Костюк Светлана Викторовна РОЛЬ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК В
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК. На правах рукописи Костюк Светлана Викторовна РОЛЬ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК В ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА 03.02.07 — генетика Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук Вейко Наталья Николаевна Москва – 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ (Внеклеточная ДНК – биологически активная молекула) 1.1. Свойства внеклеточной ДНК 1.1.1. Стандартизация методов выделения и хранения вкДНК 9 16 1.1.6. Окислительная модификация оснований вкДНК 17 17 21 23 26 30 31 1.1.7. Свойства вкДНК определяют ее характеристики как маркера при патологии и при опасных для генома воздействиях 34 1.1.7.1. Применение вкДНК в качесве маркера ранней диагностики в онкологии 37 1.1.2. Концентрация вкДНК 1.1.3. Фрагментация вкДНК 1.1.4. Содержание различных последовательностей в составе вкДНК 1.1.5. Эпигенетические модификаци вкДНК: метилирование фрагментов вкДНК 1.1.7.2. Применение вкДНК в качесве маркера в пренатальной диагностике, транспланталогии и других областях диагностики 1.2. Происхождение вкДНК. Механизм появления вкДНК в циркуляции 1.3. Формы существования вкДНК 1.4. Биологическая активость вкДНК 1.4.1. ВкДНК как активатор иммунных реакций 1.4.2. ВкДНК как фактор стресс-сигнализации в индуцированном ионизирующей радиацией эффекте свидетеля 1.5. Способы проникновения вкДНК внутрь клетки 1.6. Внутриклеточные рецепторы, опознающие фрагменты вкДНК 1.6.1. Белки семейства TLR – сенсоры фрагментов вкДНК 1.6.1.1. Общая характеристика белков TLR 1.6.1.2. Природные и синтетические лиганды TLR9 1.6.1.3. Ингибиторы взаимодействия CрG -ДНК с TLR9 1.6.1.4. Механизм доставки лигандов к TLR, расположенным на эндосомах 1.6.1.5. Шапероны – роль в подготовке и перемещении TLR в эндосомы 1.6.1.6. Как иммунная система отличает нуклеиновые кислоты болезнетворных микроорганизмов и собственные нуклеиновые кислоты 1.6.2. Другие рецепторы - кандидаты на роль связывания вкДНК 1.6.2.1. ZBP1 или DAI – сенсор цитозольной ДНК 1.6.2.2. Роль рецептора RIG1 в проведении сигнала от вкДНК 1.6.2.3. AIM2 и инфламмасома 1.7. Внеклеточная ДНК – индуктор окислительного стресса в клетках 1.7.1. Роль фермента NOX4 в синтезе активных форм кислорода, индуцированном вкДНК 1.8. Внеклеточная ДНК принимает участие в регуляции клеточного цикла 39 42 48 53 53 56 58 60 61 61 64 67 70 75 79 82 84 85 86 88 89 92 3 1.9. Транскрипционные факторы и сигнальные пути, активирующиеся в клетках при действии внеклеточной ДНК 1.9.1. Внеклеточная ДНК вызывает активацию транскрипционного фактора NF-kB 1.9.2. Внеклеточная ДНК вызывает активацию ядерного фактора NRF2 1.9.3. Взаимодействие между NRF2 - и NF-kB - сигнальными путями 1.10. Заключение по данным литературы 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 2.1. Анализируемая выборка 2.2. Выделение внеклеточной ДНК 2.3. Определение концентрации и размеров фрагментов ДНК вкДНК 2.4. Определение содержания повторяющихся последовательностей генома в составе вкДНК 2.5. Определение нуклеазной активности 2.6. Метод ИФА на ДНК-связывающих мембранах 2.7. Культивирование мезенхимных стволовых клеток (МСК) 2.8. Культивирование HUVEC (клеток эндотелия из вены пуповины) 2.9 Культивирование фибробластов 2.10. Выделение лимфоцитов 2.11. Приготовление образцов ДНК 2.12. Определение количества активных форм кислорода 2.13. Определение уровня окиси азота в клетках 2.14. Определение количества нитритов и нитратов (метаболитов окиси азота) в среде культивирования 2.15 Определение f-актина 2.16. Определение содержания 8-окси-7,8-дигидрогуанозина (8-oxoG) в составе вкДНК 2.17. Определение одно- и двуцепочечных разрывов ДНК в клетках. Метод ДНК-комет (single cell gel electrophoresis) 2.18. Определение двуцепочечных разрывов ДНК ядер клеток методом иммунофлуоресценции 2.19. Анализ разрывов ДНК в клетках методом TUNEL 2.20. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) 2.21. Определение ферментативной активности каспазы 3 2.22. Определение уровня экспрессии белков 2.23. Ингибирование TLR9 клеточного пути 2.24. Оценка уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени 2.25. Статистическая обработка результатов 3. РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. свойства внеклеточной ДНК. Поиск свойств, определяющих биологическую активность вкДНК 96 98 100 102 104 106 106 106 107 107 108 108 109 109 109 109 110 111 111 111 111 112 112 112 113 113 113 114 114 114 118 119 119 4 3.1.1. Концентрация вкДНК не может служить маркером хронического низкоуровнего повреждающего воздействия или хронически протекающего патологического процесса 3.1.1.2. Концентрация вкДНК зависит от нуклеазной активности плазмы крови 119 3.1.2. Длины фрагментов внДНК 124 126 3.1.3. Концентрация повторяющихся последовательностей генома человека в плазме крови 127 3.1.3.1. ГЦ-богатая последовательность рибосомного повтора накапливается в составе вкДНК 130 3.1.3.2. Содержание АТ-богатой последовательности генома в циркулирующей вкДНК плазмы крови лиц, подвергавшихся профессиональному хроническому воздействию ионизирующего излучения снижено по сравнению с контрольной группой 3.1.4. Окислительная модификация вкДНК 133 135 3.1.5. Фрагменты рДНК, накапливающейся в составе вкДНК, образует в крови комплексы с антителами 137 3.1.5.1 Титры антител к рДНК в выборке облученных лиц выше, чем в контрольной 141 3.2. Влияние внеклеточной ДНК на функциональную активность генома гистологически различных культивируемых клеток человека с разным пролиферативным потенциалом 3.2.1. Общая схема эксперимента 143 3.2.3. Характеристика образцов вкДНК и модельных фрагментов 143 144 146 3.2.4. Локализация окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК в клетках разных типов 152 3.2.2. Характеристика культивируемых клеток 3.2.5. Изменение уровня активных форм кислорода в разных типах клеток при действии окисленных и неокисленных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 3.2.5.1. Количество АФК в HUVEC определяется свойствами вкДНК 156 157 3.2.5.2. Синтез АФК в МСК при воздействии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК 165 3.2.5.3. Окисленные вкДНК индуцируют в раковых клетках MCF-7 кратковременный окислительный стресс 171 3.2.5.4. Изменение уровня активных форм кислорода в фибробластах при действии гДНК и гДНКокси 175 3.2.6. Окислительные модификации вкДНК индуцируют повышение уровня окислительных модификаций собственной ДНК в ядрах клеток 178 3.2.7. Окисленные фрагменты вкДНК индуцируют кратковременную экспрессию NOX4 в разных типах клеток 181 3.2.8. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают быстро репарируемые разрывы ДНК ядер клеток 187 3.2.8.1. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают в ядрах HUVEC быстро репарируемые разрывы ДНК 188 3.2.8.2. Внеклеточная ДНК с измененными свойствами стимулирует образование и репарацию разрывов хроматина культивируемых мезенхимных стволовых клеток человека 194 5 3.2.8.3. Окисленные вкДНК стимулируют увеличение количества разрывов ДНК в ядрах клеток MCF-7 3.2.8.4. Окисленные фрагменты вкДНК снижают уровень двунитевых разрывов в HEF и HDF , культивируемых в условиях окислительного стресса 199 3.2.9. Окисленные вкДНК повышают уровень нестабильности генома 203 206 3.2.9.1. Окисленные фрагменты вкДНК транзиторно увеличивают содержание фракции subG1 в разных типах клеток 210 3.2.10. Изменение свойств вкДНК влияет на пролиферацию разных типов клеток 212 3.2.10.1. Снижение содержания Ki-67 в клетках в ответ на присутствие вкДНК 212 3.2.10.2. Изменение экспрессии маркера пролиферации и репарации PCNA в клетках в ответ на присутствие фрагментов вкДНК 3.2.11. ВкДНК вызывает остановку клеточного цикла 216 220 3.2.11.1. Изменение экспрессии генов, участвующих в регуляции клеточного цикла при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 223 3.2.12. Активация процессов репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 227 3.2.12.1. Изменение пространственного положения локусов прицентромерного гетерохроматина района 1q12 при действии фрагментов вкДНК 3.2.13. ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК снижают уровень гибели клеток разных типов 3.2.14. ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК снижают количество клеток с признаками апоптоза в разных клеточных популяциях 3.2.14.1. ВкДНК снижает активность каспазы 3 в клетках разных типов 3.2.14.2. Изменение экспрессии генов, участвующих в регуляции апоптоза при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 229 232 237 240 3.2.15. ВкДНК повышает транскрипционную активность клеток 241 247 3.2.16. TLR9 – рецептор, через который фрагменты вкДНК реализуют стимулирующее действие 249 3.2.16.1. ВкДНК больных ревматоидным артритом, модельные ГЦ- богатые фрагменты увеличивают экспрессию гена TLR9 в лимфоцитах человека 250 3.2.16.2. ГЦ-ДНК усиливает экспрессию TLR9 в эмбриональных фибробластах легкого человека 3.2.16.3. ГЦ-ДНК снижает экспрессию TLR9 в лимфоцитах больного СКВ 252 252 3.2.16.4. ГЦ-ДНК усиливает экспрессию TLR9 в СD34+ клетках и мононуклеарах костного мозга 254 3.2.16.5. При действии ГЦ-богатых фрагментов вкДНК активируются рецепторы TLR9 в МСК 255 3.2.16.6. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК реализуют свое активирующее действие на HUVEC с участием TLR9 264 3.2.16.6.1. Изменение уровня экспрессии белка TLR9 при действии на HUVEC вкДНК с измененными свойствам 266 6 3.2.16.7. Изменение уровня экспрессии TLR9 в MCF7 при действии вкДНК с измененными свойствами 268 3.2.16.8. ГДНК и гДНКокси снижают уровень сенсора ДНК TLR9 в культивируемых фибробластах при длительном культивировании 271 3.2.17. Участие рецепторов АIМ2 в проведении сигнала от вкДНК в клетках человека 274 3.2.17.1. Влияние фрагментов вкДНК на уровень экспрессии гена рецептора AIM2 в МСК 274 3.2.17.2. ВкДНК повышает уровень экспрессии гена рецептора AIM2 в HUVEC 276 3.2.17.3. Изменение экспрессии рецептора AIM2 на уровне гена и на уровне белка при действии фрагментов вкДНК на культуру раковых клеток MCF-7 280 3.2.17.4. Геномая ДНК и гДНКокси снижают уровень сенсора ДНК AIM2 в культивируемых фибробластах при длительном культивировании 3.2.21. ВкДНК активирует TLR-сигнальный путь 283 284 285 287 288 289 291 296 3.2.21.1. Изменение уровня экспрессии гена MyD88 –адаптера TLRсигнального пути в ответ на стимуляцию МСК фрагментами п(рДНК) 296 3.2.18. Роль рецептора RIG1 в проведении сигнала от вкДНК 3.2.18.1. Влияние вкДНК на уровень экспрессии гена RIG1 в МСК 3.2.18.2. Влияние вкДНК на экспрессию рецепторов RIG1 в HUVEC 3.2.18.3. Влияние вкДНК на экспрессию рецепторов RIG1 в MCF7 и HDF 3.2.19. Роль STING в проведении сигнала от вкДНК 3.2.20. Влияние вкДНК на экспрессию белков семейства TLR 3.2.21.2. Динамика изменения количества мРНК гена MyD88 – адаптера TLR-сигнального пути в ответ на стимуляцию HUVEC и MCF7 фрагментами вкДНК 3.2.21.3. Влияние фрагментов вкДНК на активацию адаптера TLR9 сигнального пути – MyD88 на уровне транскрипции в лимфоцитах, CD34+ клетках костного мозга и фибробластах 3.2.22. ВкДНК активирует NF-kB- сигнальный путь в разных типах клеток 301 302 303 3.2.22.1. ВкДНК активирует экспрессию генов NF-kB - сигнального пути в МСК 304 3.2.22.2. Фрагменты вкДНК активируют экспрессию транскрипционного фактора NF-kB (RelА или p65) и его перемещение в ядро в МСК 307 3.2.22.3. Активация процессов транскрипции генов цитокинов при действии фрагментов п(рДНК) на МСК. Активация синтеза цитокинов - IL10 и TNFα фрагментами ГЦ-обогащенной вкДНК 3.2.22.4. Изменение экспрессии генов молекул сигнального каскада, контролирующего транскрипционный фактор NF-kB, в HUVEC при действии фрагментов вкДНК 3.2.22.5. Влияние фрагментов вкДНК на количества белка р65 и его локализацию в HUVEC 3.2.22.6. ВкДНК повышает экспрессию генов цитокинов IL8, IL6, IL10 и TNFа в HUVEC 3.2.22.7. Изменение уровня экспрессии генов молекул адгезии: ICAM1, SELE и VCAM1, контролируемых фактором NF-kB, при действии окисленных и ГЦ- 312 315 316 319 7 богатых фрагментов вкДНК в HUVEC 3.2.22.8. ГЦ-обогащенная п(рДНК) активирует NF-kB - сигнальный путь в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров 322 3.2.22.9. Активация экспрессии генов NF-kB – сигнального пути образцами окисленной и неокисленной вкДНК в MCF7 324 3.2.22.10. Влияние окисленных фрагментов вкДНК на активность NF-kB – сигнального пути в фибробластах в условиях окислительного стресса 3.2.23. Активация фрагментами вкДНК NRF2 – сигнального пути 3.2.23.1. вкДНК активирует NRF2 – сигнальный путь в МСК 3.2.23.2. Активация NRF2- сигнального пути фрагментами вкДНК в HUVEC 3.2.23.3. Окисленные и неокисленные образцы вкДНК снижают активность транскрипционного фактора NRF2 и активируют транскрипционный фактор STAT3 в клетках MCF7 3.2.23.4. Окисленные вкДНК активируют NRF2 – сигнальный путь в фибробластах 3.2.23.5 Изменение уровня экспрессии гена SOD1 при действии ГЦ-богатых и окисленных ДНК в разных типах клеток 3.2.24. Активация STAT3 - сигнального пути фрагментами вкДНК в разных типах клеток 3.2.24.1. Активация экспрессии STAT3 фрагментами вкДНК в МСК 3.2.24.2. Активация STAT3 - сигнального пути фрагментами вкДНК в HUVEC 3.2.24.3. Активация STAT3 - сигнального пути фрагментами вкДНК в MCF-7 321 238 331 332 336 339 341 342 346 347 348 350 3.2.25. Активация транскрипционного фактора PPARG2 фрагментами вкДНК в клетках разных типов 353 3.2.26. Окисленная вкДНК – фактор стресс-сигнализации в передаче сигнала при радиационно-индуцируемом эффекте свидетеля 357 3.2.27. Окисленная вкДНК повышает устойчивость HDF к ионизирующей радиации 3.2.28. Воздействие ГЦ- ДНК улучшает выживаемость МСК после облучения 358 359 3.2.29. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК стимулируют в МСК устойчивость к повреждающему действию этанола 361 3.2.30. Влияние изменения свойств вкДНК на специфическую функциональную активность клеток 363 3.2.30.1. Изменение свойств вкДНК влияет на количество окиси азота в HUVEC 3.2.30.2. Изменение уровня экспрессии и полимеризации актина 3.2.30.3. Повышение экспрессии генов миогенной дифференцировки при действии вкДНКокси на МСК 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ Применение результатов научных выводов СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 363 368 370 374 389 389 390 8 СПИСОК ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ CpG-ОДН – CpG-содержащие олигонуклеотидные аналоги; GAPDH – глицеральдегид фосфодигедрогеназа; IRF3/7 – фактор, регулирующий транскрипционную активность гена интерферона; MAPК – митоген активируемая протеинкиназа; MyD88 –миелоидный фактор дифференцировки; NBT – нитротетразолий голубой (nitro blue tetrazolium chloride); NOX – НАДФН-оксидаза; RIG-I – цитоплазматическая РНК-геликаза, рецепор, узнающий dsРНК (retinoic acid inducible gene 1); SDS – додецилсульфат натрия; SSC – стандартный солевой раствор; SOD – супероксиддисмутаза; TCR – Т-клеточный рецептор; TLR – «Toll» - рецепторы; TNF-α – фактор некроза опухоли альфа; АФК – активные формы кислорода; АО – адаптивный ответ; вкДНК – внеклеточная ДНК; вкДНКокси– окисленная in vitro ДНК; гДНК – геномная ДНК; ГЦ-ДНК – ДНК, обогащенная GC парами азотистых оснований; ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота; ДР – двуцепочечные разрывы; ЗД – здоровые доноры; ИЛ – интерлейкин; инг-ОДН – ингибирующие олигодезоксинуклеотиды; ИФА – иммуноферментный анализ; ИФН – интерферон; КД – контрольные доноры; ОД – облученные доноры; ОДН – олигодезоксинуклеотиды; ОИМ – острый инфаркт миокарда; ОНП – однонуклеотидный полиморфизм; ПЦР – полимеразная цепная реакция; РА – ревматоидный артрит; СатIII – субфрагмент сателлита 3; ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания; СКВ – системная красная волчанка; ТОрДНК – транскрибируемая область рибосомного повтора; ФНО – фактор некроза опухоли; ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота; ЭС – эффект свидетеля; яДНК – ядерная ДНК; ЯОР – ядрышкообразующие районы хромосом. 9 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Фрагменты ДНК, циркулирующие вне клеток в межклеточной среде организма или в среде культивирования клеток, называют внеклеточной ДНК (вкДНК) [Galeazzi et al., 2003]. Существует несколько гипотез о происхождении внеклеточной ДНК, основными из которых являются – образование пула внеклеточных нуклеиновых кислот в результате гибели клеток (“гипотеза клеточной гибели”) и активная секреция ДНК живыми клетками (гипотеза “метаболической ДНК“) [Pisetsky, 2012; Peters and Pretorius, 2011; Gahan et al., 2008]. Повышенный интерес к внеклеточной ДНК связан с возможностью ее использования в качестве маркера для диагностики. В составе внеклеточной ДНК, выделенной из плазмы или сыворотки периферической крови, обнаруживается ДНК опухоли (при онкологической патологии), ДНК плода (при беременности), что позволяет анализировать соответственно геном опухоли или плода, не прибегая к биопсии. Определение концентрации внеклеточной ДНК позволяет в ряде случаев оценить уровень гибели клеток при патологии или при действии повреждающих факторов, в том числе, ионизирующей радиации и ультрафиолета [Schwarzenbach, 2013; El Messaoudi et al., 2013; González-Masiá et al., 2013; Jung et al., 2010; Zhang et al.,2010; Chiu et al.,2013]. К моменту начала данного исследования гораздо меньшее число работ было посвящено биологическому действию внеклеточной ДНК на активность генома клеток организма человека [Gahan et al., 2010]. Вместе с тем внеклеточная ДНК циркулирует в составе крови организма и потенциально может влиять на функциональную активность клеток разного типа. Известно, что многие клетки экспрессируют на поверхности и в цитоплазме ДНК-сенсоры, которые потенциально могут опознавать внеклеточную и цитоплазматическую ДНК с определенными свойствами. Поэтому исследование общих свойств вкДНК и биологического действия вкДНК на активность генома клеток человека является актуальной проблемой генетики. Исследование свойств вкДНК необходимо как для создания новых подходов и методов диагностики состояний, сопровождающихся повышенным уровнем гибели клеток организма, так и для определения основных характеристик пула внеклеточной ДНК, благодаря которым вкДНК становится биологически активной молекулой. К таким свойствам вкДНК можно отнести содержание отдельных последовательностей генома человека, как повторяющихся, так и уникальных [Peters and Pretorius, 2012; Suzuki et al., 2008]. В составе вкДНК обнаружено увеличение содержания митохондриальной ДНК, приводятся сведения об увеличении ГЦ-состава вкДНК по сравнению с ДНК, выделенной 10 из ядер клеток. [Вейко и соавт., 2006; Rykova et al., 2012; Gonzalez-Masia et al., 2013]. Однако в литературе нет данных, которые объясняли бы механизм значительного изменения количественного состава фрагментов вкДНК в норме и при патологии. Неизвестно также, каким образом изменение состава вкДНК изменяет биологическую активность вкДНК в отношении разных типов клеток. Для того чтобы понять, какие функции выполняет вкДНК в организме в норме и при патологии, необходимо, во-первых, определить закономерности изменения ее свойств по сравнению с геномной ДНК нормально функционирующих клеток. Во-вторых, необходимо выяснить, приводит ли изменение характеристик вкДНК к изменению ее биологической активности в отношении различных типов клеток человека. И, наконец, важно определить основные звенья пока не известного клеточного механизма, посредством которого вкДНК изменяет функциональную активность различных клеток организма. Для решения перечисленных задач необходимо исследование свойств вкДНК в норме и при патологии, исследование процессов регуляции пула вкДНК в организме и биологического действия фрагментов вкДНК на клетки человека. Результатом подобных исследований будут новые знания о молекулярных и клеточных механизмах действия вкДНК, которые необходимы как для создания новых методов молекулярной диагностики и лечения, так и для понимания фундаментальных основ взаимодействия внеклеточных нуклеиновых кислот с живыми клетками организма. Исследование роли молекулы внеклеточной ДНК – носителя генетической информации в регуляции активности генома клеток разного типа представляется актуальной задачей генетики. Цель исследования: Установление взаимосвязи между структурными особенностями внеклеточной ДНК и ee способностью изменять уровень транскрипционной активности генов, имеющих ключевое значение для сохранения стабильности генома и регуляции адаптивных реакций клеток человека разного гистогенеза. Задачи исследования: 1. Определить концентрацию, изменение содержания ГЦ- и АТ- богатых последовательностей, размер фрагментов, уровень окислительной модификации оснований вкДНК в плазме крови здоровых доноров, беременных женщин, больных аутоиммунными и сердечно-сосудистыми заболеваниями и лиц, контактировавших с источниками ионизирующего излучения. Выявить структурные особенности которые определяют ее выраженную биологическую активность. вкДНК, 11 2. Исследовать локализацию ГЦ-обогащенных и окисленных фрагментов вкДНК в нормальных (на примере клеток эндотелия) и раковых клетках (на примере культуры клеток аденокарциномы молочной железы). 3. Проанализировать влияние фрагментов вкДНК на развитие окислительного стресса в клетках разного типа (HUVEC, МСК, фибробластах и MCF-7) Определить локализацию синтеза АФК в раковых клетках линии MCF-7. Охарактеризовать время развития окислительного стресса в разных типах клеток. 4. Изучить повреждающее действие фрагментов вкДНК на клетки (HUVEC, МСК, MCF-7 и фибробласты). Проанализировать уровень окисления и количество одно- и двунитевых разрывов ДНК в ядрах клеток, а также признаки нестабильности генома раковых и нормальных клеток. 