Активность ферментов антиоксидантной защиты и окисление
advertisement
УДК 612.015.1:618.3 Н.М. КОЗЛОВА1, Л.П. КАСЬКО2, А.Г. КУТЬКО1, В.А. ПЕТРОВИЧ1, Т.А. СЕРЖАН3, Е.И. СЛОБОЖАНИНА1 АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И ОКИСЛЕНИЕ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ В ЭРИТРОЦИТАХ ЖЕНЩИН ПРИ НЕКОТОРЫХ ПАТОЛОГИЯХ БЕРЕМЕННОСТИ 1 Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, Минск, Беларусь, 2 Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск, Беларусь, 3 Родильный дом Минской области, Беларусь. (Поступила в редакцию 04.01.2010) Введение. Известно, что окислительный стресс включается в патогенез многих заболеваний. В литературе имеются данные, что в крови беременных женщин с нормально протекающей беременностью концентрация активных форм кислорода (АФК) и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме и клетках крови повышается по сравнению с их уровнем у небеременных [1], что компенсируется усилением активности основных антиоксидантных ферментов [2]. Концентрация липидных перекисей в крови беременных женщин со сроком гестации 40 недель в 1,6 раза выше, чем у небеременных [3]. В течение беременности наблюдается постепенное увеличение концентрации всех продуктов ПОЛ в сыворотке крови, наибольших значений эти показатели достигают к моменту родов [4]. Недавно показано [5], что при нормально протекающей беременности значительно понижается общая антиоксидантная активность плазмы крови. Это говорит об изменении функционирования антиоксидантной системы, которое может происходить из-за снижения уровня отдельных антиоксидантов. Авторы работы предполагают, [5] что общая антиоксидантная способность организма – не просто сумма активностей различных антиоксидантов, а их совместное действие, которое обеспечивает наилучшую защиту от действия свободных радикалов. Существует динамическое равновесие между различными антиоксидантами. Хотя уровень отдельных антиоксидантов повышается во время беременности, суммарный результат может давать понижение антиоксидантной активности. Это относится и к патологии беременности. Повышение активности интенсивности может играть ПОЛ важную и роль снижение в антиоксидантной развитии осложнений беременности, о чем свидетельствуют исследования последних лет. Так, у женщин с гестозом напряженность окислительного стресса, регистрируемая по динамике уровня общей оксидантной активности плазмы крови и концентрации продуктов ПОЛ, прогрессивно нарастает к концу 3-го триместра беременности [6, 7]. Аналогичные изменения наблюдаются и при беременности на фоне железодефицитной анемии: повышается уровень малонового диальдегида (МДА) в плазме крови [8], снижается уровень восстановленного глутатиона в эритроцитах [9], существенно возрастает уровень метаболитов [10]. В итоге суммарный потенциал антиоксидантной системы снижается за счет уменьшения уровня восстановленного глутатиона и активности глутатионпероксидазы (ГП) в сыворотке крови [6]. Согласно литературным данным, причиной преждевременных родов при незрелости плода и внутриутробной смертности является окислительный стресс, сопровождающийся увеличением образования продуктов ПОЛ в плазме крови и уменьшением уровня общей антиоксидантной активности [11]. Показано, что у беременных с внутриутробной задержкой развития плода (ВЗРП) уровень МДА в плазме крови также значительно выше, чем у женщин с нормально протекающей беременностью [12]. Наряду с этим отмечается высокое содержание диеновых конъюгатов и липидных гидроперекисей в мембранах эритроцитов [13]. Обнаружено увеличение протеолитической активности в эритроцитах беременных с ВЗРП, что авторы работы [12] считают индикатором чрезмерного окисления белков. Все эти данные указывают на возникновение состояния окислительного стресса в клетках крови при патологии беременности. Имеются сведения о том, что окислительный стресс может вносить значительный вклад и в патогенез преэклампсии. У беременных женщин с этим заболеванием наблюдается повышение продукции АФК, особенно NO. и О2.