Для диагностики птичьего гриппа
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КИРОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ На правах рукописи ПОПОВА Светлана Валентиновна «ПРИМЕНЕНИЕ НАТИВНЫХ И ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ АНТИГЕНОВ В КАЧЕСТВЕ БИОЛИГАНДОВ В ГИДРОЗОЛЬНЫХ ПРЕПАРАТАХ ДЛЯ ЭКСПРЕССНОЙ ИММУНОДИАГНОСТИКИ» 03.01.06 – биотехнология (в том числе и бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор технических наук, профессор А.Г. Мешандин г. Москва – 2012 СОДЕРЖАНИЕ СОДЕРЖАНИЕ………………………………………………….………….2 ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………….4 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ИММУНОДИАГНОСТИКИ В КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ И ВЕТЕРИНАРИИ (обзор литературы) 1.1.Иммунохимия в системе клинической лабораторной диагностики....................................................................................................10 1.2.Практические приложения - примеры конкретного применения иммунохимических методов……………………………………………......12 1.3.Особенности ряда диагностических препаратов, применяемых в иммунохимическом анализе............................................................................21 1.4.Гидрозольные препараты как экспрессные бесприборные диагностикумы................................................................................................23 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.Материалы исследования……………………………...………………..33 2.2. Методы исследования ……………………………………………….....37 2.3. Статистическая обработка полученных результатов……………...45 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ: 3.1. Применение гидрозольных диагностикумов с нативным антигеном по определению антител к вирусу гепатита псовых в сыворотке крови, оценка адекватного иммунитета…………………………………………..47 3.2. Применение гидрозольных диагностикумов с нативным антигеном по определению антител к вирусу H5N1 (вирус птичьего гриппа) в сыворотке крови…………………………………………………………………………..49 3.3.Применение гидрозольных диагностикумов с нативным и генноинженерными антигенами в задачах выявления специфических антител к M. Tuberculosis (туберкулёз) в сыворотке и капиллярной крови………….52 3.4.Применение гидрозольного антительного диагностикума для выявления антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в сыворотке крови и моче…………………………………………………..69 2 3.5.Обоснование экономической целесообразности внедрения реакции гидрозольной агглютинации в практику здравоохранения.........................74 РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ ГИДРОЗОЛЕЙ В КЛИНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ……………………………………………………………….....75 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………..................................... 76 ВЫВОДЫ…………………………………………….....................................79 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………….............................80 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ………………………………………………………..…..82 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………....................................................84 ПРИЛОЖЕНИЯ..............................................................................................94 3 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Иммунохимические методы, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности для целей охраны окружающей среды. Обнаружение образующегося комплекса антиген-антитело может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные и другие метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность классических иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких минут [7]. Современная биотехнология занимает ведущее положение в системе биологических, медицинских, ветеринарных и зоотехнических исследований и представляет собой современную прогрессивную форму промышленной технологии, основу которой составляют биологические объекты-человек, животные, растения, микроорганизмы, клетки и вирусы. Один из разделов биотехнологии – иммунохимия, успехи её развития позволили создать принципиально новую биотехнологию производства высокооднородных в химическом и иммунологическом отношениях антител, названных моноклональными, применение которых позволили создать эффективные методы иммунодиагностики - иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА), иммуноблоттинг, метод цепной полимеразной реакции (ПЦР). Эти и другие методы, основанные на реакции антиген – антитело, нашли широкое применение практически во всех областях современной биологии, а также в медицине и ветеринарии. Для 4 этих методов характерны высокая чувствительность и точность результатов [26, 27, 31, 48, 73]. Всё вышесказанное подтверждает тот факт, что эти методы применяются, прежде всего, как верифицирующие тесты, но не как скриннинговые. Наметившиеся новые тенденции в медицине XI века ориентированы на профилактику и выявление ранних нарушений показателей здоровья, поэтому в настоящее время требуется новая тактика лабораторных исследований и необходима диагностика, позволяющая выявлять контингенты повышенного риска патологий, методические приемы, в том числе упрощенные для массовых исследований и контроля реабилитации. Наиболее перспективной является разработка новых высокоинформативных чувствительных и специфичных способов диагностики. При этом особое место должно населения с отводиться целью методам раннего профилактического выявления заболевания, обследования что диктует необходимость повышения требований к показателям диагностической эффективности скрининговых тестов. Следовательно, актуальны простые по исполнению методы, позволяющие обнаружить причинные антигены и маркеры в минимальных и следовых количествах в большом объеме анализируемых образцов в различных стадиях течения заболевания. В сфере первичной помощи пациентам экспресс-диагностика может существенно улучшить исходы заболеваний за счет более широкого скрининга с целью выявления пациентов, которые нуждаются в применении специального обследования, а также за счет систематического мониторинга (включая самомониторинг) эффекта лечебных мер у амбулаторных больных. Таким образом, основным предметом нашего исследования стали изучение применения нативных и рекомбинантных антигенов, в качестве биолигандов в гидрозольных препаратах иммунодиагностики. 5 для экспрессной Анализ данных специальной литературы и высказанные выше предпосылки позволили сформулировать цель и задачи настоящей работы. Цель исследования Разработка и апробация нового оригинального экспресс метода с применением нативных и генно-инженерных антигенов в реакции гидрозольной агглютинации для выявления антител к вирусам гепатита псовых, птичьего гриппа, к микобактериям туберкулёза, детекции хорионического гонадотропина человека в тесте на беременность. Задачи исследования 1. Разработать гидрозольные антигенные диагностикумы для выявления антител к вирусу гепатита псовых, птичьего гриппа, M.tuberculosis. 2. Изучить возможность применения гидрозольных диагностикумов с нативными и генно-инженерными антигенами с целью обнаружения антител в исследуемом материале. 3. Разработать гидрозольный антительный диагностикум для выявления антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). 4. Определить диагностическую ценность реакции гидрозольной агглютинации для диагностики ряда заболеваний. Научная новизна работы Впервые разработана технология получения гидрозольных препаратов на основе коллоидных растворов оксида железа (Fе3O4) и гексацианферрата (II) железа (III), проведена их сравнительная характеристика. Доказана целесообразность и эффективность их применения для детекции в исследуемом материале: 1. Антител к вирусу гепатита псовых. 2. Антител к вирусу птичьего гриппа. 3. Антител к M. tuberculosis. 4. Антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). 6 Научно-практическая значимость работы На основании полученных результатов исследования осуществлён синтез основных реагентов для экспресс-тестов, показана простота и экономичность постановки анализа, достаточная чувствительность и специфичность реакции гидрозольной агглютинации в выявлении антител к вирусам гепатита псовых, птичьего гриппа, M. tuberculosis, антигена хорионического гонадотропина человека, что позволяет рекомендовать разработанные нами экспресс-тесты для использования в ветеринарии и медицинской практике. Апробация работы Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на научных и научно – практических конференциях: V съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Москва, 2008); XI межрегиональной научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием «Молодёжь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2009); IV Всероссийской итоговой студенческой научной конференции (Самара, 2010); V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2010). Публикации По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из которых 4 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Основные положения, выносимые на защиту 1. Реакция гидрозоля, нагруженного соответствующим антигеном, может быть использована для обнаружения антител к вирусу гепатита у собак, вирусу H5N1 птичьего гриппа, M. Tuberculosis. 2. Реакция гидрозоля, нагруженного мышиными моноклональными антителами к бета-субъединице ХГЧ, может быть использована для обнаружения антигена хорионического гонадотропина человека в тесте на беременность. 7 3. Реакция гидрозольной агглютинации при выявлении в сыворотке крови и капиллярной крови антител к M. Tuberculosis по своим основным характеристикам не уступает традиционным микробиологическим методам. 4. Гидрозоль на основе гексацианферрат (II) железа (III) обеспечивает наиболее оптимальный комплекс иммунохимических свойств разработанных тестов. Реализация в практическом здравоохранении и ветеринарии Материалы исследований внедрены и используются в учебном процессе на кафедре общей химии Кировской медицинской академии при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами лечебного и педиатрического факультетов. В ходе работы получены и в последующем апробированы в лабораторно – клинических условиях гидрозольные диагностикумы, предназначенные для выявления маркёров таких заболеваний, как гепатит псовых, птичий грипп, туберкулёз, и хорионического гонадотропина человека у беременных женщин. Испытания производились на базе клинических лабораторий Кировской областной клинической больницы, больницы ФГУ ЛИУ – 12 УФСИН России по Кировской области, на базе лаборатории Биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН г. Санкт – Петербурга, в лаборатории диагностического центра ОАО НПП «АВИВАК» г. Санкт – Петербурга. Теоретические положения, методики расчета и результаты исследований диссертации использованы в отчёте о НИР по договору № 1406/11-К от 20 июня 2011г. Результаты научных исследований использованы для разработки методических рекомендаций (положений) в рамках темы: «Лазурь», выполненной по заказу Федерального медико–биологического агенства (ФМБА) Минздравсоцразвития РФ, для оформления проекта технических условий и инструкции по применению. Предполагается выпуск теста для диагностики туберкулеза на профильных предприятиях ФМБА. 8 Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждений, выводов, практических предложений, списка использованной литературы (105 источников, из них 27 - иностранных авторов), приложений. Работа изложена на 119 страницах, содержит 17 таблиц, 4 диаграммы, 4 рисунка. 9 ГЛАВА 1 МЕТОДЫ ИММУНОДИАГНОСТИКИ В КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ И ВЕТЕРИНАРИИ (обзор литературы) 1.1. Иммунохимические методы, их место в системе клинической лабораторной диагностики Иммунодиагностика — диагностика заболеваний человека и животных с использованием методов, основанных на специфическом взаимодействии антиген-антитело. Методы иммунодиагностики применяют в клинической медицине и ветеринарии для выявления различных стадий инфекционного процесса, определения иммунного ответа организма при аллергических, аутоиммунных, онкологических и других заболеваниях, для определения групп крови, а также в судебно-медицинской практике[19]. В рутинной клинической лабораторной практике получили широкое распространение методы: агглютинации (латекса, РПГА/РНГА и др.), иммунохроматографические (ИМХР), иммунофлуоресценции (РИФ), твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблоттинг (ИБ) и другие. Важнейшей областью для медицинской биотехнологии стала клеточная инженерия, в частности, технология получения моноклональных антител, которые продуцируются в культуре или в организме животного гибридными лимфоидными клетками — гибридомами. Технология получения моноклональных антител оказала большое влияние на фундаментальные и прикладные исследования в области медицины и на медицинскую практику. На их основе разработаны и применяются новые системы иммунологического анализа — радиоиммунологический и иммуноферментативный анализ. Они позволяют определять в организме исчезающе малые концентрации специфических антигенов и антител. Большое значение моноклональные антитела приобрели для типирования тканевых антигенов (прежде всего антигенов класса HLA) при подборе наиболее подходящих доноров для трансплантации органов и тканей, для диагностики различных заболеваний. 10 Обладая высокой специфичностью действия, они обеспечивают идентификацию не только вида возбудителя, но и его серотипа. С помощью моноклональных антител можно тестировать различные гормоны, метаболиты, белковые факторы. Наиболее быстрый метод индикации основан на применении антител, иммобилизованных на мембранных электродах — аналогах ферментных биосенсоров. Они позволяют диагностировать беременность, выявлять предрасположенность к диабету, ревматоидному артриту, идентифицировать наследственные заболевания, сопровождающиеся утратой тех или иных ферментов и других белковых компонентов [22 ]. Нативный антиген представляет собой белковую фракцию, выделенную из культуральной жидкости, выращенную на синтетической питательной среде [84]. Рекомбинантные антигены - это антигены, полученные генно- инженерным способом. Белки-аналоги определенных белковых антигенов возбудителя. Технология выделения рекомбинантных белков даёт возможность в достаточно чистом виде получать аналог любого отдельного антигена. Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы высокоиммуногенными (то есть в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам в достаточно большом количестве) и высокоспецифичными (то есть характерными лишь для данного возбудителя и не дающими перекрёстных реакций с антителами другой природы). Специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 % [14,88]. 1.2. Практические приложения - примеры конкретного применения иммунохимических методов Иммунологические методы исследования широко используются для лабораторной диагностики инфекционных 11 и паразитарных болезней, определения групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, видовой принадлежности белка, распознавания аллергии и аутоиммунных болезней, беременности, гормональных нарушений, а также в научно- исследовательской работе. Они включают серологические исследования, или серологические реакции, к которым относят обычно реакции прямого воздействия антигенов и антител сыворотки крови in vitro. Серологические реакции различаются по способности выявлять отдельные классы антител. Реакция агглютинации, например, хорошо выявляет IgMантитела, но менее чувствительна для определения IgG-антител. Реакции связывания комплемента и гемолиза, которые требуют участия комплемента, не выявляют антитела, не присоединяющие комплемент, например, IgAантитела и IgE-антитела. В реакции нейтрализации вирусов участвуют лишь антитела, направленные против антигенных детерминант поверхности вириона, связанных с патогенностью. Чувствительность иммунологических методов исследования превосходит все другие методы исследования антигенов и антител, в частности, радиоиммунный и иммуноферментный анализы позволяют улавливать присутствие белка в количествах, измеряемых в нанограммах и даже в пикограммах. С помощью их определяют группу и проверяют безопасность крови (гепатит В и ВИЧинфекция). При трансплантации тканей и органов они позволяют определять совместимость тканей и тестировать методы подавления несовместимости. В судебной медицине используют реакции для определения видовой специфичности белка и реакцию агглютинации для определения группы крови [38,49]. Иммунологические диагностике методы инфекционных широко болезней. применяют в лабораторной Этиологию заболевания устанавливают также на основании прироста антител к возбудителю в сыворотке крови реконвалесцента по сравнению с пробой, взятой в первые дни болезни. На основе иммунологических тестов изучают иммунитет 12 населения по отношению к массовым инфекциям, например, к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок. Развитие иммунологического исследования идет как по линии совершенствования реагентов (чистоты антигенов и антител), так и по линии создания автоматизированных систем постановки реакций и их инструментального учета [13, 91]. В зависимости от их механизма и учета результатов их можно подразделить на: 1.Реакции, основанные на феномене агглютинации. Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек — носителей антигена с помощью иммунной сыворотки к этому антигену. Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t°37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, бациллярной дизентерии, сыпного тифа. Реакции агглютинации для определения группы крови и резус-фактора основаны на взаимодействии аллоантител (изоантител) и антигенов эритроцитов. Антитела против резус-фактора являются неполными, они не способны к прямой реакции с резус-положительными эритроцитами, поэтому для их обнаружения используют реакцию Кумбса, основанную на выявлении неполных антител с помощью антиглобулиновых сывороток. К эритроцитам известной специфичности добавляют исследуемую сыворотку крови, а вслед за этим антиглобулиновую сыворотку против IgG (непрямая реакция Кумбса). Fab-фрагменты неполных антител исследуемой сыворотки крови 13 присоединяются к эритроцитам, а к свободным Fc-фрагментам этих антител присоединяются антитела против IgG, и происходит агглютинация эритроцитов. В реакции пассивной (или непрямой) гемагглютинации (РПГА, РНГА) используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов. Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА), основанная на феномене предотвращения (торможении) иммунной сыворотки гемагглютинации эритроцитов вирусами, используется для выявления и титрования противовирусных антител. Она служит основным методом серодиагностики гриппа, кори, краснухи, эпидемического паротита, клещевого энцефалита и других вирусных гемагглютинирующими инфекций, возбудители свойствами. Например, которых для обладают серодиагностики клещевого энцефалита в лунки панели разливают двукратные разведения сыворотки больного на щелочном боратном буферном растворе. Затем 14 добавляют определенное количество антигена клещевого энцефалита , (обычно 8 АЕ агглютинирующих единиц), и после 18 ч экспозиции при t°4° вносят взвесь гусиных эритроцитов, приготовленную на кислом фосфатнобуферном растворе. Если в сыворотке крови больного есть антитела к вирусу клещевого энцефалита, то антиген нейтрализуется, и агглютинация эритроцитов не происходит [25]. 2.