УДК 577.112 ФЕРМЕНТЫ-АНТИОКСИДАНТЫ: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА И РОЛЬ В РЕГУЛИРОВАНИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

УДК 577.112
ФЕРМЕНТЫ-АНТИОКСИДАНТЫ: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА
И РОЛЬ В РЕГУЛИРОВАНИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
Л.Т. Рязанцева
Изложены представления о структурно-функциональных свойствах основных ферментов антиоксидантной
системы: супероксиддисмутазы и каталазы. Анализируются кинетические параметры процессов структурнофункциональных модификаций указанных белков
Ключевые слова: антиоксиданты, супероксиддисмутаза, каталаза, кинетические параметры
Существование живых организмов на
Земле (кроме небольшого числа бактерий –
облигатных анаэробов) невозможно без кислорода, являющегося неотъемлемым компонентом метаболических процессов. Однако при
включении кислорода в процессы жизнедеятельности организма образуются активированные производные молекулярного кислорода –
активные формы кислорода (АФК). АФК инициируют реакции свободнорадикального окисления (в том числе перекисное окисление липидов), приводящие к химической модификации и разрушению биомолекул. В тканях благодаря наличию сложных ферментативных
комплексов со специфическими электронтранспортными простетическими и коферментными группировками процесс восстановления кислорода протекает по многоступенчатому механизму, что сводит к минимуму возможность образования высокореакционных
промежуточных соединений кислорода.
Ферментативные антиоксиданты (АО)
характеризуются высокой специфичностью
действия, а также клеточной и органной локализации, использованием в качестве катализаторов некоторых металов (Cu, Zn, Mn, Fe) (рисунок). Уровень внутриклеточных ферментативных АО находится под генетическим контролем. У животных в условиях гипоксии и
гипероксии, усиливающих образование активных форм кислорода, повышается уровень
внутриклеточных ферментов АО системы, что
связано с механизмами поддержания устойчивости организма к окислительному стрессу
(рисунок).
Супероксиддисмутаза (КФ 1.15.1.11,
СОД) - фермент, катализирующий реакцию
дисмутации супероксидных анион-радикалов с
Рязанцева Лариса Тихоновна – ВГТУ, канд. биол. наук,
доцент, тел. (4732) 521939
образованием пероксида водорода и триплетного кислорода:
.
.
O2 + O2 + 2Н+ → Н2О2 + О2
СОД принадлежит к наиболее интенсивно изучаемым белкам, так как она является
ключевым ферментом, непосредственно обеспечивающим обрыв цепей кислородзависимых
свободнорадикальных реакций в клетках
аэробных организмов [1]. К настоящему времени получены три типа СОД человека, для
функционирования которых необходимо наличие марганца, меди и цинка. Медь-цинковая
форма (Сu,Zn-СОД) содержится в цитозоле и
межмембранном пространстве митохондрий,
Mn-СОД локализована в митохондриях. Экстрацеллюлярная высокомолекулярная форма
СОД, содержащая медь, рассматривается как
третий тип фермента - эСОД.
Молекула Сu,Zn-СОД состоит из двух
идентичных субъединиц с молекулярной массой 16,3 Да, связь между которыми осуществляет дисульфидный мостик. По другим данным, субъединицы объединены через ионы
металлов, причем места связывания металлов
неидентичны.
Химическими
методами,
методами
атомной абсорбционной спектроскопии и ЭПР
показано присутствие в молекуле фермента по
два иона меди и цинка. Установлено, что ионы
меди (Cu2+)в молекуле СОД играют важную
роль при катализе реакции дисмутации, тогда
как цинк имеет отношение к сохранению определенной конформации белка, необходимой
для формирования реактивного медьсвязывающего участка. Ион меди в молекуле СОД
окружен тремя прочно связанными с ним и
одним слабым лигандами, которые являются
имидазольными группами гистидиновых остатков [2]. Пятое место занимает вода, которая
может быть заменена на другие лиганды; расстояние Cu2+-О составляет примерно 0,2 нм.