-, и повышение уровня ПОЛ в плазме и клетках крови [2, 14]. Многие исследователи рассматривают увеличение продуктов ПОЛ и уменьшение антиоксидантной активности в плазме крови как маркеры окислительного стресса [11, 15, 16]. Одним из маркеров для оценки окислительного стресса in vivo могут служить параметры, характеризующие окисление мембранных белков [17 ,18]. Цель данной работы – выяснить, могут ли активность ферментов антиоксидантной защиты и концентрация сульфгидрильных групп в мембранных белках эритроцитов являться маркерами окислительного стресса у женщин при патологии беременности. Материалы и методы исследования. Клиническое обследование и наблюдение беременных женщин проводилось в УЗ «Родильный дом Минской области». Обследовано три группы беременных: I – женщины с нормально протекающей беременностью при сроке гестации 38−40 недель (n=15), II – женщины с угрозой прерывания беременности (n=21), III – женщины, беременность которых осложнилась внутриутробной задержкой развития плода (согласно МКБ-ВОЗ Р05 – замедленный рост и недостаточность питания плода) при сроке гестации 30−40 недель (n=8). В работе использованы эритроциты периферической крови и изолированные из них мембраны. Эритроцитарные мембраны получали по методу Доджа и сотр. [19]. Концентрацию белка в тенях эритроцитов определяли по модифицированному методу Лоури [20], активность ГП – по методу Моина [21], супероксиддисмутазы (СОД) – непрямым спектрофотометрическим методом, основанным на использовании реакции супероксид-зависимого окисления кверцетина [22]. Количество мембранных SH-групп оценивали двумя независимыми флуориметрическим методами: (с спектрофотометрическим помощью флуоресцирующего [23] и SH-реагента N-(1-пирен)малеимида) [24, 25]. Об изменении микровязкости липидов в мембранах эритроцитов судили по параметрам флуоресценции липофильных зондов 1-(4-триметиламмоний)-6-фенил-1,3,5-гексатриена (ТМА-ДФГ) и лаурдана, включенных в липидный бислой изолированных эритроцитарных мембран. Флуориметрические измерения ТМА-ДФГ проводили аналогично методу, описанному в работе [26] (λвозб = 365 нм, λрег = 428 нм), а для лаурдана определяли величину генерализованной поляризации (GP) (λвозб = 340 нм, λрег = 440 нм и λрег = 490 нм) [27]. Флуоресцентные измерения производили на люминесцентном спектрофотометре LSF222 («СОЛАР», Беларусь), а спектрофотометрические – на спектрофотометре Specord M-40 (Германия). Результаты экспериментов анализировали методом вариационной статистики с использованием параметрического критерия Стьюдента. В работе использованы следующие реагенты: ТМА-ДФГ, лаурдан (Мolecular Probes, США), трет-бутилгидроперекись (t-BHP), 5,5-дитио-бис-2нитробензойная кислота (ДТНБ), N-(1-пирен)малеимид (ПМ) фирмы Sigma (США), NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4 (марки ОСЧ или ХЧ, «Реахим», Россия). Результаты и их обсуждение. Изучена активность ферментов антиоксидантной защиты ГП и СОД в эритроцитах женщин при патологии беременности. Как видно из данных, представленных в табл. 1, активность СОД в эритроцитах периферической крови беременных снижалась в среднем на 15% как у женщин с угрозой прерывания беременности, так и у женщин, беременность которых осложнилась ВЗРП, по сравнению данными показателями крови женщин с нормально протекающей беременностью. Активность же ГП в эритроцитах женщин с угрозой прерывания беременности при этом повышалась на 25−35% и не отклонялась от значений, характерных для нормально протекающей беременности, в группе женщин, беременность которых осложнилась ВЗРП. Параллельно с этим в эритроцитах женщин с угрозой прерывания беременности было выявлено повышение (на 30−40%) уровня продуктов ПОЛ (рис. 1). О повышении уровня продуктов ПОЛ в плазме крови [11, 13] и эритроцитах женщин, беременность которых была осложнена ВЗРП, свидетельствуют данные и других авторов [12]. Нами установлено, что существует связь между активностью СОД и накоплением ТБК-продуктов в мембранах эритроцитов женщин с угрозой прерывания беременности (r = −0,680, Р = 0,064), (рис. 2). Так как известно, что в основе развития многих патологических процессов лежат нарушения физического состояния липидов, нами было изучено состояние липидного бислоя мембран эритроцитов. Были использованы флуоресцентные зонды лаурдан и ТМА-ДФГ. Однако значительных отличий в показателях флуоресценции