Реакции, основанные на феномене преципитации. Преципитация происходит в результате антигенами. Простейшим взаимодействия примером антител реакции с растворимыми преципитации является образование в пробирке непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело. Различные разновидности реакции преципитации широко применяют в полужидких гелях, которые носят одновременно качественный и количественный характер. В результате свободной диффузии в геле антигенов и антител в зоне оптимального их соотношения образуются специфические комплексы — полосы преципитации, которые выявляют визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген — антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител. Для постановки двойной иммунодиффузии наливают слой растопленного геля на стеклянную пластинку и после затвердевания вырезают лунки диаметром 1,5—3 мм. В расположенные по кругу лунки помещают исследуемые антигены, а в центральную лунку — иммунную сыворотку известной специфичности. Диффундируя навстречу друг другу, гомологичные сыворотки и антигены образуют преципитат. Иммуноэлектрофорез основан на усилении миграции в геле антигенов и антител путем помещения пластины геля с реагентами в электрическое поле. При этом достигается разделение антигенов и антител на компоненты в соответствии с их подвижностью и зарядом. 15 3.Реакции с участием комплемента, в качестве которого используют свежую сыворотку крови морской свинки. Они основаны на способности субкомпонента комплемента Clq и затем других компонентов комплемента присоединяться к иммунным комплексам. Реакция связывания комплемента (РСК) позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации комплемента комплексом антиген — антитело. Эта реакция состоит из двух фаз: взаимодействия антигена с испытуемой сывороткой крови (исследуемая система) и взаимодействия гемолитической сыворотки с эритроцитами барана (индикаторная система). При положительной реакции в исследуемой системе происходит связывание комплемента, и тогда при добавлении эритроцитов, сенсибилизированные антителами, гемолиза не наблюдается. Реакцию применяют для серодиагностики сифилиса (реакция Вассермана), вирусных и бактериальных инфекций. Иммунное прилипание. Эритроциты, тромбоциты и другие клетки крови имеют на поверхности рецепторы к третьему компоненту комплемента (СЗ). Если к антигену (бактериям, вирусам и др.) добавить соответствующую иммунную сыворотку и комплемент, то образуется комплекс антиген — антитело, покрытый СЗ-компонентом комплемента. Эту реакцию применяют при изучении ряда вирусных инфекций (клещевого энцефалита), которые сопровождаются иммунопатологическими процессами и циркуляцией в крови вирусных антигенов в комплексе с антителами [25]. нейтрализации 4.Реакция основана на способности антител нейтрализовать некоторые специфические функции макромолекулярных или растворимых антигенов, например, активность ферментов, токсины бактерий, болезнетворность вирусов. В бактериологии эту реакцию используют для обнаружения антистрептолизинов, антистрептокиназов и антистафилолизинов. Реакцию нейтрализации токсинов можно оценивать по биологическому эффекту, например, 16 титруют антистолбнячные и антиботулинические сыворотки. Смесь токсина с антисывороткой, введенная животным, не вызывает их гибели. Различные варианты реакции нейтрализации применяют в вирусологии. При смешивании вирусов с соответствующей антисывороткой и введении этой смеси животным или в клеточные культуры патогенность вирусов нейтрализуется, и при этом животные не заболевают, а клетки культур не подвергаются деструкции [13]. 5. Реакции с использованием химических и физических меток. Иммунофлюоресценция заключается в использовании меченных флюорохромом антител, точнее, иммуноглобулиновой фракции антител IgG. Меченное флюорохромом антитело образует с антигеном комплекс антиген — антитело, который становится доступным наблюдению под микроскопом в УФ-лучах, возбуждающих свечение флюорохрома. Реакцию прямой иммунофлюоресценции используют для изучения клеточных антигенов, выявления вируса в зараженных клетках и обнаружения бактерий и риккетсий в мазках. Так, для диагностики бешенства отпечатки кусочков мозга животных, подозреваемых на вирусоносительство, обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате в цитоплазме нервных клеток выявляются глыбки ярко-зеленого цвета. Применяют также метод непрямой иммунофлюоресценции, основанный на выявлении комплекса антиген — антитело с помощью люминесцирующей иммунной сыворотки против IgG-антител и используемой для обнаружения не только антигенов, но и титрования антител. Иммунофлюоресценцию широко используют не только в бактериологии, вирусологии, паразитологии, но и в иммунопатологии для обнаружения антител к тканевым антигенам человека [25,26,27,28]. Радиоиммунологический метод основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Она является наиболее чувствительным методом определения антигенов и антител и используется для определения гормонов, лекарственных веществ и антибиотиков, для диагностики 17 бактериальных, вирусных, риккетсиозных, протозойных заболеваний, исследования белков крови, тканевых антигенов. Первоначально был разработан как специфический метод измерения уровня циркулирующих в крови гормонов. Тест-системой являлись меченный радионуклидом гормон (антиген) и антисыворотка к нему. Если к такой антисыворотке добавить материал, содержащий искомый гормон, то он свяжет часть антител, при последующем внесении меченого титрованного гормона с антителами свяжется уменьшенное по сравнению с контролем его количество. Результат оценивают по сопоставлению радиоактивной метки. конкурентной реакции. Эта кривых связанной разновидность Существуют и и метода несвязанной носит другие название модификации радиоиммунологического метода [83]. Иммуноферментные методы основаны на использовании антител, конъюгированных с ферментами, главным образом пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Чтобы обнаружить соединение меченых антител с антигеном, добавляют субстрат, разлагаемый присоединенным к IgG ферментом, с окрашиванием в желто-коричневый (пероксидаза) или желтозеленый (фосфатаза) цвет. Используют также ферменты, разлагающие не только хромогенный, но и люмогенный субстрат. В этом случае при положительной реакции иммунофлюоресценции обнаружения появляется свечение иммуноферментный антигенов в клетках или метод [11]. Подобно применяют титрования антител для на антигенсодержащих клетках. Наиболее популярной разновидностью иммуноферментного метода является иммуносорбция. На твердом носителе, которым могут быть целлюлоза, полиакриламид, декстран и различные пластмассы, сорбируют антиген. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. В лунки с сорбированным антигеном вносят исследуемую сыворотку крови, затем меченную ферментом антисыворотку и субстрат. Положительные результаты 18 учитывают по изменению цвета жидкой среды. Для обнаружения антигенов на носитель сорбируют антитела, затем вносят в лунки исследуемый материал и проявляют реакцию меченной ферментом антимикробной сывороткой. Повышению чувствительности иммунофлюоресцентного и иммуноферментного методов способствует введение в систему реакции авидина и биотина. Иммуногистологические методы предназначены для определения антигенов на поверхности или внутри клетки, например, для обнаружения маркеров лимфоцитов и иммунокомплексов при гломерулонефритах и других заболеваниях почек. В этой реакции для выявления антигенов иммуноферментными пользуются конъюгатами иммунофлюоресценцией, с пероксидазой. или Количество специфических антигенов определяют по интенсивности окрашивания или с помощью спектрофотометра. В зависимости от того, какие антигены используются, все иммуноферментные тест-системы для выявления антител подразделяются на: 1. Лизатные, использующие нативный антиген (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре); 2. Рекомбинантные, использующие полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определенных белковых антигенов возбудителя; 3. Пептидные, использующие химически синтезированные фрагменты белков. Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным. Иммуноблоттинг применяют для выявления антител к отдельным антигенам или «узнавания» антигенов по известным сывороткам. Метод состоит из 3 этапов: разделения биологических макромолекул (например, вируса) на отдельные белки с помощью электрофореза в полиакриламидном геле; переноса разделенных белков из геля на твердую подложку (блот) 19 путем наложения пластины полиакриламидного геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозу; выявления на подложке искомых белков с помощью прямой или непрямой иммуноферментной реакции. Этот диагностический метод используют при ВИЧ-инфекции. Диагностическую ценность имеет обнаружение антител к одному из белков внешней оболочки вируса. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд. пар оснований [7]. Помимо амплификации (увеличения числа копий) ДНК ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов [104]. Прямая хемoлюминесценция - химическая реакция, которая испускает энергию в виде света. Когда используется в комбинации с технологией иммунологического анализа, свет, произведенный реакцией, указывает 20 количество анализируемого вещества в образце. Прямая хемолюминесцентная реакции непосредственно измеряет световую энергию без использования дополнительных шагов или усиливающих молекул. Например, в АДВИА Кентавре используется сложный эфир акридина (AE) как хемолюминесцентную метку, так как он не требует добавления катализатора или субстрата. Прямая хемилюминесценция, использующая AE, легко автоматизируется и обеспечивает много преимуществ, типа длительного срока хранения реактива, быстрого времени срабатывания и высокой чувствительности теста. Используется диметильная форма AE, потому что она более стабильна, что позволяет длительно использовать реактив. В ходе анализа идёт окисление перекисью водорода и излучение света максимально во время изменения среды от кислого до основного. Окисления происходят быстро, с пиковым излучением света в пределах одной секунды. Быстрое время срабатывания и очень низкий фон делает прямую хемилюминесценцию с AE эффективнее, чем РИА или ИФА методы. AE молекула намного меньшая, чем молекула щелочной фосфатазы, используемая в ИФА протоколах. Этот меньший размер уменьшает блокировку мест связывания, увеличивает скорость диффузии и увеличивает чувствительность анализа [104,105]. 1.3. Особенности ряда диагностических препаратов, применяемых в иммунохимическом анализе Диагностикумы – это препараты, содержащие известный антиген для выявления специфических антител, например, в сыворотке больного, или препараты известных антител (иммунных сывороток) для идентификации антигена, например, возбудителя инфекционного заболевания [17]. Бактериальные диагностикумы представляют собой взвесь клеток микроорганизмов или препараты, полученные из них антигенных фракций. Для их изготовления используют 21 специально отобранные штаммы известного антигенного состава [63]. Взвеси убитых бактерий или др. антигенов, применяемые для серологической диагностики инфекционных болезней. Они обладают стабильными свойствами, специфичны, безопасны и просты в применении [70]. Эритроцитарные диагностикумы для реакции гемагглютинации применяют при диагностике сальмонеллезов, шигеллезов, туляремии и других заболеваний. В качестве антигена могут применяться вещества – бактерии, вирусы либо генно-инженерные продукты анализа. Чувствительность теста в 100 раз превосходит реакцию связывания комплемента. Результаты получают через 4 часа, учет реакции визуальный. Условия хранения – в сухом месте с относительной влажностью воздуха не более 60% и при температуре от 4 до 10°С. Существенным недостатком эритроцитарных диагностикумов является то, что эритроциты обладают собственными антигенными свойствами, являются нестабильным биологическим сырьем [70]. Комплементарные диагностикумы изготавливают для постановки реакции Вассермана (РСК) при серодиагностике сифилиса.[21]. Использование данных препаратов связано с рядом недостатком: недостаточная чувствительность, специфичность, сложность постановки. Иммуносорбенты – комплексы нерастворимых носителей, обычно полимерных материалов, с антигенами или антителами, используемые для выделения специфических антител на основе специфического взаимодействия антиген-антитело с последующей десорбцией целевого продукта. Конъюгаты биоспецифическими маркерами в коллоидного зондами) золота становятся иммуноцитохимических все и с белками более (и иными перспективными молекулярно-генетических исследованиях биологических объектов с использованием методов световой и электронной микроскопии. Благодаря интенсивной окраске золотосодержащего маркера можно проводить прямую визуализацию 22 продуктов биоспецифических реакций с чувствительностью, приближающейся к чувствительности радиоизотопной метки. На принципе иммуносорбции основаны тест–системы иммуноферментного анализа, радиоиммунного анализов, иммунофлюоресценции и другие [21]. Латекс – диагностикумы – гомогенные водные дисперсии унифицированных по размеру микросфер (частиц) полимера, на которые различными способами сорбируются биолиганды (физическая сорбция, ковалентное присоединение). Для сенсибилизации способом физической сорбции используют модифицированные микросферы, а для сенсибилизации способом ковалентного присоединения используют глутаральдегид – модифицированные латексные микросферы, позволяющие реализовать прямое связывание белка с латексной поверхностью через амидную связь. Эти препараты являются одними из наиболее простых в техническом отношении, так как не требуют специального оборудования, высокой квалификации персонала, могут проводиться в полевых условиях [37]. 1.4. Гидрозольные препараты как экспрессные бесприборные диагностикумы Реализация большинства современных иммунохимических диагностических методов анализа невозможна без твёрдофазных носителей. Объектами нашего исследования стали гидрозольные препараты, которые могли бы обеспечить сорбцию белков-антигенов (нативных и генноинженерных) на эту поверхность. Гидрозоли - это частицы ультрадисперсной неорганической природы на поверхности, которых сорбированы биоспецифические белки: антиген либо антитело. В целом гидрозоли близки к иммуносорбентам, которые представляют собой коллоидные и полуколлоидные растворы комплексных соединений "переходных" металлов [43], на поверхности которых адсорбированы биоспецифические компоненты. Переведённые в нерастворимую форму они 23 связывают антитела или антигены, которые при этом также становятся нерастворимыми. Термин «золь» используется для отличия коллоидных суспензий от макроскопических. Хотя четкое разграничение между ними отсутствует, размеры частиц золя в общем случае достаточно малы, что обеспечивает их свободное прохождение через фильтровальную бумагу. Если дисперсионной средой является Устойчивость вода, то коллоидной вандерваальсовых (слабые используется термин дисперсной системы силы притяжения) «гидрозоль» зависит и от [54]. баланса кулоновских (электростатическое отталкивающее взаимодействие двойных слоев) сил [61]. Метод гидрозольной определённые агглютинации положительные сочетает свойства в себе различных некоторые известных иммунохимических реакций. В данном методе в качестве визуализирующих меток используют гидрозоли с адсорбированными по определённой технологии конкретных биолигандов, ассоциированных с тем или иным «маркёром» определённого заболевания [47]. 1.4.1. Особенности адсорбции биолигандов на гидрозольные препараты На сегодняшний день можно отметить очень малое количество публикаций по технике синтеза и постановки иммунохимических гидрозольных реакций. В основном это патентные материалы, в частности, известна постановка гидрозольных реакций в ёмкостях, покрытых антифрикционными материалами. К таковым относятся фторполимеры, фторированные органические масла [40]. Известна постановка реакции гидрозольной агглютинации в разных буферных системах. При этом для разведения гидрозолей и биологических жидкостей используют буферные растворы, содержащие в своем составе поверхностно-активные вещества (ПАВ). В качестве ПАВ используют 24 неионогенные ПАВ и белковые молекулы [12]. Известно несколько практических приложений гидрозольных препаратов в научно-технической, научно-медицинской литературе. В частности, известно определение противомозговых антител с помощью модифицированных гидрозолей [29]. На основе моноклональных антител был синтезирован гидрозоль для скрининга эпителиального опухолевого маркера в крови онкологических больных [55]. Серологическая оценка сальмонеллеза при помощи гидрозолей на основе оксида железа (III) была описана в 2001 году [33]. Гидрозоли также нашли прикладное применение при оценке рабдомиолиза: повреждение мышц в клинике неотложных состояний у хирургических больных [68]. Коллоидные растворы – это типичные гетерогенные высокодисперсные системы, свойства которых определяются очень сильно развитой межфазной поверхностью. Чем выше дисперсность, тем больше склонность к самопроизвольному уменьшению дисперсности [9]. Поэтому для получения устойчивых коллоидных растворов необходимо не только достигнуть заданной дисперсности, но и создать условия для её стабилизации. Ввиду этого устойчивые дисперсные системы состоят из трех компонентов: дисперсионной среды, дисперсной фазы и третьего компонента – стабилизатора дисперсной системы. Стабилизатор может иметь как ионную, так молекулярную, часто высокомолекулярную природу. Ионная стабилизация золей связана с присутствием электролитов (может являться одним из компонентов получаемого коллоидного раствора, находящегося в избытке), создающих ионные пограничные слои между дисперсной фазой и дисперсионной средой [49]. 1.4.2. Ионная адсорбция В литературе отмечается, если точно известна изоэлектрическая точка хорошо очищенного предварительно биолиганда, возможно внесение 25 определенного вклада в процессы адсорбции со стороны ионных составляющих. В литературе [15, 16, 20, 53, 54, 27] не отмечается каких – либо строгих корреляций между величиной поверхностного заряда твердой фазы и ее сорбционной активностью по отношению к конкретному биолиганду. Непосредственно при осуществлении процессов адсорбции использовали буферные растворы различной величины рН до и после изоэлектрической точки каждого конкретного антигена. Были получены данные, указывающие на отсутствие влияния величины положительного заряда поверхности твердой фазы, на сорбцию биолигандов на его поверхность [40]. Механизм этого явления можно рассмотреть на примере конкретного препарата Fе2О3 (пигмент) и активатора уксусной кислоты, используемой в виде кислого ацетатного буфера. Методика нагружения Fe2O3 биолигандами, описанная в литературе [40], сводится в основном к следующему: 50 мг оксида активируют 2 мл 0,05 М ацетатного буфера pH 4,0 в течение определённого времени. Далее препарат подвергают центрифугированию, осадок ресуспендируют в том же буфере, содержащем очень малые количества (от 1 мкг/мл до 100 мкг/мл) биолиганда. Постановка реакции сводится к раститровке подлежащего анализу биоматериала в лунках круглодонных (U, V- образных) планшетов и внесению туда хорошо гомогенизированных суспензий нагруженного пигмента (гидрозоля). При положительной реакции фиксируется агглютинация, сводящаяся к быстрому формированию агрегатов частиц Fe2O3 на дне лунки. При отрицательной реакции агглютинация отсутствует. Согласно литературе [40] оксид железа образует с уксусной кислотой и с ацетатными буферными растворами приблизительно следующего строения: [Fe3(CH3COO)6]+OH-26 комплексные соединения При последующем смешении этих соединений с растворами белков ниже их изоэлектрической точки формируется «мицелла» приблизительно следующей структуры [Fe3(CH3COO)6]+ OH-- + NH3+–R, где R–NH3+ – белковый (биолигандный) компонент. Следовательно, здесь основным инкрементом сорбции могут быть ионные взаимодействия. По мере увеличения положительного заряда в ядре мицеллы должно увеличиваться количество гидроксильных противоионов, а, следовательно, количество и прочность связывания биолиганда с Fe2O3. Для подтверждения этого предположения были взяты органические кислоты, имеющие силу (Ка, либо рКа) как меньше, так и больше уксусной кислоты, рассматриваемой в качестве базового соединения. Полученные экспериментальные данные впоследствии подтвердились на реальных системах: детекции миоглобина и антител к бледной трепонеме в сыворотке крови человека [37,43]. Иммунологическая активность препаратов, полученных практически на основе любой органической кислоты по схеме ионных связей, быстро снижается. По-видимому, чисто ионные взаимодействия при синтезе биолигандов такого типа неспецифичны, это и приводит к недостаточному уровню качества получающихся препаратов, т.