ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ПРОФЕССОРА В.Ф. ВОЙНО-ЯСЕНЕЦКОГО»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
На правах рукописи
ТЕПЛЯШИНА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА
ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ
КОМПЕТЕНТНОСТИ ООЦИТОВ ПРИ НОРМАЛЬНОМ
И ПАТОЛОГИЧЕСКОМ ФОЛЛИКУЛОГЕНЕЗЕ
14.03.03 – патологическая физиология (биологические науки)
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор медицинских наук М.В. Екимова
2014
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение……………………………………………………………….…..
6
Глава 1. Обзор литературы…………………………………………….….
15
1.1.
Фолликулогенез и стероидогенез в яичниках……………….…
15
1.1.1.
Фолликулогенез в норме ……………………………..................
15
1.1.2.
Стероидогенез в растущих фолликулах яичниках…………….
19
1.2.
Гуморальные факторы в регуляции роста и атрезии фолликулов………….……………………………………………………
27
1.2.1.
Семейство инсулиноподобных факторов роста………………
27
1.2.2.
Семейство эпидермального фактора роста………….……......
28
1.2.3.
Семейство фактора некроза опухолей (FasL/FasR)……………
29
1.3.
Ангиогенез в растущих фолликулах яичника. Факторы роста
в регуляции неоангиогенеза……………………….…………..
34
1.3.1.
Сосудисто-эндотелиальный фактор роста
34
1.3.2.
Эндотелин-1……………..……………………………………..
38
1.4.
Нарушение фолликуло- и стероидогенеза при гиперандроге-
41
нии и гиперпролактинемии
Глава 2. Материал и методы исследования……………………………
44
2.1.
Объект и методы экспериментальной части исследования….
44
2.2.
Метод иммуноферментного анализа…………………………..
47
2.3.
Расчетные коэффициенты
53
2.4.
Статистическая обработка результатов………………………..
53
Глава 3. Результаты собственных исследований………………………..
55
3.1.
Стероидогенез на разных этапах роста и созревания фолликулов при гиперандрогении и гиперпролактинемии………….
3.2.
Маркеры апоптоза в динамике роста фолликулов при гиперандрогении и гиперпролактинемии…………………………...
3.3.
55
60
Маркеры ангиогенеза в динамике роста фолликулов при гиперандрогении и гиперпролактинемии ……………………...
64
3
3.4.
3.5.
Маркеры пролиферации в динамике роста фолликулов при
гиперандрогении и гиперпролактинемии ……………………...
69
Корреляционный и корреляционно-регрессионный анализ
76
полученных результатов……………………………………….
3.6.
Метод математического моделирования …………………….
79
Глава 4. Обсуждение полученных результатов………………………….
84
Выводы……………………………………………………………………..
108
Практические рекомендации……………………………………………..
109
Список литературы………………………………………………………..
110
4
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Ал – андростендиол;
Ан – андростендион;
АТФ – аденозинтрифосфорная кислота;
ВРТ – вспомогательные репродуктивные технологии;
ГнТ – гонадотропины;
ГБОУ ВПО – государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования;
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота;
ДЭА – дегидроэпиандростендион;
ДЭА-С, (ДЭА-сульфат) – дегидроэпиандростендион-сульфат;
Е1 – эстрон;
Е2 – эстрадиол;
ИФА – иммуноферментный метод анализа;
ИФР – инсулиноподобный фактор роста;
ИФР-СБ – ИФР-связывающий белок;
ЛГ – лютеинезирующий гормон;
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота;
ОГНГ – овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
оФРФ – фактор роста фибробластов основной;
ПБР – периферический бензодиазепиновый рецептор;
Прог – прогестерон;
РЛДЦ ИХМИ – региональный лабораторно - диагностический центр иммунохимических методов исследования;
РНК – рибонуклеиновая кислота;
Т – тестостерон;
ТПФ – трубно-перитонеальный фактор бесплодия (контрольная группа);
ТФР-β1 – трансформирующий фактор роста β1;
СЭФР – сосудисто-эндотелиальный фактор роста;
ФГП – функциональная гиперпролактинемия;
5
ФНОα – фактор некроза опухолей альфа;
ФРП – фактор роста плаценты;
ФСГ – фолликулостимулирующий гормон;
цАМФ – цикло аденозинмонофосфорная кислота;
чХГ – человеческий хорионический гонадотропин;
ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение;
ЭФР – эпидермальный фактор роста;
Apaf-1 – протеаза активирующая апоптоз;
FasL – Fas-лиганд;
FasR – Fas-рецептор;
NO – оксид азота;
NF-κB – ядерный фактор каппа В;
Puma – р53 модулятор апоптоза;
TNF – фактор некроза опухоли;
Bcl-2, Bax, IAP – ингибиторы апоптоза.
6
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
На современном этапе развития биологических знаний о репродуктивных процессах все большее значение придается изучению закономерностей
развития фолликулов в процессе фолликулогенеза, физиологической регуляции этого процесса, а также системному анализу воздействия основных регуляторных модуляторов на клетки и функциональные уровни репродуктивной
системы в целом.
Изучение молекулярно-биологических маркеров при эндокринном бесплодии показывает различные состояния функционирования яичников и позволяет получить ценную объективную информацию о состоянии процессов
пролиферации, апоптоза, неоангиогенеза. Детальное рассмотрение поступательного развития фолликулов в динамике развития патологического процесса может способствовать раннему выявлению неизвестных закономерностей
их функционирования.
Исследование молекулярно-биологических маркеров развития фолликулов в процессе фолликулогенеза – одно из наиболее перспективных и социально-значимых направлений репродуктивной биологии. В настоящее
время актуальность изучения проблемы оогенеза и фолликулогенеза обусловлена высоким процентом числа бесплодных браков, связанных с проблемами в репродуктивной сфере.
Согласно данным ВОЗ рождаемость в России не достигает уровня, необходимого для простого воспроизводства населения. Суммарный коэффициент рождаемости составляет 1,6, тогда как для простого воспроизводства
населения без прироста численности необходим суммарный коэффициент
рождаемости 2,11-2,15 [6].
Эндокринное бесплодие у женщин является важнейшей составляющей
многофакторной структуры бесплодного брака. На первый план выступают
такие заболевания как овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза
7
(ОГНГ) и функциональная гиперпролактинемия (ФГП). В основе патогенеза
указанных вариантов эндокринного бесплодия лежит функционирование репродуктивной системы в условиях измененного гормонального статуса, что
приводит к последовательному нарушению стероидо- и фолликулогенеза,
овуляции и оплодотворения [30,31].
Измененный гормональный статус женщин оказывает непосредственное воздействие на дифференцировку, пролиферацию и гибель клеток фолликула и эндометрия [157]. При этом развитие ооцитов в растущем пуле
фолликулов во многом зависит от состава фолликулярной жидкости (ФЖ)
[62].
Поскольку ФЖ формирует микроокружение для ооцита и является источником веществ, необходимых для его правильного развития, представляется вероятным, что содержание того или иного вещества может свидетельствовать об оптимальных или, напротив, неоптимальных условиях для развития конкретного ооцита. Изменения средней концентрации этих молекулмаркеров в образцах ФЖ указывают на нарушение репродуктивной функции
в целом [4]. В настоящее время выявлена корреляция между уровнем стероидных гормонов в антральной жидкости, количеством митозов в клетках гранулезы и качественными характеристиками ооцитов [99].
Рост сосудов и васкуляризация играют определяющую роль для развития доминантного фолликула, который характеризуется высокой концентрацией сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР) [8]. В контексте рассматриваемой проблемы важно отметить факт мало изученной роли эндотелина-1 в регуляции неоангиогенеза и его значения для развивающегося фолликула [122].
Известно, что в ФЖ доминантных фолликулов при ОГНГ и ФГП увеличена концентрация митогенных факторов и снижено содержание факторов
выживаемости, что определяет развитие ускоренной атрезии фолликулов и
функциональную незрелость яйцеклеток при обеих эндокринопатиях [74],
8
что соотносится с большой частотой невынашивания беременности после лечения ЭКО [30].
Анализ литературных данных показывает, что для выявления причин
рассматриваемых вариантов эндокринного бесплодия и его диагностики
большое значение имеет понимание патофизиологических механизмов, приводящих к функциональной неполноценности женских гамет. К ним следует
отнести нарушенный ангиогенез, дизрегуляцию эффектов стероидных гормонов, активацию апоптоза клеток гранулезы фолликулов, изменение соотношений про- и антиапоптотических факторов и накопление цитокинов в составе ФЖ [37, 52, 58]. Обозначенные проблемы показывают перспективы
дальнейшего исследования в данной сфере.
В этой связи является актуальным изучение условий протекания гормонально-зависимого этапа формирования пула антральных фолликулов, регуляции их роста и селекции доминантного фолликула, а также идентификация факторов ФЖ, под влиянием которых развивающиеся ооциты при ОГНГ
и ФГП становятся неполноценными.
Цель исследования
состоит в исследовании функциональной компетентности ооцитов при некоторых вариантах эндокринного бесплодия человека и эффективности стимуляции овуляции в программах экстракорпорального оплодотворения.
Задачи исследования
1. Исследовать уровень маркеров функциональной компетентности ооцитов (эстрадиола (Е2), тестотерона (Т), индекса эстрадиол/тестостерон
(Е2/Т), Fas-лиганд/Fas-рецептор (sFasL/sFasR), основной фактор роста фибробластов (оФРФ), инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1), эпидермальный фактор роста (ЭФР), индекс инсулиноподобный фактор роста1/эпидермальный фактор роста (ИФР-1/ЭФР), трансформирующий фактор
роста-ß1 (ТФР-ß1) в фолликулярной жидкости в динамике созревания фол-
9
ликулов при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии.
2. Изучить влияние эндотелина-1 и СЭФР в фолликулярной жидкости
на развитие фолликулов при исследуемых вариантах эндокринного бесплодия.
3. Определить роль пролиферации, ангиогенеза и апоптоза в процессе
созревания пула малых антральных фолликулов, их роста и селекции доминантного фолликула при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза
и функциональной гиперпролактинемии.
4. Оценить характер взаимосвязи маркеров физиологических механизмов и развития фолликулов при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии.
5. Выявить маркеры фолликулогенеза, прогнозирующие исход лечебных циклов ЭКО при рассматриваемых вариантах эндокринного бесплодия.
Научная новизна
1. Выявлено патологическое изменение фолликулярного микроокружения при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии. (снижение Е2/Т и накопление тестостерона)
начиная с IV стадии гормонально-зависимого этапа фолликулогенеза.
2. Установлено, что увеличение секреции sFasR в фолликулярной
жидкости при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии является косвенным свидетельством готовности гранулезных клеток развивающихся фолликулов к реализации программы апоптоза или отражает запуск механизма апоптоза гранулезных клеток.
3. Обнаружено, что снижение содержания основных маркеров пролиферации (ИФР-1, ЭФР) в развивающемся доминантном фолликуле может
свидетельствовать о нарушенной пролиферации гранулезных клеток при
10
овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии, начиная со стадии раннего преовуляторного фолликула.
4. Показано, что сниженная секреция основных маркеров неоангиогенеза (СЭФР, оФРФ) в растущем фолликуле позволяет судить о недостаточном кровоснабжении доминантного фолликула как одном из механизмов развития преждевременной атрезии фолликула и/или созревания ооцита со сниженным фертилизационным потенциалом. Секреция СЭФР в растущем фолликуле при изученных вариантах эндокринного бесплодия зависит от стероидного микроокружения ооцитов.
Личный вклад соискателя
Научные выводы и результаты, полученные при проведении диссертационного исследования, получены Тепляшиной Е.А. самостоятельно. Диссертантом лично осуществлено:
 формулирование цели, разработка конкретных задач работы и плана их
выполнения;
 обработка экспериментального материала;
 проведение экспериментальной части исследования;
 создание компьютерной базы данных исследованных образцов фолликулов разной степени зрелости у женщин;
 статистическая обработка полученных данных и интерпретация результатов;
 написание текста диссертации и автореферата.
Теоретическая значимость работы
Полученные данные о характере и выраженности патологических изменений развивающихся фолликулов при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии могут быть использованы в курсах обучения физиологии и эндокринологии, при планиро-
11
вании экспериментальных протоколов направленных на изучение молекулярных механизмов нарушения репродуктивной функции, ассоциированных
с дизрегуляцией фолликулогенеза.
Практическая значимость работы
Выявленные закономерности развития фолликулов в зависимости от
гуморального микроокружения целесообразно учитывать при оценке репродуктивного статуса пациенток с эндокринопатиями, а также при определении
индивидуальных схем лечения в циклах вспомогательных репродуктивных
технологий.
Настоящая работа представляет практический интерес в связи с выяснением прогностической роли ряда маркеров, которые могут быть использованы для оценки исходов лечебных циклов ЭКО у женщин с овариальной гиперандрогенией неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемией.
Положения, выносимые на защиту
1. При нормальном фолликулогенезе молекулами, маркирующими эффективность фолликулогенеза, оплодотворения и имплантацию эмбриона,
являются эстрогены, оФРФ и ЭФР; при функциональной гиперпролактинемии - тестостерон, ТФР-β1, эндотелин-1; при овариальной гиперандрогении
неопухолевого генеза - оФРФ, ТФР-β1, эндотелин-1. Сниженная секреция
основных маркеров неоангиогенеза в растущем фолликуле может приводит к
недостаточному кровоснабжению доминантного фолликула. Имеется отрицательная корреляция между концентрацией оФРФ и степенью зрелости
фолликула для пациенток с овариальной гиперандрогенией неопухолевого
генеза (r=-0,93; p=0,001).
2. Особенностью развивающихся ооцитов у пациенток с исследуемыми
вариантами эндокринного бесплодия является снижение их пролиферативной
активности, регистрируемой по подавлению секреции полипептидных фак-
12
торов и интенсификации апоптоза вследствие дизрегуляции sFasR/sFasL взаимодействий на фоне нарушенного синтеза стероидных гормонов, что в результате приводит к снижению эффективности оплодотворения и имплантации эмбриона.
Внедрение результатов исследования
Результаты работы внедрены в научно-исследовательский процесс
НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, в диагностическую деятельность РЛДЦ ИХМИ г. Красноярска, в учебный процесс кафедры биохимии с
курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, кафедры патологической физиологии, кафедры клинико-лабораторной диагностики ИПО ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого МЗ РФ.
Апробация работы
Основные положения диссертационного исследования представлены и
обсуждены:
- на V Международной конференции молодых ученых «Современные
вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии» (Москва, 2011 год);
- на V Международном конгрессе по репродуктивной медицине
(Москва, 2011 год);
- на III Съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011 год);
- на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы
биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010 год);
- на семинарах НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ
ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (Красноярск, 2009–2011
гг.);
- на заседании проблемной комиссии «Фундаментальная медицина»
(выписка из протокола №3 от 22 декабря 2009 года).
Публикации
13
По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ: из них в
журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ – 5, в тезисах
докладов на конгрессе и конференциях всероссийского и международного
уровней – 9. Издано методическое пособие «Диагностика нарушения стероидогенеза в клетках кумулюса фолликулов яичников у женщин с эндокринным бесплодием в лечебных циклах ЭКО», рекомендованное к печати центральным координационным методическим советом ГБОУ ВПО КрасГМУ
им.проф.В.Ф.Войно-Ясенецкого (протокол № 9 от 16.06.2011).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 33 рисунками. Состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 173 источников (отечественных и иностранных).
Благодарности
Автор
выражает
благодарность
к.б.н.
А.В.
Светлакову,
С.А.Сыромятниковой, коллективам Центров репродуктивной медицины и
гинекологической эндокринологии и репродукции «Три сердца» за предоставленный исследовательский материал, коллективу РЛДЦ ИХМИ г. Красноярска за помощь в его обработке, к.т.н., доц. С.А. Арутюняну за помощь в
обработке статистических данных, а также сотрудникам НИИ молекулярной
медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. ВойноЯсенецкого (к.б.н. Е.А. Пожиленковой, к.м.н. Н.А. Малиновской) за методическую помощь.
14
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Фолликулогенез и стероидогенез в яичниках
1.1.1. Фолликулогенез в норме
Реализация репродуктивной функции женщины связана с процессом
фолликулогенеза. Данный процесс включает совокупность регуляторных
компонентов и факторов роста на различных молекулярных уровнях. В
настоящее время важный вклад в изучение патогенеза эндокринного бесплодия вносят исследования необратимого дегенеративного процесса гибели
фолликулов (атрезии), сопряженного с циклическим стероидогенезом в яичниках, и тесно связанным с ним ангиогенезом. Молекулярно-биологические
маркеры позволяют оценить функционирование яичников и получить ценную объективную информацию о состоянии фолликулогенеза.
Вместе с тем, имеющиеся в настоящее время литературные данные не в
полной мере отражают пути решения проблем в области репродукции и не в
полной мере показывают всю гамму молекулярно-биологических подходов к
пониманию патогенеза эндокринного бесплодия.
Одним из современных подходов к пониманию патогенеза различных
заболеваний является изучение процессов регуляции клеточной гибели
(апоптоза). Косвенным маркером готовности гранулезных клеток яичника к
вступлению в апоптоз является увеличение содержания в ФЖ растворимой
формы FasR – sFasR. Вместе с тем в основе физиологического обеспечения
функционирования репродуктивной системы женщины лежат процессы циклического ангиогенеза. Изучение взаимосвязи данных процессов в норме
позволяет объяснить возникновение и характер определенных заболеваний и
роль молекулярно-биологических маркеров в регуляции.
Так, молекулярно-биологические маркеры при различных заболеваниях выступают в качестве потенциальных прогностических факторов, а также
дают ценную информацию о процессах, протекающих на молекулярном
уровне.
15
Анализ причинных факторов неудач при проведении программ ЭКО
позволяет признать их мультифакторный характер, опосредованный нарушением всех этапов репродуктивного процесса, в регуляции которого принимают участие нервная, эндокринная и иммунная системы.
Измененная фолликулярная среда при некоторых вариантах эндокринного бесплодия может оказывать влияние на качество ооцитов, которое в
свою очередь обусловливает сниженную имплантацию. Мониторинг данной
проблемы является весьма сложной задачей, решение которой возможно с
использованием математических методов исследования.
Так, в современной медицине использование математических моделей
решает многие не только прогностические, но и диагностические задачи. В
нашем исследовании определенные методы статистической обработки применялись для изучения влияния определенных факторов роста и гормонов на
результаты лечебных циклов ЭКО.
Одним из важнейших репродуктивных органов женщины являются
яичники, выполняющие две основные функции. Одна из этих функций –
оогенез, связана с образованием зрелых гамет (яйцеклеток), а другая – стероидогенез, сопряжена с производством стероидных гормонов, необходимых
для развития фолликула и подготовки репродуктивных органов женщины к
беременности [24, 41].
Основной структурной и функциональной единицей яичника является
фолликул. Каждый фолликул состоит из ооцита, окруженного слоем или слоями соматических клеток. Соматические компоненты яичника (гранулеза, тека, эндотелиальные клетки и поддерживающая соединительная ткань) развиваются из недифференцированных гонад эмбриона. Главное предназначение
гранулезных клеток связано с выработкой стероидных гормонов [11,72,73].
Доказательством сложных преобразований в яичниках является факт
экспрессии в них 20-30 % всех генов человека. Например, в мышечной ткани
экспрессируется только 6-7 % генов. Ключевую роль в формировании яичников играет ген FIGLIA. Экспрессия данного фактора приводит к синтезу бел-
16
ков блестящей оболочки (zona pellucida). Важным представителем, отвечающим за взаимодействие ооцита с клетками гранулезы и теки, является ген,
экспрессирующий фактор ВМР 15 (CDF9B). Указанный фактор относится к
семейству ТФР-β1, который контролирует процесс формирования роста первичных фолликулов. Мутация в данном гене приводит к возникновению дисгенезии яичников [8,31]. Зависимость динамики фолликулярного развития от
указанных факторов и сигналов показана в таблице 1.
Временные параметры фолликулогенеза ограничиваются поздним этапом фазы менструального цикла и началом пика гонадотропинов [106]. Скоординированные эндо-, экзо- и паракринные взаимодействия способствуют
поэтапному развитию фолликулов [10,161].
Согласно современным данным, процесс фолликулогенеза можно разделить на следующие стадии: 1) формирование пула растущих фолликулов;
2) базальный рост (рост до стадии антрального фолликула); 3) селекция и созревание доминантного фолликула; 4) овуляция доминантного фолликула
[42,160]. Первые две стадии представляют этап гормонально-независимого
развития фолликулов, третья и четвертая стадия – этап гормональнозависимого развития фолликулов [8,98].
Таблица 1
Факторы, оказывающие влияние на динамику фолликулярного развития
Представители
Bcl-2, TФР-β, kit-лиганд (стволовой клеточный фактор), BMP, GATA-4, интегрин
Bcl-2, Bax, ФСГ, ингибин, Fas-лиганд, каспазы
Fas, каспазы, ТNF, p53, прогибитин, интерферон и эндотелины
Fas/ Fas-лиганд, каспаза 3, Вах, прогибитин,
BMP лиганды, рецепторы (ВМР рецептор и
простагландин)
Оказываемое влияние
Способствуют выживанию фолликулов
Осуществляют селекцию
Обеспечивают процесс фолликулярной
атрезии
Способствуют процессу лютеогенеза (лютеолиз/лютеонизация)
Процесс фолликулогенеза наглядно показан в классификации Pedersen
& Peters (1968 год). Данная классификация отражает наиболее развернутую
картину основных морфологических событий: инициацию роста ооцита, про-
17
лиферацию гранулезных и слоя тека-клеток, формирование антрального фолликула. На рис.1 показан процесс атрезии, овуляции и лютеинизации фолликула.
В соответствии с существующими представлениями развитие фолликула в репродуктивном периоде женщины имеет ряд особенностей и претерпевает обозначенные на рисунке 1 стадии [98].
На основании процессов, протекающих в яичниках женщины, обнаруживается существование двух пулов фолликулов – группы «спящих» примордиальных фолликулов и группы первично инициированных антральных
фолликулов. Основное депо представлено пулом примордиальных фолликулов, в то время как, пул антральных фолликулов способен к дальнейшему росту и длительной стабилизации на данном этапе развития [10].
Антральные фолликулы могут быть разделены на следующие виды:
малые антральные фолликулы с диаметром 1-3 мм и большие антральные
фолликулы диаметром 5-6 мм. Формирование доминантного фолликула из
когорты растущих антральных фолликулов находится в непосредственной
зависимости от ФСГ. Формирование когорты растущих антральных фолликулов начинается в конце второй фазы предыдущего менструального цикла.
В данной фазе наблюдается пропорциональное уменьшение объема желтого
тела с одновременным увеличением секреции ФСГ гипофизом и, соответственно, снижается секреция Прог, Е2 и ингибина [31].
В основе роста и селекции доминантного фолликула лежит так называемая «теория окна», предложенная J. Brown (1978) & D. Baird (1987).
Согласно данной теории каждый из антральных фолликулов имеет свой
индивидуальный порог чувствительности к концентрации ФСГ, который, как
уже отмечалось, зависит от количества рецепторов к ФСГ в гранулезных
клетках.
Для каждого из антральных фолликулов с диаметром 3 – 5 мм в начале
фолликулярной фазы менструального цикла уровень ФСГ должен достигать
определенного значения или порога. Этот порог строго индивидуален и зави-
18
сит от сохранности овариальных резервов. В нормальных условиях снижается уровень ФСГ в середине фолликулярной фазы цикла и доминантным становится один фолликул, который далее овулирует [9].
Рис. 1. Стадии фолликулярного развития с указанием диаметра и типа
фолликула [Elvin J., Matzuk M., 1998]
Последовательное развитие фолликула осуществляется за счет поступающих к нему питательных веществ из окружающей ФЖ. Состав ФЖ зависит от гормональных изменений в период фолликулогенеза [70,158].
1.1.2. Стероидогенез в растущих фолликулах яичника
Реализация стероидогенной функции яичника осуществляется, в основном, посредством таких гормонов как Прог, андрогены и эстрoгены, действующие через специфические ядерные рецепторы.
Механизм действия стероидных гормонов различен у разных видов
животных. Так, у мышей эмбриональные яичники не продуцируют стероид-
19
ные гормоны. Однако, у ряда других видов животных стероидогенез в развивающихся яичниках достаточно активен. Данный факт подтверждается тем,
что выделение этих гормонов у обезьян и овец во внутриутробном состоянии
нарушает развитие гонад, фолликулов, существенно изменяет морфологию
яичников и приводит, в конечном счете, к формированию кист [125,157,163].
Весьма показателен процесс стероидогенеза в развивающихся фолликулах овец. Клетки этих фолликулов экспрессируют рецепторы для эстрогенов (ERα и ERβ) и андрогенов (АR), за исключением Прог (PR), которые обнаруживаются методом гибридизации in situ и иммуногистохимией в эмбриональный период [137].
Экспрессия перечисленных рецепторов наблюдалась у овец с 26 по 75
день эмбрионального развития. В свою очередь ERβ обнаруживался в гранулезных клетках в течение всего периода развития яичников. Рецепторы к андрогенам обнаруживались на 55 день в клетках стромы. мРНК рецепторов PR
не наблюдалась в указанный период, однако проявлялась в малых антральных и больших фолликулах [127].
Экспрессия ERα и ERβ, АR, PR наблюдается в поверхностном эпителии
и строме яичников эмбриональных, новорожденных и взрослых особей. В
конечном счете, стероидные гормоны у данных животных являются регуляторами развития различных типов клеток яичника и фолликулов в целом на
ранних стадиях [137].
J. E. Fortune (2003) проанализировал эффекты стероидных гормонов на
ранних стадиях фолликулогенеза у различных животных. Результаты его исследования представлены в табл. 2.
