ВОДА– ТАКОЙ ЖЕ ХИМИЧЕСКИЙ РЕАКТИВ В СОВРЕМЕННОЙ

₪
ВЫСТАВКА «АНАЛИТИКА-2014», МОСКВА 15-18 АПРЕЛЯ
ВОДА – ТАКОЙ ЖЕ ХИМИЧЕСКИЙ РЕАКТИВ
В СОВРЕМЕННОЙ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
С.А. Шестаков, специалист по продукции
и технологиям компании Мерк Миллипор
Марвин МакМастер – хроматографист с более чем 25-летним стажем работы – пишет в своей книге, что 90% всех проблем в
системах высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее по тексту – ВЭЖХ), с которыми он сталкивался на своей
практике, были связаны с колонками, которые в свою очередь были вызваны использованием некачественной воды.
Таким образом, примеси, содержащиеся в воде, могут свести на нет все преимущества, предлагаемые производителями
современных аналитических приборов. С такого достаточно громкого заявления я бы хотел начать данный очерк,
который будет посвящён концепции использования очищенной воды и растворителей для ВЭЖХ в современной
аналитической лаборатории. Приведённая ниже ценная информация поможет Вам избежать наиболее распространённых
проблем, связанных с загрязнением воды. Статья построена вокруг метода ВЭЖХ, но всё, что здесь сказано, будет в
той или иной степени справедливо для любых высокоточных и чувствительных приложений. После прочтения данного
материала Вы поймёте, что в аналитической лаборатории вода является таким же химическим реактивом, к качеству
которого необходимо относится не менее трепетно, чем к качеству любого другого реактива высокой степени чистоты.
ВЭЖХ в наши дни является одним из самых распространенных аналитических методов, применяемых в самых разных
лабораториях для широкого спектра приложений. Системы
ВЭЖХ отличаются повышенной чувствительностью, высокой
скоростью проведения исследований и высокой воспроизводимостью результатов. Для того чтобы в полной мере использовать потенциал ВЭЖХ, чистота реагентов и растворителей
должна соответствовать самым высоким стандартам.
Для растворителей, используемых в ВЭЖХ, существует несколько различных типов или градаций по степени
чистоты: HPLC, LC-MS, ULC/MS grade. Так как вода обычно
присутствует в растворах в довольно больших количествах
(от нескольких до десятков процентов!), то количество примесей, которые могут придти из воды, будет более ощутимым, нежели количество примесей из других компонентов
раствора. Таким образом, по важности использования
очищенная вода встаёт в один ряд с растворителями для
ВЭЖХ высокой степени чистоты. Становится понятно, что
для предотвращения искажений результатов анализа и для
поддержания прибора в хорошем состоянии очень важно
использовать воду, свободную от посторонних примесей.
Надежный источник такой воды – это свежеприготовленная
сверхчистая вода из эффективной системы очистки.
Вода разной степени очистки различается по уровню содержания примесей, потенциально влияющих на разделение
компонентов. Существует пять основных групп примесей: неорганические ионы, органика, частицы и коллоиды, бактерии
и их субпродукты, растворенные газы. Рассмотрим каждую
группу примесей немного подробнее. Неорганические ионы,
например Na+, Ca2+ или Cl-, могут присутствовать в воде
в разных количествах в зависимости от источника воды и
окружающей среды в лаборатории. Ионы могут поступать
из трубопроводов, пластиковой и стеклянной посуды. Но для
хроматографиста, как правило, наиболее критичной является
другая группа примесей – органика. Растворенная органика,
обычно присутствующая в водопроводной воде, имеет биологическое происхождение, например, гумусовые кислоты
и липополисахариды. Хорошо известно, что вода сильно
загрязнена продуктами агро-, индустриального комплекса,
лекарственными компонентами, также органические примеси
поступают в воду из труб. Бисфенол А является ярким представителем пластификаторов, попадающих в воду из ПВХ труб.
