АННОТИРОВАННЫЙ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ О

АННОТИРОВАННЫЙ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ
О РЕЗУЛЬТАТАХ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ, ВЫПОЛНЕННЫХ
НА ЭТАПЕ № 1
«Исследование частоты регистрации полиморфных вариантов генов цитокинов»
Соглашение от 23 июля 2012 г № 14.А18.21.0199.
Тема: «Молекулярно-генетический анализ генов цитокиновой системы при
нарушении репродуктивной функции человека»
Исполнитель: федеральное государственное автономное образовательное
учреждение высшего профессионального образования «Южный федеральный
университет»
Ключевые слова: цитокины, полиморфизм генов, неразвивающаяся беременность,
спонтанный аборт, децидуальная ткань, хорионическая ткань, бесплодие
1.
Цель проекта
1.1. Формулировка задачи проекта.
Суммарные репродуктивные потери у человека составляют примерно 50% по
отношению к числу зачатий. Одним из возможных факторов, приводящих к бесплодию,
может быть нарушение первичных процессов развития зародыша и имплантации.
Изучение генных сетей, определяющих ранние этапы эмбриогенеза человека, является
актуальной проблемой современной биологии и генетики. Особое значение приобретает
исследование генов, кодирующих сигнальные молекулы (в том числе и цитокины) и
обуславливающих согласованную работу различных систем и органов.
1.2. Формулировка цели реализованного проекта.
Цель - исследовать частоту регистрации полиморфизма генов цитокинов в тканях
материнского и зародышевого происхождения при различных вариантах течения
эмбриогенеза человека, а также у женщин и мужчин из бесплодных супружеских пар для
выявления полиморфных состояний генов-кандидатов, ассоциированных с нарушением
репродуктивной функции человека. Большая часть современных работ по изучению роли
цитокинов при мультифакторных патологиях человека направлена на определение уровня
цитокинов в крови. Однако уровень цитокинов в плазме может не отражать содержание
данных соединений в тканях – мишенях контролируемого процесса. В данном
исследовании определен полиморфизм генов цитокинов не только в клетках крови, но и
непосредственно в тканях эндометрия и хориона, что позволяет оценить вклад генотипа
эмбриона.
2.
Основные результаты проекта
2.1. Краткое описание основных полученных результатов.
Проведен анализ данных литературы о роли цитокинов и полиморфизма их генов в
нарушении репродуктивной функции человека.
Проведена научно-исследовательская работа по анализу ассоциации полиморфизма
ряда генов цитокинов с нарушением ранних сроков беременности. В частности проведен
анализ частоты регистрации полиморфизма -31С-Т гена IL-1β (MIM *147720), -174G-C
гена IL-6 (MIM *147620), -592С-A и -818С-Т гена IL-10 (MIM *124092), -308G-A гена TNFα
(MIM *191160) в клетках материнского и зародышевого происхождения при различных
вариантах течения ранних сроков беременности, а также среди мужчин и женщин из
бесплодных супружеских пар.
В результате исследования выявлены статистически значимые отличия в частотах
генотипов по полиморфизму -31С-Т гена IL-1β в клетках крови между двумя группами
женщин с патологией беременности в I триместре (неразвивающаяся беременность и
спонтанный аборт) (χ2 =7.78 Р=0.02). Частота полиморфного варианта гена IL-1β среди
женщин с неразвивающейся беременностью статистически значимо выше по сравнению с
группой женщин со спонтанным абортом (СА).
Характер распределения частот генотипов по полиморфизму -174G-C гена IL-6 в
клетках крови женщин со спонтанным абортом или неразвивающейся беременностью
(НБ) идентичен контрольному.
В группе женщин со спонтанным абортом количество гомозигот по аллели -592С
гена IL-10 снижено, а доля гетерозиготных носителей полиморфизма -592С-Т гена IL-10
повышена по сравнению с контролем. Данные различия являются статистически
значимыми. Фактором повышенного риска развития спонтанного аборта является
гетерозиготное носительство полиморфизма -592С-Т гена IL-10 (OR = 2.72 95% CI 1.43 –
5.18). Гомозиготное состояние данного полиморфизма оказывает защитный эффект (OR =
0.29 95% CI 0.06 – 1.36). Распределение частот генотипов у женщин с НБ соответствует
контрольному, в отличие от группы женщин со спонтанным абортом. Частота аллели 819Т гена IL-10 среди женщин со СА достоверно выше по сравнению с группой контроля.
Выявлены статистически значимые отличия в частотах генотипов по
полиморфизму G-308A гена TNF в клетках крови между группой женщин со СА в I
триместре и контрольной группой (χ2=6,96 Р=0.03). Также выявлены статистически
значимые отличия в частотах генотипов и аллелей по полиморфизму G-308A гена TNF
между двумя группами женщин с патологией беременности в I триместре (НБ и СА).