На протяжении постнатального развития экспрессия мРНК ERβ возрастает в соответствии с пролиферацией гранулезных клеток, а мРНК ERα
напротив, остается стабильной. Исследования последних лет позволили
определить роль ERα и ERβ в репродуктивной функции женщины. Так, ERα
посредством неизвестного пока механизма подавляют процесс овуляции, в то
20
время как ERβ стимулируют рост фолликулов, подавляя атрезию и инициируя экспрессию специфических генов [137].
В 2002 году K. Britt & J. Findlay продемонстрировали на экспериментальных моделях (мыши линии ArKO – линия с недостаточным количеством
Е2 и, как следствие этого, приостановленным процессом фолликулогенеза на
антральной стадии и отсутствием овуляции) биологическое действие Е2 на
репродуктивную функцию. Назначение Е2 крысам с удаленным гипофизом
стимулирует пролиферацию гранулезных клеток в малых преантральных
фолликулах и снижает атрезию. Последующее назначение ФСГ крысам с экзогенным Е2, способствует росту фолликулов, дифференциации и образованию антральной полости [89].
Необходимо отметить, что сам по себе Е2, является потенциальным митогеном, действуя на гранулезные клетки in vivo у кроликов. В условиях in
vitro он лишен митогенной активности. Это показывает, что in vitro культура
не способна поддерживать митогенный эффект Е2 на гранулезные клетки
и/или воздействие других внутрифолликулярных факторов роста. Неизвестные факторы, вырабатываемые клетками теки, способны оказывать влияние
на митогенный эффект эстрогенов. Научная группа под руководством
M. Bley в 1997 году доказала, что комбинация эстрогенов и ФСГ или андрогенов стимулирует пролиферацию гранулезных клеток in vitro и этот эффект
возрастает в присутствии инсулина или ИФР-1 [89].
Данные, полученные C. Wang и S. Roy (2007 г.), подтверждают важную
роль Е2 в дифференцировке соматических клеток. Более того, данный гормон
имеет двойственный эффект на развивающиеся соматические клетки. Указанный эффект зависит от дозы Е2, что было показано экспериментально. Исследование проводилось на новорожденных хомяках [170].
На первой стадии эксперимента 1-2 мкг Е2 (estradiol cypionate ECP),
воздействовали на формирующиеся примордиальные фолликулы на 1 и 4
день после рождения экспериментальных животных. Параллельно проводили
исследование в культуре эмбриональных яичников, где концентрация воз-
21
действующего Е2 составила 1, 5, или 10 нг/мл. Необходимо отметить, что
1 мкг ECP соответствовал физиологической концентрации Е2. При данной
концентрации значительно снижался уровень апоптоза, инициировалось
формирование и развитие примордиальных фолликулов. Напротив, 2 мкг
ECP содержали повышенную концентрацию Е2 (до 400 пг/мл), что значительно снижало воздействие на ранние стадии развития фолликулов в процессе фолликулогенеза [170].
Таким образом, результаты данного исследования доказывают важность рассмотренного гормона для выживания и развития соматических клеток, ооцитов, что приводило к развитию примордиальных фолликулов как in
vivo так in vitro.
Таблица 2
Суммарные эффекты стероидных гормонов в процессе фолликулогенеза
Стадия воздействия
Примордиальная→первичная
(активация фолликулов)
Рост примордиальных
фолликулов
Первичные→вторичные
Малые преантральные
Средние преантральные
Большие прентральные
Позитивный
эффект
-
Негативный
эффект
-
Нет эффекта
-
-
-
Е2 (кролики)
Е2(крупный
рогатый скот)
Е2(приматы)
-
-
Андрогены (приматы)
-
-
Воздействие Е2 на динамику растущих фолликулов доказано S. Hulshof
в 1995 году. В качестве подтверждения научной гипотезы были проведены
эксперименты по культивированию яичников крупного рогатого скота. Среда
для культивирования содержала Е2 в концентрации 10-8М и/или ФСГ в концентрации 0.05 IU hФСГ/мл. В результате наблюдался рост преимущественно первичных фолликулов до увеличения их диаметра 30-70 нм [93].
Функционирование женского организма невозможно без участия половых гормонов стероидного происхождения – андрогенов. Синтез андрогенов
генетически обусловлен и детерминирован экспрессией гена Р450с17. В организме взрослой женщины синтезируются: ДГА-С, ДГА, Ан, Т и дигидроте-
22
стостерон. Наличие данного спектра гормонов является биологической необходимостью, поскольку они являются предшественниками биосинтеза эстрогенов [43].
Таблица 3
Средняя концентрация андрогенов в плазме крови здоровых женщин
репродуктивного возраста
Андрогены
ДГА-С
ДГА
Ан
Ал
Т
Дигидротестотерон
Нг/мл
1700
4,2
1,76
0,75
0,39
0,19
Нмоль/л
4630
14,6
6,1
2,6
1,3
0,65
Содержание данных гормонов у здоровых женщин продемонстрировано в табл. 3.
Андрогены образуются в яичниках, надпочечниках и периферических
тканях (рис.2). Для половых желез и надпочечников характерна общность
происхождения, они формируются из урогенитального гребешка [63]. Претерпевая сложный процесс дифференцировки, каждая железа приобретает
способность к синтезу строго определенных гормонов – андрогенов, эстрогенов или кортикостероидов. Главным элементом, обусловливающим характер
стероидогенеза, является цитохром Р450 и ряд последовательных реакций
гидроксилирования [7,39,104].
Ряд
эффектов
андрогенов
продемонстрирован
в
исследованиях
A. Murray, проведенных in vitro в 1998 г. В качестве экспериментальных моделей были выбраны мыши и крупный рогатый скот. В результате проведенных опытов наблюдалось преобразование первичного фолликула во вторичный, стимуляция роста преантрального фолликула, увеличивалось количество митозов в гранулезных клетках [93,108].
В экспериментах, проведенных M. Orisaka, показано преимущественно
позитивное воздействие Ан и Т на рост и развитие фолликулов на гонадотропин-зависимой стадии. Высокий уровень экспрессии рецепторов андрогенов
23
наблюдалось в преантральных и антральных фолликулах крыс. Назначение
Т или дигидротестотерона половозрелым особям обезьян способствовало
значительному увеличению числа преантральных и малых антральных фолликулов, усиливало пролиферацию гранулезных и клеток теки [108].
Рис.2. Суточная продукция андрогенов в яичниках и коре надпочечников, % [43]
В женской репродуктивной системе функционирует еще один важный
стероидный гормон – Прог. Этот гормон играет важную роль в овуляции,
имплантации и поддержании беременности. Прог оказывает непосредственный эффект на функцию гранулезных клеток.
Физиологические эффекты данного гормона опосредованы взаимодействием со специфическими внутриклеточными рецепторами, которые обозначаются как Пр-А и Пр-В. Оба рецептора являются продуктом одного гена.
Анализ структурной и функциональной активности каждой из форм рецептора показал, что, несмотря на общность происхождения, они имеют различные
эффекты при взаимодействии с Прог. Подавляющий эффект в отношении
Пр-В оказывает Пр-А. Равное соотношение этих двух форм является определяющим моментом в формировании клеточного ответа [137].
Иммуногистохимически было показано, что рецепторы Прог локализованы как в тека клетках малых антральных фолликулов, так и в гранулезных
24
клетках преовуляторных фолликулов. Прог способен также оказывать прямое действие на гранулезные клетки, что можно наблюдать, например, при
ингибировании преобразования примордиального фолликула в первичный у
новорожденных крыс. В гранулезных клетках яичников идентифицирован
белок, связывающий Прог с молекулярной массой 60 кДа, который способен
модулировать действие данного гормона [134].
Кроме того, действие Прог способствует увеличению продукции протеолитических ферментов, имеющих большое значение для созревания фолликула и овуляции [134].
Функцию рассматриваемого гормона в репродуктивной системе объяснила группа ученых под руководством J. Lydon в 1995 году. В качестве экспериментальной модели использовались мыши с выключенными генами
ADAMTS-1 и cathepsin-L, необходимыми для овуляции. Несмотря на гистологически нормальные яичники, у этих мышей не происходила овуляция,
даже после экзогенной стимуляции гонадотропинами, что подтверждалось
присутствием неполноценного преовуляторного фолликула в яичниках и отсутствием ооцитов в яйцеводе и матке. Гранулезные клетки этих преовуляторных фолликулов были лютеинизированы, что в свою очередь, подтверждает, что Прог не требуется для формирования желтого тела.
Последнее наблюдение вызвало споры между представителями разных
научных школ [89].
Так, Natraj & Richard в 1993 году, высказали предположение, что действие Прог опосредованное его рецепторами, все-таки необходимо для процесса лютеинизации. Дальнейшее изучение роли Пр-А и Пр-В показало, что
именно Пр-А участвует в процессе овуляции, в то время как участие Пр-В в
этом процессе является необязательным [89].
В рамках исследования развития фолликулов целесообразно рассмотреть влияние стероидных гормонов на процесс фолликулогенеза согласно
двухклеточной теории стероидогенеза (рис. 3).
25
Клетки
гранулезы
Клетки
теки
ФСГ
ФСГ
ЛГ
Т
Э
Т
Э
Т
Х
Т
Х
ЛГ
ЛГ
Размер
фолликула
менее 10 мм
Размер
фолликула
более 10 мм
Рис. 3. Двухклеточная теория стероидогенеза [9,59,61]
В соответствии с двухклеточной теорией стероидогенеза в яичниках
происходит регуляция менструального цикла и стимуляция суперовуляции. В
начале менструального цикла в клетках теки фолликулов, под действием ЛГ,
происходит синтез андрогенов – Т и его производных. Предшественником
андрогенов выступает холестерол.
В клетках гранулезы фолликулов из Т синтезируется Е2 под действием
фермента ароматазы (ароматазная реакция). Фолликулы с диаметром 10 мм в
диаметре характеризуются низким уровнем синтеза Е2. При достижении доминантным фолликулом более 10 мм в диаметре на клетках гранулезы яичников появляются рецепторы к ФСГ и ЛГ. Стимулирующее действие этих
гормонов приводит к значительному увеличению синтеза Е2 [43].
Стероидогенная активность фолликула сопряжена с его последовательным развитием, что в свою очередь отражается в динамике активности Е2.
Показано, что 95 % находящегося в крови Е2, синтезируется в яичниках гранулезными клетками доминантного фолликула [56,111,115,133].
Развитие доминантного фолликула тесно сопряжено с процессом атрезии других антральных фолликулов. Данные фолликулы отличаются сниженной способностью к синтезу Е2, что в свою очередь приводит к преобла-
26
данию андрогенов в фолликулярной жидкости и формированию андрогенного микроокружения, которое характеризуется снижением отношений Е2 /Т и
ИФР-1/ЭФР.
Для фолликулов, находящихся в состоянии атрезии, характерно повышение в фолликулярной жидкости уровня растворимого маркера апоптоза
sFasR, лиганд которого располагагается на мембране ооцита [5,28].
Рассмотренные гормоны осуществляют формирование репродуктивной
функции и поддержание гормонального гомеостаза женщины в различные
возрастные периоды. Вместе с тем, в успешной реализации данного процесса
принимают участие и другие гуморальные факторы.
1.2. Гуморальные факторы в регуляции роста и атрезии фолликулов
1.2.1. Семейство инсулиноподобных факторов роста (ИФР)
Важную роль в регуляции роста и атрезии фолликулов играют гуморальные факторы, одним из которых является ИФР-1. Результаты исследований последних лет подтверждают значимость данного фактора, безусловно
выступающего внутриклеточным регулятором фолликулогенеза.
ИФР – представляют собой группу белков – посредников эндокринных
эффектов гормона роста, осуществляющих эндокринную, аутокринную и паракринную регуляцию процессов роста, развития и дифференцировки клеток
и тканей организма. Вызывают большой интерес проведенные эксперименты,
в которых использовались мыши, мутантные по генам ИФР-I и ИФР-IP.
Мыши, мутантные по гену ИФР-I, при рождении имели дефицит массы
примерно 60% от нормы и повышенную смертность. У взрослых мышей выявляли яичники, уменьшенные в размерах [8,11].
Роль данного фактора доказана в селекции доминантного фолликула.
Были проведены эксперименты на моноовуляторных животных – коровах и
лошадях. При введении ИФР-I в фолликул, по размерам следующий за доми-
27
нантным, отмечалось повышение концентрации факторов, способствующих
развитию доминантного фолликула, а именно активина А, ингибина А, эндотелиального фактора роста. В данном фолликуле наблюдалось уменьшение
концентрации Ан и белка, связывающего ИФР-I. Кроме того, фолликул с
введенным ИФР-I приобретал функции доминантного при удалении истинного доминантного фолликула. Данный факт подтвердили экспериментом, в
результате которого после введения физиологического раствора животным
контрольной группы только 33 % фолликулов продолжали обладать свойствами доминантного [11].
В целом, процесс роста фолликула от примордиальной стадии до
преовуляторной носит последовательно-запрограммированный характер.
Первый этап данного процесса имеет гормонально-независимую основу, в
котором большую роль играют такие факторы роста как ЭФР и FasL/FasR.
1.2.2. Семейство эпидермального фактора роста (ЭФР)
Данное семейство очень разнообразно и крайне неоднородно по своему
составу и включает ЭФР, ТФРα, амфирегулин, герегулин (новый дифференцировочный фактор - NDF), гепаринсвязывающий ЭФР-подобный ростовой
фактор (НВ-ЭФР), бета-целлюлин, эпирегулин и ростовой фактор вируса коровьей оспы (VVGF). Рассматриваемые ростовые факторы имеют активную
форму в результате эндопротеолитического преобразования внеклеточного
домена, расположенного на поверхности клеток.
Проведенные рядом исследователей эксперименты показали, что ЭФР
и ИФР-1 в различной концентрации действуют на процесс формирования
доминантного фолликула, а также на функционирование гранулезных клеток.
Оба фактора взаимосвязаны между собой и участвуют в совместном действии на процесс фолликулогенеза. В соответствии с протоколом, концентрация ЭФР в питательной среде была 10 нг/мл, концентрация ИФР составила 0, 1, 10 или 100 нг/мл. Кроме этого, применяли совместное действие факторов ЭФР в концентрации 10 нг/мл + ИФР 50 нг/мл. Общее количество пре-
28
антральных фолликулов составляло 240, которые были объединены в группы
по 15. Влияние ЭФР на рост и изменения фолликулов фиксировали в динамике, через 24, 48, 72 и 96 часов наблюдения [94].
Митогенный эффект ЭФР наблюдался в среде, содержащей фетальную
телячью сыворотку. В присутствии как одного ЭФР, так и при совместном
действии ЭФР + ИФР наблюдался высокий уровень пролиферации гранулезных клеток, апоптоз клеток был заторможен. Формирование антральной полости происходило как в среде, содержащей фетальную телячью сыворотку,
так и без нее. В последующем отмечалось накопление ФЖ, увеличение размера ооцита, что способствовало росту фолликула [94].
Концентрация ЭФР в ФЖ малых антральных фолликулов составила
13.6±1 нг/мл, по сравнению с большими преовуляторными фолликулами, где
концентрация ЭФР была <6 нг/мл. По мнению авторов [94], данный фактор
роста стимулирует образование преантральных фолликулов у человека.
Подобные результаты были получены при экспериментах на мышах,
хомяках и крупном рогатом скоте. Кроме того, у последних наряду с перечисленными эффектами в присутствии ЭФР наблюдалась выраженная пролиферация клеток теки [94].
Кроме перечисленных факторов роста, регулирующих пролиферацию и
дифференцировку клеток фолликулов, большое значение имеют факторы
некроза опухолей, обеспечивающие процесс запрограммированной клеточной гибели.
1.2.3. Семейство фактора некроза опухолей (FasL/FasR)
Нормальное функционирование организма возможно благодаря динамическому равновесию обновляющихся клеток и тканей, которое в свою
очередь обеспечивается двумя разноплановыми процессами – размножением
клеток путем митоза и гибелью клеточных популяций. Апоптоз является неотьемлемой стороной таких физиологических состояний организма как эм-
29
бриогенез, морфогенез, клеточная дифференцировка, а также тканевый и
клеточный гомеостаз [1,29,32].
Поддержание постоянства состава клеточных элементов в органах и
тканях организма, гибель клеток, закончивших свой жизненный цикл – такова основная физиологическая роль апоптоза. Нормальная жизнедеятельность
многоклеточных организмов невозможна без него. Многие ответные реакции
организма на внешние воздейтствия протекают путем реализации процесса
апоптоза [57,66].
Рассматриваемый процесс возможен благодаря участию специфических протеаз и нуклеаз, кроме того, он генетически контролируемый и энергозависимый [25,38,75]. Изменения в реализации данной программы приводят к различным заболеваниям.
Представители семейства фактора некроза опухолей обеспечивают
апоптоз клетки.
Морфологические признаки клетки, вступившей в апоптоз, подробно
описаны: уменьшенный размер, сморщенное ядро, уплотнение и фрагментация хроматина с последующим процессом деградации. Уникальность и физиологическая целесообразность апоптоза привела к его детальному изучению, в том числе и в клетках яичника.
В эмбриональный период, примерно на 20–24-й неделях гестации,
наблюдается уменьшение овариального резерва. При рождении девочки величина овариального резерва составляет 1–2 млн. антральных фолликулов
(примордиальных, первичных, многослойных бесполостных и полостных).
Пубертатный период характеризуется содержанием от 300 до 450 тысяч
яйцеклеток в яичниках, из которых около 500 будут овулировать на протяжении репродуктивного периода женщины [34].
В 1993 году специальные исследования показали морфологическое
сходство процесса фолликулярной атрезии и апоптоза. Так, преовуляторный
фолликул с окружающими его клетками эпителия яичника во время процесса
овуляции подвергаются дегенерации – процессу, схожему с апоптозом. Экс-
30
периментально было показано, что посредством апоптоза осуществляется
механизм атрезии фолликулов. Данный процесс можно наблюдать в атретических фолликулах, в эпителии яичника и в желтом теле [138,144].
Рис. 4. Развитие фолликулов яичника: эмбриональный и внеутробный
период [144]
Большинство фолликулов подвергается атрезии на стадии малых антральных. Данный процесс регулируется эндокринными факторами (ФСГ и
ЛГ), паракринными факторами (ИФР-1, ЭФР, оФРФ, активином, ИЛ-1b).
К стимулирующим факторам относят туморнекротический фактор-ɑ
(TNF- ɑ), ГнРГ, IL-6, свободные радикалы. K. Kugu c соавторами идентифицировали в структурах яичника белки bcl, bax и p53. Представители семейства белков p53 включают важные регуляторы апоптоза. Среди них bcl-2 и
bcl-xl – антиапоптотические, а такие гены как bax, bid, bod и bcl-xS - проапоптотические [138].
Основной функцией семейства белков bcl-2 является высвобождение
проапоптотических факторов, в частности цитохрома с – основного звена механизма клеточной смерти, который мигрирует их митохондрии в цитозоль.
В митохондриях клетки локализованы различные проапоптотические факторы, которые высвобождаются в цитоплазму после специфического сигнала.
Это, в первую очередь, - цитохром с, который, совместно с апоптотическим
31
протеаза-активированным фактором-1 и прокаспазой-9, образует специфический комплекс. Образовавшийся специфический комплекс активирует каспазу-3, после чего на поверхности клетки появляются рецепторы фосфатидилсерина. Активированная форма каспазы приводит к высвобождению ДНКактивируемой каспазы (CAD), приводящей к расщеплению ДНК [154,155].
Схематично рассмотренный механизм апоптоза в яичниках представлен на
рис. 5.
Рассмотренный механизм является основным, но не единственным механизмом реализации запрограммированной клеточной смерти. Так, например, при действии радиации повреждается молекула ДНК, и апоптоз запускается экспрессией белка р53. В данном механизме с лигандом связываются такие рецепторы как СД95/Fas, фактор некроза опухолей, приводящий к образованию комплекса, посылающего клетке сигнал о ее гибели. Затем с помощью Fas-ассоциированного белка, подающего сигнал о гибели клетки, происходит активация каспазы-8 [32].
ФСГ и ЛГ выступают важнейшими регуляторами апоптоза. На поверхности антрального фолликула экспрессируются ФСГ-рецепторы и такой
фолликул является ФСГ-зависимым. Во время менструального цикла с помощью ФСГ осуществляется отбор новых фолликулов. К факторам, подавляющим апоптоз, относятся эстрогены, оФРФ, ИФР-1, ЭФР, активин, IL-1b.
Например, IL-1b на стадии преовуляторного фолликула в 3 раза сильнее ингибирует апоптоз, чем на стадии ранних антральных фолликулов. К внутриклеточным медиаторам подавления апоптоза относят цГМФ.
Была выявлена степень эффективности каждого фактора в подавлении
апоптоза на стадии ранних антральных фолликулов: ФСГ>IGF-I, IL-1b>ЛГ,
EGF, bFGF, активин >>>гормон роста [1,32].
В исследованиях, проведенных М.В. Ямановой с соавторами (2004 г.),
были проанализированы образцы ФЖ 72 доминантных фолликулов стимулированных яичников пациенток. В образцах антральных фолликулов женщин
с эндокринным бесплодием было выявлено достоверное увеличение содер-
32
жания растворимой формы Fas R (р<0,01), лиганд которого располагается на
мембране ооцита. Данный фактор является проапоптотическим маркером для
развивающихся ооцитов. В исследовании наблюдали достоверное снижение
отношений Е2/Тест (р<0,01) и ИФР-1/ЭФР (р<0,01) у женщин с эндокринным
бесплодием. Наличие андрогенного микроокружения характеризует фолликулы как находящиеся в состоянии атрезии. Полученные данные являются
косвенным подтверждением активации апоптоза ооцитов в атретических
фолликулах при эндокринном бесплодии [2].
Рис. 5. Основные механизмы апоптоза в яичниках [120]
Процесс атрезии фолликулов характеризуется спонтанным временным
началом. Важным моментом в редукции тысяч фолликулов является атрезия
фолликулов на стадии третичных, которые не будут овулировать. Экспрессия
гена bcl-2, главной функцией которого является предотвращение апоптоза,
необходима для развития вторичного фолликула из первичного [8].
33
Представители семейства фактора некроза опухолей ФНО – индукторы
апоптоза, одни из самых значимых мембранных белков в клетке, экспресируемых в яичниках человека. К этому семейству относятся факторы, вовлеченные в процесс развития фолликулов и их атрезии, а именно ФНО, Fas/Fas
Ligand (Fas L), TRAIL. Регуляцию апоптоза гранулезных клеток яичника
осуществляет ген Fas и его лиганд Fas L, где Fas выступает в роли рецептора. Индукция апоптоза происходит при связывании Fas лиганда с Fas рецептором [112,128].
Экспериментально было показано, что ооциты первичных и примордиальных фолликулов иммунопозитивны к Fas, во вторичных и антральных
фолликулах ооциты слабо иммунопозитивны, а в преовуляоторных фолликулах ни один из структурных элементов фолликула не дает положительную
реакцию на Fas. Эти данные подтверждают, что Fas-антиген выступает в роли медиатора апоптоза. Механизм клеточной гибели, вызванный связыванием рецептора медиатора апоптоза, может быть приведен в действие Fasлигандом ооцитов в преантральных фолликулах, а также ооцитов или соматических клеток в антральных фолликулах [138,145].
Одним из возможных факторов, приводящим к запуску процесса
апоптоза, может быть нарушение кровоснабжения фолликулов. Адекватное
кровоснабжение обеспечивает полноценный рост фолликула, что предопределяет успех последующих событий фолликулогенеза.
1.3. Ангиогенез в растущих фолликулах яичника. Факторы роста в
регуляции неоангиогенеза
1.3.1. Сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР)
Одним из важных физиологических процессов, необходимых для формирования и развития полноценного доминантного фолликула, является ангиогенез. Во время развития фолликула и последующего образования желтого тела в тека-клетках яичника формируется сосудистая система. Дополни-
34
тельные сосуды могут формироваться в месте разорвавшегося фолликула
[13,17,19].
Обзор факторов, регулирующих процесс ангиогенеза в границах СЭФР
и ФРФ, представлен в табл. 4.
Рассмотрение ангиогенеза в растущих фолликулах яичника необходимо
начать с начальных стадий развития фолликула, при этом важно отметить,
что инициация васкуляризации начинается в клеткaх теки. Как примордиальные, так и первичные фолликулы получают необходимые вещества и кислород путем их пассивной диффузии из клеток стромы [165,166,168].
Формирование индивидуальной капиллярной системы вокруг каждого
фолликула является обязательным и неотъемлемым этапом его дальнейшего
развития.
На начальной стадии капиллярная сеть выглядит тонкой с неровными
границами и представлена единственным слоем. Она окружена слоем клеток
теки и слоем гранулезных клеток. В таком виде капиллярная сеть остается на
всем протяжении процесса фолликулогенеза [121,162].
Инициация формирования капиллярной сети в гранулезных и текаклетках происходит под действием СЭФР, в то время как формирующаяся
структурная и функциональная полноценность васкулярной системы требует
скоординированного действия целого объединения факторов (СЭФР, оФРФ,
фактор роста плаценты (ФРП), ангиопоэтин, тромбоспондин, ангиостатин).
Данные результаты были получены в экспериментах на крупном рогатом скоте – коровах. Так, например, ангиопоэтин не обнаруживается в клетках теки до антральной стадии развития фолликула, а введение СЭФР в циклах стимуляции способствует развитию вторичных фолликулов. Однако механизмы действия данных факторов в полной мере не изучены [173].
ФРП и ФРФ-2 присутствуют в ооцитах на примордиальной и первичной стадии развития фолликула, воздействуя на рост фолликула в тандеме и
инициируя его переход с примордиальной стадии в стадию первичного ро-
35
ста. Данные факторы обнаруживаются в преантральных фолликулах, способствуя их росту и формированию текальной ткани [167,168].