Еще один тип загрязнений, встречающихся в водопроводной
воде, – механические примеси и коллоиды. Их можно разделить на твердые – песчинки, пылинки, коллоиды – и мягкие
– различный растительный мусор. В воде также присутствуют
микроорганизмы, особенно в поверхностных водах. Бактерии
образуют биоплёнку на различных поверхностях и могут выделять органику, ионы, а также выступать в роли механических
примесей. И наконец, пятая группа примесей – растворенные
48
Фармацевтические технологии и упаковка № 2, 2014
Тел./факс редакции «МБ»: (495) 6726010, 7903699, 8 (929) 563-27-86
Рисунок 1. ESI+ спектр брадикинина с использованием (А)
свежеприготовленной сверхчистой воды и (В)
сверхчистой воды с добавлением ионов Na+.
Рисунок 2. Противодавление как функция номера инжекции
стабильно в течение всего эксперимента
газы из воздуха, такие как азот, кислород, углекислый газ. Они
могут иметь различные концентрации в зависимости от окружающей среды в лаборатории. Например, при растворении в
воде СО2 получается угольная кислота, которая влияет на рН.
Теперь давайте посмотрим, какое влияние может оказывать
каждый тип примесей на хроматографическое разделение
и сам прибор. А чтобы не быть голословным, после каждого
примера я буду приводить результаты практических экспериментов, которые проводились при поддержке научно-исследовательского центра компании Мерк Миллипор. Ионное
загрязнение может оказаться весомой проблемой для пользователей ВЭЖХ, а именно, ионы могут аккумулироваться в
колонке и влиять на процесс разделения. Некоторые ионы,
например, нитриты, поглощают в УФ-спектре. Также ионы
могут влиять на результаты, полученные с помощью массдетектора, особенно при работе в режиме электроспрея (ESI+).
№3 (241) 2014
ВЫСТАВКА «АНАЛИТИКА-2014», МОСКВА 15-18 АПРЕЛЯ
Для демонстрации эффекта ионного загрязнения воды, используемой для приготовления растворителя для ЖХ-МС, пептид
(брадикинин) растворяли в смеси свежеприготовленной сверхчистой воды с ацетонитрилом (96% и 4% соответственно) и напрямую вводили в масс-спектрометр. Полученный спектр (Рисунок
1А) содержит только протонированные пики нашей молекулы. При
наличии в воде ионов натрия (Рисунок 1Б) спектр становится более сложным из-за наличия пиков натриевых аддуктов. Исходя из
всего выше сказанного, рекомендуется использовать свободную
от посторонних ионов сверхчистую воду и специальные реагенты,
пригодные для приготовления проб и подвижной фазы в ЖХ-МС.
Переходим к следующему виду загрязнения – механическое,
вызываемое механическими примесями или частицами различной
природы. Как правило, они повреждают насосы, инжекторы в хроматографической системе, а также загрязняют источники ионов в массспетрометре при его использовании. Но эффект от механических
примесей становится куда существеннее, когда речь идёт об ультраВЭЖХ, при проведении которой используются гораздо меньшие
колонки, сильно подверженные забиванию. Последнее приводит к
плохой воспроизводимости результатов, плохому разрешению и,
наконец, к аварийной остановке самого прибора. Для демонстрации
пригодности применения свежеприготовленной сверхчистой воды
для УВЭЖХ мы провели серии экспериментов совместно с одним из
производителей этих приборов. Смесь из 7 веществ была проанализирована 600 раз подряд. При этом постоянно контролировалось
противодавление каждые 30 секунд (Рисунок 2). В качестве подвижной фазы использовалась свежеприготовленная сверхчистая вода
и ацетонитрил. На рисунке показано противодавление как функция
номера инжекции, и Вы видите, что давление остается стабильным
в течение всего времени эксперимента.