данных зондов по сравнению с контролем в группах беременных с патологией не обнаружено (рис. 3). Выявлена лишь тенденция снижения GP флуоресценции лаурдана (рис. 3, А), связанного с мембранами эритроцитов (а следовательно, и вязкости бислоя мембран) только в группе женщин с угрозой прерывания беременности, в то время как поляризация флуоресценции ТМА-ДФГ при этом не изменялась (рис. 3, Б). Полученные данные свидетельствуют о том, что при исследуемых патологиях беременности микровязкость липидного бислоя мембран эритроцитов не изменяется. Снижение активности антиоксидантных ферментов в эритроцитах может привести к накоплению АФК и вызвать окислительное повреждение мембранных белков. Ранее нами было показано, что при патологии беременности, связанной с угрозой ее прерывания, происходит изменение структурно-функционального состояния поверхностных компонентов мембран эритроцитов. Это параметров активности подтверждено изменением мембраносвязанной кинетических ацетилхолинэстеразы [28]. Нарушение структурно-функционального состояния мембран эритроцитов при патологии беременности может быть связано с окислительной деструкцией как липидов, так и белков. Учитывая разнообразную роль белков в мембранах, модификация носит, можно в предположить, отличие от что их пероксидации окислительная липидов, более избирательный и специфический характер. Ранее было обнаружено повышение уровня карбонильных групп в плазме крови женщин, беременность которых была осложнена ВЗРП, что свидетельствовало об окислительном разрушении белков плазмы крови при данном заболевании [12]. В данной работе двумя независимыми методами исследован уровень SH-групп в мембранных белках эритроцитов обследуемых групп беременных. С помощью флуоресцентного и спектрофотометрического методов (использование N-(1-пирен)малеимида и реактива Эллмана) установлено достоверное снижение уровня SH-групп белков в мембранах эритроцитов в группе женщин с угрозой прерывания беременности (табл. 2). Это свидетельствует об окислительном повреждении белков в мембранах эритроцитов женщин с угрозой прерывания беременности. Аналогичное изменение уровня SH-групп мембранных белков выявлено и в эритроцитах беременных с внутриутробной задержкой развития плода (табл. 2). Как показано выше, нами обнаружено снижение активности СОД на 15−20% в эритроцитах беременных обследуемых групп с аналогичными показателями в группе женщин с нормально протекающей беременностью. Уменьшение активности СОД в эритроцитах можно рассматривать и как накопление АФК, что может приводить к окислительному повреждению мембранных белков. Заключение. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об окислении мембранных белков и снижении активности супероксиддисмутазы в эритроцитах женщин при угрозе прерывания беременности и ВЗРП, что указывает на возможность использования этих параметров в качестве маркеров для диагностики угрозы прерывания беременности и беременности, осложненной ВЗРП, с целью назначения антиоксидантной терапии. Работа поддержана грантом БРФФИ № Б07-319. Литература 1. M o r r i s J . M . , G o p a u l N . K . , E n d r e s e n M . J . R . e t a l . // Br. J. Obstet. Gynaecol. 1998. Vol. 105. P. 1195–1199. 2. S h a r m a R . K . , A g a r w a l A . // Reproduct. Med. and Biol. 2004. N 3. P. 177–199. 3. Y o s h i k i T a k e h a r a , T a m o t s u Y o s h i o k a . // Acta Medica Okayama. 1990. Vol. 44, N 2. P. 103–111. 4. М и к а е л я н Микаелян Н. П., Максина А. Г., Князев Ю. А., А . В . // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1997. Т. 123, № 1. С. 26– 28. 5. A d i g a U . S . , A d i g a M . N . S . // Online J. of Health and Allied Sci. (On-line/Unpaginated). 2009. Vol. 8, N 2. 6. А к к е р Л. В., Варшавский Б. Я., Ельчанинова С. А. и д р . // Акушерство и гинекология. 2000. № 4. С. 17–20. 7. К о л о м и й ц е в а А. Г., Черненко Т . С . // Акушерство и гинекология. 1986. № 4. С. 22–26. 8. Б а л а б и н а Н . М . // Сибир. мед. журн. 2009. № 3. С. 41–43. 9. N e e l i m a H e m k a r , S h a r m a D . C . , M a n m i n d e r R i y a t // J. of Clin. Med. and Res. 2010. Vol. 2, N 2. P. 012–014. 