Таблица 4
Главные регуляторы ангиогенеза и их свойства
Лиганд
Изоформа
Биохимические
свойства
Специфические
рецепторы
Функция
Индукторы
ангиогенеза
СЭФР121,
СЭФР145,
СЭФР165,
СЭФР189,
СЭФР206
Гепаринсвязывающий гликопротеин (исключение
СЭФР121) СЭФР121
и СЭФР145, 165
секретируются и
растворяются, в
то время как,
формы СЭФР189,
непосред206
ственно связываются с клеткой
Гепаринсвязывающий
СЭФP Р-1(Flt-1) ,
СЭФP
Р-2
(KDR/murine
аналог
Flt1обладающий
тиронкиназной
активностью),
СЭФР Р-3 (Flt-4),
нейрофилин -1 и
-2.
Стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток, индуцирует действие серийных
протеаз и коллагеназ,
увеличивает хемотаксис
эндотелиальных
клеток и вазодилатацию
Высокоаффинные рецепторы
ФРФ1-4
(обладают тирозинкиназной активностью)
Стимулирует пролиферацию и модулирует функцию эндотелиальных клеток, ингибирует апоптоз, отвечают за хемотаксис
Семейство
сосудистоэндотелиального
фактора роста (СЭФР)
Фактор
роста
фибробластов
(ФРФ-1,
ФРФ-2)
Цитоплазматический 18
кДа,
ядерный
22-34 кДа
В преантральной стадии фолликулогенеза плотность сосудов капиллярной системы преантрального фолликула значительно увеличивается. Отмечено, что 40 % всех пролиферирующих клеток теки – эндотелиальные
клетки. Для преантрального фолликула также характерна значительная экспрессия мРНК СЭФР в гранулезных и тека- клетках. Возможно, что последующая селекция преантральных фолликулов связана со степенью васкуляризации [26,78,105,124].
В антральной стадии развития фолликула его васкулярная оболочка состоит из двух капиллярных сетей: внутренней – основной мембраны и
наружной – текальной. Неоваскуляризация важна для роста антрального
фолликула, а также доминирования преовуляторного фолликула. Доминант-
36
ный фолликул характеризуется обширной васкуляризацией и высокой концентрацией СЭФР [119,162].
Практическая значимость рассматриваемых процессов прослежена в
работе Д.А. Ниаури с соавт. (2010 г.). Было отмечено, что нарушения менструального цикла и функциональное бесплодие характеризуются изменением кровоснабжения яичников и матки. В своем исследовании они провели
оценку гемодинамических параметров репродуктивной системы женщины
при различных формах овариальной недостаточности, включая гиперпролактинемию и овариальную гиперандрогению. При исследовании кровотока в
яичниках в период селекции предполагаемого доминантного фолликула из
когорты синхронизированных фолликулов наблюдалось усиление кровотока
в строме яичника с доминантным фолликулом у здоровых женщин. При различных видах овариальной недостаточности достоверных различий параметров кровотока в яичнике, содержащим доминантный фолликул, не было выявлено. Нарушение процесса васкуляризации, по мнению этих исследователей, является ключевой причиной развития овариальной недостаточности,
приводящей к ослаблению функции лидирующего фолликула в процессе
фолликулогенеза и дальнейшим затруднениям неоангиогенеза желтого тела
[40].
Действие СЭФР имеет несколько аспектов, что обусловлено существованием пяти изоформ данного фактора роста с различными биохимическими
свойствами. По данным литературы, мРНК рассматриваемого фактора впервые обнаруживается в тека- и гранулезных клетках зрелых вторичных фолликулов, но отсутствует в примордиальных, первичных и ранних вторичных
фолликулах [121,140].
Экспрессия изоформ СЭФР различна в процессе фолликулогенеза. Так,
мРНК СЭФР164 экспрессируется в гранулезных клетках крупного рогатого
скота и не зависит от концентрации Е2, но находится в прямой зависимости
от концентрации Прог. Противоположный эффект данные стероиды оказывают на экспрессию мРНК СЭФР120 [77,78,105].
37
Известно, что СЭФР120 не способен связываться нейрофилином-1 из-за
низкой митогенной активности. мРНК нейрофилина-1 присутствует в гранулезных и тека-клетках, а мРНК нейрофилин-2 экспрессируется только в слое
тека-клеток. Более того, секреция нейрофилина-1 регулируется прогестероном и эстрадиолом в гранулезных клетках крупного рогатого скота. В целом
рассматриваемый фактор локализован в аваскулярной зоне гранулезных клеток [78,146,156,159].
Биологические эффекты СЭФР значительно модулируются скоординированным действием других ангиогенных маркеров (ангиопоэтин, фактор роста фибробластов, фактор роста плаценты). Концентрация ФРФ-2 заметно
увеличивается на заключительной стадии развития фолликулов у крупного
рогатого скота, а максимальная концентрация тромбоспондина и его рецептора CD36 обнаруживается в малых антральных фолликулах. Предполагается, что регуляция тромбоспондином может играть ключевую роль в фолликулярной атрезии путем ингибирования ангиогенеза. Экспрессия данного ангиогенного маркера увеличивается под действием ЛГ в гранулезных клетках
крыс и присутствует на ранних стадиях формирования желтого тела [75,77,
105,116,121,124].
Таким образом, формирование сосудистой сети имеет сходные временные рамки с активным ростом и преобладанием доминантного фолликула.
Это обстоятельство оказывает первостепенное значение для диагностики
развивающегося бесплодия, что связано с использованием значимых маркеров ангиогенеза, таких как СЭФР и эндотелин [85,102,162]. Изменения этих
маркеров позволяют оценить и/ или выявить степень нарушения системы
кровоснабжения фолликулов на разных стадиях их развития.
1.3.2. Эндотелин
Характер ангиогенеза, определяемый синтезом ангиогенных факторов
роста и их рецепторами, является не единственным параметром, влияющим
на состояние кровоснабжения фолликула в процессе фолликулогенеза. Во
38
многом этот процесс зависит также от свойств эндотелия и баланса эндотелиальных факторов, контролирующих тонус сосудов [20,33,67,79,86,107,119,
142,146].
Эндотелиальные клетки выстилают внутреннюю поверхность сосудов,
эндотелий формирует барьер между кровью и гладкой мускулатурой сосудов
и функционирует в качестве модулятора функций сосудов. Под контролем
эндотелина происходит регулирование сосудистого тонуса, гемостаза, транспорта липидов и иммунологической реактивности [12,20,95,96].
Для выявления физиологической роли эндотелина ФЖ в динамике развития фолликулов при эндокринном бесплодии и оценке влияния указанного
маркера на величину пула малых антральных фолликулов, их рост и селекцию доминантного фолликула необходимо рассмотреть особенности химического строения эндотелина.
Семейство эндотелинов представлено четырьмя эндотелиновыми пептидами, имеющими сходную химическую структуру. Хорошо изученными
являются эндотелин-1, эндотелин-2 и эндотелин-3 [171].
Эндотелин-2 отличается от эндотелина-1 двумя аминокислотными
остатками в структуре N-концевого участка, а эндотелин-3 и эндотелин-1
различаются шестью аминокислотными остатками. На основании такого
сходства аминокислотной последовательности предполагается общность
происхождения данных групп молекул эндотелинов [122].
Синтез эндотелина заключается в последовательном отщеплении олигопептидных фрагментов у неактивного предшественника препроэндотелина,
после чего он превращается в активную форму. В свою очередь, препроэндотелин человека состоит из 212 аминокислотных остатков, а N-концевой участок характеризуется наличием гидрофобной последовательности, назначением которой, по мнению авторов, является транспорт данного предшественника через мембрану клеточного ядра для последующих его превращений
[97,117].
39
В табл. 5 представлены функции основных видов эндотелина, места их
синтеза.
Таблица 5
Свойства эндотелинов и места их синтеза
Эндотелин-1
Эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки гладкой мускулатуры, нейроны, астроциты
головного и спинного мозга, мезангиальные клетки почек, внутриматочные клетки, гепатоциты,
клетки Сертоли, эпителиоциты
молочной железы.
Стимулирует образование ряда
простагландинов.
Эндотелин-2
Синтез
Почки, кишечник, в
небольших количествах обнаруживается в миокарде, матке, плаценте.
Функции
Не известны
Эндотелин-3
Циркулирует в плазме крови,
источник неизвестен. В высоких концентрациях обнаруживается в головном мозге.
Стимулирует образование ряда
простагландинов.
В табл. 6 показано сродство эндотелиновых рецепторов к различным
изоформам.
Таблица 6
Сродство эндотелиновых рецепторов (ЭТА, ЭТв, ЭТс) к изоформам
эндотелина-1, -2, -3 (ЭТ-1,2,3)
Тип эндотелинового рецептора
ЭТА – рецептор
ЭТв – рецептор
ЭТс – рецептор
Сродство к изоформам
ЭТ-1>ЭТ-2>>ЭТ-3
ЭТ-1= ЭТ-2= ЭТ-3
ЭТ-3> ЭТ-1
Исследования, проведенные группой итальянских ученых CheMyong
Ko, Mary C. Gieske, Linah Al-Alen и др. (2006 г.) показали наличие экспрессии ЭТ-1 в гранулезных клетках яичников человека и проявление ЭТ-1 иммунореактивности в ФЖ, полученной от женщин при индукции суперовуляции в лечебных циклах ЭКО.
В полученной ФЖ уровень ЭТ-1 был выше в гонадотропинстимулированных циклах, по сравнению со спонтанными циклами. В ходе
проведенных экспериментов была доказана экспрессия рецепторов ЭТА и
ЭТв в яичниках человека. Однако концентрация данных рецепторов была
40
различна: концентрация ЭТв гораздо выше, чем ЭТА. Метод гибридизации in
situ обнаружил высокую экспрессию обоих типов рецепторов в период формирования кровеносной системы яичников. В овуляторном фолликуле отмечали концентрацию большого количества рецепторов к ЭТА, локализованных
в тека interna [97]. Представленный эксперимент свидетельствует о значительной роли эндотелинов в процессе ангиогенеза.
Присутствие рассматриваемого фактора в ФЖ женщин, вступивших в
лечебный цикл ЭКО и подвергающихся индукции суперовуляции, показывает включенность эндотелиновой системы в процесс фолликулогенеза человека. Данное обстоятельство демонстрирует значительную практическую значимость исследований эндотелинов в динамике развития фолликулов при эндокринной патологии.
1.4. Нарушение фолликуло- и стероидогенеза при гиперандрогении
и гиперпролактинемии
Значимость стероидных гормонов в организме женщины сложно переоценить, поскольку они выступают регуляторами детородной функции. Предупреждение и лечение различных форм овариальной недостаточности у
женщин репродуктивного возраста тесно связано с пониманием механизмов
возникновения данных состояний, а также разнообразием клинических симптомов.
Гиперандрогенные состояния выявляются у 10 - 20 % женщин с различными нарушениями менструальной функции [22, 64, 88, 90,101,130].
Наличие двух основных источников происхождения андрогенов в женском
организме – яичников и надпочечников, обусловливает клинические варианты синдрома гиперандрогении: надпочечниковой и яичниковой [71].
Синдром овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза наблюдается примерно у 5 % женщин репродуктивного возраста и у 35-41 % пациенток, страдающих бесплодием, обусловленным хронической ановуляцией
[43, 44].
41
Патофизиологические процессы, развивающиеся в репродуктивной системе женщины при данном синдроме, обусловлены действием избыточной
продукции андрогенов на органы и ткани-мишени.
Морфологически яичниковая гиперандрогения характеризуется наличием множества кист, отсутствием доминантного фолликула, желтого тела,
утолщением белочной оболочки, гиперплазией текальной ткани. Данное состояние характеризуется повышением уровней свободного и общего Т и Ан,
соотношения ЛГ/ФСГ, хронической ановуляцией, бесплодием [141].
Избыточная продукция андрогенов при ОГНГ зависит от концентрации
ЛГ. Повышение ЛГ влечет за собой повышение индекса ЛГ/ФСГ. Гиперстимуляция ЛГ морфологически проявляется гиперплазией тека ткани яичников
[35,47,60].
В настоящее время в репродуктивной эндокринологии доказана значимость пролактина. Гиперпролактинемия – состояние, характеризующееся избыточным содержанием пролактина, что является показателем неблагополучия репродуктивной системы человека. Пролактин – полипептидный гормон,
молекула которого состоит из 199 аминокислот с молекулярной массой 23
кДа, и имеет высокую рецепторную связывающую и биологическую активность [23,68].
Обсуждая патофизиологию ФГП, целесообразно отметить механизм
контроля секреции пролактина, который складывается из сложного каскада
действий множества гормонов и различных физиологических стимулов. В
данном каскаде задействован гипоталамус, вырабатывающий ингибирующие
факторы, в частности дофамин. Именно этот ингибирующий агент способен
вызывать уменьшение секреции пролактина [87,149].
Особое внимание следует обратить на воздействие пролактина на репродуктивную систему. Установлено, что высокие уровни данного гормона
подавляют синтез основных стероидных гормонов и секрецию ЛГ, что является причиной развивающейся ановуляции, аменореи [23,80].
42
В заключение литературного обзора необходимо отметить важность
каждого внутриклеточного регулятора репродуктивный системы женщины,
начиная от факторов, контролирующих рост и развитие фолликула, и заканчивая факторами роста, стимулирующими или ингибирующими ангиогенез, а
также состояние эндотелия и баланса эндотелиальных факторов. При этом
исключительная важность каждого из вышеуказанных биологических регуляторов в процессе фолликулогенеза в конечном итоге может влиять на исход лечебного цикла ЭКО.
43
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект и методы экспериментальной части исследования
Для решения поставленных задач диссертационного исследования проанализированы образцы фолликулярной жидкости (n=187) полостных фолликулов разной степени зрелости, полученных от пациенток с ОГНГ и ФГП,
проходивших лечение в лечебных циклах ЭКО.
Выполнение работы одобрено локальным этическим комитетом Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф.
Войно-Ясенецкого (выписка из протокола № 19 от 25 ноября 2009 года).
В исследовании
соблюдались этические принципы, предъявляемые
Хельсинкской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World
Medical Association Declaration of Helsinki (1964, 2000 ред.).
Образцы ФЖ были получены специалистами Красноярского Центра
репродуктивной медицины (директор – к.б.н. А.В.Светлаков) и Центра гинекологической эндокринологии и репродукции «Три сердца» (директор –
С.А.Сыромятникова) от 140 пациенток с диагнозом «Бесплодие», находившихся там на лечении.
Возраст пациенток варьировал от 21 до 42 лет и в среднем составил
32,7 ± 1,5 года. Период предшествующего бесплодия у обследованных супружеских пар составила 3 – 18 лет и в среднем – 7,6 ± 1,5 года. У половых
партнеров пациенток была подтверждена нормоспермия при двухкратном
исследовании эякулята.
С целью выявления причин бесплодия пациентки обследовались специалистами Центров репродуктивной медицины и «Три сердца» согласно
стандартному комплексному клинико-лабораторному протоколу, включающему общеклиническое и ультразвуковое исследование, гормональные методы функциональной диагностики, посткоитальный тест и лапароскопическое
обследование.
Образцы ФЖ от пациенток с изолированными формами эндокринного
бесплодия были разделены на 2 группы в зависимости от варианта заболева-
44
ния: образцы ФЖ от женщин с ФГП (n=62); образцы ФЖ от женщин с ОГНГ
(n=65). Контрольную группу составили образцы ФЖ от женщин с трубноперитонеальной формой бесплодия (ТПФ) (n=60). По длительности бесплодия группы были сопоставимы между собой.
Критериями для включения женщин в исследование явились:
в контрольную группу – данные анамнеза, наличие двухфазного менструального цикла, отсутствие симптомов другой эндокринной патологии,
инфекционной патологии и патологических изменений эндометрия; лапароскопически подтвержденный диагноз ТПФ;
в группу с ФГП – наличие нарушений менструального цикла, хроническая ановуляция, бесплодие, повышенный уровень пролактина (более 480
мМЕ/мл) в сыворотке крови при трехкратном исследовании, эутиреоз, отсутствие аденомы гипофиза при рентгенологическом исследовании гипофиза,
отсутствие симптомов другой эндокринной патологии [141].
в группу с ОГНГ – наличие нарушений менструального цикла, хроническая ановуляция, бесплодие, гирсутизм, повышенные уровни яичниковых
и/или надпочечниковых андрогенов в сыворотке крови, поликистозные яичники, данные гистологического исследования биоптатов ткани яичника
[101,113].
Стимуляцию овуляции во всех лечебных циклах ЭКО осуществляли по
стандартному длинному или короткому протоколу с использованием препаратов агонистов ГнРГ (а-ГнРГ) (Декапептил-дейли) в сочетании с человеческим рекомбинантным гонадотропином (Пурегон). Схема стимуляции выбиралась в зависимости от возраста пациентки и состояния яичников.
Через 35–36 часов после введения овуляторной дозы ХГ (овитрель)
производилась трансвагинальная пункция (ТВП) яичников в целях аспирации
ооцитов. В качестве профилактики развития синдрома гиперстимуляции
яичников пунктировали все фолликулы, содержащие антральную жидкость.
ТВП проводили в гинекологическом кресле под контролем ультразвуковой эхографии при разрешающей способности УЗИ-сканера ≥ 1 мм. Для
45
проведения трансвагинальной аспирации ооцитов непосредственно к датчику
прикрепляли пункционный адаптер, что обеспечивает движение иглы строго
по специальной пунктирной линии на экране монитора. После того как презерватив, содержащий стерильный гель, надевали на датчик, и к нему фиксировали стерильную пункционную насадку, врач, манипулируя датчиком,
обеспечивал получение оптимального эхографического изображения яичника.
После прокалывания стенки яичника и вхождения в полость фолликула
включали вакуумотсос, и под давлением 130–140 мм водного столба ФЖ поступала в стерильные пробирки. Полученную ФЖ передавали эмбриологам
для идентификации ооцитов, последующего их культивирования и оплодотворения.
После забора ооцитов, образцы ФЖ перемещали в стерильную пластиковую посуду и впоследствии использовали в эксперименте. Образцы анализировали по принципу: «одна пациентка – один доминантный фолликул» или
«одна пациентка – 2–3 фолликула разной степени зрелости».
Объем полученной ФЖ варьировал от 10 – 15 мкл до 6 - 8 мл для фолликулов диаметром от 0,9 – 2 мм до 16 – 20 мм, соответственно.
Стадии развития фолликулов определяли в зависимости от их диаметра. Таким образом, в исследование включались фолликулы от стадии антральных до преовуляторных (IV – VIII классы) [106].
Внутригрупповые показатели сравнивали с таковыми в стадии антрального фолликула. Показатели исследуемых групп сравнивали с данными
соответствующей стадии развития фолликула в контрольной группе (ТПФ).
Поскольку в естественных условиях ФЖ является средой для развития
ооцита, формирует его микроокружение и является источником веществ, необходимых для его развития, исследование состава ФЖ позволяет судить о
функциональной компетентности ооцитов.
Для выявления силы и характера взаимосвязей влияния гормонов и
факторов роста на показатели эффективности программы ЭКО и ПЭ были
46
использованы ранее полученные нашей исследовательской группой клинические данные [74]: эффективность программ ВРТ оценивалась с использованием показателей - частота нормального оплодотворения (ЧНО), частота
наступления имплантации (ЧНИ), число полученных эмбрионов (ЧПЭ), кумулятивный балл полученных эмбрионов (КБПЭ) в соответствии с классификацией Гарднера [50].
Дизайн исследований образцов ФЖ представлен на рис. 6.
Рис.6. Дизайн исследования
2.2. Метод иммуноферментного анализа
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) в классическом варианте
основан на принципе использования твердой фазы иммуносорбента с иммо-
47
билизованными ферментами. Тест-система ИФА использует антитела, иммобилизованные на твердой фазе (сорбированные на микролунках) и моноклональные антитела мыши в ферментном конъюгате (пероксидаза хрена).
По истечении 45 минут инкубационного периода при комнатной температуре, лунки промываются водой, чтобы смыть меченые антитела. Раствор тетраметилбензидина (TMB) добавляется на 20 минут, в результате чего
окраска становится синей. Развитие изменения цвета прекращается при добавлении 2н HCl, причем цвет меняется на желтый и спектрофотометрически
измеряется при 450 нм. Концентрация определяемых веществ прямо пропорциональна интенсивности цвета тестового образца.
В работе применяли полуавтоматический иммуноферментный анализатор Zenith (RADIM, Италия) и автоматический иммунолюминесцентный
анализатор Immulite (DPC, США).
Исследование гормонов и факторов роста осуществлялось с использованием стандартных наборов реактивов, согласно приложенным к ним инструкциям: набор для определения тестостерона – «Immulite 1000 Total Testosterone (PILKTW-12)», набор для определения эстрадиола – «Immulite 1000
Estradiol (PILKE2-14)», набор для определения ИФР-1 – «Non-Extraction IGFI ELISA DSL-10-2800», набор для определения эндотелина-1 – «Bl-20052 Endotelin (1-21)», набор для определения ЭФР – «Invitrogen Immunoassay Kit
KHG0062», набор для определения СЭФР – «BMS277/2 human VEGF-A Platinum ELISA», набор для определения sFasR – «BMS245 human sAPO-1/Fas
Platinum ELISA», набор для определения sFasL – «BMS260/2 human sFas-L
ELISA», набор для определения оФРФ – «Invitrogen ELISE Kit KHG0021»,
набор для определения ТФР-ß1 – «BMS249/3 human TGF-ß1 Platinum
ELISA».
Концентрация гормонов Т, Е2, выражалась в нмоль/л, а концентрация
sFasL, sFasR, СЭФР, ИФР-1, ЭФР, ТФР-ß1, эндотелина, оФРФ – в пкг/мл.
Определение факторов и стероидных гормонов осуществлялось по схожей
методике. На выполнение одного исследования требовалось от 10 мкл ФЖ.
48
Принцип действия теста, необходимые реактивы, проведение анализа,
обработка результатов рассмотрены на примере определения содержания
ТФР-ß1.
Выполнение теста осуществляется в несколько этапов:
1) используется 96-луночный планшет с анти-человеческими ТФР-ß1
антителами, абсорбированными в микролунках;
2) человеческие ТФР-β1, присутствующие в инкубационном образце,
связываются с антителами, абсорбированными в микролунках;
3) добавление биотин–конъюгированного комплекса и связывание его с
человеческим ТФР-β1, связавшимся с первым антителом;
4) промывка планшета. Добавление стрептавидин–HRP комплекса и
связывание его с биотин–конъюгированным комплексом и первыми антителами.
Реактивы для определения ТФР-β1 «BMS249/3 human TGF-ß1 Platinum ELISA» приведены в табл.7.
Проведение анализа включает следующие последовательные действия:
А. Приготовление образцов.
Разведение сыворотки, плазмы или супернатанта клеточной культуры 1: 10 буферным раствором (1Х) в соответствии со следующей схемой:
20 мкл образца +180 мкл буферного раствора (1х)
Добавление 20 мкл 1N HCl к 200 мкл предварительно растворённого
образца, смешивание и инкубирование в течении 1 часа, при комнатной температуре.
Нейтрализация добавлением 20 мкл 1N NaOH.
Таблица 7
Реактивы для определения ТФР-ß1 при проведении ИФА
Количество
Оборудование, реактивы
1
алюминиевый контейнер с микролунками и пластиной, покрытой моноклональными антителами и человеческим TGF-β1
1
Пробирка (120мл) биотин–конъюгированный комплекс античеловеческого TGF-β1 моноклонального антитела
1
флакон (150 мл) стрептавидина-HRP
49
2
1
1
1
1
1
1
1
1
6
флакон TGF-β1 лиофилизированные стандарты (4 нг/ мл)
флакон (5 мл) концентрата буферного раствора 20х (РВS с 1 %
полисорбатом и 10% ВSА)
флакон (3мл) 1N HCl
флакон (3мл) 1N NaOH
флакон (15мл) ТМБ (тетраметилбензидин) субстрата
флакон (15 мл) останавливающий реагент (1М фосфорная кислота)
флакон (0,4 мл) синяя краска
флакон (0,4 мл) зелёная краска
флакон (0,4 мл) красная краска
полоска адгезионной (клейкой) плёнки
Б. Определение количества микролуночных стрипов, требуемых для
проведения исследования, количества проб, добавление соответствующего
количества клеток необходимых для заполнения пустых мест и проб. Каждая
проба, контрольный образец исследуется в двух параллельных постановках.
Перемещение дополнительных микролуночных стрип из держателя в контейнер из фольги для высушивания при температуре 2-8 ºС;
В. Промывание микролуночных стрипов производится дважды промывающим буфером (400 мкл) для каждой лунки. Оставить моющий буфер в
лунках на 10-15 секунд перед аспирацией;
Г. После последней промывки пустых лунок и микролуночных стрипов поместить их на гипроскопическую прокладку или бумажное полотенце для удаления остатков моющего буфера. Альтернативные микролуночные стрипы могут быть размещены в перевёрнутом виде на влажной абсорбирующей бумаге не более, чем на 15 минут (не до полного высыхания лунок);
Д. Стандартное разведение на микролуночной пластине (альтернативно стандартное разведение может быть приготовлено в пробирках).
Добавить 100 мкл буферного раствора (1х) в удвоенном количестве ко
всем стандартным лункам. Добавить 100 мкл приготовленного стандарта
(S1=4000 пк/мл) в лунки А1 и А2. Смешать содержимое лунок А1 и А2. В
лунки В1 и В2 добавить раствор приготовленного стандарта S1 (в концентра-
50
ци на каждую лунку=2000 пкгр/мл). Провести данную процедуру 5 раз (разведение от 2000 до 31 пк/мл);
Е. Добавить 100 мкл буферного раствора (1Х) в удвоенном количестве
в пустые лунки;
Ё. Добавить 60 мкл Буферного раствора (1Х) в соответствующие лунки.