NADPH(пентозный цикл)
NADP
Объект
фагоцитоза
О2
О2 +Н2О
Н2 О2
Каталаза
МПО
Сl–
Оксидазы
D-аминокислот
ОН·
О2
–·
Меn+ О2
СОД
NADPH оксидаза
Фагоцитирующие лейкоциты
(нейтрофилы)
Плазма
Ткани
Активация
Fe+2 → Fe+3 Пероксидация
фосфолипазы А2
сывороточных
ЦП
Пероксидаза Глюкоза,
липидов
Деполимеризация
мочевая
ПОЛ
ПОЛ
биополимеров
кислота
Н2 О2
(ловушка
OH·
Арахидоновая
Ме(n-1)-хелаты
радикалов)
СОД
кислота
–·
О2
Циклоокси- Липооксигенация
генация
Н2 О2
Меn+ -хелаты
–·
(Трансферрин, церулоплазмин,
О2
–·
хелатные соединения Cu++ и Fe+++ )
–·
О2
О2
Простагландины, тромСОД боксаны
Эритроциты
–·
Каталаза
–
ОСl
ОН·
1
O2
–·
О2
СОД
Н2 О2 → НbFе+2
Меn+-катализ
Глутатион-пероксидаза
ПОЛ
Н2 О2 +О2 О2
→ НbFе+3
OH·
Гемихром
Тельца Гейнца
ПОЛ Каталаза Гидроксиперокси- эйкотетрадазы
еновая
кислота,
лейкотриЛизис
ены
мембран
Пути превращения активизированных метаболитов кислорода в тканях
Ионы меди и цинка связаны через азот
имидазольного кольца гистидина, причем цинк
может оттягивать на себя пару электронов в
ходе одной из стадий ферментативного процесса.
В настоящее время существуют 2 модели функционирования СОД.
1. На основании исследования спектров
ЭПР фермента было разработано представление о двухтактном механизме действия СОД
(“пинг-понг”) [3], заключающемся в последовательном восстановлении и реокислении меди в активном центре фермента:
.
E-Cu2+ + O2 → E-Cu+ + O2,
.
O
2
+ 2H+ → E-Cu2+ + H2O2.
E-Cu +
+
2. Б. С. Маринов с соавторами предложили многоцентровую модель функционирования СОД [4], сочетающую экспериментальные наблюдения и результаты квантовомеханических расчетов. Согласно этой модели,
.
одна молекула субстрата ( O2 ) связывается с
ионом меди в активном центре фермента, а
вторая - взаимодействует с участком на периферии молекулы белка. Неспаренный электрон
из активного центра передается по белку к пе-
.
риферийному O2 , в результате чего в актив-
ном центре образуется молекула кислорода, а
на внешней поверхности фермента - пероксид
водорода.
Функциональные свойства СОД из эритроцитов человека всесторонне изучены [5].
Для нее характерен широкий температурный
оптимум, фермент стабилен при нагревании в
течение 40 мин в температурном интервале 20
÷ 70 °С. Фермент также устойчив к колебаниям значений рН в широком диапазоне, он сохраняет свою активность в интервале рН 5,5 11,5, причем в области рН 8,0 - 9,5 ферментативная активность СОД достигает максимального значения и практически не изменяется.
При концентрации супероксидного анион-радикала 10-10 моль/л фермент в 105 раз ус-
.
коряет спонтанную реакцию дисмутации O2
(k ≈ 2. 109 М-1.с-1).
У человека ген, кодирующий синтез
СОД, локализован в хромосоме 21; выявлены
случаи генетически детерминированного как
снижения, так и повышения содержания СОД
(у людей с трисомией по хромосоме 21). Интересно отметить, что в обоих случаях изменения концентрации фермента являются причиной развития патологических процессов: в
первом - вследствие недостаточности защиты
от активных форм кислорода, во втором - в
результате усиления цитотоксического дейст-
.
вия Н2О2, образующегося при дисмутации O2 .
Рассмотренная Cu, Zn-СОД является
внутриклеточным энзимом и в межклеточных
жидкостях (плазма крови, лимфа, синовиальная жидкость) быстро, в течение 5-10 мин,
разрушается.