10. Б е г о в а С . В . , О с м а н о в а З . М . , О м а р о в Н . С . - М . // Вопр. геникологии, акушерства и перинатологии. 2007. Т. 6, № 3. С. 23–27. 11. K a r o w i c z - B i l i n s k a A . , K d z i o r a - K o r n a t o w s k a K . , B a r t o s z G . // Free Radic. Res. 2007. Vol. 41, N 8. P. 870 – 873. 12. U l l a s Kamath, Guruprasad Rao, Shobha U. Kamath, L a v a n y a R a i // Ind. J. of Clin. Biochem. 2006. Vol. 21, N 1. P. 111–115. 13. K a r o w i c z - B i l i n s k a A . // Ginecol. Pol. 2004. Vol. 75. P. 6–9. 14. S h a a m a s h A . H . , E l s n o s y a E . D . , M a k h l o u f a A . M . e t a l . // Inter. J. of Gynecol. & Obstetrics. 2000. Vol. 68, N 3. P. 207–214. 15. L a g o d L . , P a s z k o w s k i T . , S i k o r s k i R . , R o l a R . // Ginekol. Pol. 2001. Vol. 72, N 12. P. 1073–1078. 16. K k e n G . , K i r S a h i n F . , C o s a r E . e t a l . // Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 2007. Vol. 86, N 11. P. 1317–1321. 17. K a r o w i c z - B i l i n s k a A . , M a r s z a l e k M . , K o w a l s k a - K o p r e k U . e t a l . // Ginekol. Pol. 2004. Vol. 75, N 1. P. 15–20. 18. К а с ь к о Л. П., Козлова Н. М., Кутько А . Г . и д р . // Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы: материалы конференции 4–5 апреля 2008 г., Минск. Ч.1. С. 138–141. 19. D o d g e G. T., Mitchell C., Hanahan D . J . // Arch. Biochem. Biophys. 1963. Vol. 100. P. 119–130. 20. M a r k w e l l M. A. K., Haas S. M., Tolbert N . E . // Analyt. Biochem. 1978. Vol. 87, N 2. P. 206–210. 21. М о и н В . М . // Лаб. дело. 1986. № 12. С. 724–727. 22. K o s t y u k V . A . , P o t a p o v i t c h A . I . // Biochem. Int. 1989. Vol. 19. P. 1117–1124. 23. K i t a j i m a H., Yamaguchi T., Kimoto E . // J. Biochem. 1990. Vol. 108. P. 10571062. 24. W u C. W., Yarbrough L. R., Wu F . Y . H . // Biochemistry. 1976. Vol. 15, N 13. P. 28632868. 25. S h a r m a M., Joshi P. G., Joshi N . B . // Radiat. Phys. Chem. 1997. Vol. 49, N 1. P. 141143. 26. S o k a l A . , P u l a s k i L . , R y c h l i k B . e t a l . // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. Vol. 44, N 1. P. 97–105. 27. P a r a s a s s i T., De Stasio G . e t a l . // Biophys. J. 1990. Vol. 57. P. 1179–1186. 28. К а с ь к о Л. П., Козлова Н. М., Слобожанина д р . // Докл. НАН Беларуси. 1994. Т. 38. № 6. С. 81–83. Е. И. и Таблица 1. Активность глутатионпероксидазы (ГП) в супероксиддисмутазы эритроцитах (СОД) обследуемых и групп беременных Активность, % Группа Женщины с СОД ГП 100 100 (n=10) (n=12) 85,93,9 132,68,9 (n=21) (n=27) беременность 85,55,4 109,310,4 осложнилась (n=12) (n=13) нормально протекающей беременностью (I гр.) Женщины с угрозой прерывания беременности (II гр.) Женщины, которых внутриутробной задержкой развития плода (III гр.) П р и м е ч а н и е . За 100% принято среднее значение активности антиоксидантных ферментов у женщин с нормально протекающей беременностью. Достоверность различий по сравнению с I группой: 0,05; – Р 0,1. –Р ТБК, % 160 120 80 40 0 I II ТБК, мкмоль r = -0,680 0,4 P = 0,064 0,3 0,2 0,1 0,12 0,14 0,16 А, мкмоль/мин Т а б л и ц а 2 . Изменение параметров, характеризующих уровень SH- групп в мембранных белках эритроцитов беременных женщин Группы обследованных % беременных Iфл. ПМ [SH] (возб. =342 нм, рег. =396 нм) I –Женщины с нормально 100% 100% 81,55,2 81,43,7 88,92,0 84,60,4 протекающей беременностью (n=10) II – Женщины с угрозой прерывания беременности (n=21) III – Женщины, беременность которых осложнилась внутриутробной задержкой развития плода (n=8) П р и м е ч а н и е . За 100% принято среднее значение интенсивности флуоресценции N-1-пирен-малеимида (ПМ) и концентрации SH- групп [SH] мембранных белков эритроцитов группы женщин с нормально протекающей беременностью. Достоверность различий по сравнению с I группой: – Р 0,05; – Р 0,1. А GP Б P 0,4 * 0,4 0,3 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1 0,0 0,0 I II III I II III Подписи к рисункам Рис.1. Уровень ТБК-продуктов в эритроцитах беременных женщин. Группы обследуемых: I– женщины с нормально протекающей беременностью; II – женщины с угрозой прерывания беременности. За 100% принято среднее значение уровня ТБК-продуктов в эритроцитах группы