Ж. Закрыть адгезионной (клейкой) плёнкой и инкубировать при комнатной температуре (18-25 ºС) в течение двух часов;
З. Приготовить биотин-конъюгированный комплекс;
И. Уберать адгезионную плёнку. Промыть планшет 5 раз, в соответствии с пунктом с протокола исследования;
К. Добавить 100 мкл биотин-конъюгированного комплекса во все лунки;
Л. Закрыть адгезионной (клейкой) плёнкой и инкубировать при комнатной температуре (18 -25 ºС) в течении 1 часа на микропланшетном шейкере.
М. Добавить стрептавидин-HRP раствор во все лунки, включая пустые;
Н. Закрыть адгезионной (клейкой) плёнкой и инкубировать при комнатной температуре (18 - 25 ºС) в течении 1 часа на микропланшетном шейкере;
О. Убрать адгезионную плёнку. Промыть микролуночные стрипы 5
раз, в соответствии с пунктом с протокола исследования;
П. Добавить 100 мкл ТМБ-субстрата во все лунки;
Р. Инкубировать микролуночные стрипы при комнатной температуре
(18-25 ºС) в течение 30 минут, исключая прямое воздействие яркого света.
Следует проводить наблюдения за цветовым проявлением на планшете
и остановкой реакции субстрата. Определение идеального временного периода
для цветового проявления должно быть сделано индивидуально для
каждого раствора;
51
С. Рекомендуется добавить останавливающий раствор, когда цвет первой пробы начнёт изменяться на тёмно-голубой. Реакцию субстрата следует
остановить, как только она достигнет стандарта оптической плотности равной 0,9 – 0,95;
Т. Добавить 100 мл останавливающего раствора в каждую лунку.
Очень важно, чтобы останавливающий раствор был распределён быстро и
равномерно во всех микролунках до полного инактивирования фермента. Результаты обрабатываются сразу же
после добавления останавливающего
раствора или в течение одного часа;
У. Абсорцию определяют при длине волны 450 нм (допустимая длина
волны от 610нм до 650нм). Пустые лунки не учитываются.
Обработка результатов.
- производится вычисление средней величины абсорбции для каждого
набора двойных стандартов и образцов (дубликаты должны быть в пределах
20 % от средней величины);
- строится стандартная кривая методом построения средней абсорбции
для каждой стандартной концентрации на ординате напротив абсциссы с
расположением концентрации человеческого TGF-β1. Проводится наиболее
подходящая кривая через точки на графике (рекомендуется построение кривой по 5 параметрам);
- определяется концентрация циркуляции человеческого TGF-β1 для
каждого образца. Находится значение средней величины абсорбции на ординате и проводится горизонтальная линия к стандартной кривой. В месте пересечения проводится вертикальная линия к абсциссе (с учетом данных о
концентрации человеческого TGF-β1);
- в случае если все инструкции в данном исследовании выполняются
разбавленными образцами 1:30 (20мкл образца + 180 мкл буферного раствора
(1х) + 20 мкл 1N HCl +20 мкл 1N NaOH и 40мкл обработанного образца +
60мл буферного раствора (1х)), то значение, определенное по стандартной
кривой, умножается на коэффицент разбавления (х30);
52
- вычисление образцов с концентрацией, превышающей стандарт, может быть результатом низкого уровня человеческого TGF-β1.
2.3. Расчетные коэффициенты
В качестве расчетных коэффициентов были проанализированы соотношения
маркеров
функциональной
компетентности
ооцитов:
Е2/Т,
ИФР1/ЭФР в ФЖ в динамике созревания фолликулов при эндокринном бесплодии, позволяющие оценить преобладание андрогенного/эстрогенного
микроокружения ооцитов [10].
Лабораторные ИФА исследования проводились в ООО «РЛДЦ ИХМИ»
(директор – к.б.н. А.В. Светлаков).
2.4. Статистическая обработка результатов
Анализ данных производили с помощью стандартных методов статистической обработки с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Для представления полученных данных использовали методы описательной статистики.
Статистический анализ полученных результатов включал следующие
методы: в пределах каждой выборки находили основные статистические характеристики: среднее значение, дисперсию, среднее квадратичное отклонение, ошибку среднего. Показатели исследуемых групп сравнивали с аналогичными показателями контрольной группы.
Для проверки статистических гипотез был использован непараметрический критерий Манна-Уитни для оценки показателей в двух независимых
групп, критерий Вилкоксона для двух зависимых групп и двусторонний критерий Фишера при сравнении групп по качественному признаку.
Для оценки связи признаков применяли корреляционный анализ с расчетом корреляции по методу Спирмена. Результаты оценивали с учетом следующих величин r: | r | ≤ 0,25 – корреляция слабой силы; 0.25 ≤ | r | ≤ 0,75 –
корреляция умеренной силы; | r | ≥ 0,75 – тесная корреляция. Критический
53
уровень значимости при проверке статистических гипотез в исследовании
принимался равным 0,05.
В работе также использовался статистический анализ парных взаимосвязей переменных. В качестве независимой переменной выступали сигнальные молекулы, являющиеся ключевыми на определенных этапах фолликулогенеза, динамика которых определялась в фолликулах разной степени зрелости (IV – VIII класс). Некоторые интегральные показатели оценки исходов
лечебных циклов ВРТ выступали в качестве зависимой переменной.
Для проверки каждой из трех выборок (ОГНГ, ФГП, ТПФ) на однородность было применено правило «трех сигм», в результате чего были исключены неоднородные данные, выходящие за интервал от оценки среднего. Для
того чтобы определить факторы роста, оказывающие наибольшее влияние на
показатели эффективности ЭКО, с помощью метода наименьших квадратов
были построены линейные регрессионные модели зависимости для каждого
из 4 показателей от каждого из 9 факторов во всех трех группах с помощью
метода наименьших квадратов.
Проверка статистической значимости оценки коэффицента корреляции
(R) осуществлялась сравнением его модуля с табличным значением Rтабл (при
доверительной вероятности 0,95). Если модуль оценки коэффицента корреляции больше табличного, то оценка R статистически значима, независимая
переменная X может быть отнесена к существенно влияющим на зависимую
переменную Y.
Качество аппроксимации истиной зависимости линейным уравнением
регрессии оценивалось с помощью дисперсионного отношения (критерия
Фишера Fp). В результате сравнения Fp с табличным значением Fт, если
Fp>Fтабл, то с доверительной вероятностью 0,95 гипотеза об адекватности математической модели не отвергается.
Полученные экспериментальные данные представлены в виде полей
корреляций, а их аппроксимация – уравнение регрессии в виде линии.
54
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Стероидогенез на разных этапах роста и созревания фолликулов при гиперандрогении и гиперпролактинемии
Фолликулогенез и созревание ооцитов – сложные молекулярноклеточные процессы, зависящие от координации эндокринных и паракринных механизмов и сопровождающихся морфологическими и функциональными изменениями фолликула и ведущими к клеточной дифференцировке и
развитию ооцита. Данные преобразования зависят от тесного взаимодействия
аутокринных и паракринных механизмов регуляции, а также факторов роста,
локализованных в гранулезных, тека, стромальных клетках и ооцитах [36, 84,
103].
Паракринную регуляцию развития ооцита в условиях специфической
среды осуществляют факторы роста, цитокины и гормоны [92]. Первостепенное значение среди них занимают половые гормоны стероидного происхождения, предопределяющие нормальное функционирование репродуктивной системы женского организма. Этим гормонам отводится важная роль в
регуляции репродуктивной функции женщины и поддержании способности к
оплодотворению. Также данные гормоны участвуют в эмбриональном развитии яичников и росте фолликулов на ранних этапах фолликулогенеза
[3,43,103].
Стероидные гормоны обеспечивают связь между яичником и гипофизом, действуя как внутри-яичниковые регуляторы. В частности, эстрогены, и
среди них – Е2, наиболее важны для репродуктивной системы женщины.
Синтез Е2 осуществляется клетками гранулезы под действием ФСГ [24].
Существование двух основных форм рецепторов ERα и ERβ способствует реализации действия Е2. ERβ присутствует в предоминантных фолликулах яичника, кроме того различные формы этого рецептора были идентифицированы у человека. мРНК таких форм как ERβ2/сх, ERβ2, ERβ4 и ERβ5
экспрессируется яичником, однако функции данных форм пока неизвестны
[106].
55
На рис. 7 показана динамика Е2 в ФЖ в процессе фолликулогенеза в
группах женщин с рассматриваемыми вариантами эндокринного бесплодия и
ТПФ. Концентрация Е2 в ФЖ контрольной группы пациенток постепенно
увеличивалась с 950 пкг/мл до 3500 пкг/мл на разных этапах развития фолликулов, причем различия в концентрациях этого гормона на стадии преовуляторного фолликула (16-20 мм) и стадии антрального фолликула были статистически значимы (р < 0,05).
Рис. 7. Концентрация эстрадиола в фолликулярной жидкости антральных фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ
Обозначения на рисунке:
– – – функциональная гиперпролактинемия;
------ овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
—— трубно-перитонеальная форма бесплодия.
Примечание: здесь и далее
* - р < 0,05 внутри одной исследуемой группы;
# - р < 0,05 между аналогичными показателями контрольной группы и группы сравнения (двухвыборочный
критерий Манна-Уитни)
56
В группах пациенток с ОГНГ и ФГП уровень Е2 нарастал от стадии антрального к овуляторной стадии, причем на заключительных этапах развития
это увеличение было достоверным (р < 0,05). В группе пациенток с ФГП выявлено повышение содержания Е2 на всех стадиях фолликулогенеза по сравнению с содержанием Е2 на аналогичных стадиях ТПФ.
Согласно двуклеточной теории стероидогенеза, синтез эстрогенов тесно связан с процессами синтеза и конверсии андрогенов [98]. Основным местом синтеза андрогенов является стромальная ткань, имеющая клетки теки в
качестве эмбрионального предшественника. При этом важно заметить, что в
фолликулах 2, 3а, 3b, 4, 5, 5b типов согласно классификации Pedersen повышение концентрации андрогенов приводит к их превращению в 5αредуцированные андрогены, и, как следствие этого, к подавлению синтеза Е2
[113,147,153].
По данным M. Fritz & L. Speroff (1982 г.), синтез андрогенов в яичниках
начинается на ранней стадии развития преантрального фолликула. Концентрация андрогенов в преантральном фолликуле определяет его дальнейшее
развитие. Низкая концентрация андрогенов приводит к усилению процессов
ароматизации и образованию Е2. Высокие концентрации тестостерона способствуют его превращению в дигидротестостерон, который в свою очередь
не способен к реакции ароматизации, что приводит, в конечном счете, к атрезии фолликула [88].
Регуляторное действие андрогенов ярко выражено на гонадотропин–
зависимой, и частично, на гонадотропин–независимой стадии фолликулярных преобразований [92,150]. Паракринный эффект андрогенов, достигающийся путем воздействия на клетки, расположенные вблизи клеток продуцентов, оказывает прямое стимулирующее действие на фолликулярный рост.
При исследовании уровня андрогенов характер распределения Т в ФЖ
контрольной группы пациенток показал незначительные колебания на ранних этапах роста фолликулов с резким подъемом уровня на стадии овуляции
(рис. 8). Концентрация Т варьировала от 5,2 пкг/мл на начальной стадии до
57
12,3 пкг/мл на заключительной стадии развития (фолликулы с диаметром >
20 мм) (р < 0,05).
Рис. 8. Концентрация тестостерона в фолликулярной жидкости антральных фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ
Обозначения на рисунке:
– – – функциональная гиперпролактинемия;
------ овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
—— трубно-перитонеальная форма бесплодия.
Уровень Т в ФЖ пациенток с ОГНГ показал два выраженных возрастания по сравнению с концентрацией Т в стадии антрального фолликула. Первый подъем наблюдался при диаметре фолликула 0,9 – 2 мм, а второй – при
16 – 20 мм, и различия в этом случае были достоверны (р < 0,05), как по отношению к стадии антрального фолликула, так и по отношению к аналогичному показателю в контрольной группе.
В ФЖ пациенток с ФГП уровень рассматриваемого гормона статистически значимо (р < 0,05) повышался на стадиях развития фолликулов с диаметром 2 – 5 мм, 5 – 10 мм, > 20 мм.
Вместе с тем, в ФЖ данной группы пациенток отмечалось значительное превышение уровня Т на всем протяжении процесса развития фолликулов, по сравнению с уровнем Т в аналогичных стадиях контрольной группы.
58
Для определения степени зрелости ооцита используется ряд критериев
[8]. Одним из таких критериев выступает отношение концентраций Е2/Т в
образцах фолликулярной жидкости пациенток, вступивших в лечебный цикл
ЭКО. Значения данного индекса могут свидетельствовать о качестве ооцитов,
которые развиваются в условиях андрогенного (понижение индекса), либо
эстрогенного микроокружения (повышение индекса) [50].
Рис. 9. Отношение Е2/Т в фолликулярной жидкости антральных фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ
Обозначения на рисунке:
– – – функциональная гиперпролактинемия;
------ овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
—— трубно-перитонеальная форма бесплодия.
В ФЖ пациенток с ТПФ наблюдалось постепенное увеличение данного
индекса относительно стадии антрального фолликула (диаметр 0,9 – 2 мм)
(рис. 9), что, вероятно отражает активацию стероидогенеза по мере роста
фолликулов.
В ФЖ пациенток с ОГНГ динамика Е2/Т имела сходство с динамикой
данного показателя в группе пациенток с ФГП. Достоверные различия Е2/Т
(р < 0,05) были получены для стадии предоминантного фолликула по отно-
59
шению к стадии антрального фолликула. На стадии овуляторного фолликула
соотношение Е2/Т статистически значимо различалось (р < 0,05) с величиной
этого показателя в аналогичной стадии развития фолликула в контрольной
группе.
У пациенток с ФГП отмечалось постепенное снижение соотношение
Е2/Т, начиная со стадии антрального фолликула (0,9 – 2 мм) и заканчивая
стадией овуляторного фолликула. Кроме того, для указанных стадий были
получены достоверные различия Е2/Т (р < 0,05) по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы.
Выявленные нами факты демонстрируют, что при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии
наблюдается достоверное снижение соотношения Е2/Т в обеих группах сравнения, что свидетельствует о развитии фолликулов в условиях андрогенного
микроокружения, начиная с ранних стадий.
3.2. Маркеры апоптоза в динамике роста фолликулов при гиперандрогении и гиперпролактинемии
Формирование полноценного доминантного фолликула во времени
определяется характерными морфологическими изменениями, во многом
обусловленных совокупностью пролиферативных процессов и степени
апоптоза клеток кумулюса [145,155].
Известно, что подавляющее большинство фолликулов в яичнике подвергается атрезии посредством апоптоза [25,29,32]. У человека овариальный
резерв, установленный в эмбриональный период, постепенно истощается.
Рассматриваемый процесс жизненно необходим для нормального функционирования яичников и, соответственно, роста фолликулов в динамике фолликулярного развития [83, 120].
Динамика секреции растворимого маркера апоптоза sFasR в группе
пациенток с ТПФ значительно отличалась от двух групп сравнения (рис. 10).
Отмечено 2 пика концентрации маркера – 17,7 пкг/мл (V класс фолликулов)
60
и 15,4 пкг/мл (VII класс), что соотносится во времени со стадией селекции
доминантного фолликула и преовуляторной стадией развития фолликула, соответственно.
Для пациенток с ТПФ увеличение концентрации sFasR было зарегистрировано на стадиях фолликула диаметром 2 – 5 мм и диаметром > 20 мм,
и это изменение уровня sFasR было достоверным (р < 0,05).
Рис. 10. Концентрация sFasR в фолликулярной жидкости антральных
фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ
Обозначения на рисунке:
– – – функциональная гиперпролактинемия;
------ овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
—— трубно-перитонеальная форма бесплодия.
Для пациенток с ОГНГ было показано достоверное (р < 0,05) увеличение концентрации sFasR, которое отмечалось на стадии предоминантного
фолликула по сравнению с уровнем sFasR в стадии антрального фолликула.
Отмечено сохранение первого пика маркера на стадии селекции доминантного фолликула. Вместе с тем, в ФЖ пациенток с ОГНГ уровень sFasR имел
тенденцию к повышению по сравнению с уровнем sFasR в группе ФГП,
начиная со стадии антрального фолликула.
61
Для пациенток с ФГП увеличение содержания sFasR в ФЖ отмечалось
начиная со стадии антрального и продолжалось до стадии предоминантного
фолликула (р < 0,05) по сравнению с данным показателем в группе пациенток с ТПФ (рис. 10).
Рис. 11. Концентрация sFasL в фолликулярной жидкости антральных
фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ
Обозначения на рисунке:
– – – функциональная гиперпролактинемия;
------ овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
—— трубно-перитонеальная форма бесплодия.
Апоптоз гранулезных клеток яичника контролируют ген Fas и его лиганд FasL, где Fas выступает в роли рецептора. Запуск процесса апоптоза
осуществляется посредством взаимодействия между FasL ооцитов и FasR
гранулезных клеток [148].
На рис. 11 проанализирована динамика FasL в процессе фолликулогенеза.
62
В контрольной группе пациенток секреция sFasL снижалась в зависимости от стадии развития фолликулов. На стадии развития фолликулов с
диаметром 10 – 16 мм и >20 мм значения данного маркера были достоверны
низкими (р < 0,05) по сравнению с уровнем sFasL начальных стадий роста
фолликула.
У пациенток с ОГНГ и ФГП уровень sFasL также снижался от стадии
антрального фолликула с диаметром 0,9 – 2 мм к стадии зрелого фолликула с
диаметром > 20 мм. У пациенток с ФГП отмечался резкий подъем концентрации sFasL для фолликулов VI класса, который, однако, не совпадал по
времени с пиками sFasR.
Такое расхождение пиков по времени реализации в ходе фолликулогенеза, очевидно, является проявлением определенного механизма адаптации к
существованию ооцитов в условиях андрогенного микроокружения, оказывающего в течение некоторого времени протекторный антиапоптотический
эффект, и направленного на выживание и развитие пула фолликулов.
Однако уже на стадии овуляторного фолликула наблюдается совпадение пиков по времени, что может свидетельствовать о запуске программы
апоптоза. Эти данные подтверждаются
более ранними работами нашей
научной группы, где реализация апоптоза в гранулезных клетках овуляторного фолликула при ФГП и ОГНГ доказана прямыми методами детекции
апоптоза [52, 53] .
Вместе с тем, на развитие доминантного фолликула оказывает влияние
не только равновесие про- и антиапоптотических факторов, но и факторов
роста, отвечающих за циклическое формирование микроциркуляторного
русла.
63
3.3. Маркеры ангиогенеза в динамике роста фолликулов при гиперандрогении и гиперпролактинемии
Степень развития сосудов фолликула имеет большое значение для роста и развития доминантного фолликула. Как известно, данный механизм основывается на различиях в кровоснабжении фолликулов и степени проницаемости их капилляров [105,124].
Ангиогенный потенциал регулируется действием целого ряда молекулярно-биологических маркеров, обеспечивающих овариальную устойчивость
и стабильный кровоток в сосудах репродуктивной системы женщины. Непосредственный контроль процесса образования новых капилляров осуществляется благодаря скоординированному действию индукторов и ингибиторов
ангиогенеза. В физиологических условиях ингибиторы ангиогенеза необходимы для контроля за ростом кровеносных сосудов и предотвращения избыточной неоваскуляризации [78,162,168].
Выбор лидирующего фолликула зависит от качества его кровоснабжения и функционирования капилляров. Установлено, что формирование сосудистой сети имеет сходные временные рамки с активным ростом и преобладанием доминантного фолликула. Каждый зрелый фолликул имеет разветвленную систему кровоснабжения [121,127,167].
Реализация данной программы возможна посредством механизмов и
факторов, которые влияют на формирование сосудов. Данные факторы могут
активизировать или ингибировать образование сосудов, ускорять или замедлять их рост, воздействовать на развитие сосудистой стенки, определять
направление их развития [19,51,77].
Ангиогенные факторы роста, такие как СЭФР, оФРФ, эндотелин-1 способствуют как реорганизации структуры существующего сосуда, так и созданию новых сосудов [78,165].
Сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР) – гепаринсвязывающий гликопротеин, индуцирующий ангиогенез и пролиферацию клеток фол-
64
ликула. Данный фактор роста выступает как ключевой ангиогенный маркер и
ему отводится значительная роль в регуляции фолликулярного ангиогенеза.
Изучение секреции основных ангиогенных маркеров (СЭФР, оФРФ) и
эндотелина-1 в процессе фолликулогенеза у пациенток с рассматриваемыми
вариантами эндокринного бесплодия позволяет сформулировать определенные закономерности.
Так, в группе пациенток с ТПФ секреция СЭФР повышалась в зависимости от стадии роста фолликула и достигала своего максимума на стадии
доминантного фолликула (р < 0,05), оставаясь на том же высоком уровне до
стадии овуляторного фолликула (диаметр > 20 мм) (рис. 12). Интересно появление пика СЭФР на стадии селекции доминантного фолликула (VI класс),
что, вероятно, обеспечивает интенсификацию неоангиогенеза у выбранного
из пула фолликулов предоминантного фолликула.
В группе пациенток с ОГНГ подобная динамика роста секреции СЭФР
сохранялась. Однако, начиная со стадии предоминатного фолликула (2 – 5
мм) уровень СЭФР был достоверно (р < 0,05) снижен по сравнению с этими
показателями в группе пациенток с ТПФ.
У пациенток с ФГП уровень СЭФР был снижен со стадии антрального
фолликула с диаметром 0,9 – 2 мм до стадии доминантного фолликула с диаметром 5 – 10 мм и на заключительной стадии развития фолликула с диаметром > 20 мм, по сравнению с этим показателем в аналогичных стадиях группы ТПФ (р < 0,05).
Динамику СЭФР целесообразно рассмотреть вместе с динамикой
оФРФ, который действуя синергично с СЭФР, способствует высвобождению
СЭФР из экстрацеллюлярного матрикса [69].
Известно, что оФРФ широко распространен в тканях репродуктивной
системы женщины. Достигая максимальной концентрации в экстрацеллюлярном матриксе, оФРФ способствует инициации процесса ремоделирования, который является одним из ключевых этапов ангиогенеза [12,20].
65
Рис. 12. Концентрация СЭФР в фолликулярной жидкости антральных
фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ
Обозначения на рисунке:
– – – функциональная гиперпролактинемия;
------ овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
—— трубно-перитонеальная форма бесплодия.
В контрольной группе концентрация оФРФ постепенно снижалась в
зависимости от стадии развития фолликула (рис. 13). На заключительных
стадиях развития фолликулов с диаметром 16 – 20 мм и > 20 мм значения
оФРФ были снижены по сравнению с уровнем оФРФ в стадии антрального
фолликула (р < 0,05).
В ФЖ пациенток с ОГНГ динамика оФРФ на стадиях антрального,
предоминантного фолликулов была снижена по сравнению с уровнем оФРФ
в аналогичных стадиях группы пациенток с ТПФ (р < 0,05). Вместе с тем, на
стадии доминантного фолликула было отмечено пиковое возрастание оФРФ.
Концентрация оФРФ оставалась высокой вплоть до заключительной стадии
развития фолликула (р < 0,05).
В группе пациенток с ФГП концентрация данного фактора роста была
значительно снижена по сравнению с концентрацией данного маркера в
66
группе пациенток с ТПФ. Статистически значимая достоверность (р < 0,05)
различий концентрации оФРФ отмечалась на всех стадиях развития фолликула, за исключением стадии предоминантного и доминантного фолликулов.
Рис. 13. Концентрация оФРФ в фолликулярной жидкости антральных
фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ
Обозначения на рисунке:
– – – функциональная гиперпролактинемия;
------ овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
—— трубно-перитонеальная форма бесплодия.
Характер ангиогенеза, определяемый синтезом ангиогенных факторов
роста и их рецепторов, является не единственным параметром, характеризующим состояние кровоснабжения фолликула в процессе его развития. Во
многом этот процесс зависит также от свойств эндотелия и баланса эндотелиальных факторов, контролирующих тонус сосудов. Поддержание баланса
эндотелиальных факторов во многом определяется активностью эндотелина.
Эндотелины плазмы крови оказывают влияние на различные явления
во многих тканях и органах, а увеличение их концентрации можно использовать в качестве молекулярно-биологических маркеров патологических процессов в организме человека [12, 18].
67
Рецепторы эндотелина экспрессируются не только на начальной стадии
процесса формирования доминантного фолликула, но и в период овуляции,
как в гранулезных, так и тека-клетках. В период овуляции в гранулезных
клетках обнаруживаются высокие концентрации ЭТ-2 [102,119,132,151, 164,
166].
На следующем этапе работы было прослежено изменение секреции эндотелина в гормонально-зависимом этапе фолликулогенеза (рис. 14).
Рис. 14. Концентрация эндотелина-1 в фолликулярной жидкости антральных фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ
Обозначения на рисунке:
– – – функциональная гиперпролактинемия;
------ овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
—— трубно-перитонеальная форма бесплодия.
Показано, что концентрация ЭТ-1 в ФЖ контрольной группе пациенток
поступательно снижалась по отношению к уровню ЭТ - 1 в антральной стадии развития фолликула в процессе фолликулогенеза (р < 0,05).
В ФЖ пациенток с ОГНГ и ФГП динамика ЭТ-1 в ФЖ была схожа на
протяжении гормонально-зависимого этапа роста фолликулов.
68
Концентрация ЭТ-1 в исследуемых группах превышала значения данного маркера в контрольной группе пациенток. Показатели ЭТ-1 в группах
пациенток с ОГНГ и ФГП превышали аналогичные показатели в ФЖ контрольной группы пациенток до стадии предоминантного фолликула и были
выше в обеих группах сравнения на данном этапе развития (р < 0,05).