5. Исследовать ответ клеток (HUVEC, МСК, MCF-7 и фибробласты) на окислительный стресс, индуцируемый фрагментами вкДНК с разными свойствами, на уровне транскриптома. Изучить пролиферативную активность клеток, клеточный цикл, экспрессию гена репарации BRCA1, пространственную структуру хроматина, уровень апоптоза и транскрипции антиапоптотических генов под действием вкДНК. 6. Исследовать транскрипционную активность генов сигнальных путей NF-kB, NRF2, PPARG и STAT3 в клетках (HUVEC, МСК, MCF-7 и фибробластах) в ответ на действие ГЦ - обогащенных и окисленных фрагментов вкДНК. 7. Проанализировать перемещение транскрипционных факторов NF-kB, NRF2 и STAT3 в ядро клеток (HUVEC, МСК, MCF-7 и фибробластов); исследовать уровень экспрессии генов – мишеней NF-kB – сигнального пути (TNF, IL1B, IL8, IL6, IL-10), и гена SOD1- мишени антиокислительного NRF2 - сигнального пути, 8. Исследовать влияние ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК на уровень экспрессии генов внутриклеточных ДНК-сенсоров TLR9, AIM2, RIG1, участвующих в распознавании чужеродных нуклеиновых кислот и генов - адаптеров внутриклеточных рецепторов – MyD88 и STING. Проанализировать влияние фрагментов вкДНК на изменение экспрессии белков TLR9 и AIM2. 9. Исследовать влияние окисленных фрагментов вкДНК на синтез низкомолекулярного сигнального медиатора внутриклеточных и внеклеточных процессов – оксида азота в клетках эндотелия человека и на экспрессию генов четырех ключевых транскрипционных факторов миогенной диференцировки (MYOD1, MYOG, MYF5, MRF4) в МСК. 12 Научная новизна полученных результатов: Впервые подробно охарактеризованы свойства внеклеточной ДНК (содержание ГЦ- и АТ-богатых последовательностей и уровня окисления) в норме (у здоровых доноров) и при патологии (на выбрке больных аутоиммунными, сердечно- сосудистыми заболеваниями), при беременности и при контакте с ионизирующим излучением. Выявлены общие структурные характеристики внеклеточной ДНК – накопление в ее составе ГЦ-богатых фрагментов рибосомного гена, устойчивого к нуклеазному гидролизу, снижение АТ-богатой последовательности сателлита 3 и увеличение содержания окисленной формы дезоксирибогуанозина. На основании полученных данных предложена оригинальная обобщенная гипотеза образования пула вкДНК в организме, который подвергается хроническому воздействию ионизирующего излучения. Впервые выявлены две составляющие пула вкДНК, которые превращают ее из относительно инертной молекулы, которой является геномная ДНК клеточных ядер, в биологически активную молекулу. Во-первых, это эпигенетическая модификация вкДНК – окисление фрагментов вкДНК, маркером которого является 8-окси- дезоксирибогуанозин. Во-вторых, накопление в составе вкДНК ГЦ-богатых фрагментов ДНК, маркером которых является транскрибируемая область рибосомного повтора. Впервые была выявлена роль ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК в функционировании клеток разного типа: дифференцированных (клеток эндотелия, фибробластов, лимфоцитов), недифференцированных мезенхимных стволовых клеток и раковых клеток. Впервые был обнаружен новый клеточный механизм, посредством которого реализуется биологическое действие вкДНК в отношении различных типов клеток. Центральным звеном этого механизма является индукция при действии ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК синтеза активных форм кислорода, что приводит к повреждению ДНК ядер клеток: образованию одно- и двунитевых разрывов и геномной нестабильности. В ответ на повреждение ядерной ДНК активируются системы репарации ДНК: снижается пролиферация, возникает остановка клеточного цикла и повышается экспрессия генов, ответственных за репарацию. В результате снижается уровень гибели в клеточных популяциях за счет активации транскрипции антиапоптотических генов и ингибирования апоптоза. Впервые исследован ответ транскриптома клеток на изменение свойств вкДНК – от рецепторов, адаптеров и эффекторов каскада сигнальных путей до медиаторов клеточного ответа (цитокинов, факторов роста и молекул адгезии). Показана активация экспрессии 13 внутриклеточных рецепторов TLR9, AIM2, и, в меньшей степени, RIG1 на уровне генов и на уровне белков. Выявлены и исследованы сигнальные пути, которые активируются в ответ на воздействие ГЦ-богатых и/или окисленных фрагментов вкДНК. Впервые описана активация четырех транскрипционных факторов фрагментами при изменении свойств вкДНК: NF-kB, NRF2, STAT3 и PPARG2. Впервые была высказана и подтверждена экспериментально гипотеза о роли окисленной и ГЦ-богатой вкДНК как нового медиатора стресс-сигнализации в развитии адаптивного ответа клеток. Впервые предложена новая альтернативная стратегия повышения выживаемости МСК, применяемых в трансплантологии и для лечения заболеваний, сопровождающихся дегенерацией тканей, включающая использование ГЦбогатых фрагментов ДНК в низких концентрациях. Таким образом, данная работа является оригинальным исследованием, охватывающим новую область знаний о роли внеклеточной ДНК в функциональной активности генома клеток эндотелия, фибробластов, лимфоцитов, недифференцированных мезенхимных стволовых клеток и раковых клеток линии аденокарциномы молочной железы. Научно-практическая значимость работы: 1. Полученные в работе данные имеют фундаментальное значение и могут быть рекомендованы для использования на курсах лекций по разным разделам медицинской генетики, биологии развития, клеточной биологии, при подготовке специалистов в высших учебных заведениях медико - биологического профиля, а также включены в руководства и учебные пособия по данным специальностям. 2. Результаты проведенного анализа свойств вкДНК представляют собой базу для разработки диагностических систем эпигенетических маркеров. По результатам работы зарегистрирован патент регистрационный номер 2013147906/20 (074505). «Определение содержания GC-богатой последовательности генома (GC-ДНК) в составе циркулирующей внеклеточной ДНК плазмы периферической крови как способ определения уровня гибели клеток при хронических заболеваниях, при физиологических состояниях (беременность) и при хроническом действии неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека». 3. Часть материалов работы была получена и использована в рамках выполнения прикладных разработок выполнение поисковых по Государственному Контракту № 14.512.11.0090 на научно-исследовательских работ по теме «Разработка 14 высокоточной тест-системы для оценки и прогнозирования индивидуальной радиочувствительности человека». 4. В последнее время терапия стволовыми клетками приобретает все более актуальное значение для лечения заболеваний, сопровождающихся дегенерацией тканей. Массовая гибель клеток, пересаженных в очаг поражения, остается серьезной проблемой в трансплантологии. Полученные результаты позволяют предложить альтернативный подход к повышению выживаемости МСК при трансплантации или замещающей терапии. Культивирование МСК в присутствии низких количеств ДНК гена 18sРНК, накапливающейся в составе внеклеточной ДНК, способствует выживанию МСК при неблагоприятных и гибельных воздействиях среды микроокружения. Подана заявка на патент регистрационный номер 2013147907/20 (074506) « Применение фрагмента ДНК транскрибируемой области рибосомного повтора для повышения устойчивости мезенхимных стволовых клеток к действию агрессивных факторов окружающей среды». 5. Проведенное в ходе работы исследование характеристик вкДНК, механизмов регуляции вкДНК в организме, биологического действия вкДНК на разные типы клеток способствует получению новой информации о биологической функции циркулирующей внеклеточной ДНК крови в норме и при патологии. Обнаруженный при выполнении диссертационной работы факт повышения выживаемости раковых клеток при контакте с фрагментами внеклеточной ДНК может привести к коррекции схем проведения радиотерапевтических процедур при лечении в онкологии. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Накопление в составе вкДНК ГЦ-богатых последовательностей и окислительная модификация оснований обуславливают ее выраженную биологическую активность. 2. Проникающая способность окисленных фрагментов внеклеточной ДНК в раковые и нормальные клетки выше, чем неокисленных. Неокисленные фрагменты вкДНК связываются с мембраной клетки, окисленные проникают в цитоплазму и локализуются вблизи ядра. 3. Синтез активных форм кислорода в клетках вблизи ядерной мембраны новый, ранее не описанный фактор стресс-сигнализации на фрагменты вкДНК, посредством которого реализуется ответ клеток на внешнее воздействие. 4. Окисленные фрагменты вкДНК вызывают транзиторное образование быстрорепарируемых разрывов ДНК ядер клеток и нестабильность генома раковых клеток, сопровождающиеся кратковременным блокированием 15 5. 6. 7. 8. 9. пролиферативной активности клеток, остановкой клеточного цикла и активацией процесса репарации. Адаптивный ответ на окислительный стресс, вызываемый ГЦ-богатыми и окисленными фрагментами в составе внеклеточной ДНК, на уровне транскриптома является общей закономерностью ответа злокачественных и нормальных клеток человека с разным пролиферативным потенциалом. Характерными особенностями адаптивного ответа являются: усиление транскрипции антиапоптотических генов семейства BCL-2, гена репарации BRCA-1, генов адаптеров, костимуляторов и эффекторов сигнального пути NF-kB, транскрипционных факторов PPAR-гамма и STAT3, гена-мастеррегулятора антиокислительного ответа клеток NRF2. Результатом таких изменений транскриптома является повышение выживаемости клеток. Перемещение транскрипционных факторов NF-kB, NRF2 и STAT3 из цитоплазмы в ядро с последующим усилением транскрипционной активности генов антиокислительного фермента SOD1, молекул адгезии, цитокинов и усиление синтеза цитокинов происходят в процессе реализации адаптивного ответа клеток человека на фрагменты вкДНК. Реакция транскриптома клеток на воздействие ГЦ-богатых и окисленных фрагментов различается по длительности и амплитуде профиля экспрессии генов NRF2– и NF-kB - зависимых сигнальных путей. Повышенная экспрессия внутриклеточных рецепторов TLR9, AIM2, RIG1, участвующих в распознавании чужеродных нуклеиновых кислот особенность адаптивной реакции транскриптома разных типов клеток на ГЦобогащенные и окисленные фрагменты вкДНК. Эпигенетическая модификация вкДНК, вызванная окислением, блокирует ее способность стимулировать синтез низкомолекулярного сигнального медиатора внутриклеточных и внеклеточных процессов NO в клетках эндотелия человека. Повышение экспрессии генов четырех ключевых транскрипционных факторов миогенной дииференцировки (MYOD1, MYOG, MYF5, MRF4) в МСК – особенность ответа МСК на окисленные фрагменты. Фрагменты вкДНК с умеренно повышенным ГЦ- содержанием или слабым окислением остатков гуанозина обладают способностью защищать клетки от гибели при воздействии химических и физических повреждающих факторов. 16 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ВНКЛЕТОЧНАЯ ДНК - БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ МОЛЕКУЛА В 1940-х годах было обнаружено, что ДНК млекопитающих не только заключена в ядре клеток, но и циркулирует в периферической крови [Mandel and Metais, 1948]. Фрагменты ДНК, циркулирующие вне клеток, называют внеклеточной ДНК (вкДНК), экстрацеллюлярной ДНК, внехромосомной ДНК, ДНК плазмы, ДНК сыворотки, в англоязычной литературе - cell-free DNA, circulating DNA, CNAPS [Galeazzi et al., 2003]. Повышенный интерес к вкДНК связан с возможностью ее использования в диагностических целях: для диагностики разных типов рака по измененной вкДНК опухоли; для выявления патологии течения беременности и нарушений развития плода; для оценки риска повреждающих факторов, в том числе, ионизирующей радиации и ультрафиолета [El Messaoudi et al., 2013; Schwarzenbach, 2013; González-Masiá et al., 2013; Jung et al., 2010; Zhang et al., 2010; Chiu et al., 2013]. ВкДНК используют как маркер патологии при аутоиммунных заболеваниях; при острых состояниях, сопровождающихся гибелью большого количества клеток (инсультах, инфарктах миокарда); при сепсисе; при трансплантации; при травме [Cui et al., 2013; Bliksøen et al., 2012; Tsai et al., 2011; Ren et al., 2013; Fleissner et al., 2012; Nielsen, 2012; Dwivedi et al., 2012; Shimony et al., 2010; Swarup and Rajeswari, 2007; Urbanova et al., 2010; Hanaoka et al., 2012]. В настоящее время появились работы о присутствии в сыворотке циркулирующей РНК, которая также может служить маркером многих патологий [Turchinovich et al., 2011; Arroyo et al., 2013; Kosaka et al., 2013; Katsuda et al., 2013; Kinet et al., 2013]. С развитием современных методов диагностики стало возможным проведение анализа первичной последовательности и метилирования вкДНК [Yi et al., 2013; Martinez et al., 2013]. Однако, несмотря на интенсивные исследования возможности применения вкДНК для диагностики, в клиническую практику было введено только несколько тестов в области пренатальной диагностики и онкологии [Chiu and Lo, 2013; El Messaoudi et al., 2013], что связано с отсутствием методов стандартизации выделения и анализа вкДНК [El Messaoudi et al., 2013]. В настоящее время внимание исследователей привлечено не только к использованию вкДНК в качестве раннего маркера заболеваний и патологических состояний, но и к исследованию возможных биологических функций вкДНК [Gahan et al., 2010; González-Masiá et al., 2013; Rykova et al., 2012; Ermakov et al., 2011; Malinovskaya et al., 2011; Ermakov et al., 2008]. В данном обзоре мы рассматриваем возможные механизмы влияния внеклеточной ДНК на функционирование клеток организма человека. Однако, чтобы определить влияние фрагментов циркулирующей ДНК на процессы, протекающие 17 в клетках и в организме в целом, необходимо иметь представление о свойствах вкДНК и о характере взаимодействия фрагментов вкДНК с клетками организма. Заранее приношу свои извинения коллегам, работающим в области исследования вкДНК, чьи работы остались за рамками обзора из-за ограничения объема. 1.1. Свойства внеклеточной ДНК При патологии и опасных для генома воздействиях изменяются такие свойства вкДНК, как концентрация, фрагментация в плазме крови, содержание различных последовательностей ядерной и митохондриальной ДНК в составе вкДНК, эпигенетические характеристики вкДНК, такие, как метилирование и окислительные модификации вкДНК [Tsai et al., 2011; El Messaoudi et al., 2013; Gahan et al., 2012; Ermakov et al., 2013; Swarup and Rajeswari, 2007; Urbanova et al., 2010; Yi et al., 2013]. Изменение этих характеристик может служить тестом для ранней диагностики патологического процесса в организме [González-Masiá et al., 2013; Kim, 2013; Ulivi and Silvestrini, 2013; Urbanova et al., 2010; Yu 2012; Skibsted et al., 2013]. Несмотря на растущий интерес к циркулирующей вкДНК и ее применение в качестве маркера в различных областях медицины, особенно, в онкологии и пренатальной диагностике, мало исследований посвящено стандартизации методов, применяемых авторами разных работ, несмотря на то, что этот вопрос регулярно поднимается исследователями в статьях [El Messaoudi et al., 2013; Urbanova et al., 2010; Swarup and Rajeswari, 2007; Tong et al., 2006]. Несогласованность между различными протоколами для обработки проб и методами, использованными для анализа вкДНК – одно из основных препятствий к вводу анализа вкДНК в область клинической практики [Urbanova et al., 2010]. Методы выделения и определения количества вкДНК/РНК плазмы/сыворотки крови являются критичными при анализе данных. Требуется стандартизация методов выделения и количественного определения вкДНК/РНК, осторожная оценка и анализ данных согласно общим параметрам, таким, как специфичность и чувствительность. Необходимо определить, какой источник – плазма или сыворотка крови является более пригодным для анализа внеклеточных нуклеиновых кислот. Легкие, дешевые и более быстрые методы в будущем могут сделать идентификацию вкДНК и ее количественный анализ рутинным лабораторным биохимическим тестом [El Messaoudi et al., 2013]. 1.1.1. Стандартизация методов выделения и хранения вкДНК Несмотря на накопившиеся данные, свидетельствующие о повышении уровня вкДНК при многих патологиях, определение концентрации вкДНК до сих пор не является введенной в практику тест-системой, поскольку данные в разных литературных 18 источниках противоречат друг другу: концентрация вкДНК плазмы у больных раком варьирует от нескольких тысяч нг/мл до нескольких нг/мл, перекрываясь с диапазоном концентраций вкДНК здоровых людей [Weiss et al., 2013; Jung et al., 2010; Chan et al., 2007]. Кроме того, фрагментация вкДНК при онкологических заболеваниях по разным литературным источникам может быть ниже, эквивалентна, или выше, чем фрагментация вкДНК в контрольной группе [Holdenrieder et al., 2008; Jiang et al., 2007; Schmidt et al., 2008; Mouliere et al., 2011; Mouliere et al., 2012]. Такие различия в полученных данных связаны с разным принципом формирования выборок исследуемых больных, с разным источником выделения вкДНК (из плазмы или сыворотки), с разницей процедур выделения, очистки, определения концентрации и хранения образцов вкДНК, используемых каждой лабораторией, так как нет единых стандартных протоколов [El Messaoudi et al., 2013]. Это и является основным препятствием для клинического применения вкДНК в качестве диагностического маркера. Основной вопрос, какой источник лучше использовать для выделения ДНК – сыворотку или плазму крови. В нескольких работах сравнивали концентрацию вкДНК, полученную при параллельном выделении из сыворотки и плазмы одного и того же донора [El Messaoudi et al., 2013; Chan et al., 2005; Lee et al., 2001; Umetani et al., 2006; Lui et al., 2002]. Концентрация вкДНК в сыворотке крови была значительно выше, чем в плазме - в таблице 1.1 приведены некоторые результаты из опубликованных статей. Литературный Размер Клиническая Концентрация Концентрация источник выборки область вкДНК в плазме вкДНК в сыворотке Lee et al., 2001 18 Здоровые Около Медиана: пациенты 40 копий / мл 8000 копий / мл р-значение Umetani et al., 2006 24 Онкология Среднее ± SD: 180 ± 150 пг / мкл Среднее ± SD: 970 ± 730 пг / мкл p=0.0002 Lui et al., 2002 22 Транспланталогия Медиана: 1195 копий / мл Медиана: 975 копий / мл p< 0.0001 Chan et al., 2005 27 ВкДНК плода Медиана: Медиана: p< 0.05 600 копий / мл 975 копий / мл Таблица 1.1. Некоторые данные из литературных источников – показаны концентрации вкДНК, выделенной из плазмы и сыворотки одних и тех же больных [Lee et al., 2001; Umetani et al., 2006; Lui et al., 2002; Chan et al., 2005]. Однако в ряде публикаций отмечалось, что вкДНК сыворотки крови может быть обогащена неспецифической геномной ДНК, появляющейся в результате лизиса белых клеток крови из-за процессов свертывания [El Messaoudi et al., 2013; Thierry et al., 2010]. 19 Это приводит к получению в дальнейшем завышенных значений вкДНК [Thierry et al., 2010]. Но, несмотря на то, что на протяжении нескольких лет в литературе рекомендуется использовать плазму для выделения вкДНК, многие лаборатории продолжают работать с сывороткой, отчасти из-за того, что при проведении ретроспективных исследований в клинических лабораториях традиционно сыворотку собрать проще. Поскольку ПЦР широко используют при изучении свойств вкДНК, а гепарин может ингибировать ПЦР, то его лучше не использовать в качестве антикоагулянта [Lui et al., 2002]. ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) - наиболее предпочтительный для использования антикоагулянт при сборе крови, особенно при отсроченном выделении вкДНК [Barrett et al., 2011; El Messaoudi et al., 2013]. ЭДТА обеспечивает лучшую сохранность вкДНК в течение 6 часов по сравнению с гепарином и цитратом натрия, при этом нет различий между хранением крови при комнатной температуре и при +4°С [Barrett et al., 2011; Hidestrand et al., 2012; Fernando et al., 2011]. Время задержки между взятием крови и выделением вкДНК при хранении цельной крови в пробирках с ЭДТА, превышающее 6 часов, приводит к увеличению концентрации вкДНК в плазме крови [El Messaoudi et al., 2013, Mouliere et al., 2012; Barrett et al., 2011]. Это может быть вызвано несколькими процессами: разрушением ядросодержащих клеток крови в результате апоптоза или некроза [Mouliere et al., 2012], высвобождением связанной с поверхностью клеток вкДНК [Rykova et al., 2012], активной секрецией вкДНК клетками [Gahan et al., 2010]. Кроме того, хранение образцов крови в пробирках с ЭДТА в течение 3 часов с перемешиванием или 6 часов при комнатной температуре вызывает повышенние фрагментации вкДНК (фрагментация вкДНК оценивалась с помощью индекса целостности DII: отношение средней концентрации вкДНК, определяемой с использованием набора праймеров для амплификации последовательности ≈300 п.о. к средней концентрации вкДНК, определяемой с помощью набора праймеров для амплификации последовательности ≈100 п.