Анализ частот генотипов в клетках децидуальной ткани по полиморфизму -31С-T
гена IL-1β, -174CC гена IL-6 и -308G-A гена TNF не выявил статистически значимых
различий между сравниваемыми группами. Среди образцов децидуальной ткани женщин
контрольной группы преобладают гомозиготные по аллели -592С гена IL-10. В отличие от
контрольной группы и группы со спонтанными абортами среди женщин с НБ более 70%
приходится на гомозигот СС-592; при этом частота аллели -592А гена IL-10 в 2,2 раза
меньше. Сочетанный анализ частоты всех исследуемых полиморфизмов показал, что в 30
% образцов децидуальной ткани, полученных после спонтанного аборта, полиморфизм по
гену IL-6 сочетается с полиморфизмом гена IL-10.
Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфизму -31С-T гена IL-1β в
клетках хориона не отличается от такового для клеток децидуальной ткани. В клетках
хорионической ткани распределение частот генотипов и аллелей по полиморфизму -174GC гена IL-6 в контрольной группе и среди женщин со спонтанным абортом практически
одинаково и не отличается от такового для клеток материнской части плаценты. В то же
время среди образцов хорионической ткани, полученных из абортивного материала при
неразвивающейся беременности, статистически значимо чаще регистрируются
гомозиготы по аллели -174G гена IL-6. При этом OR = 18,0 (95% CI 3.2 – 100.9).
Полиморфный вариант гена в данном случае не является фактором риска (OR = 0.16 95%
CI 0,04-0.63). Характер распределения частот генотипов и аллелей в клетках
хорионической ткани по полиморфизму -592C-A гена IL-10 и -308G-A гена TNF одинаков
во всех трех сравниваемых группах.
Среди мужчин из бесплодных пар статистически значимо чаще регистрируются
гетерозиготные носители полиморфизма -592 С-A гена IL-10 (OR = 2,67, P 95% CI 1,116,41). В то же время среди мужчин не выявлено ни одного случая гомозиготного
состояния по полиморфизму -592АА гена IL-10.
Cреди мужчин и женщин из бесплодных пар полиморфный вариант гена фактора
некроза опухоли в гетерозиготном состоянии зарегистрирован в 25 % случаев (в контроле
– 40%). Одновременно с этим в бесплодных парах увеличена доля гомозигот по аллели 308G гена TNF. При объединении группы мужчин и женщин из бесплодных пар выявлены
статистически значимые отличия в распределении частот генотипов по полиморфизму 308G-A гена TNF по сравнению с контролем (χ2 = 6,55 при Р = 0,04) и аллелей (χ2 = 5,88
при Р = 0,02). Больший вклад в данные различия вносят особенности генотипов мужчин из
бесплодных пар. Среди мужчин из бесплодных пар частота аллели -308А гена фактора
некроза опухоли более чем в 2 раза ниже по сравнению с контролем.
2.2. Описание новизны научных результатов.
Впервые получены данные о частоте полиморфных вариантов генов цитокинов в
клетках децидуальной и хорионической тканях при двух различных патологиях первого
триместра беременности – спонтанном аборте и неразвивающейся беременности.
Установлено, что вклад исследуемых полиморфизмов генов цитокинов в увеличение
риска спонтанного прерывания беременности и остановку развития зародыша не
одинаков. Впервые показано, что случаи спонтанного аборта характеризуются снижением
доли образцов, в которых и в децидуальной и в хорионической тканях выявлен
полиморфный вариант гена IL-1β. Если в контрольной группе 58% парных образцов
тканей являются гетерозиготами по полиморфизму -31С-Т гена IL-1β, то в группе со
спонтанным абортом данный показатель составил 7,1% (OR = 0.056 95% CI 0.006-0.52
P=0.0036).
Установлено, что риск развития такого патологического состояния как
неразвивающаяся беременность повышается в случае гомозиготного состояния по аллели
-174G гена IL-6 в клетках хорионической ткани (OR = 18 (3.2 – 100.9). Частота аллели 174C в данной группе в 2,8 раз меньше по сравнению с контролем.
Впервые показано, что в бесплодных супружеских парах более чем в 40% случаев
как мужчина, так и женщина имеют в своем генотипе полиморфные варианты по крайней
мере двух генов цитокинов – IL-6 с IL-10 или IL-1β. При обоих вариантах генотипов
возникает ситуация повышенной продукции провоспалительных цитокинов или
нарушение баланса между уровнем про- и противовоспалительных цитокинов, что может
обуславливать нарушение ранних этапов эмбрионального развития человека.
2.3.Сопоставление с результатами аналогичных работ мирового уровня.
Подавляющая часть работ по исследованию генетических причин невынашивания
беременности и бесплодия направлена на изучение роли полиморфизма генов фолатного
цикла, факторов свертывающей системы крови и системы детоксикации ксенобиотиков
(Rey et al., 2003; Ruzzi et al., 2005; Goodman et al., 2006; Sood, 2009; Aagaard-Tillery et al.,
2010; Slezak et al., 2011; Nair et al., 2012; Wu et al., 2012). В то же время исследования
генов, контролирующих
межклеточные взаимодействия, иммунные реакции
немногочисленны и противоречивы. Накопленные в настоящий момент данные о роли
цитокинов при нарушении репродуктивной функции человека, в основном касаются их
уровня в периферической крови, что лишь косвенно отражает их содержание в тканяхмишенях. Большинство работ по изучению регуляторных молекул при развитии
патологического процесса направлены на изучение отдельных цитокинов. В
действительности в ответ на активационный сигнал происходит синтез клетками
одновременно нескольких цитокинов, участвующих в формировании цитокиновой сети.
