Влияние концентрации солей в бескислородной добавке на

Известия Тульского государственного университета
Естественные науки. 2012. Вып. 1. С. 229–235
Химия
УДК 577.1.087+577.3
Влияние концентрации солей
в бескислородной добавке
на количественные характеристики
«эффекта быстрого потребления
кислорода»
М. Б. Белякова, Л. Я. Дьячкова, Н. В. Костюк, Д. В. Лещенко,
М. В. Миняев
Аннотация. Моделировалось явление «эффекта быстрого
потребления кислорода» путем внесения в насыщенную кислородом
при 37◦ С среду инкубации бескислородных добавок с различным
содержанием солей. Показано, что при более низком, чем в среде,
содержании солей в добавке величина эффекта заметно возрастает,
а при более высоком — снижается.
Ключевые слова: кислородный датчик, высаливающий эффект,
эффект быстрого потребления кислорода, бескислородная добавка.
Введение
Несмотря на то, что кислородные датчики различных конструкций
широко используются в биохимических исследованиях, вопрос о механизме
хорошо известного «эффекта быстрого потребления кислорода» (ЭБПК),
который заключается в резком снижении показаний измерительного прибора
в момент внесения митохондриальной суспензии в инкубационную среду [1,
2], до сих пор окончательно не решен [1–6]. Исследования, ранее проведенные
авторами настоящей публикации, показали, что наиболее вероятными
причинами его возникновения являются:
1) снижение концентрации кислорода в среде инкубации в результате ее
разведения, например, митохондриальной суспензией, содержание кислорода
в которой существенно снижено за счет эндогенного дыхания [7];
2) снижение парциального давления кислорода в среде инкубации за
счет уменьшения ее температуры при добавлении охлажденной суспензии
митохондрий [8].
Тем не менее существует еще один фактор, воздействие которого
также может привести к возникновению эффекта, подобного ЭБПК. Это
230
М.Б. Белякова, Л.Я. Дьячкова, Н.В. Костюк и др.
снижение парциального давления кислорода в результате добавления к
среде инкубации раствора, концентрация солей в котором ниже, чем в среде.
Поэтому целью данной работы явилось изучение влияния концентрации
солей в бескислородной добавке на количественные характеристики ЭБПК.
1. Материалы и методы
Использовалась термостатированная при 37◦ С (±0, 1◦ С) измерительная
ячейка емкостью 4 мл, снабженная серебряно-цинковым закрытым
полярографическим кислородным датчиком [9]. Показания датчика
снимались при помощи оксиметра N5221 (Польша) и фиксировались
самопишущим регистратором ЭПП-09 м3.
Чтобы исключить возникновение осмотических эффектов на мембране
кислородного датчика и облегчить вычисления, вместо реальной
среды инкубации использовалась простая модель — раствор KCl с
концентрацией 60 г/л, который по составу и осмотическим свойствам не
отличался от электролита датчика и позволял на основании справочных
данных вычислить исходную концентрацию кислорода в среде. Раствор,
используемый в качестве инкубационной среды, насыщался кислородом
путем непрерывной продувки атмосферным воздухом, обогащенным
водяными парами при 37◦ С в темостатированном сосуде. Концентрация
О2 в среде при температуре 37◦ С и атмосферном давлении 760 мм рт.
ст. составляла 1, 54 · 10−7 моль/мл. В качестве бескислородных добавок
служили термостатируемые при 37◦ С растворы KCl с концентрациями от
0, 30, 60 и 120 г/л, кислород из которых удалялся путем непрерывной (на
протяжении всего эксперимента) продувки азотом.
Схема эксперимента: в измерительную ячейку приливали 3,5 мл
насыщенной кислородом при 37◦ С инкубационной среды и выжидали 5–15
мин до стабилизации показаний оксиметра. Затем включали регистратор
и вносили в среду бескислородную добавку при помощи микродозатора.