о.) [Mouliere et al., 2012; Chan et al., 2005]. Индекс целостности DII еще более снижался через 24 часа хранения образцов крови в пробирках с ЭДТА, что указывает на более высокую степень фрагментации вкДНК с увеличением времени хранения [El Messaoudi et al., 2013] После забора крови ее дальнейшая обработка связана с отделением клеточных элементов крови центрифугированием, так как для анализа вкДНК плазма или сыворотка не должна быть загрязнена геномной ДНК. Эффективным способом избавления от присутствующих в плазме клеток оказалось центрифугирование плазмы в 2 этапа: 1200g 1600g в течение 10 минут, затем 16000g в течение 10 минут [El Messaoudi et al., 2013; Mouliere et al., 2011; Chan et al., 2004]. Концентрации вкДНК, полученной при двойном 20 центрифугировании, сходны с концентрациями, определяемыми после однократного центрифугирования с последующим фильтрованием через 0,2 мкм фильтр (по протоколу фильтрование через поры диаметром 0,2 мкм обеспечивает получение бесклеточной плазмы) [El Messaoudi et al., 2013]. Однократное центрифугирование не полностью очищало плазму от клеток, а в третьем центрифугировании нет необходимости, поскольку концентрации ДНК из супернатантов образцов после второй и третьей стадии центрифугирования были сходными [Mouliere et al., 2011]. Второй этап центрифугирования может проводиться как до, так и после хранения образца плазмы при температуре -20°С или -80°С [El Messaoudi et al., 2013]. Показано также, что процесс центрифугирования (от 400g до 16000g) не вызывает разрушения присутствующих в плазме клеток и не способствует обогащению вкДНК фракцией геномной ДНК [Mouliere et al., 2012; Lui et al., 2002]. Оптимальный срок хранения освобожденной от клеток плазмы при температуре +4°С – не более 4 часов, при температуре -20°С – не более 3-х месяцев, при температуре 80°С – не более 9 месяцев [El Messaoudi et al., 2013; Mouliere et al., 2012; Holdenrieder et al., 2008]. При температуре +4°С отмечали небольшое повышение концентрации вкДНК [El Messaoudi et al., 2013], связанное, возможно, с разрушением с течением времени более сложных структур существования вкДНК – экзосом и нуклеопротеинов, что, как следствие, может приводить к дополнительному выбросу вкДНК [El Messaoudi et al., 2013; Rykova et al., 2012]. Такие же сроки являются оптимальными и для хранения выделенной растворенной вкДНК, однако, концентрация раствора выделенной вкДНК с течением времени уменьшается медленнее, чем концентрация вкДНК в сыворотке [El Messaoudi et al., 2013]. Срок хранения важен при анализе концентрации вкДНК, но не влияет на обнаружение специфических последовательностей или мутаций во вкДНК, поскольку мутации могут быть обнаружены и через несколько лет после замораживания образца, может быть нарушена только чувствительность метода, так как специфические последовательности могут присутствовать в меньших количествах [Mouliere et al., 2012]. Повторные циклы замораживания/оттаивания могут приводить к разрушению вкДНК. Показано, что не более 2-х раз можно размораживать плазму, хранимую при температуре 20°С или -80°С [Mouliere et al., 2012; Chan et al., 2005] и не более 3-х раз выделенную растворенную вкДНК, также хранимую при температуре -20°С или -80°С [Mouliere et al., 2012]. Таким образом, на основании анализа литературных источнтков можно сделать вывод об оптимизации процессов выделения и хранения вкДНК: 21 – предпочтительнее использовать плазму, а не сыворотку в качестве источника вкДНК [El Messaoudi et al., 2013; Chan et al., 2005; Lee et al., 2001; Umetani et al., 2006; Lui et al., 2002; Thierry et al., 2010]; – для забора крови лучше испльзовать пробирки с ЭДТА [Barrett et al., 2011; Hidestrand et al., 2012; Fernando et al., 2011; Lui et al., 2002]; – хранить кровь можно при комнатной температуре до 4-6 часов (в случае использования пробирок с ЭДТА), нет разницы между хранением крови при комнатной температуре и при +4°С [Barrett et al., 2011; Hidestrand et al., 2012; Fernando et al., 2011; Mouliere et al., 2012]; – перемешивания образцов крови следует избегать [El Messaoudi et al., 2013; Mouliere et al., 2012; Chan et al., 2005]; – присутствующие в плазме крови клетки удаляют в 2 этапа: первый этап – центрифугирование при 1200-1600g в течение 10 минут, второй этап – микроцентрифугирование при 16000g в течение 10 минут [El Messaoudi et al., 2013; Mouliere et al., 2011; Mouliere et al., 2012; Chan et al., 2004; Lui et al., 2002]. Второй этап может проводиться как до, так и после хранения образца плазмы при температуре -20°С или -80°С [El Messaoudi et al., 2013]; – плазма до этапа выделения вкДНК или выделенная растворенная вкДНК может храниться при температуре -20°C до трех месяцев, при -80°С – до девяти месяцев, при +4°C – до 3 часов [El Messaoudi et al., 2013; Mouliere et al., 2012; Holdenrieder et al., 2008]; – образцы плазмы могут выдержать не более двух циклов замораживанияоттаивания, а образцы выделенной вкДНК могут выдержать не более трех двух циклов замораживания-оттаивания [Mouliere et al., 2012; Chan et al., 2005]. 1.1.2. Концентрация вкДНК Стандартный метод выделения нуклеиновых кислот из плазмы или сыворотки – фенол - хлороформная экстракция, основанная на оригинальном методе, разработанном Чромцзынским и Сакки [Chomczynski and Sacchi, 1987]. В настоящее время широко используются коммерчески доступные наборы для выделения. Были проведены сравнительные исследования эффективности выделения внеклеточных нуклеиновых кислот в зависимости от используемых протоколов и реактивов разных фирм [Gormally et al., 2006]. В сравнительном анализе участвовали девять коммерческих наборов для выделения ДНК: Rneasy Mini Kit (Qiagen), QIAmp Viral RNA Mini Kit (Qiagen), SV Total RNA Isolation system (Promega), Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic mini reagent set (Brinkman Instruments Inc.), Magna Zorb DNA Mini-Prep Kit (Cortex Biochem) и TriBD Reagent (Sigma) и был добавлен протокол, основанный на оригинальном методе 22 Чромцзынского и Сакки [Chomczynski and Sacchi, 1987]. Лучшая эффективность была достигнута при использовании методов, основанных на осаждении: метода фенольной экстракции и с помощью реагента тизол (TriBD, Sigma) [Gormally et al., 2006]. Концентрация вкДНК может быть измерена флуоресцентным методом, с использованием простых флуоресцирующих красителей: реактивов Pico Green и Hoechst 33258 [Swarup and Rajeswari, 2007; El Messaoudi et al., 2013]. Суммарно концентрация вк(ДНК + РНК) может быть оценена с помощью красителя SYBR Green II dye [Swarup and Rajeswari, 2007]. Концентрацию вкДНК можно определять и с помощью флуоресцирующего красителя RiboGreen, который эффективно определяет концентрацию длинных (20 т.п.н) и коротких (менее 100 п.н.) фрагментов ДНК [Puszyk et al., 2009]. Флуориметрический анализ – прост и недорог, хотя, имеет ограничения из-за влияния связывания вкДНК с белками на выход флуоресценции любого красителя [Pisetsky, 2012]. Концентрацию вкДНК можно также оценивать по связыванию со специфическими антителами к вкДНК [Pisetsky, 2012; Holdenrieder and Stieber, 2009]. Иммунный ответ нуклеосом при использовании метода "сэндвич" зависит от специфики и свойств используемых антител [Pisetsky, 2012; Holdenrieder and Stieber, 2009; Jung et al., 2010]. Концентрация вкДНК может быть оценена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификации специфических последовательностей очищенной вкДНК [Pisetsky, 2012]. ПЦР-амплификация специфических последовательностей является точной, но результаты могут быть занижены из-за селективной потери того или иного гена, например, в процессе апоптоза [Pisetsky, 2012]. Количественная ПЦР в реальном времени увеличила чувствительность диагностики уровня вкДНК до 90% [Swarup and Rajeswari, 2007], а в некоторых случаях, при определении Y-хромосомы в материнской крови или RhD эмбриона чувствительность обнаружения приближается к 100% [Swarup and Rajeswari, 2007]. За последнее десятилетие ПЦР в реальном времени использовалась для диагностики разных типов рака, главным недостатком этого метода является то, что во всех случаях только единичный маркер или группу единичных маркеров можно диагностировать [Swarup and Rajeswari, 2007] Это заметно влияло на чувствительность и специфику подхода [Swarup and Rajeswari, 2007]. Согласно литературным данным, концентрация вкДНК в плазме крови здоровых людей, определяемая методом ПЦР в реальном времени, составляет 1,8 - 36 нг/мл [Rykova et al., 2012; Gahan and Stroun, 2010; Gahan et al., 2010; Fleischhacker et al., 2007]. Значения концентрации варьируют в работах разных авторов, что связано с методическими проблемами, возникающими при выделении вкДНК [El Messaoudi et al., 2013]. При 23 определении концентрации вкДНК методом ПЦР плазма является наиболее предпочтительным источником для выделения вкДНК не только из-за ее возможного обогащения фрагментами геномной ДНК, но и из-за более низкой активности фермента ДНКазы 1 (в плазме в 2-5 раз ниже, чем в сыворотке), что способствует сохранению целостности вкДНК при выделении [El Messaoudi et al., 2013; Casciano et al., 2010]. Использование других методов количественного определения вкДНК приводит к более высоким значениям концентрации, определяемым в выборке здоровых доноров: определяемое методом ник-трансляции с включением радиоактивной метки среднее значение концентрации вкДНК – 266 ± 57 нг/мл [Raptis and Menard, 1980]. При определении концентрации вкДНК по флуоресценции ДНК-связывающего красителя среднее значение в плазме крови – 128 нг/мл при разбросе значений от 0 до 1320 нг/мл [Vernon et al., 2002], а в сыворотке – 7747 ± 678 нг/мл (при использовании красителя PicoGreen, Invitrogen) [Roth et al., 2011]. В выборке здоровых людей нет зависимости концентрации вкДНК от возраста или пола [El Messaoudi et al., 2013; Tong et al., 2006]. При патологии, беременности, травме и других состояниях, характеризующихся повышенным уровнем гибели клеток, концентрация вкДНК может повышаться в несколько раз [Gonzalez-Masia et al., 2013; Hong and Zu, 2013; Ghorbian and Ardekani, 2012]. Небольшое количество работ посвящено определению концентрации вкРНК, средние значения концентрации вкРНК в плазме крови здоровых людей, определяемые спектрофлуориметрически, составляют – 2,5-5,1 нг/мл [Gahan et al., 2010; Holford et al., 2008]. Показано, что часть вкДНК и вкРНК связана с поверхностью клеток [Rykova et al., 2012]. При использовании методов выделения вкДНК/РНК, способствующих отделению внеклеточных нуклеиновых кислот с поверхности, их концентрация значительно возрастает (так, определяемая концентрация свободно циркулирующей вкРНК в плазме крови здоровых людей ≈ 2,5 нг/мл, а при обогащении вкРНК фракцией, связанной с клеточной поверхностью, ее концентрация возрастает до ≈ 31,2 нг/мл) [Rykova et al., 2012]. 1.1.3. Фрагментация вкДНК Показано, что вкДНК в плазме крови присутствует в виде фрагментов. При разделении вкДНК плазмы здоровых доноров с помощью гель-электрофореза обнаруживаются полосы, соответствующие длинам фрагментов 185-200 п.о. и длинам, кратным этому числу – этот размер соответствует межнуклеосомному расщеплению хроматина [Chan et al., 2005; Suzuki et al., 2008], что является отличительной чертой 24 гибели клеток в процессе апоптоза. Такая картина электрофореза получила название «нуклеосомной лесенки» (рисунок 1.1). Рисунок 1.1. А - Распределение по размерам фрагментов очищенной вкДНК плазмы крови 10 здоровых доноров. Полиакриламидный гель-электрофорез [Suzuki et al., 2008]. Б Распределение по размерам фрагментов вкДНК, выделенной из среды интактных (1) и облученных (10 сГр) (2) лимфоцитов человека [Ermakov et al., 2008]. М, М1 и М2 – маркеры длин. Кроме того, в плазме могут присутствовать и длинные фрагменты – длиной более 23 т.п.о., которые, как полагают, попадают в циркуляцию вследствие некроза клеток [Gahan et al., 2010]. При обнаруживается выраженная аутоиммунных заболеваниях на электрофореграмме «нуклеосомная лесенка» [Radic et al., 2013]. В крови беременных женщин обнаруживаются короткие (менее 300 п.о.) фрагменты вкДНК плода, что позволяет провести обогащение вкДНК плода по размеру фракционирования [Chan et al., 2004]. В плазме крови через несколько часов после воздействия ионизирующего излучения начинает появляться низкомолекулярная фракция вкДНК, обнаружена корреляция между накоплением низкомолекулярной фракции вкДНК в плазме и дозой воздействующего ионозирующего излучения, показано уменьшение низкомолекулярной фракции вкДНК при улучшении состояния облученных людей [Vasilyeva, 2001]. При действии малых доз ионизирующей радиации (10сГр) на лимфоциты in vitro наблюдается существенное увеличение содержания коротких фрагментов вкДНК, соответствующих моно- и олигонуклеосомам [Ermakov et al., 2008]. Обогащение среды культивирования облученных лимфоцитов нуклеосомными фрагментами вкДНК может указывать на увеличение числа апоптотических клеток [Ermakov et al., 2008]. Кроме того, показано увеличение нуклеазной активности в облученных лимфоцитах, которое может являться причиной повышенной фрагментации хроматина [Ermakov et al., 2008]. С помощью метода ПЦР было показано, что можно различить длинные фрагменты вкДНК, появляющиеся в циркуляции благодаря некрозу и более короткие фрагменты, появляющиеся в циркуляции в результате апоптоза [Wang et al., 2003]. Это способствовало введению термина «индекс целостности» ДНК (integrity index) [Wang et 25 al., 2003], который отражает степень фрагментации вкДНК. Этот показатель равен отношению количества молекул амплифицированного фрагмента длиной ≈400-200 п.о. к числу молекул амплифицированного фрагмента того же гена длиной ≈100 п.о. [Wang et al., 2003]. Так, индекс целостности внДНК 400 /100 п.о. (для гена β-актина) варьирует от 0,06 до 0,28 [Wang et al., 2003], 356/105 п.о. и 201/105 п.о. (для гена лептина) варьирует соответственно от 0,01 до 0,1 и от 0,2 до 0,5 [Chan et al., 2005]. Эти значения индекса целостности свидетельствуют о наличии одно- и двунитевых разрывов вкДНК. Видимо, фрагментированность вкДНК является причиной, по которой значения концентрации, определяемые методом ПЦР ниже значений, определяемых другими физико-химическими методами, не чувствительными к присутствию разрывов ДНК. Показано, что у онкологических больных индекс целостности выше, чем в выборке здоровых людей и составляет 0,911 [Pinzani et al., 2010]. Индекс целостности вкДНК при подозрении на онкологические заболевания служит маркером обнаружения рака [Gonzalez-Masia et al., 2013]. Индекс целостности вкДНК при использовании количественной ПЦР для ALU-повторов увеличивается на ранних стадиях рака толстой кишки и рака молочной железы [Umetani et al., 2006], а также имеет более высокую, чем концентрация вкДНК прогностическую ценность для определения узловых метастазов в онкологии, для диагностики стадии и метастазирования злокачественных новообразований [Gonzalez-Masia et al., 2013; Umetani et al., 2006]. Индекс целостности коррелирует с размером опухоли при связанной с гепатитом В гепатоцеллюлярной карциноме [Umetani et al., 2006]. Клиническое значение индекса целостности было показано не только для диагностики, но и для мониторинга заболеваний. Например, было обнаружено, что индекс целостности уменьшается в ответ на хирургическое лечение опухолей головы и шеи [Jiang et al., 2006], меланомы [Pinzani et al., 2011], при химиотерапии лейкоза [Gao et al., 2010], при лучевой терапии опухолей носоглотки [Chan et al., 2008], при химиорадиотерапии колоректального рака [Agostini et al., 2011]. Кроме того, сообщалось, что пациенты с высоким индексом целостности вкДНК имели более короткие безрецидивные интервалы [Chan et al., 2008]. Изменения в индексе целостности вкДНК были также обнаружены в других органических жидкостях, например, в моче, и могут быть использованы при ранней диагностике рака мочевого пузыря без применения цитологических методов диагностики [Casadio et al., 2013]. Некоторые авторы считают, что индекс целостности соответствует многим требованиям универсального биомаркера [Schwarzenbach et al., 2011], однако, другие исследователи не поддерживают эту идею [Holdenrieder et al., 2008]. 26 1.1.4. Содержание различных последовательностей во вкДНК ВкДНК по своему составу не идентична ДНК клеточных ядер. При проведении сравнительной гибридизации вкДНК и яДНК с метафазными пластинами было показано различие в характере распределения гибридизационного сигнала [Chan et al., Clin Chem., 2005]. Кроме того, исследуя хромосомное распределение 542 клонов вкДНК, было показано, что во вкДНК доля интронов, экзонов и промежуточных областей гена составляет соответственно 24%, 1% и 75% геномной ДНК [Suzuki et al., 2008]. По составу содержащихся последовательностей вкДНК отлична от ядерной ДНК. Показано, что вкДНК обогащена ГЦ-последовантельностями по сравнению с ядерной ДНК (рисунок 1.2) [Peters and Pretorius, 2012; Suzuki et al., 2008]. Содержание ГЦобогащенных фрагментов во вкДНК варьирует от 30,5% до 74,8%, среднее значение 53,7%, в то время как одержание ГЦ-фрагментов в ядерной ДНК составляет 38% [Chan et al., Clin Chem., 2005; Sano and Morimoto, 1982; Li and Steinman, 1989]. Рисунок.1.2. Содержание ГЦ-последовательностей во вкДНК [Chan et al., Clin Chem., 2005]. Показано, что вкДНК плазмы представляет собой двухцепочечную ДНК с 5 'выступающим концом, при этом 5'- конец обогащен C, а 3'- конец обогащен G [van der Vaart and Pretorius, 2008; Chan et al., Clin Chem., 2005]. Эти структурные характеристики циркулирующих фрагментов вкДНК могут отражать кинетические свойства ферментов, фрагментирующих вкДНК в процессе апоптоза и преимущественно расщепляющих ATобогащенные фрагменты ДНК [van der Vaart and Pretorius, 2008]. Кроме того, структура циркулирующих фрагментов вкДНК может способствовать их стабильности в плазме 27 крови, возможно, через взаимодействие с белками плазмы крови [Peters and Pretorius, 2012; Suzuki et al., 2008]. Данные об обогащении вкДНК ГЦ-последовательностями согласуются с обнаруженным повышенным содержанием во вкДНК фрагментов транскрибируемой области рибосомного повтора [Вейко и соавт., 2006]. Обогащение вкДНК ГЦобогащенной неметилированной последовательностью рибосомного повтора происходит при хронической патологии, которая сопровождается усилением гибели клеток (ишемическая болезнь сердца, хроническая артериальная гипертензия, ревматоидный артрит) [Bulicheva et al., 2007], а также при внешнем хроническом повреждающем воздействии (например, ионизирующее излучение) [Костюк и соавт., 2008] содержание этих ГЦ-богатых маркерных последовательностей в составе вкДНК крови по сравнению с ДНК ядер клеток увеличивается в 10 и более раз (рисунок1.3) [Костюк и соавт., 2008]. Рисунок 1.3. Накопление в составе вкДНК ГЦ-обогащенной области рибосомного повтора [по статье Костюк и соавт., 2013] . Однако после облучения лимфоцитов in vitro ионизирующей радиацией в дозе 10 сГр в течение 3-х часов во вкДНК не происходит существенного увеличения содержания ГЦ-богатой транскрибируемой области рибосомного повтора по сравнению с контролем [Ермаков и соавт., 2011]. Для накопления этой последовательности, видимо, необходимо длительное воздействие повреждающего фактора, в том числе, и ионизирующего излучения [Ермаков и соавт., 2011]. По всей вероятности, механизм накопления ГЦбогатого рибосомного повтора в составе вкДНК связан с тем, что транскрибируемая область рибосомного повтора устойчива к действию нуклеаз плазмы крови [Вейко и Спитковский, 2000]. Таким образом, высокое содержание в составе вкДНК ГЦ- 28 обогащенной рибосомной ДНК – маркер хронически протекающего патологического процесса. Количественное определение содержания последовательности в составе вкДНК можно проводить методом ПЦР-амплификации фрагмента этой последовательности, методом нерадиоактивной количественной дот-гибридизации и с помощью секвенирования [Ермаков и соавт., 2011; Rykova et al., 2013]. Определение содержания повторяющихся последовательностей в составе вкДНК, содержащей повреждения и модификации, методом количественной ПЦР в реальном времени дает заниженные значения при амплификации даже коротких фрагментов транскрибируемой области рибосомного повтора [Ермаков и соавт., 2011]. В основе метода нерадиоактивной количественной дот-гибридизации лежит гибридизация денатурированной вкДНК с биотинированными ДНК-зондами; визуализируется молекула биотина на фильтре в результате ферментативной реакции с коньюгатом –стрептавидин-щелочной фосфатазой. [Вейко и соавт., 2003]. Этот метод практически не чувствителен к повреждениям вкДНК и позволяет более адекватно определять количество рибосомного повтора в составе вкДНК [Ермаков и соавт., 2011]. Секвенирование вкДНК показало, что Alu-повторы составляют непропорционально большую долю во вкДНК по сранению с яДНК, в то же время количество LINE1 повторов уменьшено по сранению с яДНК [Rykova et al., 2013; Morozkin et al., 2012; Beck et al., 2010; Beck et al., 2009; van der Vaart et al., 2009; Stroun et al., 2001]. Методом количественной ПЦР также показано повышенное содержание Alu повторов и сниженное содержание LINE1 повторов во вкДНК по сравнению с яДНК [Ponomaryova et al., 2011]. LINE1 элементы в основном расположены в транскрипционно неактивных областях гетерохроматина, а Alu повторы локализованы в основном в районах эухроматина, характеризующегося транскрипционной активностью [Rykova et al., 2013; Ponomaryova et al., 2011]. Полученные данные позволяют предположить, что уровень деградации вкДНК при апоптозе зависит от плотности упаковки ДНК и связан с транскрипционной активностью генома, что приводит к обогащению вкДНК кодирующими последовательностями [Rykova et al., 2013]. Известно, что районы активной транскрипции хроматина имеют уникальные эпигенетические характеристики [Faulkner et al., 2009]. Низкая плотность упаковки ДНК связана со снижением уровня метилирования по цитозину [Faulkner et al., 2009]. Высокая частота Alu повторов вблизи участков начала транскрипции генов связана с повышенной устойчивостью этих генов к аномальному метилированию при раке [Estecio et al., 2010]. Результаты этих исследований показывают, что один из подходов к поиску маркеров рака во вкДНК может быть связан изучением 29 гипометилированных последовательностей (Alu, транскрибируемой области рибосомного гена), которые чрезмерно представлены во вкДНК [Estecio et al., 2010]. В настоящее время ведется активный поиск во вкДНК мутаций генов, найденных в первичных опухолях [Gonzalez-Masia et al., 2013], поскольку вкДНК содержит, в том числе, и яДНК опухолевых клеток. Среди наиболее часто используемых в качестве маркеров на ранних стадиях канцерогенеза – онкоген KRAS (при ранней диагностике колоректального рака, рака поджелужочной железы, мочевого пузыря); TP53, HER2, BRCA1 (при обнаружении рака молочной железы и для диагностики клинического течения заболевания после терапии); APC, PIK3CA, BRAF (при диагностике рака прямой кишки) [Gonzalez-Masia et al., 2013]. Показано, что вкДНК обогащена митохондриальной ДНК (мтДНК) [Gonzalez-Masia et al., 2013; Yu, 2012]. Митохондрии ответственны за множество клеточных функций включая выработку энергии, формирование свободных радикалов, регуляцию пролиферации клеток и апоптоз [Wallace, 2010]. Митохондрии несут свой собственный генетический материал, митохондриальную ДНК (мтДНК), которая присутствует в сотнях тысяч копий, отчасти из-за отсутствия эффективного механизма репарации ДНК [Yu, 2012]. При гибели клеток в результате апоптоза или некроза логично ожидать, что во внеклеточной среде будут накапливаться фрагменты яДНК и мтДНК пропорционально их количеству в погибших клетках, однако, во вкДНК мтДНК накапливается в большей степени [Yu, 2012]. При ряде патологий (при раке яичников, раке молочной железы) обнаружено накопление мтДНК в составе вкДНК, что может быть одним из диагностических маркеров этих патологий [Gonzalez-Masia et al., 2013, Yu, 2012]. Изучение генетических и эпигенетических изменений гДНК и мтДНК в составе вкДНК является краеугольным камнем исследований в области ранней диагностики рака [Gonzalez-Masia et al., 2013], при этом изучение внеклеточной мтДНК в имеет ряд преимуществ: • митохондриальный геном короче и проще организован, чем ядерная ДНК [Wallace, 2010]. Это уникальное свойство делает скрининг митохондриального генома более простым и экономически эффективным [Yu, 2012]; • большее количество копии мтДНК, по сравнению с ядерной ДНК в составе вкДНК делать диагностику на основе мтДНК более чувствительным методом [GonzalezMasia et al., 2013]; • фрагменты мтДНК были обнаружены в различных жидкостях организма больных раком на ранних стадиях, например, в крови, слюне, моче, мокроте [Gonzalez-Masia et al., 2013]. 