их нет. Поскольку различные формы дистрофина встречаются в сетчатке глаза, местоположение мутации играет роль в развитии нарушения цветного зрения у отдельных мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Совместно с проф. Francesco Muntoni, Королевский колледж Лондона. Пропуск экзонов Индукция пропуска экзонов не является лечением. Методика с пропуском экзонов используется как попытка замедлить скорость прогрессирования мышечной дистрофии Дюшенна, изменяя течение заболевания, делая его более похожим на доброкачественную дистрофию Беккера с более мягким течением. Это не исправляет мутации, но оказывает влияние на считывание и обработку отдельного гена. Пропуск экзонов не может рассматриваться как метод излечения мышечной дистрофии Дюшенна, этот метод может только снизить тяжесть симптомов заболевания, что является единственной целью терапии. Если мутация, делеция, дупликация или точечная мутация, сдвигают рамку считывания матричной РНК, мРНК, и приводят к развитию мышечной дистрофии Дюшенна, рамка может быть восстановлена с помощью предотвращения включения в мРНК одного или более экзонов с антисмысловыми олигорибонуклеотидами, AOНами. Они являются короткими участками РНК, синтезированными искусственно, структура которых позволяет им присоединяться к комплементарной последовательности пре-мРНК внутри экзона и избирательно удалять только этот участок, не действуя на остальные. Таким образом, АОН оказывают влияние на механизм сплайсинга, препятствуя включению отдельного экзона или экзонов в мРНК, при этом они пропускаются. Поскольку мРНК после пропусков короче нормальной, длина дистрофина также меньше, поскольку он содержит меньшее количество аминокислот. Если отсутствующие аминокислоты являются частью областей, не имеющих критического значения, таких как центрально-стержневые домены, более короткий белок может сохранять способность стабилизировать мембраны миоцитов. Вследствие этого, тяжѐлые симптомы, характерные для мышечной дистрофии Дюшенна, могут трансформироваться в более мягкие, характерные для мышечной дистрофии Беккера. В первых исследованиях пропуска экзонов использовалось два вида АОН, защищѐнных при помощи химических методов. Защита молекул требуется, поскольку это снижает темп их разрушения или полностью блокирует их инактивацию ферментами клетки, разрушающими нуклеиновые кислоты. Двумя типами АОН являются 2'O-метил-фосфоротиоаты, которые также называются 2’O-метилы и морфолины. Пропуск экзонов: исследование в Нидерландах. Первое исследования метода пропуска экзонов, выполненное с участием людей, проводилось в Нидерландах с января 2006 по март 2007. Исследование преследовало цель только доказать состоятельность данного подхода к лечению, но не оценивало терапевтическую эффективность препарата у мальчиков, получавших лечение. В исследовании проводилась оценка небольшого участка одной мышцы, передней большеберцовой мышцы голени, в которую вводился 2’O-метил антисмысловой олигорибонуклеотид, комплементарный экзону 51, который называется PRO051. Этот тип АОН, защищѐнного химическими методами, использовался голландскими учѐными при проведении доклинических исследований в течение нескольких лет, и позволял осуществлять пропуск экзонов дистрофина в мышечных волокнах, не только в клеточных культурах, но и у живых мышей и собак после местного и системного (в кровоток) введения. До начала этого первого клинического исследования пропуска кодонов, были выполнены клинические и молекулярно-генетические исследования каждого мальчика для того, чтобы убедиться, что использование процедуры пропуска экзонов у этих мальчиков приведѐт к синтезу более короткого дистрофина, структура которого сходна с белком, характерным для мышечной дистрофии Беккера. В исследовании принимали участие четыре мальчика, которые уже были прикованы к инвалидным креслам. Возраст участников находился в пределах от 10 до 13 лет, были верифицированы делеции экзонов дистрофина 50, 52, 48-50, и 49-50. Участники исследования получали лечение последовательно, назначение лечения последующему участнику исследования проводилось только после получения положительных результатов и отсутствия серьѐзных побочных действий у участников исследования, которые получали лечение ранее. Каждому мальчику проводилось четыре инъекции по 0.2 мг PRO051, растворѐнного в 0.2 мл физиологического раствора (0.9% NaCl) под местной анестезией в область мышцы голени небольшого размера - участок передней большеберцовой мышцы длиной 1.5 см. Через четыре недели выполнялась биопсия места введения препарата с последующей оценкой для выявления изменѐнной мРНК с пропущенными кодонами и укороченного дистрофина. Исследования показали, что через 4недели введения препарата дистрофические волокна, содержащие вновь синтезированный дистрофин в мышечных волокнах выявлялись в 64%, 85%, 97%, и 73% случаях. По сравнению с этим, введение α2ламинина, белка, который не вовлекается в дистрофический процесс, сопровождалось содержанием дистрофина 33%, 35%, 17%, и 25%. Это сравнение учитывает выраженность дегенеративных изменений мышечной ткани. Без этой поправки, у 13-летнего мальчика с высоким содержанием соединительной ткани и жира в мышцах, содержание нормального дистрофина составило 3% от нормального количества, в то время, как у мальчика с менее выраженным поражением эта доля составляла 12%. При помощи метода молекулярного секвенирования было доказано, что новый дистрофин при восстановлении рамки считывания сохраняет свою структуру. Было невозможно установить, является ли количество вновь синтезируемого дистрофина, достаточным для замедления прогрессирования заболевания в мышечной ткани всего организма, поскольку объѐм мышечной ткани, который оценивался в исследовании, был чрезвычайно мал. Полученные результаты указывают, что лечение с использованием пропуска экзонов, при появлении возможности его использования, должно начинаться, пока большая часть мышечной ткани не захвачена патологическими изменениями, непосредственно после выявления вида мутации дистрофина, которая вызывает сдвиг рамки считывания. В настоящее время голландские исследователи начали клиническое исследование I/II Фазы для изучения эффективности, безопасности, переносимости и возможных побочных эффектов системного введения АОН PRO051 непосредственно в кровоток, чтобы препарат поступал во все типы мышечной ткани, включая гладкие мышцы лѐгких и миокард. Исследование выполнено в сотрудничестве с Университетом Лувена в Бельгии, Лейденским университетским медицинским центром и Медицинским центром королевы Сильвии в Швеции. В настоящее время проводится набор пациентов. Данные, полученные на мышах и обезьянах, при подкожном введении препарата, свидетельствуют о том, что данный путь введения способствует развитию пропуска экзонов без сопутствующих серьѐзных побочных эффектов во всех исследуемых мышцах, а также сердца и диафрагмы, и позволяют рассчитывать на возможность использования этого пути, что позволит избежать частого посещения врача и госпитализации при необходимости повторных инъекций. Эта техника инициации пропуска экзонов с использованием 2’O-метил АОН была разработана в Лейденском университете проф. Gertjan van Ommen, Др. Judith van Deutekom и их сотрудниками, но за организацию и проведение клинического исследования в настоящее время отвечает компания Prosensa B.V. в Лейдене, президентом которой является Др. Gerard Platenburg. Др. van Deutekom в настоящее время является директором по проведению исследований компании Prosensa. Это исследование системного введения проводилось с участием 12 мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна в возрасте 5-15 лет, которым в течение пяти недель еженедельно проводились подкожные введения препаратов. Поскольку не была доказана безопасность использования у детей доз АОН, использованных в доклинических исследованиях, в начале исследования системного введения применялись очень низкие дозы, которые постепенно увеличивались до оптимального уровня с начальной дозы 0.5 мг/кг/ на инъекцию до максимальной 10 мг/кг. В настоящее время Prosensa производит АОН для индукции пропуска экзона 51 в количестве, исчисляемом граммами, качество которого соответствует необходимому для использования в клинических исследованиях, для проведения данной работы. Также была оптимизирована структура АОН, приготовленных против экзонов 43, 44, 45, 46, 50, 52 и 53. Совокупность этих АОН, в том числе анти-51 АОН, позволит проводить лечение порядка 65% пациентов с делециями. Однако, по финансовым причинам, Prosensa в настоящее время разрабатывает только АОН против 44, 51, и 52, предназначенные для клинического использования и продажи. Для разработки других АОН компании требуются дополнительные инвестиционные средства, компания с признательностью использует средства, полученные от организаций пациентов, таких как голландские и немецкие родительские проекты, французская ассоциация изучения мышечной дистрофии AFM и других. Пропуск экзонов: клиническое исследование в Великобритании. Другим клиническим исследованием пропуска экзонов было исследование, выполненное в Великобритании Консорциумом MDEX под управлением проф. Francesco Muntoni Королевского колледжа Лондона. Консорциум MDEX, финансируемый департаментом здравоохранения, объединяет девять исследователей, а также хартии: Компания по изучению мышечной дистрофиии, ActionDuchenne, и Группа поддержки родителей пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. В культуре нормальных и поражѐнных мышечной дистрофией Дюшенна миоцитов человека и не поражѐнных дистрофией миоцитов мышей, содержащих гены дистрофии человека, оценивались восемь различных антисмысловых олигонуклеотидов. Лучшие результаты были получены при использовании АОН морфолино H51A , разработанным проф. Steve Wilton, в Перте (Австралия); проф. Dominic Wells в Лондоне показал достаточную стабильность для длительного клинического использования. АОН морфолино для клинического использования был разработан компанией AVI BioPharma инк. в Портланде, Орегон, и носит название AVI-4658. Три группы по три мальчика, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, в каждой, в возрасте от 12 до 18 лет, которые не могли самостоятельно передвигаться, получали три различные дозы: 0.09, 0.297, и 0.9 мг АОН морфолина в 0.9 мл физиологического раствора, которые разделялись на девять инъекций, проводимых непосредственно в короткий разгибатель большого пальца на наружной поверхности одной из стоп. Эта мышца была выбрана, поскольку она легко доступна и может быть удалена без серьѐзных последствий при развитии серьезных побочных эффектов. В другие мышцы стопы вводился физиологический раствор для контроля. До начала исследования и через 30 дней проводились обширные клинические обследования, включая проведение биопсии. После получения разрешения трѐх регуляторных органов Великобритании в ходе длительной процедуры подготовки, первое введение АОН мальчику было выполнено 18 декабря 2007. Публикация окончательных результатов исследования ожидается в 2008 году. Поскольку в первом исследовании были получены обнадѐживающие результаты, будет начато исследование системного использования препарата, которое в настоящее время находится на стадии окончания планирования, в исследовании планируется проводить подкожное введение АОН AVI-4658, с целью поступления препарата в кровоток. Одним из наиболее важных экспериментов на животных было исследование, когда АОН вводился семь раз в неделю в вену хвоста мышей mdx, что приводило к образованию более чем 50% от нормального количества дистрофина в большинстве мышц и отмечалось как минимум в течение 14 недель. В этом исследовании системного введения было запланировано лечение четырѐх групп мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, которые могли передвигаться, препарат должен был вводиться в низкой дозе около 600 мг АОН, с повышением до 3 грамм, в расчѐте на мальчика 10 лет. В выполненных ранее клинических исследованиях других заболеваний, АОН в дозах 300 мг/кг/сут хорошо переносились, таким образом, стартовая доза, использованная в исследованиях мышечной дистрофии Дюшенна, была крайне низкой. Целью исследования была оценка безопасности и переносимости, а также изменения функций мышц и их силы. Предполагается, что использование минимальной дозы может определить, вызывает ли препарат достаточную эффективность пропуска экзонов при хорошей переносимости у детей, без развития серьѐзных побочных эффектов. Подробное описание клинических исследований местного использования препаратов приводится на сайте http://clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00159250 Пропуск экзона с переносом гена U7: исследователи института Gẻnẻthon в Эври в пригороде Парижа, проф. Luis García и Др. Aurélie Goyenvalle (в настоящее время Оксфордский университет) и их сотрудники попытались комбинировать терапию, направленную на пропуск экзонов и генную терапию, вызывая самостоятельную выработку антисмысловых олигорибонуклеотидов мышцами, что не требовало повторного введения препарата. Это могло быть достигнуто введением в мышцы, модифицированной U7ня<низкомолекулярной ядерной>РНК, содержащей информацию о сборке АОН. U7-няРНК являются мелкими молекулами РНК, которые сходны по структуре с факторами сплайсинга. В рамках второй исследовательской программы, французские исследователи разработали новую, более общую методику пропуска экзонов, которая также основана на использование вирусной трансфекции генов U7. Для оценки первого подхода, модифицированный ген U7-няРНК был сконструирован при помощи добавления комплементарных последовательностей ДНК к двум АОН, что необходимо для пропуска экзона 23 мышей линии mdx. Это короткие няРНК, такие же, как другие РНК, также "сделаны" из генов. Модифицированный ген U7, U7 SD23/BP22, с контрольными последовательностями, был введѐн в состав векторов AAV<аденоассоциированный вирус>-типа-2 и введѐн сначала местно в мышцы мышей линии mdx, а затем системно, в кровоток. Это сопровождалось появлением дистрофина без аминокислот, которые кодировались экзоном 23 в почти 80% волокнах мышц, в которые вводился препарат, этот новый укороченный дистрофин мигрировал в своѐ обычное положение в мембране клеток, и сохранял стабильность в течение более одного года без развития какой-либо иммунной реакции. Дистрофические процессы в мышцах мышей mdx, сопровождавшиеся ранее дегенерацией и регенерацией, были полностью остановлены. У мышей линии mdx, которым проводилось системное введение препарата, во время физической нагрузки при беге на тредмиле не развивалось повреждение мышечной ткани, характерное для мышей линии mdx, которым не вводился препарат. Эта методика лечения с введением гена U7 была использована для лечения золотистого ретривера с клиническими признаками дистрофии GRMD <мышечная дистрофия золотистых ретриверов>. Для этих собак характерны мутации в месте сплайсинга экзона 7, которая может быть ―исправлена‖ при помощи пропуска экзонов 6 и 8. Введение модифицированного вектора U-7, содержащего антисмысловые структуры к экзонам 6, 7, и 8, укорачивало дистрофин почти до нормального уровня в течение двух месяцев после однократного местного введения в мышцу. Региональное системное введение в нижнюю конечность с блокированной циркуляцией приводило к образованию большего количества дистрофина, которых продолжал выявлялся в течение шести месяцев. Во втором подходе, основанном на переносе гена U7, пропуск экзона вызывался новым и почти ―универсальным‖ U7няРНК вектором, который включал комплементарную последовательность ДНК в экзон и свободный конец, который служил местом связи разнородных ядерных рибонуклеопротеинов A1/A2 (ряРНП), белков, блокирующих сплайсинг всех экзонов. Последовательность, комплементарная перенесѐнному