Теперь рассмотрим органическое загрязнение, которое, пожалуй, оказывает наибольшее влияние на проведение ВЭЖХ и, тем
более, на УВЭЖХ. Первый и наиболее распространенный источник
органики в хроматографе – это смесь воды и растворителя, используемая в качестве подвижной фазы. Посторонние органические
примеси, присутствующие в подвижной фазе, накапливаются в колонке, что приводит к очень нестабильной и шумной базовой линии,
сокращению срока службы колонки. Также органические примеси
выливаются во множество посторонних пиков на хроматограмме,
так как органика поглощает в УФ-спектре или легко ионизируется и
имеет массы, близкие к массам исследуемых компонентов. Кроме
того, органические примеси существенно влияют на сам процесс
разделения. Органика формирует слой на поверхности неподвижной фазы, нарушая взаимодействие исследуемых веществ с
ней. При этом происходит смещение базовой линии, уменьшается
разрешение и время удерживания, что приводит к сложностям в
интерпретации результатов. При использовании МС-детектора
его ионизатор также может быть загрязнен. Общий органический
углерод или ТОС отражает общее содержание углерода и является
показателем органической загрязненности воды. Обычно низкие
уровни ТОС достигаются за счёт использования технологии УФфотоокисления, которая позволяют снизить этот показатель до
значения менее 5 ppb (мкг/л). Для демонстрации эффекта органического загрязнения сверхчистая вода с разным содержанием
ТОС вводилась в колонку до градиентного элюирования, после
чего сравнивались градиентные профили, измерения проводились
на длине волны 214 нм. На Рисунке 3 представлены результаты
эксперимента. При значении ТОС 2 ppb (мкг/л) присутствуют лишь
незначительные пики. С ростом ТОС от 5 до 20 ppb наблюдается
больше пиков с нарастающей интенсивностью. Это происходит
из-за накопления органики в колонке и ее выхода в виде паразитных
пиков. Органическое загрязнение может быть более очевидным
по прошествии значительного количества времени. Как уже было
отмечено выше, органика накапливается в колонке и позже проявляется в виде дополнительных пиков, дрейфа базовой линии
или потери разрешения. Описанный ниже эксперимент наглядно
демонстрирует некоторые долгосрочные эффекты, вызванные качеством растворителя для ВЭЖХ. Бутилированная вода для ВЭЖХ
не имеет спецификации по уровню ТОС. Как показано в Таблице 1,
уровень ТОС меняется в зависимости от производителя и значительно превосходит уровень ТОС в свежеприготовленной сверхчистой
воде. В данном эксперименте смесь из 7 лекарственных препаратов
разделялась с помощью колонки С18 более 1000 раз; в качестве растворителя использовалась вода и ацетонитрил. Для определения
долгосрочного эффекта на разделение использовалось два типа
воды – свежеприготовленная сверхчистая вода и бутилированная
вода для ВЭЖХ.
Фармацевтические технологии и упаковка № 2, 2014
Тел./факс редакции «МБ»: (495) 6726010, 7903699, 8 (929) 563-27-86
₪
Рисунок 3. Хроматограммы (214 нм)
сверхчистой воды с разным уровнем ТОС
Таблица 1. Автономные измерения уровня ТОС
в бутилированной воде для ВЭЖХ
Источник воды
Бутилированная вода А
Бутилированная вода B
Бутилированная вода C
Бутилированная вода D
Бутилированная вода E
Бутилированная вода F
Свежеприготовленная сверхчистая вода
ТОС (ppb)
100
87.0
777
16,5
32.4
25.5
7.0*
Хроматограммы вводов проб 50, 290, 530, 770, 1010 и 1310
показаны на Рисунках 4А-В (214 нм) и 4C-D (254 нм). Ожидалось
наблюдение дрейфа базовой линии, особенно на малых длинах
волн. Однако сильный дрейф наблюдался при использовании
бутилированной воды для ВЭЖХ (Рисунок 4А,С) что позволяет
предположить накопление примесей в колонке с течением
времени. Подобный дрейф не наблюдается при использовании
сверхчистой воды (Рисунок 4B,D). Еще одно отличие при использовании разных источников воды – появление посторонних
пиков при использовании бутилированной воды. Посторонний
пик появляется примерно на 5 минуте на хроматограмме 254нм
при вводе #770 (Рисунок 4С). Другой посторонний пик появляется
примерно на 15 минуте на хроматограмме 214нм при вводе #530
(Рисунок 4А). Появление посторонних пиков – другое проявление
наличия примесей в подвижной фазе.