В результате получали кривую, описывающую снижение парциального
давления кислорода в среде в ответ на внесение добавки. Величину ЭБПК
(∆ N ) определяли по точке минимума Pmin на регистрационной кривой:
ΛN =
5, 373 · 10−7 · PA · (100 − Pmin )
,
760 · 100
где 5, 373 · 10−7 (моль) — содержание О2 в 3,5 мл среды; Pmin (%) — показание
оксиметра в точке минимума; 760 (мм рт. ст.) — стандартное атмосферное
давление; PA (мм рт. ст.) — атмосферное давление в момент измерения.
На всех этапах работы использовались объемы добавок 100, 200, 300
и 400 мкл. С каждым объемом производилось по 10 измерений. Между
измерениями ячейку заполняли свежей порцией среды, насыщенной
атмосферным кислородом при 37◦ С, и оставляли на 15–20 мин для
восстановления исходных показаний. Статистическая обработка результатов
Влияние концентрации солей в бескислородной добавке
231
заключалась в вычислении среднего арифметического, стандартной ошибки
среднего (±m) и коэффициента вариации (CV ).
2. Результаты и их обсуждение
Средние значения результатов обработки экспериментально полученных
значений ЭБПК для различных концентраций KCl в бескислородной добавке
представлены в таблице 1.
Таблица 1
Зависимость величины ЭБПК от объема бескислородной добавки и
содержания в ней KCl (n = 10)
[KCl]
(г/л)
120
60
30
0
V добавки
(мкл)
100
200
300
400
100
200
300
400
100
200
300
400
100
200
300
400
ЭБПК
(моль·10−8 )
0,72
1,74
2,68
3,59
1,24
2,63
3,63
4,89
1,34
2,74
3,96
5,24
1,37
2,91
4,23
5,43
m
±0, 03
±0, 07
±0, 03
±0, 03
±0, 03
±0, 04
±0, 06
±0, 03
±0, 02
±0, 02
±0, 01
±0, 05
±0, 04
±0, 04
±0, 04
±0, 01
Cv
(%)
13,10
12,84
3,75
2,39
7,51
4,05
5,12
2,03
4,12
2,25
1,09
2,97
7,60
4,64
3,08
0,51
Как видно из таблицы, величина ЭБПК проявляла отчетливую
зависимость от объема бескислородной добавки, тогда как зависимость
от содержания в добавке KCl (высаливающий эффект) оказалась менее
выраженной. Тем не менее ЭБПК всегда имел положительное значение,
откуда следует, что основным фактором, вызывающим ЭБПК, в данном
случае являлся эффект разбавления среды инкубации бескислородной
добавкой [7], а высаливающий эффект лишь оказывал определенное влияние
на степень его проявления.
Для того чтобы выявить вклад высаливающего эффекта в суммарную
величину ЭБПК, он вычислялся как отклонение величины ЭБПК от
значений, полученных при использовании изоосмотических добавок (60 г/л),
не изменявших высаливающих свойств среды, что позволило устранить
232
М.Б. Белякова, Л.Я. Дьячкова, Н.В. Костюк и др.
влияние эффекта разведения среды бескислородной добавкой. Результаты
представлены в таблице 2.
Таблица 2
Средние отклонения величины ЭБПК (моль·10−8 ) от значений,
полученных при использовании изоосмотических добавок
[KCl] (г/л)
120
60
30
0
Объем добавки (мкл)
100
200
300
0,52
0,89
0,95
0
0
0
−0, 10 −0, 11 −0, 33
−0, 13 −0, 28 −0, 60
400
1,03
0
−0, 62
−0, 81
Как видно из таблицы, отклонение величины ЭБПК от значений,
полученных при использовании изоосмотических добавок, может быть
как положительным (при [KCl] менее 60 г/л), так и отрицательным
(при [KCl] более 60 г/л), то есть имитировать как прирост, так и
убыль кислорода в среде. Таким образом, высаливающий эффект не
только оказывает влияние на количественные характеристики ЭБПК,
вызванного другими факторами, но и вполне может самостоятельно
вызывать как ЭБПК, так и противоположный ему эффект. Причина
наблюдаемого явления заключается в том, что разбавление инкубационной
среды раствором, имеющим более низкую концентрацию солей, ведет к
повышению растворимости кислорода в полученной смеси и, как следствие,
к снижению его парциального давления, что регистрируется измерительной
аппаратурой как потребление кислорода. Механизм противоположного
эффекта, вызываемого добавками с более высокой концентрацией солей,
аналогичен.
