АННОТИРОВАННЫЙ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ О РЕЗУЛЬТАТАХ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ, ВЫПОЛНЕННЫХ НА ЭТАПЕ № 1 «Исследование частоты регистрации полиморфных вариантов генов цитокинов» Соглашение от 23 июля 2012 г № 14.А18.21.0199. Тема: «Молекулярно-генетический анализ генов цитокиновой системы при нарушении репродуктивной функции человека» Исполнитель: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» Ключевые слова: цитокины, полиморфизм генов, неразвивающаяся беременность, спонтанный аборт, децидуальная ткань, хорионическая ткань, бесплодие 1. Цель проекта 1.1. Формулировка задачи проекта. Суммарные репродуктивные потери у человека составляют примерно 50% по отношению к числу зачатий. Одним из возможных факторов, приводящих к бесплодию, может быть нарушение первичных процессов развития зародыша и имплантации. Изучение генных сетей, определяющих ранние этапы эмбриогенеза человека, является актуальной проблемой современной биологии и генетики. Особое значение приобретает исследование генов, кодирующих сигнальные молекулы (в том числе и цитокины) и обуславливающих согласованную работу различных систем и органов. 1.2. Формулировка цели реализованного проекта. Цель - исследовать частоту регистрации полиморфизма генов цитокинов в тканях материнского и зародышевого происхождения при различных вариантах течения эмбриогенеза человека, а также у женщин и мужчин из бесплодных супружеских пар для выявления полиморфных состояний генов-кандидатов, ассоциированных с нарушением репродуктивной функции человека. Большая часть современных работ по изучению роли цитокинов при мультифакторных патологиях человека направлена на определение уровня цитокинов в крови. Однако уровень цитокинов в плазме может не отражать содержание данных соединений в тканях – мишенях контролируемого процесса. В данном исследовании определен полиморфизм генов цитокинов не только в клетках крови, но и непосредственно в тканях эндометрия и хориона, что позволяет оценить вклад генотипа эмбриона. 2. Основные результаты проекта 2.1. Краткое описание основных полученных результатов. Проведен анализ данных литературы о роли цитокинов и полиморфизма их генов в нарушении репродуктивной функции человека. Проведена научно-исследовательская работа по анализу ассоциации полиморфизма ряда генов цитокинов с нарушением ранних сроков беременности. В частности проведен анализ частоты регистрации полиморфизма -31С-Т гена IL-1β (MIM *147720), -174G-C гена IL-6 (MIM *147620), -592С-A и -818С-Т гена IL-10 (MIM *124092), -308G-A гена TNFα (MIM *191160) в клетках материнского и зародышевого происхождения при различных вариантах течения ранних сроков беременности, а также среди мужчин и женщин из бесплодных супружеских пар. В результате исследования выявлены статистически значимые отличия в частотах генотипов по полиморфизму -31С-Т гена IL-1β в клетках крови между двумя группами женщин с патологией беременности в I триместре (неразвивающаяся беременность и спонтанный аборт) (χ2 =7.78 Р=0.02). Частота полиморфного варианта гена IL-1β среди женщин с неразвивающейся беременностью статистически значимо выше по сравнению с группой женщин со спонтанным абортом (СА). Характер распределения частот генотипов по полиморфизму -174G-C гена IL-6 в клетках крови женщин со спонтанным абортом или неразвивающейся беременностью (НБ) идентичен контрольному. В группе женщин со спонтанным абортом количество гомозигот по аллели -592С гена IL-10 снижено, а доля гетерозиготных носителей полиморфизма -592С-Т гена IL-10 повышена по сравнению с контролем. Данные различия являются статистически значимыми. Фактором повышенного риска развития спонтанного аборта является гетерозиготное носительство полиморфизма -592С-Т гена IL-10 (OR = 2.72 95% CI 1.43 – 5.18). Гомозиготное состояние данного полиморфизма оказывает защитный эффект (OR = 0.29 95% CI 0.06 – 1.36). Распределение частот генотипов у женщин с НБ соответствует контрольному, в отличие от группы женщин со спонтанным абортом. Частота аллели 819Т гена IL-10 среди женщин со СА достоверно выше по сравнению с группой контроля. Выявлены статистически значимые отличия в частотах генотипов по полиморфизму G-308A гена TNF в клетках крови между группой женщин со СА в I триместре и контрольной группой (χ2=6,96 Р=0.03). Также выявлены статистически значимые отличия в частотах генотипов и аллелей по полиморфизму G-308A гена TNF между двумя группами женщин с патологией беременности в I триместре (НБ и СА). Анализ частот генотипов в клетках децидуальной ткани по полиморфизму -31С-T гена IL-1β, -174CC гена IL-6 и -308G-A гена TNF не выявил статистически значимых различий между сравниваемыми группами. Среди образцов децидуальной ткани женщин контрольной группы преобладают гомозиготные по аллели -592С гена IL-10. В отличие от контрольной группы и группы со спонтанными абортами среди женщин с НБ более 70% приходится на гомозигот СС-592; при этом частота аллели -592А гена IL-10 в 2,2 раза меньше. Сочетанный анализ частоты всех исследуемых полиморфизмов показал, что в 30 % образцов децидуальной ткани, полученных после спонтанного аборта, полиморфизм по гену IL-6 сочетается с полиморфизмом гена IL-10. Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфизму -31С-T гена IL-1β в клетках хориона не отличается от такового для клеток децидуальной ткани. В клетках хорионической ткани распределение частот генотипов и аллелей по полиморфизму -174GC гена IL-6 в контрольной группе и среди женщин со спонтанным абортом практически одинаково и не отличается от такового для клеток материнской части плаценты. В то же время среди образцов хорионической ткани, полученных из абортивного материала при неразвивающейся беременности, статистически значимо чаще регистрируются гомозиготы по аллели -174G гена IL-6. При этом OR = 18,0 (95% CI 3.2 – 100.9). Полиморфный вариант гена в данном случае не является фактором риска (OR = 0.16 95% CI 0,04-0.63). Характер распределения частот генотипов и аллелей в клетках хорионической ткани по полиморфизму -592C-A гена IL-10 и -308G-A гена TNF одинаков во всех трех сравниваемых группах. Среди мужчин из бесплодных пар статистически значимо чаще регистрируются гетерозиготные носители полиморфизма -592 С-A гена IL-10 (OR = 2,67, P 95% CI 1,116,41). В то же время среди мужчин не выявлено ни одного случая гомозиготного состояния по полиморфизму -592АА гена IL-10. Cреди мужчин и женщин из бесплодных пар полиморфный вариант гена фактора некроза опухоли в гетерозиготном состоянии зарегистрирован в 25 % случаев (в контроле – 40%). Одновременно с этим в бесплодных парах увеличена доля гомозигот по аллели 308G гена TNF. При объединении группы мужчин и женщин из бесплодных пар выявлены статистически значимые отличия в распределении частот генотипов по полиморфизму 308G-A гена TNF по сравнению с контролем (χ2 = 6,55 при Р = 0,04) и аллелей (χ2 = 5,88 при Р = 0,02). Больший вклад в данные различия вносят особенности генотипов мужчин из бесплодных пар. Среди мужчин из бесплодных пар частота аллели -308А гена фактора некроза опухоли более чем в 2 раза ниже по сравнению с контролем. 2.2. Описание новизны научных результатов. Впервые получены данные о частоте полиморфных вариантов генов цитокинов в клетках децидуальной и хорионической тканях при двух различных патологиях первого триместра беременности – спонтанном аборте и неразвивающейся беременности. Установлено, что вклад исследуемых полиморфизмов генов цитокинов в увеличение риска спонтанного прерывания беременности и остановку развития зародыша не одинаков. Впервые показано, что случаи спонтанного аборта характеризуются снижением доли образцов, в которых и в децидуальной и в хорионической тканях выявлен полиморфный вариант гена IL-1β. Если в контрольной группе 58% парных образцов тканей являются гетерозиготами по полиморфизму -31С-Т гена IL-1β, то в группе со спонтанным абортом данный показатель составил 7,1% (OR = 0.056 95% CI 0.006-0.52 P=0.0036). Установлено, что риск развития такого патологического состояния как неразвивающаяся беременность повышается в случае гомозиготного состояния по аллели -174G гена IL-6 в клетках хорионической ткани (OR = 18 (3.2 – 100.9). Частота аллели 174C в данной группе в 2,8 раз меньше по сравнению с контролем. Впервые показано, что в бесплодных супружеских парах более чем в 40% случаев как мужчина, так и женщина имеют в своем генотипе полиморфные варианты по крайней мере двух генов цитокинов – IL-6 с IL-10 или IL-1β. При обоих вариантах генотипов возникает ситуация повышенной продукции провоспалительных цитокинов или нарушение баланса между уровнем про- и противовоспалительных цитокинов, что может обуславливать нарушение ранних этапов эмбрионального развития человека. 2.3.Сопоставление с результатами аналогичных работ мирового уровня. Подавляющая часть работ по исследованию генетических причин невынашивания беременности и бесплодия направлена на изучение роли полиморфизма генов фолатного цикла, факторов свертывающей системы крови и системы детоксикации ксенобиотиков (Rey et al., 2003; Ruzzi et al., 2005; Goodman et al., 2006; Sood, 2009; Aagaard-Tillery et al., 2010; Slezak et al., 2011; Nair et al., 2012; Wu et al., 2012). В то же время исследования генов, контролирующих межклеточные взаимодействия, иммунные реакции немногочисленны и противоречивы. Накопленные в настоящий момент данные о роли цитокинов при нарушении репродуктивной функции человека, в основном касаются их уровня в периферической крови, что лишь косвенно отражает их содержание в тканяхмишенях. Большинство работ по изучению регуляторных молекул при развитии патологического процесса направлены на изучение отдельных цитокинов. В действительности в ответ на активационный сигнал происходит синтез клетками одновременно нескольких цитокинов, участвующих в формировании цитокиновой сети. Биологические эффекты в тканях и на уровне организма зависят от присутствия и концентрации многих цитокинов с синергичным, аддитивным или противоположным действием. В данном исследовании проведен анализ полиморфных вариантов генов цитокинов непосредственно в тканях, задействованных в ранних этапах эмбриогенеза человека, что позволяет определить индивидуальный комплекс аллельных вариантов генов цитокинов и возможный характер ответной клеточной реакции, ее интенсивность и продолжительность. Особое значение имеет выявление значимого сочетания полиморфных вариантов генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, поскольку вероятнее всего наблюдается аддитивный эффект данных вариантов генов. Результаты данного проекта соответствуют аналогичным работам мирового уровня. 