На заключительных стадиях развития фолликула значения ЭТ-1 имели достоверные (р < 0,05) различия, как по отношению к показателям в стадии антрального фолликула, так и по отношению к показателям аналогичной
стадии развития фолликулов в ФЖ контрольной группы.
Известно, что экспрессия генов факторов неоангиогенеза осуществляется различными факторами роста, включая ЭФР [41] .
Данные сведения послужили предпосылкой для изучения динамики
маркеров пролиферации на разных этапах роста и развития фолликулов.
3.4. Маркеры пролиферации в динамике роста фолликулов при
гиперандрогении и гиперпролактинемии
Факторам пролиферации отводится важная роль в процессе фолликулогенеза. Значение данных регуляторных элементов сложно переоценить,
поскольку они тесным образом связаны с процессом фолликулогенеза на так
называемой гормонально-независимой стадии, а также с процессами ангиогенеза и апоптоза. Контроль данных процессов осуществляют ЭФР, ИФР, а
также медиаторы апоптоза [27,69,134,136]. Среди них наибольшее внимание
уделяется таким факторам роста как ЭФР, ТФР-ß1, ИФР-1. Роль ЭФР и ТФРɑ
в организме наиболее исследована в силу их высокой распространенности
[169].
Молекула ЭФР (урогастрона – полипептида с молекулярной массой
6000Да) состоит из 53 аминокислотных остатков. Под действием ЭФР гранулезные клетки фолликулов приобретают пролиферативную способность [10].
69
Фолликулы, находящиеся на антральной стадии развития, характеризуются значительным содержанием ЭФР, обеспечивающим их выживание.
Синтез ЭФР в антральных фолликулах регулируется андрогенами. Сохранение фолликулов на антральной стадии фолликулогенеза осуществляется посредством двух основных эффектов: ЭФР нейтрализует стимулирующее влияние ФСГ и обладает антиапоптотическим действием [8], что нашло отражение на рис. 15, где показана динамика ЭФР в ходе фолликулогенеза.
Рис. 15. Концентрация ЭФР в фолликулярной жидкости антральных
фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ
Обозначения на рисунке:
– – – функциональная гиперпролактинемия;
------ овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
—— трубно-перитонеальная форма бесплодия.
В ФЖ пациенток с ТПФ секреция ЭФР постепенно понижалась в зависимости от стадии роста фолликула и достигала своего минимального значения на стадии фолликула с диаметром >20 мм. На стадии доминантного фолликула значение ЭФР было достоверно (p < 0,05) значимым по отношению к
этому показателю на стадии антрального фолликула.
В группе пациенток с ОГНГ динамика секреции ЭФР изменялась в небольшом диапазоне значений (3,3 – 4,6 пкг/мл). На стадии предоминантного
70
фолликула отмечена достоверность изменения (p < 0,05) значений ЭФР по
сравнению с этим показателем на стадии антрального фолликула. Данный
показатель был достоверно уменьшен (p < 0,05) на стадии развития фолликулов с диаметром 0.9 – 2 мм по сравнению с этим показателем в аналогичной
стадии контрольной группы пациенток.
В ФЖ пациенток с ФГП концентрация ЭФР изменялась в диапазоне 4,3
– 2,9 пкг/мл, а на стадии роста фолликулов с диаметром 0,9 – 2 мм и >20 мм
достоверно (p < 0,05) различалась по сравнению с этим показателем в аналогичных стадиях контрольной группы.
Следует отметить, что в обеих группах сравнения динамика секреции
ЭФР на стадиях антрального фолликула (0.9 – 2 мм) до стадии доминантного
фолликула (5 – 10 мм) была идентична и характеризовалась низкими значениями уровня ЭФР по сравнению с показателями ЭФР в контрольной группе.
Начиная со стадии доминантного фолликула (для ФГП) и преовуляторного
фолликула (для ОГНГ) концентрация ЭФР повышалась до заключительной
стадии развития фолликула по сравнению с показателями аналогичных стадий контрольной группы пациенток.
Ключевым регулятором клеточного роста и дифференцировки считается ТФР-ß1. Известно, что этот маркер является ключевым в обеспечении развития эмбриона до стадии бластоцисты [74].
В фолликулах яичника ЭФР и ТФР-ß1 имеют общий рецептор – ЭФР-R,
который локализован на поверхности кумулюсных клеток и мембране ооцита, в связи с чем, взаимодействие между этими факторами выступает важным
механизмом в регуляции роста преантральных фолликулов [123].
На рис. 16 отражена концентрация ТФР-ß1 в процессе фолликулогенеза.
Так, в группе пациенток с ТПФ секреция ТФР-ß1 повышалась в зависимости от стадии развития фолликула. Лишь на стадии преовуляторного
фолликула отмечалось небольшое понижение концентрации данного фактора
роста.
71
В ФЖ пациенток с рассматриваемыми вариантами эндокринного бесплодия динамика секреции ТФР-ß1 была приблизительно схожа и снижена
по сравнению с данным показателем контрольной группы пациенток.
В ФЖ пациенток с ОГНГ концентрация ТФР-ß1 на заключительных
стадиях развитиях фолликула была достоверно ниже по сравнению со значением ТФР-ß1 (p < 0,05) контрольной группы пациенток.
Рис. 16. Концентрация ТФР-ß1 в фолликулярной жидкости антральных
фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ
Обозначения на рисунке:
– – – функциональная гиперпролактинемия;
------ овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
—— трубно-перитонеальная форма бесплодия.
Особая роль в поступательном развитии фолликулов отводится ИФР-1.
ИФР-I действует на процесс фолликулогенеза, селекцию доминантного
фолликула, атретическую гибель фолликулов, а также оказывает влияние на
стероидогенез в яичнике.
72
Активация стероидогенеза осуществляется ИФР-1 посредством прямого и непрямого эффектов. В первом случае наблюдается непосредственное
действие на стероидогенные ферменты, а также на количество рецепторов к
ЛГ [45,152]. При непрямом эффекте предполагается действие ИФР-1 на метаболизм глюкозы и аминокислот, синтез ДНК, что приводит к повышению
жизнеспособности клеток, и, как следствие этого, усилению синтеза гормонов. Данный фактор роста способствует выбору доминантного фолликула и
дальнейшему поддержанию его развития вплоть до овуляции [10].
Рис. 17. Концентрация ИФР-1 в фолликулярной жидкости антральных
фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ
Обозначения на рисунке:
– – – функциональная гиперпролактинемия;
------ овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
—— трубно-перитонеальная форма бесплодия.
Известно, что высокие концентрации ИФР I и II обусловливают механизм действия ФСГ на клетки гранулезы. Так, основным местом синтеза
ИФР-1 в яичниках выступают клетки гранулезы. Экспериментально было показано, что в культуре клеток гранулезы инсулин и ИФР-1 повышают ба-
73
зальный и стимулированный уровень ФСГ, ЛГ, а также биосинтез Прог и
эстрогенов, увеличивают активность энзимной системы 17-Р-цитохрома,
опосредуют стимулирующий эффект ФСГ, повышая ароматазную активность
клеток гранулезы и плотность ЛГ-рецепторов [152].
Фолликулы, подвергающиеся атрезии, характеризуются повышенной
концентрацией ИФРСП, особенно это характерно для ИФРСП-4. Фактор, ингибирующий действие ИФР, выделяется из клеток гранулезы фолликулов и
клеток желтого тела. Данный фактор называется сывороточным белком
(pregnancy-associated plasma protein-A – PAPP-A), ассоциированным с беременностью [8].
Динамика ИФР-1 в процессе фолликулогенеза показана на рис. 17.
В группе пациенток с ТПФ уровень ИФР-1 незначительно изменялся на
всем протяжении развития фолликулов и лишь на заключительной стадии
развития (фолликулы с диаметром >20 мм) концентрация данного фактора
повышалась.
Уровень ИФР-1 в ФЖ пациенток с ОГНГ и ФГП незначительно изменялся как по отношению к уровню данного фактора в антральной стадии развития фолликулов, так и к его изменениям в аналогичных стадиях в контрольной группе. На заключительной стадии также отмечалось резкое повышение уровня ИФР-1.
В ФЖ пациенток с ОГНГ на стадии доминантного фолликула отмечалось достоверное (p < 0,05) различие концентрации ИФР-1 по отношению к
аналогичной стадии в контрольной группе. У пациенток с ФГП выявлена достоверность (p < 0,05) различий показателя ИФР-1 для фолликулов с диаметром > 20 мм по отношению к аналогичным показателям в контрольной группе.
Известно, что для изучения условий, в которых развивался ооцит, помимо отношения Е2/Т очень показательным является отношение ИФР-1/ЭФР
[2].
74
В частности, М.В. Ямановой было показано, что в ФЖ овуляторных
фолликулов при ОГНГ и ФГП снижено отношение ИФР-1/ЭФР. Это позволило сделать заключение о неадекватных условиях развития ооцита при изучаемых вариантах эндокринного бесплодия, поскольку выявленные параметры состава ФЖ характерны для фолликулов, находящихся в состоянии атрезии [2].
Рис. 18. Отношение ИФР-1/ЭФР в фолликулярной жидкости антральных фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ
Обозначения на рисунке:
– – – функциональная гиперпролактинемия;
------ овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;
—— трубно-перитонеальная форма бесплодия.
На рис. 18 продемонстрирована динамика рассматриваемого показателя. Видно, что в контрольной группе пациенток значения ИФР-1/ЭФР постепенно возрастали в зависимости от стадии развития фолликула. У пациенток
с ОГНГ и ФГП изменения показателя ИФР-1/ЭФР в фолликулярной жидкости имели сходный характер. По сравнению с контрольной группой рассматриваемый показатель был повышен до стадии преовуляторного фолликула,
75
после чего он начинал снижаться до заключительной стадии развития фолликулов.
ЭФР и ИФР-1 являются достаточно информативными маркерами пролиферации клеток. Совместное их действие способствует снижению развития
апоптоза в клетках яичника и формированию антральной полости. Следовательно, выявленные изменения в соотношении ИФР-1/ЭФР соответствуют
полученным ранее данным о динамике показателя E2/T и подтверждают
предположение о том, что на протяжении всей стадии гормональнозависимого роста фолликулы при ОГНГ и ФГП развиваются в условиях андрогенного микроокружения и характеризуются сниженным потенциалом к
дальнейшему развитию.
3.5. Корреляционный анализ полученных результатов
Корреляционный анализ взаимосвязей полученных данных проводился
по Спирмену. Исследовалась взаимосвязь стероидных гормонов и факторов
роста, как между собой, так и со стадиями поступательного развития фолликулов. Результаты представлены на рис. 19 – 23.
Наличие отрицательной степени связи между физиологическим процессом и какими-либо факторами характеризует существование обратной
корреляции, предполагающей, что действие одного фактора отрицательно
регулирует выраженность другого (down-регуляция). И наоборот, наличие
положительной корреляции обнаруживает стимулирующее влияние на выраженность другого фактора (up-регуляция).
При изучении зависимостей между маркерами функциональной компетентности и степенью зрелости фолликула в процессе фолликулогенеза у пациенток с трубно-перитонеальной формой бесплодия была выявлена сильная
степень влияния ЭФР, оФРФ, эндотелина-1, sFasR на рост и развитие фолликулов и положительное влияние СЭФР, ТФР-β1, а также средняя степень
влияния Е2.
76
ЭФР
r=-0,86; p=0,01
СЭФР
r=0,89; p=0,007
ТФР-β1
r=0,89; p=0,007
Степень зрелости
фолликула
Эндотелин-1
r=-0,76; p=0,05
оФРФ
r=-0,96; p=0,001
Е2
r=0,75; p=0,05
sFasL
r=-0,67; p=0,001
sFasR
r=-0,74; p=0,05
Рис. 19. Корреляционные взаимосвязи стероидных гормонов и факторов роста со степенью зрелости фолликула в контрольной группе пациенток
ЭФР
r=-0,82; p=0,014
СЭФР
r=0,96; p=0,001
Е2
Степень
зрелости
фолликула
r=0,72; p=0,05
Эндотелин-1
r=-0,89; p=0,007
оФРФ
r=-0,93; p=0,000
ТФР-β1
r=-0,92; p=0,03
Рис. 20. Корреляционные взаимосвязи стероидных гормонов и факторов роста со степенью зрелости фолликула у пациенток с овариальной гиперандрогенией неопухолевого генеза
При изучении зависимостей между маркерами функциональной компетентности и степенью зрелости фолликула в процессе фолликулогенеза у
пациенток с ОГНГ была выявлена сильная степень отрицательного воздей-
77
ствия ЭФР, оФРФ, эндотелина-1, ТФР-β1 на развитие фолликулов и положительное воздействие СЭФР и Е2.
СЭФР
r=0,92; p=0,003
Е2
r=0,94; p=0,003
Степень зрелости
фолликула
Рис. 21. Корреляционные взаимосвязи стероидных гормонов и факторов роста со степенью зрелости фолликула у пациенток с функциональной
гиперпролактинемией
При росте и созревании фолликула в процессе фолликулогенеза была
выявлена сильная степень положительной связи с такими маркерами как
СЭФР, Е2.
Е2
СЭФР
Т
sFasR
Рис. 22. Корреляционные взаимосвязи стероидных гормонов и факторов роста у пациенток с овариальной гиперандрогенией неопухолевого генеза
–––– связь положительная r=0,83; p=0,01*;
------ связь отрицательная r=0,87; p=0,01*.
При исследовании динамики Е2 и СЭФР в фолликулярной жидкости
пациенток с ФГП выявлено наличие сильной прямой корреляционной зави-
78
симости между этими показателями. Cильную обратную корреляционную зависимость наблюдали между уровнем Т и sFasR.
Е2
СЭФР
Т
sFasR
Рис. 23. Корреляционные взаимосвязи стероидных гормонов и факторов роста у пациенток с функциональной гиперпролактиемией:
–––– связь положительная r=0,72; p=0,01*;
------ связь отрицательная r=0,75; p=0,03*.
При исследовании Е2 и СЭФР в фолликулярной жидкости пациенток с
ФГП выявлено наличие средней корреляционной зависимости между данными показателями.
Достоверную средную корреляционную зависимость наблюдали между
уровнем Т и sFasR.
3.6. Метод математического моделирования
Полученные результаты позволяют выдвинуть предположение о нарушении взаимосвязанных, физиологически протекающих процессов апоптоза,
стероидогенеза и ангиогенеза в процессе фолликулогенеза при ФГП и ОГНГ.
Считается, что состав ФЖ определяет качество ооцита и, в какой-то
мере, исход программ ВРТ [4]. Для получения более полных данных, позволяющих подтвердить или опровергнуть устоявшееся мнение, нами были привлечены данные нашей научной группы, изучавшей исходы лечебных циклов
ЭКО при ОГНГ и ФПГ в сходных условиях. Результаты работы, полученные
и опубликованные ранее [74], и предлагаемого диссертационного исследования, были подвергнуты дополнительной математической обработке.
79
Полученные математические модели позволяют выявить и проанализировать закономерности взаимосвязи показателей, а также определить, какие биологические механизмы отражают появление математических зависимостей.
Пары «фактор роста – показатель эффективности ЭКО», модели, взаимодействия которых оказались адекватными, приведены в таблице 8.
Таблица 8
Математические модели и результаты корреляционного анализа
парных взаимосвязей «фактор роста – показатель эффективности ЭКО»
Независимая Зависимая
Коэффици- Критерий
Уравнение линейной
№ переменная переменная
ент корреФишера
модели
Х
Y
ляции (R)
(F)
Трубно-перитонеальная форма бесплодия (Fтабл = 1,74; Rтабл = 0,32; N = 37)
1
Е2
ЧНО
y = -0,01x + 93,76
-0,39
6,17
2
ЭФР
ЧПЭ
y = 0,21x + 7,00
0,33
4,18
Функциональная гиперпролактинемия (Fтабл = 1,74; Rтабл = 0,32; N = 37)
1
ИФР-1
ЧНО
y = 0,50x + 20,13
0,35
4,93
2
ЭФР
ЧПЭ
y = -0,55x + 10,19
-0,35
4,88
3
Т
ЧНО
y = -0,019x + 91,91
-0,28
3,00
4
ЭТ-1
ЧНИ
y = -0,05x + 17,63
-0,31
2,63
5
ТФР-β1
ЧНИ
y = -0,016x + 12,03
-0,15
3,05
1
Овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза
(Fтабл = 2,48; Rтабл = 0,51; N = 15)
оФРФ
КБПЭ
y = 0,25x + 17,73
0,56
5,81
2
ТФР-β1
КБПЭ
y = 0,02x + 15,80
0,82
26,27
3
ЭТ-1
ЧНИ
y = 19,74x + 6,39
0,56
5,95
В результате исследования было выявлено, что в контрольной группе
пациенток факторами, определяющими частоту нормального оплодотворения
и, следовательно, число полученных эмбрионов, являются уровни Е2 и ЭФР
(рис. 24,25).
80
При анализе ключевых факторов, влияющих на эффективность ВРТ
при ФГП, выявлены их отличия от аналогичных показателей контрольной
группы. Так, обнаружено, что ЧНО зависит от уровней Т и ИФР-1
(рис. 26, 27), а ЧНИ – от ЭТ – 1 и ТФР-β1.
Рис. 24. Поле корреляции и аппроксимация линейной однофакторной
регрессией парной связи «частота нормального оплодотворения - эстрадиол»
Рис. 25. Поле корреляции и аппроксимация линейной однофакторной
регрессией парной связи «число полученных эмбрионов – ЭФР» в контроле
81
Рис. 26. Поле корреляции и аппроксимация линейной однофакторной
регрессией парной связи «частота нормального оплодотворения – тестостерон» в группе пациенток с ФГП
Рис. 27. Поле корреляции и аппроксимация линейной однофакторной
регрессией парной связи «частота нормального оплодотворения – ИФР-1» в
группе пациенток с ФГП
При исследовании взаимодействий, характерных для ОГНГ, интересным фактом стала выявление статистически значимой линейной зависимости
критерия КБПЭ, характеризующего качество полученных эмбрионов, от
оФРФ и ТФР-β1 (рис. 28,29).
82
Рис. 28. Поле корреляции и аппроксимация линейной однофакторной
регрессией парной связи «кумулятивный балл полученных эмбрионов –
оФРФ» в группе пациенток с ОГНГ
Рис. 29. Поле корреляции и аппроксимация линейной однофакторной
регрессией парной связи «кумулятивный балл полученных эмбрионов - ТФРβ1» в группе пациенток с ОГНГ
83
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Изучение молекулярно-клеточных механизмов, лежащих в основе реализации репродуктивной функции женщины, стало возможным благодаря
развитию современного направления науки – репродуктивной биологии. С
внедрением методологий ВРТ у исследователей появилась возможность изучать основные закономерности роста фолликула, овуляции, развития желтого
тела, особенности гонадотропной и гипоталамической регуляции этих процессов.
Реализация репродуктивной функции представляет процесс, существующий в силу действия факторов роста и стероидных гормонов посредством
эндокринных и паракринных сигналов [41]. Многофакторность патогенеза
эндокринных нарушений, приводящих, в конечном счете, к бесплодию,
предполагает детальное изучение составных элементов этой многоуровневой
системы.
К числу наиболее частых причин бесплодного брака относят ОГНГ и
ФГП. При рассматриваемых вариантах эндокринного бесплодия ведущую
роль играет измененный синтез стероидных гормонов, и, как следствие этого,
нарушенный процесс созревания доминантного фолликула [55].
Анализ вариабельности клинической симптоматики и гормонального
профиля при ОГНГ и ФГП, а также сложность и многогранность факторов,
приводящих к развитию данных патологических состояний, указывают на
необходимость изучения основных процессов репродуктивной системы на
молекулярном уровне.
В структуре гинекологических заболеваний, сидром гиперандрогении
составляет 1,3 - 4 % и является одной из наиболее частых причин нарушения
репродуктивной функции у женщин – олигоменореи, ановуляции и, в конечном счете, развития бесплодия [35,45,60]. Характерной морфологической
чертой поликистозного яичника при ановуляции у женщин является приостановка развития и накопление антральных фолликулов с диаметром 2 – 8
мм, характеризующихся концентрацией андрогенов, превышающей их нор-
84
мальное состояние, что наблюдается из-за отсутствия в них ароматазной активности вследствие незрелости клеток гранулезы. Все эти события приводят
к нарушению процесса селекции доминантного фолликула [14,47,141].
Синдром ФГП у женщин – это вызванные гиперпролактинемией нарушения менструального цикла, галакторея, бесплодие. Клиническая картина
ФГП
зависит
от
особенностей
синтеза
и
секреции
пролактина
[44,68,81,110,143].
Частота гиперпролактиновых состояний составляет 11 – 47% в структуре гинекологических заболеваний. Среди пациенток, страдающих бесплодием, данная патология выявляется в 18,9% случаев, и в 40% обнаруживается
при эндокринном бесплодии и нарушениях менструального цикла [22,23].
Известно, что причиной развивающегося бесплодия для данной патологии
может служить нарушение процесса инициации и развития доминантного
фолликула, неоангиогенеза желтого тела с сопровождающимся нарушением
кровотока в сосудах репродуктивной системы женщины [40].
Как известно, циклическое выделение гонадотропных гормонов, происходящее на всем протяжении репродуктивного периода жизни женщины,
определяется гормонами яичников. Последовательное развитие примордиального фолликула до стадии доминантного фолликула является ФСГзависимым процессом. В этой связи, гормонам яичника отводится значительная роль в регуляции процессов протекающих не только в самом яичнике, но
и в гипоталамо-гипофизарном комплексе [103,137,147].
Рассмотрение процесса фолликулогенеза при нормальных и патологических состояниях показывает особую важность в этом процессе стабильного
стероидогенеза как одного из ведущих факторов успешного развития ооцита.
Е2 является ключевым гормоном, участвующим в регуляции координирующих связей между отдельными звеньями репродуктивной системы.
Важнейшим условием благоприятного наступления беременности является успешное развитие ооцита, который выступает морфологически динамической единицей, характеризующейся определенными физиологически-
85
ми параметрами. Адекватное развитие фолликула и реализация его стероидогенной активности являются взаимообусловленными событиями. В цикле
ВРТ уровень Е2 в крови является показателем созревания фолликула. При
этом большая часть Е2 синтезируется в гранулёзных клетках развивающегося
фолликула [24]. Следовательно, уровень Е2 может являться маркером пролиферации гранулезных клеток и показателем, характеризующим среду, в которой развивается ооцит (эстрогенное или андрогенное микроокружение) [176].
В нашем исследовании концентрация Е2 во всех группах женщин
нарастала от стадии антрального к стадии преовуляторного фолликула, причем на заключительных стадиях развития фолликула это увеличение было
значимым (р<0,05). В группе пациенток с ФГП выявлено превышение содержания Е2 на всех стадиях фолликулогенеза по сравнению с уровнем Е2 в аналогичных стадиях фолликулогенеза пациенток с ТПФ (гл.3).
Интерпретировать полученные показатели представляется логичным с
использованием результатов ранее проведенного нашей научной группой
исследования внутриклеточной локализации периферических бензодиазепиновых рецепторов (ПБР) [53], являющихся маркерами пролиферативной и
стероидогенной активности гранулёзных клеток [126].
Продемонстрировано преимущественно перинуклеарное распределение
рецепторов при ФГП, прогностически наиболее благоприятное для исходов
лечебных циклов ВРТ [52]. Доминирующая перинуклеарная локализация
ПБР, вероятно, свидетельствует о миграции ПБР-экспрессирующих митохондрий в ядерную область. Подобный тип распределения обеспечивает сохранность темпов стероидогенеза в гранулёзных клетках, и, тем самым, замедляет развитие апоптоза, способствуя сохранению жизнеспособности клеток даже при действии апоптогенных факторов [83].
Развитие доминантного фолликула происходит синхронно с процессом
атрезии других антральных фолликулов. Как известно, атрезия может происходить на любой стадии развития фолликула [157]. Атретические фолликулы
имеют меньшее количество клеток гранулезы и более низкую концентрацию
86
эстрогенов по сравнению с растущими фолликулами аналогичного размера
[128]. Вместе с тем, отличительной чертой этих фолликулов является накопление в фолликулярной жидкости андрогенов [157].
В нашей работе оценивалась концентрация Т в ФЖ у женщин с рассматриваемыми вариантами эндокринного бесплодия. Уровень данного андрогена в при ОГНГ и ФГП, начиная со стадии антрального фолликула, был
значительно выше на всем протяжении процесса развития фолликулов, по
сравнению с концентрацией данного гормона в аналогичных стадиях контрольной группы.
Еще одним подтверждением существования андрогенного микроокружения при гормональном дисбалансе является снижение индекса Е2/Т в фолликулярной жидкости пациенток с ОГНГ и ФГП. Данная тенденция наблюдалась, начиная со стадии антрального фолликула и заканчивая стадией овуляторного фолликула. Важно отметить, что снижение индекса Е2/Т в фолликулярной жидкости пациенток с ФГП было достоверным по сравнению с индексом в аналогичных стадиях контрольной группы.
Данный факт может быть важен для понимания изначальной «ущербности» ооцитов у пациенток с ОГНГ, что объясняет весьма скромные результаты применения методов ВРТ у данной группы больных.
Одним из возможных механизмов развития неполноценности ооцитов
при существовании в условиях андрогенного микроокружения может быть
апоптоз гранулезных клеток фолликула, как характерный признак атрезии
фолликула [138].
Регуляция апоптоза клеток гранулезы обеспечивается посредством взаимного влияния гормонов и цитокинов. Установлено, что андрогены вызывают атрезию растущих фолликулов, что было подтверждено экспериментальным предотвращением атрезии фолликулов введением блокаторов андрогенных рецепторов и антител к тестостерону [139].