Величина высаливающего эффекта оказалась вполне ощутимой даже
по сравнению с исходным содержанием кислорода в среде инкубации:
при объеме добавки, составляющим 10% от объема реакционной смеси,
высаливающий эффект, в зависимости от содержания солей в добавке,
колебался в пределах 1–2% от исходного содержания кислорода в среде
инкубации. Это существенно ниже ЭБПК, вызываемого разбавлением
среды изоосмотической бескислородной добавкой (более 9% от исходного
содержания кислорода), тем не менее ошибки, связанные с изменением
высаливающей способности среды, могут существенно исказить результаты
измерения если объем добавки превышает 10% от объема среды [10] или
если потребление кислорода объектом исследования сравнительно невелико
[11].
Эксперименты, связанные с изучением метаболического потребления
кислорода биологическими объектами, обычно сопровождается последовательным добавлением к среде инкубации нескольких реагентов (субстратов
Влияние концентрации солей в бескислородной добавке
233
окисления, ингибиторов или активаторов дыхания, АДФ и др.). Объемы
этих добавок, а также содержание в них солей и других высаливающих
веществ могут существенно различаться. Поэтому высокой точности
измерения потребления кислорода можно достичь только путем учета
суммарного влияния подобных добавок на парциальное давление кислорода
в среде инкубации. В связи с этим была предпринята попытка выявления
зависимости величины высаливающего эффекта от концентрации солей
в инкубационной среде, устанавливающейся после внесения добавки. Эта
зависимость графически представлена на рисунке.
Зависимость величины высаливающего эффекта от концентрации солей в
среде инкубации, устанавливающейся после внесения добавок разного
объема и с различной концентрацией солей
Как следует из рисунка, величина высаливающего эффекта в
исследованном диапазоне концентраций находится практически в
линейной зависимости от концентрации солей в реакционной смеси,
устанавливающейся после внесения добавки в инкубационную среду, что
позволяет использовать ее для корректировки результатов измерения
потребления кислорода биологическими объектами.
Выводы
1. Внесение в инкубационную среду бескислородных добавок,
концентрация солей в которых ниже, чем в среде, ведет к заметному
усилению ЭБПК, вызванного эффектом разбавления среды бескислородной
добавкой.
2. Внесение в инкубационную среду бескислородных добавок,
концентрация солей в которых выше, чем в среде, ведет к столь же
заметному ослаблению ЭБПК, вызванного эффектом разбавления.
3. Величина высаливающего эффекта в исследованном диапазоне
концентраций находится практически в линейной зависимости от
234
М.Б. Белякова, Л.Я. Дьячкова, Н.В. Костюк и др.
концентрации солей, которая устанавливается в инкубационной среде после
внесения добавки.
Список литературы
1. Chance B., Williams G.R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization // J. of Biological Chemistry. 1955. V.217. №1. P.383–393.
2. Котова Е.И., Ротенберг Ю.С. Исследование быстрого потребления О2
митохондриями при введении их в аэробную среду инкубации // Биохимия.
1975. Т.20. Вып.4. С.746–747.
3. Панченко Л.Ф., Шпаков А.А. Ферментная, электронномикроскопическая и
полярографическая характеристики изолированных митохондрий мозга крыс.