3. Назначение и область применения результатов проекта 3.1. Описание областей применения полученных результатов. Результаты научно-исследовательской работы могут быть использованы всеми научно-исследовательскими учреждениями в области биологии и генетики, а также широким кругом учреждений здравоохранения и НИИ медицинского профиля, центров экстракорпорального оплодотворения, медико-генетическими консультациями. Результаты НИР могут служить теоретической основой для разработки диагностических тестов и досимптоматической диагностики возможного развития бесплодия как мультифакторного состояния. Результаты НИР используются в образовательном процессе на факультете биологических наук Южного федерального университета. В частности, при чтении специальных курсов «Генетика репродукции», «Медико-генетическое консультирование» для студентов, специализирующихся на кафедре генетики. Методики исследования, применяемые при выполнении НИР, используются студентами при выполнении дипломных работ и магистерских диссертаций. 4. Перспективы развития исследований 1) Участие в ФЦП способствовало формированию новых и укреплению существующих исследовательских партнерств, в частности с Ростовским государственным медицинским университетом, Научно-исследовательским институтом акушерства и педиатрии г. Ростова-на-Дону, Перинатальным центром Ростовской области. 2) Коллектив исполнителей данного проекта в настоящее время участвует в следующих проектах по аналогичной тематике: «Молекулярно-генетический анализ генов системы репарации и контроля клеточного цикла при невынашивании беременности» (РФФИ). «Разработка системы скрининга нарушений репродуктивного здоровья школьников в околопубертатный период на основе геномных и постгеномных маркеров» (Минобрнауки). «Исследование прогностических геномных и постгеномных маркеров эмбриогенеза человека» (Минобрнауки). В 2013 году коллективом исполнителей проекта планируется выполнение следующих проектов: «Исследование роли уровня активности генов цитокинов в ответной реакции клеток на действие окислительного стресса», «Комплексный анализ белков межклеточной сигнализации и их генов при различных вариантах течения беременности». 3) Планируется проведение обмена опытом и совместных исследований в области генетики и эпигенетики ранних этапов эмбрионального развития млекопитающих с коллегами из университета Земли Саар (Саарбрюкен, Германия), в частности с кафедрой генетики (эпигенетики) профессора Йорна Вальтера (Jorn Walter). 5. Опыт закрепления молодых исследователей – участников проекта (этапа проекта) в области науки, образования и высоких технологий В ходе реализации первого этапа проекта участвовали: Бурьянова Дарья Петровна, 13.11.1991 года рождения входит в состав научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения № 14.А18.21.0199. Золотухин Петр Владимирович, 12.06.1988 года рождения входит в состав научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения № 14.А18.21.0199. Коваленко Константин Алексеевич, 24.03.1983 года рождения входит в состав научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения № 14.А18.21.0199. Куцын Ксения Андреевна, 29.05.1991 года рождения зачислена в магистратуру на кафедру генетики факультета биологических наук, входит в состав научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения № 14.А18.21.0199. Лаптина Татьяна Алексеевна, 06.08.1990 года рождения зачислена в магистратуру на кафедру генетики факультета биологических наук, входит в состав научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения № 14.А18.21.0199. Майборода Екатерина Александровна, 29.08.1984 года рождения входит в состав научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения № 14.А18.21.0199. Миктадова Александра Валентиновна, 24.12.1987 года рождения входит в состав научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения № 14.А18.21.0199. Шерчкова Татьяна Александровна, 07.10.1992 года рождения входит в состав научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения № 14.А18.21.0199. Руководитель организации - Получателя гранта Проректор по развитию магистратуры и послевузовского профессионального образования Южного федерального университета Сероштан М.В. Руководитель Проекта Машкина Е.В.