Рисунок 4. Хроматограммы смеси лекарственных препаратов,
полученные с использованием двух разных источников очищенной
воды в качестве элюента. А: бутилированная вода для ВЭЖХ
(214 нм); В: свежеприготовленная сверхчистая вода (214 нм); С:
бутилированная вода для ВЭЖХ (254 нм); В: свежеприготовленная
сверхчистая вода (254 нм). Смесь лекарственных препаратов:
1-ацетаминофен, 2-ацетазоламид, 3-фенобарбитал,
4-карбамазепин, 5-дифенин, 6-секобарбитал, 7-набуметон
№3 (241) 2014
49
₪
ВЫСТАВКА «АНАЛИТИКА-2014», МОСКВА 15-18 АПРЕЛЯ
Таблица 3. Примеси в воде, их эффекты на ВЭЖХ,
технологии очистки
Ионообменная смола +
Активированный уголь
Резервуар
УФ 254 нм
Предварительная Электродеионизация
очистка
Обратный
Осмос
Водопроводная
вода
УФ 185/254 нм
Эффект
Появление дополнительных
пиков – трудности с идентификацией пиков
Нестабильность базовой линии
– трудности при количественном
анализе
Меньший срок службы колонки
Некоторые ионы (нитраты,
нитриты) поглощают в УФ диапазоне
Формирование аддуктов (особенно Na+, K+) при использовании МС-детектора
Технология очистки
Обратный осмос
Синтетический активированный уголь
УФ фотоокисление
Фильтр финишной
очистки на основе
частиц С18
Обратный осмос
Электродеионизация
Ионообменные смолы
Частицы
Засорение колонки – меньший
срок службы колонки
Повреждение насоса и инжектора – замена дорогостоящих
частей
Засорение распылительной иглы
источника ионизации в массспектрометре
Обратный осмос
Мембранный фильтр
финишной очистки
0.22 мкм
Бактерии
Засорение колонки – меньший
срок службы колонки
Побочные органические примеси
– появление дополнительных
пиков, нестабильность базовой
линии
Обратный осмос
УФ-облучение 254 нм
Мембранный фильтр
финишной очистки
0.22 мкм
0,2 мкм
Резистивная
ячейка
УФ 254 нм
Подготовительный модуль (Elix)
Примеси
Органика
ТОС
монитор
Модуль доочистки (Milli-Q)
Сверхчистая
вода
Ионы
Рисунок 5. Схема оптимальной линии очистки воды для получения
сверхчистой воды для ВЭЖХ.
Бактерии так же создают проблемы пользователям
ВЭЖХ, особенно тем, кто работает с фосфатными буферами. Обычно бактерии имеют долгосрочный эффект, так
как, однажды появившись в приборе, они уже никуда не
исчезают, а продолжают расти и размножаться. В основном бактерии приносят те же проблемы, что и механические примеси, они загрязняют инжекторы и насос, части
масс-спектрометра. Бактерии могут засорять колонки и
фритты, увеличивая противодавление. Также бактерии
выделяют ионы и органику, что приводит к появлению
паразитных пиков.
Теперь давайте рассмотрим типы лабораторной воды и
области её применения. Производители систем очистки воды
делят воду на три типа – 1, 2 и 3 – по остаточному содержанию
рассмотренных выше примесей в каждом из них (Таблица 2).
Как Вы видите из таблицы, самая чистая вода – тип 1, которая
известна как вода Milli-Q или сверхчистая вода, являющаяся
идеальным реактивом для ВЭЖХ и всех смежных методов.
Вода тип 2 – это чистая вода, которая соответствует по качеству
воде дистиллированной/бидистиллированной и подходит для
многих, кроме высокоточных и чувствительных, лабораторных
приложений, а также рекомендована в качестве источника для
получения сверхчистой воды тип 1.
Таблица 2. Спецификации для различных типов воды,
производимой системами очистки воды Мерк Миллипор
Примеси
Параметры и единицы
Тип 3
Тип 2
Тип 1
Ионы
Сопротивление (МОм.см при 25°С)
>0.05
>5.0
>18.0
Органика
ТОС (ppb)
<200
<30
<5
Частицы
Частицы > 0.2 мкм (частиц/мл)
NA
<1*
<1*
Бактерии
Бактерии (КОЕ/мл)
<1000
<0.1*
<0.1*
Для производства сверхчистой воды тип 1 используется
комбинация различных технологий очистки для эффективного удаления примесей. Очистка воды может быть разделена на два основных этапа: подготовительный этап, в ходе
которого удаляется от 95 до 99% примесей, изначально
представленных в воде, и так называемый этап доочистки, в
ходе которого удаляются оставшиеся примеси до получения
сверхчистой воды (Рисунок 5).