е. конъюгаты быстро диссоциируют на неорганические частицы и белки [40] Природа этого явления объясняется по-разному. Согласно одной точки зрения причина состоит в десорбции сорбированных на твердой фазе биолигандов [59], согласно другой – это связано с термо-временным старением, деструкцией и денатурацией сорбированного белка [83]. Повидимому, в каждом конкретном случае превалирует тот или иной процесс. Биолиганд, в частности, – белок вполне может солюбилизироваться под влиянием растворов хлористого натрия различной ионной силы, растворов 27 типа буферов Хенкста и т.п. При этом по мере усиления процесса солюбилизации под действием ионов буферного раствора возможен полный переход биолиганда в растворенное состояние и, следовательно, его десорбция с поверхности [72]. Данный процесс естественно будет иметь экстремальный характер. При малых концентрациях ионов в буферных растворах будут превалировать десорбционные – солюбилизационные инкременты; при большой ионной силе будет иметь место высаливание биолиганда из раствора. В целом этот процесс изучен недостаточно, особенно в связи с характером связывания твердой фазы и биолиганда (ковалентным, ковалентно-гидрофобным, гидрофобным, слабогидрофобным) [40]. 1.4.3.Ковалентные инкременты в синтезе гидрозолей В литературе [15, 16, 20, 53, 54, 27] отмечается, что, наряду с нековалентным типом связывания биолиганда и твердой фазы в иммунохимии, имеется и ковалентный – "химический" тип пришивки. Отмечается, что основными преимуществами ковалентного связывания в сравнении с обычным являются: присоединения биолиганда к твердофазному носителю протекают неспецифичности более сорбции контролируемо, увеличиваются в силу более низкой чувствительность и специфичность анализа. Кроме того, при осуществлении хемосорбции существенно снижается возможность десорбции биолигандов. Существует много альтернативных способов химического связывания между поверхностью твёрдой фазы гидрозоля и иммунобиологическим препаратом, подлежащим сорбции на неё. Теоретически возможно осуществление связывания по всем типам химических реакций белков, липидов, полисахаридов друг с другом, часто используемых при синтезе разнообразных конъюгатов [40]. Фактически же имеет место ряд жёстких ограничений: не всякий биолиганд будет специфически хемосорбироваться 28 на неорганическом объекте. В литературе, посвящённой практике сорбции различных иммунохимических лигандов, описаны разные приёмы физикохимического ввода активных химических групп, например, путём сорбции модификаторов на поверхность твёрдой фазы [72]. В научной и патентной литературе имеются сведения о путях возможного химического связывания биолигандов с твёрдой поверхностью: 1. Связывание происходит по концевым –NН2 группам лизина [47] a,w – диальдегиды. O O O C R C H2N-Prot-COOH + H HOOC-Prot-N C R C - H2O H H H белок альдегид основание Шиффа. Из конкретных представителей диальдегидов наиболее широко O O C применяется глутаральдегид CH2 H 3 C H. используется как до сорбции белков на полимерную поверхность [52], так и после нее для целей повышения прочности фиксации и увеличения молекулярной массы белка. Отмечается хорошая воспроизводимость реакции. Альдегидный тип связывания имеет ряд определённых недостатков: окисление альдегидной группы в обычных условиях, что предопределяет работу по связыванию ех tempore; основания Шиффа не являются достаточно стабильными соединениями; процесс связывания протекает в узком интервале рН; альдегиды, помимо окисления склонны к полимеризации [42]; связывание только NН2 группам с твёрдой фазой может привести к конформационно невыгодному расположению антигенных центров по отношению к детектируемым антителам. "Полианионы" – это в основном полисульфоксилхлориды общей формулы ClO2S -R-SO2Cl [47]. Известны как активные реагенты для связывания двух белков по концевым NH2 группам, преимущественно по лизиновым остаткам. Ряд 29 полимеров такого типа известен в виде катионобменных смол, выпускаемых различными производителями под особыми фирменными наименованиями [80]. В принципе могут использоваться как основы для синтеза химически связанных биолигандов, однако в литературе конкретные сведения отсутствуют. 2. Связывание белка с твердой фазой по SH-группе. Известно, что катионы тяжелых металлов (ртути, свинца, висмута и подобные металлы) очень быстро реагируют с тиольными группами белков, образуя нерастворимые и чрезвычайно устойчивые связи типа [белок- S – Ме – S – белок] по механизму реакции нуклеофильного замещения. Следовательно, при наличии малорастворимых в воде и совместимых с коллоидными мицеллами ртутных, свинцовых, висмутовых производных возможен синтез необычного металлоорганического иммуносорбента. В литературе такие иммуносорбенты не описаны, хотя в принципе могут использоваться в практике твердофазных иммунохимических методов анализа [81]. 3. Связывание белка по другим боковым группам белка. Производные общей формулы R-CN [3] отличаются чрезвычайной реакционной способностью по отношению к спиртовым, тиольным, аминогруппам различных соединений, в том числе и белков. В присутствии кислоты типа НСI или НВr способны взаимодействовать так же и с карбоксильными группами с образованием гидрогалогенидимидов [40]. Представляют теоретический и практический интерес как удачные компоненты иммуносорбентов. Диазосоединения солеобразные вещества, в R[N=N]+НаI [46] водном растворе представляют почти собой полностью диссоциированы на ионы: R[N=N]+ НаI- и имеют нейтральную реакцию. Являются чрезвычайно активными по отношению к иммунохимическим лигандам соединениями. Возможны их реакции с концевыми –SH, -ОН и – 30 NH2 группами, легкопротекающие в среде близкой к нейтральной. Они также легко взаимодействуют с фенильными и другими соединениями ароматического, гетероциклического, имидазольного, индольного ряда. Использование диазопрепаратов в качестве основы для синтеза иммуносорбентов известно и описано в литературе. В частности, описано присоединение белка к целлюлозе через диазосвязь [12]. Опубликованы работы относительно синтезов иммуносорбентов типа «колонка» и латексов, в которых биолиганды присоединены к твёрдой фазе посредством диазосвязь [37,41]. 4. Связывание белка по –СООН группе. Азиды – RN3, где R – любой органический радикал, в частном случае – ацильный [46]. Эти соединения легко связываются с белками и другими лигандами как по NH2, так и по COOH концевым группам. Реакция протекает гладко в буферных системах при рН, близком к нейтральному. Химическое – ковалентное связывание иммунопрепарата и твердофазного иммуносорбента типа мицелла гидрозоля может существенно усилить чувствительность и избирательность последующего иммунохимического, в частности, гидрозольного анализа. Ряд других типов химического связывания биолигандов и иммуносорбентов типа «коллоидная частица» мало исследованы и практически не представлены в доступной литературе. Таким образом, необходимо дальнейшее совершенствование серологической диагностики путём поиска носителей антигенов и антител, у которых отсутствует собственная антигенность и которым свойственна стабильность при длительном хранении. Разрабатываемые диагностические методы должны обладать высокой чувствительностью, специфичностью, скоростью прохождения реакции, простотой техники её постановки и экономичностью. серологической В связи диагностике с этим перспективным заболеваний можно направлением считать в разработку гидрозольных препаратов (Мешандин А. Г., 1997), представляющих собой 31 коллоидные растворы оксидов и гидроксидов «переходных металлов» таблицы Д. И. Менделеева, на поверхности которых адсорбированы биоспецифические компоненты, в частности, антигены либо комплементарные им антитела. Первый опыт применения диагностикумов из этой группы в качестве иммуносорбентов в эпиднадзоре за холерой в Дагестане и Чеченской Республике (Ефременко В. И. с соавт., 1996) показал их высокую надёжность и эффективность, избирательное концентрирование инфекционного агента, возможность исследования сильно заражённых объектов. Заключая приведённые в настоящей главе данные, необходимо отметить, что диагностика заболеваний, несмотря на большое количество предлагаемых методов, используемых для определения антигенов и специфических антител, остаётся актуальной проблемой и требует своего дальнейшего усовершенствования. 32 ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для поставленных в работе задач были проведены исследования с применением существующих базовых методов бактериологических и серологических - твёрдофазного иммуноферментного (ИФА), иммунохемилюминесцентного (ИХЛА), иммунохроматографического и нового гидрозольного агглютинационного анализов (РГЗА). Гидрозольные диагностикумы были изготовлены на кафедре общей химии Кировской ГМА, под руководством зав. кафедрой д.т.н., профессора Мешандина А.Г. 2.1.Материалы исследования Работа выполнена на кафедре общей химии ГБОУ ВПО КГМА в период с 2007 по 2012 г.г. Ряд исследований проведены на базах ОАО НПП «АВИВАК» (С.-Петербург); НИИ Гриппа РАМН (С.-Петербург); клинических лабораторий больниц: ФГУ ЛИУ – 12 по Кировской области и КОГБУЗ Кировской областной клинической больницы. Объектами исследований являлись гидрозольные реагенты, используемые в реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА). Для исследования нами были изготовлены гидрозоли, нагруженные нативными и генно-инженерными антигенами (с целью выявления антител в сыворотке крови) и мышиными моноклональными антителами к бетасубъединице ХГЧ (с целью обнаружения антигена), состав которых был следующим: 33 2.1.1.Твёрдофазные носители Таблица 1 - Твердофазные носители в качестве основы для гидрозольных диагностикумов Тип пигмента, формула Плотность, Размер частиц, г/см3 нм 1,92 80-200 Синий 4,73 200-500 Коричневый Цвет Гексацианоферрат (II) железа (III) или «берлинская» лазурь Fe4[Fe(CN)6] 3 Оксид железа Fe3O4 2.1.2. Модификаторы Модификатор, осуществляющий хемосорбцию белка по NH2–группе лизина и по SH– группе цистеина с неорганической твёрдой фазой, представлен в таблице 2 [48]. Таблица 2 - Модификатор для твердой фазы гидрозольных диагностикумов № 1. Наименование Хлорид ртути (II) (сулема) Механизм взаимодействия Формула SH HgCl2 S 2+ + Hg Pt SH Hg2+ Pt S 2.1.3. Биолиганды, использованные в работе На поверхности микрочастиц препарата адсорбируется по определенной технологии различные биолиганды – антигены или антитела, специфичные конкретному маркеру (таблица 3). 34 Таблица 3 - Биолиганды, использованные в РГЗА № 1. Тип биолиганда Область применения Лизат антигенов гепатита псовых (Киров, ГСХА) Для диагностики инфекционного гепатита у животных Антигены вирусов гриппа (H5N1) (вируса 2. птичьего гриппа), производства НИИ гриппа РАМН, Санкт - Петербурга Для диагностики птичьего гриппа Рекомбинантные антигены туберкулёза, полученные с помощью генно-инженерных 3. технологий (BL(DT3)/pCFP-ESAT), Для диагностики туберкулёза Покровский завод биопрепаратов, Владимирская область Комплексный туберкулезный антиген – 4. диагностикум ППД производства Санкт - Для диагностики Петербургского НИИ вакцин и сывороток туберкулёза им. Мечникова Моноклональные антитела к бетасубъединице хорионического Для диагностики 5. гонадотропина человека, ООО беременности у женщин «Прогрессивные биомедицинские технологии», Москва 2.1.4. Биологические материалы Для исследования в качестве биологических материалов использовали гепаринизированную кровь подопытных привитых и непривитых животных, 35 сыворотки крови больных людей с верифицированным диагнозом, сыворотки крови и мочу беременных женщин, сыворотки крови и мочу здоровых доноров в объёме 8 - 20 мкл. Сыворотку получали путём центрифугирования крови, допускалось взятие крови капиллярным способом. Результаты проведённых исследований согласуются с требованиями всемирной организации здравоохранения, в соответствии с которыми диагнозы устанавливались с использованием действующих стандартных методов оценки факта наличия антител к - птичьему гриппу, туберкулёзу и антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). 36 2.2. Методы исследования 2.2.1. Реакция гидрозольной агглютинации Методика по изготовлению гидрозолей для исследования состояла из нескольких этапов. Сначала выполняли синтез твёрдых фаз: Fe4 [Fe(CN)6]3 и Fe3O4. Далее твёрдые фазы модифицировали 2% НgСl2, после чего осуществляли хемосорбцию исследуемых биолигандов. Принцип реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА) заключался в следующем: протекающая на молекулярном уровне реакция взаимодействия антигена с антителами должна приводить к развитию явлений, доступных наблюдению невооружённым глазом. Эту задачу удаётся решить, опираясь на факты множественности антигенных детерминант, а также на наличие двух областей связывания антигена у каждой молекулы антитела. Если частицы нагрузить антителами, то в силу бивалентности антител происходит их связывание или агглютинация. Образование даже небольших агрегатов приводит к их быстрому и хорошо заметному осаждению из суспензии. При смешивании разбавленных сывороток или крови со взвесью таких поливалентных частиц даже ничтожная концентрация антигена достаточна для возникновения заметной агглютинации. Она обнаруживает себя, тем, что частицы не оседают на сферическое дно лунки планшета в виде маленького сгустка, а выстилает ровным слоем всю поверхность твёрдой фазы (лунок планшета). При визуализации реакции на фильтровальной бумаге «красная лента» мы получали следующую картину: при положительной реакции – плотный, компактный комплекс с чёткой границей; при отрицательной реакции – распределение частиц реагирующих веществ без чёткой границы в виде пятна. Для проведения реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА) нами были изготовлены гидрозоли нагруженные антигенами (с целью выявления антител в сыворотке крови) и антителами (с целью обнаружения антигена). 37 Работа состояла из следующих этапов: - синтеза твёрдых фаз; - синтеза модификатора; - приготовления растворов для титрования сывороток крови и гидрозолей; - разведения подлежащих тестированию сывороток для последующего анализа; - постановки реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА). 2.2.2. Методики синтезов твердых фаз 2.2.2.1. Синтез гексацианоферрата (III) железа (II) Fe4[Fe(CN)6]3 или «берлинской лазури» Синтез осуществляли путём одномоментного смешения 0,01М растворов FeCl3 и K4[Fe(CN)6]3 , причём раствор K4[Fe(CN)6]3 брали в избытке (20%- 25% по объёму), по отношению к объёму раствора FeCl3. Полученный, исключительно стабильный «золь» коллоидного раствора «берлинской лазури» (БЛ) использовали в дальнейшем для синтеза диагностикумов. Достаточно разбавленный раствор 0,01М К4[Fe(CN)6] при интенсивном перемешивании вводили в FeCI3 аналогичной концентрации. При этом брали избыток K4[Fe(CN)6] для того, чтобы обеспечить отрицательный заряд гранулы получающегося коллоидного раствора, либо избыток FeCI3 для обеспечения положительного заряда гранулы (рисунок 1). Рисунок 1 - Строение коллоидной частицы гексацианоферрата (III) железа (II) Fe4[Fe(CN)6]3 3K4[Fe(CN)6] + 4FeCl3 12KCl + Fe4[Fe(CN)6]3 m[Fe4[Fe(CN)6]3]n[Fe(CN)6]4-4(n-x)K+4x-4xK+ m[Fe4[Fe(CN)6]3]nFe3+3(n-x) Cl-3х+3x Cl- 38 Наличие [Fe(CN)6]4--, либо Fe3+ в качестве потенциалопределяющего иона, предопределяет возможность ионного взаимодействия между ним и различными химическими модификаторами: катионами тяжёлых металлов. - для приготовления раствора хлорного железа (III) на аналитических весах отвешивали 0,135 гр. FeCl3*6H2O (препарат должен быть сухой, если он увлажнен, рекомендуется его лиофилизация в мягких условиях) и растворяли его в 24,865 мл дистиллированной воды. Далее разводили в дистиллированной воде в соотношении 1мл концентрата FeCl 3 – 49 мл дистиллированной воды. - для приготовления раствора «желтой кровяной соли» на аналитических весах отвешивали 2,2 г K4[Fe(CN)6]*3H2O и растворяли его в 17,8 мл дистиллированной воды. Далее разводили в дистиллированной воде в соотношении 1мл концентрата – 24 мл дистиллированной воды. - для синтеза коллоидного раствора БЛ смешивали рабочие растворы (а) и (б), причем раствор (б) вливали в раствор (а). - для синтеза гидрозоля исходный коллоидный раствор БЛ вносили в количестве 1 мл в пробирку и вводили целевой биолиганд в концентрации от 5 до 250 мкг по белку. Адсорбция происходила в течение 20 – 30 минут. В ряде случаев, определяемых конкретной природой подлежащих адсорбции антигенов либо антител, необходима была активация коллоидного раствора катионами d – переходных металлов (Hg2+). - для " забивки " свободных сайтов на поверхности гидрозоля в указанный в пункте (в) объем вводили 100 мл раствора бычьего сывороточного альбумина в дистиллированной воде. 2.2.2.2.Синтез оксида железа (Fe3O4) Общее уравнение реакции: 2FeСl3+FeSO4+8NaOH=Fe3O4+6NaСl+Na2SO4+4H2O 39 Исполнение: - 5,4 г хлорного железа растворяли в 150 мл дистиллированной воды; - 2,8 г сульфата железа двухвалентного растворяли в 150 мл воды; - 5,0 г едкого натра растворяли в 50 мл воды. Первые два раствора фильтровали и сливали (соединяли) вместе - образовался раствор стехиометрического состава, соответствующий реакции осаждения. Раствор щелочи фильтровали через стеклофильтр и приливали к раствору солей. Образовывался обильный осадок Fe3O4 чёрного цвета. Промывали его несколько раз декантацией на воронке Бюхнера до PH=8,0 до окончательного удаления щелочи. Осадок на воронке Бюхнера всё время (находился) должен быть под слоем воды. Промытый осадок с фильтровальной бумагой помещали в колбу 250 мл и вносили 200 мл 0,1 N раствора соляной кислоты. Происходила быстрая пептизация осадка и образование устойчивого золя. 2.2.3. Синтез модификатора 2.2.3.1. Синтез хлорида ртути (II) НgСl2 В качестве модификатора был взят хлорид ртути (II) (НgСl2) в концентрации - 2%. Синтез гидрозольных препаратов по механизму ковалентной сорбции осуществляли следующим способом: растворяли соответствующее количество модификатора в определённом объёме воды. Далее осуществляли взаимодействие исходной твёрдой фазы с модификатором, т.е. смешивали раствор модификатора и соответствующее количество твёрдофазных носителей: Fe4[Fe(CN)6]3, Fe3O4. После этого осуществляли конденсацию модификаторов твёрдой фазы с белком биолигандом. Конденсацию осуществляли путём ввода биолиганда в виде водно-солевого раствора в модифицированный твёрдофазный носитель. Все 40 свободные «сайты» модификатора «забивали» 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) или тиосульфатом натрия. 2.2.4. Приготовление растворов для раститровки сывороток Для приготовления буферного раствора для осуществления реакции агглютинации гидрозолей отвешивали на аналитических весах 0,85 гр. хлорида калия, 0,26 г мононатрия фосфата, 0,34 г динатрия фосфата. Каждую навеску последовательно растворяли в 1 литре дистиллированной воды. С помощью иономера проверяли pH данного раствора – эта величина должна находиться в интервале рН 7,2 – 7,4. Далее вносили TWEEN – 20-500 мкл и тщательно перемешивали. Затем вносили азид натрия 100 мг, отвешенного на аналитических весах. 2.2.5. Методики разведения подлежащих тестированию сывороток для последующего анализа 2.2.5.1. Разведение 1:25 Проводили в планшетах с U-образными лунками. В верхний ряд лунок вносили 96 мкл раствора для разведения, затем добавляли в них по 4 мкл отрицательной и положительной сыворотки. В остальные лунки вносили по 50 мкл буферного раствора. Раститровывали многоканальной пипеткой по 50 мкл, начиная с первого ряда. В последние лунки сыворотки не вносили (оставляли для контроля). Затем во все лунки вносили по 50 мкл готового гидрозольного препарата. 