гену, считывается и синтезируется РНК небольшого размера, которая прикрепляется к экзону, который необходимо пропустить, и поскольку переносятся компоненты, прикреплѐнные к ряРНП, это вызывает пропуск экзонов, поскольку эти белки связываются с комплексом, осуществляющим сплайсинг, сплайсосомами, находящимися в конце этого экзона пре-мРНК. Таким образом, подобный вид пропуска экзона вызывается не обычными АОН, а ―универсальными‖ белками, которые могут ингибировать сплайсинг всех экзонов. Эффективность использования этого метода была успешно оценена в лабораторных условиях для пропуска экзона 51 в миобластах, выделенных у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Обоснованием этого подхода было значительное сокращение продолжительности процедур регистрации, которые должны проводится в отношении многих, если не всех видов AON, которые используются для методик индукции пропуска экзонов, поскольку новый подход использует ―универсальную‖ основную структуру, к которой присоединяется ДНК последовательность, комплементарная экзону, который необходимо "пропустить". Пропуск нескольких экзонов у собак, страдающих дистрофией. Для лечения многих видов дистрофий Дюшенна, вызванных делециями, дупликациями и точечными мутациями, для восстановления рамки считывания требуется пропуск двух и более экзонов. Поскольку собакам, страдающим дистрофией, требуется пропуск двух экзонов, ожидается, что эти исследования откроют путь к разработке лечения при помощи пропуска нескольких экзонов, при более сложных, для коррекции, мутациях, приводящих к развитию дистрофии Дюшенна. На основании теоретических предположений ожидается, что одновременный пропуск 11 экзонов с 45 по 55 у 63% мальчиков с мышечной дистрофией Дюшенна, связанной с делецией, может перевести заболевание в мышечную дистрофию Беккера, для которой характерно более мягкое течение. Однако, попытки коррекции в течение двух лет указывают на невозможность выключения такого большого количества экзонов одновременно. Проф. Terence Partridge Детского национального медицинского центра Вашингтона с сотрудниками начали работу над методом, позволяющим осуществить пропуск нескольких экзонов у собак-золотистых ретриверов, страдающих дистрофией, GRMD. В противоположность мышам линии mdx с мягкими симптомами дистрофии, у собак развивались физические дефекты, поэтому в экспериментах могли быть получены результаты сходные с результатами клинических исследований с участием пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Использование в качестве моделей собак позволяет проводить многолетние эксперименты, в связи с большей продолжительностью жизни, чем у мышей. У этих собак отмечались мутации в месте сплайсинга экзона 7 гена дистрофина, которая вызывала делецию экзона 7 в мРНК и сдвиг рамки считывания, с быстрым преждевременным достижением стоп-кодона. Пропуск двух, расположенных рядом, экзонов 6 и 8 может восстановить рамку считывания. В первом исследовании местного введения, исследователи вводили различные дозы смеси трех АОН "морфолино", два их которых были направлены против экзона 6, а третий - против экзона 8, в переднюю большеберцовую мышцу молодых взрослых собак GRMD. Через две недели выполнялась биопсия тканей, окружающих место инъекции, которые содержали во всех мышечных волокнах новый и укороченный дистрофины, с почти нормальной структурой. В дополнение к запланированному выключению экзонов 6 и 8, также выключался экзон 9; однако это не приводило к сдвигу рамки считывания. В предварительных экспериментах на культуре ткани, экзоны 6, 8, и 9 пропускались при использовании морфолинов, предназначенных только для экзона 6, но этого не происходило при непосредственном введении морфолинов в мышцы; смесь морфолинов против экзонов 6 и 8 использовалась для пропуска трех экзонов в мышцах живых лабораторных животных. Таким образом, пропуск экзонов в культуре тканей не является полноценной моделью, отражающей состояние мышц лабораторных животных и человека. Исследование системного введения было выполнено совместно с Др. Shin'ichi Takeda в Главном центре лабораторных исследований в Токио, собакам в возрасте трѐх месяцев выполнялось введение трѐх АОН в вены нижних конечностей, что также приводило к пропуску трѐх экзонов 6, 8, и 9. После двух месяцев, большая часть скелетных мышц животных вырабатывала укороченный дистрофин в необходимых количествах, выработка белка носила дозозависимый характер. В миокарде вновь синтезированного дистрофина не выявлялось, что соответствовало данным выполненных ранее исследований о том, что АОН морфолино не проникают в сердечную мышцу. На основании оценки нескольких мышц, физическое состояние собак стабилизировалось на уровне, который был до начала лечения, в то время, как у собак, не получавших лечение, отмечалось значительное ухудшение. Таким образом, создавалось впечатление, что системное введение препарата снижало скорость дегенерации мышц. Оценка структуры мышц проводилась по данным ядерно-магнитно-резонансной томографии (ЯМР). Эта неинвазивная методика показала при оценке мышечной ткани информативность, сходную с биопсией. Это представляет важность для проведения клинических исследований в группе мальчиков, страдающих болезнью Дюшенна, поскольку при их проведении требуется минимизация количества биопсий. Таким образом, АОН морфолино показали эффективность при лечении крупных животных, сходных по морфологическим признакам с человеком. Препараты нетоксичны и не вызывают иммунной реакции. Однако, в связи с нестойким эффектом, препараты требуют повторного введения, также возможен перерыв в терапии при развитии осложнений. Препараты эффективны только в тех тканях, в которых ген дистрофина транскрибируется в пре-мРНК, например, в мышечной ткани. В скором времени ожидается публикация подробностей этих обнадѐживающих результатов. Пропуск экзонов с пептидными нуклеиновыми кислотами. Как сообщалось выше, в клинических исследованиях с участием мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, используется два вида антисмысловых нуклеотидов, которые вызывают пропуск экзонов, 2’O-метилфософоротинатов (2’O-метилы) в Нидерландах и морфолины в Великобритании. Также исследовалась способность индуцировать пропуск экзонов у другой группы АОН, пептид-нуклеиновых кислот (ПНК). Рибонуклеиновые кислоты (РНК) и пептиднуклеиновые кислоты имеют различную основу: основу РНК составляет цепочка чередующихся остатков фосфорной кислоты и рибозы, в то время, как основу ПНК составляет цепочка аминокислот. Ввиду низкой полярности химической связи, -CO-NH-, между аминокислотными остатками, РНП обладают электронейтральными свойствами. Они растворимы в воде, очень химически устойчивы, могут быть легко модифицированы для того, чтобы нести на своей поверхности обычные ДНК и РНК правильной пространственной структуры с любой желаемой последовательностью. Таким образом, в настоящее время в экспериментах с пропуском экзонов используются, короткие антисмысловые цепочки РНК, состоящие из 20 - 30 оснований, такие как два других типа АОН. Др. Matthew Wood и его сотрудники в Оксфордском Университете начали работу с антисмысловой РНК, созданной из субъединиц, кодирующих самую простую аминокислоту, глицин, для пропуска экзона 23 у мышей линии mdx. Эксперименты в клеточной культуре и с использованием введения в отдельные берцовые мышцы молодых и старых живых мышей линии mdx, показали, что через три недели после однократного введения многие мышечные волокна содержали новый дистрофин, который сохранял стабильность в течение восьми недель. Для улучшения поступления в мышечную ткань, ―конъюгированные‖ ПНК прикрепляются к другим пептидам и белкам, таким как синтетические пептиды, содержащие большое количество аргинина, для трансдукции домена TAT протеина ВИЧ , и функционального домена оболочечного белка ААВ. Положительные результаты пропуска экзонов при использовании РНК-конъюгатов могут быть улучшены, по крайней мере, в клеточной культуре, при использовании антисмысловой РНК, основа которой состоит из изменяющихся субъединиц аминокислоты пролина и других аминокислот, которые так же, как и пролин, имели в своѐм составе пятичленный цикл. Результаты этого исследования не опубликованы, поэтому автор не может привести подробности эксперимента. Они поразительны и позволяют надеяться, что использование препаратов с антисмысловыми последовательностями даст эффективный инструмент для индукции пропуска экзонов. Введение гена дистрофина Введение гена дистрофина с использованием вирусных векторов. Введение модифицированного гена дистрофина с использованием аденовирусов (ААВ) в качестве векторов (переносчиков генов) в мышечные клетки является одним из подходов к лечению мышечной дистрофии Дюшенна. Успешные эксперименты на мышах и собаках, страдающих дистрофией, оказали помощь в разработке препарата Biostrophin™ биологической наночастицы компанией Asklepius в Чапел Хилл, Северная Каролина, вектора ААВ, серотипа 2.5 сначала для клинических исследований этого метода генетической терапии. Эти достаточно небольшие вирусные частицы теряют способность к раздражениям в клетке, поскольку большинство их генов удалено. В результате этого освобождается место для последовательностей терапевтического гена, размер которого не должен превышать 5,000 пар оснований. Поэтому, векторы, которые используются в этом исследовании, переносят сконструированный ген дистрофина без интронов (кДНК), включающий отдельные части экзона 17, а все экзоны от 18 до 59 и от 70 до 79 удалены. Трансфекция такого микрогена не приводит к излечению мышечной дистрофии Дюшенна, а только трансформирует заболевание в более доброкачественную форму Беккера с более мягким течением. Ожидаемая длина нового дистрофина, встречающегося при мышечной дистрофии Беккера приблизительно равна трети длины нормального белка. В 1990 году данная форма укороченного дистрофина была выявлена в мышечной ткани у 61-го летнего пациента, страдающего мышечной дистрофией Беккера, который сохранял способность ходить. Результаты использования метода сходны с лечением, основанным на пропуске экзонов, его действие связано с видом мутации: после завершения разработки метода трансфекции гена будет возможно его использование для лечения всех пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. После окончания оценки безопасности и токсичности вектора мини-дистрофина в исследованиях на лабораторных животных, было выполнено двойное-слепое исследование Ia Фазы с участием шести мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, в возрасте старше пяти лет, оно проводилось в 2006 и 2007 году под руководством проф. Jerry Mendell, в Национальном детском медицинском центре и в Государственном университете Огайо в Колумбусе, Огайо. Мальчики получали инъекции препарата в три точки, находящиеся на расстоянии 0.5 см одна от другой, эти точки располагались на бицепсе одной руки, в аналогичную мышцу на другой вводился физиологический раствор. Для каждой группы из трѐх пациентов использовались различные дозы препарата. Образцы мышечной ткани из места введения препарата забирались при проведении биопсии, у четырѐх мальчиков на четвѐртой неделе, а у двух на двенадцатой неделе после введения препарата. Во время проведения исследования нежелательные явления генетической терапии не отмечались, что указывало на хорошую переносимость метода. Все результаты будут опубликованы сразу после их оценки. У мальчиков-участников исследования не ожидалось развития эффекта от лечения во время первого исследования, основной целью работы было доказательство, что этот метод генетической терапии вызывает выработку нового дистрофина в скелетных мышцах не только мышей и собак, но и человека, а его использование не сопровождается развитием недопустимых побочных эффектов, таких как иммунологический ответ на новый мини-дистрофин или компоненты вектора. Для подготовки к следующему шагу были выполнены следующие эксперименты на животных, в которых исследовались условия для проведения первого клинического исследования с внутрисосудистым введением препарата мальчикам, страдающим мышечной дистрофией Дюшенна: предполагалось введение векторов в региональный кровоток нижней конечности, поскольку возможности производства векторов были ограничены, это позволяло избежать их распределения по всему телу у мальчиков, при этом предполагалось, что использование методики сможет увеличить длительность самостоятельного передвижения у пациентов. Однократное введение ААВ вектора 6 или 8 типа, обеспечивающего синтез микро-дистрофина во временно блокированный кровоток нижней конечности мыши линии mdx, приводило к выработке микро-дистрофина в более чем 80% волокон мышц нижней конечности и значительному улучшению их функции, которое отмечалось до одного года. Эти эксперименты повторялись на макаках, морфологическое строение тела которых было сходным со строением тела маленьких детей. Но эти животные не страдали дистрофией, поскольку могли синтезировать собственный дистрофин. Векторы окрашивались зелѐным флуоресцентным белком, это искусственная метка, которая легко определяется по флуоресцирующему свечению. Результаты снова были обнадѐживающими: 60 80% волокон в мышцах нижних конечностей содержали зелѐный флуоресцирующий белок. Получив положительные результаты исследований на мышах и обезьянах, исследователи начали подготовку к так называемым вводным исследованиям или исследованиям Ib Фазы с участием мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, начало которых запланировано на 2008 или 2009 год. Ожидается, что изучаемая методика с введением препарата в региональный кровоток, позволит мальчикам, которые участвуют в исследовании, дольше сохранять способность ходить, чем при отсутствии лечения, что значительно улучшит качество их жизни. Перенос гена при помощи плазмид. Компания Transgune, Страсбург, в сотрудничестве с Французской ассоциацией изучения мышечной дистрофии (AFM), в 1995 году начали изучение переноса гена дистрофина при помощи плазмидных векторов. В то время работа проводилась под руководством Др. Serge Braun, который в настоящее время является Директором по научным исследованиям AFM. Эта методика использовала 79 экзонов ДНК гена дистрофина, его кДНК, и структуры, которые их контролируют, которые включались в генетический материал плазмид. Плазмиды - это небольшие структуры, состоящие из кольцевидной ДНК без белков, депротеинизированной ДНК, находящиеся внутри бактерий; основное значение плазмид — обеспечение резистентности к антибиотикам. После успешных экспериментов с культурами мышечных клеток, на мышах и собаках, страдающих дистрофией, в конце 2000 года было начато первое клиническое исследование с участием 9 пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна и Беккера, в возрасте старше 15 лет, поскольку требовалось подписание пациентами информированного согласия. Раствор, содержащий плазмиды, вводился в одну из мышц предплечья. В мышечных волокнах, расположенных вокруг места введения, отмечалось повышение количества отдельных видов нового дистрофина полной длинны, величина которого составляла до 25%. Не было выявлено признаков развития иммунных реакций ни на плазмидные частицы, ни на вновь образованный дистрофин. Таким образом, в этом исследовании I Фазы была показана безопасность введения гена с депротеинизированной ДНК. После этого, французские учѐные начали совместную работу с группой исследователей Др. Jon Wolff компании Mirus в Мадисон/ Висконсин, который вводил сходные плазмидные конструкции в кровоток отдельных конечностей мышей, крыс, собак и обезьян под давлением. Давление создавалось кратковременным прекращением кровотока в конечности с использованием манжетки медицинского тонометра. Клиническое исследование новых систем доставки с участием пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, будет проведено сразу после создания достаточного количества векторов, содержащих генетический материал, необходимый для синтеза дистрофина; подход с использованием плазмид, содержащих генетический материал, кодирующий синтез дистрофина полной длины, может использоваться у пациентов, для лечения которых невозможно использовать методы, основанные на пропуске экзонов. Введение миогенных клеток. Проф. Jacques Tremblay и его коллеги в Университете Лавал в г. Квебек, Канада, продолжают работать над методиками введения фибробластов, которые называются в настоящее время трансплантацией миогенных клеток. В клиническом исследовании с участием 9 мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, авторам удалось показать, что у 8 пациентов после введения миогенных клеток родственников, отмечалось усиление синтеза нового нормального дистрофина до 26%. Клетки вводились в небольшой участок голени, в область передней большеберцовой мышцы, с небольшим расстоянием между местами введения - 1 - 2 мм. Ожидается, что этот способ введения клеток будет иметь несколько преимуществ, к ним относятся следующие: (1) новый дистрофин будет иметь нормальную длину, а его синтез будет находиться под контролем нормальных последовательностей генов; (2) положительный эффект может отмечаться длительно; (3) эта методика может сочетаться с фармакологическим лечением; и (4), что наиболее важно, метод может использоваться для лечения пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, более старшего возраста. Требуется выполнение около 100 инъекций на квадратный сантиметр области мышцы, впервые методика была опробована на нескольких обезьянах, при этом не было серьѐзных осложнений, после этого метод использовался для лечения пациентов, в возрасте старше 18-ти лет, страдавших мышечной дистрофией Дюшенна. Обоим пациентам выполнялось введение клеток в одну или несколько мышц под местной анестезией. Возраст одного из пациентов на момент проведения лечения составлял 26 лет. Восемнадцать месяцев спустя, при биопсии, в 34% мышечных волокон отмечалась экспрессия дистрофина донорского типа. У этого пациента трансплантация миогенных клеток позволила увеличить вдвое силу мышц, отвечающих за движения в большом пальце (эти мышцы были единственной группой, которая сохраняла способность сокращаться). Однако, поскольку пациенту было известно, что клетки вводятся в эту мышцу, не исключается влияние эффекта плацебо. Возраст второго пациента составлял 18 лет, миогенные клетки вводились только в запястье. Отмечалось небольшое повышение силы мышц через 3, но не через 6 месяцев. Через 6 месяцев у этого пациента не было выявлено мышечных волокон, содержащих дистрофин, однако определялись признаки разрушения клеток. Оба пациента без колебаний выразили согласие продолжить введение препарата в другие мышцы. Группа исследователей Др. Tremblay с коллегами в настоящее время исследуют использование миостатина в комбинации с трансплантацией миогенных клеток, они также разрабатывают методику, повышающую иммунологическую толерантность, позволяющую избежать длительного приѐма иммунодепрессантов. Стволовые клетки Регенерация мышц при использовании дифференцирующихся эмбриональных стволовых клеток. В процессе эмбрионального развития, предшественники скелетных мышц появляются на ранних стадиях в виде сомитов, производных мезодермы, расположенных с обеих сторон от зародышевой нервной трубки. Под влиянием факторов транскрипции (белков, контролирующих активность гена, – в частности Pax3), клетки сомитов дифференцируются (превращаются в более специализированные клетки) с образованием других структур, миотомы, на основании которого развиваются миобласты, мышечные трубочки и мышечные волокна. Если бы было возможно приготовить из сомитов, в которых нет дистрофических изменений, клетки для замены миотомов, их можно было бы размножить и использовать для восстановления пострадавших миоцитов, поскольку они содержат интактный ген дистрофина. Проф. Rita Perlingeiro и еѐ сотрудники, работающие в Северо-западном медицинском центре Техасского университета в Далласе, пытались выделить молодые клетки сомитов из эмбриональных стволовых клеток мыши в клеточной культуре. Они установили, что для того, чтобы получить миогенные (образующих мышцы) клетки, диффиренцирующиеся стволовые клетки нуждаются в факторе транскрипции Pax3, ген которого можно ввести в X-хромосому стволовых клеток с использованием методик генной инженерии. При использовании поточной цитометрии (метод сортировки клеток), исследователям удалось выделить миогенные клетки из эмбриональных стволовых клеток, которые дифференцировались в течение пяти дней под действием Pax3. Клетки с рецепторами PDGF-α, не вырабатывающие рецепторы Flk-1, являются группой клеток, которая дифференцируется в мышечные волокна без риска развития злокачественных опухолей. Группа клеток, обладающих такими свойствами, была получена и использовалась для введения в область передней большеберцовой мышцы и в кровоток у мышей линии mdx. Новый дистрофин определялся в 11 - 16% всех мышечных волокон, что сопровождалось значительным повышением мышечной силы. Поскольку, по данным других исследований генетической терапии у мышей линии mdx, для развития значимого терапевтического эффекта не требуется, чтобы дистрофин содержался во всех волокнах мышечной ткани, клеточная терапия может быть эффективным методом лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Регенерация мышц с использованием мышечных стволовых клеток. Стволовые клетки, которые используются для лечения мышечной дистрофии Дюшенна должны обладать следующими свойствами: (1) Они должны легко выделяться из биологического материала, забранного у человека, например, из мышечной ткани; (2) клетки должны легко размножаться в лабораторных условиях, для получения достаточных количеств для лечения детей; (3) клетки должны быть пригодными для введения в них последовательностей ―здоровых‖ генов дистрофина с использованием вирусных векторов; (4) необходимо, чтобы клетки могли использоваться для системного введения; (5) они должны сохранять способность к миграции из кровотока в мышцы; (6) они должны сохранять способность к размножению мышечной ткани, поражѐнной дистрофией с образованием большого количества миоцитов, содержащих дистрофин и функционирующих миосаттелиоцитов, и (7) их использование не должно сопровождаться развитием серьѐзных побочных эффектов, особенно злокачественными опухолями. Два выделенных типа клеток, которые обладали такими свойствами, являлись зрелыми, а не стволовыми клетками: мезангиобласты и перициты, которые располагались снаружи от стенки сосудов, в мышечной ткани, из которой они могли быть выделены. После получения положительных результатов экспериментов с мезоангиобластами на мышах с недостаточностью белка, α-сакрогликана, проф. Giulio Cossu со своими коллегами в Институте изучения стволовых клеток Клиники Св. Раффаэля в Милане, выделили сходные клетки, перициты, из стенки капилляров (мелких кровеносных сосудов) нормальной и поражѐнной дистрофией мышечной ткани человека, и использовали их для системного введения мышам линии mdx с инактивированной иммунной системой. До введения перицитов, полученных из ткани, поражѐнной дистрофией, они были обработаны вирусными векторами, содержащими гены, кодирующие мини-дистрофины. В обоих случаях большие количества мышечных волокон мышей линии mdx содержали новый дистрофин, и отмечалось функциональное улучшение. В качестве следующего шага к использованию у человека, команда Др. Cossu провела лечение четырѐх собак, страдающих дистрофией, с использованием системного введения стволовых клеток, выделенных из их собственной мышечной ткани (аутологичная трансплантация) в которые был введен ген человеческого микродистрофина, и шести собак с использованием клеток, полученных от здоровых собак (гетерологичная трансплантация) которые содержали нормальный дистрофин, при этом требовалась иммуносупрессия с использованием циклоспорина. Гетерологичная трансплантация была значительно более эффективна, чем аутологичная трансплантация. Одна собака, которой было выполнено введение клеток через катетер, установленный в аорту, достаточно хорошо передвигалась спустя пять месяцев после окончания пятинедельного курса лечения. Выздоровление других собак происходило медленнее. В настоящее время повторяются исследования с использованием аутологичных стволовых клеток собак, содержащих более длинные последовательности гена дистрофина. Выполнено несколько контрольных экспериментов для оценки действия монотерапии циклоспорином, а также влияния миосаттелиоцитов на новые мышечные волокна. В ходе дальнейших длительных исследований, которые также проводились на собаках, и получения клеток с качеством, пригодным для клинического использования, будет начато клиническое исследование I Фазы с участием пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, для оценки безопасности и возможности синтеза, каких-либо видов нового дистрофина. Регенерация мышц при использовании генномодифицированных стволовых клеток с пропуском экзонов. Исследовательская команда проф. Luis García института Généthon в Эври в пригороде Парижа и проф. Yvan Torrente в Лаборатории изучения стволовых клеток Университета Милана, совместно разрабатывали новый метод терапии мышечной дистрофии Дюшенна: они выделили стволовые клетки из мышечной ткани пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, восстановили ген дистрофина с использованием генетического метода, направленного на пропуск экзона, и вводили их мышам линии mdx, при этом отмечалась регенерация мышечных волокон со значительным снижением симптомов дистрофии. Нижеприведѐнные данные являются очень упрощѐнным описанием очень сложной схемы исследования, для выполнения которой требуется большое количество экспериментов для контроля активности и биохимических показателей, а биологических тестов для оценки функции мышц. Источником стволовых клеток, в основном миосаттелиоцитов, был материал, полученный при биопсии у мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, у которых отмечалась делеция экзонов 49 и 50 гена дистрофина. Для своих экспериментов французско-итальянская группа исследователей использовала только около 1% клеток, содержащих на поверхности маркер - белок CD133: ранее было показано, что эти клетки могут замещать миоциты, образуя новые клетки мышечной ткани. CD133+ клетки выращивались в лабораторных условиях в клеточной культуре, после чего при помощи лентивирусного вектора в них вводились гены двух антисмысловых олигорибонуклеотидов, вызывающих пропуск экзона 51 по использованному ранее механизму (который описан на странице 5) генетического пропуска экзона 23 у мышей линии mdx. За двадцать четыре часа до проведения эксперимента, с использованием мышей линии scid/mdx в возрасте двух месяцев, у которых не было дистрофина, и был угнетѐн иммунитет, животные подвергались действию стрессовых факторов виде плавания, для усиления выраженности процессов дегенерации-регенерации. Двадцать четыре мыши получили 20,000 - 40,000 генномодифицированных человеческих стволовых клеток, выделенных у мальчика, страдающего мышечной дистрофией Дюшенна; клетки вводились в виде трѐх инъекций в переднюю большеберцовую мышцу. Шести другим мышам было выполнено системное введение 500,000 таких стволовых клеток в бедренную артерию нижней конечности. На 21 и 45 день после местного и системного введения выполнялись многочисленные оценки этой сложной генной терапии. Результаты указывали на лучшую регенерацию мышц, дистрофин вырабатывался в большем, чем ожидалось, количестве в регенерировавших волокнах без аминокислотных последовательностей, которые определяются экзонами 49, 50 и 51, отмечено также улучшение морфологической структуры мышц, и существенное восстановление мышечной функции. Эта методика основана на прямой индукции пропуска экзонов, как было показано на странице 5, она использует ту же систему U-7, что открывает путь для разработки новой стратегии для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Однако, для того, чтобы планировать проведение клинических исследований, необходимо установить точный механизм пропуска экзонов с использованием лентивирусных векторов, поскольку эти вирусы могут приводить к развитию случайных изменений генетического материала миоцитов, и, возможно, могут разрушать другие гены, или даже быть причиной развития опухолей. Фармакологические подходы Использование стероидных препаратов. На международном конгрессе ActionDuchenne в Лондоне, в ноябре 2007, проф. Adnan Manzur Клиники Хаммерсмит в Лондоне провел обзор современного состояния использования стероидов для лечения, в котором рассматривались только препараты с доказанной эффективностью для восстановления или поддержания функции мышц мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна в течение ограниченного времени. Этот вид лечения рассматривается в настоящее время как ―золотой стандарт‖ и используется для сравнения при разработке других методов лечения. К настоящему времени в различных странах выполнено 47 клинических исследований, но только шесть из них имеют научную значимость, поскольку являются двойными слепыми, а их результаты опубликованы. В большинстве исследований оценивался ежедневный приѐм препаратов, но в отдельных работах изучались другие режимы, например, приѐм препарата в течение 10 дней, с последующим 10 дневным периодом без приѐма препаратов (―10 дней приѐма, 10 дней без приѐма‖), или приѐм препаратов в течение 10 дней подряд в течение каждого месяца. Отдельные наиболее важные результаты приводятся ниже: Первые двойные слепые исследования были выполнены в 1991 Fenichel с соавт. в США с участием 99 мальчиков, которые получали преднизолон в дозе 0.75 мг/кг/сут в течение двух лет. Исследование показало улучшение и стабилизацию силы мышц у мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна в течение около трѐх лет при проведении терапии с соблюдением научно-обоснованного режима. Но у 73% мальчиков развились побочные эффекты, в большинстве случаев - избыточная масса тела. В двойном слепом исследовании, выполненном в Германии Reitter с соавт. в 2000 году, в группе из 100 мальчиков оценивались два стероидных препарата - преднизолон и дефлазакорт. Увеличение массы тела было значительно более выраженным в группе мальчиков, которые получали преднизолон, по сравнению с группой, которая получала дефлазакорт. Но приѐм дефлазакорта сопровождался большей вероятностью развития доброкачественной катаракты (помутнение хрусталика глаза), чем приѐм преднизолона. Результаты исследования опубликованы не полностью. В 2006 Biggar с соавт. в Канаде опубликовали результаты длительного, но открытого исследования с участием 74 мальчиков в возрасте 10 - 18 лет, 40 из которых получали лечение дефлазакортом в дозе 0.9 мг/кг/сут, средняя продолжительность лечения составила 5.5 лет. Через 9,8 лет из наблюдения выбыло 34 мальчика, которые не получали лечения. Из мальчиков, получавших лечение, 81% сохраняли способность к самостоятельному передвижению через 12 лет, 76% через 15 лет и 30% через 18 лет. У мальчиков, получавших лечение, отмечалось лучшее состояние функции дыхания и сердца и меньшая частота развития сколиоза (деформации) позвоночника. King с соавт. в США в 2007 оценили анамнез 143 мальчиков, 75 из которых получали ежедневное лечение, в большинстве случаев, дефлазакортом, в течение в среднем 8 лет, и 68 не получали лечение. Мальчики, получавшие лечение, сохраняли способность к самостоятельному передвижению на 3.3 года дольше и имели значительно меньший риск развития сколиоза по сравнению с пациентами, которые не получали лечения. Но для них был характерен более высокий риск