В основе атретических процессов при фолликулогенезе лежит апоптотическая гибель соматических клеток фолликула, из которых гранулёзные
87
клетки больше всего подвержены апоптозу. Гранулёзные клетки вступают в
программу апоптоза асинхронно, и этот феномен особенно выражен в клетках с измененным гормональным статусом. В работе нашей научной группы
прямыми методами идентификации апоптоза была доказана реализация
апоптоза в гранулезных клетках овуляторны фолликулов при ОГНГ и ФГП, а
также большая жизнеспособность гранулезных клеток у пациенток с ФГП по
сравнению с аналогичным показателем пациенток с ОГНГ.
Запуск механизма регуляции апоптоза возможен за счет блокирующего
действия sFasR в отношении FasL, экспрессируемого преимущественно на
ооцитах. Система FasR/Apo-1/CD95 выступает медиатором апоптоза соматических клеток фолликула. Идентификация комплекса Fas - FasL может свидетельствовать о вступлении фолликулов в апоптоз [145]. В свою очередь,
обнаружение проапоптотических растворимых комплексов Fas - FasL в фолликулярной жидкости хорошо соотносится с преобладанием «андрогенного»
профиля микроокружения в фолликулярной жидкости [120,145].
В настоящей работе исследована динамика секреции молекулы sFasR и
FasL на разных стадиях фолликулогенеза.
В ФЖ пациенток с ТПФ при уровне sFasR 10,2 – 12,3 пкг/мл был отмечен пик секреции 17,68 ± 0,6 пкг/мл (p < 0,05), что, вероятно, может отражать
начало массовой атрезии данного пула фолликулов, поскольку на данном
этапе происходит селекция доминантного фолликула.
В ФЖ пациенток с ОГНГ показано достоверное увеличение содержания sFasR на всех стадиях развития фолликулов по сравнению с группой
ТПФ. У пациенток с ФГП уровень sFasR имел тенденцию к повышению,
начиная со стадии раннего антрального фолликула. Для этой группы выявлено достоверное увеличение содержания sFasR по сравнению с этим показателем у пациенток с ТПФ от стадии антрального фолликула до стадии доминантного фолликула.
Динамика FasL в группах пациенток с ОГНГ и ФГП отличалась от динамики данного показателя в группе контроля. В контрольной группе пациен-
88
ток динамика секреции sFasL понижалась в зависимости от стадии развития
фолликулов.
Нами выявлено несовпадение пиков sFasR и sFasL, вплоть до стадии
овуляторного фолликула, что, очевидно может играть определенную защитную роль и/или быть свидетельством адаптации к существованию в условиях
андрогенного микроокружения, помогать фолликулам «выживать» в этих
условиях.
Вместе с тем на стадии овуляторного фолликула нами обнаружено совпадение пиков sFasR и sFasL по времени. Полученные результаты косвенно
подтверждают более рание данные о том, что в овуляторных фолликулах
женщин с измененным гормональным статусом запущены процессы запрограммированной гибели клетки (апоптоза) [2].
Остаются неясными особенности, обеспечивающие клеткам кумулюса
высокую степень выживаемости. По-видимому, ведущую роль в этом процессе, особенно при ФГП, играет сохранность биосинтеза стероидных гормонов,
в частности, эстрадиола.
При ОГНГ готовность фолликулов к реализации программы апоптоза
обнаружена в группе пациенток с ОГНГ, начиная с ранних этапов формирования полостного фолликула. Ранее для гранулезных клеток при ОГНГ показано
преобладание процессов некроза в сочетании с доминирующей цитоплазматической гранулярной локализацией ПБР [37,74], что в совокупности может
свидетельствовать о более раннем начале и более тяжелых последствиях
апоптоза для фолликулогенеза в условиях ОГНГ.
Баланс между про- и антиангиогенными факторами роста крайне важен
для изучения гормонального нарушения фолликулогенеза. По мнению ряда
авторов, в основе патогенеза целого ряда репродуктивных расстройств, лежит дисбаланс между факторами, ответственными за процессы пролиферации клеток [60].
Факторы ангиогенного потенциала выступают как важные молекулярно-биологические единицы, характеризующие в целом процесс сосудистой
89
пролиферации и неоангиогенеза [77].
Недостаточное кровоснабжение яичников, безусловно, сказывается как
на формировании полноценного доминантного фолликула, так и на процессах, сопровождающих данные события [40]. Формирование сосудистой сети
имеет идентичные временные рамки с активным ростом, селекцией и доминацией доминантного фолликула. В литературе имеются данные о влиянии
эстрогенов на рассматриваемые процессы. Так, биологическое действие эстрогенов опосредовано специфическими рецепторами, что способствует многостороннему влиянию не только на функции различных органов и систем
женского организма, но и на эндотелий сосудистой стенки [127].
Потенциальным митогенным фактором, стимулирующим миграцию
эндотелиальных клеток и способствующим стабилизации их структуры, считается СЭФР. Этот гепаринсвязывающий гликопротеин выступает в качестве
ключевого ангиогенного маркера и играет важную роль в фолликулогенезе.
Проведенные исследования подтверждают способность СЭФР инициировать
как ангиогенез, так и аккумуляцию антральной жидкости в полости фолликула [78].
Эти данные соотносятся с мнением многих ученых о том, что инициация адекватного образования сосудов играет важную роль в дальнейшем активном росте фолликулов [121,162,167].
В работе обнаружено резкое увеличение концентрации СЭФР на стадии селекции доминантного фолликула (VI класс), который в дальнейшем
развивается до овуляторного фолликула.
В настоящее время не вызывает сомнения факт, что аномальная секреция СЭФР может быть причиной сосудистой дисфункции и, как следствие
этого, развития нарушений функций яичников [165,168].
Действительно, у пациенток с ОГНГ и ФГП выявлена тенденция к
снижению концентрации СЭФР в фолликулярной жидкости, начиная со стадии антрального фолликула.
90
Важным эффектом взаимодействия СЭФР с эстрадиолом является его
влияние на аккумуляцию антральной жидкости в полости фолликула. Выявленные закономерности корреляционного анализа подтвердили, что при
ОГНГ и ФГП с увеличением степени васкуляризации ускоряется процесс образования антральной полости развивающегося фолликула.
Снижение секреции СЭФР в растущем фолликуле может свидетельствовать об отставании развития капиллярной сети сосудов и недостаточном
кровоснабжении доминантного фолликула, что может повлечь за собой развитие преждевременной атрезии фолликула и/или созревания ооцита со сниженным фертилизационным потенциалом [124].
Для созревающих фолликулов яичника характерна продукция факторов
роста, оказывающих модифицирующее действие на процессы клеточной
дифференцировки. К их числу можно отнести ангиогенный гепаринсвязывающий фактор – оФРФ.
Данный фактор роста связывается с клетками эндотелия, увеличивая их
подвижность, пролиферацию и протеинкиназную активность. Кроме того, он
стимулирует пролиферацию во многих клетках организма и способствует
усилению экспрессии в эндотелиальных клетках интегрина αv ß3, отражающего интенсивность ангиогенеза [102].
В настоящей работе отмечено увеличение содержания оФРФ в ФЖ у
пациенток с ФГП по сравнению с уровнем оФРФ в аналогичных стадиях
контрольной группы пациенток, начиная со стадии предоминантного фолликула. Исследование закономерностей развития фолликулов со стадии антрального фолликула до преовуляторного подтверждает выводы, полученные
ранее о высокой пролиферативной способности соматических клеток фолликула [52].
В то же время при ОГНГ отмечалось значительное снижение уровня
данного фактора роста, начиная со стадии антрального фолликула вплоть до
стадии овуляторного фолликула, по сравнению с показателями в контрольной группе пациенток. Сниженная ангиогенная активность соматических
91
клеток развивающихся фолликулов при ФГП может свидетельствовать о замедленном развитии кровеносных сосудов, в том числе, за счет сниженной
пролиферативной активности.
Как известно, экспрессия и продукция СЭФР регулируется проангиогенными факторами, одним из которых является оФРФ [162,166]. Указанное
обстоятельство косвенно подтверждается в данной работе. Вероятно, нарушение секреции эндогенного регулятора – оФРФ могло стать одной из причин снижения концентрации СЭФР при ОГНГ и ФГП, по сравнению со значением СЭФР в группе пациенток с ТПФ. Тесная взаимосвязь отмеченных
факторов объясняется существованием сложного механизма контроля ангиогенеза, основанного на координации многих факторов с участием различных
типов клеток [77].
Регуляция сосудистых процессов, протекающих в яичниках, осуществляется не только посредством изменения ангиогенной активности СЭФР и
оФРФ. Особенностью патогенеза рассматриваемых форм эндокринного бесплодия наряду с нарушениями процесса развития фолликулов, выступают
структурные изменения эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла.
В настоящее время известно, что эндотелиальные клетки специфически
реагируют на различные молекулярные сигналы и выполняют при этом достаточно широкий диапазон функций: транспортные, барьерные, участвуют в
метаболизме внеклеточного матрикса и биосинтезе цитокинов [12]. Эндотелий сосудов принимает участие в процессах диффузии и трансцитоза [67].
Кроме этого, эндотелины относятся к числу наиболее мощных вазоконстрикторов и играют важную роль в регуляции кровотока [12].
В данной работе выявлено превышение концентрации эндотелина-1 в
фолликулярной жидкости у пациенток с ОГНГ и ФГП на всех этапах развития фолликулов, начиная с антрального вплоть до стадии преовуляторного
фолликула, по сравнению с уровнем эндотелина-1 в аналогичных стадиях
фолликулогенеза контрольной группы.
92
Хорошо известно, что выбор лидирующего фолликула зависит от качества его кровоснабжения и функционирования капилляров. Каждый зрелый
фолликул обладает разветвленной системой кровоснабжения. В работах многих авторов четко просматривается взаимосвязь о влиянии женских половых
гормонов на функцию эндотелия [67].
Исходя из этого, можно предположить, что сниженный уровень ангиогенной активности СЭФР при ОГНГ и ФГП и сниженный уровень секреции
эндотелина при тех же вариантах эндокринного бесплодия взаимосвязаны и
обусловлены, в первую очередь, изменением гормонального фона при данных эндокринопатиях.
Действительно, результаты проведенных исследований подтверждают,
что формирование эндотелиальной дисфункции при рассматриваемых формах эндокринного бесплодия можно соотнести как со степенью развития
фолликулов, так и напрямую - с выявленным снижением уровня Е2 в фолликулярной жидкости женщин с ОГНГ и ФГП.
В литературе имеются данные, оценивающие способность эндотелина1 отвечать за регуляцию роста, созревания и деградацию эндотелиоцитов
[84]. Выявленное в нашей работе сильное влияние эндотелина-1 на ЧНИ при
ФГП (y = - 0,55x + 10,19) представляется отличным от показателей контрольной группы, и, вероятно, может являться доказательством изменения процессов неоангиогенеза при ФГП, как одного из ключевых событий, влияющих на
наступление имплантации. Хорошо известен факт изменения проницаемости
сосудистого русла, играющего важную роль в трансформации эндометрия в
процессе подготовки его к имплантации бластоцисты [46].
Координирование функций женской репродуктивной системы осуществляется посредством взаимосвязи и взаимозависимости полноценного
стероидогенеза и синтеза ангиогенных факторов роста и их рецепторов,
определяющих состояние кровоснабжения фолликула на каждой отдельной
стадии развития.
93
Не вызывает сомнения факт, что определенный вклад в неоангиогенез
вносит существование физиологического равновесия между пролиферативными
процессами и уровнем апоптоза в гранулёзных клетках кумулюса
[145,173].
Важная роль в осуществлении эндокринной, аутокринной и паракринной регуляции процессов клеточного роста, развития и дифференцировки
клеток и тканей принадлежит ИФР-1. Следствием ослабления роли ИФР-1 в
ингибировании апоптоза и развития патологических состояний выступает
нарушение механизма функционирования данного фактора.
Уровень ИФР-1 в крови зависит от действия соматотропного гормона,
половых стероидов, тиреоидных гормонов, глюкокортикоидов и инсулина.
При этом известно, что инсулин, андрогены, эстрогены повышают, секрецию
ИФР-1 включая клетки печени. Вместе с тем, глюкокортикоиды снижают
секрецию ИФР-1 [152].
ИФР-1 отводится возможная роль в стимуляции стероидогенеза в яичниках, которая осуществляется посредством двух механизмов – непрямого и
прямого. Непрямой механизм предполагает действие на метаболизм глюкозы
и аминокислот, синтез ДНК, что приводит к повышению жизнеспособности
клеток, и, как следствие этого, усиливается синтез гормонов. Прямой эффект
предполагает активацию стероидогенных ферментов, а также увеличение количества рецепторов к ЛГ [152].
В настоящей работе выявлено повышение уровня ИФР-1 в фолликулярной жидкости. Данное повышение отмечено со стадии антрального фолликула, как при ОГНГ, так и при ФГП по сравнению с аналогичными значениями данного маркера ФЖ пациенток контрольной группы. Данное обстоятельство приводит к сниженной активности ароматазы в гранулезных клетках яичников, что согласуется с данными других исследователей [23,39,41].
Результаты проведенных исследований подтвердили, что доминантный
фолликул содержит ИФР-1 в большей концентрации, чем недоминантные когорты. Это наблюдалось как для пациенток с ОГНГ и ФГП, так и для пациен-
94
ток контрольной группы исследования.
Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о ключевой роли
ЭФР в фолликулогенезе. Данному фактору, по характеру его влияния на гранулезные и тека-клетки фолликула, отводится ведущая роль в выживании
фолликулов на ранних стадиях развития, по сравнению с другими молекулярно-биологическими маркерами регуляции.
Подтверждением этому выступает эффект ингибирования эпидермальным фактором роста ФСГ-стимулированной ароматазной активности гранулезных клеток. При этом высокие дозы ЭФР способны ингибировать физиологическое действие фоллитропина на 70-90 % [94]. Отмечено, что физиологическое снижение образования эстрогенов накануне овуляции может находиться в прямой зависимости от ЭФР.
По данным L. Westergaard с соавт., физиологическое значение высокой
концентрации ЭФР может также проявляться в блокировании синтеза овариального ингибина соматическими клетками фолликула [94]. Данному фактору роста отводится важная роль в стимуляции секреции ИФР-1 [94], а также в
проявлении ангиогенной активности, которая усиливается гликозаминогликанами [94].
Как отмечает К.Ю. Боярский, высокие концентрации ЭФР, характерные для мелких антральных фолликулов человека, защищают последние от
действия ФСГ и способствуют длительному пребыванию фолликулов в данном состоянии. Резкое снижение выработки ЭФР наступает при достижении
фолликулом диаметром 5-6 мм [10].
Действительно, для пациенток контрольной группы были отмечены достаточно высокие значения ЭФР, которые составили 12 пкг/мл на стадии антрального фолликула с постепенным снижением концентрации до 3,8 пкг/мл
на стадии доминантного фолликула.
Для пациенток с ОГНГ и ФГП также выявлено увеличение концентрации ЭФР. Для пациенток с ФГП увеличение концентрации данного фактора
роста отмечалось со стадии доминантного фолликула, а для пациенток с
95
ОГНГ со стадии раннего преовуляторного фолликула, по сравнению с уровнем ЭФР в аналогичных стадиях опытной группы пациенток.
Сниженная выработка ЭФР клетками гранулезы, характерная для фолликулов с диаметром 0,9-2 мм до 5-10 мм у пациенток с ОГНГ и ФГП, может
способствовать долговременному блокирующему действию данного фактора
на выработку ингибина и на чувствительность гранулезы к действию ФСГ.
Период селекции роста фолликулов является ФСГ-зависимым. Следовательно, относительный дефицит ФСГ может выступать одной из причин нарушения роста и созревания доминантного фолликула до преовуляторного, а также последующей атрезии антральных фолликулов.
Поступательному развитию фолликула и проявлению действия гонадотропинов на клетки мишени фолликулярного комплекса способствует физиологический ритм секреции ЭФР в тканях фолликула. Это обусловлено разнообразным спектром влияния данного фактора роста на процесс фолликулогенеза.
Способность к активной рецепции ЭФР гранулезными клетками фолликула находится под контролем нейрогуморальных механизмов. Данный
факт, подтверждается тем, что при длительном введении гонадолиберина отмечается снижение выработки ЭФР-рецепторов в гранулезных клетках фолликула [9].
В экспериментах по культивированию гранулезных клеток показано,
что область модулирующих воздействий ЭФР проявляется также в стимулировании образования прогестинов. Например, высокая концентрация ЭФР в
фолликулах может способствовать «раннему переключению» внутрифолликулярного стероидогенеза на прогестеронобразование [94].
Достаточно показательным является отношение ИФР-1/ЭФР в аспекте
изучения патогенеза различных форм эндокринного бесплодия. Данные, изложенные в главе 3 данной работы, свидетельствуют о снижении уровня
ИФР-1/ЭФР со стадии раннего преовуляторного фолликула у пациенток с
ОГНГ и ФГП. Выявленные особенности динамики таких параметров фолли-
96
кулярной жидкости как ИФР-1/ЭФР, Е2/T соответствуют предположениям о
неадекватных условиях развития ооцита при ОГНГ и ФГП и подтверждают
вывод о том, что на протяжении всей стадии гормонально-зависимого периода фолликулы при эндокринном бесплодии развиваются в условиях андрогенного микроокружения.
Из приведенных данных также следует, что рассматриваемое соотношение показывает снижение цитопротекторного действия факторов, слагающих его суммарный эффект. Это, в конечном счете, может сказаться на
жизнеспособности гранулезных клеток.
К числу перечисленных факторов роста, обладающих модифицирующим действием на процессы клеточной дифференцировки в созревающих
фолликулах, следует отнести ТФР-ß1.
ТФР-ß1 – мультифункциональный пептид, обладающий как ингибирующим, так и активирующим действием на клеточную пролиферацию и дифференцировку. Доказано, что ТФР-ß1 может выступать посредником апоптотических эффектов стероидных гормонов, способствуя запуску процесса
апоптоза клеток фолликула [123].
Кроме того, для семейства данного фактора роста в преимплантационный период характерна эмбриотрофическая активность. Присутствие ТФРα и
внутриклеточного домена к рецептору ЭФР характерно для 4-клеточного эмбриона. Для 8- и 14-клеточных эмбрионов подтверждено наличие ТФРα,
внутри- и внеклеточные домены к рецептору ЭФР, ИФР-1 и соответственно
его рецептор [123,172].
Известно, что представители семейства ТФР-ß1 играют значительную
роль в имплантации, способствуя формированию рецептивных свойств эндометрия по отношению к бластоцисте. Так, данное обстоятельство было
подтверждено экспериментально в работе F. Taniguchi с соавт. Введение
ТФР-ß1 в диапазоне концентраций 1-10 нг/мл в среду для инкубации оказывало достоверное воздействие на стадиях адгезии и инвазии трофобласта
[48,49].
97
Как отмечает М.В. Яманова с соавт., при ОГНГ затруднен процесс
формирования бластоцист человека in vitro [2]. Кроме того, отмечалось также
снижение количества имплантировавших эмбрионов из общего числа перенесенных по сравнению с показателями контрольной группы пациенток и
группой женщин с ФГП [74].
В нашем исследовании в группах пациенток с ОГНГ и ФГП секреция
ТФР-ß1 была значительно снижена, по сравнению с уровнем секреции ТФРß1 в аналогичных стадиях контрольной группы пациенток. Данное обстоятельство дает возможность предположить, что низкая концентрация обсуждаемого фактора будет сказываться на процессе формирования бластоцисты
и, впоследствии, на ее имплантации.
В дальнейшем, при исследовании взаимодействий, характерных для
ОГНГ, это заключение подтвердилось выявлением статистически значимой
линейной зависимости критерия КБПЭ, характеризующего качество полученных эмбрионов, от оФРФ и ТФР-β1.
Полученные нами данные о тесноте линейной (корреляционной) связи
между парой признаков «кумулятивный балл полученных эмбрионов - ТФРβ1» при ОГНГ подтверждают ранее опубликованные результаты о роли
ТФР-β1 в раннем эмбриогенезе у млекопитающих [123]. Данный фактор роста, выступая регулятором клеточной пролиферации и дифференцировки,
способствует формированию бластоцисты [41,49], а впоследствии влияет на
процессы адгезии бластоцисты и инвазии трофобласта [84,123].
Таким образом, в работе выявлены регуляторные молекулы, являющиеся ключевыми при нормальном и патологическом фолликулогенезе (эстрогены, оФРФ и ЭФР при ТПФ); ИФР-1, тестостерон, ТФР-β1, эндотелин-1 при ФГП; оФРФ, ТФР-β1, эндотелин-1 - при ОГНГ, изменение экспрессии
которых влияет как на качество формирующегося ооцита, так и на эффективность оплодотворения и имплантации эмбриона.
В целом, рассмотренная нами модельная система позволяет определять
маркеры для эффективной диагностики и разработки новых подходов к тера-
98
пии некоторых форм эндокринного бесплодия.
Результаты проведенного исследования особенностей синтеза стероидных гормонов, процессов ангиогенеза, пролиферации и запрограммированной клеточной гибели в яичниках, а также участия в них ростовых факторов,
привели к необходимости коррекции патогенетических механизмов, лежащих в основе рассматриваемых форм эндокринного бесплодия, а также определения ключевых моментов воздействия молекулярно-биологических маркеров на различные стадии фолликулогенеза (рис. 24).
ФЖ, гранулезные клетки и ооцит выступают динамически изменяющейся и саморегулирующейся системой фолликула. Каждый элемент такой
системы влияет как на сам фолликул, так и на другие структурные элементы
яичника [99,111].
В связи с этим, можно с уверенностью сказать, что ФЖ с измененным
гормональным профилем способствует нарушению процесса развития фолликула с ранних стадий, что является результатом нарушения механизмов регуляции данного процесса.
Согласно данным корреляционного анализа созревание ооцитов при
трубно-перитонеальной форме бесплодия определяется взаимосвязанными и
взаимозависимыми процессами стероидогенеза и ангиогенеза, пролиферации
и апоптоза.
Развитие ооцитов при ОГНГ происходит в условиях дизрегуляции процессов пролиферации, апоптоза, ангиогенеза и стероидогенеза.
Созревание ооцитов при ФГП протекает в условиях дизрегуляции ангиогенеза и стероидогенеза.
В патогенезе репродуктивной функции ведущую роль играют измененный синтез стероидных гормонов. Особенно важно воздействие андрогенов
на репродуктивную систему. Концентрация андрогенов в фолликуле определяет его дальнейшую судьбу: при низких концентрациях фолликул синтезирует эстрогены и растет, а при высоких – атрезируется. Выявленная зависи-
99
мость подтверждает, что дегенерирующие фолликулы характеризуются повышенным содержанием Т, что характерно как для ОГНГ, так и для ФГП.
Анализ всей совокупности данных позволяет предположить наличие
существенных метаболических нарушений в соматических клетках фолликулов при ОГНГ, возможно более выраженных, чем было принято считать ранее.
Как отмечает С.А. Бутрова и другие авторы для ОГНГ характерны метаболические расстройства в виде нарушений углеводного и липидного обмена [13,35]. Ранее проведенные исследования показали нарушение обмена
регуляторных пептидов при эндокринном бесплодии для данной патологии
[66], тогда как для ФГП подобные нарушения не выявлены.
Изложенные выводы имеют важное научно-теоретическое значение,
так как заложенные в них закономерности лежат в основе развития ановуляторных состояний, недостаточности желтого тела и соответствующих форм
женского бесплодия.
Результаты проведенного исследования подтверждают роль дизрегуляции определяющих процессов развития фолликула в развитии патологических состояний репродуктивной функции. Есть все основания полагать, что
изучение механизмов апоптоза, пролиферации и ангиогенеза с применением
молекулярно-биологических маркеров позволит осуществлять раннюю диагностику причин эндокринного бесплодия, более точно оценивать распространенность патологического процесса, а также производить более тщательный мониторинг течения заболевания и эффективности лечения.
Полученные данные позволили систематизировать роль маркеров
функциональной компетентности ооцитов в процессе фолликулогенеза,
оплодотворения и имплантации эмбриона, представленных в таблице 9 и на
рис. 30.
100
Таблица 9
Молекулы – маркеры функциональной компетентности ооцитов
в процессах фолликулогенеза, оплодотворения и имплантации эмбриона
Молекулярнобиологические
маркеры
Маркеры
ангиогенеза
Маркеры
фолликулярного
микроокружения
(«эстрогенное»,
«андрогенное»)
Маркеры
апоптоза
Маркеры
пролиферации
Интерлейкины
Широко распространенные
маркеры репродуктивной
функции
СЭФР, ФРФ, эндотелин-1, ФРП,
ангиопоэтин-1,ангиопоэтин-2,
ангиостатин, тромбоспондин-1,
тромбоспондин-2
Е2, Т, отношение Е2/Т
Наиболее информативные
маркеры репродуктивной дисфункции (при ОГНГ и ФГП)
СЭФР+Эндотелин-1+ФРФ
sFasR-sFasL
sFasR-sFasL+определение степени экспрессии и локализации
ПБР+ Е2/Т+ ИФР-1/ЭФР.