30 В настоящее время активно проводится поиск мутаций во внеклеточной мтДНК при раке поджелудочной железы, предстательной железы, толстой кишки и пищевода и других заболеваниях [Gonzalez-Masia et al., 2013]. Кроме того, “индекс целостности мтДНК” (отношение между длинными и короткими фрагментами мтДНК) может служить маркером урологических злокачественных новообразований (почек, простаты и мочевого пузыря) [Ellinger et al., 2012]. 1.1.5. Эпигенетические модификаци вкДНК: метилирование фрагмкетов вкДНК Метилирование ДНК является одним из наиболее распространенных механизмов эпигенетической регуляции [Kim et al., 2013]. Метилирование ДНК было изучено при многих типах рака: при раке толстой кишки, молочной железы, легких и предстательной железы [Ehrlich et al., 2009; Han et al., 2013]. Два вида изменения метилирования ДНК происходят при раке - гипо- и гиперметилирование конкретных генов, а также глобальные изменения метилирования ДНК генома [Ehrlich et al., 2009; Han et al., 2013]. Большинство исследований в области эпигенетики рака было сосредоточено на значении гиперметилирования промотеров генов-супрессоров опухолей [Gonzalez-Masia et al., 2013]. Тем не менее, есть намного меньше исследований гипометилирования ДНК при заболеваниях человека, включая рак, несмотря на то, что паттерн гипометилирования ДНК является известной характеристикой раковых клеток. Это касается, в частности, мобильных генетических элементов, таких как повторы, LINE1, Alu, и т.д. [Ehrlich et al., 2009; Han et al., 2013]. Метилирование вкДНК отражает картину метилирования ДНК ядер клеток [Levenson, 2010; Ramirez et al., 2003]. Эпигенетические изменения при раке, происходящие в яДНК, можно обнаружить во вкДНК, что представляет собой альтернативную возможность для поиска биомаркера ранней стадии диагностики рака [Levenson, 2010; Melnikov et al., 2009; Ramirez et al., 2003]. Изменения профиля метилирования определенных генов в составе вкДНК показано при различных раковых заболеваниях, включая рак простаты, молочной железы, желудка; при меланоме; при нейродегенеративных и психиатрических нарушениях – при болезни Альцгеймера и шизофрении [Levenson, 2010; Zmetakova et al., 2013; Cassinotti et al., 2012; Behrens et al., 2009; Feng et al., 2009; Ramirez et al., 2003] В настоящее время показано, что ионизирующая разиация может влиять на паттерн метилирования ДНК [Pogribny et al., 2004]. Воздействие ионизирующей разиации на паттерн метилирования ДНК зависит от дозы, пола и тканеспецифичных эффектов, что показано в экспериментах на мышах [Pogribny et al., 2004]. Ионизирующая разиация 31 вызывает снижение метилирования параллельно с уменьшением уровня экспрессии ДНК метилтрансфераз (DNMTs; DNMT1, DNMY3a и DNMT3b) и метил-CpG-связывающих белков (MeCP2) [Loree et al., 2006, Raiche et al., 2004]. Эти результаты позволяют предположить, что индуцированный ионизирующей разиацией гипометилированный паттерн ДНК может привести к геномной нестабильности в облученных клетках [Pogribny et al., 2004]. Логично ожидать, что и во вкДНК после действия ионизирующей радиации будет наблюдаться снижение уровня метилирования, однако, необходимы серьезные исследования влияния ионизирующего излучения на метилирование вкДНК. Мало известно и о том, как метилирование ДНК изменяется в раковых клетках после радиационного облучения [Hofstetter et al., 2010; Kuhmann et al., 2011; Chaudhry et al., 2012]. Так, показано, что индуцированное 5-азацитидином гипометилирование ДНК приводит к повышению чувствительности клеток к ионизирующей радиации при раке толстой кишки [Hofstetter et al., 2010]. В клетках рака молочной железы при воздействии фракционированной ионизирующей радиации выявлено несколько локус-специфических изменений метилирования ДНК, в основном, потеря метилирования (TRAPP9, FOXC1 и LINE1) [Kuhmann et al., 2011]. Показано, что существуют дифференциальные изменения метилирования ДНК между радиочувствительными и радиорезистентными клетками [Chaudhry et al., 2012]. Хотя активно исследовались изменения, происходящие в раковых клетках при использовании радиоактивного облучения, однако, эпигенетические механизмы, которые приводят к изменениям метилирования ДНК, остаются неизвестными [Chaudhry et al., 2012]. Более широкое изучение эпигенетических изменений при радиационном воздействии на раковые клетки может открыть новые возможности для развития таргетной терапии рака, а также способствовать поиску эпигенетических изменений в профиле метилирования вкДНК для обнаружения маркеров эффективности радиационного воздействия при раке [Kuhmann et al., 2011; Levenson et al., 2010]. Исследование профиля метилирования вкДНК при различных заболеваниях и при действии повреждающих агентов, в том числе, при радиационном воздействии, открывает широкие возможности для поиски специфичных и точных биомаркеров, однако, для эффективного поиска биомаркеров необходимо совершенствовать методы анализа метилирования вкДНК [Levenson et al., 2010]. 1.1.6. Окислительная модификация оснований вкДНК. В условиях окислительного стресса, вызванного внешним воздействием (например, при действии ионизирующего излучения), или при патологии значительно возрастает уровень окислительной модификации ДНК ядер клеток [Roszkowski et al., 2014; Rodriguez 32 et al., 2013]. Клетки с высоким уровнем окислительных нерепарируемых повреждений ДНК гибнут, пополняя пул вкДНК фрагментами окисленной вкДНК (рисунок 1.4.) [Ermakov et al., 2013]. При окислительном стрессе все основания ДНК способны окисляться в той или иной степени [Roszkowski et al., 2014; Rodriguez et al., 2013]. Основными продуктами окисления ДНК ядер клеток являются тимидин гликоль и 8гидрокси-2'-деоксигуанозин (8-oxodG) [Ermakov et al., 2013; Russo et al., 2004; Speina et al., 2005]. Наиболее широко используемый "маркер" для окислительных повреждений ДНК 8-oxodG [Rodriguez et al., 2013]. 8-OxodG образуется в ДНК либо с помощью прямого окисления нуклеиновых кислот, или может быть инкорпорирован из нуклеотидного пула ДНК-полимеразой [Russo et al., 2004; Speina et al., 2005]. Рисунок 1.4. Схема образования окисленных фрагментов вкДНК. Действие ионизирующей радиации вызывает окислительный стресс в клетках организма и приводит к синтезу актиных форм кислорода (АФК); процесс формирования АФК после облучения занимает от нескольких секунд до 2-5 минут от начала экспозиции в различных типах клеток [Leach et al., 2001]. АФК вызывают множественные поражения клеточной ДНК, в числе которых - образование окисленных оснований [Ermakov et al., 2013]. Известно, что многие хронические заболевания сопровождаются увеличением 33 окисления геномной ДНК [Roszkowski et al., 2014; Ermakov et al., 2013]. Обнаружено окисление геномной ДНК у больных раком легких, при хронической почечной недостаточности, при бронхиальной астме, при наследственной оптической невропатии Лебера, при болезни Паркинсона, Альцгеймера, при анемии Фанкони, у пациентов с ишемической болезнью сердца степень окисления геномной ДНК коррелирует с тяжестью заболевания [Roszkowski et al., 2014; Ermakov et al., 2013; Collado et al., 2011; Haider et al., 2011; Yurdakul et al., 2011; Yen et al., 2004]. Частота 8-oxodG в образцах геномной ДНК (гДНК) клеток здорового донора содержит приблизительно от 0,1 до 0,5 8-oxodG на миллион нуклеотидов [Mangal et al., 2009] Однако нормальные ткани молочной железы пациентов, больных раком, имеют значительно более высокий уровень окислительных повреждений ДНК – 25 8-oxodG на миллион нуклеотидов [Li et al., 2001]. При карциноме молочной железы, уровень 8-OHdG увеличен в 8 - 17-раз в первичной опухоли груди по сравнению с нормальной тканью молочной железы [Valavanidis et al., 2009]. Было показано, что митохондриальная ДНК является основным носителем окисленных оснований ДНК [Cossarizza et al., 2011]. Содержание 8-oxodG составляет около 20 оснований на миллион нуклеотидов в интактной митохондриальной ДНК и около 300 оснований на миллион нуклеотидов в митохондриальной ДНК при окислительном стрессе [Cossarizza et al., 2011]. Имеющиеся в литературе многочисленные данные о содержании 8-oxodG в плазме/сыворотке крови позволяют оценить примерный уровень окисления вкДНК [Ermakov et al., 2013]. Ряд авторов отмечают значительные различия в уровне 8-oxodG в сыворотке, определяемом методом ELISA и методами HPLC [Hu et al., 2011; Wang et al., 2011]. Эти различия связаны с тем, что 8-oxodG циркулирует в крови, как в свободном виде, так и в связанном виде в составе окисленной вкДНК [Ermakov et al., 2013]. Метод ELISA определяет общую концентрацию 8-oxodG, которая у здоровых доноров составляет 0.3 - 5.9 нг/мл плазмы/сыворотки [El-Zein et al., 2010; Hamurcu et al., 2010; Bloomer et al., 2008]. Методы, включающие HPLC, детектируют только свободный 8oxodG, концентрация которого в плазме/сыворотке крови по данным разных авторов составляет 0.013-0.022 ng/ml [Hu et al., 2011; Wang et al., 2011; Chang et al., 2011]. Можно оценить нижний предел содержания 8-oxodG в составе вкДНК плазмы/сыворотки крови [Ermakov et al., 2013]. Если общая концентрация вкДНК составляет 1000 нг/мл (максимально определяемые количества), а концентрация связанного 8-oxodG - 0.3 – 0.022 ≈ 0.28 нг/мл (минимальная концентрация), то минимальное содержание 8-oxodG во вкДНК плазмы/сыворотки оценивается примерно в 280 8-oxodG на миллион 34 нуклеотидов, что значительно выше, чем концентрации 8-oxodG в составе клеточной ДНК [Ermakov et al., 2013]. Конечно, эта оценка завышена, поскольку свободный 8-oxodG может циркулировать не только в виде нуклеозида, но и в виде нуклеотида и трифосфата, но данных о содержании этих соединений в плазме/сыворотке крови пока нет [Ermakov et al., 2013]. В составе вкДНК содержание маркера окисления ДНК - 8-охоdG достигает 300 и более на миллион нуклеотидов [Loseva et al., 2012]. Особенно высоко содержание 8-охоdG во вкДНК онкологических больных и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и может достигать 3000 8-oxodG на миллион нуклеотидов [Loseva et al., 2012]. Основная причина обогащения вкДНК маркером окисления 8-oxodG – это преимущественная гибель клеток с высоким уровнем окисления клеточной ДНК [Ermakov et al., 2013]. Однако на содержание маркера окисления 8-oxodG в составе вкДНК может влиять и другой процесс – значительное увеличение в составе вкДНК по сравнению с ядерной ДНК содержания GC-богатых последовательностей генома [Ermakov et al., 2013; Loseva et al., 2012]. Кроме того, при стрессе в составе вкДНК возрастает содержание митохондриальной ДНК, которая содержит повышенное количество маркера окисления 8oxodG [Cossarizza et al., 2011]. Помимо 8-oxodG, в составе вкДНК присутствуют другие продукты окислительной модификации, которые также могут значительно изменять эпигенетические характеристики вкДНК [Ermakov et al., 2013]. Таким образом, содержание 8- охоdG в составе вкДНК может служить маркером окислительного стресса в организме [Ermakov et al., 2013]. 1.1.7.Свойства вкДНК определяют ее характеристики как маркера при патологии и при опасных для генома воздействиях. Исследование свойств вкДНК (концентрации, фрагментации, состава, окисления) в норме и патологии способствует применению вкДНК в качестве маркера при острых и хронических заболеваниях и при действии повреждающих факторов (рисунок 1.5). При патологии, травме, беременности, при действии радиации в плазме крови повышается концентрация вкДНК; особенно значительно увеличена концентрация вкДНК при острых состояниях в ближайшие часы после воздействия: травма, инфаркт, инсульт, лучевое поражение [Cui et al., 2013; Bliksøen et al., 2012; Tsai et al., 2011; Ren et al., 2013; Fleissner et al., 2012; Nielsen, 2012; Dwivedi et al., 2012; Shimony et al., 2010; Swarup and Rajeswari, 2007; Urbanova et al., 2010; Hanaoka et al., 2012]. 35 Рисунок 1.5. Циркулирующая внеклеточная ДНК – маркер при различных патологических состояниях, сопровождающихся повышенной гибелью клеток. ВкДНК является прогностическим маркером выживания при терминальных состояниях в отделениях интенсивной терапии; повышение концентации вкДНК более, чем в 2 раза, является неблагоприятным прогнозом [Kung et al., 2012; Rhodes et al., 2006]. Концентрация вкДНК в травматологии напрямую связана с тяжестью травмы, в первые часы после аварии концентрация вкДНК служит предиктором смертности с чувствительностью и специфичностью 100 % и 81 %, соответственно [Lo et al., 2000]. Прогностическое значение концентрации вкДНК также было показано у пациентов с острым инфарктом миокарда и острым инсультом [Borissoff et al., 2013; Chang et al., 2003; Rainer et al., 2003]. Показано увеличение уровня концентрации вкДНК в плазме крови в первые 48 часов после ожога: уровень вкДНК коррелирует с серьезностью поражения, определяемой по проценту площади поверхности поражения [El Messaoudi et al., 2013]. Не только острые состояния, характеризующиеся гибелью большого числа клеток, сопровождаются повышением уровня вкДНК: повышение концентрации вкДНК и органоспецифичной вкРНК характерно для ряда аутоиммунных заболеваний и сахарного диабета [Nielsen, 2012]. Диабетическую ретинопатию, которая является серьезным осложнением диабета, трудно обнаружить, однако повышение концентрации мРНК родопсина может служить маркером развивающейся диабетической ретинопатии [Swarup and Rajeswari, 2007]. Уровень вкДНК может быть биомаркером при серповидно-клеточной анемии, сопровождаемой гемолизом, вазоокклюзией и воспалением [Swarup and Rajeswari, 2007]. При пролонгированной микардиальной ишемии также обнаруживают повышенный 36 уровень вкДНК, поскольку длительная ишемия в конечном счете приводит к некрозу, что вызывает повторый выброс вкДНК в циркуляцию [Borissoff et al., 2013]. Однако наряду с увеличением может наблюдаться и уменьшение концентрации вкДНК [Вейко и соавт., 2003; Костюк и соавт., 2008]. Одно из возможных объяснений – сильная фрагментация вкДНК вследствие увеличения эндонуклеазной активности; вкДНК расщепляется до коротких фрагментов и активно выводится из организма [Вейко и соавт., 2008; Chan et al., 2005; Suzuki et al., 2008]. Появление на электрофореграмме образца вкДНК «нуклеосомной лесенки» - маркер патологии, которая сопровождается усиленным апоптозом клеток (рисунок 1.1) [Radic et al., 2013]. При аутоиммунных заболеваниях, при действии радиации или при химиотерапии в составе вкДНК преобладают моно - и олигонуклеосомные фрагменты ДНК [Radic et al., 2013; Vasilyeva, 2001]. Изменение состава вкДНК также может служить маркером патологии [Вейко и соавт., 2006; Gonzalez-Masia et al., 2013, Yu, 2012; Bulicheva et al., 2007]. Показано, что в составе вкДНК накапливаются ГЦ-последовательности, которые более устойчивы к нуклеазному гидролизу, чем АТ-фрагменты вкДНК (рисунок 1.3) [Вейко и соавт., 2006; Peters and Pretorius, 2012; Suzuki et al., 2008]. Так, содержание ГЦ-обогащенной умеренно повторяющейся последовательности генома - транскрибируемой области рибосомного повтора (ТОрДНК) в составе вкДНК в несколько раз превышает содержание этого повтора в ДНК клеточных ядер [Вейко и соавт., 2006; Костюк и соавт., 2008; Ермаков и соавт., 2011; Bulicheva et al., 2007]. При хронической патологии, которая сопровождается усилением гибели клеток (при ишемической болезни сердца, при артериальной гипертензии, при ревматоидном артрите), а также при внешнем хроническом воздействии (малые дозы ионизирующего излучения) содержание этих ГЦ-богатых маркерных последовательностей в составе вкДНК крови по сравнению с гДНК увеличивается в 10 и более раз [Вейко и соавт., 2006; Костюк и соавт., 2008; Bulicheva et al., 2007]. Таким образом, высокое содержание в составе вкДНК ГЦ-богатой рибосомной ДНК – маркер хронически протекающего патологического процесса (рисунок 1.5). ВкДНК содержит значительное количество окисленных оснований по сравнению с гДНК [Rodriguez et al., 2013]. Если содержание известного маркера окисления ДНК – 8охоdG в составе гДНК в норме и при патологии варьирует в среднем от 1 до 10 на миллион нуклеотидов, то в составе вкДНК содержание 8- охоdG достигает 300 и более на миллион нуклеотидов [Ermakov et al., 2013]. Особенно высоко содержание 8-охоdG во вкДНК онкологических больных и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями [Loseva et al., 2012].Содержание 8-охоdG в составе вкДНК – чувствительный маркер 37 окислительного стресса в организме, в том числе, при действии ионизирующей радиации (рисунок 1.5). 1.1.7.1. Применение вкДНК в качесве маркера ранней диагностики в онкологии Начиная с 1994 года вкДНК стали рассматривать как потенциальный маркер при диагностике рака [Swarup and Rajeswari, 2007]. Во многих работах отмечается повышенная концентрация вкДНК у больных раком по отношению к выборке здоровых людей [Marzese et al., 2013; Ramachandran et al., 2013; Schwarzenbach 2013; Breitbach et al., 2012; Cheng et al., 2009; Frattini et al., 2006]. [Jung et al., 2010; Schwarzenbach et al., 2013; Katsuda et al., 2013; Roth et al., 2011; Cassinotti et al., 2013]. Однако уровень вкДНК плазмы не является постоянным, он колеблется в течение большого промежутка времени, и связан не только с ростом опухоли [Xiang et al., 2013; Cassinotti et al., 2013]. Поэтому, только измерений уровня вкДНК не достаточно, более информативным является обнаружение маркера ДНК [Marzese et al., 2013; Ramachandran et al., 2013; Schwarzenbach et al., 2013]. Известно, что фрагменты ДНК/РНК, обнаруживаемые в плазме крови при раке являются результатом лизиса опухолевых клеток [Schwarzenbach et al., 2013]. Активированные онкогены, мутации в генах-супрессорах опухоли, таких как p53, хромосомные перестройки и гиперметилирование промоторов генов являются частью обычно обнаруживаемой наследственной изменчивости при раке [Martinez et al., 2013; Bidard et al., 2013; Dobrzycka et al., 2010]. В раковой клетке накапливаются генетические и эпигенетические изменения, раковые клетки погибают и в циркуляцию поступают свободные нуклеиновые кислоты, для которых также характерны хромосомные изменения, точечные мутации, микросаттелитная нестабильность, и гиперметилирование генов-супрессоров опухоли [Martinez et al., 2013; Bidard et al., 2013; Dobrzycka et al., 2010; Schwarzenbach et al., 2013; Katsuda et al., 2013; Zane et al., 2013; Urbanova et al., 2010]. Чтобы обнаружить точечные мутации во вкДНК, связанные с опухолью, в плазме или сыворотке больных раком, используется аллель-специфичная ПЦР [Martinez et al., 2013; Bidard et al., 2013; Dobrzycka et al., 2010; Zane et al., 2013]. Этот метод позволяет детектировать мутантные последовательности, присутствующие в плазме в низкой концентрации [Martinez et al., 2013; Zane et al., 2013; Gormally et al., 2006]. Кроме того, диагностика по мутациям во вкДНК – ранний маркер канцерогенеза, отдаленного метастазирования и рецидивов [Kukita et al., 2013; Lecomte et al., 2012; Swarup and Rajeswari, 2007]. Так, мутации в генах TP53 или KRAS обнаруживались во вкДНК здоровых доноров в среднем соответственно за 20.8 месяцев и за 14.3 месяца до постановки диагноза рака [Lecomte et al., 2012; Gormally et al., 2006; Dobrzycka et al., 2010]. Выявление редких мутаций в циркулирующей ДНК опухоли при разных формах 38 рака с помощью секвенирования нового поколения имеет значительный потенциал для диагностических целей [Kukita et al., 2013]. Основным препятствием для использования этого метода является высокая частота ошибок чтения результатов сиквенса [Kukita et al., 2013]. Хромосомные перестройки – еще один класс событий, которые могут происходить при неоплазии [Leary et al., 2012]. Во вкДНК больных неходжкинской лимфомой были обнаружены перестройки гена тяжелой цепи иммуноглобулина, во вкДНК при колоректальном раке и раке молочной железы выявлены перестройки генов ERBB2 и CDK6 [Campos et al., 2013; Swarup and Rajeswari, 2007]. Микросаттелитная нестабильность, частичная потеря гетерозиготности (LOH - loss of heterozygosity), наблюдалась непосредственно и в ткани опухоли, и в соответствующей вкДНК [Schwarzenbach et al., 2012]. Обнаружение LOH в сыворотке – маркер течения и исхода заболевания, а также результативности проводимой терапии при злокачественной меланоме, при раке молочной железы, приколоректальном раке [Schwarzenbach et al., 2012; Lecomte et al., 2012; Tong et al., 2006]. Этот метод также имеет ограничения из-за распространенности явления LOH [Tong et al., 2006]. Микросаттелитная нестабильность обнаруживается при многих типах рака: при раке ободочной и прямой кишки, немелкоклеточном раке