развития переломов конечностей и позвоночника, в связи с развитием остеопороза, по сравнению с мальчиками, не получавшими лечение. Группа исследователей Др. Manzur приводит в своѐм обзоре следующее заключение: длительное использование стероидов преднизона (и сходного с ним преднизолона) и делфазакорта улучшает силу мышц и повышает их функциональные возможности, увеличивая продолжительность способности к самостоятельному передвижению на несколько лет, улучшая дыхание и функцию сердца, снижая риск развития сколиоза и повышая качество жизни. Положительное действие препарата более выражено при раннем начале лечения, приблизительно в течение четырѐх лет с начала заболевания, а также при ежедневном приѐме препаратов. Побочные эффекты, такие как повышенный аппетит, приводящий, если пациент не придерживается диеты, богатой белками со сниженным содержанием жиров и углеводов, к повышению массы тела и развитию кушингоидного (лунообразного) лица, отмечаются уже с начала лечения, особенно, при приѐме преднизолона. Оба препарата замедляют рост и повышают риск развития перелома костей, а также приводят к различным нарушениям поведения. Делфазакорт приводит к развитию отдельных видов доброкачественной катаракты, по поводу которой не требуется проведения особого лечения. Поскольку необходимо проведение дополнительных исследований, Сеть клиник Северная Звезда, объединение 15 центров Великобритании с Сообществом родителей детей, страдающих мышечной дистрофией и ActionDuchenne, планирует оптимизировать и стандартизировать схему лечения стероидами для мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, сохранивших способность к самостоятельному передвижению, создать национальную клиническую базу данных, и способствовать внедрению ежедневной и курсовой терапии стероидами, мальчиков, страдающих болезнью Дюшенна в возрасте от четырѐх лет или даже раньше, с проведением научных и клинических оценок и исследований до, во время и после лечения. TREAT-NMD, Европейская сеть изучения нервно-мышечных заболеваний, опубликовала 8 страниц предварительных рекомендаций по стандартам помощи пациентам, страдающим мышечной дистрофией Дюшенна, в которые включен приѐм кортикостероидов. Этот текст доступен в интернете по адресу www.treatnmd.eu/ soc/eng/dmd/. Клинические исследования с оценкой преднизолона и циклоспорина: клиническое исследование, оценивающее преднизолон и циклоспорин, было выполнено в Германии под руководством проф. Rudolf Korinthenberg, Детская клиника Университета Фрайбурга, и преследовало цель возможного снижения побочных эффектов монотерапии преднизолона. Циклоспорин является препаратом, снижающим выраженность иммунных реакций. Это исследование было начато в 15 немецких клинических центрах в 2004 году, когда половина пациентов получали циклоспорин в дозе 3.5 – 4 мг/кг/сут в комбинации с преднизолоном в дозе 0.75 мг/кг/сут, а другая половина - получала монотерапию той же дозой преднизолона. Каждый пациент получал лечение в течение 15 месяцев. Для правильной оценки результатов численность участников исследования должна была составлять не менее 150 пациентов. Все они были включены в исследование и большинство из них закончили лечение к настоящему времени. В связи с тем, что исследование было двойным слепым, результаты о комбинированном приѐме циклоспорина и преднизолона будут доступны только после окончания анализа данных. Однако, исследование было выполнено качественно, при его проведении не было выявлено выраженных побочных эффектов. Публикация результатов ожидается в 2008 году. Положительная регуляция атрофина для замещения дистрофина. Атрофин - белок, сходный по структуре и функции с дистрофином. У людей ген, кодирующий этот белок, расположен в 6 хромосоме и включает 75 экзонов, его длина составляет около одного миллиона пар оснований. Атрофин встречается во многих тканях тела, в том числе в мышцах, но он располагается в нервно-мышечных, при помощи которых двигательные нервы контактируют с мембраной миоцитов. На 12 неделе эмбрионального развития мышечные мембраны содержат как атрофин, так и дистрофин, а затем атрофин исчезает, и при рождении остаѐтся только дистрофин. Таким образом, атрофин можно рассматривать как фетальную форму дистрофина. У мышей линии mdx, у животных, у которых ген атрофина был угнетен экспериментально, и в мышцах не содержится ни дистрофина, ни атрофина, развиваются симптомы, характерные для мышечной дистрофии Дюшенна, в то время как у ―нормальных‖ мышей линии mdx, отмечается развитие менее выраженных повреждений, несмотря на отсутствие дистрофина. Повышение количества атрофина у мышей линии mdx в три-четыре раза, в связи с использованием генетических технологий, которые не могут быть применены у человека, может предотвратить развитие симптомов дистрофии или значительно уменьшить их выраженность. У пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна атрофин начинает поступать из нервно-мышечных соединений в мышечные мембраны, и чем больше атрофина у пациента, тем длительнее период прикованности к инвалидному креслу. Это означает, что, положительная регуляция гена атрофина может использоваться для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Атрофин встречается в двух сходных формах, но только A-атрофин встречается в небольших количествах в нервно-мышечных соединениях всех миоцитов. Исследователи начали изучение веществ, которые могут использоваться для положительной регуляции гена, отвечающего за синтез A-атрофина, с последующим поступлением этого белка в участки клеточных мембран, в которых он замещает у мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, дистрофин. Работы по изучению и разработке метода лечения были начаты проф. Оксфордского Университета Dame Kay Davies, и в настоящее время продолжаются ей и еѐ сотрудниками в университете совместно с компанией Summit plc, расположенной в близи Оксфорда, которой руководит Др. Jon Tinsley. К окончанию 2007 года будет проведѐн скрининиг более 30,000 химических веществ с целью выявления их пригодности для положительной регуляции активности гена атрофина в культуре тканей мышей линии mdx. Было выделено большое количество действующих веществ, большинство перспективных препаратов в настоящее время дорабатывается и оценивается на живых мышах линии mdx, с целью выделения тех, которые вызывают достаточное повышение количества A-атрофина во всех мышцах животных. Продолжается проведение дополнительных скрининговых тестов с использованием данио <небольшая аквариумная рыбка>, страдающих дистрофией, для выделения препаратов для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Эмбрионы данио очень маленького размера (2-3 мм), легко транспортируются, для их полного развития требуется 24 часа. Их мышечные ткани могут легко просматриваться и анализироваться под микроскопом в поляризованном свете. Патология мышц (изменѐнная структура) у эмбрионов с отсутствием дистрофина сходна со структурой у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. После оптимизации, одно из наиболее активных действующих веществ, SMT C1100, приводит к восстановлению функции мышц мышей линии mdx, вследствие значительного снижения выраженности их дегенерации, фиброза, замещения жировой тканью и хронического воспаления. После ежедневных инъекций в течение 28 дней, побочных эффектов не отмечалось. Если доклинические токсикологические и производственные исследования будут успешными, в 2008 году планируется начало исследований безопасности с участием здоровых добровольцев, с последующим проведением в 2009 году исследований с участием пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Положительная регуляция атрофина с использованием бигликана. Во время разработки белок бигликан был выявлен за пределами миоцитов поперечно-полосатых и сердечных мышц и соединяется с их двумя концами, белками α- и гамма-сакрогликаном, которые являются двумя компонентами дистрофин-белкового комплекса мембран миоцитов. Бигликан является важным участником многих сигнальных и структурных белков мембраны миоцитов. Эксперименты, выполненные проф. Justin Fallon и его сотрудниками в Университете Брауна в г. Провиденс, Род Айленд, на мышах, не страдающих дистрофией, у которых ген бигликана был деактивирован, показали, что при отсутствии бигликана многие белки комплекса дистрофина исчезали. Лечение этих мышей с использованием местного и системного введения рекомбинантного (искусственного) человеческого бигликана приводило к повторному появлению белков β-синтрофина и αдистробревина, что было указанием на восстановление комплекса дистрофина. Наиболее удивительной находкой было то, что использование однократных системных введений человеческого бигликана мышам линии mdx в течение двух-трѐх недель приводило к повышению активности синтеза атрофина приблизительно в 2.5 раза по сравнению с исходным. Через три месяца повторных системных введений, мышцы этих животных, лишѐнные дистрофина, становились более устойчивыми к повреждениям, вызванным растяжением. Поскольку два белка, с которыми связывается бигликан, встречаются только в миоцитах скелетных мышц и миокарда, бигликан действует только на поражение этих типов мышц, поэтому оказывает минимальное побочное действие. Развития иммунных реакций не ожидается, поскольку биглкан встречается у зародышей человека. Несмотря на то, что белок может оказывать действие за пределами миоцитов, при использовании для лечения он не выходит за пределы мембран мышечных клеток. Планируется продолжение исследований на животных для оптимизации условий лечения. После получения бигликана, чистота которого позволит использовать препарат в клинических исследованиях, в течение двух лет могут быть начаты клинические исследования I Фазы. Трансфекция гена атрофина. Проф. George Karpati с сотр. Университета МакГилл, в Монреале, Канада, вводили целый ген атрофина, с использованием аденовирусной векторной системы, в переднюю большеберцовую мышцу новорожденных и взрослых мышей линии mdx. После этого, в 58% волокон в мышцах, в которые вводился препарат у новорожденных мышей и в 35% волокон мышц взрослых мышей, содержался атрофин, который располагался в мембранах вблизи мест, в которых у здоровых животных находится дистрофин. Белки дистрофин-ассоциированного комплекса восстанавливаются на срок до одного года. Новый атрофин в клеточных мембранах предотвращает развитие некроза (дистрофическое повреждение) в мышцах, в которые выполнялись инъекции у новорожденных мышей, и останавливает его в мышцах здоровых мышей линии mdx. Физиологические тесты показали улучшение функции всей мышцы, в которую выполнялась инъекция. Поскольку атрофин встречается в норме в нервно-мышечных соединениях, образование нового атрофина не вызывает иммунного ответа. Однако, повышенное <в ходе лечения> количество атрофина у взрослых, но не у новорожденных мышей, со временем, снижалось. Этот факт указывает на необходимость максимально раннего начала генетического лечения, если его использование у детей будет возможно, у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Транскрипция с игнорированием стоп-кодона PTC124. Приблизительно у 13-15% всех пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, заболевание вызвано нонсенс мутацией гена дистрофина. Этот тип мутации является точечным изменением, которое приводит к появлению стоп-кодона, который преждевременно прерывает синтез мРНК. Такой стоп-кодон приводит к началу синтеза белка до полного считывания гена дистрофина. Неполная молекула дистрофина слишком короткая для того, чтобы белок мог нормально выполнять свою функцию, он разрушается, что лежит в основе развития мышечной дистрофии. PTC Therapeutics, Инк, компания, расположенная в Южном Плейнфильде, Нью-Джерси, которой руководит Др. Langdon Miller – разработала препарат, PTC124, который позволяет системам, осуществляющим биосинтез белка в клетке, считывать генетический материал, игнорируя стоп-кодон мРНК, таким образом, синтезируется белок с нормальной длиной. Этот подход к лечению отличается от генетической терапии с пропуском экзонов. Для того, чтобы выделить мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, у которых терапия PTC124 будет эффективна, необходимо подтвердить наличие мутации, вызывающей преждевременное прекращение синтеза, при генетическом анализе. Более подробное описание нового препарата, включая его молекулярную структуру, было опубликовано с комментариями в журнале Nature в мае 2007. PTC124 - это белый кристаллический порошок, который можно принимать внутрь, смешивая с водой или молоком. PTC124 был открыт с помощью программы автоматизированного скрининга, оценивавшей около 800,000 низкомолекулярных веществ, и выявляет те, под действием которых может происходить пропуск стоп-кодона. Один из наиболее эффективных препаратов, PTC124, был химически модифицирован, после чего активно исследовался в лабораторных условиях. В доклинических исследованиях в культуре мышечной ткани отмечалась выработка дистрофина. У мышей линии mdx со стоп-кодоном в экзоне 23 гена дистрофина, было показано, что PTC124 вызывает выработку дистрофина полной длины, что приводит к снижению выраженности повреждений, связанных с сокращением мышц, и снижает активность креатинкиназы (КК) в крови. Таким образом, PTC124 поможет миоцитам преодолеть одну из генетических причин, приводящих к развитию мышечной дистрофии Дюшенна. PTC124 не считывается с использованием обычного стоп-кодона, у которого есть различные структурные различия по сравнению со стоп-кодоном, прерывающим синтез белка. Исследования токсичности на мышах, крысах и собаках, с использованием высоких доз препарата, показали допустимый профиль, что позволяет продолжить клиническую разработку препарата. Клиническое исследование PTC124 I Фазы было выполнено с участием 61 здорового добровольца в возрасте 18-30-лет, которые получали препарат 3 раза в день в течение 2 недель. При использовании этого лечения сывороточная концентрация препарата поддерживалась на уровне 2 - 10 микрограмм/мл, что по данным исследований на мышах оказывало лечебное действие. Дозы, превышающие 100 мг/кг/сут, хорошо переносились здоровыми взрослыми без развития серьѐзных побочных эффектов. Эта доза была выше, чем планировалось использовать для лечения мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Эти результаты позволили начать клиническое исследование IIa Фазы с участием мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, которое проводилось с декабря 2005 по май 2007, в котором принимало участие 38 мальчиков, в возрасте 5 - 17 лет. Они были репрезентативной группой пациентов, 33 сохраняли способность ходить, 29 получали стероиды, 26 имели стоп-кодон UGA, 6 UAG и 6 UAA между экзонами 6 и 70. В исследовании не оценивался терапевтический эффект препарата. Шесть мальчиков получали PTC в дозе 16 мг/кг/сут, 20 мальчиков 40 мг/кг/сут и 12 мальчиков 80 мг/кг/сут, разделѐнные на 3 приѐма. Клиническая оценка пациентов проводилась в течение 21 дня с начала лечения, затем пациенты получали лечение в течение 28 дней, а в течение последующих 28 дней проводились динамические оценки. Биопсия мышц выполнялась до и после введения препарата в короткий разгибатель пальцев (EDB) стопы, для оценки восстановления продукции дистрофина полной длины. До введения препарата мышечная ткань из биоптата обрабатывалась PTC124 в лабораторных условиях. В образцах тканях, полученных у всех мальчиков, отмечался дозозависимый характер повышения количества дистрофина полной длины. До начала лечения, мышечная ткань, полученная в первых сериях биопсии, обрабатывалась PTC124 в лабораторных условиях. В мышечной ткани всех мальчиков можно было выявить дозозависимое повышение концентрации дистрофина полной длины. Анализ образцов мышечной ткани, полученной при биопсии после