В последние десятилетия компания Мерк Миллипор была
лидером по инновациям в процессе получения сверхчистой
воды для хроматографов. Успех был обеспечен сочетанием
нашего опыта в построении систем очистки воды и понимания требований жидкостной хроматографии и способов
детектирования. Технологии и системы очистки воды разрабатывались с учетом двух основных факторов: (а) отсутствие влияния на исследуемые вещества и (б) оптимизация
эффективности работы хроматографической системы.
Эти цели достигаются путем снижения уровня содержания
примесей в очищенной воде с использованием наиболее
оптимальной комбинации различных технологий очистки,
приведённых на Рисунке 5.
Как уже неоднократно подчёркивалось выше, вода
высокой степени очистки (тип 1), пригодная для ВЭЖХ, не
должна содержать органических примесей, ионов, частиц
и бактерий. В Таблице 3 приведен обзор всех примесей,
критичных для ВЭЖХ, эффектов их влияния на приборы
для ВЭЖХ и результаты, а также технологий очистки воды
для наиболее эффективного удаления той или ионной
группы примесей.
50
Фармацевтические технологии и упаковка № 2, 2014
Тел./факс редакции «МБ»: (495) 6726010, 7903699, 8 (929) 563-27-86
Итак, что можно сказать, подводя итоги? Очищенная
вода широко применяется для проведения ВЭЖХ – приготовление бланков, стандартов и образцов, подвижной
фазы, а также для отмывки и ополаскивания посуды.
Многочисленные эксперименты показывают важность использования для этих целей свежеприготовленной сверхчистой воды с низким содержанием органики, неорганики,
частиц и бактерий. При попадании этих примесей на любой
из названных этапов проведения ВЭЖХ, они остаются на
протяжении всего эксперимента и могут существенно повлиять на конечный результат. Поэтому очень важно всегда
помнить, что вода – это такой же химический реактив высокой степени чистоты в аналитической лаборатории, и обращаться с ним необходимо также аккуратно и осторожно,
как и с другими реактивами подобного качества.
Список литературы:
McMaster, M.C. LC/MS a Practical Users Guide. John Wiley
and Sons, New Jersey, (2005)
Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Dolan, J.W. Introduction to
Modern Liquid Chromatography,”3rd Ed, John Wiley and Sons,
New Jersey, (2010).
ASTM Standard D1193–06, “Standard Specification for
Reagent Water,” March, (2006)
ISO 3696, “Laboratory water for analytical purpose –
Specification and test methods,” (1987).
Mabic, S.; Regnault, C.; Krol, J. “The Misunderstood
Laboratory Solvent: Reagent Water for HPLC,” LCGC, January,
(2005).
Stewart, B.; Williamson, B. L. “Evaluation of HPLC reagent
water purity via LC-MS and total organic carbon analysis,” Am.
Laboratory, December, 19, 16-18, (2001).
Kano I.; Castillo E.; Darbouret D.; Mabic, S.“Using ultrapure
water in ion chromatography to run analyses at the ng/L level”
J. Chromatogr. A, 1039, 27-31, (2004).
Regnault, C.; Kano, I.; Darbouret, D.; Mabic, S.“Ultrapure
water for liquid chromatography-massspectrometry studies,”
J. Chromatogr. A, 1030, 289-295, (2004).
Tarun, M.; Monferran, C.; Devaux, C.; Mabic, S.“Improving
chromatographic performance by using freshly delivered
ultrapure water in the mobile phase,” LCGC The Peak, June,
7-17, (2009).
Regnault. C.; Mabic, S. “Benefits of the pretreatment step
in purifying water for LC-MS analyses,” LCGC The column,
September, 12-15, (2005).
Мерк Миллипор
адрес: 117198, г. Москва,
Ленинский пр-т, 113.1, офис Е-718
e-mail: sergey.shestakov@merckgroup.com
сайт: merckmillipore.ru
телефон: +7(495) 931-91-91, доб.117
№3 (241) 2014