легких (NSCLC) меланоме, раке яичников, молочной железы, легких, острой миелоидной лейкемии и миелодисплазии [Lecomte et al., 2012; Tong et al., 2006]. Во многих случаях уровень и постоянство микросаттелитной нестабильности, является прогностическим критерием рецидивов и коррелирует с тяжестью течения заболевания [Lecomte et al., 2012; Tong et al., 2006] [Yi et al., 2013; Han et al., 2013; Zane et al., 2013; Zmetakova et al., 2013; Cassinotti et al., 2012; Levenson et al., 2010; Melnikov et al., 2010; Estecio et al., 2010; Ehrlich et al., 2009]; Помимо генетических изменений, во вкДНК плазмы или сыворотки крови больных раком наблюдаются эпигенетические изменения, связанные с опухолью [Yi et al., 2013; Han et al., 2013; Zane et al., 2013; Levenson et al., 2010]. Метилирование ДНК физиологический процесс, который является активным в здоровых клетках, но большое число заболеваний связано с нарушением процесса метилирования [Han et al., 2013; Zmetakova et al., 2013; Cassinotti et al., 2012; Feng et al., 2009]. Метилирование CpGостровков в промотерной области генов-супрессоров опухоли может привести к подавлению активности гена, не изменяя ее кодирующую последовательность [Yi et al., 2013; Han et al., 2013]. Метилирование определенных генов описано как раннее событие канцерогенеза, обнаружение метилированной вкДНК позволяет проводить раннюю диагностику разных типов рака: печени, легкого, молочной железы, пищевода, яичников, 39 колоректального рака [Yi et al., 2013; Han et al., 2013; Zane et al., 2013; Zmetakova et al., 2013; Weiss et al., 2013; Cassinotti et al., 2012; Levenson et al., 2010; Melnikov et al., 2010; Estecio et al., 2010; Ehrlich et al., 2009; Swarup and Rajeswari, 2007]. Первое сообщение об использовании присутствующей вкРНК в сыворотке как маркера опухолевого процесса относится к 1987 году [Tong et al., 2006]. В случае неоплазии вкРНК считается более чувствительным маркером, чем вкДНК [Kurisetty et al., 2014]. В течение последнего десятилетия сделан большой шаг вперед по исследованию вкРНК при различных опухолях [Kurisetty et al., 2014; Arroyo et al., 2011]. ВкРНК обнаружена при раке груди, печени и легких, раке ободочной и прямой кишки, фолликулярной лимфоме, раке простаты, злокачественной меланоме, гепатоцеллюлярной карциноме, сквамозной клеточной карциноме головы и шеи [Kurisetty et al., 2014; Rani et al., 2013; Kosaka et al., 2013; Turchinovich et al., 2011; Arroyo et al., 2011]. Выявление опухоль-ассоциированных транскриптов вкРНК открывает возможность более широкого изучения экспрессионных профилей генов при различных типах рака [Turchinovich et al., 2011]. Показано, что внеклеточный транскриптом отличается у больных раком от транскриптома сыворотки здоровых людей по более, чем 300 генам при разных типах рака [Turchinovich et al., 2011; Arroyo et al., 2011]. Исследование полноразмерного транскриптома сыворотки крови, возможно, позволит выявить маркеры стадий канцерогенеза [Rani et al., 2013]. Анализ микроРНК в составе вкРНК представляют большой интерес для диагностики рака - накапливаются данные, что микроРНК играют важную роль в канцерогенезе, являясь регуляторами клеточных процессов: пролиферации, дифференцировки, апоптоза, выживания, подвижности и морфогенеза [Kurisetty et al., 2014; Turchinovich et al., 2011]. Однако, так же, как и в случае применения вкДНК в качестве маркера, для вкРНК требуется стандартизация методов выделения, хранения и анализа, чтобы нивелировать существующий в литературе разброс данных [Swarup and Rajeswari, 2007]. 1.1.7.2. Применение вкДНК в качесве маркера в пренатальной диагностике, транспланталогии и других областях диагностики. Рутинные иследования, применяемые в пренатальной диагностике, включая хориоцентез, амниоцентез и кордоцентез, связаны с риском потери плода [Chiu and Lo, 2013]. В 1997 году впервые было показано наличие циркулирующей вкДНК эмбриона в плазме беременной женщины, когда обнаружили последовательность ДНК Y-хромосомы в материнской плазме [Urbanova et al., 2010]. Обнаружение внеклеточных нуклеиновых в плазме и сыворотке привело к созданию нетравматичных методов пренатальной диагностики, направленных на обнаружение патологии эмбриона и связанных с 40 беременностью осложнений [Lo, 2013; El Messaoudi et al., 2013; Chiu and Lo, 2013; Barrett et al., 2011; Pinzani et al., 2010; Chan et al., 2005]. При усовершенствовании чувствительности и специфичности методов детекции и анализа, вкДНК материнской плазмы оказалась маркером многих процессов, связанных с патологией протекания беременности [El Messaoudi et al., 2013; Chiu and Lo, 2013; Tsui an Lo, 2012; Lo, 2013]. Анализ вкДНК позволяет проводить диагностику Резус-фактора D, состояния пола у плода, анеуплоидии, трисомии 21, 18, 13, эндокринных и неврологических нарушений плода [Gahan, 2013; Chiu and Lo, 2013; Yu et al., 2013; Tsui et al., 2012; Hill et al., 2012]. Изменения концентрации вкРНК в материнской плазме связано с рядом расстройств при беременности, таких как преэклампсия, геморрагия и полигидрамнион (многоводие) [Tsui et al., 2012; Hill et al., 2012]. Успешная пренатальная диагностика заболеваний с менделеевским наследованием включает определение унаследованных родительских аллелей или мутаций в материнской плазме [Lo, 2013; Hahn et al., 2009]. Успешно диагностируются по вкДНК материнской плазмы такие аутосомно-доминантные заболевания, как ахондроплазия, миодистрофия и болезнь Хантингтона [Lo, 2013; Lo and Chiu et al., 2012; Tsui et al., 2012; Hahn et al., 2009]. В случае диагностики наследования аутосомно-рецессивных заболеваний анализ вкДНК позволяет исключить наследование врожденной гиперплазии надпочечниковй, муковисцедоза и бета-талассемии [Tsui et al., 2012]. В настоящее время проведен полногеномный сиквенс ДНК плода по вкДНК плазмы матери [Bianchi and Wilkins-Haug, 2014]. Плацентарная вкРНК, выделяемая из материнской плазмы, увеличивает количество маркеров патологии беременности и открывает новые горизонты для пренатальной диагностики, позволяя пренебрегать полом плода и разницей в полиморфизмах матери и плода [El Messaoudi et al., 2013]. Однако исследования вкРНК плаценты проводились на небольших выборках, для надежного определения анеуплоидии и заболеваний с менделеевским наследованием необходимы исследования широкого масштаба на больших когортах [El Messaoudi et al., 2013; Fox et al., 2012; Fernando et al., 2010]. Постоянно пополняется спектр методов исследования вкДНК. Для массспектрометрии были разработаны дополнительные протоколы определения однонуклеотидных полиморфизмов, трисомии по 21 хромосоме, трисомии по 18 хромосоме [Sharma et al., 2011; Sayres et al., 2011]. Цифровая ПЦР - новый метод количественной оценки нуклеиновых кислот в плазме, когда требуется высокая точность и чувствительность [Tsui and Lo, 2012]. В цифровой ПЦР образец разделяют на большое количество отдельных микрореакций амплификации. Если в микрореакции содержится 41 целевая молекула, получается положительный сигнал, если нет – отрицательный, который учитывают при подсчете абсолютного количества мишеней в образце [Tsui and Lo, 2012]. В данном подходе используется статистика Пуассона [Tong et al., 2006]. Метод цифровой ПЦР применяют не только для определения точной концентрации вкДНК/РНК, но и для определения уровня экспрессии, копийности генов и обнаружения редких аллелей [Tsui and Lo, 2012; Tong et al., 2006]. Эмульсионная ПЦР позволяет использовать в качестве матрицы малые количества вкДНК – в миллилитровом объеме проходят миллионы невзаимодействующих микрореакций амплификации [Sayres et al., 2011]. Использование микрофлюидных чипов в биомедицине – серьезный скачок в развитии диагностики, в том числе, вкДНК: микрофлюидные ПЦР системы позволяют с высокой чувствительностью проводить количественный анализ вкДНК за короткий промежуток времнени [Sayres et al., 2011]. Преамплификация может повышать чувствительность методов, особенно в случае анализа эмбриональной вкДНК в материнской плазме, что позволяет выявить различия, даже когда анеуплоидный материал составляет 10 % исследованного образца [Sayres et al., 2011]. Shotgun секвенирование последовательности с – метод использованием определения крупных первичной стохастических нуклеотидной фрагментов с перекрывающимися последовательностями – эффективный современный нетравматичный метод обнаружения анеуплоидии в пренатальной диагностике [Canick et al., 2012]. Этим методом успешно диагностированы все девять случаев трисомии 21 хромосомы, два случая трисомии 18 хромосомы и один случай трисомии 13 хромосомы в смешанной выборке 18 образцов вкДНК, выделенной из плазмы беременных без патологии и с анеуплоидией [Canick et al., 2012]. Еще одна область медицины, в которой перспективно исследование вкДНК медицинская транспланталогия. Даже при применении иммунодепрессантов отторжение аллотрансплантата является серьезной проблемой. Донорский генетический материал может сохраниться в кровообращении после трансплантации, поэтому проводят анализ наличия вкДНК донора в организме реципиента [El Messaoudi et al., 2013]. Диагностика последствий ионизирующего излучения с использованием вкДНК – одна из перспективных областей применения вкДНК в качестве маркера [Umetani et al., 2006; Kim et al., 2013]. Изучение свойств, биолгического действия и поведения вкДНК в крови – начиная от способов ее появления в циркуляции и заканчивая ее биологическим действием на живые клетки – необходимо для поиска адекватных маркеров. Есть все предпосылки того, что диагнотика на основе нуклеиновых кислот окажется очень полезным инструментом диагностики при многих заболеваниях и при действии повреждающих агентов на клетки. 42 1.2. Происхождение вкДНК. Механизм появления вкДНК в циркуляции Хотя количество данных, доказывающих наличие высокого уровня циркулирующих нуклеиновых кислот в плазме пациентов при различных патологиях увеличиваются день за днём, происхождение вкДНК все еще остается предметом дискуссий [Peters and Pretorius, 2011; van der Vaart and Pretorius, 2007; Pisetsky, 2012; Gahan and Stroun, 2010]. Существует несколько теорий о происхождении вкДНК в плазме/сыворотке крови. Основные гипотезы – это образование пула внеклеточных нуклеиновых кислот в результате гибели клеток (“теория клеточной гибели”) и активная секреция живыми клетками (теория “метаболической ДНК“), [Pisetsky, 2012; Peters and Pretorius, 2011; Gahan et al., 2008]. Хотя спектр патологий, при которых повышается уровень вкДНК широкий – от беременности до злокачественного перерождения, большинство этих состояний, вероятнее всего, ассоциированы с воспалением или повышенным уровнем гибели клеток [Pisetsky, 2012]. ДНК, таким образом, может быть количественным биомаркером уровня гибели клеток, обеспечивая общую оценку процесса клеточной гибели [Вейко и соавт., 2006; Pisetsky, 2012]. В настоящее время известно, что гибель клеток может происходить разными путями, которые различаются механизмом развития (рисунок 1.6) [Stevens et al., 2013; Griffith, 2011]. Условно гибель клеток опосредуется тремя основными путями с точки зрения их потенциального вклада в пул вкДНК: апоптоз, некроз и NETosis [Pisetsky, 2012; van der Vaart and Pretorius, 2008]. Апоптоз является регулируемой формой клеточной гибели и опосредован ферментативными каскадами, регулируемыми внутренними или внешними факторами [Booth et al., 2013; ]. Некроз является случайной формой гибели клеток индуцированной химическим или физическим повреждением, однако, в зависимости от пускового фактора, некроз может регулироваться и перейти под контроль ферментативных процессов [Stevens et al., 2013; Pisetsky, 2012]. В последнее время стали выделять отдельно некроптоз (necroptosis) - форму запрограммированной клеточной смерти, независимой от каспаз, но зависимой от RIPK и RIPK3 [Yu et al., 2013]. Наконец, нетоз (NETosis) ограничен определенными типами гемопоэтических клеток (нейтрофилов) и является быстрым, почти взрывным процессом выброса ДНК, с прикрепленными цитоплазматическими и гранулированными белками, как процесс антибактериальной защиты [Cooper et al., 2013; Yipp and Kubes, 2013; Pisetsky, 2012; Papayannopoulos et al., 2010]. Наиболее популярной является «теория апоптоза», которая предполагает появление вкДНК в кровотоке в результате апоптотической гибели клеток, содержащих 43 ядро (рисунок 1.6) [Ermakov et al., 2013; Pisetsky, 2012; Peters and Pretorius, 2011; Schwarzenbach et al., 2011]. Рисунок 1.6. Схематическое представление различных путей, которыми нуклеиновые кислоты попадают в циркуляцию. Считается, что в крови существует субпопуляция лимфоцитов, чувствительных к индукции апоптоза малыми дозами радиации, эту немногочисленную – около 2% от общего числа клеток субпопуляцию называют лимфоцитами "мутаторного фенотипа", "адаптивных мутаций" или же клетками "онтогенетического резерва" [Спитковский, 1992; Brenner et al., 2001; Nagasawa and Little, 2002; Nikjoo and Khvostunov, 2003]. Это субпопуляция активированных клеток крупного размера, диаметром ≈ 8 мкм, спонтанно включающих 3Н-тимидин, имеющия на поверхности маркеры CD25 и CD71, отличающаяся повышенной радиочувствительностью, сниженной активностью темновой репарации и высоким уровнем спонтанных хромосомных аберраций и апоптоза, возрастающего после воздействия ионизирующего излучения [Ермаков и соавт., 2000; Brenner et al., 2001; Nikjoo and Khvostunov, 2003]. Однако полагают, что количество вкДНК при апоптотической гибели лейкоцитов минимально и не может составлять тех значений, которые обнаруживаются в крови в норме - 1.0 - 36 нг/мл [Gahan et al., 2010]. Поскольку диплоидный лейкоцит содержит 7 пг ДНК, концентрация вкДНК 30 - 63 нг/мл крови будет соответствовать тотальной гибели всей популяции лейкоцитов, следовательно, в норме 10-50 % популяции лейкоцитов должны участвовать в апоптозе 44 одновременно, что маловероятно [Gahan et al., 2010]. Следовательно, в процессе апоптоза при образовании пула вкДНК должны участвовать не толко лейкоциты [Gahan et al., 2010]. Размер фрагментов вкДНК погибших клеток отражает различия в механизмах гибели [Ermakov et al., 2008; Tong et al., 2006]. Апоптоз, как основной источник вкДНК, должен приводить к образованию в сыворотке фрагментов вкДНК, поскольку при апоптозе происходит активный процесс нуклеазного гидролиза, в крови накапливаются молекулы ДНК низкой молекулярной массы, эквивалентные кратному целому числу копий ДНК нуклеосом (185-200 п.о.), что и обнаруживается при электрофорезе вкДНК – появляется “апоптотическая лесенка” (рисунок 1.1) [Ermakov et al., 2008; Tong et al., 2006]. При раке апоптоз также рассматривают как источник образования вкДНК, поскольку электрофоретическая картина (например, при раке легких и поджелудочной железы) также соответствует процессу апоптоза [Tong et al., 2006]. Однако в нормальных условиях фрагменты циркулирующей ДНК апоптотических клеток должны фагоцитироваться макрофагами и дендритными клетками на заключительном этапе [Pisetsky, 2012] и не должны поступать в кровь. Однако было показано, что макрофаги как раз и необходимы для появления вкДНК в крови [Jiang et al., 2003]. Показано, что у мышей, получавших клодронат в липосомах (clodronate liposomes), чтобы исчерпать макрофаги, вкДНК не появляется в крови после индукции апоптоза [Jiang et al., 2003]. Эти результаты вызывают удивление, поскольку они предполагают, что наличие большого количества мертвых и умирающих клеток не является достаточным для появления вкДНК в крови, а необходимо взаимодействие мертвых и умирающих клеток с макрофагами. По этому сценарию макрофаги могут поглощать и переваривать мертвые и умирающие клетки и расщеплять ДНК на фрагменты с более низким молекулярным весом как побочный продукт [Pisetsky, 2012]. Кроме того, концентрационный взрыв ДНК в крови может являться неудачной попыткой макрофагов убрать мертвые и умирающие клетки – при превышении пропускной способности фагоцитоза макрофаги могут погибнуть, и в крови появятся и ДНК макрофага, и ДНК захваченной клетки. [Radic and Marion, 2013]. Еще одно доказательство апоптотического происхождения вкДНК получено при идентификации митохондриальной ДНК в составе вкДНК [Yu, 2012; Bliksøen et al., 2012; Tsai et al., 2010]. Повышение митохондриальной вкДНК наблюдалось у пациентов при травме, инфекции, при инфаркте миокарда, ишемии, разных формах рака [Ren et al., 2013; Cossarizza et al., 2011; Yu, 2012; Bliksøen et al., 2012; Tsai et al., 2010]. Повышение митохондриальной вкДНК коррелировало с неблагоприятным прогнозом при раке простаты – 2,6-кратное увеличение уровня миитохондриальной вкДНК наблюдалось у 45 пациентов при раке простаты с летальным исходом по сравнению с выжившими независимо от возраста [Tong et al., 2006]. Сомнения об исключительности попадания вкДНК в кровь при раке только благодаря апоптозу связаны с тем, что механизм апоптоза подавлен в пролиферирующих клетках опухоли, однако у больных раком в среднем повышен уровень вкДНК в плазме крови, что ослабляет «теорию апоптоза» [Swarup and Rajeswari, 2007]. «Теория некроза» предполагает появление повышенных количеств вкДНК в плазме, в частности, у больных раком, из-за некроза опухоли [Swarup and Rajeswari, 2007]. При некрозе, особенно при быстрых формах, который следует за сильной травмой, ДНК выходит из клетки нетронутой и обладает высокой молекулярной массой [Swarup and Rajeswari, 2007; van der Vaart and Pretorius, 2007]. При электрофорезе вкДНК, образующаяся из некротических клеток и переваривающаяся только частично и неспецифично, должна формировать полосы, соответсвующие 10,000 п.о. и выше [Ermakov et al., 2008; van der Vaart and Pretorius, 2007]. Действительно, некоторые образцы плазмы крови содержат фрагменты ДНК высокого молекулярного веса от 21 т.п.о. до 80 т.п.о. [Swarup and Rajeswari, 2007], однако вклад таких фрагментов в состав вкДНК мал по сравнению с “апоптотической лесенкой” [Ermakov et al., 2008; van der Vaart and Pretorius, 2008]. Однако, после радиотерапии, которая, как предполагается, вызывает некроз опухоли, количество внеклеточных нуклеиновых кислот, как это ни парадоксально, уменьшается у 90 % пациентов – это можно объяснить радиотерапевтической супрессией пролиферации раковых клеток [Swarup and Rajeswari, 2007]. Во время нетоза ДНК с высокой молекулярной массой образует решетку или сетку [Cooper et al., 2013; Yipp and Kubes, 2013; Pisetsky, 2012; Papayannopoulos et al., 2010]. Нетоз (NET) – уникальный ответ, в первую очередь нейтрофилов, в которых ядерная ДНК, после смешивания с содержимым цтоплазмы, выходит из клетки как NET (neutrophil extracellular trap или внеклеточная ловушка нейтрофилов) [Cooper et al., 2013; Yipp and Kubes, 2013; Pisetsky, 2012; Papayannopoulos et al., 2010]. Для выяснения механизмов образования вкДНК, были проведены эксперименты in vitro и на моделях in vivo [Pisetsky, 201; Beyer et al., 2010; Choi et al., 2004; Choi et al., 2005]. При исследованиях in vitro индуцировали апоптоз или некроз в долгокультивируемых клеточных линиях, затем измеряли концентрацию ДНК с использованием красителя PicoGreen [Beyer et al., 2010; Choi et al., 2005].. Как показано в экспериментах с апоптозом в клеточных линиях, таких как культура клеток Тлимфобластного лейкоза человека Jurkat, выброс ДНК зависел от времени, внеклеточная ДНК появлялась в среде культивирования при поздних стадиях апоптоза или при 46 вторичном некрозе [Choi et al., 2004; Choi et al., 2005]. Эта ДНК образует апоптотическую «лесенку». При некрозе in vitro ситуация с концентрацией вкДНК и временем выброса менее однозначная и зависит от индуцирующего некроз стимула [Beyer et al., 2010]. При индукции некроза методом замораживания-оттаивания (обычно используемая методика при изучении иммунологической активности некротических клеток), ДНК из клеток выбрасывается практически немедленно, но подвергается воздействию нуклеаз [Beyer et al., 2010]. При стимуляции некроза высокой температурой или H2O2, концентрация вкДНК, освобождающейся из клеток, значительно ниже и накапливается она медленнее [Beyer et al., 2010]. Минимальные концентрации вкДНК наблюдаются при стимуляции некроза этанолом. [Pisetsky, 2012; Beyer et al., 2010]. Моделирование гибели клеток in vivo – более сложная задача, поскольку повреждающий агент помимо клеток-мишеней (например, гепатоцитов) может иметь более широкий радиус действия и повреждать клетки нескольких типов [Jiang et al., 2003]. Для упрощения модели вводили клетки, убитые in vitro (либо апоптозом или некрозом) нормальным мышам внутрибрюшинно и измеряли вкДНК в крови [Jiang et al., 2003]. Для этих экспериментов использовали мужские клетки линии клеток Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat), имеющие Y-хромосомы, что позволяет однозначно идентифицировать происхождение ДНК в крови с помощью ПЦР-амплификации, когда клетки вводят самкам - реципиентам. Эти исследования показали, что введение либо апоптотических, либо некротических клеток Jurkat приводит к повышению уровня вкДНК в крови, которое происходят в течение 5-6 ч после введения и исчезает к 24 часам [Jiang et al., 2003]. Эта вкДНК несет последовательность Y-хромосомы и формирует «лесенку» независимо от того, погибла клетка путем апоптоза или некроза in vitro [Jiang et al., 2003; Pisetsky and Jiang, 2006]. Эти результаты подтверждают, что «лесенка» может отражать события после гибели клеток, таких, как переваривание нуклеазами сыворотки или поглощение фагоцитами [Pisetsky, 2012; Pisetsky and Jiang, 2006]. Повышение в крови вкДНК может быть следствием на уровне организма повреждения или вмешательства, вызывающего местную гибель клеток [Pisetsky, 2012]. Так, в экспериментах на мышах, применение гепатотоксических агентов, таких как ацетаминофен, четыреххлористый углерод или анти-Fas является причиной быстрого роста в крови концентрации вкДНК, которая похожа по размерам и кинетике на вкДНК, появляющуюся в крови при введении убитых ex vivo клеток [Tran et al., 2008]. Так как ацетаминофен, четыреххлористый