лечения, показал у 19 из 38 мальчиков увеличение количества нового дистрофина, который синтезировался в небольшом количестве. Главными причинами, по которым новый дистрофин не выявлялся у всех мальчиков и не выявлялся в больших количествах, чем во время периода лечения, было то, что мышцы EDB были не лучшим материалом для анализа, поскольку для них характерна низкая скорость дегенерации и регенерации. Однако у всех мальчиков отмечалось снижение уровня КК в кровотоке на фоне лечения. Активность КК крови после лечения снова повышалась, как ожидалось при постоянном приѐме препарата. Отдельные родители и учителя отмечали, что через 2 - 4 недели после относительно кратковременного лечения, мальчики были более активными, отмечалось повышение работоспособности, снижение утомляемости по сравнению с состоянием до лечения. Поскольку эти необычные виды действия препарата требуют постоянной динамической оценки, временная динамика этих симптомов оценивается как показатель эффективности препарата. Наблюдались отдельные нежелательные явления, но их нельзя было чѐтко связать с действием PTC124, и они не были клинически значимыми. Для уточнения риска и пользы длительного приѐма PTC124, в настоящее время были начаты длительные рандомизированные контролируемые клинические исследования IIb Фазы. В это исследование будет включено 165 пациентов в возрасте старше 5 лет, которые сохраняют способность ходить (могут пройти ≥75 метров). Мальчики, получавшие кортикостероиды, должны были прекратить приѐм препаратов. Участники исследования были рандомизированы в три группы: приѐм PTC 124 в высокой дозе, приѐм PTC124 в низкой дозе или плацебо. Лечение будет продолжаться в 48 недель. В качестве первичной конечной точки выбрано расстояние, которое мальчики могли пройти в течение 6 минут, сравнивался результат оценки до начала лечения и во время лечения. Кроме того, планируется использование 10 дополнительных вторичных конечных точек. После окончания исследования, все пациенты, включая тех, кто принимал плацебо, будут получать PTC124 в высокой дозе. Для проведения этого исследования был создан международный управляющий комитет, который организует и будет наблюдать за взаимодействием многих клинических центров Европы, Австралии, Израиля, Канады и Соединѐнных Штатов Америки. Членами организационного комитета являются Д-ра Kate Bushby и Thomas Voit, Европейские эксперты по мышечной дистрофии Дюшенна. Исследование начинается в США и вскоре начнѐтся в других странах. Если в этом крупном исследовании IIb Фазы будет показана терапевтическая эффективность препарата, возможна регистрация препарата регуляторными органами: FDA в США и EMEA в Европе. Проект Catalyst - программа использования терапии PTC для исследования и разработки низкомолекулярных препаратов для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Проект Catalyst, под руководством Др. Ellen Welch, был начат в мае 2004 для выделения методом автоматического скрининга тысяч веществ, тех, которые могут снижать или провышать синтез, экспрессию, четырѐх биологических мишеней в мышечных клетках и, таким образом, сохранять и восстанавливать структуру и функцию мышц у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Понижающая регуляция миостатина и повышающая регуляция мышечно-специфичного инсулиноподобного фактора роста ИФР-1 приводит к ускорению роста и регенерации мышц. Повышающая регуляция атрофина и α7-интегрина стабилизирует мембраны миоцитов и, таким образом, улучшает функцию мышц. Метод автоматического скрининга для выявления веществ, которые можно использовать как препараты для лечения мышечной дистрофии Дюшенна, включает новые подходы к оценке, основанные на оценке интенсивности светового излучения от исследуемого белка - фермента светлячков - люциферазы. В настоящее время в лаборатории ведутся работы над веществами, которые обладают отдельными желаемыми свойствами. Кроме того, начата работа над другим белком, Ca2+ АТФазой саркоплазматического ретикулума (SERCA2a), который поможет сохранить сократительную функцию сердца. Эти перспективные препараты будут доработаны, ожидается начало клинических исследований I Фазы с участием мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Ингибирование миостатина: Прежде всего, Миостатин является неактивным белком, содержащим 375 аминокислот, которые синтезируется в миоцитах, а затем поступают в кровоток. Когда часть его структуры, так называемый пропептид, отделяется от белка, миостатин активируется и связывается с белком-рецептором, активином II типа, который находится в мембране миоцита. После связи с рецептором миостатин запускает цепь (каскад) химических реакций, которые вовлекают ядра миоцитов и блокируют гены, участвующие в образовании мышц. Таким образом, миостатин ограничивает рост мышц. Быки Бельгийской голубой породы и уиппеты с генетическими отклонениями обладают большой мышечной массой, поскольку их ген, кодирующий миостатин, инактивируется вследствие мутации. В Берлине в 1999 году был обнаружен мальчик, обладающий большими физическими возможностями, без миостатина, скелетные мышцы которого были почти вдвое больше, чем у нормального ребѐнка. Блокирование миостатина антителами. У взрослых мышей линии mdx с инактивированным геном миостатина, у которых не было дистрофина и которые не могли синтезировать миостатин, было больше нормальных мышечных волокон, отмечалась меньшая выраженность развития фиброза (рубцовой ткани) и большая скорость регенерации мышц, чем у "нормальных" мышей линии mdx, что было показано проф. Kathryn Wagner, в Веллстонском Центре изучения мышечных дистрофий Университета Джона Хопкинса в Балтиморе, и его командой исследователей. Этот и другие случаи, описанные выше, указывают, что понижающая регуляция или блокирование миостатина может стимулировать регенерацию мышечных волокон у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, что может замедлить темп дегенерации и даже привести к увеличению размера мышц. Компания Wyeth Pharmaceuticals в Колледжвилле, близ Филадельфии, совместно с Др. Wagner недавно опубликовали результаты клинического исследования I/II Фазы с оценкой специфических человеческих антител против миостатина, Myo 029, которые используются для системного введения. Исследование проводилось с участием 116 взрослых, страдающих мышечной дистрофией, включая пациентов с мышечной дистрофией Беккера, которым вводился внутривенно MYO-029 в четырѐх дозах от 1 до 30 мг/кг каждые две недели в течение 24 недель, после чего проводилось клиническое наблюдение в течение 12 недель. Целью этого клинического исследования I/II Фазы было оценить безопасность и, отчасти, доказать эффективность. Результаты показали, что MYO-029 безопасен при использовании в исследованных дозировках, и вероятно достигает необходимой цели - повышает мышечную массу у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Беккера. Однако в исследовании продолжительностью 6 месяцев не было показано улучшения функций мышечной ткани. Несколько американских фармацевтических компаний запланировали проведение клинических исследований других ингибиторов миостатинов. Блокирование миостатина его пропептидом. Проф. Keith Foster биологического факультета Лондонского университета и его коллеги использовали стабилизированный пропептид для связывания и инактивации миостатина. Они вводили ген, кодирующий пропептид, включѐнный в состав плазмид (депротеинизированная ДНК) местно в отдельные мышцы мышей, не страдающих дистрофией, или системно с использованием вектора ААВ8 в кровоток. В обоих случаях через десять недель размер мышечных волокон и функциональные показатели мышц повышались на 20 – 30%, преимущественно в "медленных" мышцах. Однако использование сходного лечения в исследованиях на мышах линии mdx не приводило к росту мышц и улучшению их функций. Одновременная вирусная трансфекция пропептида и микро-дистрофина не вызывало как либо улучшений у мышей линии mdx. Но эта комбинация может рассматриваться, как перспективная терапевтическая стратегия, направленная на стимуляцию образования новых волокон и увеличения их в размерах. Вероятно, мышам линии mdx требуется введение более высоких доз, поскольку они вырабатывают больше миостатина, чем мыши, не страдающие дистрофией. Этот вопрос в настоящее время продолжает исследоваться. Повышение мышечной массы и силы с помощью блокирования миостатина фоллистатином. Фоллистатин-344 - гормоноподобный белок, состоящий из 344 аминокислот, который активируется отщеплением 29 аминокислот с карбоксильного конца с образованием фолистатина-315. Фоллистатин-315 с другими сходными белками, фоллистатин-связанный белок(FLRG) и сывороточный белок, связанный с фактором роста и дифференцировки-1 (GASP-1), принимают участие в регуляции активности миостатина, оказывая прямое блокирующее действие на миостатин, его рецептор, а также опосредованно, через ещѐ неизученные механизмы. Асс. Brian Kaspar, сотрудник Национального детского медицинского центра в Государственном университете Огайо в Колумбусе, Огайо, и его коллеги ввели три гена человеческого фолистатина-344, FLRG и GASP-1 при помощи векторов ААВ-1 типа в отдельные мышцы, четырѐхглавую мышцу бедра и переднюю большеберцовую мышцу нормальных мышей и мышей линии mdx. Для сравнения проводилось введение флуоресцентного белка, все остальные условия были прежними. Инъекция 100 миллиардов (10 11) векторов ААВ1 4-х недельным нормальным мышам приводила через 725 дней (почти через 2 года) к повышению массы тела с увеличением мышечной массы не только в месте введения препарата, а также и в других местах, например, трѐхглавых мышцах, что указывало на возможность действия препарата на другие мышцы даже при местном введении. Результаты функционального теста силы захвата указывали на повышение общей мышечной силы у животных. Для оценки этого подхода, более значимого для лечения мальчиков, страдающих дистрофией Дюшенна на поздних стадиях, использовались методики, сходные с теми которые использовались для оценки мышей mdx, которые получали препарат в дозах 10 или 100 миллиардов вирусных частиц. Эти мыши, страдающие дистрофией, получали препарат в возрасте трех недель, с последующей оценкой через пять месяцев, или – и это было очень важно для дальнейшего использования метода для лечения более взрослых пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна – препарат вводился однократно животным в возрасте 210 дней (семь месяцев), когда у животных развивались чѐткие симптомы заболевания, и, после этого оценка проводилась при достижении животными возраста 560 дней (около 1½ лет). Через 60 дней после введения отмечалось повышение мышечной массы, которое сохранялось до окончания исследования. В этих исследованиях не было проблем, связанных с использованием вирусного материала или белковых препаратов, фоллистатина или комбинации данных терапевтических подходов. Полученным результатом было повышение размера мышечных волокон, снижение активности воспаления и фиброза по сравнению с контрольной группой мышей линии mdx. Проф. Kaspar и его группа исследователей закончили свою публикацию словами: ―Поразительная способность фоллистатина обеспечивать рост и стойкое улучшение функций мышц, поражѐнных при дистрофии, у взрослых животных необходимо принимать во внимание при разработке методов лечения заболеваний опорно-двигательной системы, в том числе и возрастных пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна‖. Блокирование ТФР-β. Трансформирующий фактор роста бета (ТФР-β) является белком, блокирующим миосаттелиоциты (миогенные стволовые клетеки) регенерирующей мышечной ткани. У мышей линии mdx и мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, встречаются повышенные количества ТФР-β, что приводит к развитию фиброза (рубцовой ткани), в связи с избыточным ростом соединительной ткани и еѐ отложением между мышцами, взамен разрушенных мышечных волокон. В норме соединительная ткань связывает мышечные волокна, но при патологическом увеличении еѐ количества отмечается ригидность мышц и образование контрактур. Соединительная ткань состоит преимущественно из белка коллагена, обладающего низкой эластичностью, который вырабатывается фибробластами. Таким образом, блокирование ТФР-β при помощи препаратов может снизить выраженность фиброза. Проф. Andrew Hoey Университета Южного Квинсленда в Тувумба, Австралия, с сотрудниками оценивали пирфенидон, препарат, зарегистрированный для лечения лѐгочного фиброза. Препарат вводился мышам линии mdx в возрасте восьми месяцев, и через семь месяцев лечения было показано снижение уровней ТФР-β и восстановление функции сердца почти до нормального уровня, но выраженность фиброза у этих животных линии mdx не снижалась. Запланирована оценка эффективности препарата у животных более молодого возраста. Лозартан и ТФР-β. Группа исследователей, Др. Ronald Cohn и его сотрудники из Медицинского института Университета Джона Хопкинса, Балтимор, попытались изменить течение заболевания, блокируя ТФР-β и механизмы развития фиброза с его участием. Они начали работу с мышами линии mdx более старшего возраста с более распространѐнными формами дистрофии, чем у молодых животных. Введение кардиотоксина змеиного яда в изолированные мышцы, не поражѐнные дистрофией, вызывало их повреждение; для регенерации требовалось от двух до трѐх недель. У мышей линии mdx регенерация была существенно нарушена. Лечение мышей линии mdx с использованием антител к ТФР-β снижает время регенерации. Поскольку эти антитела недоступны в продаже, ученые начали исследование с использованием Лозартана, зарегистрированного антигипертензивного препарата, обладающего сходным действием в связи с блокадой рецепторов ангиотензина II, который играет роль в снижении активности механизмов, запускаемых ТФР-β. Исследователями было показано, что лечение трѐхмесячных мышей, с использованием Лозартана в течение более одного года, приводило к снижению выраженности многих симптомов дистрофии, например фиброза мышц и развития общей слабости в тестах, оценивающих мышечную силу. Лечение не приводило к выздоровлению мышей, а только снижало выраженность слабости. Таким образом, назначение Лозартана пациентам, страдающим мышечной дистрофией Дюшенна, может сопровождаться эффектами, сходными с теми, что отмечались у мышей, и может использоваться и терапевтический подход, наряду с другими методами лечения, которые снижают выраженность симптомов без влияния на генетические причины, приводящие к развитию заболевания. Др. Cohn и его команда исследователей в настоящее время занимаются подготовкой двойного слепого клинического исследования Лозартана. В исследовании примут участие около 100 мальчиков в возрасте от 5 до 15 лет, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, которые могут самостоятельно передвигаться. Половина участников будет получать лечение Лозартаном в течение одного года. Другая половина будет получать плацебо в течение шести месяцев, после чего, в течение последующих шести месяцев они также будут получать лечение Лозартаном. Все мальчики в обеих группах должны продолжать принимать стероиды, если они принимали их регулярно до начала исследования. В качестве первичной конечной точки, на основании которой оценивалась эффективность лечения, было выбрано время, которое требуется для прохождения дистанции в 30 футов (около 10 метров). Изменения качества жизни и дыхательной функции использовались как вторичные конечные точки. Исследователи надеялись начать исследование в 2008 году. Получение результатов запланировано через два года после начала исследования. Если по результатам исследования будет показана терапевтическая эффективность препарата, он будет рекомендован для приѐма. Однако, важно, что до того, как препарат будет рекомендован, родители не должны давать Лозартан