2.2.5.2. Разведение 1:100 Проводили аналогично разведению 1:25 с той лишь разницей, что в первый ряд лунок вносили 50 мкл сывороток отрицательной и положительной (без буферного раствора), а во второй ряд - по 50 мкл 41 буферного раствора с 50 мкл сывороток. Раститровку проводили, начиная со второго ряда лунок по 50 мкл. 2.2.2.6. Постановка реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА) Для исследования брали сыворотку крови, капиллярную кровь и мочу в объёме 8 - 20 мкл. Сыворотку получали путём центрифугирования крови, допускалось взятие крови капиллярным способом. Для постановки РГЗА использовали U-образные иммунологические планшеты, в лунках которых разводили и титровали сыворотки крови, капиллярную кровь, мочу брали без разведения. В первый и второй ряды лунок вносили раствор для разведения, затем в те же лунки добавляли сыворотку отрицательную и положительную, раститровывали одноканальным дозатором с первой лунки, последние оставляли для контроля (гидрозоль не вносился) далее вносили готовый гидрозоль. Разведения «положительной» и «отрицательной» сывороток проводили раствором для разведения в определённых титрах таким образом, чтобы объём подлежащего титрованию биопрепарата в лунке составил 50 мкл. Затем в каждое разведение добавляется 5-50 мкл гидрозольного препарата на основе «берлинской лазури» (Fe4[Fe(CN)6] 3) или оксида железа (Fe3O4), с сорбированным, конкретным антигенами или моноклональными антителами. В течение 1-20 минут производили визуальную оценку реакции. При этом в лунках с «отрицательной» сывороткой не агглютинации, а в лунках с «положительной» сывороткой происходила наблюдался осадок – крупные агломераты. Положительной реакцией иммунологического анализа считалось наличие агглютинации в лунках (точка в центре лунки) (рисунок 2). Далее из лунки по 5 мкл аналит+гидрозоль вносили на поверхность пористого фильтра, на фильтровальную целлюлозную бумагу типа «красная лента» и оценивали результат анализа. На фильтровальной бумаге при отрицательной реакции наблюдали распределение частиц 42 реагирующих веществ без чёткой границы в виде пятна, при положительной реакции образовывался плотный, компактный комплекс с чёткой границей, диаметром 2-4 мм (рисунок 3). Результаты каждой постановки в виде отдельного протокола прикладываются к протоколу осуществлённого исследования (приложение). Рисунок 2 - Реакция гидрозольной агглютинации в планшете U-образный планшет ─ + 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 А Б А – положительная сыворотка, Б – отрицательная сыворотка Рисунок 3- Визуализация результатов на фильтровальной бумаге А Б А – отрицательная сыворотка Б – положительная сыворотка 43 2.3. Статистическая обработка полученных результатов Полученные результаты обработаны статистическими методами. При сравнении качественных признаков применялся критерий Мак-Нимара, метод распределение χ2 (хи-квадрат) в электронных таблицах Microsoft Excel, Statistiсa. Для выявления вида зависимости титра от концентрации применялся регрессионный анализ [67]. Критерий Мак-Нимара применялся для сравнения значения двух качественных признаков «есть-нет» у одних и тех же больных в постановке реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА). Таблица сопряженности во всех случаях будет размерностью 2*2, она будет выглядеть следующим образом (таблица 4): Таблица 4 - Таблица сопряженности Метод второй есть нет Метод есть А В первый нет С Д При помощи распределения χ2 (хи-квадрат) определили теоретическую частоту положительных результатов эксперимента при равномерном распределении. Для проверки гипотезы определяется экспериментальное значение 2; по формуле: 2 эк. = (| В-С | – 1)2 В+С Критическое значение определяется аналогично обычному критерию хиквадрат: 2 кр.(; f=1). Число степеней свободы здесь всегда равно 1, так как размерность таблицы сопряжённости минимальная (2*2). Корреляции устанавливали и подтверждали методом расчета коэффициента корреляции. Различия считали статистически значимыми при p< 0,05. 44 2.3.1. Методы оценки эффективности диагностических исследований Для определения диагностической ценности тестов, использованных в работе рассчитаны операционные характеристики: диагностическая чувствительность (Se), диагностическая специфичность (Sp). Для расчета использованы следующие формулы: Se =а/(а+с)×100%, Sp =d/(d+b)×100%, где а – истинноположительный результат, b – ложноположительный результат, с – ложноотрицательный результат, d – истинноотрицательный результат (J. Geerling, 1998). 45 ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Установление факта заболевания с учётом специфического иммунного ответа имеет важное практическое значение. В настоящее время серологические методы применяются в клинической практике не только для подтверждения диагноза у больных, но и при эпидемиологических исследованиях. Несмотря на большое число разработанных серологических методов диагностики, использование большинства из них ограничено либо из-за сложности, либо из-за больших экономических затрат. В связи с этим назрела настоятельная необходимость разработки и/или усовершенствования уже имеющихся серологических реакций, которые имели бы высокую специфичность и чувствительность, низкую себестоимость, были бы просты в исполнении. В данной работе была изучена диагностическая ценность разработанной реакции гидрозольной агглютинации в сопоставлении с методами, широко применяемыми в практическом здравоохранении. Предлагаемая реакция применялась как при определении антител в сыворотке крови, капиллярной крови здоровых и больных (в этих случаях она ставилась с антигенным гидрозольным диагностикумом), так и для выявления антигена хорионического гонадотропина человека в сыворотке и моче (при этом использовали антительный гидрозольный диагностикум). В качестве основ гидрозольных препаратов брали два препарата - оксид железа (Fe3O4) и «берлинскую лазурь», а также различные виды биолигандов -нативные и генно-инженерные антигены, моноклональные антитела- для адсорбции их на поверхности указанных коллоидных растворов, в результате были проведены и получены: 46 -экспериментальные данные по определению антител к инфекционному гепатиту псовых, оценка поствакцинального иммунитета; -экспериментальные данные по определению антител к вирусу H5N1 (птичьего гриппа) в сыворотке крови; -экспериментальные данные по определению антител к M. Tuberculosis (туберкулёз) в сыворотке крови; -экспериментальные данные по определению антигена хорионического гонадотропина (ХГЧ) в сыворотке крови и моче. 3.1.Исследование гидрозольных препаратов в задачах выявления антител к вирусу гепатита псовых в сыворотке крови Для определения эффективности РГЗА при диагностике вирусного гепатита у собак с применением двух гидрозолей нами была изучена частота обнаружения сывороточных антител и их уровень у 5 непривитых и 6 – привитых собак, спустя 3-9 месяцев после прививки (образцы крови были предоставлены ветеринарной клиникой г. Кирова). Первый антигенный гидрозольный диагностикум взят на основе гексацианферрата II железа III (Fe 4 [Fe(CN) 6] 3), или «берлинская лазурь», второй - оксида железа (Fe3O4), на поверхности, которых адсорбировали антиген вируса гепатита псовых (по выше указанной методике) в соотношении 10 мкг антигена по белку (1мг/мл) на 1 мл исходного гидрозоля. Таким образом, получали – гидрозоли, с которыми проводили реакцию гидрозольной агглютинации. Подлежащую тестированию гепаринизированную капиллярную кровь собак титровали с двойным шагом в лунках U-образных полистирольных планшетов, начиная с разведения 1:25. В первый ряд лунок вносили 192 мкл раствора для разведения, затем в те же лунки добавляли сыворотку отрицательную и положительную по 8 мкл; в остальные ряды вносили по 100 мкл буфера и производили титрование кровь+буфер по 100 мкл в параллельные ряды 47 лунок, последние лунки оставляли для контроля (гидрозоль не вносился). Далее в лунки вносили по 20 мкл гидрозоля, содержимое перемешивали. Затем учитывали результат: в лунках самого планшета в интервале от 0,5 до 5 минут и на фильтровальной бумаге, путем переноса по 5 мкл смеси кровь+гидрозоль на фильтровальную целлюлозную бумагу типа «красная лента» с подложкой. Для эксперимента брали разведения: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600. Данные полученных серопозитивных и серонегативных результатов в РГЗА представлены в таблице 5. Таблица 5 - Выявляемость антител к вирусу гепатита псовых в сыворотке крови привитых собак с гидрозольными препаратами Гидрозольные препараты на основе: Гексацианферрата II Объекты исследования железа III («берлинской Оксида железа (Fе3O4) лазури») (Fe 4 [Fe(CN) 6] 3) Привитые собаки от «+» - результаты в «+» - результаты в гепатита псовых: 6 проб реакции гидрозольной крови агглютинации в титре от агглютинации в титре от 1:25 до 1:400 Контрольная группа - «-» - результаты в реакции гидрозольной 1:25 до 1:200 «-» - результаты в непривитых собак: реакции гидрозольной реакции гидрозольной 5 проб крови агглютинации агглютинации Время реакции 1-10 Цвет реакции – синий минут Цвет реакции коричневый Диагностические титры специфических антител определялись в 6 пробах у всех привитых собак с обоими гидрозолями. При этом установлено, что 48 определяемый максимальный титр специфических антител к вирусу гепатита псовых с гидрозолем на основе «берлинской лазури» достигал величины 1:400, а с оксидом железа (Fe3O4) – 1:200. Так, титр антител с помощью первого гидрозоля выявлялся в 2 раза выше (р<0,01), чем со вторым (таблица 6). Таблица 6 - РГЗА в выявлении антител к вирусу гепатита псовых Группа Привитые Непривитые 6 0 0 5 Есть Наличие реакции реакция Нет реакции Достоверность отличий между группами в РГЗА по критерию хи-квадрат составил p=0,007. Таким образом, сравнивая полученные из такой небольшой выборки данные РГЗА с помощью вышеперечисленных объектов, установлены условно - диагностические титры для суммарных антител к вирусу гепатита псовых у вакцинированных собак (от 1:25 до 1:400). Кроме того, было установлено, что результативность реакции с гидрозолем «берлинской лазури» выше в сравнении с реакцией с гидрозолем оксида железа (Fe3O4). 3.2. Исследование гидрозольных препаратов в задачах выявления антител к вирусу H5N1 (птичьего гриппа) в сыворотке крови Испытание производились на базе лабораторий Биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН г. Санкт-Петербурга и ГМА г.Кирова. Для обнаружения антител в сыворотке крови проводили РГЗА только на основе «берлинской лазури», модифицированной 49 катионами Hg2+,на поверхности которого адсорбировали специфические, в нашем случае гриппозные антигены. Готовили три гидрозоля с различным содержанием антигена H5N1: 1-й - 5 мкг, 2-й - 50 мкг, 3-й - 100 мкг по белку (10мг/мл) на 1 мл исходного гидрозоля. Подлежащие тестированию сыворотки (10 мкл) с двойным шагом в лунках U-образных полистирольных планшетов титровали от 1:20 до 1:1280. Далее вносили в лунки по 20 мкл гидрозоля и через 2-10 минут производили учет результатов. Его осуществляли путем переноса по 5 мкл смеси сыворотка+гидрозоль на фильтровальную бумагу. Результаты сведены в таблицу 7. Таблица 7 - Зависимость обратного титра сыворотки от концентрации антигена в гидрозоле Обратный титр концентрация 1: 10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 0,05% (5 мкг в 1000 мкл р-ра) 0,5% (50 мкг в 1000 мкл р-ра) 10,00% (100 мкг в 1000 мкл р-ра) + + + + + + + + + + + + _ _ _ _ + + + _ _ _ _ _ Исходя из данных таблицы, была построена диаграмма 1 зависимости обратного титра сыворотки от концентрации антигена в гидрозоле. 50 Диаграмма 1 - Зависимость обратного титра от соотношения биолиганда (H5N1) и коллоидного раствора «берлинской лазури» Был выполнен анализ распределения частот положительных результатов эксперимента при различных концентрациях антигена и различных значениях обратного титра с помощью метода χ2. Были получены значения χ2эмп. 6,0 и 20,0 соответственно. Следовательно, распределения частот положительных результатов эксперимента при различных концентрациях антигена и обратном титре отличаются от нормального (р ≤ 0,05 и ≤ 0,01). Наибольшая частота положительных результатов эксперимента была получена при концентрации антигена 0,05% и при обратном титре 1:1280. При исследовании влияния концентрации антигена в гидрозоле на РГЗА были получены достоверные отличия (p=0,024). Количество «+» реакций с первым препаратом составили 100%, со вторым – 50% и с третьим - 30%. На основании полученных данных было установлено, что чем выше концентрация биолиганда в гидрозоле, 5 мкл - 50- мкл - 100 мкл, тем титр обнаруживаемых антител ниже (1:1280 – 1:80 – 1:40 соответственно) и чаще наблюдалось ухудшение иммунохимических свойств препарата. Это можно объяснить наличием стерических факторов. При этом необходимо отметить, что отрицательные сыворотки, изучаемые в настоящей работе, не проявляли 51 каких-либо тенденций агглютинации с изучаемым гидрозольным препаратом. Таким образом, нами было найдено оптимальное соотношение биолиганда и гидрозоля на основе «берлинской лазури» 5 мкг антигена (H5N1) на 1 мл гидрозоля. Также нами определён максимальный титр специфических антител к вирусу птичьего гриппа в РГЗА - 1:1280, при этом наблюдалось чёткое различие между положительной и отрицательной реакциями. 3.3 Исследование гидрозольных препаратов в задачах выявления специфических антител к M. Tuberculosis В настоящее время туберкулёз является опасным инфекционным заболеванием. Его распространение, в том числе в Российской Федерации с 1991 года, является крайне негативным социальным фактором. Естественно, наряду с профилактикой данного заболевания, значительная роль принадлежит его эффективной и своевременной диагностике. Из существующих методов диагностики туберкулёза можно указать на микробиологические методы, инструментальные (флюорография, рентген), выходящие за пределы компетенции настоящей работы, и иммунологические методы (ИФА, ПЦР и др.). Основными сегодняшний методами день, к выявления возбудителя сожалению, остаются туберкулёза на традиционные микробиологические методы - микроскопия мазка и культуральные исследования (посев). Характеризуются высокой специфичностью, чувствительность метода посева равна 80-90%, метода микроскопии ниже – не более 50% от всех больных туберкулёзом. При проведении микроскопии методом Циля – Нильсена, в 1 мл мокроты должно содержаться от 5000 и более микробных клеток. Этот метод не позволяет определить видовую принадлежность выявленных кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) и 52 специфически идентифицировать возбудителя ТБ. Культуральный метод позволяет выявить МБТ при наличии в 1 мл исследуемого материала нескольких десятков жизнеспособных особей. Но к недостаткам метода можно отнести его высокую стоимость, сложность обработки диагностического материала, а также медленный рост микобактерий туберкулёза, результатов обуславливающий исследования необходимость длительного ожидания (от 14 дней до 12 недель). ИФА – иммуноферментный анализ – определения противотуберкулёзных антител не имеет самостоятельного диагностического значения, что обусловлено недостаточной чувствительностью и специфичностью метода, для которого характерны неэкспрессность, дороговизна приборов и комплексных наборов реактивов. ПЦР - полимеразная цепная реакция – высокая специфичность – 99,8% и чувствительность – более 85% в испытаниях, однако при применении в клинике эти цифры оказались ниже. Это объясняется высокими требованиями к условиям проведения анализа, исключающий перекрёстный перенос фрагментов молекул ДНК (РНК); сложностями, связанными с экстракцией ДНК (РНК) из инфекционного материала, кроме того стоимость аппаратуры и тест – наборов делает этот метод дорогостоящим [1,2,3,4]. Экспресс – диагностика : LEBI internаtional CША, Amni Sure Франция, Identa Corp. Израиль и др. – эти методы дороги и не могут быть использованы для массового обследования в Российской Федерации. Многие годы ведётся интенсивный поиск антигенных детерминант, присущих только M. Tuberculosis и позволяющих дифференцировать вакцинальный иммунитет, развивающийся в результате вакцинации БЦЖ, иммунные реакции на нетуберкулёзные микобактерии и M. Tuberculosis. Обнаружить антигены, свойственные только M.Tuberculosis, удалось лишь после завершения исследования по первичной структуре её генома. Установлено, что M. Tuberculosis кодирует синтез двух секреторных белков 53 ESAT-6 и CFP-10, которые отсутствуют у M. bovis и большинства непатогенных микобактерий [65]. На сегодняшний день диагностические затруднения при туберкулёзе общепризнаны. В свою очередь, от раннего выявления больных зависит предупреждение эффективность распространения лечебных и заразных форм профилактических заболевания и мероприятий. С возникновением осложнений возможности выздоровления от ТБ снижаются, а исходы запущенного процесса могут приводить к инвалидности. Раннее выявление больных осуществляется, как говорилось выше, всеми видами активного медицинского поиска в порядке массового обследования всего населения. Необходимым условием успеха профилактики является внедрение в медицинскую практику методов, которые обладали бы требуемой специфичностью и чувствительностью, достоверностью результатов, простотой применения и низкой стоимостью, одновременно могли бы обеспечить экспрессность исследования искомого компонента. В этом направлении проводилась наша работа, которая состояла из трёх этапов. Разработанные нами диагностические препараты для выявления микобактерий туберкулёза исследованы в лабораторных и клинических условиях. Целью наших исследований являлось максимально возможное лабораторное выявление МТБ у наиболее эпидемически опасной категории больных. Сбор, хранение, транспортировку и работу с диагностическим материалом (сыворотка крови) проводили согласно приказу МЗ РФ № 109, приложение № 10 от 21.03.2003. 3.3.1 Образцы крови были предоставлены клинико-диагностическими лабораториями г.Кирова ОКП Туберкулёзного диспансера и г. КировоЧепецка ОР-218 ГУИН РФ. На первом этапе формировали панели сывороток крови, взятых от 16 пациентов с установленным диагнозом - туберкулёз, подтверждённый 54 клинико-лабораторными методами. Из них 90,0% от бациллярных больных с активной формой легочного туберкулёзного процесса и 10,0% от пациентов с внелегочной формой туберкулёза (туберкулёз среднего уха, мочевого пузыря, лимфаденит). В качестве контрольной группы взяли 48 образцов сывороток здоровых доноров, возраст которых составлял от 25 до 55 лет. РГЗА проводилась как на основе «берлинской лазури», так и оксида железа (Fе3O4). В каждом случае синтезировали гидрозоли с нативными антигенами ППД и рекомбинантными антигенами туберкулёза (BL(DT3)/pCFP-ESAT) по вышеуказанной методике. Получали четыре вида гидрозолей: гексацианферрат железа с адсорбированным рекомбинантным антигеном туберкулёза (BL(DT3)/pCFP-ESAT), гексацианферрат железа с ППД антигеном, оксид железа (Fе3O4) с рекомбинантным антигеном туберкулёза (BL(DT3)/pCFP-ESAT), оксид железа (Fе3O4) с ППД антигеном. Предварительно исследуемые сыворотки крови больных и здоровых доноров титровали от 1:20 до 1:2560. Данные, полученные при изучении серопозитивных и серонегативных результатов к M. tuberculosis, представлены на диаграмме 2. Диаграмма 2 - Сравнительная характеристика гидрозольных препаратов в РГЗА 55 Результаты постановок на первой панели показали, что все гидрозоли фиксируют наличие специфических антител к M. Tuberculosis, и чувствительность теста, выражающаяся в величине обратного титра, различна. При этом наиболее высокие титры в серопозитивных пробах были выявлены с гидрозолями на основе «берлинской лазури» и оксида железа (Fе3O4) с адсорбированными рекомбинантными антигенами (1:2560 и 1:1280 соответственно, Р<0,001). В сравнении с гидрозолями на основе «берлинской лазури» и оксида железа (Fе3O4) с адсорбированным нативным антигеном титры антител были ниже (1:640 и 1:160 соответственно, Р<0,05). Анализируя показатели выявления титров специфических антител к M. Tuberculosis, установлены наиболее выраженные отличия в РГЗА с гидрозолем на основе «берлинской лазури» с адсорбированными рекомбинантными антигенами. 