женщин с нормально протекающей беременностью. Рис. 2. Связь между активностью СОД и уровнем ТБК-продуктов в эритроцитах женщин с угрозой прерывания беременности Рис. 3. Параметры флуоресценции липофильных зондов, включенных в мембраны эритроцитов. А – генерализованная поляризация (GP) флуоресценции лаурдана, встроенного в мембраны эритроцитов беременных женщин (λвозб = 340 нм, λрег = 440 нм и λрег = 490 нм); Б – поляризации флуоресценции ТМА-ДФГ, встроенного в мембраны эритроцитов беременных женщин (λвозб = 365 нм, λрег = 428 нм). I – женщины с нормально протекающей беременностью; II – женщины, беременность которых осложнена внутриутробной задержкой развития плода; III – женщины с угрозой прерывания беременности. – Р < 0,05 по сравнению с контролем. УДК 612.015.1:618.3 Н. М. Козлова, Л. П. Касько, А. Г. Кутько, В. А. П е т р о в и ч , Т . А . С е р ж а н , Е . И . С л о б о ж а н и н а . Активность ферментов антиоксидантной защиты и окисление мембранных белков в эритроцитах женщин при некоторых патологиях беременности // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2010. № 3. С. Изучены активность ферментов антиоксидантной защиты (глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы), физическое состояние липидов в мембранах эритроцитов и концентрация сульфгидрильных групп в мембранных белках эритроцитов у женщин с патологией беременности. Обнаружено снижение активности супероксиддисмутазы в эритроцитах женщин при угрозе прерывания беременности и у беременных с внутриутробной задержкой развития плода (ВЗРП). Показано, что микровязкость мембранных липидов в эритроцитах обследованных не изменяется. С помощью флуоресцентного и спектрофотометрического методов установлено достоверное снижение уровня SH-групп белков в мембранах эритроцитов женщин с данными патологиями. Полученные результаты указывают на возможность использования этих параметров в качестве маркеров для диагностики угрозы прерывания беременности и беременности, осложненной ВЗРП, с целью назначения антиоксидантной терапии. Табл. 2. Ил. 3. Библиогр. – 28 назв. Резюме 1 Козлова Н.М., 2Касько Л.П., 1Кутько А.Г., 1Петрович В.А., 3 Сержан Т.А., 1Слобожанина Е.И. АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И ОКИСЛЕНИЕ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ В ЭРИТРОЦИТАХ ЖЕНЩИН ПРИ НЕКОТОРЫХ ПАТОЛОГИЯХ БЕРЕМЕННОСТИ 1 ГНУ ”Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси”, г. Минск, Республика Беларусь, 2 Белорусская медицинская академия последипломного образования МЗ РБ 3 Обнаружено УЗ «Родильный дом Минской области» снижение активности супероксиддисмутазы в эритроцитах женщин при угрозе прерывания беременности и у беременных с внутриутробной задержкой развития плода. С помощью флуоресцентного и спектрофотометрического методов установлено достоверное снижение уровня SH–групп белков в мембранах эритроцитов у женщин с данными патологиями. Полученные результаты указывают на возможность использования этих параметров в качестве маркеров для диагностики угрозы прерывания беременности и беременности, осложненной внутриутробной задержкой развития плода, с целью назначения антиоксидантной терапии. 1 N.M. KOZLOVA, 2L.P. KASKO, 1A.G. KUTKO, 1V.A. PETROVICH, 3 T.A. SERZHAN, 1E.I. SLOBOZHANINA ACTIVITY OF ANTIOXIDANT DEFENCE ENZYMES AND MEMBRANE PROTEINS OXIDATION IN ERYTHROCYTES OF WOMEN WITH SOME PATHOLOGIES OF PREGNANCY 1 Institute of Biophysics and Cell Engineering of NAS of Belarus, Minsk, 2 Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education, Minsk, 3 Maternity hospital of Minsk region Summary The decrease of superoxide dismutase in erythrocytes in pregnant women with intrauterine growth restriction and with threatened abortion was found. By means of fluorescent and spectrophotometric methods it was shown that the level of SHgroups of proteins in erythrocyte membranes in pregnant women with threatened abortion and intrauterine growth restriction reliably decreases. The results obtained show the possibility of use of these parameters in the capacity of markers for diagnostics of intrauterine growth restriction and threatened abortion for the purpose of prescription of antioxidant therapy.