своим больным сыновьям, но должны продолжать лечение, включая приѐм стероидных препаратов и дополнительные методы, которые обеспечат максимально длительную сохранность физического состояния пациентов. Препараты, блокирующие воспаление. Деградация и гибель мышечных клеток при мышечной дистрофии приводит к инфильтрации мышечной ткани клетками воспаления для очистки от клеточного детрита. Стероиды могут снижать активность воспалительных процессов, в связи с этим преднизон, его активная форма преднизолон, и сходный с ним дефлазакорт, могут повышать мышечную массу и снижать выраженность иммунного ответа, однако, их приѐм часто сопровождается развитием серьезных побочных эффектов. Проф. Melissa Spencer Калифорнийского университета Лос-Анджелеса изучала возможные пути замены стероидов другими препаратами, снижающими активность воспаления и иммунного ответа, без характерных побочных эффектов. В исследованиях была показана роль отдельных клеток иммунной системы в прогрессировании заболевания. Они вырабатывают цитокины, молекулы, усиливающие воспаление и развитие фиброза у мышей линии mdx, и пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. У здоровых лиц это нормальное течение заживления ран, процессы усиливают прочность ткани и ускоряют выздоровление. У мальчиков с мышечной дистрофией Дюшенна, процесс заживления ран не прекращается, и мышечная ткань непрерывно находится в состоянии заживающей раны. На основании этого предполагается, что подавление клеток иммунной системы и активных цитокинов может замедлить разрушение и фиброз мышц, вовлечѐнных в дистрофический процесс. Существует большое количество противовоспалительных препаратов, разрешѐнных к использованию FDA, которые могут быть эффективны для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Исследование препаратов для лечения мышечной дистрофии Дюшенна, разрешѐнных FDA для проведения клинических исследований, позволяет снизить затраты времени по сравнению с разработкой новых препаратов. Четыре из них, используемые при других заболеваниях, оценивались Др. Spencer для лечения мышей линии mdx в лабораторных условиях: Галектин-1, Ремикад®, и Энбрел®, все препараты были предназначены для лечения ревматоидного артрита, и гликолипиды Anti-asialo GM1, антитела, которые используются для лечения болезни Паркинсона. Остеопонтин является белком, выполняющим разнообразные функции в костной ткани, регуляцию иммунных процессов, поддержание жизнеспособности клеток, при воспалении и метастазах опухолей. У мышей линии mdx отмечается повышение вещества, как в крови, так и в мышечной ткани. Др. Spencer et al. оценивали остеопонтин, как возможную мишень для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Для мышей линии mdx без остеопонтина была характерна большая мышечная сила, более низкие активности КК, снижение активности фиброза. В настоящее время продолжаются работы по поиску препарата для подавления активности остеопонтина у мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, который может использоваться для лечения пациентов. Идебенон. Отсутствие дистрофина не только снижает прочность клеточных мембран, но и оказывает отрицательное влияние на митохондрии миоцитов у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Эти ―энергетические станции‖, универсальный источник энергии, аденозинтрифосфат (АТФ), клетки вырабатывают при помощи окислительного фосфорилирования. Синтетическое вещество, Идебенон, разработанный компанией Santhera Pharmaceuticals в Листале, близ Базеля, под руководством Др. Thomas Meier, директора по науке, является производным естественного фермента Q10. Идебенон не только является мощным антиоксидантом, но, что более важно, усиливает выработку энергии в клетке. Более того, молекула Идебенона была изменена химическим путѐм, что позволило ей поступать в клетки, включая миоциты. Эффективность Идебенона была впервые показана в исследованиях с участием пациентов, страдающих атаксией Фридрейха. Было показано улучшение неврологических функций при назначении Идебенона пациентам, страдающим этим заболеванием. Кроме того, Идебенон снижал выраженность гипертрофической кардиомиопатии (увеличения сердца), которая является жизнеугрожающим осложнением этого нервномышечного заболевания. Позднее, учѐные университета Лѐвена в Бельгии, под руководством проф. Gunnar Buyse в сотрудничестве с Santhera, начали изучение эффективности Идебенона при мышечной дистрофии Дюшенна. Во-первых, они использовали препарат для лечения мышей линии mdx с дефицитом дистрофина в течение 10 месяцев – лечение начиналось сразу после рождения и продолжалось до достижения взрослого возраста - животные получали Идебенон или плацебо в рамках двойного слепого исследования. В этом исследовании отмечалось значительное снижение выраженности дисфункции миокарда у этих мышей, страдающих дистрофией. В частности, летальность при экспериментальной нагрузке на миокард, снизилась с 58% до 19%. Кроме того, на фоне приѐма Идебенона отмечалось значительное повышение времени бега в колесе (интегративный тест для оценки функции мышц) у мышей линии mdx. Ожидается публикация научного сообщения по результатам этого нового и обнадѐживающего исследования. Эти результаты побудили исследователей начать двойное слепое, плацебо-контролируемого клиническое исследование II Фазы с участием 21 мальчиков, страдавших мышечной дистрофией Дюшенна, в возрасте от 8 до 16 лет, которое проводилось в Университете Лѐвена под руководством проф. Gunnar Buyse. Тринадцать мальчиков получали лечение в течение 12 месяцев, суточная доза препарата составила 450 мг, в таблетках по 150 мг, восемь пациентов получали плацебо. Основной целью этого исследования было определение влияния Идебенона на функцию миокарда, которое оценивалось на основании изменения пиковой систолической радиальной деформации нижнебоковой стенки левого желудочка, области сердца, которая наиболее рано и сильно поражается при мышечной дистрофии Дюшенна. У пациентов, которые получали Идебенон, отмечалось улучшение функций сердца по сравнению с плацебо. В качестве вторичных конечных точек использовались оценки дыхательной функции. У пациентов, получавших лечение Идебеноном в течение 52-х недельного периода исследования, отмечалось значительное увеличение пиковой скорости выдоха, в то время, как у пациентов, получавших плацебо, продолжалось ухудшение состояния. Эти доказательства улучшения функций сердечной и дыхательной системы на фоне приѐма Идебенона приобретают особую значимость, поскольку эти нарушения являются серьѐзными осложнениями у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Результаты этого исследования будут представлены в ближайшее время на медицинской сессии ежегодного конгресса Американской Академии неврологии в 2008 году. Следовательно, это первые данные, указывающие на эффективность Идебенона для лечения нарушений функций дыхательной и сердечной системы у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Эти результаты являются базой для планирования других исследований клинического применения Идебенона. После получения таких положительных результатов, Santhera приняла решение продолжать изучение Идебенона, который за эффективность при лечении мышечной дистрофии Дюшенна получил статус орфанного препарата. К сожалению, антиоксиданты, витамины E и C, не показали своей эффективности. Однако они могли повышать уровень двух ферментов, супероксиддисмутазы и каталазы. Фактически, в лабораторных исследованиях было показано, что введение этих ферментов в изолированные сердца мышей линии mdx, блокирует оксидативный стресс, нейтрализуя избыток свободных радикалов. Поэтому, проф. Joe McCord Университета Колорадо, вместе с компанией Life Vantage Corp. Денвер, разработали природный препарат Протандим® для снижения выраженности оксидативного стресса, через повышение активности этих двух атиоксидантных ферментов. Протандин содержит экстракты пяти видов растений: Bacopa monnieri <Бакопа монье>, Silibum marianum <Расторопша пятнистая> или марьин чертополох, Withania somnifera<Ашваганда>, Curcuma longa <Куркума длинная> которая используется для приготовления пряности - куркумы, и Camellia sinensis или зелѐного чая. В клиническом исследовании, выполненном в 2006, принимали участие 29 пациентов, в возрасте 20-78 лет, которые получали препарат в течение 120 дней. После окончания исследования было получено два наиболее важных результата, что активность супероксиддисмутазы повышалась в среднем на 30%, а активность каталазы - на 54%, и значительное угнетение перекисного окисления липидов. Недавно было показано действие Протандима через индукцию элементов антиоксидантного ответа (ARE), генетического механизма, который не только контролирует выработку супероксиддисмутазы и каталазы в организме, но и увеличивает почти вдвое, в сравнении с другими важными ферментами-антиоксидантов. Более того, пять растительных лекарственных веществ, входящих в состав Протандима, действуют совместно, обеспечивая большую эффективность, по сравнению с использованием по отдельности. Протандим для коррекции оксидативного стресса: источником энергии в клетках служит аденозинтрифосфат, АТФ, вещество, в том числе, необходимое для мышечного сокращения. АТФ синтезируется многочисленными митохондриями, расположенными внутри клеток. Их размеры сходны с размером бактерий, они используют кислород для синтеза богатого энергией вещества АТФ, в реакциях оксидативного фосфорилирования. Но около 1-2% потребляемого кислорода превращается в чрезвычайно активные супероксидные свободные радикалы. Нормальные клетки защищаются от этих токсических продуктов с помощью двух ферментов: суперооксиддисмутазы, СОД, которая превращает свободные радикалы в перекись водорода, и каталазы, которая превращает перекись водорода в воду и кислород. В мышечных клетках, лишѐнных дистрофина, вырабатывается большее количество супероксидных радикалов, они вызывают оксидативный стресс, что способствует дегенерации мышечных волокон, поскольку эти два фермента не способны блокировать избыток радикалов достаточно быстро, чтобы они не успели запустить процессы хронического воспаления, фиброза, перекисного окисления липидов, вызвать замедление регенерации мышечной ткани, что может быть симптомами мышечной дистрофии Дюшенна, начиная с трѐхлетнего возраста. При лечении мышечной дистрофии Дюшенна требуется купировать эти процессы в этом возрасте и даже раньше. Блокирование NFκB. В Университете Стилл в Кирсквилле, Миссури, проф. George Carlson и его сотрудники разработали метод оценки кальциевого тока в изолированных волокнах, сильно поражѐнных дистрофическим процессом, взятых из поперечной мышцы груди (TS) мышей линии mdx, для того, чтобы установить, влияет ли повышенный кальциевый ток на симптомы дистрофии. Однако полученные ими результаты указывают, что кальциевый ток в этих повреждѐнных волокнах был не выше, чем в нормальных волокнах, находящихся в таких же условиях. Исследователями были получены данные о том, что пассивное растяжение активирует NFκB (произносится NFkappaB) сигнальный путь в мышцах, команда под руководством Др. Carlson попыталась изучить связь этой активации с повреждением TS мышцы при дистрофии. Белок NFκB встречается в цитоплазме всех клеток, но в большинстве из них он инактивирован другим белком, ингибитором κB (IκB). Воспалительные процессы, направленные на борьбу с инфекцией и дегенерацией клеток, активируют патологический путь FκB, и это приводит к повышению регуляции сигнальных каскадов (цепи реакции) многих генов, которые кодируют белки - факторы воспаления. Эти факторы блокируют воспаление, когда необходимость в нѐм исчезает. Однако, если понижающая регуляция этих факторов блокируются вследствие генетической мутации или в состоянии стресса, воспаление продолжается, что может приводить к развитию хронических заболеваний, таких как атеросклероз, фиброз лѐгких, бронхиальная астма, ревматический артрит, и, возможно, мышечная дистрофия Дюшенна. Существует большое количество препаратов, которые могут блокировать активацию NFκB в начале сигнального каскада. Одним из этих препаратов является пирролидин дитиокарбамат. Др. Carlson с сотрудниками оценивали действие препарата на изолированных волокнах TS мышц мышей линии mdx и выявили, что их диаметр повышался, а их функция значительно улучшалась. Есть и другие препараты, которые блокируют NFκB, что уже показало эффективность в лечении других заболеваний. Одним из них является сульфасалазин. Этот препарат, наряду с другими, оценивается в доклинических исследованиях для получения информации, которая будет использована при проведении клинических исследований препаратов. Блокирование ФНО -α. Поскольку мембраны миоцитов у мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, не стабилизируются дистрофин-протеиновым комплексом, они легко повреждаются механически при мышечном сокращении. Фактор некроза опухоли α (α-ФНО) является белком, усиливающим повреждение мышц при дистрофии, стимулируя воспаление, которое приводит к некрозу (разрушению) мышечных волокон даже без повреждения мышечной ткани. Таким образом, ожидается, что блокирование α-ФНО снизит выраженность дегенерации на фоне отсутствия дистрофина. Проф. Miranda Grounds и еѐ сотрудники из Университета Западной Австралии, Перте, использовали антитела, cV1q, блокирующие α-ФНО в длительном исследовании на мышах линии mdx. У мышей линии mdx более старшего возраста доля некротизированных мышечных волокон составляла около 5%, и эта доля не должна была снижаться при помощи лечения антител, связывающих α-ФНО. Исследователи предоставили мышам свободную возможность бегать в колесе, что привело к удвоению некротических мышечных волокон. Продолжительное лечение антителами в течение до трѐх месяцев, во время свободного доступа мышей к колесу, предотвращало развитие повреждений, вызванных физической нагрузкой. Следовательно, блокада α-ФНО снижает выраженность повреждения мышц, а также активность КК, повышение которой выявляется у мышей линии mdx при физической нагрузке. Кроме того, мыши, получавшие лечение cV1q, имевшие возможность самостоятельно регулировать объѐм физической нагрузки, могли бегать значительно дольше, чем животные, не получавшие лечение, что указывало на их лучшее самочувствие и улучшение функции мышц. Необходимо проведение клинических исследований подобных антител и других препаратов, блокирующих α-ФНО. Повышающая регуляция ИФР-1. Инсулиноподобный фактор роста (ИФР-1) - это белок, состоящий из 70 аминокислот, которые выстроены в одну цепочку с тремя стабилизирующими мостиками, и имеющим, таким образом, форму, сходную с инсулином. Он существует в большом количестве форм, незначительно отличающихся по структуре. Одна из них, называемая также изоформой, ИФР-1A, положительно влияет на мышечную ткань, поскольку стимулирует рост и повышает мышечную силу, что представляет интерес для использования препарата при лечении детей, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Команда исследователей проф. Elisabeth Barton из Университета Пенсильвании проводили исследование на генномодифицированных мышах линии mdx, в мышцах которых в течение всей жизни вырабатывались повышенные количества ИФР-1. Эти мыши mdx-ИФР-плюс характеризовались более активным ростом мышц, которые выглядели как здоровые, и меньшей скоростью развития фиброза по сравнению с ―нормальными‖ мышами линии mdx. Но, поскольку этот фактор роста оказывает влияние на различные процессы за пределами миоцитов, при использовании препарата в высоких дозах, необходимых для оптимального действия на мышечную ткань, не исключается развитие потенциально серьѐзных побочных эффектов. Поэтому, ИФР-1 объединяется с одним из связывающих белков (ИФРBP3) с образованием комплекса IPLEX™, который зарегистрирован, как