ЭФР, ТФР-β1, ИФР-1,
отношение ИФР-1/ЭФР
IL-1
ЭФР, ИФР-1
Е2+Т+ Е2/Т+ ИФР-1/ЭФР
Т+ Е2 +Е2/Т+ ИФР-1/ЭФР
IL-1 (заключительные этапы созревания доминантного
фолликула+регуляция процессов
имплантации)
Рис. 30. Действие молекулярно-биологических маркеров на различные стадии фолликулогенеза
В заключении представляется целесообразным дать итоговую характеристику полученным результатам:
Состав фолликулярной жидкости при ОГНГ характеризуется следующими особенностями:
- изменение содержания в фолликулярной жидкости основных ангиогенных факторов роста (СЭФР, эндотелин-1, в меньшей степени оФРФ),
начиная со стадии антральных фолликулов, что позволяет предположить, что
в развивающихся фолликулах нарушен про- и антиангиогенный баланс и
снижена барьерная функция сосудов микроциркуляторного русла;
- обнаруженное значительное повышение уровня FasR в процессе фолликулогенеза, по сравнению с уровнями FasR в аналогичных стадиях фолликулогенеза пациенток с ТПФ, может служить косвенным признаком активации апоптоза ооцитов в атретических фолликулах, начиная с ранних этапов
развития фолликулов;
- в развивающихся ооцитах нарушены процессы пролиферации клеток
(значительное снижение уровней ИФР-1, ЭФР, ТФР-β1) фолликула и преобладает андрогенное микроокружение, что подтверждается достоверным снижением отношений Е2/Т и ИФР-1/ЭФР;
- ключевыми на этапах патологического фолликулогенеза регуляторными маркерами являются оФРФ, ТФР-β1, эндотелин-1, изменение экспрессии которых напрямую влияет на качество формирующегося ооцита, и косвенно – на эффективность оплодотворения и имплантацию эмбриона.
Состав фолликулярной жидкости при ФГП характеризуется следующими особенностями:
- изменение содержания в фолликулярной жидкости основных ангиогенных факторов роста (СЭФР, эндотелин, оФРФ), начиная с антральных
фолликулов, позволяет предположить, что в развивающихся фолликулах
нарушен про- и антиангиогенный баланс и снижена барьерная функция сосудов микроциркуляторного русла;
103
- обнаружено незначительное повышение уровня FasR в процессе фолликулогенеза, по сравнению с уровнем FasR в аналогичных стадиях фолликулогенеза пациенток с ТПФ;
- выявленные особенности синтеза стероидных гормонов, показали
значительное превышение содержания Е2 в процессе фолликулогенеза, начиная со стадии антрального фолликула, по сравнению уровнем Е2 в аналогичных стадиях фолликулогеназа у пациенток с ТПФ, что может выступать защитным фактором в отношении реализации апоптоза и нарушения процессов
пролиферации клеток фолликула;
- ключевыми на этапах патологического фолликулогенеза регуляторными маркерами являются ИФР-1, тестостерон, ТФР-β1, эндотелин-1, изменение экспрессии которых прямо влияет на качество формирующегося ооцита, а также на эффективность оплодотворения и имплантацию эмбриона.
- При ОГНГ и ФГП в развивающихся ооцитах наблюдается достоверное снижение отношений Е2/Т и ИФР-1/ЭФР.
В настоящее время накоплено достаточное количество данных о процессе развития женских половых клеток. В то же время, не в полной мере
изучены маркеры, способствующие процессам роста и дегенерации созревающих половых клеток в физиологических условиях и в условиях патологии.
Современный уровень исследований пока не позволяет установить первичное
звено в генезе такого процесса как атрезия фолликулов яичника.
Существуют представления об особенностях расположения и функционирования структурных единиц яичника. Однако нуждаются в уточнении
процессы взаимодействия структурных элементов яичника с такими параметрами как микроциркуляторное русло, идентификация и распределение
ростовых факторов.
К числу наиболее интересных и приоритетных направлений репродуктивной медицины, безусловно, следует отнести проблему регуляции роста
развивающихся фолликулов. Исследование систем передачи гормональных
104
сигналов гранулезными и тека- клетками фолликулов может служить перспективным направлением для дальнейшего развития представлений о механизмах селекции фолликулов. При этом особый интерес представляет система регуляции функций репродуктивной системы. Вместе с тем, внутриовариальные модуляторы регуляции фолликулогенеза и участие в этих процессах
ростовых факторов выступают объектом особого изучения.
Понимание процессов регуляции, вытекающих из полученных результатов проведенного диссертационного исследования, отражено на заключительных схемах (рис. 31,33,34).
Нарушение функциональной активности маточных труб
ПРОЦЕСС ФОЛЛИКУЛОГЕНЕЗА
Гормонально-зависимый период
Гормонально-независимый период
2-5 мм
V класс
N-Е2, ↑↑Т, ↓Е2/Т,
ИФР-1/ЭФР
N-СЭФР, N-оФРФ,
↑ эндотелин-1
5-10 мм
VI класс
N sFasR, N-sFasL
10-16 мм
VII класс
16-20 мм
VIII класс
N-ЭФР, ТФР-ß1, ИФР-1
Формирование полноценного доминантного фолликула
На эффективность оплодотворения и имплантацию эмбриона влияют эстрогены, оФРФ и ЭФР
Рис. 31. Схема фолликулогенеза при трубно-перитонеальной форме бесплодия (контроль)
>20 мм
106
↑Т, ↑Ан в сыворотке крови
ПРОЦЕСС ФОЛЛИКУЛОГЕНЕЗА
Гормонально-независимый период
2-5 мм
V класс
N-Е2, ↑↑Т, ↓Е2/Т,
ИФР-1/ЭФР
Андрогенное
микроокружение
развивающихся
фолликулов
5-10 мм
VI класс
↓↓СЭФР, N-оФРФ,
↑ эндотелин-1
Нарушен ангиогенез,
снижена барьерная функция микроциркуляторного
русла
Гормонально-зависимый период
10-16 мм
VII класс
↑↑ sFasR, N-sFasL
Ранняя активация
апоптоза ооцитов
в атретических
фолликулах
16-20 мм
VIII класс
>20 мм
N-ЭФР, ↓ ТФР-ß1, ↑/↓ИФР-1
Нарушение
процесса пролиферации
гранулезных клеток развивающегося фолликула
Нарушение роста и созревания доминантного фолликула
На эффективность оплодотворения и имплантацию эмбриона влияют оФРФ, ТФР-β1, эндотелин-1
Рис. 32. Предполагаемая схема формирования патологического фолликулогенеза при ОГНГ
107
↑Пролактин
ПРОЦЕСС ФОЛЛИКУЛОГЕНЕЗА
Гормонально-зависимый период
Гормонально-независимый период
2-5 мм
V класс
↑↑Е2, Т, N-Е2/Т,
ИФР-1/ЭФР
Защитный фактор в
отношении
реализации апоптоза
5-10 мм
VI класс
↓СЭФР,↓оФРФ,
↑эндотелин-1
10-16 мм
VII класс
16-20 мм
VIII класс
↑ sFasR
N-sFasL
>20 мм
↓/↑ЭФР, ↓ ТФР-ß1, N-ИФР-1
Нарушен ангиогенез,
снижена барьерная функция
микроциркуляторного русла
Нарушение кровоснабжения доминантного фолликула
На эффективность оплодотворения и имплантацию эмбриона влияют ИФР-1, тестостерон, ТФР-β1, эндотелин-1
Рис. 33. Предполагаемая схема формирования патологического фолликулогенеза при ФГП
ВЫВОДЫ
1. Для овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии характерно отставание развития сосудов микроциркуляторного русла, проявляющееся снижением уровня СЭФР (на 33 %
при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза, на 30% при функциональной гиперпролактинемии) и оФРФ, а также нарастанием концентрации эндотелина-1 (на 24,2 % при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза, на 17% при функциональной гиперпролактинемии) на всем протяжении развития фолликула. Это приводит к недостаточному кровоснабжению доминантного фолликула, необходимому для последующей овуляции.
2. В развивающемся доминантном фолликуле при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии
нарушена пролиферация гранулезных клеток. Концентрация маркеров пролиферации снижена, начиная со стадии раннего преовуляторного фолликула:
ИФР-1 на 18 % при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза, на
14 % при функциональной гиперпролактинемии; ЭФР на 31 % при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза, на 26 % при функциональной
гиперпролактинемии.
3. Фолликулогенез на фоне избытка андрогенов в клетках теки яичников, реализуется в условиях большого количества повреждающих факторов
(андрогенное микроокружение развивающихся ооцитов, повышенная готовность к апоптозу, нарушение формирования микроциркуляторного русла и
ангиогенеза). Наблюдается отсутствие рекрутирования и овуляции доминантных фолликулов. Для избытка пролактина характерно изменение условий развития микроциркуляторного русла и ангиогенеза при наличии выраженного защитного эффекта эстрадиола (повышение концентрации эстрадиола на 22 % по сравнению с контролем), что, вероятно, может служить защитным фактором в отношении реализации апоптоза.
4. Полученные результаты свидетельствуют о том, что регуляторные
109
молекулы, изменение концентрации которых исследовалось, в наибольшей
степени влияют на качество формирующегося ооцита, а также на эффективность
оплодотворения
и
имплантацию
эмбриона
(при
трубно-
перитонеальной форме бесплодия - эстрогены, оФРФ и ЭФР; при функциональной гиперпролактинемии - ИФР-1, тестостерон, ТФР-β1, эндотелин-1;
при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза - оФРФ, ТФР-β1,
эндотелин-1). Указанные молекулы могут использоваться для прогноза исходов лечебных циклов ЭКО.
Практические рекомендации
Результаты исследования могут послужить основой для развития и совершенствования методов диагностики патологических состояний женской
репродуктивной системы.
Закономерности, выявленные при детальном изучении этапов гормонально-зависимого этапа фолликулогенеза пациенток с эндокринным бесплодием, целесообразно использовать при определении индивидуальных
схем диагностики и лечения пациенток с овариальной гиперандрогенией неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемией в циклах ВРТ.
Определение содержания выявленных маркеров (ИФР-1, тестостерон,
ТФР-β1, эндотелин-1 при функциональной гиперпролактинемии; оФРФ,
ТФР-β1, эндотелин-1 при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза) может использоваться в качестве прогностических маркеров для оценки
исходов лечебных циклов при данных вариантах эндокринного бесплодия.
110
С ПИСОК
1.
ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТО ЧНИКОВ
Апоптоз в гормонально-зависимых тканях репродуктивной си-
стемы / Т. Г. Сухих, М. М. Дементьева, В. Н. Серов [и др.] // Акушерство и
гинекология. – 1999. – № 5. – С. 12–15.
2.
Апоптоз клеток гранулезы и показатели фертилизации ооцитов у
женщин с эндокринным бесплодием и эндометриозом в программе ЭКО / М.
В. Яманова, А. Б. Салмина, А. В. Светлаков [и др.] // Проблемы репродукции.
– 2004. – № 5. – С. 31–36.
3.
Ахкубекова, Н. К. Взаимодействие эстрогенов, прогестерона и
дофамина в регуляции секреции пролактина / Н. К. Ахкубекова // Проблемы
эндокринологии. – 2009. – № 6. – С. 46–47.
4.
Баркалина, Н. В. Антагонисты гонадотропин-рилизинг-гормона в
программах вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы) / Н. В. Баркалина, Н. Г. Мишиева, А. Н. Абубакиров // Проблемы репродукции. – 2012. – № 1. – С. 65–69.
5.
Баркалина, Н. В. Фолликулярная жидкость и прогноз исходов
ВРТ / Н. В. Баркалина // Проблемы репродукции. – № 6. – С. 57–64.
6.
Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лече-
нию / под ред. Г. Т. Сухих, Т. А. Назаренко. – М. : Гэотар-Медиа, 2010. – 784
с.
7.
Биохимические основы патологических процессов : учебное по-
собие / под ред. Е. С. Северина. – М. : Медицина, 2000. – 304 с.
8.
Боярский, К. Ю. Молекулярные основы фолликулогенеза. От
первичных половых клеток до антральных фолликулов (обзор литературы) /
К. Ю. Боярский // Проблемы репродукции. – 2006. – № 4. – С. 26–37.
9.
Боярский, К. Ю. Влияние гликозилирования ФСГ на фоллику-
лярную динамику и овариальную стимуляцию в программах ЭКО/ИКСИ (обзор литературы) / К. Ю. Боярский // Проблемы репродукции. – 2012. – № 4. –
С. 40–44.
111
10.
Боярский, К. Ю. Фолликулогенез и современная овариальная
стимуляция (обзор литературы) / К. Ю. Боярский // Проблемы репродукции.
– 2002. – № 3. – С. 36–43.
11.
Боярский, К. Ю. Молекулярные основы фолликулогенеза: от ста-
дии больших антральных фолликулов до овуляции / К. Ю. Боярский // Проблемы репродукции. – 2010. – № 5. – С. 13–23.
12. Биохимия и физиология семейства эндотелинов / С. А. Патарая, Д.
В. Преображенский, Б. А. Сидоренко [и др.] // Кардиология. – 2000. – № 6. –
С. 78–85.
13.
Бурлев, В. А. Регуляция ангиогенеза гестационного периода / В.
А. Бурлев, З. С. Зайдиева, Н. А. Ильясова // Проблемы репродукции. – 2008. –
№3. – С. 18–22.
14.
Бутрова, С. А. Метаболический синдром: патогенез, клиника, ди-
агностика, подходы к лечению / С.А. Бутрова // Рус. мед. журн. – 2001. – №2.
– С. 56–76.
15.
Василевская, С. Е. Классификация и морфометрические показа-
тели жизнеспособных бластоцист / С. Е. Василевская, А. В. Иванов, К. Ю.
Боярский // Проблемы репродукции. – 2004. – № 3. – С. 17–21.
16.
Влияние возраста пациенток на частоту биологических потерь в
программах ЭКО: опыт работы / Л. Д. Белоцерковцева, Л. В. Коваленко, Е. В.
Корнеева [и др.] // Проблемы репродукции. – 2008. – № 3. – С. 53–56.
17.
Гиперандрогения и оксидантный стресс / И. Б. Манухин, Т. Н.
Федорова, С. О. Смирнова [и др.] // Проблемы Репродукции. – 2012. - № 2. –
С.42–45.
18.
Гуморальные факторы микроокружения ооцитов на разных ста-
диях роста фолликулов при эндокринном бесплодии / М. В. Екимова, Е. А.
Тепляшина, Е. А. Пожиленкова [и др.] // Проблемы репродукции. – 2011. – №
4. – С. 19–22.
112
19.
Диагностическое значение маркеров ангиогенеза в биологиче-
ских жидкостях больных с аденомиозом / В. А. Бурлев, Н. А. Ильясова, Е. Д.
Дубинская [и др.] // Проблемы репродукции. – 2009. – № 1. – С. 86–88.
20.
Дисфункция эндотелия как предиктор развития метаболического
синдрома у женщин в период перименопаузы / Л. Д. Белоцерковцева, Л. В.
Коваленко, Е. В. Корнеева [и др.] // Вестн. новых мед. технологий. – 2010. –
№1. – С. 91–93.
21. Дисфункция эндотелия. Причины, механизмы, фармакологическая
коррекция / под ред. Н. Н. Петрищева. – СПб.: СПбГМУ, 2003. – 184 с.
22.
Годюнин, С. В. Инсулинорезистентность и регуляция метаболиз-
ма / Гордюнин С. В. // Проблемы эндокринологии. – 2012. – № 3. – Т.58 –
С.31–34.
23.
Иловайская, И. А. Биология пролактина: нейроэндокринный кон-
троль и регуляция секреции / И. А. Иловайская, Е. И. Марова // Акушерство и
гинекология. – 2000. – № 5. – С. 42–44.
24.
Йен, С.С.К. Репродуктивная эндокринология : пер. с англ. / С.С.К
Йен – М. : Медицина, 1998. – 1136 с.
25.
Калиниченко, С.Г. Мофлогическая характеристика апоптоза и его
значение в нейрогенезе / С. Г. Калиниченко, Н. Ю. Матвеева // Морфология.
– 2007. – Т.131, №2. – С. 16–27.
26.
Капустина, И. Н. Значение сосудистого фактора в развитии опу-
холей яичников / И. Н. Капустина, И. С. Сидорова // Рос. вестн. акушерагинеколога – 2003. – № 6. – С. 27–32.
27.
Колычев, А.П. Структурная организация связывающих детерми-
нант в молекуле инсулиноподобного фактора роста I (ИФР-1) / А. П. Колычев // Журн. эволюционной биохимии и физиологии. – 2010. – №1. – С. 74–
91.
113
28.
Кузьмичев, Л.Н. Экстракорпоральное оплодотворение. Отбор,
подготовка и тактика ведения больных / Л. Н. Кузьмичев, В. И. Кулакова, Б.
В. Леонова. – М. : Мир, 2001. – 165 с.
29.
Кулаков, В. И. Апоптоз в клинике гинекологических заболеваний
(обзор литературы) / В. И. Кулаков, Г. Т. Сухих, Р. Г. Гатаулина // Проблемы
репродукции. – 1999. – №2. – С. 15–25.
30.
Лечение женского и мужского бесплодия. Вспомогательные ре-
продуктивные технологии / под ред. В. И. Кулакова, Б. В. Леонова, Л. Н.
Кузьмичева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2005. – 592 с.
31.
Линде, В. А. Фолликулогенез: от примордиальной зародышевой
клетки до белого тела (обзор литературы) / В. А. Линде, А. В. Иванов // Проблемы репродукции. – 2007. – № 4. – С. 21–25.
32.
Манухин, И. Б. Роль апоптоза в патофизиологии синдрома поли-
кистозных яичников / И. Б. Манухин, Н. Е. Кушлинский, М. А. Геворкян //
Проблемы репродукции. – 2001. – № 4. – С. 31–34.
33.
Марков, Х. М. Оксидантный стресс и дисфункция эндотелия / Х.
М. Марков // Патологическая физиология и эксперимент. терапия. – 2005. –
№3. – С. 5–9.
34.
Марченко, Л. А. Преждевременное выключение функции яични-
ков: можно ли преодолеть бесплодие? / Л. А. Марченко, Г. Т. Сухих, Н. В.
Александрова // Проблемы репродукции. – 2006. – № 5. – С. 31–38.
35.
Метаболические нарушения у больных с синдромом поликистоз-
ных яичников / М. А. Геворкян, И. Б. Манухин, Н. Е. Кушлинский [и др.] //
Проблемы репродукции. – 2000. – № 6. – С. 38 – 42.
36.
Межклеточные взаимодействия / М. А. Пальцев, А. А. Иванов, С.
Е. Северин – 2-е изд. перераб. и дополн. – М.: Медицина, 2003. – 288 с.
37.
Микроокружение ооцитов при эндокринном бесплодии / М. В.
Яманова, А. В. Светлаков, А. Б. Салмина [и др.] // Бюл. эксперимент. биологии и медицины – 2004. – № 1. – С. 94–98.
114
38.
Мойбенко, А. А. Ферментативные механизмы апоптоза / А.А.
Мойбенко, В. Е. Досенко, В. С. Нагибин // Патол. физиология и эксперимент.
терапия. – 2005. – № 3. – С. 17–26.
39.
Назаренко, Т. А. Ингибиторы ароматазы в репродуктивной меди-
цине / Т. А. Назаренко, Д. В. Дмитриев // Проблемы репродукции. – 2007. –
№ 1. – С. 14–20.
40.
Ниаури, Д. А. Репродуктивное здоровье женщины и недостаточ-
ность функции яичников / Д. А. Ниаури, Л. Х. Джемлиханова, А. М. Гзглян //
Журн. акушерства и женских болезней. – 2010. – № 1. – С. 84–89.
41.
Никитин, А. И. Фолликуло- и оогенез при стимуляции овуляции
синдром / А. И. Никитин // Журн. акушерства и гинекологии. – 1998. – № 1. –
С. 41–45.
42.
Обухова, Ю. Д. Морфология яичников в различные периоды он-
тогенеза (обзор литературы) / Ю. Д. Обухова // Вестн. новых мед. технологий. – 2010. – № 2. – С. 301–305.
43.
Овсянникова, Т. В. Андрогены в физиологии и патофизиологии
женского организма / Т. В. Овсянникова, Н. В. Сперанская, О. И. Глазкова //
Гинекология. – 2000. – № 2. –– С. 42–46.
44.
Овсянникова, Т. В. Эндокринное бесплодие у женщин при гипер-
пролактинемии / Т. В. Овсянникова // Гинекология. – 2004. – Т. 6, №4. – С.
121–123.
45.
Ожирение и репродуктивная функция женщин / Е. А. Карпова, М.
Ф. Белоярцева, А. А. Шарова [и др.] // Проблемы репродукции. – 2006. – № 4.
– С. 57–62.
46.
Ольховская, М.А. Биомаркеры «имплантационного окна» (обзор
литературы) / М.А. Ольховская // Проблемы репродукции. – 2007. – № 1. –
С. 72–77.
115
47.
Основные принципы лечения больных с различными формами
гиперандрогении / Р. А. Саидова, Э. М. Арутюнян, Е. В. Першина [и др.] //
Журн. акушерства и женских болезней. – 2009. – № 1. – С. 84–92.
48.
Особенности оплодотворения ооцитов и развития эмбрионов в
культуре в зависимости от реакции яичников на стимуляцию суперовуляции /
О. А. Воробьева, В. В. Потин, В. С. Корсак [и др.] // Проблемы репродукции.
– 1998. – № 5. – С. 53–58.
49.
Оценка морфологии преимплантационных эмбрионов на различ-
ных стадиях развития in vitro (обзор литературы) / М. М. Левиашвили, Н. Г.
Мишиева, Н. Ю. Костромина [и др.] // Проблемы репродукции. – 2011. – № 3.
– С. 74–79.
50.
Оценка эффективности программы ЭКО: день переноса эмбрио-
нов в полость матки и показатели контролируемой индукции овуляции / Н.С.
Щетинина, Л.Н. Кузьмичев, В.А. Бурлев [и др.] // Проблемы репродукции. –
2011. – № 3. – С. 56–62.
51. Повещенко, А. Ф. Механизмы и факторы ангиогенеза / А. Ф. Повещенко, В. И. Коненков // Успехи физиологических наук. – 2010. – № 2. – С.
68–89.
52. Пожиленкова, Е. А. Влияние фолликулярного микроокружения на
жизнеспособность гранулезных клеток при некоторых формах эндокринного
бесплодия : автореф. дис. … канд. биол. наук: 14.00.16 / Пожиленкова Елена
Анатольевна. – Иркутск, 2008. – 25 с.
53. Пожиленкова, Е. А. Внутриклеточная локализация периферических бензодиазепиновых рецепторов у пациенток с эндокринным бесплодием
/ Е. А. Пожиленкова, М. В. Екимова, А. Б. Салмина // Проблемы репродукции. – 2009. – № 3. – С. 21–25.
54.
Пищулин, А. А. Овариальная гиперандрогения и метаболический
синдром / А. А. Пищулин, Е. А. Карпова // Рус. мед. журн. – 2001. – № 2. – С.
93–98.
116
55.
Репродуктивная функция: роль NO в обеспечении овуляции и
имплантации / Т. В. Блашкив, О. Н. Сердюк, Т. Ю. Вознесенская [и др.] //
Проблемы репродукции. – 2012. - № 3. С. 11–15.
56.
Секреты репродуктивной медицины / П. Т. К. Чен, М. Гоул-
дстайн, З. Розенвэкс / под общ. ред. акад. РАМН, проф. В. И. Кулакова – М. :
МЕДпресс-информ, 2006. – 448 с.
57.
Светлаков, А. В. Вероятность наступления имплантации у жен-
щин с разными формами бесплодия при лечении методом ЭКО / А. В. Светлаков, М. В. Яманова, А. Б. Салмина // Проблемы репродукции. – 2002. – №
3. – С. 61–67.
58.
Сидорова, И. С. Маркеры дисфункции эндотелия в оценке степе-
ни тяжести гестоза и эффективной терапии беременных, страдающих этим
осложнением / И. С. Сидорова, Н. Б. Зарубенко, О. И. Гурина // Рос. вестн.
акушера-гинеколога – 2012. – № 1. – С. 8–12.
59. Состояние овариального резерва при некоторых формах функционального бесплодия / Д. О. Жорданидзе, Т. А. Назаренко, Э. Р. Дуринян [и
др.] // Акушерство и гинекология. – 2010. – № 5. – С. 25–31.
60.
Сотникова, Е. И. Синдром поликистозных яичников: вопросы па-
тогенеза / Е. И. Сотникова, Э. Р. Дуринян, Т. А. Назаренко // Акушерство и
гинекология. – 1998. – № 1. – С. 36–42.
61.
Стимуляция функции яичников / под ред. Т. А. Назаренко. – М.:
Медпресс-информ, 2009. – 272 с.
62.
Репродуктивная эндокринология / под ред. С. С. К. Йена, Р. Б.
Джаффе. – М. : Медицина, 1998. – 273 с.
63.
Роговская, С. И. Андрогены и антиандрогены / С. И. Роговская //
Гинекология. – 2000. – № 2– С. 47–51.
64.
Телунц, А. В. Гиперандрогения у девочек-подростков / А. В. Те-
лунц // Акушерство и гинекология. – 2001. – № 1. – С. 8–11.
117
65.
Тишкевич, О. Л. Клинико-эмбриологическая оценка результатов
экстракорпорального оплодотворения в зависимости от возраста пациенток /
О. Л. Тишкевич, А. Б. Жабинская, Е. В. Малышева // Проблемы репродукции.
– 2004. – № 2. – С. 33–37.
66.
Ткачук, В. А. Введение в молекулярную эндокринологию: учеб-
ное пособие / В. А. Ткачук. – М. : Изд-во моск. ун-та, 1983. – 256 с.
67.
Тюренков, И. Н. Развитие эндотелиальной дисфункции при недо-
статочности половых гормонов / И. Н. Тюренков, А. В. Воронков, А. И. Робертус // Патол. физиология и эксперимент. терапия. – 2009. – № 4. – С. 33–
36.
68.
Уварова, Е. В. Возможности негормональной коррекции уровня
пролактина на фоне гормональной контрацепции у сексуально активных молодых женщин / Е. В. Уварова, Н. В. Болдырева // Рус. мед. журн. – 2007. ––
№ 3. – С. 191–196.
69.
Факторы роста и их роль в регуляции репродуктивной функции у
больных с синдромом поликистозных яичников / В. А. Бурлев, А. С. Гаспаров, Н. С. Аванесян [и др.] // Проблемы репродукции. – 1998. – № 3. – С. 17–
25.
70.