3.3.2. На втором этапе, учитывая данные первых испытаний для реакции гидрозольной агглютинации, рекомбинантными использовали антигенами только два (BL(DT3)/pCFP-ESAT), гидрозоля с которые адсорбировали и на «берлинскую лазурь», и на оксид железа (Fе3O4). Мы исследовали панели сывороток от 20 больных с клинически подтверждённым диагнозом туберкулёза, 20 здоровых доноров. В отличие от первой группы параллельно у 10 из них была исследована капиллярная кровь. Данные исследования представлены в таблице 8. 56 Таблица 8 - Данные проведённого исследования панелей сывороток методом гидрозольной агглютинации на базе КДЛ г. Кирово-Чепецке ОР-218 РФ № п/п, биоматериал Год Дата Клинические Результат взятый для рождения установлен- формы. гидрозоль- исследования больного ного диаг- Результат ной реакции ноза микробиологич в сыворотке еских методов. и капилляр. крови («берлинская лазурь») 1.Больной №1 1966 г. 30.10.08 г. Очаговый Взята сыворотка туберкулёз(ТБ) Взята капиллярная в/д лев. Лёгкого кровь в фазе инф-ии положительн. МБТ(-) 2. .Больной №2 1980 г. 23.10.08 г. Инф. ТБ в/д Взята сыворотка прав. Лёгкого Взята капиллярн. МБТ(-) положительн. кровь 3. Больной №3 1958 г. 16.10.08 г. Очаговый ТБ в/д Взята сыворотка лев. Лёгкого в Взята капиллярн. фазе инф-ии кровь МБТ(-) 4.Больной №4 1952 г. 14.10.08 г. положительн. Инф. ТБ в/д Взята сыворотка прав. лёгкого Взята капиллярн. МБТ(-) положительн. кровь 5. Больной №5 1943 г. 08.10.08 г. Инф.ТБ в/д Взята сыворотка прав. лёгкого Взята капиллярн. МБТ(-) кровь 57 положительн. 6. Больной №6 1962 г. 30.09.08 г. Инф. ТБ в/д Взята сыворотка прав. лёгкого Взята капиллярн. МБТ(-) положительн. кровь 7. Больной №7 1987 г. 19.09.08 г. Инф. ТБ в/д Взята сыворотка прав. лёгкого Взята капиллярн. МБТ(-) положительн. кровь 8. Больной №8 1987 г. 15.07.08 г. Очаговый ТБ в/д Взята сыворотка справа в фазе Взята капиллярн. инф-ии. Инф. ТБ положительн. кровь слева в ф. инфии.МБТ (-) 9. Больной №9 1951 г. 27.05.08 г. Взята сыворотка Инф.ТБ в/д лев. лёгкого МБТ(-) положительн. Взята капиллярн. кровь 10. Больной №10 1976 г. 28.08.08 г. Взята сыворотка Инф. ТБ в/д лев. лёгкого МБТ(-) положительн. Взята капиллярн. кровь 11.Больной №11 1975 г. Взята сыворотка выявлен04.07 Инф.ТБ в/д года правого лёгкого положительн. в фазе распада (МБТ+) 12. Больной №12 1971 г. выяв. 09.06 г. Взята сыворотка Инф. ТБ в/д прав. лёгкого в фазе распада и отсева в в/д левого лёгкого МБТ(+) 58 положительн. 13. Больной №13 1960 г. выяв.02.08г. Взята сыворотка Инф. ТБ в/д левого лёгкого положительн. в фазе распада МБТ(+) 14. Больной №14 1984 г. выяв.12.06г. Взята сыворотка Инф. ТБ S6 прав. лёгкого положительн. МБТ(+) 15. Больной №15 1986 г. выяв.12.06г. Взята сыворотка Инф. ТБ в/д лев. лёгк. в ф. распад положительн. МБТ(+) 16. Больной №16 1982 г. выяв.03.06г. Взята сыворотка Инф. ТБ в/д прав. лёгкого в положительн. фазе распада МБТ(+) 17. Больной №17 1985 г. выяв. 04.08г. Взята сыворотка Инф. ТБ в/д лёгк. в ф. распад положительн. МБТ(+) 18. Больной №18 1982 г. выяв.2005г. Взята сыворотка Инф. ТБ в/д лёгк положительн. в фазе распада МБТ(+) 19. Больной №19 1977 г. выяв.03.06г. Взята сыворотка Инф. ТБ в/д правого лёгкого в ф. распад.и от- положительн. сева в в/длев.лёг МБТ(+) 20. Больной №20 1976 г. выяв.2002г. Взята сыворотка Инф. ТБ в/д обоих лёгких положительн. МБТ(+) Сравнивая показатели, полученные в РГЗА, мы обнаружили, наиболее выраженные достоверные отличия между двумя гидрозолями. Гидрозоль на основе оксида железа (Fе3O4), с адсорбированными рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT) в данном испытании в капиллярной крови 59 не сработал, в сыворотке крови проявил слабую агглютинабельность – 10% от общего количества обследуемых. По результатам этой серии испытаний высокую чувствительность и специфичность показал гидрозольный препарат на основе «берлинской лазури» с рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT) как в сыворотке, так и в капиллярной крови. Реакцию агглютинации наблюдали со всеми сыворотками от 20 пациентов в разведении 1:1000 и капиллярной крови от 10 больных - в разведении 1:100. Статистическую обработку в данном случае провели следующую: для сравнения двух качественных признаков – «есть» или «нет», определённых у одних и тех же больных, выполнили с помощью критерия Мак – Нимара [67] (таблица 9). Таблица 9 - Сравнение двух методов Метод второй есть нет Метод есть А=10 В=0 первый нет С=10 Д=0 Для проверки гипотезы определяется экспериментальное значение 2; по формуле: 2 эк. = (| В-С | – 1)2 = (0- 10) – 1) 2 В+С 0+10 = (-9) 2 = 8,1 10 Где эк. – экспериментальное Критическое значение определяется по таблице 2,исходя из числа степеней свободы f=1 и уровня значимости по таблице: =0,05 2 кр.=3,8 =0,01 2 кр.=6.6 =0.001 2 кр.=10.8 Где кр.- критическое 60 В итоге было выявлено, что экспериментальные значения критерия больше критического, с вероятностью ошибки менее 0,01 (<1%). Таким образом, можно с достоверностью более 99% (мощность критерия >0,09) утверждать, что предложенный метод диагностики позволит выявить антитела к M.tuberculosis при различной локализации возбудителя. 3.3.3. На третьем этапе для подтверждения результативности РГЗА нами было проведено сравнение результатов наличия противотуберкулёзных антител в качественных тестах, в параллельных исследованиях титры антител определялись в реакциии гидрозольной аглютинации (РГЗА) и в иммунохроматографической реакции (ИМХР) с тест – полосками с коллоидным золотом - производства ВНИИБП ФМГА (Всероссийского научно-исследовательского института биологического приборостроения ФМГА г. Москвы). Было проведено тестирование 44 проб клинического материала (сыворотки крови) от больных различными формами туберкулёза различной локализации с бактериологически подтверждённым диагнозом. В контрольную группу вошли 40 образцов, из которых взяли: 20 пациентов с заболеваниями сходных локализаций, но не имеющих туберкулёза в анамнезе (больные с хроническими бронхитами, бронхиальной астмой и другие); 20 – здоровые доноры. В данном случае в РГЗА использовали оптимальный с нашей точки зрения гидрозоль - «берлинскую лазурь» с адсорбированными рекомбинантными осуществлялась антигенами с заведомо (BL(DT3)/pCFP-ESAT). положительными и Постановка отрицательными сыворотками крови в титрах 1:20-1:200 по вышеописанной методике. В ходе исследования нами были определены ложноположительные и ложноотрицательные результаты, выявленные сравниваемыми методами в одних и тех же пробах сывороток крови (таблица 10). 61 Таблица 10 - Ложноотрицательные и ложноположительные результаты, выявленные сравниваемыми методами в одних и тех же пробах сывороток крови у здоровых и больных лиц Кол-во Диагноз Ложноотрицательные проб результаты РГЗА ИМХР (ВНИИБП) Туберкулёз лёгких 37 3 9 Туберкулёз гортани 3 1 1 Туберкулёзный спондилит 2 0 2 Туберкулёз внутригрудных узлов и 1 0 0 1 0 1 пальца кисти Туберкулёзный менингит Ложноположительные результаты Пневмония (нетуберкулёзной 3 0 1 Бронхиальная астма 13 1 3 Аллергический альвеолит 1 0 0 Бронхит 3 0 0 Здоровые доноры 20 0 0 этиологии) При выявлении специфических противотуберкулёзных антител в зависимости от локализации M. Tuberculosis мы обнаружили, что в РГЗА, в сравнении с ИМХР, ложноотрицательные результаты наблюдались меньше (4 и 13 соответственно), также меньше и ложноположительные результаты у лиц с заболеваниями нетуберкулёзной этиологии (1 и 4 соответственно). Анализируя показатели выявления специфических антител, было установлено, что РГЗА, в сравнении с ИМХР, позволила повысить 62 результативность серодиагностики туберкулёза в этой группе больных в 3,2 раза (р <0,05) и увеличить расшифровку диагноза до 13,4%. Данные полученных результатов обследования здоровых и больных лиц туберкулёзом представлены в таблице 11. Таблица 11 - Обобщение полученных серопозитивных и серонегативных результатов в РГЗА и ИМХР Культуральный Реакция гидрозольной Иммунохроматографический и микробиол- агглютинации (РГЗА) метод (ИМХР) (тест-полоски на гический методы основе коллоидн. золота) положительный отрицательный Положительный положительный отрицательный 40 4 31 13 39 1 36 4 79 5 67 17 44 сыворотки Отрицательный 40 сывороток Общий результат 84 сывороток Чувствительность 91% (40/44) 70% (31/44) Специфичность 98% (39/40) 91% (36/40) При сравнении полученных данных исследования на тест-полосках с коллоидным золотом (ВНИИБП ФМГА) и нами изготовленного гидрозольного реагента было установлен следующий факт. Последний показал чувствительность 91% (40/44) и специфичность 98% (39/40), а также хорошую корреляцию результатов с данными культурального и микробиологического методов (общая согласованность данных =96,6%). При этом аналогичные показатели для тест-полосок были ниже. Результаты расчёта чувствительности сравниваемых реакций имели преимущество РГЗА перед ИМХР (показатель чувствительности составил 91,0% и 70,0% соответственно). 63 Для проверки этого предположения сравнили экспериментальные значения (таблицы 12-14). Таблица 12 - Сравнение РГЗА с культуральным методом Культуральный Реакция гидрозольной и микробиол- агглютинации (РГЗА) гический положительный отрицательный методы Положительный 40 4 39 1 44 сыворотки Отрицательный 40 сывороток Достоверность отличий культурального метода и реакции гидрозольной агглютинации р<0,001. Таблица 13 - Сравнение культурального метода и ИХМР Культуральный Иммунохроматографический и микробиол- метод (ИМХР) (тест-полоски на гический основе коллоидн. золота) методы положительный отрицательный Положительный 31 13 36 4 44 сыворотки Отрицательный 40 сывороток Достоверность отличий культурального метода и ИМХР р< 0,002. 64 Таблица 14 - Сравнение РГЗА и ИХМР Реакция Иммунохроматографический гидрозольной метод (ИМХР) (тест-полоски на агглютинации основе коллоидн. золота) (РГЗА) положительный отрицательный Положительный 31 13 36 4 40 сыворотки Отрицательный 39 сывороток Экспериментальные значения критерия больше критического, таким образом, РГЗА отличается от ИМХР с вероятностью ошибки р< 0,002. Проведённая статистическая обработка экспериментальных данных показала, что у больных туберкулёзом, диагноз которых подтверждён бактериологическими методами, выявляемость серопозитивных пациентов с помощью нового метода (РГЗА) выше, чем в методе сравнения (р< 0,002). Исходя из полученных результатов, нами была рассчитана чувствительность применяемых серологических реакций по формуле, предложенной J. Geerling. Как показали расчёты, чувствительность метода ИМХА составила 70%. Чувствительность метода РГЗА была достоверно выше и превышала 90%, и специфичность соответственно (диаграммы 3,4). 65 Диаграмма 3 - Чувствительность различных методов в диагностике туберкулёза Диаграмма 4 - Специфичность различных методов в диагностике туберкулёза Полученные данные свидетельствуют о том, что РГЗА обладает достаточной специфичностью и чувствительностью. В связи с этим представляется целесообразным применение РГЗА с целью серодиагностики туберкулёза, особенно при обследовании больных с внелёгочной формой туберкулёза. 66 В ходе исследований мы провели сравнительной анализ результатов традиционных и экспресс-анализов и их технико-экономическое обоснование, которые показывают явные преимущества применения реакции гидрозольной агглютинации в выявлении антител к микобактерии туберкулёза. Сравнительная характеристика методов представлена в таблице 15. Таблица 15 - Сравнение методов диагностики туберкулёза № п/п Метод 1. Культивирование МТБ 2. Время детекции Выявляемость Литературный источник 1-3 мес. 0,5-14 % Туберкулинодиагностика 72 ч 67 % Чутаев Ю.П. с соавт, 1996 3. Микроскопия 2,5 ч 14 % Канюк А.Н., 1995 4. ИФА 3ч 76 % Ефременко Е.В. 5. Гексацианферрат II железа III с адсорбированным рекомбинантным антигеном Оксид железа (Fе3O4) с адсорбированным рекомбинантным антигеном 1-10 мин. 91% Собственные 6. Полученные данные Клименко М.Т. с соавт, 1987 исследования 1-10 мин. свидетельствуют 69 % о том, что наиболее эффективным диагностикумом в выявлении анитител к M. Tuberculosis как в сыворотке крови, так и в капиллярной является гидрозоль - гексацианферрат II железа III («берлинская лазурь»), с адсорбированными рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT). 67 Таким образом, лабораторные исследования нового набора реагентов (гидрозоля) показали, что он обладает высокой чувствительностью (91%) и позволяет определять в образцах крови специфические антитела в титре от 1:100 до 1:2560. Кроме того, результативность РГЗА, в сравнении с микробиологическими методами, выше в 1,6 раза. Немаловажным является и тот факт, что обнаружение противотуберкулёзных антител возможно у больных с различной локализацией патологического процесса. Учитывая полученные результаты проведённого исследования, можно говорить о том, что разработанные нами гидрозольные антигенные диагностикумы могут с успехом использоваться с целью экспресс – диагностики туберкулёза. 3.4.Экспериментальные данные по определению антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) В последнее время накопилось большое количество данных о целесообразности включения в широкую практику методов экспрессной диагностики ХГЧ (хорионического гонадотропина человека), основанных на выявлении антигена. Преимуществами этих методов является: простота и экспрессность постановки, экономичность, отсутствие сложной аппаратуры. Несмотря на большое количество реакций, предлагаемых для обнаружения антигенов, до сих пор ведутся поиски более простых, чувствительных и специфичных, приемлемых для практического здравоохранения методов. Наши исследования были направлены на изучение ценности РГЗА для выявления антигена ХГЧ в сыворотке крови и моче беременных женщин. С этой целью мы использовали реакцию гидрозольной агглютинации с антительным диагностикумом. Образцы сывороток крови и мочи были предоставлены клиникодиагностической лабораторией г. Кирова областной клинической больницы. Нами было исследовано 259 образцов сывороток крови и 287 проб мочи 68 беременных женщин. Концентрация ХГЧ (от 31 мМЕ/мл до 281000 мМЕ/мл) была ранее определена (хемилюминесцентный иммунохемилюминесцентным анализатор CENTAUR) в методом различные сроки беременности (от 1 до 39 недель). В качестве референсного метода для выявления ХГЧ в моче также использовали тест - полоски со специфическими моноклональными антителами мечеными коллоидным золотом, производство ООО «Прогрессивные Био-Медицинские Технологии» г. Москва. Разведение «положительной» и «отрицательной» сывороток проводили в буферном растворе в U – образном планшете в титрах 1:100 и 1:1000. Мочу брали без разведения. В качестве отрицательных образцов взяли сыворотку и мочу мужчин. В данной работе в качестве твёрдой фазы использовали те же гидрозольные реагенты: гексацианферрат II железа III и оксид железа (Fе3O4), на поверхности которых адсорбировали по определённой технологии моноклональные антитела к бета-субъединице ХГЧ. Выбор оптимального соотношения биолиганда и раствора «берлинской лазури» и оксида железа (Fe3O4) остановили на - 250 мкг антител на 1 мл исходных коллоидных растворов. Получали диагностикум – гидрозоль. После чего проводили реакцию гидрозольной агглютинации. осуществляли качественную оценку результатов, фиксировали Далее на фильтровальной бумаге. Исследование проводили параллельно с сывороткой крови и мочой беременных женщин. При визуализации реакции на фильтровальной бумаге «красная лента» мы получили следующую картину: при положительной реакции – плотный, компактный комплекс с чёткой границей; при отрицательной реакции – распределение частиц реагирующих веществ без чёткой границы в виде пятна (рисунок 4). 69 Рисунок 4 - Результаты в РГЗА на основе «берлинской лазури» и оксида железа по выявлению ХГЧ 70 Данные исследования сведены в таблицу 16. Таблица 16 - Сравнение экспериментальных данных различными методами Методы исследования Моча 40 «-» 87 «+» Сыворотка в Сыворотка разведении разведении 1:100 1:1000 в 30 «-» 59 «+» 30 «-» 59 «+» Реакция агглютинации с «берлинской - + - + - + - + - + - + - + - + лазурью» Реакция агглютинации с оксидом железа (Fe3O4) Хемилюминисцентный Исследование тест не проводили ИМХР (тест-полоски с коллоидным золотом) - Исследование не проводили + Сопоставляя показатели РГЗА с гидрозолями на основе «берлинской лазури», оксида железа (Fe3O4) с другими методами (хемилюминисцентный тест, ИМХР с тест-полосками на основе коллоидного золота), мы не обнаружили существенных различий при определении содержания хорионического гонадотропина человека в сыворотке крови и в моче беременных женщин. Проведённая статистическая обработка полученных данных показала, что результаты исследования при использовании сравниваемых методов хорошо коррелируют (р=0.921), достоверных отличий по биологическим жидкостям не выявлено (таблица 17). 71 Таблица17 - Сравнение РГЗА и ИМХР Берлинская Традиционные методы лазурь (имунохроматографический тест) Моча Есть Наличие реакции реакция Нет реакции Сыв.1:100 Сыв.1:1000 87 59 59 40 30 30 Достоверных отличий по биологическим жидкостям нет р=0.921. Резюмируя выше изложенные результаты собственных наблюдений, можно заключить следующее: 1. Имеется явная положительная корреляция в выявлении антигена ХГЧ в моче как при помощи теста с использованием коллоидного золота, так и при помощи гидрозольной агглютинации. 2. Такая же положительная корреляция наблюдается при детекции антигена ХГЧ в сыворотке крови как при помощи гидрозольного метода, так и в хемилюминисцентном анализаторе (CENTAUR). 3. Не выявлено существенных различий в определении ХГЧ как в сыворотке, так и в моче при помощи гидрозолей, как на основе «берлинской лазури», так и с оксидом железа (Fe3O4). Судя по данным этой серии экспериментов, можно рекомендовать последующую паспортизацию и изучение обоих гидрозолей. В то же время скорость постановки с гидрозольными препаратами и бесприборность позволяют рекомендовать их для тестирования антигена ХГЧ, альтернативным тест-полоскам на основе коллоидного золота. Из представленных данных можно сделать заключение, что исследованные нами гидрозольные препараты применимы для определения ХГЧ как в сыворотке крови, так и в моче, обладают требуемой специфичностью и чувствствительностью, достоверностью результатов, 72 простотой примененения, одновременно обеспечивают экспрессность исследования искомого компонента. 