препарат, стабилизирующий ИФР-1 в крови, и высвобождение вещества происходит только, когда в нѐм возникает необходимость. Первое клиническое исследование IPLEX было выполнено в Университете Рочестера с участием 15 взрослых пациентов, страдающих миотонической дистрофией. Использование этой стратегии может рассматриваться как эффективный способ доставки ИФР-1 в мышцы, без развития побочных эффектов в других тканях. Другим способом достижения высоких концентраций ИФР-1 в мышечной ткани, является введение гена, кодирующего данный фактор с использованием векторов ААВ, что приводит к выработке ИФР-1. В лаборатории Др. Barton, в которой исследовался данный подход, были достигнуты успехи в повышении уровня наиболее активной изоформы ИФР-1A в 30 – 40 раз после внутримышечного введения этого вектора. Вновь синтезированный ИФР-1 находился в мышечной ткани, что вызывало гипертрофию (увеличение мышечных волокон), но позволяло избежать развития побочных эффектов, вызванных активацией других тканей. Требуется несколько лет для того, чтобы получить возможность использовать подобный подход с использованием вирусной терапии у мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. β-агонисты. β-агонисты являются гормоноподобными веществами, которые связываются со специфическими белками-рецепторами, находящимися на наружной поверхности клеточной мембраны, что запускает цепь биохимических реакций, β-адренергический сигнальный путь или каскад, который передаѐт сигнал на биологические мишени, расположенные внутри клетки, что имеет значение для контроля синтеза и разрушения белка. Отдельные β-агонисты разрешены к использованию в качестве бронходилататоров, препаратов, расслабляющих мышцы дыхательных путей у пациентов, страдающих астмой, или используются в качестве анаболических средств, повышающих размер и силу мышц, которые иногда нелегально применяются атлетами (―допинг‖). В лаборатории проф. Gordon Lynch, Университет Мельбурна, β-агонист формотерол показал превосходные результаты, как препарат, способный замедлять снижение количества мышечной ткани у взрослых крыс, отмечена возможность использования препарата для лечения пожилых людей. Положительные результаты указывают, что такие препараты ―для борьбы со старением‖ могут использоваться, как препарат для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Небольшое клиническое исследование с участием пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна и дистрофией Беккера, фактически уже было выполнено. Участники исследования в течение 28 недель получали лечение альбутеролом (8 мг/ сут), другим β-агонистом, зарегистрированным для использования при лечении бронхиальной астмы. Эта низкая доза была выбрана по результатам другого однолетнего исследования с участием пациентов, страдающих FSH (лице-лопаточно-плечевой) дистрофией (другое мышечное заболевание), в котором было показано, что альбутерол, в дозе 16 и 32 мг/сут, приводил к недопустимым нарушениям со стороны сердца, например, развитию трепетаний. Сниженная доза препарата в исследовании с участием пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна и Беккера, не приводила к развитию побочных эффектов, но вызывала лишь небольшое увеличение мышечной силы, которой было недостаточно для эффективного лечения снижения объѐма и силы мышц. Для подготовки другого клинического исследования с более мощным β-агонистом, проф. Lynch с коллегами лечили мышей линии mdx очень низкими (клинически значимыми) дозами формотерола (25 мкг/кг). Эта низкая доза препарата увеличивала размер "быстрых" и "медленных" мышц мышей линии mdx и, что представляет важность, не приводила к более быстрому развитию усталости мышц. Влияние на размеры сердца также снижалось при приѐме низких доз препарата. Поскольку увеличение сердца не является необходимым эффектом лечения у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, необходимо избегать действия этих препаратов на сердце, сохранив положительное действие на скелетные мышцы. Разделение этих двух эффектов является важным научным вопросом, над которым работает проф. Lynch, исследующий этот препарат. Другой побочный эффект понижающая регуляция рецепторов β-агонистов мембран миоцитов, что снижает действие препарата на скелетные мышцы, и требует решения этого вопроса до начала клинических исследований длительного использования препарата для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. BBIC-ингибирующие протеазы. Разрушение мышечной ткани при мышечной дистрофии Дюшенна, происходит под действием нескольких различных протеаз (ферментов, разрушающих белки) среди которых фермент кальпаин и большой белковый комплекс, который называется протеасома. При мышечной дистрофии Дюшенна, мембраны миоцитов становятся более проницаемыми, что позволяет ионам (изменѐнным атомам) кальция проникать в клетки и активировать кальпаин, а также протеасомы. Исследователи предприняли попытку предотвратить активацию кальпаина и других протеаз, и, таким образом, замедлить разрушение миоцитов. Проф. Lee Sweeney и его сотрудники Университета Пенсильвании, Филадельфия, исследовали один их ингибиторов протеазы, концентрат ингибитора Боумана-Бирка, (BBIC), природного белка, состоящего из 71 аминокислот, выделенного из соевых бобов. Это водорастворимое вещество, которое можно принимать внутрь. Поскольку его молекула слишком велика, чтобы проникать в мышечные клетки, оно блокирует отдельные протеазы, такие, как пищеварительные ферменты, трипсин и химотрипсин, находящиеся за пределами клетки, и могут вызывать развитие воспаления при мышечной дистрофии Дюшенна. Длительный приѐм BBIC повышал силу и массу мышц у мышей линии mdx. Также отмечается снижение активности КК и выраженности фиброза. При использовании по другим показаниям, у пациентов, страдающих раком, BBIC показал себя, как наиболее безопасный. В настоящее время продолжается подготовка клинического исследования I Фазы совместно с Др. Kenneth Fishbeck из Национального института здравоохранения (NIH), Вифезда, близ Вашингтона. Если результаты исследования будут сходны с полученными в исследованиях на мышах линии mdx, это будет указывать на способность препарата замедлять разрушение мышц. Соевые бобы содержат также другие протеазы, что требует выделения и очистки BBIC. Употребление бобов в пищу не оказывает эффекта. GAMT и AGAT. Несмотря на то, что в мышцах мышей линии mdx нет дистрофина, у них не встречается клинических симптомов, сходных по тяжести с проявлениями мышечной дистрофии Дюшенна. Проф. Brian Tseng, работавший ранее в Университете Колорадо в Денвере, а в настоящее время в Гарвардской Массачусетской многопрофильной клинике в Бостоне, и его команда продолжают исследовать способы замедления прогрессирования мышечной дистрофии. Исследователи использовали скрининговые методики для выявления ―модифицирующих‖ генов, которые находятся в активизированном состоянии у мышей линии mdx и обладают сниженной активностью у мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Они выделили два таких гена, которые кодируют ферменты аргинин:глицин амидотрансфераза, AGAT, и гуанидиноацетатметилтрансферазу, GAMT. Оба фермента играют важную роль в синтезе креатина, который является биологическим источником энергии миоцитов скелетных мышц. В отличие от мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, у мышей линии mdx возможна положительная регуляция обоих ферментов, что приводит к синтезу собственного креатина в мышечных клетках. Было показано, что у мальчиков с мышечной дистрофией Дюшенна количество креатина составляет только 20% от количества вещества в нормальных мышцах. В противоположность этому, у мышей линии mdx концентрация креатина в мышцах составляет 80-90% от концентрации вещества в мышцах здоровой контрольной группы. Была создана линия мышей mdx с инактивацией гена, кодирующего GAMT. Эти мыши плохо передвигались, рано погибали, их мышцы выглядели более повреждѐнными, также как и мышцы мальчиков с мышечной дистрофией Дюшенна. В настоящее время, сотрудники лаборатории Др. Tseng работают над выведением мышей линии mdx, у которой блокирован другой фермент, AGAT, который также может быть сильно повреждѐн. Они исследовали, каким образом отсутствие белка дистрофина оказывает влияние на транспорт креатина из кровотока в миоциты, механизм, который может увеличить скорость прогрессирования мышечной дистрофии. Эти нарушения работы транспортных систем креатина невозможно эффективно лечить с использованием только увеличения содержания вещества в пище. Группа исследователей Др. Tseng также изучала два гена GAMT и AGAT у мальчиков и мужчин, страдающих атипичными мышечными дистрофиями, у которых не было дистрофина, но симптомы были сходны с мышечной дистрофией Беккера или сохранялась нормальная сила мышц. Использование производительного скринингового метода, позволило выделить вещества, зарегистрированные препараты, или ―пищевые добавки‖ (дополнения к рациону, обладающие физиологическим действием), которые могут вызывать повышающую регуляцию ―модификатора‖ генов GAMT и AGAT у мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Они могут уменьшить тяжѐлые симптомы, сделав их сходными с нарушениями у мышей линии mdx и выиграть время в условиях разработки ―реального лечения‖. L-аргинин и nNOS <синтаза оксида азота>. Другим следствием отсутствия дистрофина является снижение количества одного из важных компонентов дистрофин-гликопротеидного комплекса, фермента - нейрональной синтазы оксида азота (nNOS). Этот фермент вырабатывает оксид азота (NO) из аминокислоты L-аргинина. Несмотря на то, что NO является газом, он действует как гормон, который, кроме прочего расширяет кровеносные сосуды, что является важным для нормального кровоснабжения и поступления энергии в мышцы. При отсутствии nNOS, в сердце мышей линии mdx и пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, развивается фиброз миокарда. Проф. Andrew Hoey и его сотрудники в Университете Южного Квинсленда в Австралии назначали L-аргинин ежедневно в течение 6 месяцев мышам линии mdx в возрасте 6 месяцев. Это сопровождалось снижением выраженности фиброза миокарда, повышением скорости коронарного кровотока, и улучшало функцию сердца. В продолжающихся экспериментах проводится исследование этого эффекта L-аргинина, что необходимо для того, чтобы решить, может ли L-аргинин использоваться как препарат для лечения мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. О современном состоянии проблемы и перспективах еѐ развития. Как и было сказано в начале, автор подготовил этот и предыдущие сообщения по результатам исследований для вас, мальчики и юноши, страдающие мышечной дистрофией Дюшенна, а также ваших близких, для того, чтобы дать вам информацию о том, что делается для того, чтобы остановить развитие заболевания или, в конечном счѐте избавиться от него. При написании выводов было отобрано 33 исследовательских проекта, которые, по мнению автора, были наиболее важными работами учѐных различных стран, которые пытаются найти эффективное и безопасное средство для прекращения или замедления развития нарушения функции ваших мышц. "Плохие" и "хорошие" мутации. Мышечная дистрофия Дюшенна не является заболеванием, открытым недавно, как СПИД, поскольку она встречается у мышей, крыс, кошек и собак, и, возможно, у всех животных, у которых есть мышцы. Следовательно, оно возникло задолго до того, как мы стали отличаться от наших предков - животных. Это позволяет рассматривать заболевание, как случайность, побочный эффект эволюции. Если бы не было мутаций, случайных изменений генетической информации, не было бы ни нас, ни жизни на земле. Некоторые из мутаций являются ―хорошими‖, поскольку улучшают жизнь, но они могут быть ―плохими‖ и опасными, являться причинами смерти или вызывать развитие заболевания до или после рождения. Мутация, которая вызывает мышечную дистрофию Дюшенна, не является наказанием для вас или кого-то ещѐ, она просто произошла. Это не место для религиозных рассуждений, которые в первую очередь приходят на ум. Позвольте мне высказать одну мысль: Природа действует вслепую, она не видит своих жертв, с другой стороны, мы должны помнить о хороших мутациях, которые компенсируют этот побочный эффект эволюции. Научные исследования. Если вы прочитали сообщение полностью, вы можете заключить, что многие учѐные и их команды исследователей делают всѐ для того, чтобы максимально быстро разработать методы лечения. В 1986/87, когда были открыты ген и белок дистрофина, мы все думали, что скоро удастся найти правильный подход для того, чтобы исправить молекулярно-генетическую причину заболевания. Но в настоящее время, более 20 лет спустя, мы продолжаем ждать, что появиться метод радикального или, по меньшей мере, симптоматического лечения, который сможет замедлить разрушение мышц. Слишком медленная разработка методов лечения характерна не только для этого заболевания, успехи в лечении других генетических заболеваний, таких как муковисцидоз или отдельные формы рака, достигаются значительно медленнее, чем предполагалось ранее. Фактически, ―наше заболевание‖, мышечная дистрофия Дюшенна, может стать первым редким врождѐнным заболеванием, для которого в недалѐком будущем будет разработан метод лечения, действующий на генетическом уровне. Шаг за шагом. Исследовательские подходы, которые описываются в этом сообщении, основанные на соответствующих результатах научных исследований, могут использоваться для создания технологий производства препаратов. Но для этого необходимо время, поскольку разработка препарата является многоэтапным процессом, каждый шаг которого должен быть тщательно спланирован, исследован на животных и затем оценен в клинических исследованиях, для подтверждения его эффективности у пациентов. Сокращения процесса, даже если они кажутся теоретически возможными, недопустимы. Необходимо помнить, что большинство разработанных препаратов наши дети, страдающие мышечной дистрофией Дюшенна, будут вынуждены принимать всю оставшуюся жизнь. Не допускается, чтобы у препаратов были побочные эффекты, которые могут накапливаться в течение жизни и представлять опасность для пациентов. Препараты должны быть абсолютно безопасными. Это известно исследователям и они также знают, что регуляторные организации, такие как FDA и EMEA, делая свою работу, часто, замедляют разработку препаратов для вашего лечения. Прохождение этих процессов шаг за шагом требует много времени, но осложнения, наносящие вред вам или другим людям, страдающим другими заболеваниями, только замедляют разработку вашего и их препаратов. Пропуск экзонов. Одной из перспективных методик, обсуждаемых в этом сообщении, является пропуск экзонов. В клиническом исследовании, выполненном в Нидерландах с участием четырѐх мальчиков, была показана эффективность одного из препаратов, антисмысловых олигонуклеотидов – АОН, при лечении мышечной дистрофии Дюшенна. Сходное исследование с оценкой другого препарата продолжается в настоящее время в Великобритании. Выражается надежда на то, что его результаты также будут положительными. В настоящее время запланированы или уже выполняются введения АОН в кровоток, для того, чтобы препарат мог достигнуть всех мышц. Эффективность использования данного метода у животных позволяет надеяться на сходную эффективность использования у детей. У мальчиков, участвующих в этих исследованиях системного введения, которым было необходимо выполнить индукцию пропуска экзона 51, будет выполнено удаление экзонов в большей части поврежденных молекул, переносящих генетическую информацию, мРНК, о дистрофине. Эти мышцы могут уже работать лучше по окончанию исследования. Таким образом, мы надеемся, что данный подход ляжет в основу эффективной терапии, даже если его использование не будет приводить к излечению заболевания. Это