углерода и анти-Fas быстро убивают большое количество гепатоцитов (и, возможно, клеток других клеточных популяций), сходство с введением убитых in vitro клеток не является неожиданным, тем не менее, разница в 47 расположении погибших клеток может повлиять на этот ответ [Tran et al., 2008]. При применении гепатотоксинов, вкДНК в крови также обладает низким молекулярным весом, соответствующим размеру нуклеосомы, что предполагает, что нуклеосомная «лесенка» может появиться и при апоптозе, и при или некрозе [Pisetsky, 2012; Tran et al., 2008]. Другая экспериментальная модель, которая приводит к накоплению вкДНК в крови - применение эндотоксина, особенно в дозах, вызывающих шок [Licht et al., 2008; Jiang et al., 2003]. Эндотоксин обладает разнонаправленным действием, включающим воспаление и гибель клеток в результате ишемии и сосудистой недостаточности [Pisetsky, 2012]. При применении эндотоксина и при других моделях септического шока (например, при перевязке перфорации слепой кишки), может произойти формирование NETs – события, ответственного за некоторую часть вкДНК в крови [Pisetsky, 2012]. В то время как источник вкДНК, появляющейся в крови при сепсисе, не ясен (возможен вклад погибших клеток паренхимы и иммунных клеток, а также формирование NETs), однако, сепсис может быть связан с высоким уровнем вкДНК крови [Skibsted et al., 2012; Dwivedi et al., 2012; Rhodes et al., 2006]. В связи с этим, модели сепсиса также характеризуются высоким уровнем других ядерных компонентов, таких как гистоны и HMGB1 в крови [Xu et al., 2009; Harris et al., 2012]. Еще один возможный источник нуклеиновых кислот в плазме – активная или пассивная секреция этих нуклеиновых кислот в циркуляцию («метаболическая ДНК», рисунок1.6.) [Gahan and Stroun, 2010; Gahan et al., 2010]. Предполагается рядом авторов, что вкДНК может секретироваться пролиферирующими клетками опухоли или активированными лимфоцитами [Garcia-Olmo et al., 2010; Gahan and Stroun, 2010]. Пополнять пул вкДНК может вкДНК, связанная с поверхностью клеток [Rykova et al., 2012]. Наличие пула вкДНК, связанного с клеточной поверхность было показано для лейкоцитов и эритроцитов [Rykova et al., 2012]. Другой возможный источник вкДНК в плазме при раке - микрометастазы, которые активно попадают в циркуляцию, но этой гипотезе противоречат результаты Соренсона и Чена, которые измеряли высокое количество внеклеточной ДНК и РНК, не соответствующей числу клеток опухоли, представленных в кровотоке [Urbanova et al., 2010]. Поэтому, теория микрометастазов имеет мало приверженцев [Urbanova et al., 2010]. Еще одна гипотеза накопления вкДНК в сыворотке крови связывает повышение уровня вкДНК с активностью дезоксирибонуклеаз [Gahan and Stroun, 2010; Ermakov et al., 2008; Samejima et al., 2005]. В крови здоровых людей присутствует только небольшое количество вкДНК, вероятно, из-за высокой активности этих ферментов [Вейко и соавт., 2008; Ermakov et al., 2008]. Средняя концентрация ДНК-азы I плазмы крови, которая 48 составляет 90 % всей дезоксирибонуклеазы крови, составляет 41±30 нг/мл у здоровых мужчин и 21±21 нг/мл у здоровых женщин с активностью 0.307±0.249 U/мл у мужчин и 0.405±0.509 U/мл у женщин [Gahan and Stroun, 2010]. Следовательно, относительно низкие уровни циркулирующей ДНК у здоровых людей могут, действительно, быть частично обусловлены активностью ДНК-азы периферической крови [Вейко и соавт., 2008; Gahan and Stroun, 2010; Ermakov et al., 2008]. В крови больных раком была обнаружена низкая активность этих ферментов, что поддерживает эту теорию [Urbanova et al., 2010]. Высокий уровень вкРНК может также быть обусловлен устойчивостью РНК к перевариванию РНКазами, поскольку иногда диагностируют повышенный уровень РНК и РНКаз одновременно [Gahan and Stroun, 2010]. Показано, что вкРНК может быть защищена комплексом с гликолипидом [Gahan and Stroun, 2010]. В пуле вкРНК в плазме крови здоровых субъектов и больных раком были обнаружены фрагменты рибосомных 18рРНК, 28рРНК митохондриальной РНК [Rykova et al., 2012]. Ее происхождение связывают с теми же прцессами, благодаря которым образуется вкДНК [Gahan and Stroun, 2010]. Концентрация митхондриальной вкРНК, также как и вкДНК, является прогностическим критерием при раке простаты – ее концентрация была в 3,8 раза повышена при летальном исходе заболевания по сравнению с выжившими пациентами [Swarup and Rajeswari, 2007]. Кроме эндогенной вкДНК в плазме крови присутствуют также фрагменты экзогенной вкДНК и вкРНК (рисунок 1.6). Даже прежде, чем внеклеточные нуклеиновые кислоты стали популярными как мишень для диагностики опухоли, было описано присутствие вирусных внеклеточных нуклеиновых кислот [Swarup and Rajeswari, 2007]. Показано присутствие ДНК вируса Эпштейна Барра (EBV) в крови больных носоглоточной карциномой и присутствие ДНК вируса папилломы человека (HPV) в сыворотке крови пациентов с раком шейки матки [Urbanova et al., 2010; Swarup and Rajeswari, 2007]. Что касается эмбриональной вкДНК, рассматривают три возможных источника появления эмбриональной ДНК в плазме беременной женщины: трансфер вкДНК через плацентарный барьер, плацента и гематопоэтические клетки, из которых как наболее вероятную рассматривают все же плаценту (рисунок 1.6) [Swarup and Rajeswari, 2007]. 1.3. Формы существования вкДНК Внеклеточные нуклеиновые кислоты постоянно присутствуют во всех проверенных биологических жидкостях в естественных условиях и питательных средах всех клеток in vitro [Peters and Pretorius, 2011]. Клетки выделяют внеклеточную ДНК и 49 РНК (вкДНК и вкРНК) эндогенного происхождения, эти внеклеточные нуклеиновые кислоты естественно вовлекаются в комплексы с липидами и белками или находятся внутри имеющих мембрану частиц, что обеспечивает их защиту от деградации нуклеазами или узнавание иммуноцитами как ”сигналы опасности” и обеспечивают их эффективный клиренс [Rykova et al., 2012; Peters and Pretorius, 2011; Holdenrieder et al., 2008]. У здоровых индивидов вкДНК, циркулирующая в крови, присутствует в устойчиво низких концентрациях и иммунологически неактивна, что резко изменяется при раке и аутоиммунных нарушениях [Rykova et al., 2012; Pisetsky, 2010]. Клетки эукариот способны адсорбировать внеклеточные нуклеиновые кислоты на мембране, с последующей интернализацией вкДНК или вкРНК внутрь клетки [Rykova et al., 2012]. Эти свойства могут превращать вкДНК и вкРНК в молекулы сигнализации [Pisetsky, 2012; Malinovskaya et al., 2011; Pisetsky, 2010; Ermakov et al., 2009]. На этом же свойстве проникать в клетки основана и теория “генометастазов” [Garcia-Olmo et al., 2010]. В составе ядра ДНК образует нуклеосомы - участки левозакрученной двойной спирали, связанной с гистоновыми белками H2A, H2B, H3 и H4, ДНК между нуклеосомами называется линкерной ДНК [Khorasanizadeh, 2004]. Структура хроматина не является статичной, другие белки также могут связывать ДНК, в том числе в межнуклеосомных участках [Pisetsky, 2012]. Среди этих белков - гистон Н1 и HMGB1, негистоновый ядерный белок, который встречается в большом количестве в ядре и имеет более переходный и менее стабильный тип связывания с ДНК, чем основных гистонов [Yang et al., 2010; Pisetsky, 2012]. Экспозиция ДНК в свободной или "голой" форме либо как во внутриклеточном, так и во внеклеточном пространстве ограничена [Pisetsky, 2012]. Поскольку ДНК является источником генетической информации, сохранение структуры ДНК в неповрежденном (интактном) состоянии имеет большое значение для выживания и деления клеток, возможность сохранения структуры обеспечивается за счет систем, которые узнают и репарируют повреждения ДНК [Pisetsky, 2012]. При апоптозе клетки ДНК подвержена действию внутриклеточных ДНКаз, которые расщепляют ДНК в области линкерной ДНК до низкомолекулярных фрагментов, образуя нуклеосомы, поэтому вкДНК существует в межклеточном пространстве в виде моно- и олигонуклеосом [Pisetsky, 2012; Samejima et al., 2005]. Внеклеточные нуклеиновые кислоты присутствуют в сыворотке крови не в изолированном виде, а в составе комплексов с белками [Breitbach et al., 2005]. Комплексы, образуемые циркулирующими нуклеиновыми кислотами, разнообразны по происхождению и составу, а, следовательно, и по биологическим свойствам [Rykova et al., 50 2012; Pisetsky, 2012]. Нуклеосомы - комплексы ДНК с компонентами белка также идентифицируются в циркуляции у пациентов с раком и с аутоиммунными болезнями [Urbanova et al., 2010]. Измерение уровня нуклеосом в связи с другими маркерами опухоли может использоваться в предсказании ответа на радиотерапию или химиотерапии [Holdenrieder and Stieber, 2005]. Не столь много работ посвящено рассмотрению возможных механизмов защиты вкРНК от активности РНКаз плазмы крови [Urbanova et al., 2010; Turchinovich et al., 2011; Arroyo et al., 2011; Peters and Pretorius, 2011]. Поскольку РНК не слишком стабильная молекула, но ее присутствие обнаруживается в сыворотке крови, логично предположить, что существуют механизмы, защищающие вкРНК от ферментативной деградации [Urbanova et al., 2010]. Вероятно, вкРНК либо находится внутри апоптотических телец, либо находится в комплексе с липопротеинами [Urbanova et al., 2010; Turchinovich et al., 2011; Arroyo et al., 2011]. Это предположение подтверждается в ряде экспериментов: было показано, что пропускание образцов плазмы и сыворотки через 0.2-миллиметровые фильтры уменьшает концентрацию вкРНК в фильтрате; а эндогенная вкРНК была устойчива, по крайней мере, в течение 3 часов при комнатной температуре в цельной крови или в плазме перед извлечением РНК при сохранной ферментативной активности крови – ферменты расщепляли добавленную экзогенную мышиную РНК (20 мг) [Urbanova et al., 2010]. Кроме того, было обнаружено, что целостность вкРНК уменьшена у пациентов с носоглоточной карциномой, с линейной корреляцией со стадией заболевания [Urbanova et al., 2010]. Другой тип комплексов - виртосомы, которые, как полагают, содержат синтезированные жизнеспособными клетками вкДНК и вкРНК и состоят из комплекса внеклеточных вновь синтезированных нуклеиновых кислот с липопротеинами и включают ДНК-зависимые ДНК и РНК полимеразы [Gahan and Stroun, 2010; Peters and Pretorius, 2011]. Белки сыворотки крови могут принимать участие в формировании комплексов с эндогенной вкДНК и вкРНК, поскольку показано формирование комплексов экзогенной ДНК и РНК с альбумином сыворотки крови, иммуноглобулинами, фибронектином, лактоферрином, C1q-компонентом комплимента [Rykova et al., 2012]. Часть внеклеточных нуклеиновых кислот заключена в везикулы – пузырьки, имеющие мембрану (рисунок 1.7) [Rykova et al., 2012]. Самыми маленькими везикулами являются экзосомы – пузырьки эндоцитозного происхождения диаметром 30 – 90 нм, которые синтезируются широким диапазоном типов клеток млекопитающих, повидимому, как транспортное средство для межклеточной коммуникации без мембранных клеточных контактов [Schorey et al., 2008; Rak, 2013]. В настоящее время экзосомы 51 рассматриваются как один из способов распространения нуклеиновых кислот [Valadi et al., 2007]. Экзосомы были идентифицированы в таких жидкостях, как моча, амниотическая жидкость, малигнизированный асцит, бронхоальвеолярный лаваж, синовиальная жидкость, грудное молоко, слюна и кровь [Rak, 2013; Lehmann et al., 2008]. Предположение, что экзосомы содержат неактивные формы вкРНК: рРНК, мРНК и микроРНК, которые могут быть переданы другой клетке и быть функциональными в новом окружении, стимулировало работы по изучению профилей микроРНК экзосом, циркулирующих в крови [Moldovan et al., 2013; Huang et al., 2013; Valadi et al., 2007]. Усиленный выброс экзосом опухолевыми клетками свидетельствует об их увеличенном уровне в крови во время поздней стадии заболевания и повышенной экспрессии определенных биомаркеров опухолевой клетки, что подтверждает важную роль экзосом в диагностике и исследовании биомаркеров [Rak, 2013; Lehmann et al., 2008]. Рисунок 1.7. Образование везикул, содержащих вкДНК [Rykova et al., 2012]. Самыми маленькими везикулами являются экзосомы – пузырьки эндоцитозного происхождения диаметром 30 – 90 нм, которые синтезируются широким диапазоном типов клеток млекопитающих, по-видимому, как транспортное средство для межклеточной коммуникации без мембранных клеточных контактов [Schorey et al., 2008; Rak, 2013]. В настоящее время экзосомы рассматриваются как один из способов распространения нуклеиновых идентифицированы в таких кислот [Valadi жидкостях, как et al., моча, 2007]. Экзосомы амниотическая были жидкость, 52 малигнизированный асцит, бронхоальвеолярный лаваж, синовиальная жидкость, грудное молоко, слюна и кровь [Rak, 2013; Lehmann et al., 2008]. Предположение, что экзосомы содержат неактивные формы вкРНК: рРНК, мРНК и микроРНК, которые могут быть переданы другой клетке и быть функциональными в новом окружении, стимулировало работы по изучению профилей микроРНК экзосом, циркулирующих в крови [Moldovan et al., 2013; Huang et al., 2013; Valadi et al., 2007]. Усиленный выброс экзосом опухолевыми клетками свидетельствует об их увеличенном уровне в крови во время поздней стадии заболевания и повышенной экспрессии определенных биомаркеров опухолевой клетки, что подтверждает важную роль экзосом в диагностике и исследовании биомаркеров [Rak, 2013; Lehmann et al., 2008] Микрочастицы – малые мембраносвязанные пузырьки с диаметром 200 - 1000 нм, которые образуются в результате впячивания («blebbing») плазматических мембран разнообразных типов клетки в ответ на активацию, повреждение или ранний апоптоз (рисунок 1.7) [Rykova et al., 2012; Pisetsky, 2012]. Апоптотические тельца образуются на поздних стадиях апоптоза (рисунок 1.7). Диаметр апоптотических телец от 1 до 5 мкм, они представляют собой уплотненные или конденсированные остатки апоптотических клеток [Rykova et al., 2012; Peters and Pretorius, 2011]. Часть внеклеточных нуклеиновых кислот может быть связана с поверхностью клеток крови – лейкоцитами и эритроцитами [Rykova et al., 2012]. Множество механизмов может быть вовлечено в закрепление вкДНК на поверхности клеток, например, вкДНК может связываться с фосфолипидами клеточной мембраны через бивалентные катионы [Rykova et al., 2012; Beliaev et al., 1998]. Возможно, вкДНК связывается с поверхностью клеток через мембранные рецепторы. Полагают, что в роли рецепторов на мембране клеток могут выступать альбумин, цитокератины, скавенджер (scavenger) -рецепторы, моэзин (moesin) и эзрин (ezrin), другие рецепторы ждут своей идентификации [Rykova et al., 2012; Chelobanov et al., 2006]. ДНК-связывающие рецепторы на поверхности клеток могут не только связывать вкДНК, но и промотировать интернализацию ДНК в клетки крови, как это было показано для цитокератинов [Rykova et al., 2012; Laktionov et al., 2003]. Другой пример кандидатов транспортеров вкДНК внутрь клетки – гистоны, расположенные на мембране клеток и способствующие проникновению вкДНК в клетку потенциал - зависимым способом, независимо от эндоцитоза [Evans et al., 2009]. Не только свободноциркулирующие вкДНК в составе комплексов могут связываться с мембраной клеток, но и везикулы, содержащие вкДНК и вкРНК, могут 53 закрепляться на циркулирующих клетках (рисунок 1.8) [Rykova et al., 2012]. Как результат этой ассоциации, нуклеиновые кислоты могут остаться обратимо связанными с поверхностью клеток или могут быть инкорпорированы в клетки или рецепторным способом, или в результате слияния между мембраной частицы и клеточной мембраной (рисунок 1.8). Эта способность проникновения вкДНК и вкРНК в клетку подтверждается данными о передаче мРНК и мяРНК от одной клетки к другой в составе экзосом [Yuan et al., 2009; Valadi et al., 2007]. Рисунок 1.8. Предполагаемые механизмы мембранных ассоциации везикул с клеточной мембраной [Rykova et al., 2012]. 1.4. Биологическая активость вкДНК 1.4.1. ВкДНК как активатор иммунных реакций ВкДНК - полимерная макромолекула, биологическая активность которой зависит от местоположения, а также от связи с ассоциированными молекулами [Pisetsky, 2012]. Внутри клетки яДНК является источником генетической информации и связывает гистоны для формирования нуклеосом [Khorasanizadeh, 2004]. ВкДНК появляется в межклеточном пространство в основном во время гибели клеток в поцессе апоптоза или некроза [Ermakov et al., 2013; Pisetsky, 2012; Peters and Pretorius, 2011; Schwarzenbach et al., 2011]. В то время как бактериальные вкДНК представляет собой мощный стимулятор иммунитета в силу своих CpG мотивов, вкДНК млекопитающих, которые обычно неактивны, могут приобрести активность путем ассоциации с ядерными, цитоплазматическими и сывороточными белками, которые способствуют проникновению 54 вкДНК в клетки, чтобы стимулировать внутренние рецепторы к вкДНК, в том числе Toll-like рецептор 9 [Kostyuk et al., 2013; Kostjuk et al., 2012; Pisetsky, 2012; Ermakov et al., 2011; Malinovskaya et al., 2011; Ermakov et al., 2009]. Антитела к вкДНК могут образовывать иммунные комплексы с вкДНК, чтобы стимулировать плазмацитоидные дендритные клетки к продукции интерферона типа 1 [Pisetsky, 2012]. Вместе взятые, эти результаты показывают, что иммунные свойства вкДНК являются изменчивыми и разнообразными, что отражается в разнообразии связывающихся с вкДНК молекул [Pisetsky, 2012]. В зависимости от взаимодействия с различными молекулами, вкДНК может быть инертной с одной стороны, или активной - с другой [Pisetsky, 2012]. В дополнение к тому, что вкДНК может вызывать ответы клеток сама по себе, вкДНК может связывать другие молекулы, формируя комплексы, активность которых превышает активность отдельных компонентов, и создавать уникальные сигналы «опасности», предупреждая возможное повреждение организма, что вызывает иммунный ответ [Pisetsky, 2012; Pisetsky and Jiang, 2006]. Потенциальную роль ДНК как агента, против которого необходимо создавать оборону, можно проиллюстрировать тем, что существует изобилие и повсеместность клеточных сенсоров ДНК, которые включают в себя как Toll-подобные рецепторы (TLR) и не- TLR рецепторы [Kostyuk et al., 2013; Kostjuk et al., 2012; Pisetsky, 2012; Ermakov et al., 2011]. Чтобы ДНК стимулировала иммунитет, она должна получить доступ к внутренним сенсорам, что может произойти с любой ДНК, расположенной внутри клетки или с ДНК, которая вошла в клетку с внешней стороны [Kostyuk et al., 2013; Pisetsky, 2012]. Внутриклеточные зкзогенные ДНК, появляются при инфицировании внутриклеточными организмами, особенно вирусами, которые размножаются в цитоплазме [Savva et al., 2013; Brencicova et al., 2013; Pisetsky, 2012]. Поскольку это происходит во время репликации, экзогенная вкДНК меньше привязана к белкам и поэтому может быть более доступна для взаимодействия с сенсором нуклеиновых кислот [Savva et al., 2013; Brencicova et al., 2013; Pisetsky, 2012]. Механизм распознавания клеткой эндогенной и чужеродной вкДНК сложен, включает систему взаимодействия внутриклеточных белков и сигнальных путей и остается практически неизученным [Savva et al., 2013; Brencicova et al., 2013]. Поскольку вкДНК покидает клетку с помощью апоптоза или некроза, она может проникнуть в другую клетку в комплексе с белками, связывающими нуклеиновые кислоты, которые обеспечивают более легкое проникновение в клетку [Rykova et al., 2012; Pisetsky, 2012]. Среди заболеваний, характеризующихся иммунным ответом на ДНК, системная красная волчанка (СКВ) была одним из первых заболеваний, при которых обнаруживался 55 повышенный уровень вкДНК в плазме [Nielsen, 2012; Hanaoka et al., 2012; Barber et al., 2011; Pisetsky and Jiang, 2006; Sano and Morimoto, 1982]. СКВ - аутоиммунное заболевание, характеризующееся наличием антител к компонентам клеточного ядра (antinuclear antibodies or ANAs), с анти-ДНК антителами - важными маркерами для диагностики и прогноза заболевания [Nielsen, 2012; Hanaoka et al., 2012; Barber et al., 2011]. Уровень антител к ДНК может подниматься и опускаться в связи с активностью заболевания, высокий уровень антител к ДНК связывают с нефритом у многих пациентов [Nielsen, 2012; Pisetsky, 2012]. Нефрит может явиться результатом отложения при действии иммунных комплексов, состоящих из ДНК, связанной с белками; локализация этих комплексов в почках может возникнуть в результате их притяжения к сайтам с зарядом в клубочковой базальной мембраны [Pisetsky, 2012]. Начиная с момента открытия роли ДНК как центрального аутоантигена при СКВ, представления об иммунных свойствах ДНК претерпели значительные изменения. Как показано в исследованиях на больных, так и в модельном эксперименте – мышиной модели СКВ, ДНК сама по себе является селективным антигеном [Pisetsky, 2012]. Тем не менее, в моделях по экспериментальной иммунизации животных, ДНК (двухцепочечная ДНК млекопитающих в конформации B) показывает, в лучшем случае, весьма ограниченную иммуногенность, даже если находится в связи с белком-носителем. В итоге, эти исследования привели к заключению, что ДНК является по существу инертной молекулой, а лишь нарушения в B и Т-клетках приводят к опознаванию молекулы, которая обычно невидима для иммунной системы [Pisetsky, 2012]. В последние два десятилетия исследования было показано, что последовательность оснований имеет большое значение для активности ДНК [Gursel et al., 2003; Ermakov et al., 2009; Вейко и соавт., 2006; Вейко и соавт., 2008; Gursel et al., 2003; Brencicova et al., 2013. Бактериальная ДНК, а также синтетические олигонуклеотиды может вызывать мощные иммунные ответы, как показано in vitro в культуре макрофагов, дендритных клеток и Вклеток человека. Бактериальная ДНК, а также последовательность синтетических олигонуклеотидов обогащена неметилированными CpG-мотивами, которые встречаются значительно чаще у прокариот, чем в эукариотической ДНК, из-за различий в паттерне метилирования [Savva et al., 2013; Brencicova et al., 2013]. ДНК ядер клеток млекопитающих отличается “недопредставленностью” CpG динуклеотидов в составе ДНК, это явление носит название CpG - подавления [Krieg, 2002]. Внеклеточная ДНК отличается повышенным содержанием CpG-мотивов, что может обеспечивать ее иммуногенные свойства [Ermakov et al., 2009; Вейко и соавт., 2006; Вейко и соавт., 2008; Gursel et al., 2003; Brencicova et al., 2013]. 