3.4. Обоснование экономической целесообразности внедрения РГЗА в практику здравоохранения и ветеринарии Определённый интерес представляет изучение экономической эффективности использования реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА) в серологической диагностике инфекционного гепатита у собак, птичьего гриппа, туберкулёза, хорионического гонадотропина человека. Известно, что техника постановки РГЗА почти полностью совпадает с техникой постановки РПГА. В связи с этим стоимость анализов будет различаться лишь по стоимости применяемых диагностикумов. Так, на сегодняшний день стоимость эритроцитарного диагностикума, необходимого для постановки одного анализа РПГА, составляет 3,3 доллара США, тогда как стоимость гидрозольного антигенного диагностиума, полученного нами в экспериментальных условиях и необходимого для постановки одного анализа РГЗА – 0,3 доллара США. Дальнейшее усовершенствование технологии получения гидрозольного диагностикума и серийный его выпуск в промышленных условиях позволит ещё более сократить затраты на его производство и приведёт к ещё большему экономическому эффекту. К преимуществам гидрозольного диагностикума, в сравнении с эритроцитарным, относится также значительное увеличение срока его хранения (срок хранения эритроцитарного диагностикума – 12 месяцев; гидрозольного, в нашем случае, срок наблюдения – 1,5-2 года). Реакция гидрозольной агглютинации высокочувствительным, является специфичным, простым не в требующим постановке, больших экономических затрат, экспрессным методом серологической диагностики, 73 что позволяет рекомендовать его к внедрению в практическое здравоохранение и ветеринарию. Результаты сравнительной характеристики традиционных и сочетанных анализов и их технико-экономическое обоснование показывают явные преимущества применения гидрозольных препаратов с последующим проведением экспресс-анализов (скрининга). Внедрение в практику РГЗА, наряду с методами, используемыми в настоящее время в лабораториях, позволит улучшить расшифровку инфекционных заболеваний. Всё это будет способствовать улучшению диагностики туберкулёза, гепатита псовых, птичьего гриппа, более раннему назначению адекватного противоэпидемических лечения и мероприятий, своевременному проведению предотвращающих дальнейшее распространение этих инфекций. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ ГИДРОЗОЛЕЙ В КЛИНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ На сегодняшний день гидрозольные препараты апробированы в диагностике самых разнообразных нозологий – туберкулеза, птичьего гриппа, гепатит псовых. Имеются положительные заключения сторонних организаций: ОАО НПП «АВИВАК» (г. С.-Петербург); НИИ Гриппа РАМН (г. С.-Петербург); Клиническая лаборатория больницы ФГУ ЛИУ – 12 по Кировской области. Результаты экспериментов, проводимых в сторонних организациях, приводятся в соответствующих копиях актов заключения, прилагающиеся к настоящей диссертационной работе. Эти акты получены исходя из методик и рекомендаций настоящей диссертационной работы. Результаты научных исследований использованы для разработки методических рекомендаций (положений) в рамках темы: «Лазурь», 74 выполненной по заказу Федерального медико–биологического агенства (ФМБА) Минздравсоцразвития РФ, для оформления проекта технических условий и инструкции по применению. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Огромное количество научных исследований, проводимых во всём мире и посвящённых проблемам диагностики инфекционных заболеваний, свидетельствует о неослабевающем интересе к данной проблеме. До сих пор туберкулёз широко распространён среди населения и наносит огромный экономический и социальный ущерб. При этом M. Tuberculosis высокоустойчива во внешней среде, а также всё более наблюдается рост антибиотикорезистентных форм. Разнообразие клинической картины зачастую вызывает трудности в постановке диагноза и своевременном проведении комплекса необходимых лечебных и противоэпидемических мероприятий. В связи с этим ведущее значение в диагностике инфекционных заболеваний сохраняют лабораторные методы исследования, среди которых главную роль играют классические бактериологический и серологические методы диагностики. В настоящее время разработаны и предложены к внедрению в клиническую практику многочисленные методы, позволяющие выявлять специфические антитела и антигены в различных бисубстратах больных. Однако использование большинства предлагаемых методов ограничено или из-за сложности постановки, отсутствия стандартных коммерческих препаратов, реагентов, оборудования, или из-за подтверждения диагноза только в поздние сроки, или из-за больших экономических затрат. 75 Наиболее достоверный бактериологический метод также не лишён недостатков: трудоёмкость, длительность исследования, использование для выделения микобактерий дорогостоящих питательных сред, получаемых из ценного пищевого сырья. Поэтому в настоящее время требуется новая тактика лабораторных позволяющая выявлять исследований контингенты и необходима повышенного диагностика, риска патологий, методические приемы, в том числе упрощенные для массовых исследований и контроля реабилитации. Всё выше сказанное выше определило направления наших исследований, которые они были посвящены разработке гидрозольных антительных и антигенных диагностикумов. В наши задачи вошло также проведение оценки эффективности реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА) с антигенными нативными и рекомбинантными диагностикумами для выявления специфических антител в сыворотке крови обследуемых и антительным диагностикумом, предназначенным для обнаружения антигенов хорионического гонадотропина человека. Клинические исследования были проведены у 11 животных: из них 5 привитых от инфекционного гепатита, 6 с диагнозом птичий грипп; у 202 больных туберкулёзом и здоровых доноров: из них 24% с нелегочной локализацией M. Tuberculosis; у 289 беременных женщин с определением хорионического гонадотропина человека не только в сыворотке крови, но и в моче. Полученные результаты свидетельствовали о том, что РГЗА с рекомбинантными антигенами, адсорбированными на «берлинской лазури», в сравнении с адсорбированными нативными антигенами также на «берлинской лазури», показывали титр антител в 2 раза выше (Р<0,05). Было установлено, что те же антигены, адсорбированные на оксиде железа (Fe3O4), определяли титры антител в 1,5 раза меньше (Р<0,01). По результатам обследования здоровых и больных пациентов нами были 76 установлены условно-диагностические титры в РГЗА. Так же определены оптимальные концентрации антигенов в гидрозолях, чем выше была она, тем чаще наблюдалось ухудшение иммунохимических свойств препарата, что можно объяснить наличием стерических факторов. Проведённые серологические исследования у больных туберкулёзом с легочной и внелегочной локализациями показали, что применение РГЗА, в сравнении с традиционными методами диагностики, позволило повысить результативность серодиагностики в этой группе в среднем в 1,2 раза (Р<0,001). При сопоставлении обнаружения специфических антител в параллельно проводимых исследованиях в РГЗА и ИМХР отмечались наиболее достоверные отличия между показателями. Чувствительность метода РГЗА была достоверно выше и превышала 80%, увеличивалась до 91%, когда в ИМХР составила 70%. Вышеперечисленные данные свидетельствуют о том, что РГЗА обладает достаточной специфичностью и чувствительностью. В последнее время многими исследователями доказана целесообразность применения методов экспрессной диагностики, основанных на выявлении антигенов в различных биосубстратах. Однако до сих пор ведутся поиски более простых, чувствительных и специфичных, приемлемых для практического здравоохранения методов индикации антигенов. Нами была апробирована РГЗА с антительным диагностикумом с целью выявления антигенов хорионического гонадотропина человека. При этом брали два гидрозоля на основе гидрозоля показали «берлинской лазури» и оксида железа (Fe3O4), оба высокую сопоставимость, воспроизводимость, чувствительность и специфичность. Таким образом, исходя из представленных экспериментальных и теоретических данных, можно сделать заключения. В работе доказано, что коллоидный раствор на основе гексацианоферрата (II) железа (III) и оксида железа (Fe3O4), можно использовать в качестве экспрессных бесприборных 77 диагностикумов для детекции различных видов маркёров. Доказано, что именно ковалентная “пришивка” белка к данной твёрдой фазе обеспечивает воспроизводство иммунохимических свойств. Данные препараты могут служить основой для разработки большого количества бесприборных диагностических систем и могут использоваться там, где требуется выявить феномен взаимодействия антигена с антителом. Это может использоваться не только в медицине, но и в ветеринарии (выявление таких патологий у животных, как инфекционного гепатита у собак). Кроме этого, все исходные материалы: оксиды металлов, компоненты буферных растворов относятся к наименее опасному – IV классу опасности химических реагентов. Данные препараты безвредны для человека. ВЫВОДЫ 1. Разработан и апробирован новый иммунохимический метод гидрозольной агглютинациии (РГЗА) на основе «берлинской лазури» и оксида железа (Fe3O4) для выявления специфических антител к возбудителям: гепатита псовых, птичьего гриппа, туберкулеза как в сыворотке крови, так и в капиллярной крови. 2. Гидрозольные диагностикумы с нативными и генно-инженерным антигеном применимы в случае выявления антител к M. tuberculosis. Сравнивая гидрозоли различного состава, были обнаружены преимущества использования препарата на основе «берлинской лазури» с генноинженерным антигеном. Во-первых, он обеспечивает сохранность специфических иммунохимических свойств диагностикума в течение одного года, в то время как диагностикум на основе «берлинской лазури» с нативным антигеном лишь в одномесячный иммунохимической активности. период специфической Во-вторых, по совокупности иммунохимических свойств «берлинская лазурь» с адсорбированным генно78 инженерным антигеном является наиболее универсальным определителем, обеспечивающим лучшую дифференцировку «+» и «-» результатов. Втретьих, данная гидрозоль обладает высокой чувствительностью (91%) и позволяет определять в образцах крови специфические антитела в титре от 1:100 до 1:2560. Кроме того, немаловажным является и тот факт, что обнаружение противотуберкулёзных антител возможно у больных с различной локализацией патологического процесса. 3. Разработаны новые диагностические препараты на основе «берлинской лазури» и оксида железа (Fe3O4), нагруженные мышиными моноклональными антителами к бета субъединице ХГЧ для выявления антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в сыворотке крови и в моче беременных женщин. Положительная корреляция наблюдалась при детекции антигена ХГЧ в исследуемых сыворотках в титрах от 1:100 до 1:1000 и в неразведенной моче при помощи обеих гидрозолей. 4. Диагностическая ценность реакции гидрозольной агглютинации с антигенным и антительным диагностикумами определяется высокой специфичностью (в среднем 98%) и чувствительностью (91%), простотой постановки, минимальных информативность затратах. серологической Её использование диагностики повышает заболеваний: гепатита псовых, птичьего гриппа, туберкулеза и диагностики беременности. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. С целью повышения качества лечебной помощи медицинским и ветеринарным специалистам рекомендуется гидрозольные препараты использовать как скрининговые тесты в диагностике самых разнообразных нозологий – туберкулеза, птичьего гриппа и гепатита псовых. 2. Материалы исследований внедрены и используются в учебном процессе на кафедре общей химии Кировской медицинской академии при чтении 79 лекций и проведении практических занятий со студентами лечебного и педиатрического факультетов. 3. Теоретические положения, методики расчета и результаты исследований диссертации использованы в отчете о НИР по договору № 14-06/11-К от 20 июня 2011г. Результаты научных исследований использованы для разработки методических рекомендаций (положений) в рамках темы: «Лазурь», выполненной по заказу Федерального медико–биологического агенства (ФМБА) Минздравсоцразвития РФ, для оформления проекта технических условий и инструкции по применению. Предполагается выпуск теста для диагностики туберкулеза на профильных предприятиях ФМБА. 4.Техника полностью постановки совпадает реакции с гидрозольной техникой агглютинации постановки реакции почти пассивной гемагглютинации. В связи с этим стоимость анализов будет различаться лишь по стоимости применяемых диагностикумов. Так, стоимость эритроцитарного диагностикума, необходимого для постановки одного анализа РПГА, составляла 20 рублей или 0,70 доллара США, тогда как стоимость гидрозольного антигенного диагностикума, полученного нами в экспериментальных условиях и необходимого для постановки одного анализа, 5 рублей или 0,17 доллара США. Серийный выпуск в промышленных условиях позволит сократить затраты на его производство и приведёт к еще большему экономическому эффекту. 4. Благодаря оптимизации свойств компонентов гидрозольного препарата появляются такие необходимые качества, как высокая чувствительность и специфичность, длительность сроков хранения, простота считывания результатов, возможность ставить реакции с малыми объемами биоматериала. В результате получены рекомендации по синтезу и оптимальному применению гидрозолей, которые могут представлять интерес для практического здравоохранения, биотехнологии и возможно спецслужб. 80 ветеринарии, промышленной СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИ 1. Усовершенствование методик выявления инфекционных и соматических па-тологий при помощи реакции гидрозольной агглютинации /Попова С.В., Мешандин А.Г., Ворона М. В. и др. // Информационный лист № 43-024-08. – Киров: ЦНТИ. – 2008. – С. 1-2. 2. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных бесприборных диагностикумов в выявлении антител к М.tuberculosis /Попова С.В., Мешандин А.Г., Плехов В.Л. и др. // Материалы V съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. – Москва: РАН. – 2008. - С. 283-284. 3. Попова С.В., Мешандин А.Г. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных бесприборных диагностикумов в выявлении антител к M.tuberculosis, птичьего гриппа, определение ХГЧ // Вятский медицинский вест-ник.– Киров: КГМА. – 2009. - № I. - С.117. 4. Попова С.В., Мешандин А.Г., Ворона М. В. Изучение коллоидных растворов на основе гексацианферрата железа в качестве возможных диагностических препаратов// Вятский медицинский вестник. – Киров: КГМА. – 2009. - № I. - С.111. *5. Попова С.В., Мешандин А.Г. Применение метода гидрозольной агглютинации в диагностике туберкулёзной инфекции //Российском биомедицинский журнал.– 2009.- № 10.- С. 478-491. *6. Попова С.В., Мешандин А.Г. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных диагностикумов в ветеринарии // Ветеринарный врач. – 2010. - № 4 - С. 24-26. *7. Попова С.В., Мешандин А.Г., Ворона М. В. Экспрессный бесприборный метод гидрозольной агглютинации //Вестник РГМУ.– 2010.специальный выпуск 2.- С. 536-537. 81 *8. Попова С.В., Мешандин А.Г., Ворона М. В. Диагностические препараты на основе коллоидного раствора гексацианферрата железа и оксида железа // Сборник научных трудов. – Самара: СГМУ. – 2010. - С. 263264. * - публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ 82 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Ерохин В.В. Микробиологические методы диагностики туберкулёза/ В.В. Ерохин, В.И. Голышевская, Э.В.Севастьянова //М.- Тверь – ООО Издательство «Триада», 2008,С. 22-23, 24-25, 32-33 . 2.Степанян И. Э. Диагностика туберкулёза органов дыхания в клинике внутренних болезней/ И. Э. Степанян// Центральный НИИ туберкулёза РАМН - М. 2008.-С 1. 3.Планц Стентон Медико-биологическая статистика/ Планц Стентон// М.:Практика.-1998.-С.314-418. 4. Степанян И. Э. Микробиологические методы диагностики туберкулёза/ Степанян И. Э. // М.:Триада.- 2008.-С 24-25, 32-33. 5. Степанян И. Э. Лабораторная диагностика туберкулёз/ Степанян И. Э.// М.:Триада.-2008.С 22-23. 6.Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии/А.И. Карпищенко//С-Пб.: Интермедика.- 2002.-С. 217-227, 577-578. 7.Беленький Е.Ф., Рискин И.Ф. Химия и технология пигментов / под ред. Л.Ф. Корсунского.- 4-е изд., Л.: Химия, 1974.- 656 с. 8. Губаревич Г.М. Адсорбционные свойства ультрадисперсных углеродных материалов / Г.М.Губаревич, Н.М.Костюкова, И.С.Ларионова, Л.И.Полева // Доклад 5 Всесоюзного совещания по детонации. Красноярск. – 1991.- Т. 1. с.112-116. 9.Новиков Н.В. Влияние состава поверхности на свойства алмазных поликристаллов / Н.В.Новиков, В.Г Алешин и др. // ДАН СССР. – 1988. Т.300. - №5. - с. 1122-1126. 10.Воюцкий С.С. Курс коллоидной химии / 2-е. изд.,- М.: Химия. - 1975. 512 с. 83 11.Гаврилова Е.М., Гомогенный иммуноферментный анализ – новое направление иммунохимии // Журн. Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. -1982.- Т.27. № 4. М.: Химия. - с. 90-96. 12.Гнутова Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений. М., Наука, – 1993, – с.102-104. 13.Глик Б.Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение/ Б. Глик, Д. Пастернак// М.: Мир.- 2002.-С 589. 14. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия/ С.Н. Щелкунов// Новосибирск: Сиб. унив.- 2004.-С 496. 15.Долматов В.Ю. Ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза. Получение, свойства, применение. – С-Пб.: Изд-во СПбГПУ. -2003. – 254 с. 16.Думанский А. В. Учение о коллоидах / 3 –е изд., М. - Л. Госхимиздат. 1988. - 416 c. Ю. Я. 17.Думпес Диагностические экспресс-тесты на твёрдофазных носителях для медицинских биохимических анализов // Рига.: Медицина.1986. - 198 с. 18.Егоров А.М., Диков М.М. Структура и механизм действия антител // Журн. Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 1982.- Т.24. №4. М.: Химия. - с.21-28. 19.Егоров А.М. Теория и практика иммуноферментного анализа / Ф.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова,- М. - Высшая школа. - 1991. – 271с. 20.Ефременко В.И. Опыт применения магноиммуносорбентных диагностикумов в эпиднадзоре за холерой в Дагестане и Чеченской Республике / В.И. Ефременко, В.И. Таран, Е.И. Афанасьев. Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 1996.-№3. М.: Синфо.-с.73-75. 21.Жуков И.И. Коллоидная химия, ч. 1. - Л. - изд. ЛГУ им. А.А. Жданова. 1949.- 324 с. 84 22.Заикина Н.А. и др. Иммунобиотехнология. Учебное пособие/ Н.А.Заикина, В.А.Галынкин, А.В. Гарабаджиу - СПб: Изд-во «Менделеев», 2005.- 155 с. 23.Иванов А.М. Диагностические возможности иммуноферментного анализа в диагностике раннего нейросифилиса / А.М.Иванов, А.В.Самцов, И.Н.Теличко, И.Ю.Крутецкая, И.И.Волков // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И. Мечникова, 26-28.03.2002 г. – М.: Росиненс. – 2002, том 3. – 325 с. 24.Иванов А.М. Оптимизация серологической диагностики сифилиса: дис… д-ра мед. наук: 14.00.11, 03.00.07. – С-Пб. - 2005.- 216 с. 25. Лефковитса И. Иммунология. Методы исследований / под ред. И. Лефковитса; пер. с англ. А.И. Маца.-М.: Мир. - 1983.-348 с. 26. Зильбера Л.А. Иммунохимический анализ / под ред. действ. чл. АМН СССР проф. Л.А. Зильбера. М.: Медицина. - 1968.- 300 с. 27. Ленхоффа Г. Иммуноферментный анализ / под ред. Г.Ленхоффа, Т.Т.Нго пер. с англ. С.В. Калугера - М.: Мир. - 1988.-444 с. 28. Уорда А.М. Иммунохимия в клинической лабораторной практике / под ред. А.М.Уорда, Дж.Т.Уичера. пер.с англ. А.М. Авербаха.- М.: Медицина. 1981.- с.59-69. 29.Карякин Ю.В. Ангелов И.И. Чистые химические вещества / 4-е изд. М.: Химия. - 1974.- 409 с. 30.Кислицын Ю.В. Определение противомозговых антител в крови больных с опухолями головного мозга методом гидрозольной иммуноагглютинации / Ю.В. Кислицын, А.Г. Мешандин. Журн. Неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова.- 2000.- т. 100. №5. М.: изд. Медиа сфера. с. 58-59. 31.Коллинз У.П. Новые методы иммуноанализа / М.Тертон, Д.Балангхем, под ред. У.П. Коллинза, пер. с англ. М.: Мир, 1991.- с.151-154. 32.Кройт Г.Р. Наука о коллоидах / Под ред. Г. Р. Кройта, пер. с англ. И.А. Плетневой. Т. 1.- М., изд. иностр. лит. - 1955.- 538 с. 85 33.Маскет М. Физические основы технологии добычи нефти.- М.- И. - 2004. – 608 с. 34.Мешандин А.Г. Серологическая диагностика сальмонеллезов / А.Г.Мешандин, Ю.В.Золотарев Л.В.Золотарева // Клиническая лабораторная диагностика. - М.: Медицина. - 2001.- № 1.- с. 52-53. 35.Мешандин А.Г, Ванеева Л.И. Проблемы потери активности сорбированных лигандов в гетерогенном иммуноферментном анализе / Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1994.- №4.- М.: С-инфо.- с. 52-55. 36.Мешандин А.Г. Возможность применения гидрозольных препаратов в практике гематологии и трансфузиологии //Актуальные вопросы трансфузионной и клинической медицины. Материалы науч. конф. - Киров.1997. - с.56-57. 37.Мешандин А.Г., Матвеев А.