Биологические эффекты в тканях и на уровне организма зависят от присутствия и
концентрации многих цитокинов с синергичным, аддитивным или противоположным
действием.
В данном исследовании проведен анализ полиморфных вариантов генов цитокинов
непосредственно в тканях, задействованных в ранних этапах эмбриогенеза человека, что
позволяет определить индивидуальный комплекс аллельных вариантов генов цитокинов и
возможный
характер ответной
клеточной
реакции, ее
интенсивность
и
продолжительность. Особое значение имеет выявление значимого сочетания
полиморфных вариантов генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов,
поскольку вероятнее всего наблюдается аддитивный эффект данных вариантов генов.
Результаты данного проекта соответствуют аналогичным работам мирового уровня.
3. Назначение и область применения результатов проекта
3.1. Описание областей применения полученных результатов.
Результаты научно-исследовательской работы могут быть использованы всеми
научно-исследовательскими учреждениями в области биологии и генетики, а также
широким кругом учреждений здравоохранения и НИИ медицинского профиля, центров
экстракорпорального оплодотворения, медико-генетическими консультациями.
Результаты НИР могут служить теоретической основой для разработки
диагностических тестов и досимптоматической диагностики возможного развития
бесплодия как мультифакторного состояния.
Результаты НИР используются в образовательном процессе на факультете
биологических наук Южного федерального университета. В частности, при чтении
специальных курсов «Генетика репродукции», «Медико-генетическое консультирование»
для студентов, специализирующихся на кафедре генетики. Методики исследования,
применяемые при выполнении НИР, используются студентами при выполнении
дипломных работ и магистерских диссертаций.
4. Перспективы развития исследований
1) Участие в ФЦП способствовало формированию новых и укреплению
существующих
исследовательских
партнерств,
в
частности
с
Ростовским
государственным медицинским университетом, Научно-исследовательским институтом
акушерства и педиатрии г. Ростова-на-Дону, Перинатальным центром Ростовской
области.
2) Коллектив исполнителей данного проекта в настоящее время участвует в
следующих проектах по аналогичной тематике:
«Молекулярно-генетический анализ генов системы репарации и контроля
клеточного цикла при невынашивании беременности» (РФФИ).
«Разработка системы скрининга нарушений репродуктивного здоровья школьников
в околопубертатный период на основе геномных и постгеномных маркеров»
(Минобрнауки).
«Исследование прогностических геномных и постгеномных маркеров эмбриогенеза
человека» (Минобрнауки).
В 2013 году коллективом исполнителей проекта планируется выполнение
следующих проектов: «Исследование роли уровня активности генов цитокинов в ответной
реакции клеток на действие окислительного стресса», «Комплексный анализ белков
межклеточной сигнализации и их генов при различных вариантах течения беременности».
3) Планируется проведение обмена опытом и совместных исследований в области
генетики и эпигенетики ранних этапов эмбрионального развития млекопитающих с
коллегами из университета Земли Саар (Саарбрюкен, Германия), в частности с кафедрой
генетики (эпигенетики) профессора Йорна Вальтера (Jorn Walter).
5.
Опыт закрепления молодых исследователей – участников проекта
(этапа проекта) в области науки, образования и высоких технологий
В ходе реализации первого этапа проекта участвовали:
Бурьянова Дарья Петровна, 13.11.1991 года рождения входит в состав научного
коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным
федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения №
14.А18.21.0199.
Золотухин Петр Владимирович, 12.06.1988 года рождения входит в состав
научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным
федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения №
14.А18.21.0199.
Коваленко Константин Алексеевич, 24.03.1983 года рождения входит в состав
научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным
федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения №
14.А18.21.0199.
Куцын Ксения Андреевна, 29.05.1991 года рождения зачислена в магистратуру на
кафедру генетики факультета биологических наук, входит в состав научного коллектива,
созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным федеральным
университетом о выполнении работ в рамках Соглашения № 14.А18.21.0199.
Лаптина Татьяна Алексеевна, 06.08.1990 года рождения зачислена в магистратуру
на кафедру генетики факультета биологических наук, входит в состав научного
коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным
федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения №
14.А18.21.0199.
Майборода Екатерина Александровна, 29.08.1984 года рождения входит в состав
научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным
федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения №
14.А18.21.0199.
Миктадова Александра Валентиновна, 24.12.1987 года рождения входит в состав
научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным
федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения №
14.А18.21.0199.
Шерчкова Татьяна Александровна, 07.10.1992 года рождения входит в состав
научного коллектива, созданного для выполнения проекта. Заключен договор с Южным
федеральным университетом о выполнении работ в рамках Соглашения №
14.А18.21.0199.
Руководитель организации - Получателя гранта
Проректор по развитию магистратуры и
послевузовского профессионального образования
Южного федерального университета
Сероштан М.В.
Руководитель Проекта
Машкина Е.В.