56 1.4.2. ВкДНК как фактор стресс-сигнализации в индуцированном ионизирующей радиацией эффекте свидетеля Эффект передачи информации от облученных клеток (клеток-мишеней) необлученным (клеткам-свидетелям) получил название «эффекта свидетеля» (ЭС) [Nagasawa and Little, 1992]. В 1992 г. факт межклеточной сигнализации был экспериментально воспроизведен на культуре клеток китайского хомячка: после облучения не более 1% клеточных ядер авторы наблюдали увеличение частоты сестринских хроматидных обменов в 20-40% культивируемых клеток. [Nagasawa and Little, 1992]. ЭС индуцируется повреждающими агентами физической и химической природы, характерен для многих типов клеток, показан для ряда передаваемых реакций и эффектов, в том числе, адаптивного ответа (АО) [Ojima et al., 2011; Ermakov et al., 2011; Ermakov et al., 2008]. В результате индукции малыми дозами ионизирующей радиации адаптивной реакции в клетках развивается устойчивость к последующему облучению в высоких (повреждающих) дозах [Iyer and Lehnert, 2002]. Например, адаптирующим предоблучением на 50-60% может быть снижено количество ожидаемых от повреждающих доз генных и хромосомных мутаций [Mitchell et al., 2004]. АО может передаваться интактным клеткам по механизму ЭС; обе реакции (АО и ЭС) тесно взаимосвязаны биологически и имеют много сходных черт и характерных признаков [Matsumoto et al., 2008; Mothersill and Seymour, 2004; Scott, 2004]. Принято считать, что существуют три возможных пути передачи сигнала «свидетелю»: непосредственный клеточный контакт с образованием общих мембранных структур, взаимодействие с участием канал-формирующего компонента – коннексина 43 или через среду культивирования облученных клеток [Klammer et al., 2013]. Для ЭС, индуцированного излучением с низкой LET, характерен третий путь [Mothersill and Seymour, 2004]. На роль факторов сигнализации при развитии эффекта свидетеля между клетками-мишенями и клетками-свидетелями предложено много кандидатов, в основном белков [Klammer et al., 2013; Hei et al., 2013]. Исследование роли внеклеточной ДНК (вкДНК), циркулирующей в крови здоровых людей и при патологии, позволило предположить, что вкДНК может являться передающимся через среду обитания клеток фактором стресс-сигнализации и вызывать, таким образом, развитие эффекта свидетеля и адаптивный ответ [Ermakov et al., 2011; Ermakov et al., 2009]. Показана роль окисленной внеклеточной ДНК в развитии адаптивного ответа и эффекта свидетеля, который вызывается в клетках человека воздействием окислительного стресса [Ermakov et al., 2009; Ermakov et al., 2013]. 57 Ионизирующая радиация оказывает как прямое воздействие на клетки при при попадании кванта энергии или частицы, так и непрямое, обусловленное значительным увеличением уровня АФК [Leach et al., 2001]. АФК вызывают множественные множественные повреждения ДНК: одно- и двунитевые разрывы, возникновение окислительных модификаций оснований, апуриновых и апиримидиновых сайтов, межуглеродные разрывы в дезоксирибозе, межмолекулярные сшивки [Klammer et al., 2013 Raleigh and Haas-Kogan, 2013; Widel, 2013]. Кроме того, АФК инициируют реакции перекисного окисления липидов в мембране клеток, нарушая функцию и структуру мембран и инициируя апоптоз [Widel, 2013]. При действии ионизирующей радиации в малых дозах показано накопление в клетках двунитевых разрывов и повышение активности каспазы 3 [Haimovitz-Friedman et al., 2013]. Основным источником внеклеточной ДНК при окислительном стрессе являются погибшие клетки [Widel, 2013; Ermakov et al., 2009]. Первым доказательством того, что внеклеточная ДНК из среды облученных клеток является фактором стресс-сигнализации в ЭС благодаря ее окислительной модификации, служит тот факт, что вкДНК из среды облученных клеток стимулирует увеличение уровня АФК в клетках примерно в той же степени, что и малые дозы радиации, и окисленная in vitro геномная ДНК, и Н2О2 [Ermakov et al., 2009; Ermakov et al., 2013]. ВкДНК интактных клеток не вызывает синтез АФК при добавлении к культуре клеток [Ermakov et al., 2009]. Показали, что окисленная вкДНК из среды культивирования облученных лимфоцитов, так же, как и окисленная геномная ДНК, вызывает те же эффекты в клетках разных типов (эндотелиальных, мезенхимальных стволовых, лимфоцитах), что и прямое воздействие малых доз ионизирующей радиации [Ermakov et al., 2009; Ermakov et al., 2013]. Неокисленная ДНК таких эффектов не вызывает [Ermakov et al., 2009]. Кроме того, показано, что умеренное повышение уровня АФК в ответ на действие вкДНК вызывает развитие адаптивного ответа, который включает активацию транскрипционного фактора NRF2, индуцирующего антиокислительный ответ [Loseva et al., 2012]. Цепочка последовательных событий при действии ионизирующей радиации: Облучение → [основной окислительный стресс → окислительные модификации гДНК → апоптоз клеток-мишеней → появление окисленных фрагментов вкДНК →прием сигнала клетками-свидетелями → вторичный окислительный стресс] → окислительные модификации гДНК в клетках-свидетелях →апоптоз клеток-свидетелей → появление окисленных фрагментов вкДНК при апоптозе клеток-свидетелей. и т.д (рисунок 1.9) [Ermakov et al., 2013]. 58 Рисунок 1.9. Механизм передачи сигнала окисленными молекулами вкДНК. Сокращения: АФК – активные формы кислорода [Ermakov et al., 2013]. Окислительный стресс является ключевым в цепочке событий, сигнальный путь вкДНК начинается и заканчивается окислительным стрессом [Ermakov et al., 2013]. В этой схеме прием сигнала клетками-свидетелями происходит с участием рецепторов TLR9 [Ermakov et al., 2013]. Показано, что умеренное повышение уровня АФК в ответ на действие вкДНК вызывает развитие адаптивного ответа, который включает активацию транскрипционного фактора NRF2, индуцирующего антиокислительный ответ [Ermakov et al., 2013; Loseva et al., 2012]. 1.5. Способы проникновения вкДНК внутрь клетки Биологическая активность вкДНК связана с активацией каскадов сигнальных путей в клетке [Kostjuk et al., 2012]. Связывание фрагментов вкДНК с внутриклеточными сенсорами нуклеиновых кислот является триггером активации многих транскрипционных факторов в клетках [Kostyuk et al., 2013; loseva et al., 2012; Ermakov et al., 2013]. При нахождении вне клетки фрагменты вкДНК эндогенного и экзогенного происхождения не являются активаторами внутриклеточных рецепторов, поскольку разделены территориально [Brencicova at al., 2013]. Однако, описано несколько механизмов, которые 59 способствуют перемещению вкДНК в эндосомальные компартменты: эндоцитоз при активации скавенджер-рецепторов; фагоцитоз, который опосредован системой комплемента; процесс, опосредованный Fc - рецептором после опсонизации антигенов (рисунок 1.10) [Brencicova at al., 2013]. Рисунок 1.10. Механизм перемещения лигандов внутриклеточных TLR в эндолизосомы антигенпредставляющих клеток. для сообразительности болезнетворных микроорганизмов и мертвых клеток. [по материалам статьи Brencicova at al., 2013]. Скавенджер - рецепторы, способствующие переносу вкДНК к эндосомам: SR-A (scavenger receptor A), MARCO и CD36 – представляют собой структурно несвязанные трансмембранные белки, относительно нетребовательные к свойствам связываемого лиганда [Brencicova at al., 2013; Jozefowski et al., 2006]. Малоизвестно, могут ли эти рецепторы отличать эндогенные и экзогенные вкДНК, различается ли активность этих рецепторов на клетках разного типа [Brencicova at al., 2013]. Однако показано, что SR-A и MARCO, так же, как и CD36 способны узнавать CpG-ОДН, и закрепление лиганда на рецепторах зависит от наличия сыворотки в среде культивирования клеток, что предполагает, что CpG-ОДН более доступны для связывания в комплексе с белками (рисунок 1.10) [Jozefowski et al., 2006]. 60 В дополнение к скавенджер-рецепторам, перенос вкДНК погибших клеток и экзогенного происхождения может быть опосредовани рецепторами коипоненов комплемента (рисунок 1.10) [Gaipl et al., 2004; Palaniyar et al., 2004]. C1q связывает ДНК и РНК погибших и умирающих в процессе апоптоза клеток и участвует в деградации ДНК в комплексе с дезоксирибонуклеазой I, что предотвращает активацию иммунной системы собственными нуклеиновыми кислотами [Gaipl et al., 2004; Palaniyar et al., 2004]. Кроме того C1q ингибирует активацию NF-kB в ответ на стимуляцию TLR, уменьшая секрецию провоспалительных цитокинов моноцитами, макрофагами и дендритными клетками [Fraser et al., 2009]. Возможно, компоненты системы комплемента способны распознавать чужерожные и собственные нуклеиновые кислоты, регулируя адекватный ответ иммунной системы и предотвращая иммунизацию [Brencicova at al., 2013]. Показано, что окисленные антигенные детерминанты апоптотических клеток могут связываться с IgM [Brencicova at al., 2013]. ВкДНК также может подвергаться опсонизации иммуноглобулинами и перемещаться в эносомальные структуры после связывания с Fc-рецепторами [Brencicova at al., 2013]. 1.6. Внутриклеточные рецепторы, опознающие фрагменты вкДНК После проникновения в клетку вкДНК взаимодействует с внутриклеточными сенсорами сенсорами нуклеиновых кислот [Chiu et al., 2009; Li et al., 2013; Unterholzner, 2013; Fu et al., 2005; O'Neill, 2008; Kostyuk et al., 20]. Возможными кандидатами на роль внутриклеточных рецепторов к вкДНК являются белки семейства "Toll", а именно TLR9, расположенный на мембране эндосом [Fu et al., 2005; Li et al., 2010]. Лигандами для TLR9 являются ДНК, обогащенные неметилированными CpG-мотивами [Kindrachuk et al., 2008; Kumagai et al., 2007]. Формирование комплекса «CpGДНК-TLR9" инициирует клеточные сигнальные пути, связанные с активацией фактора транскрипции NF-kB и его транслокацией в ядро [O'Neill, 2008; Kostjuk et al., 2012]. Экспрессия генов других, расположенных на эндосомах рецепторов – TLR7, TLR8 и TLR3 – также могожет возрасать в присутствие фрагментов вкДНК [Kostjuk et al., 2012]. ВкДНК может также активировать цитозольные внутриклеточные рецепторы AIM2, RIG-1, DAI и другие ДНК сенсоры [Chiu et al., 2009; Li et al., 2013; Unterholzner, 2013; Kawai and Akira, 2008; Triantafilou et al., 2013; Harberts avd Gaspari, 2013; Kato et al., 2011; Keating et al., 2011; Sun et al., 2013; Wu et al., 2013]. Поиск дополнительных рецепторов, задействованных в реализации сигнала от вкДНК, позволит описать механизм взаимодействия вкДНК с клеткой и разработать эффективные способы нейтрализации негативных последствий действия вкДНК [Kawasaki et al., 2012; Sun et al., 2013; Wu et al., 2013]. 1.6.1. Белки семейства TLR – сенсоры фрагментов вкДНК 61 Белки семейства TLR играют важную роль в координации врожденного и приобретенного ответа иммунной системы [Holm et al., 2013]. TLR могут узнавать не только экзогенныe патогенные молекулы (PAMP - pathogen-associated molecular patterns), но и молекулы эндогенной природы, появляющиеся при повреждении тканей, асептическом воспалении и дегенерации – DAMP (damage-associated molecular patterns) [Takagi, 2011; Lee et al., 2012]. К эндогенным лигандам TLR9 относятся фрагменты вкДНК ядер погибших в процессе апоптоза и некроза клеток, митохондриальная вкДНК [Rose et al., 2012; Goulopoulou et al., 2012]. Индукция TLR9 приводит к активации последовательно TLR9 - и NF-kB - сигнальных путей, что приводит к секреции провоспалительных цитокинов: IL-6, IL-8, IL-1β и TNF-α [O'Neill, 2008; Kostjuk et al., 2012]. Активация TLR9 фрагментами эндогенной вкДНК обусловлена наличием в составе вкДНК лигандов TLR9 – ГЦ - обогащенных неметилированных последовательностей, в частности, транскрибируемой области рибосомного повтора [Malinovskaya et al., 2011; Kostjuk et al., 2012]. Через активацию TLR9 эндогенной вкДНК, клетки могут быть вовлечены в регуляцию иммунных ответов [Griffith et al., 2011]. 1.6.1.1. Общая характеристика белков TLR TLR относят к образраспознающим рецепторам (PRR – рattern recognition receptors) системы врожденного иммунитета: было обнаружено существование целого семейства TLR млекопитающих и показано, что они отвечают на микробные лиганды [Medzhitov et al., 1997; Janeway and Medzhitov, 2002; Poltorak et al., 1998; Akira et al., 2001]. С этого момента количество статей, посвященных различным аспектам исследования TLR, возрастает с лавинообразной быстротой и трудно уследить за всеми возможными направлениями их исследования [Sasai and Yamamoto, 2013; Szabo and Rajnavolgyi, 2013; Shrivastav and Niewold, 2013; Vacchelli et al., 2013]. До настоящего времени идентифицированно 10 человеческих рецепторов TLR и 13 мышиных TLR [Sasai and Yamamoto, 2013; Szabo and Rajnavolgyi, 2013]. У человека 10 генов, кодирующих TLR, расположены на хромосомах 4, 9, 1, Х и 3 [Sasai and Yamamoto, 2013]. На хромосоме 4 расположены гены TLR1, TLR2, TLR3, TLR6 и TLR10 [Taguchi et al., 1996; Chaudhary et al., 1998; Rock et al., 1998; Takeuchi et al.,1999; Hasan et al., 2005]. На хромосоме 9 расположен ген TLR4, на хромосоме 1 – ген TLR5 [Rock et al., 1998; Chaudhary et al., 1998]. Гены TLR7 и TLR8 расположены на X хромосоме (Xp22.3), а ген TLR9 – на хромосоме 3 (3p21.3) [Chuang and Ulevitch, 2000; Armant and Fenton, 2003; Du et al., 2000]. 62 Лигандами TLR являются липопротеины, липиды и нуклеиновые кислоты [Jin et al., 2008]. Частичный список лигандов изложен в Таблице 1.2 [Sasai et al., 2013; Lee et al., 2012]. Тип TLR TLR1/2 TLR2/6 TLR2 TLR4 TLR4/6 TLR5 Физиологические лиганды Рецепторы клеточной поверхности триацил липопротеины (Pam3CSK4 и OspA), пептидогликан (компоненты клеточной стенки грамположительных бактерий) диацил липопротеины, липотейхоевые кислоты, зимозан tGPI-муцин (простейших паразитов), пептидогликан, фосфолипоманнан, гемагглютинин, порины, липоарабиноманнан, глюкироноксиломаннан, HMGB1 липополисахарид плазматической мембраны бактерий, VSV-G, RSV-F, MMTV-Env, маннан, глюкироноксиломаннан, глюкоинозитолфосфолипид, HSP60, HSP70, фибриноген, никель, HMGB1 окисленный липлпротеин низкой плотности, фибриллярный амилоид-β флагеллин (бактерии) Внутриклеточные рецепторы TLR3 двухцепочечная РНК (дцРНК) TLR7 одноцепочечная форма РНК (вирусы, бактерии), имидазохинолин TLR8 одноцепочечная форма РНК (вирусы, бактерии), TLR9 неметилированные CpG-ДНК (бактерии, вирусы, паразиты), hemozoin (паразиты) Синтетические лиганды Pam3CSK4 FSL1, MALP2, Pam2CSK4 Не определен Не определен Не определен Не определен полиинозиноваяполицитидиловая кислоты [поли (I: C)] imiquimod, resiquimod (R-848), CL075 Resiquimod, CL075, VTX-1463 CpG-A, CpG-B, CpG-C Таблица 1.2. Основные лиганды (PAMP), специфичные для определенного типа TLR [Sasai et al., 2013, Lee et al., 2012]. FSL1 – S - (2,3-bispalmitoyloxypropyl)CGDPKHSPKSF; HMGB1 - high-mobility group box 1 protein - белок из группы ядерных негистоновых белков; HSP - heat-shock protein – белок теплового шока; MALP2 macrophage-activating lipopeptide 2 kDa - активируемые макрофагами липопептиды; MMTV-Env, envelope protein of mouse mammary tumour virus; polyI:C, polyinosinic– polycytidylic acid; RSV-F, respiratory syncytial virus F protein; TLR - Toll-like receptor; VSVG, vesicular stomatitis virus coat protein. По способу распознавания лиганда TLR можно разделить на рецепторы клеточной поверхности и внутриклеточные – расположенные на эндосомах и эндолизосомах (рисунок 1.11) [Sasai et al., 2013; Lee et al., 2012]. 63 Рисунок 1.11. Локлизация TLR на клеточной мембране и внутри клетки, отмечены основные лиганды соответствующих рецепторов. Члены семейства TLR разделены на две группы по клеточной локализации. Одна группа рецепторов экспрессируется на поверхности клеток, другая расположена во внутриклеточном компартменте. На клеточной поверхности расположены рецепторы TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 и TLR6. TLR1 и TLR2 существуют в форме гетеродимеров, которые узнают триацил липопептиды (таблица 1.2), TLR2 и TLR6 гетеродимеры узнают диацил липопептиды. Флагеллин – лиганд TLR5, ЛПС (липополисахарид) опознается TLR4, который образует комплекс с MD2. После активации TLR4, часть мембраны с активированным TLR4 перемещается во внутриклеточное пространство, интернализация TLR4 является клатрин/динамин - зависимой. Все TLR, которые распознают нуклеиновой кислоты, локализованы во внутриклеточных структурах. TLR3 узнает двучепочечную РНК (дцРНК), TLR7 и TLR8 – одноцепочечную РНК (оцРНК), а TLR9 узнает ГЦ-богатую неметилированную ДНК (CpG-ДНК). Расщепление и изменение локализации внутриклеточных TLR неоходимо для проведения сигнала по TLRсигнальным путям. UNC93B1, PRAT4A и gp96 связываются с внутриклеточными TLR и имеют важное значение для их функционирования [Sasai et al., 2013; Lee et al., 2012; Majewska M et al., 2006]. У человека первая группа включает TLR1, TLR2, TLR5, TLR6 и TLR10; группа внутриклеточных рецепторов состоит из TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9; TLR4 является общим для двух групп [Sasai et al., 2013; Lee et al., 2012]. TLR клеточной поверхности узнают компоненты, расположенные на поверхности или внешней/внутренней стороне 64 мембраны различных бактерий - липопротеины, липиды и белки (таблица 1.2) [Akira et al., 2006; Sasai et al., 2013; Lee et al., 2012]. TLR, расположенные на эндосомах, узнают нуклеиновые кислоты, в основном, экзогенного происхождения (таблица 1.2) [Sasai et al., 2013; Lee et al., 2012]. Показано, что способность определенных TLR к гетеродимеризации расширяет диапазон разнообразия патогенов [Kvarnhammar et al., 2013]. TLR2 распознает различные микробные компоненты, включая бактерии, вирусы, грибы и паразиты, наиболее характерным лигандом TLR2 являются липопротеины. TLR2 образует гетродимеры с TLR1 или TLR6 для распознавания триацил диацила и липопротеинов, соответственно [Jin et al., 2007]. Известен дополнительный компонент, MD-2 (рисунок 1.11), который связывается с доменом рецептора TLR4, связывающим лиганд и требуется для функционирования TLR4 [Tsukamoto et al., 2013; Peri et al., 2013; Zhou et al., 2013]. Кроме того, в представлении лигандов TLR принимают участие другие белки-помощники: ЛПСсвязывающий белок (LPS binding protein (LBP)), CD14, дектин (dectin), и CD36 [Raby et al., 2013; Zamora et al., 2012] .Наименее изученным из группы поверхностных клеточных TLR является TLR10. Препятствием к его изучению является отсутствие его гомологов у мышей, поскольку ген TLR10 мыши модифицирован ретровирусом в процессе эволюции, а идентификацию лигандов для большинства TLR проводили в экспериментах на грызунах [Hasan et al., 2005]. Показано образование гомодимеров TLR10 и гетеродимеров TLR10 с TLR1 или TLR 2 [Hasan in et al., 2005]. Анализ природы лигандов белков TLR позволяет сделать вывод, что GC- и CpGбогатые фрагменты вкДНК, которые накапливаются в биожидкости человека в норме и, особенно, при патологии, могут узнаваться белком TLR9 [Костюк с соавт., 2011]. Экспрессия TLR9 была обнаружена в клетках многих тканей: лейкоцитах, дендритных клетках, клетках эндотелия, кардиомиоцитах, нейронах, клетках бронхиального эпителия, кератиноцитах, адипоцитах, в стволовых клетках, фибробластах, гепатоцитах [Shintani et al., 2013; Harvey et al., 2013; Fitzner et al., 2011; Boyd et al., 2006; Martin-Armas et al., 2006; Mayer et al., 2007; Lebre et al., 2006; Andersen et al., 2006; Ikeda et al., 2003]. 1.6.1.2. Природные и синтетические лиганды TLR9 В 1995 году было показано, что иммуностимулирующее действие ДНК на клетки иммунной системы определяется присутствием в ДНК мотивов, содержащих неметилированные CрG-динуклеотиды [Krieg et al., 1995]. Основания, фланкирующие неметилированные ГЦ-основания, играют важную роль в определении иммуностимулирующих свойств ДНК. Оптимальным иммуностимулирующим CрGмотивом считается R1R2CGY1Y2, где R1 — пурин (предпочтительно G), R2 — пурин или Т, 65 а Y1 и Y2 — пиримидины [Krieg, 2006]. CpG-мотив GACGTT оптимален для активации иммунной системы у грызунов, TCGTT (GTCGTT) и/или TCGTA – у приматов [Vollmer et al., 2006; Krieg, 2012]. В экспериментах in vivo на мышах с отсутствием гена TLR9 (Tlr9-/- мыши) было показано, что иммуностимулирующее действие CрG-содержащей ДНК реализуется через рецепторы TLR9 [Hemmi et al., 2000]. Исследование иммуностимулирующей синтетических активности ГЦ-содержащих CрG-содержащей ДНК олигонуклеотидных привело к созданию лигандов TLR9 (иммуностимулирующих CpG-ОДН), которые разделяются на 3 класса с разными структурными характеристиками и спецификой индуцируемых иммуностимулирующих эффектов (рисунок 1.12) [Bodera et al., 2012; Krieg, 2012; Klinman, 2004; Krieg et al., 2004; Hartmann et al., 2003; Marshall et al., 2003; Vollmer, 2006; Verthelyi and Klinman, 2003]. Рисунок 1.12. Краткое описание трех классов иммуностимулирующих CpG облгащенных олигонуклеотидов (CpG-ОДН) [по статьям Krieg, 2012; Krieg, 2006; Vollmer et al., 2006]. CpG - ОДН класса А являются мощными активаторами NK-клеток (естественных киллеров) и активаторами секреции интерферона альфа плазмацитоидными дендритными клетками, но слабо стимулируют В-лимфоциты. Канонические ОДН А-класса содержат polyG-мотивы на 5’- и/или 3’- конце, которые способны образовывать сложные высокоупорядоченные структуры, известные как G-тетрады, и центральную фосфодиэфирную область, содержащую один или более CpG-мотивов внутри самокомплементарных палиндромов [Krieg, 2006; Yasuda et al., 2006; Vollmer et al., 2006]. 