I. Новый метод выделения // Цитология. 1973. Т.15. Вып.12. С.1481–1486.
4. Шпаков А.А., Панченко Л.Ф. О природе эффекта «быстрого потребления»
кислорода при внесении гомогената тканей или суспензии митохондрий в
полярографическую ячейку // Биофизика. 1975. Т.20. Вып.3. С.467–471.
5. Шпаков А.А., Косарев А.В. О механизме окислительного фосфорилирования.
III. Зависимость функциональных показателей от состава среды инкубации
митохондрий // Биофизика. 1977. Т.22. Вып.4. С.663–667.
6. Шпаков А.А., Панченко Л.Ф. Ферментная, электронномикроскопическая
и полярографическая характеристики изолированных митохондрий мозга
крыс. II. Влияние состава сред выделения // Цитология. 1974. Т.16. Вып.9.
C.1124–1129.
7. Разбавление среды инкубации бескислородной добавкой как вероятная причина
«эффекта быстрого потребления кислорода» / М.В. Белякова [и др.] // Вестн.
ТвГУ. Сер. Биология и экология. 2006. Вып.22. №5. С.57–60.
8. Миняев М.В., Бабалова Е.Б., Ворончихина Л.И. Влияние температуры
бескислородной добавки на количественные характеристики эффекта быстрого
потребления кислорода // Вестн. ТвГУ. Сер. Биология и экология. 2007.
Вып.49. №21. С.75–77.
9. Миняев М.В. Гальванический кислородный датчик с пониженной собственной
кислородной емкостью // Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии.
Тверь: ТвГУ, 2001. С.154–161.
10. Barrientos A. In vivo and in organello assessment of OXPHOS activities // Methods.
2002. V.26. P.307–316.
11. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro /
C. Diepart [et. al.] // Anal Biochem, 2010. V.396. №2. P.250–256.
Белякова Майя Борисовна (mayabe@yandex.ru), к.б.н., старший
преподаватель, кафедра химии и биохимии, Тверская государственная
медицинская академия.
Дьячкова Людмила Яковлевна (biohimia.tgma@yandex.ru), к.х.н., доцент,
кафедра химии и биохимии, Тверская государственная медицинская
академия.
Влияние концентрации солей в бескислородной добавке
235
Костюк Наталья Валериевна (p001637@mail.ru), к.б.н., доцент, кафедра
биомедицины, Тверской государственный университет.
Лещенко Джулианна Викторовна (dvleshchenko@mail.ru), к.б.н., доцент,
кафедра химии и биохимии, Тверская государственная медицинская
академия.
Миняев Михаил Владимирович (mmb_77@mail.ru), к.б.н., научный
сотрудник, научно-исследовательский центр, Тверская государственная
медицинская академия.
The influence of salt concentration in oxygen-free additive on
quantitative characteristics of «the effect of rapid oxygen
consumption»
M. B. Belyakova, L. Ya. Djachkova, N. V. Kostiuk, J. V. Leshchenko,
M. V. Miniaev
Abstract. «The effect of rapid oxygen consumption» was modeled by oxygenfree additive with various content of salt to oxygen-saturated 37◦ C incubation
medium. It was demonstrated that value of the effect arises significantly when
content of salt in additive lower then in medium, and decreases when higher.
Keywords: oxygen sensor, salting-out effect, effect of rapid oxygen consumption, oxygen-free additive.
Belyakova Maya (mayabe@yandex.ru), candidate of biological sciences, senior
teacher, department of chemistry and biochemistry, Tver State Medical Academy.
Djachkova Liudmila (biohimia.tgma@yandex.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry and biochemistry, Tver State
Medical Academy.
Kostiuk Natalia (p001637@mail.ru), candidate of biological sciences, associate
professor, department of biomedicine, Tver State University.
Leshchenko Julianna (dvleshchenko@mail.ru), candidate of biological sciences, associate professor, department of chemistry and biochemistry, Tver State
Medical Academy.
Miniaev Mihail (mmb_77@mail.ru), candidate of biological sciences, research
assistant, research center, Tver State Medical Academy.
Поступила 14.12.2011