Автоматическое моделирование пространственной структуры

2014
Автоматическое
моделирование
пространственной структуры
антител и их комплексов с
лигандом
Выполнил ученик 10Н класса Рустам Усманов
Научные руководители:
Олег Владимирович Колясников
Владимир Константинович Аржаник
СУНЦ МГУ
01.01.2014
Оглавление
Цель исследования
3 стр.
Задачи исследования
3 стр.
Введение
3 стр.
Литобзор:
- Применение
3 стр.
- Строение
3 стр.
- Получение структур антител
5 стр.
Материалы и методы
6 стр.
Результаты и обсуждение
6 стр.
Выводы
12 стр.
Литература
12 стр.
2
Цель исследования
Смоделировать антитела, специфичные к гербициду 2,4 D и предсказать
связывание с помощью молекулярного моделирования комплекса антиген-антитело.
Задачи исследования
Смоделировать третичную структуру по известной первичной. Описать их сайты
связывания, а также предсказать связывание лиганда гербицида 2,4-D. Проверить свои
предположения, смоделировав структуру комплекса с лигандом.
Введение
Антитела (иммуноглобулины, Ig) — белки, присутствующие в крови и тканевой
жидкости в виде растворимых молекул, и обладающих способностью очень избирательно
связываться с антигенами. Антитела используются иммунной системой для
идентификации и нейтрализации чужеродных объектов — например, бактерий и вирусов.
Антитела активно применяются человеком во многих практических приложениях. На
данный момент хорошо изучены генетика образования антител, их первичная, вторичная,
третичная и четвертичная структуры, для многих антигенов объяснен механизм
связывания. Так как традиционные методы определения пространственной структуры
время- и ресурсоемки, то сейчас развиваются методы моделирования пространственной
структуры антител, и, в частности, автоматические методы моделирования. Нашей
задачей было применить автоматические методы моделирования для получения
пространственной структуры панели антител к определенному антителу, и их комплексов
с антигеном.
Литературный обзор
Применение
Антитела применяются в разных областях науки – от проверки продуктов питания
на гербициды до биоинженерии и микробиологии. Но все же главной отраслью их
применения остается медицина. В этом случае их называют терапевтическими антителами
Терапевтические антитела - род биофармацевтических препаратов, которые нашли
применение в различных областях медицины: от онкологии до лечения иммунных и
воспалительных заболеваний. (Успешное развитие новых терапевтических антител
требует понимания механизмов действия содержащих их лекарственных препаратов на
организм.) Зная точную структуру специфических антител, можно разработать новые
подходы к избавлению людей от этих недугов (взаимодействия антиген-антитело).
Строение
Антитела имеют характерную для белков структуру. Их первичная структура
представлена последовательностью аминокислот (обычно 450-550), а вторичная- β –
3
слоями (их направление указано стрелочками) и α-спиралями. Четвертичная структура
напоминает букву Y.
Антитела состоят из двух лёгких цепей и двух тяжелых цепей.
Антитела распознают антигены, связываясь с определённым эпитопом —
характерным фрагментом поверхности или линейной аминокислотной цепи антигена.
1.
Fab- участок
2.
Fc-участок
3.
Тяжелая цепь (состоит из VH, CH1, шарнирного участка, CH2 и CH3 участков)
4.
Легкая цепь (состоит из VL, CL участков)
5.
Место крепления антигена
6.
Шарнирный участок
Некоторые иммуноглобулиновые домены состоят из двух тяжелых цепей (красная
и синяя) и двух легких цепей (зеленая и желтая) антитела. Иммуноглобулиновые домены
состоят из от 7 (для константных доменов) и 9 (для вариабельных доменов) β-стрэндов.
Переменная часть антитела являются его V-регионом, а постоянная часть его Срегионом.
Некоторые части антитела имеют одни и те же функции. N-концевая часть
антитела, например, содержит сайты, которые могут связывать два антигена. Эта область
антитела называется Fab (fragment, antigen binding) region (фрагмент, связывающий
антиген). Он состоит из одного постоянного и одного вариабельного домена от,
соответственно, тяжелой и легкой цепи антитела.