не потребует ещѐ 20 лет, а произойдѐт значительно раньше. Исследование, основанное на пропуске экзонов, должно проводиться повторно через некоторое время, через несколько недель или месяцев. Но это можно рассматривать как преимущество метода, поскольку его использование может быть прекращено, или он может быть заменѐн более эффективным и безопасным методом. Ожидается, что методы, основанные на пропуске экзонов, окажут большую помощь пациентам, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, но их использование позволит только замедлить прогрессирование заболевания, таким образом, подход может рассматриваться, как эффективная терапия, но не метод излечения пациентов. Фармакологические подходы. Таким образом, для многих из вас, которые достаточно молоды, и у которых осталось сохранной достаточное количество мышечной ткани, использование методов, основанных на пропуске экзонов, может быть своевременным. Однако использование методик, индуцирующих пропуск экзонов, не может заменить утраченную мышечную ткань. Поэтому, для старших пациентов использование фармакологических методов более перспективно, чем использование генетических. Отдельные препараты такого рода могут использоваться атлетами в качестве допинга, однако, возможная эффективность использования при мышечной дистрофии позволит их использовать для лечения этого заболевания. Список возможных препаратов велик, на момент составления сообщения он включает около 30 препаратов, ожидается включение дополнительных препаратов. Отдельные клинические исследования, например, оценивающие Идебенон, дали положительные результаты. Этот подход требует меньше времени для разработки, чем генетические методы. Использование препарата для монотерапии и в комбинации с другими препаратами, такими как стероиды, в коктейлях, которые могут повышать, или поддерживать силу мышц, с меньшей частотой развития побочных эффектов, позволит вам выиграть время до разработки более фундаментальной генетической терапии. Клинические исследования являются обязательным шагом для разработки терапии. Но это только исследования с участием людей, которые могут быть выполнены неправильно. Отдельные из них уже дали отрицательные результаты, например, препарат Myodur, который не блокирует действие протеаз и Myo 029, которые ингибируют миостатин, но не вызывают клинического улучшения. Это было первое клиническое исследование, которое относилось к I Фазе и не преследовало цель изучения клинической эффективности препарата. В большинстве исследований проводилось лечение только одно мышцы, которая не имела большой функциональной значимости, и еѐ состояние не отражало состояния всех мышц. Безопасны ли изучаемые новые препараты? Это основной вопрос, на который должны ответить эти исследования. Участие в исследованиях является важным, но не настолько, чтобы вы несли большие расходы, если вы проживаете далеко от центров, где они проводятся. Выявление мутаций. Отдельные методы лечения направлены на отдельные мутации, что требует их выявления у пациентов, для того, чтобы лечение было эффективным. Примеры, пропуск экзонов и PTC124. Другие методы лечения, такие как замещение гена дистрофина при помощи вирусного вектора, или повышающая регуляция атрофина, не зависят от вида мутации. В настоящее время широко используется метод MLPA, для выявления делеций и дупликаций у мальчиков и женщин-носителей. Однако этот метод оценки генетического материала вскоре будет заменѐн новыми методами с использованием микрочипов. Выявление носительства у матерей и родственниц пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, является важным для генетического консультирования, которое позволить избежать рождения мальчиков с мышечной дистрофией Дюшенна в семье пациента. Но если у женщины с риском носительства удаѐтся доказать отсутствие дефектных генов, она может иметь здоровых детей, не опасаясь за возможный риск. Скрининг новорожденных с выявлением активности КК в высушенных пятнах крови, как это предложено в Германии (Фрейбург), Уэльсе (Кардифф) и Бельгии (Антверпен), позволяет выделить мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна на ранних стадиях, и при проведении генетического консультирования избежать рождения второго больного ребѐнка в семье. В настоящее время проводятся две программы скрининга в США в Колумбусе/Огайо и Атланте/Джорджия. Регистрация. Все мальчики и юноши, страдающие мышечной дистрофией Дюшенна, должны быть зарегистрированы в национальной базе данных пациентов, страдающих заболеванием, которая должна быть частью международной базы данных, как было предложено TREAT-NMD (www.treat-nmd.eu/registry) и Duchenn Connect (www.duchenneconnect.org). Это позволит выявлять потенциальных участников исследований с редкими мутациями, и обеспечить пациентам и членам их семей уверенность в том, что они получают самую новую информацию о результатах исследований и методах лечения. Давайте держаться вместе. Вы, семьи мальчиков и юношей, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, должны стать частью всемирного общества и работать сообща. Вы должны держаться вместе с другими пациентами и их семьями, принимающими участие в ассоциациях помощи пациентам с мышечными дистрофиями в вашей стране, а также в международных организациях. Примером такой организации является EAMDA, Европейский альянс ассоциаций пациентов, страдающих мышечными дистрофиями. Вместе с ними вы можете максимально быстро узнавать о разработке новых методов терапии. Здесь приводятся несколько доводов о пользе такого поведения: Ускорение регистрации. FDA и другим регуляторным органам требуется много месяцев для одобрения клинических исследований, изучающих новые методы терапии. Они, наконец, разрешили исследование препаратов, индуцирующих пропуск экзона-51, но исследование препаратов в Великобритании было задержано приблизительно на один год. Это было причиной невозможности закончить исследование в Дании до того, как будет разрешено начало исследования в Великобритании. В настоящее время создаѐтся впечатление, что эти органы настаивают на регистрации каждого АОН для большого количества различных делеций и дупликаций. Исследователи попытаются убедить их, что отличаются только последовательности АОН, но все остальные химические составляющие препаратов сходны по своему составу со средством, которое используется для пропуска экзона 51. Вы, семьи, должны работать совместно с PPMD и другими организациями для того, чтобы начать открытое обсуждение вопроса с регуляторными органами. Уже начаты обсуждения с FDA, они проходят достаточно успешно. В случае успеха, станут доступными многие другие препараты, вызывающие пропуск экзонов, наряду с теми, которые индуцируют пропуск экзона-51, через несколько месяцев, а не через несколько лет, как это было ранее. Обучение ваших докторов. Образовательные материалы предоставляются организациями DuchenneConnect, TREAT-NMD, PPMD, Ac-tionDuchenne, UPPMD и другими. Беседуя с врачами, важно использовать материалы, которые доступны в интернете и которые часто обновляются. Большинство ваших местных врачей, или врачей, оказывающих первичную помощь, знают крайне мало, или не знают ничего о болезни Дюшенна. Важно научить их оказывать помощь вашему ребѐнку информативными и понятными средствами. Остерегайтесь препаратов и методов лечения, которые представляются как панацея. После прочтения сообщения, и, возможно, прослушивания презентаций и ―наших‖ дискуссий на многих конференциях, посвящѐнных мышечной дистрофии Дюшенна, должно быть понятно, что препараты и методы лечения, которые могут быть эффективными и безопасными при длительном использовании, можно получить только с использованием научных методов. Если вы видите ―чудесный‖ препарат или предложение о "чудесном" лечении в интернете, и решаете использовать его для лечения своего ребѐнка, пожалуйста, спросите продавцов "чуда", как много мальчиков, страдающих болезнью Дюшенна они уже вылечили, каким образом были подтверждены результаты лечения, как много нового дистрофина им удалось обнаружить в мышцах пациентов и насколько улучшилась их функция. Если они действительно хотят предложить что-то стоящее, спросите у них, почему к ним не обратились тысячи семей с больными детьми. Будьте внимательны, поскольку вы можете потерять много денег и причинить вред своему ребѐнку. Проявляйте заинтересованность. Вы должны принимать активное участие в ассоциациях помощи пациентам с мышечными дистрофиями в своей стране, которые должны быть включены в международные организации, такие как TREAT-NMD в Европе и PPMD в США, МойМио в России и в ряде других стран. Все вместе мы сможем донести ваши повседневные проблемы и ваши надежды на лечение до внимания вашего правительства и общественности, до других людей, которые не знают, что такое мышечная дистрофия Дюшенна. Это может быть осуществлено в рамках политического лоббирования при помощи средств массовой информации, газет, радио и телевидения. Это откроет глаза организациям и объединениям, предоставляющим деньги на проведение исследований, а также позволит привлечь средства частных лиц. Материальная помощь необходима для исследований, особенно небольших. Она может составлять только часть реальных расходов на разработку препаратов, которая стоит миллионы долларов, фунтов или евро. Эти пенни и центы являются напоминанием не столь богатым, что состоятельные люди заботятся о них, и делают все для того, чтобы вы, или кто-то ещѐ жили долго и счастливо. (Эта глава подготовлена Ms. Patricia Furlong из PPMD и проф. Kate Bushby из TREAT-NMD.) Ссылки на другие важные статьи в предыдущих сообщениях. В моих ранних сообщениях о конференциях Родительских проектов в 2006 и 2008, описано больше субъектов, которые не упоминаются в этом обзоре методов исследования. Они приводятся здесь с указаниями на источник, в котором они содержатся. Более ранние версии сообщения можно найти на моей интернет-странице www.duchenne-information.eu на английском, нажав на ―Reports on the research for a therapy of Duchenne muscular dystrophy <Сообщения об исследованиях терапии мышечной дистрофии Дюшенна>‖. Краткие названия сообщений ―2006 Cincinnati English‖ (C06), ―2006 London English‖ (L06), и ―2007 Philadelphia English‖ (P07) в дальнейшем заменены аббревиатурами, и приводятся как "родители" с последующим номером страницы (например, P07-20). Я выражаю благодарность TREAT-NMD, PPMD и ActionDuchenne за финансовую поддержку. Здесь приводятся их полные адреса и контактная информация: TREAT-NMD проф. Kate Bushby Институт генетики человека Университет Ньюкасл-апон-Тайн, NE1 3BZ, Великобритания Тел.: *44-191-241-8621, Интернет: www.treat-nmd.eu Проект для родителей "Мышечные дистрофии" Patricia Furlong 1012 Северный Университетский бульвар. Миддлтаун, Огайо 45042, США Тел.: *1-513-424-0696, Интернет: www.parentprojectmd.org ActionDuchenne Nick Catlin Эпицентр, 41 Вест Стрит Лондон E11 4LJ, Великобритания Тел.: *44-208-556-9955, Интернет: www.actionduchenne.org МойМио Челябинск, Россия Тел.: +7 922 233 23 33, Интернет: www.mymio.org Это сообщение будет повторно обновляться, следующее обновление запланировано после ежегдной встречи PPMD в Филадельфии, 17 - 20 июля 2008. Это сообщение (по состоянию на июнь 2008) и его переводы на немецкий и испанский язык доступно в интернете по адресу www.duchenne-information.eu также доступны английская, германская и испанская версии моих сообщений о PPMD конференциях в Цинциннати в 2006 и в Филадельфии в 2007, а также конференции ActionDuchenne в Лондоне в 2006 году. Если вы хотите получать все мои новые сообщения сразу после их подготовки, пожалуйста, сообщите мне свой электронный адрес для того, чтобы я включил вас в листы рассылок вариантов на английском, немецком или испанском, которые уже содержат более 1,000 адресов. Guenter Scheuerbrandt, д. м. н. Im Talgrund 2 79874 Breitnau, Германия Тел.: *49-7652-1777, Факс: *49-7652-982730. электронный адрес: gscheuerbrandt@t-online.de интернет: www.duchenne-information.eu Молекулярные основы пропуска экзона 51. В клиническом исследовании в Нидерландах удалось осуществить пропуск экзона 51. Здесь приводятся молекулярные основы этого метода лечения, целью которого являлось восстановление рамки считывания, которая сдвигалась в мРНК вследствие делеции экзона 50 в гене, кодирующем дистрофин. Часть последовательностей оснований 50 и 51 мРНК нормального гена дистрофина является также окончанием экзона 49 и началом экзона 52. В экзоне 50 не установлено 29, а в экзоне 51 - 52 триплетов. Под каждым триплетом приводится аббревиатура, обозначающая аминокислоту, входящую в состав дистрофина, которая кодируется этим триплетом. (Трансляция с образованием последовательности аминокислот происходит на рибосомах. Аминокислоты не контактируют с РНК кодоном). Триплеты следуют один за другим без промежутков, дефисами выделена рамка считывания, а вертикальными линиями - границы экзонов. Три основания скрытого стоп-кодона UGA выделены красным цветом. Экзон 50 заканчивается после первого основания последнего триплета, который оканчивается UCU, остаток которого являются первым и вторым основанием триплета экзона 51, выделенного голубым. Концевой экзон 49 | Стартовый экзон 50 Концевой экзон 50| Стартовый экзон 51 ---CAG-CCA-GUG-AAG | AGG-AAG-UUA-GAA---AUU-GGA-GCC-U | CU-CCU-ACU-CAG-ACUgln pro val lys | arg lys leu glu ile gly ala ser| pro thr gln thr скрытый стоп-кодон ---GUU-ACU-CUG-GUG-ACA-CAA---AAA-CUA-GAA-AUG-CCA-UCU-UCC-UUG-AUG-UUG-GAG ---val thr leu val thr gln lys leu glu met pro ser ser leu met leu glu Концевой экзон 51 | Стартовый экзон 52 ---AUG-AUC-AUC-AAG-CAG-AAG | GCA-ACA-AUG-CAG-GAU-UUG ---met ile ile lys gln lys | ala thr met gln asp leu После удаления экзона 50 в гене и в мРНК, экзон 49 следует непосредственно за экзоном 51. Это приводит к сдвигу рамки считывания в экзоне 51 на один нуклеотид вправо, что сопровождается включением последовательности из 8 неправильных аминокислот в дистрофин до достижения сигнала стоп-кодона UGA, который прерывает синтез. Сдвинутые последовательности оснований и неправильные аминокислоты выделены красным цветом. Синтез дистрофина прекращается преждевременно, с образованием неполного белка, который разрушается, что приводит к развитию мышечной дистрофии Дюшенна. Концевой экзон 49 | Стартовый экзон 51 ---CAG-CCA-GUG-AAG | CUC-CUA-CUC-AGA-CUG-UUA -gln pro val lys | leu leu leu arg leu leu активный стоп-кодон антисмысловой олигорибонуклеотид UC-UUU-ACG-GUA-GAA-GGA-ACU -CUC-UGG-UGA-CAC AAG---AAC-UAG-AAA-UGC-CAU-CUU-CCU-UGA-UGU-UGG— leu trp СТОП! Концевой экзон 51 | Стартовый экзон 52 ---AU-GAU-CAU-CAA-GCA-GAA-G | GC-AAC-AAU-GCA-GGA-UUU--Антисмысловой олигорибонуклеотид, вызывающий пропуск экзона, AON PRO051, использованный голландскими исследователями, выделенный голубым цветом, прикреплен 20 основаниям к спирали УотсонаКрика в экзоне 51. Он индуцирует пропуск экзона 51 в мРНК мутированного гена, который в этом случае, не содержит последовательности экзона 50. Если в дополнении к удалению экзона 50, при помощи пропуска удаляется экзон 51, экзон 52 следует сразу за экзоном 49. Рамка считывания дальше не сдвигается, поскольку экзон 49 заканчивается, а экзон 52 начинается полным кодоном из трѐх оснований. Концевой экзон 49| Стартовый экзон 52 --CAG-CCA-GUG-AAG | GCA-ACA-AUG-CAG-GAU-UUG--gln pro val lys | ala thr met gln asp leu В экзоне 52 и далее не было выявлено сигналов, вызывающих преждевременное прекращение синтеза, но в белке отсутствовали 77 аминокислот, которые кодировались генетическим материалом экзонов 50 и 51. Они отсутствовали в центральной части укороченного дистрофина, что, однако имело функциональную значимость, поскольку приводило к развитию мышечной дистрофии Беккера вместо более тяжѐлой мышечной дистрофии Дюшенна.