В 1982 г Marklund впервые выделил
СОД из плазмы крови человека [6]. По своим
свойствам этот фермент отличается от извест-
ных типов СОД и рассматривается как новый
(третий) тип супероксиддисмутазы - экстрацеллюлярная СОД (эСОД). Высокомолекулярная форма СОД представляет собой тетрамерный Cu,Zn-содержащий гликопротеин с молекулярной массой около 120-150 кДа [7].
В таблице представлен сравнительный
анализ свойств СОД эритроцитов и плазмы,
откуда следует, что СОД плазмы представляет
собой новый тип супероксиддисмутазы.
Таблица
Сравнительный анализ свойств супероксиддисмутазы плазмы и эритроцитов человека
Свойства
Молекулярная масса, кДа
Содержание меди, ммоль/мг белка
Максимум поглощения в видимой
области, нм
Влияние 2,5.10-5 моль/л ацетонциангидрина
Влияние 0,47 моль/л NaF
Влияние азида натрия
ЭПР-спектры
Супероксиддисмутаза
эритроцитов
32,0; 33,6
9,0.10-6
Супероксиддисмутаза
плазмы крови
120; 147
3,14.10-5
675-680
470, 525, 560
Полностью ингибирует
Ингибирует
1мМ - активирует,
10 мМ - ингибирует
g1 = 2,68; g2 = 2,96; g = 3,24 (“тип 1 Сu”)
Не влияет
Активирует
Не влияет
Хроматографическое разделение фермента позволило выделить три его фракции: А,
В и С, отличающихся различным сродством к
гепарину. Фракции А и В фермента, обладающие слабым сродством к гепарину, присутствуют преимущественно в плазме; фракция С (с
высоким сродством к гепарину) находится, в
основном, в сосудистой стенке. Выявлено динамическое равновесие между содержанием
фракции С в плазме и в эндотелии сосудов.
Причем, супероксиддисмутаза С хорошо связывается с гепаринсульфатом гликокаликса
эндотелиоцитов, но не с лейкоцитами и эритроцитами.
При определенных условиях (длительное хранение при t=4-5 °С, тепловое воздействие в диапазоне от 20 до 40 °С, действие
HOCl) наблюдается диссоциация молекулы на
отдельные субъединицы, затем следует агрегация и образование лабильных комплексов,
что сопровождается изменением биологической активности СОД. Вероятно, такого рода
структурные изменения фермента можно рассматривать как механизм адаптации организма
к изменению окружающей среды.
Каталаза (Н2О2:Н2О2-оксидоредуктаза;
КФ 1.11.1.6) - фермент, относящийся к классу
оксидоредуктаз, катализирует гетеролитиче-
Нет ЭПР-сигнала (тип 3 Сu)
ское расщепление О-О-связи в Н2О2 и, таким
образом, является синергистом супероксиддисмутазы в клетке [8]:
Н2О2 + Н2О2 → О2 + Н2О
Каталаза всегда присутствует в системах, где осуществляется транспорт электронов
с участием цитохромов, т.е. там, где образуется токсичный для клетки пероксид водорода.
Она локализована преимущественно в пероксисомах клеток, где ее концентрация достигает
10-6 моль, и в цитоплазме. У человека высокое
содержание каталазы обнаружено в эритроцитах, а также в печени и почках; концентрация
ее в мозге и щитовидной железе мала.
Молекула каталазы представляет собой
тетрамер с молекулярной массой 250 кДа, состоящий из четырех идентичных субъединиц,
каждая из которых содержит протопорфирин
IX с хелатированным атомом железа [9]. Железо в активном центре фермента находится в
трехвалентном состоянии; четыре места в координационной сфере геминового железа заняты порфириновым циклом, пятое - имидазольным остатком гистидина, а у шестого происходит реакция каталитического разложения
пероксида водорода.