С-концевая часть Fab играет большую роль и в регуляции активности иммунных
клеток. За это отвечает область под названием Fc (кристаллизующийся фрагмент). Она
состоит из двух тяжелых цепей, образующих два или три (в зависимости от класса
антитела) константных домена. Таким образом, область Fc гарантирует, что каждое
антитело генерирует соответствующий иммунный ответ на данный антиген, путем
связывания с конкретным классом Fc рецепторов. Делая это, он является посредником
различных физиологических эффектов, включая опознавание опсонированных
(подлежащих уничтожению, лизису) частиц, лизис и очищение от токсинов жировых
клеток, базофилов и эозинофилов.
Вариабельный домен (также упоминается как область Fv) является наиболее
важным регионом для связывания с антигенами. В частности, вариабельные петли , три на
каркасном участке легкой (VL) и три – на участке тяжелой ( VH ) цепи ответственны за
связывание с антигеном. Эти петли называются областями определяющими
комплементарность (CDR). Стоит заметить, что такое огромное разнообразие антител
объясняется лишь различностью их антиген-связывающего участка, называемого
4
эпитопом. Основные его части называются CDR – Complementary Determining Regions).
Участки тяжелых и легких цепей, содержащих CDR, называют вариабельными.
Получение структур антител
Экспериментальные методы получения структуры антител, такие как
рентгеновская кристаллография и ядерный магнитный резонанс, являются энергоемкими,
трудоемкими и дорогостоящими. Полученные структуры заносятся в базу данных белков
в специальном формате PDB (Protein DataBase) с координатами каждого атома молекулы.
В то время как вычислительный метод предсказания структуры антител (т.е. их
компьютерное моделирование) обеспечивает быстрый и недорогой путь для их получения
структур. Хотел бы также подчеркнуть, что структуры некоторых антител не могут быть
получены иным образом. Наиболее распространенный метод – моделирование по
гомологии (автоматическое моделирование).
Одной из программ для работы с такими файлами является PYMOL, написанная на
языке Python. Используется трехмерная декартова система координат, в которой
положение каждого атома определяется его X, Y, Z координатами.
Остановимся подробнее на одном из этих серверов:
В Rosetta Antibody сервер (http://antibody.graylab.jhu.edu) прогнозирует
пространственную структуру первичной последовательности антител в CDR, учитывая
аминокислотные последовательности, соответствующие легким и тяжелым цепям.
Сначала, сервер определяет и отображает наиболее похожие на специальный шаблон
структуры (в отношении CDR-петель). Впоследствии наиболее схожие из них собираются
в оптимизированную «грубую» модель, и сервер отображает эскиз структуры антитела и
файл содержащий координаты трехмерной модели в пространстве.
Rosetta Antibody генерирует 2000 независимых структур, и сервер отображает
изображения, файлы координат, и подробную скоринговую информацию для 10 самых
правдоподобных моделей. Они позволяют пользователям использовать рациональное
суждение в выборе оптимальной для них модели или использовать комплект как ансамбль
для дальнейших исследований, таких, как докинг.
Следует отметить, что существующие серверные приложения не обеспечивают
высокого разрешения уточнения структуры антитела и не учитывает термодинамических
характеристик в процессе моделирования.
Итак, для пользователя работа описанных приложений выглядит так: вы вводите в
специальную форму только аминокислотные последовательности легких и тяжелых
цепей, имя антитела, имя пользователя, а на выходе получаете файл, содержащий:
1) Дату и время подачи документов, оформления и завершения.
2) Диаграммы показывающие границы CDR петель.
3) Таблицу, показывающую последовательности, наиболее гомологичные шаблону (VHVL структур, CDR, L1, L2, L3, H1, H2 и H3).
5
4) Пространственную структуру(ы), приписываемую данному антителу.
Rosetta также разработала новый алгоритм «KIC», позволяющий предсказывать
структуры антител на порядок аккуратнее (по слепому сравнению с эталоном кристаллографической структурой) чем это делает устоявшийся алгоритм ROSIE.