Г. О возможности бесприборной экспресс диагностики инфекционных заболеваний // Труды VI Всерос. Съезда микробиологов, эпидемиологов, паразитологов – Н. Новгород.-1991. - Т.2. с.226 . 38.Мешандин А.Г., Матвеев А.Г. Латексные тест-системы- основа для создания бесприборных диагностикумов // Труды раб. совещ. Состояние диагностики бактериальных инфекций. Оболенск. - 1989.-с.143. 39.Мешандин А.Г., Мальщукова А.А. Постановка реакции гидролизной агглютинации по тестированию вирусных нозологий на нетканом материале // Вятский медицинский вестник. – 2003. - №3. - с.87-90. 40.Мешандин А.Г. Гидрозольные препараты в диагностике различных инфекционных и соматических патологий / Паллиативная медицина и реабилитация. - 1997. - №1.- М.: фонд Паллиативная медицина и реабилитация больных. - с.21-23. 41.Мешандин А.Г. Физико-химические аспекты сорбционных процессов при синтезе биолигандов: дис… д-ра тех. наук: 03.00.23.- М., - 1994. - 216.с. 86 42.Мешандин А.Г. Использование модифицированных полистироловых планшетов в твердофазном иммуноферментном анализе для диагностики некоторых инфекций / Л.И. Ванеева, И, П. Агапкин. Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1993.- №5.- М.: С-инфо. - с. 97-100. 43.Некрасов В.В. Руководство к малому практикуму по органической химии. - М.: Госхимиздат, 1954. - 295 с. 44.Орлова О.Ю. Мешандин А.Г. Гидрозоли: принципиально новый класс диагностических препаратов для выявления и мониторинга инфекционных и соматических патологий // Вятский медицинский вестник. –1999.-№1.- Киров.: КГМА.- с. 37-42. 45.Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Возможность применения гидрозольных препаратов в лабораторной практике./Клиническая лабораторная диагностика. - 2000.- №10.- М.: Медицина.- с.5. 46.Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Применение нового метода гидрозольной агглютинации для оценки поствакцинального противодифтерийного иммунитета / Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. Материалы II международной конференции. - СПб. - 1998.-с. 193. 47.Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Сопоставление различных видов твердых фаз при синтезе гидрозольных иммунохимических диагностикумов / Вятский медицинский вестник. - 2000.-№ 3.- Киров.: КГМА. - с. 53-58. 48.Орлова О.Ю. Исследование конъюгатов белков и нерастворимых соединений d-элементов в бесприборном иммунохимическом анализе: дис… канд. хим. наук.- С-Пб.- 2005.- 102 с. 49.Падюков Л.Н., Харитоненков И.Г. Иммунодиагностика инфекций / Руководство: "Иммунология инфекционного процесса", М.: Медицина. 1994.- с. 63-68. 50.Пасынский А. Г., Коллоидная химия / под ред. акад. В.А.Каргина. 3-е изд., М.: Высшая школа. - 1968. - 232с. 87 51.Пастер Е.У. Практикум по иммунологии / Учебное пос. для вузов-Киев.: Выща школа. - 1989.-302 с. 52.С 2 G 01 №33/551, 33/53 Пат. № 2170434 Российская Федерация. Способ агглютинационного иммунологического анализа / Мешандин А.Г. (заявитель и патентообладатель Мешандин А.Г.). - № 96118266/14; заявл. 12.09.96; // Изобретения (Заявки и патенты). – 2001. - № 19 (II ч.). -311 с. 53.Su №883053 А1, ЕР 1839560 Физико- химические аспекты сорбционных процессов при синтезе твердофазных биолигандов / Мешандин А.Г. (заявитель и патентообладатель Мешандин А.Г.). -№883053. - заявл. 30.12.88; // Изобретения (Заявки и патенты). - 1989. 54.Песков Н.П. Курс коллоидной химии. - М., - Л.: Госхимиздат. - 1940. 76с. 55.Писаренко А.Г. Курс коллоидной химии / 3-е изд. - М.: Высшая школа. 1969.- 249 с. 56.Полетаева О.А., Мешандин А.Г. Иммуноагглютинационный диагностикум на основе моноклональных антител для скрининга эпителиального опухолевого маркера в цельной крови онкологических больных / Журн. Биотехнология. - 1995.- №3-4.- М. - с. 46-47. 57. Лямкин А.И Получение алмазов из взрывчатых веществ / А.И.Лямкин, Е.А.Петров, А.П.Ершов и др. // ДАН СССР. – 1988. - Т. 302. - с. 611-613. 58.Попечителев Е.А., Старцева О.Н. Методы иммунохимических исследований. - СПб. : СГбГЭТУ. - 1993. - с. 32-35. 59. Бургасова П.Н. Практическая иммунология/Под ред. П.Н. Бургасова, И.С. Безденежных. - М.: Медицина. - 1969. - 414 с. 60.Привалов П.Л. //Биофизика.1968 Т.13., №1., с.163-177 61.Равич- Щербо М.И. Физическая и коллоидная химия /2-е изд., М..: Высшая школа. - 1968.- с. 150-153. 62.Ребиндер П. А. Избранные труды: Поверхностные явления в дисперсных системах / Коллоидная химия, М.: Наука. - 1968.- 239 с. 88 63.Реми Г. Курс неорганической химии / Пер. с нем. к.х.н. А.И.Григорьева. Т. 2. - М.: Мир. - 1974.- 888 с. 64.Робертс Д.Д., Касерио М. Основы органической химии / Пер. с англ. Ю.Г.Бунделя. 2-е изд. - М.: Мир. - 1978.- Т.2. - 775 с. 65.Медников Б. Л. Кожная проба с препаратом Диаскинтест (аллерген туберкулёзный рекомбинантный 0,2 мкг в 0,1 мл раствор для внутрикожного введения) для идентификации туберкулёзной инфекции (пособие для врачей)/ Б. Л. Медников, Л.В. Слогоцкая Л. В.// М., 2009 г. – 32 с. 66.Сорокина З.А. Состояние калия, натрия и воды в цитоплазме клеток. Киев. 1978. С.214с 67.Сошникова Л.А., Тамашевич В.Н. Многомерный статистический анализ. М.: Юнита-Дана, 1999. С. 350. 68.Степанов Б.Н. Введение в химию и технологию органических красителей / 3-е изд. - М.: Химия. - 1984.- 589 с. 69.Строев Е.А. Биологическая химия, М.: Высшая школа. - 1986 .-500 с. 70.Теплова Н.Н. Рабдомиолиз у хирургических больных в клинике неотложных состояний: дис… канд. мед. наук: 14.00.37. - Пермь. - 2000.137.с. 71.Темпер Р.М. Иммуноферментный анализ в диагностике заболеваний / Развитие исследований по разработке иммуноферментных систем для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний. // Сборник трудов НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, М. - 1999.- с. 3-7. 72.Фримель Г. , Брок И. Основы иммунологии /пер. с нем. А.П. Тарасова; под ред. А.И. Маца. - М.: Мир. - 1986. - 254 с. 73.Харитоненков И.Г., Христова М.Л. Использование иммуноферментных методов в вирусологии / Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. - 1985.- №.6 .- с. 3-15 74.Хитров В.С., Алехин Р.М. Справочник по ветеринарным биологическим препаратам. – М.: Высшая школа. – 1973. – 315 с. 89 75.Чард Т. Радиоиммунологические методы / пер. с нем. М.С. Морозовой; под ред. Л. М. Варшавского. - М.: Мир. - 1981.- 246 с. 76.Шелудко А.Д. Коллоидная химия / пер. с болг. В.М. Муллера - М.: Мир. 1984. - 319 с. 77.Эллин Р.Д., Макензи Р. Иммунологические аспекты инфекционных заболеваний / под ред, Д.Дика; пер. с англ. А.С. Анта, М.: Медицина, 1982.574 с. 78.Adarwai A.To the question of retichal immunosozbent// Experimentia.-1971.Vol.27.-P.514-515. 79.W.P.Collins ed J.Wiley & Sons Alternative Immunoassays , //Chichester-New York-Brisbane-Toronto-Singapore, 1985. 80.Aizawa M. Immunosensors //Philos. Trans. Royal soc. London., B. Biol. Science.-1987.-Vol.316.-P.-121-133. 81.Clark R., Engvall (ELISA).Teoreoretical E. Enzyme and praktical – linked immunosorbent aspects. assay// Enzyme-Immunoassay (E.T.Maggioed.). Boca Raton, Florida.- 1981.-P.- 167-179. 82.H. R. Kruyt Colloid science .// N. Y.-[a. о.], 1949.-Vol.-1-2.-P.-52. 83.Crosignani P.G., radioimmunoassay Nakamusa R.M., A method of sodium phase untilizing polypropylene dises. // J. Clin. Endocrinof and Metabol.- 1970.- Vol .-30 .- P. 153-160. 84.Gallo D. Uses of immunofluorescence in diagnostic virology. // Amer. J. Med. Technol.- 1983. – Vol.- 49. – P, 157-161. 85.Edswall J.T. Methods of crosslinking. //J. Am. Chem. Soc. 1954.-Vol.-.76.P.3131-3138. 86.Freundlich Н., Kapillarchemie. / / Lpz., 1980.-B. 1.-P.-32. 87.Guenes Z. Factors, that can influsence of reactions antigen-antibody. //J.Biochem Physiol.-1960.-Vol..38.-P.-1235-1243. 90 88.Ichikawa E, Imagawa M. Enzyme inking of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay and immunologicol staining. // J. Immunoassay -1983. – Vol.- 4.-P.- 1399 -1401. 89.Magnusson Karl-Eric, Bartonek Eva. // Immunol. Invest.,.- 1987.- № 3.- P.227-240. 90.Goldring O. L. Detergent solubilised antigens in enzyme immunoassay with particular reference to enzyme-linked immunosorbent assey (ELISA) systems.//Immunoassay Technol.- Vol.- 2. Berlin; New York.- 1986.- P.189-213. 91.Sever John L. Future perspectives in virology – diagnosis, treatment and immunoprophylaxix.// S. Afr. Med. J. 1986.- 70, Suppl..-P. 10-16. 92.Hazen Beth W., Hazen Kevin C. Modification and application of a simple, surface hydrophobicity detection method to immune cells.// J. Immunol. Meth, 1988, 107, №2.-P.- 157-163. 93.Letonen O. Antibody connection in immunoassays//J.Immunol.Meth.-1980.Vol..-34.-P.-61-70. 94.Olownikow A Diazocrossliking in immunology.//Immunochemistry.-1967.Vol.-4-P.-77-80. 95.Parsons G. N. Antibodi-coated plastie tubes in radioimmunoassay.// Meth Enzymol .-1981.-Vol.-73.- P.-196. 96.Phillips A. P., Martin K. L. Direct and indirect immunofluorescence analysis of bacterial populations by flow cytometry. //J. Immunol. Meth., 1987, № 2, P.-219-228. 97.Pacry R. P., Love C., Detection of rubella antibody using an optical immunosenser.//J. Virol. Meth-1990.-Vol.27.-P.39-48. 98.Stewart- Tull Duncan E.S., Parant Monique. Immunopotentiators in vaccines: a drem to to a reality.//Ann. Immunol. Hung.- 1986,26.-№1.-P.- 197-223. 99.Newark N. J. Immunomedics inc receives patent on antidody-linking technology.//Appl. Genet. News.- 1987,8.- №1.P.- 8. 91 100.Stollar B. D., Rashtehian A. Immunochemikal approaches to gene probe assay // Annual. Biochem.-1987.-Vol.-161.-P.- 387-394. 101.Timpl R., Furthmayr H. //Ysolation of pure anti – collagen antibodies using a specific lmmunoadsorbent technigue, L.Ymmunitatsforsch, 1997.- P.-134, 391396. 102.Werner Georges H. Synthetic immunostimulants(excluding sulur-containing compounds).//Comp. Immunol., Microbiol., and Infect. Dieseases.-1989.-№ 2-3.P.- 131-136. 103. Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E., et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1998. – Vol.95. – P.3140-3145. 104. Bustin S.A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems// J. Mol. Endocrinol. – 2002. – Vol.29. – P.23-39. 105. Chernysh S.I., Kim S.I., Bekker G. et al. Antiviral and antitumor peptides from insects// Proceedings of National academy of science of USA. – 2002. – Vol.9. - №20. – P.12628-12632. 92 ПРИЛОЖЕНИЕ 93 94 95 СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ ......................................................................................................... РЕФЕРАТ ......................................................................................................................................... ОГЛАВЛЕНИЕ. ............................................................................................................................... ОТЧЁТ О НИР (ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ) ПРИЛОЖЕНИЕ №1-ПРОЕКТ ТЕХНИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ ПРИЛОЖЕНИЕ №2-ПРОЕКТ ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ПРИЛОЖЕНИЕ №3-ПРОЕКТОПЫТНО-ПРОМЫШЛЕННОГО РЕГЛАМЕНТА. Список исполнителей. Мешандин А. Г., д.т.н., проф. – научный руководитель работы. Попова С.В. – м.н.с. Муромцева Т.Н.- лаборант. Панкрашкина М.В. – лаборант. 96 РЕФЕРАТ Ключевые слова: реакция гидрозольной агглютинации (РГЗА), коллоидные растворы, гексацианферрат железа. Объектами исследования явились коллоидные растворы гексацианферрата железа («берлинской лазури»), на поверхности которых были адсорбированы специфические биолиганды генно-инженерные - антигены - «Диаскин-тест», аналоги белков М.Tuberculosis - BL(DT3)/pCFP-ESAT. Цель исследования. Разработать проект нормативно - технической документации – проект технических условий, проект инструкции по применению и проект опытнопромышленного регламента диагностикума на основе гидрозолей гексацианферрата железа с адсорбированными рекомбинантными антигенами для выявления антител к возбудителю туберкулеза в образцах сыворотки крови человека. Область применения: Детекция с визуализацией результатов анализа маркёров туберкулёза в биологических жидкостях человека - сыворотке крови. Практическая значимость: С помощью предлагаемых к последующей методик оказывается возможным осуществлять предварительную диагностику заболевания туберкулёзом в течение 3-7 минут, с последующей визуализацией результатов в условиях, приближенных к фельдшерско-акушерскому пункту. Проведение исследований осуществлялось в рамках темы НИР «Лазурь - 09» и «Лазурь - 10», направленных на использование гидрозолей на основе коллоидного раствора гексацианферрата железа для детекции специфических антител к М.Tuberculosis. НИР проводилась на протяжении двух лет, это позволило представить проект ТУ, проект инструкции по применению и проект опытно-промышленного регламента на производство и применение набора реагентов для выявления специфических антител к микобактериям туберкулёза в сыворотке крови пациентов «Туб-гидрозоль». Задачи НИР состояли в выявлении: 1. Наиболее оптимального антигена для синтеза гидрозоля. 2.Оптимизации его адсорбции на поверхность коллоидных частиц гексацианферрата железа. 3.Наиболее оптимального буферного раствора для осуществления реакции гидрозольной агглютинации. 4.Наиболее наглядного и оптимального иммунохимической реакции. 97 метода визуализации результатов 5. Анализ полученных результатов на панелях сывороток в реакции с гидрозольным антигенным диагностикумом. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ. 1.В качестве объектов исследования в данном сегменте исполнения НИР нами были изучены промышленно-производимые антигены-антиген ППД-Л, производимый Санкт-Петербургским НИИ вакцин и сывороток и антиген Диаскин-тест, производимый г.Покров, Владимирской обл., завод биопрепаратов. Названные антигены имеют утверждённую Минздравсоцразвития РФ документацию, используются в практическом здравоохранении in vivo. Использование данных препаратов в качестве антигенов in vivo при разработке гидрозольных препаратов ранее нигде описаны не были. Результаты проведённых нами «Диаскин-тест». исследований Последний, позволили согласно сделать нашим выбор в пользу антигена исследований, обеспечил 90% чувствительность при 95% специфичности, что существенно выше по сравнению с антигеном ППД-Л. 2.Вопросы оптимизации коллоидных частиц адсорбции антигена (Диаскин-тест) гексацианферрата железа исследовались на поверхность нами в аспекте обеспечения сохранения антигеном иммунологической специфичности, сохранения её в процессе хранения готового гидрозольного препарата. Данная задача решалась нами с использованием физической адсорбции и хемосорбции. Физическая адсорбция производилась нами путём взаимодействия аликвоты исходного коллоидного раствора с антигеном. Результаты её оказались нестабильными - в процессе хранения адсорбированного гидрозоля наблюдали неконтролируемый «дрейф» иммунохимических свойств целевого продукта, прежде всего по чувствительности. Хемосорбция осуществлялась нами с использованием катионов тяжелых металлов - Hg2+, Pb2+. В результате проведенных исследований было выявлено, что наиболее оптимальными иммунохимическими свойствами обладали гидрозоли, модифицированные названными катионами, причём катионы должны использоваться в виде малодиссоциирующих солей. Из ряда последних был выбран хлорид ртути (2), обеспечивающий наиболее оптимальный комплекс иммунохимических свойств целевого препарата - иммунохимического гидрозоля - основы визуализируемого теста. Типичная методика синтеза гидрозоля с использованием названного модификатора приведена в оригинале отчета НИР. Время операции - 20ч. 3.Полученый нами гидрозольный препарат для выявления специфических антител к M. Tuberculosis исследовался в задачах выявления и оптимизации буферного раствора для 98 разведения тестируемых сывороток. В результате проведения установлено, что наиболее оптимальным исследований было является фосфатно - калийный буфер. В состав его входят моно - и дигидрофосфат натрия в качестве буферной составляющей и хлорид калия в качестве иммунологической составляющей. Использование катиона натрия в качестве иммунологической составляющей не привели к положительным результатам. Типичная методика синтеза оптимального буферного раствора приведена в оригинале отчета НИР. 4.Интерпретация результатов иммунохимического гидрозольного анализа возможна с использованием визуального контроля реакции при постановке реакции на предметном стекле, либо путём визуализации результатов реакции на фильтровальной бумаге. Наиболее оптимальным методом интерпретации был выявлен метод визуализации результатов на фильтровальной бумаге. 5.Полученные нами образцы гидрозолей с наиболее оптимальным видом антигена, типом модификатора для хемосорбции и разводящим сыворотки буферным раствором исследовалась на панелях сывороток от: -лиц с верифицированным диагнозом « туберкулёз» различной локализации; -лиц с нетуберкулёзными заболеваниями дыхательного аппарата (пневмонии, плевриты, аллергии); -здоровых доноров. В результате проведенных испытаний были получены следующие результаты: чувствительность в панели положительных сывороток составила 90,1%, специфичность в панели доноров составила 90%. Таким образом, нами рекомендуется для проведения дальнейших внедрению гидрозольных препаратов в клинико-лабораторную практику работ по вариант гидрозольного препарата и разводящего буферного раствора, описанный в настоящем отчёте о НИР. Список, опубликованных работ. 1. Попова С.В. Усовершенствование методик выявления инфекционных и соматических патологий при помощи реакции гидрозольной агглютинации / А.Г.Мешандин , С.А.Куклина , С.В.Попова, М.В.Ворона, Е.А.Ляпустина//Информационный лист 43-024-08 -Киров:ЦНТИ, 22.09.2008. 2.Попова С.В. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных бесприборных диагностикумов в выявлении антител к M. Tuberculosis, птичьего гриппа, 99 определение ХГЧ/С.В. Попова, А.Г.Мешандин// Вятский медицинский вестник. Киров, 1,2009.-С.117 3.Ворона М.В. Изучение коллоидных растворов на основе гексацианферрата железа в качестве возможных диагностических препаратов/ М.В. Ворона, С.В. Попова// Вятский медицинский вестник. Киров, 1,2009.-С.111 4.Попова С.В. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных бесприборных диагностикумов в выявлении антител к М.tuberculosis/А.Г. Мешандин, С.В. Попова,//Сборник тезисов 5-го съезда биотехнологов. г.Москва,2009.- С283-284. 5.Попова С.В. Экспрессный бесприборный метод гидрозольной агглютинации/ С.В. Попова, М.В. Ворона, А.Г.Мешандин //Вестник РГМУ, материалы V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции. г. Москва, специальный выпуск 2,2010.-С536-537. 6. ПоповаС.В.Применение метода гидрозольной агглютинации туберкулёзнойинфекции/С.В.Попова,А.Г.Мешандин//Российском в диагностике Биомедицинский журнал, том 10, ст.21,2009.С478-491. 7. Попова С.В. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных диагностикумов в ветеринарии/ С.В. Попова, А.Г.Мешандин // "Ветеринарный врач" № 4, 2010. С 24-26. 8. Куклина С.А. Способ диагностики инфекционных заболеваний / С.А. Куклина, А.Г Мешандин., А.А. Мальщукова // Информационный листок № 24-025-06. – Киров: ЦНТИ, 2006, - 2 с. 9.Куклина С.А. Оптимизация компонентов гидрозольных препаратов для экспрессной диагностики/ С.А.Куклина А.Г. Мешандин // Вятский медицинский вестник. Киров, № 2, 2006. – С.48 10.Куклина С.А. Гидрозольные препараты для экспересс-диагностики биомаркеров / С.А.Куклина, А.Г. Мешандин // Вестник новых медицинских технологий. – 2007, Т. XIV, №2, с. 13 11.Куклина С.А. Гидрозольные препараты, изготовленные по принципам нанотехнологии в качестве экспрессных бесприборных тестов для бесприборной инфекционных и соматических патологий / С.А.Куклина, диагностики А.Г. Мешандин, А.А. Мальщукова // Вестник Российской военно-медицинской академии. С.