Процесс разложения Н2О2 каталазой может быть представлен следующей схемой:
Е-Fe3+ + H2O2
[Е-Fe3+ ...ООН]
H
[Е-Fe5+ O2- ] + H2O2
[Е-Fe3+ ...ООН];
Н
[Е-Fe5+ O2- ] + H2O;
Комплекс I
Е-Fe3+ + O2 + H2O;
Комплекс I
Нуклеофильный атом азота имидазольной группы гистидина оттягивает на себя протон, активируя молекулу Н2О2, которая замещает ОН-группу у атома железа. Последняя
протонируется гистидином и образуется молекула воды. Пероксосоединение разлагается с
образованием второй молекулы воды, одновременно присоединяя депротонированную
гистидином молекулу Н2О2. При этом происходит гетеролитическое расщепление О-Освязи в пероксиде водорода:
Для регенерации исходной структуры
активного центра достаточно обратимой ионизации имидазола, что является быстрым процессом в области рН 6-8.
Кроме характерной функции каталазы высокоэффективного катализа разложения пероксида водорода на воду и кислород (k=107
моль-1.с-1), фермент проявляет умеренную пероксидазную активность, т.е. катализирует реакции окисления пероксидом водорода различных доноров электронов (k=103 моль-1с-1).
В заключении хотелось бы отметить, что
в условиях оксидантного стресса или усиленного образования форм кислорода (как, например, в результате фагоцитоза) может происходить нарушение функционирования ферментов антиоксидантной системы и, как следствие, возникновение и накопление окислительных повреждений, что сопровождает ряд
физиологических и патофизиологических феноменов - таких, как воспаление, реперфузное
поражение тканей, старение, канцерогенез
[10]. В этой связи необходим поиск путей регулирования антиоксидантного статуса в биологической системе.
Литература
1. Hough M.A., Strange R.W., Hasnain S.S. Conformational variability of the Cu site in one subunit of bovine
Cu,Zn superoxide dismutase: the importance of mobility in
the Glu 119-Leu 142 loor regionb for catalytic function // J.
Mol. Biol. 2000. V. 204 (2). P. 231-141.
2. Tainer J.A, Hallewell R.A., Roberts V.A. et al.
Probing enzyme-substrate recognition and catalytic mechanism in Cu,Zn-superoxide dismutase // Oxygen Radicals in
Biol. and Med.: Proc. IV Int. Congr., La Jolla, 1987. London,
1988. P. 635-640.
3. Kajihara J., Enomoto M., Katoh K. Relation between ESR-detectabl Cu (II) and superoxide dismutase activity // J. Biochem. 1988. V. 104. № 5. P. 855-857.
4. Гуляева Н.В., Обидин А.Б., Маринов Б.С.
Механизм функционирования СОД: многоцентровая
модель // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1989. № 6. С. 890898.
5. Башарина О.В. Анализ фото- и термоиндуцированных структурно-функциональных изменений супероксиддисмутазы и каталазы: Дис. ... канд. биол. наук.
Воронеж, 1995. 140 с.
6. Marklund S.L., Karlsson K. Antioxidants in
therapy and preventive medicine. N.Y.: Plenum press, 1990.
P. 1.
7. Marklund S.L. Location and regulation of extracellular-superoxide dismutase synthesis // Free Rad. Biol.
a. Med. 1990. V. 9. Suppl. 1. P. 127.
8. Артюхов В.Г., Башарина О.В., Вашанов Г.А.,
Наквасина М.А., Путинцева О.В. Олигомерные белки:
структурно-функциональные модификации и роль субъединичных контактов. - Воронеж, 1997. 264 с.
9. Соломон Х., Снайдер С.Х., Дейвид С., Бредт
Д.С. Биологическая роль окиси азота // В мире науки.
1992. № 7. С. 16-26.
10. Рязанцева Л.Т. Особенности функционирования нейтрофилов крови человека в условиях лазерного
облучения: Дис. ... канд. биол. наук. Воронеж, 2002. 155
с.
Воронежский государственный технический университет
ENZYMES-ANTIOXIDANTS: STRUCTURALLY FUNCTIONAL PROPERTIES
AND A ROLE IN REGULATION OF METABOLIC PROCESSES
L.T. Ryazantseva
Concepts about structurally functional properties of the basic enzymes antioxidant system are stated: superoxide-dismutase
and catalase. Kinetic parameters of processes of structurally functional modifications of the specified proteins are analyzed
Key words: antioxidants, superoxide-dismutase, catalase, kinetical parameters