Материалы и методы
Нами был использован сайт http://rosettadock.graylab.jhu.edu/ для моделирования
пространственной модели структуры обоих вариабельных доменов 5 антител по
гомологии. При этом исходным материалом для меня служили последовательности
аминокислот первичной структуры из статьи Франека [1].
Результаты и обсуждение
Для визуализации полученных моделей я использовал программу PyMol 1.5.0.3. на
языке программирования Python.2.7.6. Были обнаружены сайты связывания, образованные
всегда CDR-петлями тяжелых и легких цепей антитела.
Для удобства, на иллюстрациях атомы углерода тяжелой цепи выделены зеленым,
легкой – голубым, кислорода и азота обеих цепей – синим и красным, а атомы сайта
связывания – фиолетовым. Аминокислоты боковой цепи CDR петлей, непосредственно
учавствующие в связывании лиганда обозначены палочками.
Ниже приведены иллюстрации сайтов связывания 5 антител, выполненные в
PyMol:
1. E2/G2
Аминокислоты, Местоположени
формирующие
я в антителе
сайт
связывания
Tyr H 95
CDR-H3
Tyr L 91
CDR-L3
Характеристика сайта связывания
Сайт связывания представлен практически плоской
поверхностью;
сформирован
совокупностью
6
Tyr L 96
CDR-L3
небольших
участков.
гидрофобных
и
гидрофильных
2. E2/B5
Аминокислоты,
формирующие
сайт
связывания
Val H 33
Tyr H 52
Tyr H 95
Tyr H 98
Ser L 32
His L 33
Tyr L 91
Tyr L 96
3. E4/C2
Местоположения
антителе
CDR-Н1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H3
CDR-L1
CDR-L1
CDR-L3
CDR-L3
в Характеристика сайта связывания
На поверхности есть большие гидрофобные
участки, однако, форма сайта, в целом, плоская
7
Аминокислоты,
формирующие
сайт
связывания
Phe H 32
Ile H 33
Tyr H 95
Gly H 96
Tyr H 97
Ser L 32
His L 43
Tyr L 91
Tyr L 94
Phe L 96
4. B5/C3
Аминокислоты,
формирующие
сайт
связывания
Phe H 32
Ile H 33
Tyr H 95
Tyr H 97
His L 34
Tyr L 91
Tyr L 94
Phe L 96
Местоположения
антителе
в Характеристика сайта связывания
CDR-H1
Полость
образована
гидрофобными
участками Tyr, Val, Leu, Ile, Ser,
CDR-H1
формирующие
гидрофобное
ядро.
CDR-H3
Небольшая часть полости образована
CDR-H3
гидрофильным
азотом
боковой
цепи
CDR-H3
триптофана H47. Глутаминовая кислота и
CDR-L1
Каркасные участки вар. гидрофильные участки боковых цепей
(тирозины
L96,
L91)
формирует
домена
гидрофильный
вход
в
полость.
CDR-L3
CDR-L3
CDR-L3
Местоположения Характеристика сайта связывания
в антителе
CDR-H1
CDR-H1
CDR-H3
CDR-H3
CDR-L1
CDR-L3
CDR-L3
CDR-L3
С виду сайт связывания плоский, но оказалось, что
внутри имеется полость. За счет теплового
движения боковой цепи аминокислоты могут
менять свое положение, освобождая путь к внутрь
полости, однако, получившийся сайт связывания
говорит о некоторых неточностях в моделировании
комплекса с лигандом. Полость сформирована
большими гидрофобными участками аминокислот
Tyr, Phe, His. Также имеется 2 участка,
сформированных положительным электрическим
зарядом аргинина и отрицательным зарядом
глютаминовой кислоты.
5. B7
8
Аминокислоты,
формирующие
сайт
связывания
Tyr H 32
Val H 33
Ser H 35
Val H 37
Trp H 47
Glu H 50
Tyr H 52
Tyr H 95
Tyr H 97
His L 34
Tyr L 49
Leu L 89
Tyr L 91
Местоположения
антителе
в Характеристика сайта связывания
CDR-H1
Полость
образована
гидрофобными
участками Tyr, Val, Leu, формирующие
CDR-H1
гидрофобное ядро. Небольшая часть
CDR-H1
полости
образована
гидрофильной
CDR-H1
боковой
цепью
серина
H
35 и азотом
Каркасные участки вар.