- Петербург. – 2008, Т.23, №3, с. 488 100 101 4. ОПИСАНИЕ ПОСТАНОВКИ АНАЛИЗА Подлежащую исследованию сыворотку разводят буферным раствором для разведения в соотношении 1/50 во вспомогательной емкости (в полимерном планшете для иммунологических реакций по ТУ 64-2-278-79), общий объем образца должен составлять 50 мкл. Далее отбрасывают 30 мкл исследуемого образца, а разведённую исследуемую таким порядком сыворотку в количестве 20 мкл смешивают с 20 мкл гидрозоля в лунке иммунологического планшета и выдерживают в течение 2-3 минут. Далее забирают при помощи дозатора 5 мкл аналита и наносят на фильтровальную бумагу в режиме свободного течения. Регистрация результатов анализа производится визуально. Факт агглютинации проявляется на фильтровальной бумаге в виде чёткой точки, факт отсутствия агглютинации - в виде диффузного пятна. 5. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Специфичность. При проверке на стандартной панели предприятия («Сыворотки крови человека, не содержащие специфические антитела к возбудителю туберкулёза для проверки специфичности», утвержденной директором ООО «Биохимресурс» 10.03.2010г.), специфичность составляет 100%. Чувствительность. При проверке на стандартной панели предприятия («Сыворотки крови человека, содержащие специфические антитела к возбудителю туберкулёза для проверки чувствительности», утвержденной директором ООО «Биохимресурс» 10.032010г.), чувствительность составляет 90%. Время проведения одного анализа. Общее время экспресс-выявления специфических антител к возбудителю туберкулёза в сыворотке (плазме) крови с использованием «Набора реагентов «туб-гидрозоль» не превышает 5мин. Объем исследуемого образца. Для экспресс-выявления специфических антител к возбудителю туберкулеза в сыворотке (плазме) крови с использованием набора реагентов «Туб-гидрозоль» требуется не более 10 мкл исследуемого образца. Сравнение набора с аналогами. При разработке и апробации набора реагентов «Туб-гидрозоль» в качестве референсного изделия медицинского назначения использовались данные верифицированных диагнозов от лиц с верифицированным диагнозом «туберкулёз» и данные верифицированных диагнозов от лиц с отвергнутым диагнозом « туберкулёз», а также сыворотки крови от здоровых доноров. При проведении сравнения результатов в панеле образцов сывороток (плазм) крови пациентов с подтвержденным диагнозом «туберкулёз», лиц с отвергнутым диагнозом «туберкулёз» и доноров (больных иными заболеваниями) показана высокая корреляция (ķŗ > 0,98) между наборами реагентов «Туб-гидрозоль» и данными по диагнозу в приложении к каждому конкретному биоматериалу (сыворотке крови). 102 6. ПОКАЗАТЕЛИ ПРАВИЛЬНОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА. Показатели контроля качества анализа приведены в аналитическом паспорте (паспорте контроля качества) для каждой серии набора реагентов «Туб-гидрозоль», который является неотъемлемой частью комплекта поставки набора. В случае если в комплекте поставки набора отсутствует аналитический паспорт (паспорт контроля качества), проведение анализа не допускается. Необходимо обратиться к поставщику (производителю) набора. Следует оценивать показатели правильности определения при каждом независимом анализе. Необходимо проводить расчет (оценку) каждого параметра контроля качества анализа при каждом независимом анализе. При неудовлетворительном результате оценки правильности определения хотя бы по одному параметру результаты анализа исследуемых образцов сыворотки крови пациентов считаются недостоверными. При неудовлетворительном результате оценки правильности определения хотя бы по одному параметру следует провести повторный анализ. При повторении неудовлетворительных результатов следует обратиться к поставщику (производителю) набора реагентов «Туб-гидрозоль.». 7. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ. Потенциальный риск применения набора - класс 2б (ГОСТ Р 51609-2000). Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как исследуемые образцы сыворотки крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированный материал. Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами. Меры предосторожности-соблюдение «Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г). 8.ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ: - дозаторы со сменными одноразовыми наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости в диапазоне 100,0-0,5мкл, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3,0 %); - холодильник бытовой; - часы или секундомер; - перчатки резиновые (ГОСТ 3-88); - бумага фильтровальная лабораторная (ГОСТ 12026-76) - ножницы для вскрытия флаконов 103 -планшеты полимерные для иммунологических реакций по ТУ 64-2-278-79. 9. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ. ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА. Для проведения анализа следует использовать свежеприготовленные образцы сыворотки (плазмы) крови. Допускается также использование образцов сыворотки крови, которые хранились после отбора не более 5 суток при температуре +4-8 0 С. При необходимости более длительного хранения, исследуемые образца сывороток крови следует заморозить при тепмературе минус 200 С. Допускается однократное замораживаниеоттаивание исследуемых образцов сыворотки крови. Перед проведением анализа компоненты набора и исследуемые образцы сыворотки крови, которые хранились при температуре +4-8 0С, следует выдержать при комнатной температуре (+18-25 0С) в течение 30 мин. Замороженные исследуемые образца сыворотки (плазмы) крови следует довести до комнатной температуры (+18-25 0С). Перед использованием следует тщательно перемешать исследуемые образцы сыворотки (плазмы) крови, избегая вспенивания. Извлечь набор из холодильника, вскрыть упаковку и выдержать все компоненты при комнатной температуре (+18-25 0С) в течение 30 мин. Рекомендуется перед анализом нанести карандашом или маркером на планшет полимерный иммунологический код исследуемого образца сыворотки крови или ФИО пациента. Подготовка исследуемых образцов сыворотки крови для анализа. В U-образную лунку иммунологического планшета, внести 50 мкл буферного раствора и 1 мкл исследуемого образца сыворотки крови человека. Тщательно перемещать содержимое лунки, избегая вспенивания. Приготовленный разведенный исследуемый образец сыворотки крови следует использовать в течение 60 минут. Хранению не подлежит. Разведённая в соотношении 1/50 сыворотка готова к использованию. Условия проведения анализа. Анализ проводят при следующих климатических условиях: - температуре окружающего воздуха + 18-25 0С; - относительной влажности воздуха не более 80%. 104 105 106 Пе рв. при мен . Настоящие технические условия распространяются на Набор реагентов для выявления специфических антител к возбудителю туберкулёза в сыворотке крови пациентов, далее по тексту -Набор. 2 9 4 . 0 0 0 0 0 В состав Набора входят следующие компоненты: -аналитический паспорт (паспорт контроля качества); -буферный раствор -гидрозольный препарат с адсорбированным рекомбинантным антигеном M.tuberculosis С -положительный и отрицательный контроли - жидкие сыворотки п -инструкция по применению р Область применения - клиническая лабораторная диагностика а При использовании всего комплекта набор рассчитан на проведение 500 анализов. Пример обозначения Набора при его заказе и в документации другого изделия: «набор «Тубгидрозоль » по ТУ 9398-001-73594697-2011, код ОКП 73594697». в Технические требования: . При осуществлении анализа при помощи компонентов Набора выявляются специфические антитела к возбудителю туберкулёза в сыворотке крови в разведении 1:50. Чувствительность анализа не менее 90%, специфичность анализа – не менее 95%. № № По дп. и да та Ин в. № дуб л. Вза м. инв .№ инв .№ По дп. и да та 107 Изм. Лист № докум. Подп. Дата ТУ 9398-001-73594697-2011. №№ п.п. Наименование показателя Характеристика и норма Методы контроля 1 2 3 п. 4.1 Внешний вид Жидкость синего цвета. 1. 1.1. Гидрозоль 1.2. Буферный раствор 1.3 «Положительный и отрицательный» контроли- pH находится в пределах 7,1 в пределах 0,1 ед. pH. 2. Технические характеристики 2.1. Время проведения одного анализа Не более 5 минут мин, не более Подп. и дата 3. 3.1 Показатели правильности определения Положительный контрольный образец Наличие агглютинации в разведении (проверка чувствительности) буферным раствором 1:50 3.2 Отрицательный контрольный образец Отсутствие агглютинации в разведении (проверка специфичности). буферным раствором 1:50 п. 4.2.3.1 п. 4.2.3.2 п. 4.2.3.3 Примечание. Для определения параметра «Время проведения одного анализа (время выхода на визуально определяемую окраску), 5 мин, не более» (п.2.1.) используется положительный Инв. № дубл. контрольный образец. 1.3.1. В комплект поставки входят: Взам. Инв. № -буферный раствор -положительный и отрицательный контроли, -гидрозольный препарат с адсорбированным рекомбинантным антигеном к M.tuberculosis Подп. и дата - инструкция по применению; - аналитический паспорт (паспорт контроля качества) Инв. № подл. 108 ТУ 9398-001-73594697-2011. Изм. Лист № Подп. Дата Лист 3 1.3.2. В состав набора входят следующие компоненты: -Гидрозоль,коллоидный раствор гексацианферрата железа с адсорбированными на его поверхности специфическими генно-инжененрными антигенами M.tuberculosis, расфасованный и упакованный в стеклянный флакон - готов к использованию – 1 шт (10мл). -Буферный раствор. Расфасованный и упакованный в стекляннные флаконы, готов к использованию – 3 шт (25 мл); -Положительный и отрицательный контроли.Расфасованы и упакованы в стеклянные флаконы; готовы к использованию - по 1 шт.(по 1 мл). 1.4. Упаковка 1.4.1. Инструкция по применению Подп. и дата 1.4.2.Гидрозоль – упакован во флаконы по ТУ 64-2-10-87. Флаконы укупорены резиновыми пробками по ТУ 38.006.108-95 и обжаты алюминиевыми колпачками по ОСТ 64-009-86. 1.4.3. Буферный раствор - упакован во флаконы по ТУ 64-2-10-87. Флаконы укупорены резиновыми пробками по ТУ 38.006.108-95 и обжаты алюминиевыми колпачками по ОСТ 64-009-86. 1.4.4. Положительный и отрицательный контроли – упакован во флаконы по ТУ 64-2-1087. Флаконы укупорены резиновыми пробками по ТУ 38.006.108-95 и обжаты алюминиевыми колпачками по ОСТ 64-009-86. 1.4.5. Аналитический паспорт на набор иммунохимических реагентов. Инв. № дубл. Взам. Инв. № Подп. и дата Инв. № подл. ТУ 9398-001-73594697-2011. Изм. Лист № докум. Подп. Дата 109 Лист 4 1.4.4. Флакон с гидрозолем, флаконы с буферным раствором, флаконы с положительным и отрицательным контролями, инструкция по применению и аналитический паспорт (паспорт контроля качества) должны быть помещены в коробку из картона коробочного (ГОСТ 7933-87) размером 140х60х30 мм. 1.4.5. Коробки с наборами должны быть помещены в ящики из картона гофрированного (ГОСТ 9142-90). 1.5. Маркировка 1.5.1. На лицевую сторону компонентов набора должна быть наклеена этикетка из бумаги этикеточной (ГОСТ 7317-78) или бумаги для печати типографской (ГОСТ 9095-89) с указанием: - названия компонента. Подп. и дата 1.5.2. Коробки набора должна быть наклеена этикетка из бумаги этикеточной (ГОСТ 7317-78) или бумаги для печати типографской (ГОСТ 9095-89) с указанием (или информация наносится непосредственно на упаковку планшета индикаторного методом термопечати): - сокращенного названия набора; - срока годности; - номера серии. 1.5.3. На внешнюю поверхность коробки типографским способом наносится информация с указанием: - наименования предприятия-изготовителя; Инв. № дубл. - юридического адреса предприятия-изготовителя; - полного и сокращенного названия набора; - комплектности (состава) набора; Взам. Инв. № - условий хранения; - номера настоящих технических условий; Подп. и дата - надписи «Только для in vitro диагностики»! 1.5.4. На каждый ящик, согласно ГОСТ 14192-96, наносят манипуляционные знаки: «Биопрепараты», «Хрупкое, осторожно», «Верх», «Ограничение температуры от плюс 5 до плюс 25 0 С», «Беречь от влаги», «Беречь от нагрева», «Беречь от солнечных лучей». 1.5.5. На каждый ящик должна быть наклеена этикетка из бумаги этикеточной (ГОСТ 731778) или для печати типографской (ГОСТ 9095-89) с указанием: - наименования предприятия-изготовителя; - наименование грузополучателя и его адрес; Инв. № подл. - условий транспортирования и хранения; - массу брутто. Изм. Лист № докум. Подп. Дата ТУ 9398-001-73594697-2011 110 Лист 5 1.5.6. Графическое оформление маркировки флаконов, пакетов, коробок производят по ГОСТ 17768-90, маркировку транспортной тары – по ГОСТ 14192-96, маркировку компонентов набора и самого набора по ГОСТ 3885-73, упаковку - по ГОСТ Р 51088-97. 2. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ 2.1. Потенциальный риск применения набора – класс 2б (ГОСТ Р 51609-2000). 2.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. 2.3. Меры предосторожности - соблюдение «Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г). 3. ПРАВИЛА ПРИЕМКИ Подп. и дата 3.1. Каждая серия наборов должна быть принята отделом технического контроля (ОТК) предприятия-изготовителя. 3.2. Под серией следует понимать определенное количество наборов, одновременно изготовленных в одинаковых производственных условиях, оформленных единым номером и документом о качестве (паспортом) с указанием: - наименования предприятия-изготовителя; - полного и сокращенного названия набора; Инв. № дубл. - номера серии; зам. Инв. № -количества наборов в серии; - срока годности; - даты изготовления; Подп. и дата - результатов контроля; - номера и даты выдачи паспорта; - обозначения настоящих технических условий; - штампа ОТК. 3.3 ОТК предприятия-изготовителя контролирует качество расфасовки, упаковки, маркировки, комплектность поставки, а также соответствие органолептических и физикохимических показателей набора требованиям, указанным в настоящих технических условиях. Инв. № подл. 111 ТУ 9398-001-73594697-2011 Изм. Лист № докум. Подп. Дата Лист 6 3.4. Для контроля качества наборов и создания, архивных образцов ОТК методом случайного отбора составляет из разных мест каждой серии выборку, включающую три Набора. 3.5. После проверки качества расфасовки, упаковки, маркировки и комплектности поставки один набор используют для контроля на соответствие требованиям настоящих технических условий. Остальные два Набора хранят в архиве до истечения срока годности. 3.6. При неудовлетворительных результатах контроля хотя бы по одному из показателей проводят повторный контроль по всем показателям Набора, взятого из той же серии. Результаты повторного контроля распространяют на всю серию. При неудовлетворительных результатах повторного контроля серию бракуют. 3.7. Контроль качества Наборов при изготовлении осуществляет ОТК предприятияизготовителя. Подп. и дата 4. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. Методы контроля набора по ГОСТ Р 51352-99. 4.1. Внешний вид компонентов Набора контролируют визуально. 4.2. Определение параметров «Время проведения одного анализа (время выхода на визуально определяемую окраску), 5 мин, не более»; «Положительный контрольный образец (чувствительность)», «Отрицательный контрольный образец (специфичность)». 4.2.1 Материалы, оборудование, реагенты: Инв. № дубл. Перчатки резиновые Фильтровальная бумага Планшеты иммунологические U-образные Взам. Инв. № Ножницы для вскрытия флаконов Дозаторы фирмы Biohit объёмом от 100 мкл до 0,5 мкл. Допускается использование дозаторов иных форм-производителей с аналогичными характеристиками. Подп. и дата Наконечники съёмные одноразовые для дозаторов. 4.2.2. Подготовка к контролю. 4.2.2.1. Условия проведения контроля Контроль проводят при следующих климатических условиях: - температура в помещении 20-25С - давление 760-770 мм.рт. ст. Инв. № подл. 4.2.2.2. Подготовка реагентов. Флаконы Набора разгерметизируют путёт снятия с них завальцованных алюминиевых колпачков. 4.2.2.3.Потребное оборудование. – относится к разделу 4.2.1 Используют дозаторы переменного объёма на 1 мл, 100 мкл, 10 мкл производства фирмы ТУ 9398-001-73594697-2011 Изм. Лист № докум. Подп. Дата 112 Лист 7 4.2.2.4. Расфасованный гидрозоль готов к использованию. 4.2.2.5. Приготовление специфичности). отрицательного контрольного образца (проверка Отрицательную контрольную сыворотку разводят в U-образной лунке иммунологического планшета буфером для разведения в соотношении 1/50.Для этого смешивают 49 мкл буферного раствора и 1,0 мкл контрольной отрицательной сыворотки. Далее отбрасывают 30 мкл разведённой сыворотки. 4.2.2.6. Приготовление чувствительности). положительного контрольного образца (проверка Положительную контрольную сыворотку разводят в U-образной лунке иммунологического планшета буфером для разведения в соотношении 1/50. Для этого смешивают 49 мкл буферного раствора и 1,0 мкл контрольной положительной сыворотки. Далее отбрасывают 30 мкл. разведённой сыворотки. 4.2.3. Проведение контроля. Подп. и дата В лунке планшета соединяют 20 мкл гидрозоля и 20 мкл растрированной как описано ранее, сыворотки. После выдержки в течение 2-3 минут, набирают 5 мкл. Полученного раствора и наносят на фильтровальную бумагу в режиме свободного течения. 4.2.3.1 .Фиксирование результатов. Появление на фильтровальной бумаге чётко видимой точки с выраженными краями свидетельствует о наличии агглютинации, т.е. о положительной реакции. Появление на фильтровальной бумаге диффузного пятна свидетельствует об отсутствии агглютинации, т.е об отрицательной реакции. Инв. № дубл. 4.2.3.2. Определение параметра «Положительный контрольный образец (чувствительность)». Появление на фильтровальной бумаге чётко видимой точки с выраженными краями свидетельствует о наличии агглютинации, т.е. о положительной реакции. Взам. Инв. № 4.2.3.3. Определение параметра «Отрицательный контрольный образец (специфичность)». Появление на фильтровальной бумаге диффузного пятна свидетельствует об отсутствии агглютинации, т.е об отрицательной реакции. Подп. и дата Инв. № подл. 113 ТУ 9398-001-73594697-2011 Изм. Лист № докум. Подп. Дата Лист 8 5. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ. 5.1. Транспортирование Наборов должно производиться всеми видами крытого транспорта с соблюдением условий и требований, установленных для данного вида транспорта, при температуре 5-25 0С. 5.2. Хранение Наборов должно проводиться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре 5-25 0С в течение всего срока годности. 6. УКАЗАНИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ. 6.1. Набор должен применяться согласно Инструкции по применению, утвержденной Подп. и дата Росздравнадзором _________ 20_ г. 7. ГАРАНТИИ ИЗГОТОВИТЕЛЯ 7.1. Предприятие-изготовитель гарантирует соответствие Набора требованиям Технических условий при соблюдении условий транспортирования, хранения и применения, установленных настоящими техническими условиями. 7.2. Срок годности Набора – 12 месяцев с момента прохождения ОТК. Приложение 1 Обязательное Инв. № дубл. ПЕРЕЧЕНЬ ДОКУМЕНТОВ, ССЫЛКИ НА КОТОРЫЕ ДАНЫ В НАСТОЯЩИХ ТЕХНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ Взам. Инв. № Подп. и дата ГОСТ3885-73 Маркировка Набора ГОСТ 7317-78 Бумага этикетировочная ГОСТ7933-87 Картон коробочный ГОСТ9095-89 Бумага типографская ГОСТ14192-96 Манипуляционные знаки ГОСТ17768-90 Графическое оформление ГОСТ Р51088-97 Упаковка ГОСТ Р51609-2000 Инв. № подл. Потенциальный риск применения ГОСТ Р51352-99 Методы контроля набора ОСТ 64-009-86 Колпачки алюминиевые Ту-38.006.108-95 Пробки резиновые ТУ 64-2-10-87 Флаконы стеклянные для биопрепаратов ТУ 64-2-278-79 Планшеты иммунологические ТУ 9398-001-73594697-2011 Изм. Лист № докум. Подп. Дата 114 Лист 9 Приложение 2 Рекомендуемое ПЕРЕЧЕНЬ ОБОРУДОВАНИЯ И СРЕДСТВ ИЗМЕРЕНИЯ ФС № 2005/450 Дозаторы многофункциональные ФС №2004/1416 Наконечники к дозаторам ОКП 943340 Ножницы лабораторные Примечание. Допускается применение оборудования другого типа, по своим характеристикам не уступающего рекомендуемому. ЛИСТ РЕГИСТРАЦИИ ИЗМЕНЕНИЙ Подп. и дата Номер изменения Измененного Номер листа (страницы) замененного нового Номер документа Подпись Дата внесения изменения Дата введения изменения аннулированного Инв. № дубл. Взам. Инв. № Подп. и дата Инв. № подл. 115 ТУ 9398-001-73594697-2011 Изм. Лист № докум. Подп. Дата Лист 10 116 117 118 119