Фолликулярная жидкость как среда, определяющая качество оо-
цита и исход программ ВРТ (обзор литературы) / А. А. Ильина, И. И. Калинина, Т. Г. Трошина [и др.] // Проблемы репродукции. – 2008. – № 4. – С. 27–
38.
71.
Чагай, Н. Б. Функция коры надпочечников при синдроме полики-
стозных яичников / Н. Б. Чагай, М. А. Геворкян // Проблемы репродукции. –
2007. – № 4. – С. 35–39.
72.
Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в
лечении женского и мужского бесплодия (теоретические и практические
подходы): руководство для врачей / под ред. В. И. Кулакова, Б. В. Леонова. –
М. : Медицинское информационное агентство, 2004. – 782 с.
118
73.
Элдер, К. Экстракорпоральное оплодотворение: пер. с англ. / К.
Элдер, Б. Дэйл. / – М. : МЕДпресс-информ, 2008. – 304 с.
74.
Эндокринное бесплодие: клеточная и молекулярная патология
имплантации / М. В. Яманова, А. Б. Салмина – М. : Медика, 2009. – 208 c.
75.
Abramovich, D. Effect of a Vascular Endothelial Growth Factor
(VEGF) Inhibitory Treatment on the Folliculogenesis and Ovarian Apoptosis in
Gonadotropin-Treated Prepubertal Rats / D. Abramovich, F. Parborell, M. Tesone
// Biol. Reprod. – 2006. – Vol. 75, № 3. – P. 434–441.
76.
Ambrosini, G. Oestrogen stimulates endothelial progenitor cells via
oestrogen receptor-alpha / G. Ambrosini, A. Ferlin // Clin. Endocrinol. – 2007. –
Vol. 67, № 4. – P. 520–525.
77.
Angiogenesis and vascular function in the ovary / R. Robinson, K.
Woad, A. Hammond [et al.] // Reproduction. – 2009. – Vol. 138, № 5. – P. 869–
881.
78.
Angiogenic factors and ovarian follicle development / J. Bruno, M.
Matos, R. Chaves [et al.] // Anim. Reprod. – 2009. – Vol. 6, № 2. – P. 371–379.
79.
Agrawal, R. Serum vascular endothelial growth factor concentrations
and ovarian stromal blood flow are increased in women with polycystic ovaries /
R. Agrawal // Hum. Reprod. – 1998. – Vol. 13, № 3. – P. 651–655.
80.
Antipsychotics and hyperpolactinaemia: pathophysiology, clinical rel-
evance, diagnosis and therapy / A. Riecher-Rossler, C. Schmid, S. Bleuer [et al.] //
Neuropsychiatria. – 2009. – Vol. 23, № 2. – P. 71–83.
81.
Bachelot, A. Reproductive role of prolactin / A. Bachelot, N. Binart //
Reproduction. – 2007. – Vol. 133. – P. 361–369.
82.
Bonnet, A Opportunities and challenges in applying genomics to the
study of oogenesis and folliculogenesis in farm animals / A. Bonnet, R. DalbiesTran, M. A. Sirard // Reproduction. – 2008. – Vol. 135, № 1. – P. 119–128.
83.
Сastedo, M. Mitochondrial apoptosis and the peripheral benzodiaze-
pine receptor: a novel target for viral and pharmacological manipulation / M.
119
Сastedo, J.-L. Perfettini, G. Kroemer // J. Exp. Med. – 2002. – Vol. 196, № 9. – P.
1121–1125.
84.
Cellular and molecular aspects of ovarian follicle ageing / C. Tatone,
A. Fernanda, M. Carbone [et al.] // Hum. Reprod. – 2008. – Vol. 14, № 2. – P.
131–142.
85.
Changes of Messenger RNA Expression of Angiogenic Factors and
Related Receptors During Follicular Development in Gilts / T. Shimizu, J. Jiang,
H. Sasada [et al.] // Biol. Reprod. – 2002. – Vol. 67, № 6. – P. 1846–1852.
86.
Characterization of endothelin-1and nitric oxide generating system in
corpus luteum-derived endothelial cells / E. Klipper, T. Gilboa, N. Levy [et al.] //
Reproduction. – 2004. – Vol. 128. – P. 463–473.
87.
Cloning and Characterization of a 5' Regulatory Region of the Prolac-
tin Receptor-Associated Protein/17ß Hydroxysteroid Dehydrogenase 7 Gene / M.
Risk, A. Shehu, J. Mao [et al.] // Endocrinology. – 2005. – Vol. 146, № 6. – P.
2807–2816.
88.
Comparison of follicle steroidogenesis from normal and polycystic
ovaries in women undergoing IVF: relationship between steroid concentrations,
follicle size, oocyte quality and fecundability / M. P. Teissier, H. Chable, S.
Paulhac [et al.] // Hum. Reprod. – 2000. – Vol. 15, № 12. – P. 1271–2477.
89.
Drummond, A. The role of steroids in follicular growth / A. Drum-
mond // Reprod. Biol. and Endocrinol. – 2006. – Vol. 4, № 16. – P. 143–152.
90.
Early Impairment of Endothelial Structure and Function in Young
Normal-Weight Women with Polycystic Ovary Syndrome / F. Orio, S. Palomba, T.
Cascella [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2004. – Vol. 89, № 9. – P. 4588 –
4593.
91.
Early Human Preantral Follicles Have Relaxin and Relaxin Receptor
(LGR7), and Relaxin Promotes Their Development / K. Shirota , K. Tateishi, T.
Koji [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2005. – Vol. 90, № 1. – P. 516–521.
120
92.
Effect of androgens on the development of mouse follicles growing in
vitro / A. A. Murray, R. S. Gosden, V. Allison [et al.] // J. Reprod. Fertil. – 1998. –
Vol. 113. – P. 27–33.
93.
Effects of fetal bovine serum, FSH and 17β-estradiol on the culture
preantral follicles / S. C. Hulshof, J. R. Figueiredo, J. R. Beckers [et al.] // Theriogenology. – 1995. – Vol. 44, № 2. – P. 217–226.
94.
Effect of epidermal growth factor and insulin-like growth factor I on
porcine preantral follicular growth, antrum formation, and stimulation of granulosal cell proliferation and suppression of apoptosis in vitro / J. Mao, M. Smith, E.
Rucker [et al.] // J. Anim. Sci. – 2004. – Vol. 82, № 7. – P. 1967–1975.
95.
Endothelin-1 and Endotelin-3 Promote Invasive Behavior via Hypox-
ia-Inducible Factor-1α in Human Melanoma Cells / F. Spinella, L. Rosano, V. Di
Castro [et al.] // Cancer Res. – 2007. – Vol. 67. – P. 1725–1734.
96.
Endothelin-1-, Endothelin-A-, and Endothelin-B-Receptor Expression
Is Correlated with Vascular Endothelial Growth Factor Expression and Angiogenesis in Breast Cancer / P. Wülfing, C. Kersting, J. Tio [et al.] // Clin. Cancer Res. –
2004. – Vol. 10. – P. 2393–2400.
97.
Endothelin-2 in Ovarian Follicle Rupture / K. CheMyong, M. Gieske,
L. Al-Alem [et al.] // Endocrinology. – 2006. – Vol. 147, №4. – P. 1770–1779.
98.
Elvin, A. J. Mouse models of ovarian failure / A. J. Elvin, M. M.
Matzuk // Rev. Reprod. – 1998. – Vol. 3. – P. 183–195.
99.
Erickson, G. The physiology of folliculogenesis: the role of novel
growth factors / G. Erickson, S. Shimasaki // Fertil. Steril. – 2001. – Vol. 76, № 5.
– P. 943–949.
100. Erickson, G. The role of the oocyte in folliculogenesis / G. Erickson,
S. Shimasaki // Trends Endocrinol. Metab. – 2000. – Vol. 11, №5. – P. 193–198.
101. Franks, S. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome / S. Franks, J. Stark, K. Hardy // Hum. Reprod. Update – 2008. – Vol. 14,
№ 4. – P. 367–378.
121
102. Fraser, H. Regulation of the ovarian follicular vasculature / H. Fraser
// Reprod. Biol. Endocrinol. – 2006. – Vol. 4, № 18. – P. 4–18.
103. Fritz, M. The endocrinology of the menstrual cycle: the interaction of
folliculogenesis and neuroendocrine mechanism / M. Fritz, R. Speroff // Fertil.
Steril. –1982. – Vol. 38, № 5. – P. 509–529.
104. Expression of Growth Differentiation Factor 9 Messenger RNA in
Porcine Growing and Preovulatory Ovarian Follicles / R. Prochazka, L. Nemcova,
E. Nagyova [et al.] // Biol. Reprod. – 2004. – Vol. 71, № 4. – P. 1290–1295.
105. Geva, E. Role of vascular endothelial growth factor in ovarian physiology and pathology / E. Geva, R. Jaffe // Fertil. Steril. – 2000. – Vol. 74, № 3. –
P. 429–438.
106. Gougeon, A. Regulation of ovarian follicular development in primates: facts and hypotheses / A. Gougeon // Endocr. Rev. – 1996. – Vol. 17, № 2.
– P. 121–155.
107. Grimshaw, M. Endothelins and hypoxia-inducible factor in cancer /
M. Grimshaw // Endocr. Relat. Cancer. – 2007. – Vol. 14, № 2. – P. 233–244.
108. Growth Differentiation Factor 9 Promotes Rat Preantral Follicle
Growth by Up-Regulating Follicular Androgen Biosynthesis / M. Orisaka, J. Jiang,
S. Orisaka [et al.] // Endocrinology. – 2009. – Vol. 150, № 6. – P. 2740–2748.
109. Growth Differentiation Factor-9 Stimulates Rat Theca-Interstitial Cell
Androgen Biosynthesis / E. V. Solovyeva, M. Hayashic, K. Margia [et al.] // Biol.
Reprod. – 2000. – Vol. 63, № 4. – P. 1214 – 1218.
110. Hendersen, H. L. Direct effects of prolactin and dofamine on the gonadotroph response to GnRH / H. L. Hendersen, J. Townsend, D. Tortonese // J.
Endocrinology. – 2008. – Vol. 197. – P. 343–350.
111. Hillier, S. Paracrine support of ovarian stimulation / S. Hillier // Hum.
Reprod. – 2009. – Vol. 15, № 12. – P. 843–850.
122
112. Hormonal regulation of apoptosis in early antral follicles: folliclestimulating hormone as a major survival factor / S-Y. Chun, K. Eisenhauer, S.
Minami [et al.] // Endocrinology. – 1996. – Vol. 137, № 4. – C. 1447–1456.
113. Houmburg, R. Androgen circle of polycystic syndrome / R. Houmburg // Hum. Reprod. – 2009. – Vol 24, № 7. – P. 1548–1555.
114. Human ovarian granulosa cells and follicular fluids indices: the relationship to oocyte maturity and fertilization in vitro / W. M. Enien, E. Chantler,
M.W. Seif [et al.] // Hum. Reprod. – 1998. – Vol. 13, № 5. – P. 1303–1306.
115. Hutt, K. J. An oocentric view of folliculogenesis and embryogenesis /
K. J. Hutt, D. F. Albertini // Reprod. Biomed. Online. – 2007. – Vol. 14, № 6. – P.
758–764.
116. Hydroxyestrogens inhibit angiogenesis in swine ovarian follicles / G.
Bassini, S. Bussolati, S. Santini [et al.] // J. Endocrinol. – 2008. – Vol. 199, № 1. –
P. 127 – 135.
117. Identification, Characterization and Biological Activity of Endothelin
Receptors in Human Ovary / R. Mancina, T. Barni, E. Aldo [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1997. – Vol. 82, № 12. – P. 4122–4129.
118. Induction of Endothelin-2 Expression by Luteinizing Hormone and
Hypoxia: Possible Role in Bovine Corpus Luteum Formation / E. Klipper, A.
Levit, Y. Mastish [et al.] // Endocrinology. – 2010. – Vol. 151, № 4. – P. 1914–
1922.
119. Induction of Follicular Development by Direct Single Injection of
Vascular Endothelial Growth Factor Gene Fragments into the Ovary of Miniature
Gilts / T. Shimizu, J. Jiang, K. Iijiama [et al.] // Biol. Reprod. – 2003. – Vol. 69, №
4. – P. 1388–1393.
120. Immunolocalization of Fas and Fas ligand in the ovaries of women
with polycystic ovary syndrome: relationship to apoptosis / N. A. Cataldo, D. A.
Dumesic, P. C. Goldsmith [et al.] // Hum. Reprod. – 2000. – Vol. 15, № 9. – P.
1889–1897.
123
121. Kaczmarek, M. M. Role of vascular endothelial growth factor in ovarian physiology – an overview / M. M. Kaczmarek, D. Schams, A.J. Ziecik // Reprod. Biol. – 2005. – Vol. 5, № 2. – P. 111–136.
122. Kedzierski, R. Endothelin system: the double-edged sword in health
and disease / R. Kedzierski, M. Yanagisawa // Annu Rev. Pharmacol. Toxicol. –
2001. – Vol. 41. – P. 851–876.
123. Knil, P Focus on TGF- β superfamily members and ovarian follicle
development / P. Knil, C. Glister // Hum. Reprod. – 2006. – Vol. 132. – P. 191–
206.
124. Lam, P. Vascular endothelial growth factor plays more than an angiogenic role in the female reproductive system / P. Lam, C. Haines // Fertil. Steril. –
2005. – Vol. 84, № 6. – P. 1775–1778.
125. Lenie, S. Steroidogenesis-disrupting compounds can be effectively
studied for major fertility-related endpoints using in vitro cultured mouse follicles /
S. Lenie, J. Smith // Toxicol. Lett. – 2009. – Vol. 185, № 3. – P. 143–152.
126. Location-dependent role of the human glioma cell peripheral-type
benzodiazepine receptor in proliferation and steroid biosynthesis / R. C. Brown, B.
Degenhardt, M. Kotoula [et al.] // Cancer Lett. – 2000. – Vol. 156, № 2. – P. 125–
132.
127. Losordo, D. Estrogen and Angiogenesis / D. Losordo, J. Isner // Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. – 2001. – Vol. 21, № 6. – P. 6–12.
128. Mahmound, R. Hussein Apoptosis in the ovary molecular / M. R.
Hussein // Hum. Reprod. Update. – 2005. – Vol. 11, № 2. – P.162–178.
129. Mechanisms regulating follicular development and selection of the
dominant follicle / R. Webb, B. Nicholas, J. G. Gong [et al.] // Reprod. Suppl. –
2003. – Vol. 61. – P. 71–90.
130. Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible
clinical implications / I. E. Messinis // Hum. Reprod. – 2006. – Vol. 12, № 5. – P.
557–571.
124
131. Miller, W. L. Minireview: Regulation of Steroidogenesis by Electron
Transfer / W. L. Miller // Endocrinology. – 2005. – Vol. 146, № 6. – P. 2544–
2550.
132. Muller, K. Histomorphological and immunohistoсhemical study of
angiogenesis and angiogenic factors in the ovary of the mare / K. Muller, C. Ellenberger, C. Schoon // Res. Vet. Sci. – 2009. – Vol. 87, № 3. – P. 421 – 431.
133. Multiple
Signaling
Pathways
Regulating
Steroidogenesis
and
Steroidogenic Acute Regulatory Protein Expression: More Complicated than We
Thought / D. Stocco, X. Wang, Y. Jo [et al.] // Mol. Endocrinol. – 2005. – Vol. 19,
№ 11. – P. 2647–2659.
134. Novel function of ovarian growth factors: combined studies by DNA
microarray, biochemical and physiological approaches / I. Ben-Ami, S. Freimann,
L. Armon [et al.] // Mol. Hum. Reprod. – 2006. – Vol. 12, № 7. – P. 413–419.
135. Novel Pathway Involving Progesterone Receptor, Endothelin-2, and
Endothelin Receptor B Controls Ovulation in Mice / G. Palanisamy, Y. Cheon, J.
Kim [et al.] // Mol. Endocrinol. – 2006. – Vol. 20, №11. – P. 2784–2795.
136. O’Donnell, J. B Epidermal growth factor activates cytosolic [Ca2+]
elevations and subsequent membrane permeabilization in mouse cumulus–oocyte
complexes / J. B. O'Donnell, J. L. Hill, D. J. Gross // Reproduction. – 2004. – Vol.
127. – P. 207–220.
137. Oestrogen receptor and β, androgen receptor and progesterone receptor mRNA and protein localization within the developing ovary and in small growing follicles of sheep / J. Juengel, D. Heath, L. Quirke [et al.] // Hum. Reprod. –
2006. – Vol. 131. – P. 81–92.
138. Oosterhuis, G. J. Apoptotic cell death in human granulosa-lutein cells:
a possible indicator of in vitro fertilization outcome / G. J. Oosterhuis, H. W.
Michgelsen, C. B. Lambalk // Fertil. Steril. – 1998. – Vol. 70, № 4. – P. 747–749.
139. Parborell, F. Intrabursal Administration of the Antiangiopoietin 1 Antibody Produces a Delay in Rat Follicular Associated with an Increase in Ovarian
125
Apoptosis Mediated by Changes in the Expression of BCL2 Related Genes / F.
Parborell, D. Abramovich, M. Tesone // Biol. Reprod. – 2008. – Vol. 78, № 3. – P.
506–513.
140. Peptide Hormone Regulation of Angiogenesis / C. Clapp, S. Thebault,
M. Jeziorski [et al.] // Physiol. Rev. – 2009. – Vol. 89, № 4. – P. 1177–1215.
141. Pregnancy and pituitary disorders / Z. Karaca, F. Tanriverdi, K. Unluhizardci [et al.] // Eur. J. Endocrinol. – 2010. – Vol. 162. – P. 453–475.
142. Production and binding of endothelin-2 (EDN-2) in the rat ovary: endothelin receptor subtype A (EDNRA)-mediated contraction / P. Bridges, M. Jo, L.
Alem [et al.] // Reprod. Fertil. Dev. – 2010 – Vol. 22, № 5. – P. 780 – 787.
143. Prolactin (PRL) and Its Receptor: Actions, Signal Tranduction Pathways and Phenotypes Observed in PRL Receptor Knockout Mice / C. Bole-Feysot,
V. Goffin, M. Edery [et al.] // Endocr. Rev. – 1998. – Vol. 19, № 3. – P. 225–268.
144. Pru, J. K. Programmed Cell Death in the Ovary: Insights and Future
Prospects Using Genetic Technologies / J. K. Pru, J. L. Tilly // Mol. Endocrinol. –
2001. – Vol. 15, № 6. – Р. 845–853.
145. Quirk, S.M. Regulation of Fas antigen (Fas, CD95)-mediated apoptosis of bovine granulosa cells by serum and growth factors / S.M. Quirk, R.M.
Harman, R.G. Cowan // Biol Reprod. – 2000. – Vol. 63, № 5. – P. 1278–1284.
146. Relaxin-Induced Angiogenesis in Ovary Contributes to Follicle Development / K. Shirota, K. Tateishi, M. Emoto [et al.] // Ann. N. Y. Acad. Sci. –
2005. – Vol. 1041. – P. 144–146.
147. Sanderson, J. T. The Steroid Hormone Biosynthesis Pathway as a
Target for Endocrine-Disrupting Chemicals / J. T. Sanderson // Toxicol. Sci. –
2006. – Vol. 94, № 1. – Р. 3–21.
148. Serum and follicular fluid levels of soluble Fas, soluble Fas ligand and
apoptosis of luteinized granulosa cells in PCOS patients undergoing IVF / G. Onalan, B. Selam, Y. Baran [et al.] // Hum. Reprod. – 2005. – Vol. 20, № 9. – P. 2391–
2395.
126
149. Sites of prolactin inhibition on gonadotropin-induced estrogen production in cultured rat granulosa cells / F. Larrea, S. Sanchez-Gonzalez, R GarciaBecerra [et al.] // Gac. Med. Mex. – 2005. – Vol. 141, № 4. – P. 259–266.
150. Szoltys, M. Immunohistochemical localization of androgen receptor in
rat oocytes / M. Szoltys, M. Slomczynska, Z. Tabarowski // Folia Histochem. Cytobiol. – 2003. – Vol. 41, №2. – P. 59–64.
151. Signaling by Hypoxia-Inducible Factors Is Critical for Ovulation In
Mice / J. Kim, C. Indrani, M. Bagchi [et al.] // Endocrinology. – 2009. – Vol. 150,
№ 7. – P. 3392–3400.
152. Silva, J. R. V. Involvement of growth hormone (GH) and insulin-like
growtn factors (IGF) system in ovarian folliculogenesis / J. R. V. Silva, J. R.
Figueiredo, R. van den Hurk // Theriogenology. – 2009. – Vol. 71, № 8. – P. 1193–
1208.
153. Soccio, R. E. Intracellular cholesterol transport / R. E. Soccio, J. L.
Breslow // Ateroscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2004. – Vol. 24. – Р. 1150–1160.
154. Son, D.-S. Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) Increases Granulosa
Cell Proliferation: Dependence on c-Jun and TNF Receptor Type 1 / D-S. Son, K.
Y. Roby, P. F. Terranova // Endocrinology. – 2004. – Vol. 145, № 3. – P. 1218 –
1226.
155. Son, D.-S. Tumor Necrosis Factor-α Induces Serum Amyloid A3 in
Mouse Granulosa Cells / D.-S. Son, K.F. Roby, P. F. Terranova // Endocrinology.
– 2004. – Vol. 145, № 5 – P. 2245–2252.
156. Spatiotemporal analysis of the protein expression of angiogenic factors and their related receptors during folliculogenesis in rats without hormonal
treatment / D. Abramovich, A. Celin, F. Hernandez [et al.] // Reproduction. –
2009. – Vol. 137, № 2. – P. 309 – 320.
157. Steroidogenesis and apoptosis in the mammalian ovary / A. Amsterdam, I. Keren-Tal, D. Aharoni [et al.] // Steroids. – 2003. – Vol. 68, № 10-13. – P.
861–867.
127
158. Stevenson, A. F. Human granulosa cells in vitro: characteristics of
growth, morphology and influence of some cytokines on steroidogenesis / A. F.
Stevenson // Indian J. Exp. Biol. – 2000. – Vol. 38, №12. – P. 1183–1191.
159. Suhail, A. R. Irregular cycles and steroid hormones in polycystic ovary syndrome / A. R. Suhail, M. Al-Zaid, P. A. Towers [et al.] // Hum. Reprod. –
2005. – Vol. 20, № 9. – P. 2402–2408.
160. Taylor, P. Effect of GnRH antagonist treatment on follicular development and angiogenesis in the primate ovary / P. Taylor, S. Hillier, H. Fraser // J.
Endocrinology. – 2004. Vol. 183. – P. 1–17.
161. Taira, H. Activity of Three-ß-Hydroxysteroid Dehydrogenase in
Granulosa Cells Treated in Vitro with Luteinizing Hormone, Follicle-Stimulating
Hormone, Prolactin, or a Combination / H. Taira, M. Beck // Poult. Sci. – 2006. –
Vol. 85. – P. 176–1774.
162. Trombospondin and Vascular Endothelial Growth Factor Are Cyclically Expressed in an Inverse Pattern During Bovine Ovarian Follicle Development / J. Greenaway, P. Gentry, J. Feige [et al.] // Biol. Reprod. – 2005. – Vol. 72,
№ 5. – P. 1071–1078.
163. The effect of follicle-stimulating hormone on follicular development,
granulosa cell apoptosis and steroidogenesis and its mediation by insulin-like
growth factor-I in the goat ovary / Y. Yu, W. Li, Z. Han [et al.] // Theriogenology.
– 2003. – Vol. 60, № 9. – P. 1691–1704.
164. The level of vascular endothelial growth factor, nitric oxide, and endothelin-1 was correlated with ovarian volume or antral follicle counts: A potential
predictor of pregnancy outcome in INF / M. Zhao, C. Chang, Z. Liu [et al.] //
Growth Factors. – 2010. – Vol. 28, № 5. – P. 299–305.
165. Vascular endothelial growth factor production in growing pig antral
follicles / B. Barboni, M. Galeati, M. Spinaci [et al.] // Biol. Reprod. – 2000. – Vol.
63. – P. 858–864.
128
166. Vascular endothelial growth factor receptor 2-mediated angiogenesis
is essential for gonadotropin-dependent follicle development / R. C. Zimmermann,
T. Hartman, S. Kavic [et al.] // J. Clin. Invest. – 2003. Vol. 112, № 5. – P. 659–
669.
167. Vascular supply as a discriminanting factor for pig preantral follicle
selection / A. Martelli, N. Bernabo, P. Berardinelli [et al.] // Reproduction. – 2009.
– Vol. 137. – P. 45–58.
168. Vascularity and expression of angiogenic factors in bovine dominant
follicles of the first follicular wave / A. Grazul-Bilska, C. Navanukraw, M. Johnson [et al.] // J. Anim. Sci. – 2007. – Vol. 85, №8. – P. 1914–1922.
169. Yang, P. Epidermal Growth Factor Modulates Transforming Growth
Factor Receptor Messenger RNA and Protein Levels in Hamster Preantral Follicles
In Vitro / P. Yang, S. K. Roy // Biol. Reprod. – 2001. – Vol. 65. – P. 847–854.
170. Wang, C. Development of Primordial Follicles in the Hamster: Role
of Estradiol-17β / C. Wang, S. K. Roy // Endocrinology. – 2007. – Vol. 148, № 4.
– P. 1707–1716.
171. Watts, S. Endothelin receptors: what's new and what do we need to
know? / S. Watts // Am J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. – 2010.
– Vol. 298, № 2. – P. 254–260.
172. Wu, J. The effect of sex steroids on human ovarian granulosa cell
apoptosis / J. Wu, L. Zhang, T. Li // Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. – 1998. – Vol.
33, № 3. – P. 157–159.
173. Yang, M. Y. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro / M. Y. Yang, J. E.
Fortune // Mol. Reprod. Dev. – 2007. – Vol. 74, № 9. – P. 1095–1104.