боковой цепи триптофана H 47.
домена
Глутаминовая кислота и гидрофильные
CDR-H2
участки боковых цепей: тирозин L 96, H52
CDR-H3
и кислород тирозина H95 формирует
CDR-H3
гидрофильный вход в полость.
CDR-H3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3
CDR-L3
9
Tyr L 96
Phe L 98
У антител E2/B5,
сайт связывания
внутри антитела.
CDR-L3
CDR-L3
E4/C2, B5/C3 он имеет более или менее плоскую форму, а у E2/G2 и B7
представлен оформленной полостью. У B5/C3 обнаружена полость
Затем, передо мной встала задача сделать докинг.
В качестве лиганда (антигена) я использовал 2,4-D Гербицид. Он применяется в сельском
хозяйстве для борьбы с двудольными сорняками. Для моделирования пространственной
структуры этого гербицида использовалась программа ACD/ChemSketch. Для докинга я
использовал программу AutoDockTools-1.5.6 Для всех антител я использовал следующие
параметры: Разрешение сетки для расчета энергии связывания (Grid)-220; количество
генерируемых структур-17. Программа генерировала 17 структур, распределила их по
кластерам (группам). В дальнейшем, я буду рассматривать и анализировать только
представительные структуры из кластеров.
Для самого докинга использовался генетический алгоритм, основанный на эволюционной
модели Ламарка. (Lamacian genetic algorithm)
Генетиический алгориитм – это алгоритм поиска, работающий по принципу случайного
подбора и комбинирования искомых параметров, подобно тому как это происходит в
природе. Отличительной особенностью генетического алгоритма является акцент на
использование. Особо важен в алгоритме оператор « скрещивания», который производит
рекомбинирует возможные решения задачи, таким образом, повторяя скрещивание в
природе.
Результаты докинга B5/C3 и B7
B5/C3
Программа разбила 17 структур на 4 кластера. Представительные структуры из каждого
кластера:15,7,13,8. Они обладают наименьшей энергией в своей группе. При ближайшем
рассмотрении, оказалось, что лиганд связывается именно в сайте связывания только в
четвертом кластере.
10
На иллюстрациях приведена визуализация антитела B5/C3, связанного с гербицидом из
четвертого представительного кластера. Наши предположения подтвердились: антиген не
может быть связан внутри полости.
B7
Программа разбила 17 структур на 2 кластера с минимальными энергиями -5.9 и -5.4.
Представительные структуры из каждого кластера:17,11. На иллюстрациях – антитело B7
с гербицидом в двух положениях. Наши предположения подтвердились: антиген
связывается в полости связывания.
11
Выводы
1. Мы смоделировали 5 структур антител
2. Мы описали сайты связывания для каждой из структур
3. Мы провели автоматическое моделирование комплекса с лигандом для одной из
структур
Литература
1. Brichta J., Fránek M. Identification of monoclonal antibodies against 2, 4-D herbicide by
ELISA and DNA sequencing //Journal of agricultural and food chemistry. – 2003. – Т.
51. – №. 21. – С. 6091-6097
2. Antibody. Wikipedia, the free encyclopedia. URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Antibody
(Дата посещения 18.4.14)
3. Using AutoDock 4 with AutoDockTools. URL :http://autodock.scripps.edu/faqshelp/tutorial/using-autodock-4-with-autodocktools/2012_ADTtut.pdf (Дата посещения
18.4.14)
12
4. Sivasubramanian A. et al. Toward high‐resolution homology modeling of antibody Fv
regions and application to antibody–antigen docking //Proteins: Structure, Function, and
Bioinformatics. – 2009. – Т. 74. – №. 2. – С. 497-514.
5. Lyskov S. et al. Serverification of Molecular Modeling Applications: The Rosetta Online
Server That Includes Everyone (ROSIE) //PloS one. – 2013. – Т. 8. – №. 5. – С. e63906.
13