66 имеют фосфоротиоатный остов, не образуют CpG - ОДН класса B высокоупорядоченных структур, содержат один или несколько CpG-мотивов [Krieg, 2012; Klinman et al., 2004; Vollmer, 2006]. ОДН типа B являются сильными активаторами Влимфоцитов и вызывают in vivo длительные эффекты по типу лимфаденопатии, но слабо активируют NK-клетки и дендритные клетки [Krieg, 2012; Degli-Esposti and Smyth, 2005; Klinman et al., 2004; Heikenwalder et al., 2004]. Стимуляция клеток иммунной системы ОДН типа В приводит к индукции секреции фактора некроза опухоли и интерлейкина-12 лимфоцитами, к активации Т-хелперов (Th1-клеток), а также сопровождается регуляцией молекул главного комплекса гистосовместимости на поверхности антигенпредставляюших клеток [Krieg, 2012; Klinman et al., 2004; Krieg, 2002]. Показано, что у фосфоротиоатных ОДН более высокая степень сродства к TLR9 чем у ОДН с фосфодиэфирной основой [Haas et al., 2008]. CpG - ОДН класса С имеют фосфоротиоатный остов, аналогично ОДН класса В, но образуют палиндромы [Krieg, 2012; Lenert et al., 2006; Vollmer, 2006]. По стимулирующему действию на клетки иммунной системы ОДН класса C объединяют характеристики ОДН класса А и B –стимулируют секрецию В-лимфоцитами интерлейкина-6 и секреции интерферона альфа плазмацитоидными дендритными клетками [Hartmann et al., 2003; Marshall et al., 2003; Vollmer, 2006]. Ни один из классов CpG-ОДН не вызывает иммуностимулирующего эффекта у мышей, дефицитных по TLR9 [Vollmer, 2006]. Механизм, посредством которого различные классы ОДН вызвают различные иммунные эффекты при стимуляции TLR9, остается не вполне ясным [Krieg, 2012]. Предполагают, что интерферон-активирующее действие ОДН опосредуется через взаимодействие с CXCL16, которые экспрессируются в дендритных клетках и отсутствуют у В-лимфоцитов [Gursel et al., 2006]. За последнее десятилетие было проведены клинические испытания CpG-ОДН как адъювантной вакцины при иммунотерапии аллергии, рака и инфекционных заболеваний [Krieg, 2012]. Разрабатываются новые эффективные препараты на основе синтетических иммуностимулирующих CpG-ОДН [Krieg, 2012; Kaminski at al., 2013; Krishnamachari at al., 2009; Klinman at al., 2008]. Наличие в бактериальной ДНК неметилированных CpGмотивов определяет ее иммуностимулирующую активность, однако, CpG-мотивы, не являются уникальными для патогенных микроорганизмов, они присутствуют и у позвоночных, но на гораздо более низком уровне из-за CpG-метилирования и подавления [Krieg, 2002; Kawai and Akira, 2011]. Фрагменты вкДНК также могут выступать в роли лигандов для TLR9. Так во внеклеточной ДНК накапливаются фрагменты транскрибируемой области рибосомного 67 повтора [Вейко с соавт., 2006], которые обогазены неметилированными CрG-мотивами [Костюк с соавт., 2010; Bird, 1986]. По представленности последовательностей, взаимодействующих с TLR9, транскрибируемая область рибосомного повтора весьма сходна с бактериальной ДНК [Костюк с соавт., 2010]. На протяжении 13 314 п.н. транскрибируемой области рибосомного повтора содержится суммарно более 100 мотивов PuPuCGPyPy, CGTCG и GTCGTT, которые обуславливают взаимодействие ДНК с TLR9 [Костюк с соавт., 2010; Krieg et al., 1995; Bauer et al., 2001; Branda et al., 1996]. Кроме рибосомного повтора во вкДНК могут накапливаться и другие ГЦ-обогащенные последовательности, например, в промоторной области многих генов встречаются неметилированные «CрG-островки» (длиной примерно 1 т.п.о.), близкие по свойствам к транскрибируемой области рибосомного повтора [Bird, 1986]. 1.6.1.3. Ингибиторы взаимодействия CрG -ДНК с TLR9 Не все CpG-ОДН обладали иммуностимулирующей активностью, некоторые, CCGG -мотив, например, блокировали индуцированную CрG-активацию клеток [Chen et al., 2001]. Было обнаружено, что метилированные CpG-мотивы в ДНК млекопитающих, и ОДН, содержащие ГЦ-шпильки, в достаточно высокой концентрации способны супрессировать иммунную активность клеток [Chen et al., 2001; Klinman et al., 2009; Dong et al., 2005]. ДНК млекопитающих метилирована и содержит теломерные последовательности, которые не присутствуют в бактериальной ДНК [Blasco et al., 1999]. Теломерные повторы TTAGGG расположены на концах теломер и физиологически защищают хромосомы млекопитающих от деградации [Blasco et al., 1999]. Видимо, когда ДНК ядер освобождается из клеток, эти теломерные регионы отвечают за ингибирующие эффекты вкДНК млекопитающих [Klinman et al., 2009; Chen et al., 2001; Gursel et al., 2001]. Олигонуклеотиды, содержащие повторяющиеся TTAGGG-мотивы, были способны блокировать синтез провоспалительных цитокинов, индуцируемых не только лигандами TLR9, но и различными антигенами (двухцепочечной РНК, пептидогликаном, липополисахаридом) [Klinman et al., 2009; Gursel et al., 2003]. In vivo TTAGGG-инг-ОДН предотвращали развитие воспалительного артрита при их внутрисуставной инъекции грызунам [Zeuner et al., 2003]; СКВ и нефрита у предрасположенных к СКВ мышей NZB/NZW [Dong et al., 2005]; индуцированного липополисахаридом токсического шока [Shirota et al., 2005]. Предполагается, что создание препаратов на основе TTAGGG-ингОДН может быть перспективным при лечении аутоиммунных и воспалительных заболеваний [Klinman et al., 2009]. Хотя механизм действия этих инг-ОДН не до конца ясен, показано, что их иммуносупрессивная активность в значительной степени зависит от 68 способности G-повторов формировать устойчивые вторичные структуры [Lenert et al., 2010; Klinman et al., 2009; Gursel et al., 2003; Vollmer, 2006]. Действие TTAGGG-мотивов частично может быть обусловлено их связыванием с STAT1 и STAT4 и блокированием последующего фосфорилирования молекул STAT [Shirota et al., 2005]. Показано также связывание синтетических инг-ОДН на основе TTAGGG повторов с транскрипционным фактором STAT3, скавенджер-рецепторами и СКВ-аутоантигенами Ku [Lenert et al., 2010; Jing et al., 2004; Bianchi et al., 1999]. Исследовали структурные особенности стимулирующих и ингибирующих ОДН [Lenert 2010; Lenert et al., 2006; Lenert et al., 2003; Stunz et al., 2002]. Замена пиримидинов на гуанины на 3’- конце мотива CpG полностью отменила стимулирующую активность прототипического CpG - ОДН, что позволило создать ингтбиторные ОДН, блокирующие проведение сигналов от TLR9 (таблица 1.3). № 2088 2114 4024 последовательность TCCTGGCGGGGAAGT TCCTGGAGGGGAAGT TCCTGGATGGGAAGT класс B/G B/G B 4084F INH-1 INH-4 INH-13 INH-18 Poly-G A151 (теломерный) GpG G-ODN IRS-869 IRS-661 IRS-954 CCTGGATGGGAA CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA CCTGGATGGGAACTTACCGCTGCA GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG B R R B B G G ссылки [Lenert et al., 2001; Stunz et al., 2002] [Lenert et al., 2001; Stunz et al., 2002] [Lenert et al., 2003; Ashman et al., 2005] [Lenert et al., 2009] [Lenert et al., 2009] [Lenert et al., 2009] [Lenert et al., 2009] [Lenert et al., 2009] [Halpern et al., 1995] [Gursel et al., 2003] TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA CTCCTATTGGGGGTTTCCTAT TCCTGGAGGGGTTGT TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA TGCTCCTGGAGGGGTTGT B B/G B/G R/TLR7 B/TLR7/9 [Ho et al., 2003] [Peter et al., 2008] [Duramad et al., 2005] [Barrat et al., 2005] [Barrat et al., 2005] Таблица 1.3. Основные ингибиторные ОДН, используемые в исследованиях, согласно литературным данным [Lenert, 2010; Klinman et al., 2009]. Были выявлены структурные особенности ингибирующих ОДН: (1) CpG мотив, метилированный или неметилированный, не требуется для ингибирования; (2) три последовательных G - нуклеотида необходимы для ингибирования; (3) 5’ - конец ОДН важен как для стимуляции, так и для ингибирования: ТСС – оптимален для стимуляции, триплет CC(T) требуется для оптимального ингибирования; (4) оптимальное расстояние между 5’- концевым CC(T) и следующим триплетом GGG – 3-5 нуклеотидов; (5) важен порядок расположения триплетов: порядок – 5’- CC(T) → GGG - 3’ – имеет решающее значение, ОДН с обратной последовательностбю, например, 5’- GGG → CC(T) - 3’, или с обратной последовательностью оснований в триплетах не является ингибиторной; (6) промежуточная последовательность между СС(Т) и GGG минимально влияет на 69 активность ОДН и может принимать несколько модификаций; (7) 3’ - конец не является критичным для ингибиторной активности ОДН, но длина ОДН вносит свой вклад в ингибиторную активность; (8) не требуется образования внутрицепочечных и/или межцепочечных водородных связей между соседними основаниями G для эффективной ингибиторной активноти ОДН [Lenert et al., 2009; Stunz et al., 2002]. Были синтезированы ингибирующие последовательности: TCCTGGAGGGGAAGT (2114); TCCTGGCGGGGAAGT (2088); TCCTGGATGGGAAGT (4024); и CCTGGATGGGAAGT (4084), таблица 1.3. [Lenert et al., 2001; Stunz et al., 2002]. Инг-ОДН 2088 блокировал индуцированную лигандом активацию TLR9, NF-kB- и SAPK/MAPK/AP1- сигнальных путей при низких (наномолярных) концентрациях, супрессируя ответ В-клеток, макрофагов и дендритных клеток [Lenert et al., 2006; Lenert et al., 2003; Stunz et al., 2002]. Инг-ОДН, содержащие канонический ингибирующий мотив для TLR9 мыши (например, 2088, 2114 и 4024) также были активны в В-клетках человека, В-клеточных линиях, PDCS и TLR9 - трансфицированных НЕК клетках [Lenert, 2005; Duramad et al., 2005; Ashman and Lenert, 2007; Lenert et al., 2009], удлинение инг-ОДН на 4-5 сснований на на 5’- конце усовершенствовало их ингибирующую активность на клетках человека (таблица 1.3.) [Lenert, 2010]. Исследование генома человека позволило обнаружить, что ингибирующих последовательностей в несколько раз больше в ДНК млекопитающих по сравнению с бактериальной ДНК E.coli, что свидетельствует о физиологической роли супрессорных последовательностей, накапливающихся в составе вкДНК при гибели клеток [Stacey et al., 2003]. В транскрибируемой области рибосомного повтора, который накапливается в составе вкДНК также обнаружены супрессорные последовательности [Kostjuk et al., 2012]. Ингибиторы, блокирующие активацию всех клеток, экспрессирующих TLR9, относятся к ингибиторам широкого круга действия – к классу B инг-ОДН (B – “broadly reactive”) [Stunz et al., 2002]. Ингибиторные ОДН класса В блокируют все известные на данный момент пути передачи сигналов, индуцированные стимуляцией CpG-ДНК [Lenert, 2010]. Ингибирование конкурентноспособно и обратимо [Lenert et al., 2009]. Некоторые инг-ОДН способны блокировать проведение сигнала и через TLR7, и через TLR9 [Lenert, 2010; Barrat et al., 2005; Lau et al., 2005]. Число синтетических ингибиторов посоянно пополняется (таблица 1.3) [Lenert, 2010]. На основе инг-ОДН 2114 создан ингибитор IRS 869 (TCCTGGAGGGGTTGT), отличающийся заменой двух оснований А на Т, показавший высокую эффекивность при ингибировании сепсиса в экспериментальной модели in vivo [Lenert et al., 2003; Ashman et al., 2005; Duramad et al., 2005]. Инг-ОДН IRS 661 (TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA) содержит 5 равномерно распределенных GC-мотивов и 70 блокирует проведение сигнала через TLR7; IRS 954 (TGCTCCTGGAGGGGTTGT) способен одновременно блокировать TLR7 - и TLR9 - зависимую активацию [Barrat et al., 2007]. Кроме ингибиторов с широкой активностью были синтезированы инг-ОДН с ограниченной активностью - инг-ОДН R класса [Lenert, 2006; Lenert, 2010]. Эти инг-ОДН оказывают ингибирующее действие на дендритные клетки, макрофаги и аутореактивные В-лимфоциты при СКВ, но обладают слабой ингибирующей активностью в отношении Влимфоцитов человека. Поэтому предположили, что именно инг-ОДН R класса могут быть эффектины при терапии СКВ, ингибируя аутоиммунные реакции, но сохраняя гуморальный иммунитет и Т-клеточную активность [Lenert, 2006]. Предполагается, что избирательная ингибирующая активность инг-ОДН R класса связана с контактом этих игнибиторов с TLR9 на стадии поздних эндолизосом в клетках [Lenert et al., 2009; Honda et al., 2005; Guiducci et al., 2006; Avalos et al., 2009]. 1.6.1.4. Механизм доставки лигандов к TLR, расположенным на эндосомах Внутриклеточные TLR используют кофакторы, которые помогают узнавать специфичные лиганды (рисунок 1.13) [Sasai et al., 2013; Lee et al., 2012]. Рисунок 1.13. Вспомогательные молекулы (кофакторы) обеспечивают связывание лиганда и его доставку к эндосомным TLR. CD14 и HMGB связываются с дцРНК, оцРНК и ДНК и опосредуют их доставку к TLR3, TLR7 и TLR9 соответственно. LL37 и програнулин (рrogranulin) связываются только с ДНК, и опосредуют доставку ДНК к TLR9 [по материалам Sasai et al., 2013; Lee et al., 2012] 71 Еще остается много вопросов относительно роли кофакторов в различных аспектах распознавания лиганда и активации рецепторов [Lee at al., 2012]. Возможно, наличие кофакторов влияет на способность TLR распознавать молекулы эндогенного и экзогенного происхождения [Brencicova at al., 2013]. Роль таких кофакторов, как гранулин и HMGB1, которые потенциально могут переносить провоспалительные эндогенные нуклеиновые кислоты в TLR - содержащие компартменты клетки еще предстоит определить [Lee at al., 2012]. Роль гранулина в доставке CpG к TLR9 В настоящее время получены доказательства участия белка гранулина в доставке CpG к TLR9 [Lee et al.,2012]. Гранулин представляет собой богатый цистеином гликозилированный многофункциональный белок, полученный в результате протеолитического процессинга 593-х аминокислотного предшественника програнулина (таблица 1.4) [Kang et al., 2011; Kessenbrock et al., 2008; Lee et al.,2012]. Название Структура белкового Локализация домена, локализация програнулин секретируемый, Взаимодей- Взаимодействие ствие с TLR с лигандом TLR9 CpG-A, CpG-B, эндолизосомы Ссылка [Park et al., 2011] CpG-C, Инг- ОДН HMGB1 ядро, TLR9, CpG-A, CpG-B, [Yanai et al., цитоплазма, возможно ДНК и РНК 2009; Ivanov et циркулируемый TLR3 и TLR7 al., 2007; Tian et al., 2007] LL37 CD14 ранние эндосомы TLR9 ДНК [Lande et al., млекопитающих 2007] секретируемый, TLR2, TLR3, LPS, PGN, [Baumann et al., связан с TLR4, Pam3CSK4, 2010]. мембраной TLR7, TLR8, Poly(I:C), CpG клеток, TLR9 ДНК эндолизосомы Таблица 1.4. Белки, облегчающие доставку лигандов к эндосомным рецепторам TLR [по материалам статей Lee et al.,2012; Park et al., 2011]. Несколько типов клеток выделяют конститутивный програнулин, и он присутствует в высоких концентрациях в сыворотке [Kang et al., 2011; Park et al., 2011]. 72 Добавление экзогенного програнулина усиливает секрецию фактора некроза опохоли альфа (ФНОа или TNFа) макрофагами (RAW) в ответ на синтетические олигодезоксинуклеотиды (ODN CpG класса B и C) [Park et al., 2011]. У мышей с отсутствием програнулина отмечается дефект синтеза ФНОа по сравнению с мышами дикого типа [Park et al., 2011]. Макрофаги костномозгового происхождения (BMDM - bone marrow-derived macrophages) с отсутствием програнулина (Grn -/-) были менее способны связывать CpG, чем макрофаги дикого типа, этот дефект может быть исправлен путем добавления экзогенного програнулина [Park et al., 2011]. Таким образом, гранулин может способствовать доставке CpG к лизосомальным отделам клетки (Рисунок 1.13) [Park et al., 2011; Lee et al.,2012]. HMGB1 – белок доставки РНК и ДНК Члены семейства ядерных белков HMGB (high mobility group box), ассоциированных с хроматином, участвуют в регуляции транскрипции ДНК [Lee et al., 2012; Lotze et al., 2005]. HMGB1 является наиболее изученным представителем этого семейства, провоспалительная функця HMGB1 реализуется через взаимодействие с рецепторами TLR2, TLR4, рецепторами RAGE (receptor for advanced glycation endproducts), CXCR4, и CD24 (рисунок 1.14) [Brencicova at al., 2013; Yanai et al., 2009]. HMGB1 играет роль в асептическом воспалении (при повреждении) и при инфекции [Hirata et al., 2013; Lee et al., 2012; Andersson et al., 2011]. HMGB1 - 215-аминокислотный растворимый белок, состоящий из двух ДНК-связывающих доменов, содержащих основные аминокислоты (А box и В box) и хвоста из кислых аминокислот (таблица 1.4) [Lee et al., 2012]. HMGB1 связывает ДНК независимо от состава нуклеотидной последовательности; показано, что HMGB1 доставляет лиганды к TLR9 и другим эндосомальным TLR [Lee et al., 2012; Chen et al., 2013; Yanai et al., 2009]. HMGB1 был описан как кофактор TLR9, связывающий CpG-ДНК, способствующий переносу CpGДНК на внутриклеточные компартменты клетки и улучшающий взаимодействие TLR9 с CpG-ДНК [Tian et al., 2007; Yanai et al., 2009]. Добавление экзогенного HMGB1 усиливает секрецию интерферона и продукцию провоспалительных цитокинов в ответ на CpG-ДНК [Ivanov et al., 2007; Tian et al., 2007]. 73 Рисунок 1.14. Ядерный белок HMGB1 выполняет разные функции в норме и при патологии. HMGB1 - ядерный ДНК-связывающий белок. Во время апоптоза связывание HMGB1 с хроматином предотвращает выброс нуклеиновых кислот клеток в окружающую ткань. При некрозе комплексы HMGB1 и хроматина попадают во внеклеточное пространство и действуют как сигналы опасности, стимулируя репарацию ткани. У комплексов HMGB1-ДНК есть способность стимулировать внутриклеточные TLR9/7/3. До сих пор неясно, какие факторы поддерживают регуляторную функцию HMGB1. HMGB1 также секретируется антиген представляющими клетками (АПК) после активации через PRR. После закрепления с вкДНК HMGB1 может действовать аутокринным и паракринным способом, сигнализируя через широкий спектр рецепторов, включая TLR2/4, RAGE, CXCR4, и CD24. [по мтериалам статьи Brencicova at al., 2013]. Секреция интерферона (ИФН или IFN) зависит от взаимодействия HMGB1 с рецепторами RAGE (рисунок 1.14) [Tian et al., 2007]. RAGE (receptor for advanced glycation end-products) описан как рецептор для связывания окисленных белков, липидов и нуклеиновых кислот и является «пассивным» рецептором кофактора TLR9 - HMGB1 [Chen et al., 2013]. Стимуляция RAGE приводит к активации ядерного транскрипционного фактора NF-kB и синтезу провоспалительных цитокинов [Ivanov et al., 2007; Bierhaus et al., 2007]. У пациентов с СКВ HMGB1 образует комплексы с нуклеосомами и циркулирует в крови [Tian et al., 2007]. Иммунные комплексы, содержащие ДНК млекопитающих, HMGB1 и IgG могут активировать аутореактивные клетки TLR9 - зависимым способом [Tian et al., 2007]. HMGB1 связывает ГЦ- богатую и ГЦ- обедненную ДНК, но только доставка ГЦ- богатой ДНК млекопитающих в виде иммунных комплексов HMGB1 - ГЦ- 74 ДНК - IgG оскществляется через B - клеточный рецептор и активирует В-лимфоциты TLR9 - зависимым способом [Avalos et al., 2010]. Таким образом, HMGB1 требуется для TLR9 - зависимого ответа клеток на CpG ДНК и может усугубить течение аутоиммунных заболеваний из-за его способности связывать ДНК [Avalos et al., 2010; Chen et al., 2013; Tian et al., 2007]. Белки HMGB могут быть универсальными посредниками врожденного иммунного ответа на нуклеиновые кислоты [Brencicova at al., 2013]. HMGB1 связывает и ДНК, и РНК, и связывается с белками HMGB2 и HMGB3, способными связывать ДНК и РНК, соответственно [Lee et al.,2012]. HMGB белки необходимы для секреции IFN типа I и провоспалительных цитокинов в ответ на РНК через TLR3 и TLR7, и ДНК через TLR9 [Chen et al., 2013]. Хотя не было продемонстрировано прямого связывания PRR с HMGB, отсутствие HMGB приводило к нижению ответов клеток на ДНК и РНК [Brencicova at al., 2013]. Таким образом, белки HMGB необходимы для адекватного ответа клеток на присутствие нуклеиновых кислот во внеклеточном пространстве (рисунок 1.14) [Brencicova at al., 2013]. Однако остается еще множество вопросов, связанных с ролью HMGB1 в TLR9-опосредованном ответе: как белки HMGB различают ДНК и РНК, как они противостоят разрушению вне клетки, как регулируется их связывания с нуклеиновыми кислотами. Будущие исследования должны ответить на эти вопросы для дальнейшего уточнения роли белков HMGB в ответе клеток на нуклеиновые кислоты. Роль LL37 в доставке лиганда к эндосомным TLR LL37 является кофактором, способстующим доставке ДНК к TLR9 в плазмоцитоидных дендритных клетках (рlasmacytoid dendritic cells – PDCS) [Lande et al., 2007]. LL37 – пептид длинной в 37 аминокислот амфипатически активированный при расщеплении его предшественника сериновой протеазой (таблица 1.4) [Gilliet et al., 2008]. Комплексы LL37 - ДНК устойчивы к деградации ДНКазами и локализуются в ранних эндосомах, откуда они опосредуют TLR9 - зависимую продукцию интерферона [Lande et al., 2007]. Высокое содержание комплексов LL37 - TLR9 обнаружено в коже пациентов с псориазом и аутоиммунными заболеваниями, характеризующимися локальной активацией дендритных клеток [Gilliet et al., 2008]. Хоть нет доказательств прямого взаимодействия LL37 и TLR9, предполагают, что LL37 могут играть роль в доставке молекул ДНК разрушенных клеток в условиях хронического повреждения клеток [Gilliet et al., 2008]. LL37 также могут образовывать комплексы с РНК для доставки этих комплексов в эндосомы к TLR7 и TLR8 рецепторам [Ganguly et al., 2009]. Таким образом, LL37 по аналогии с белками HMGB могут связывать нуклеиновые кислоты и опосредовать доставку ДНК и РНК к эндосомным TLR. 75 CD14 - кофактор нескольких TLR CD14 – 375 - аминокислотный гликопротеин, обогащенный лейциновыми повторами, который присутствует в растворимой форме в крови или в качестве мембранного белка на миелоидных клетках [Weber et al., 2012]. CD14 взаимодействует с несколькими лигандами TLR и повышает их способность активировать TLR (рисунок 1.13) [Baumann et al., 2010]. CD14 способен связывать ЛПС, пептидогликан, Pam3CSK4, polyI:C и CpG-ДНК (таблица 1.5) [Kim et al., 2005]. Аназиз кристаллической структуры CD14 выявил, что CD14 формирует димеры и образует подковообразную структуру, напоминающую эктодомен TLR, каждая субъединица оснащена гидрофобным карманом, расположенном на N - конце [Kim et al., 2005]. У CD14 сайты связывания различных лигандов TLR перекрываются, и ЛПС может конкурировать с ДНК и пептидогликанами за место связывания [Baumann et al., 2010]. CD14 усиливает иммунный ответ на лиганды эндосомальных TLR, в том числе CpG-ДНК, способствуя интернализации нуклеиновых кислот в клетку [Baumann et al., 2010]. Хотя CD14 связывается с TLR3, TLR7 и TLR9, неясно, участвует CD14 в перемещении эндосомных рецепторов так же, как TLR4, или просто способствует перемещению лмганда к эндосомпльным рецепторам [Baumann et al., 2010]. 1.6.1.5. Шапероны – роль в подготовке и перемещении TLR в эндосомы Шапероны – белки, которые ассоциированы с TLR на ранних стадиях их биосинтеза [McGettrick and O'Neill et al., 2013; Lee et al., 2012]. Эти белки участвуют в правильном архитектурном монтаже рецепторов TLR и в подготовке их выхода из эндоплазматического ретикулума (ЭПР) [McGettrick and O'Neill et al., 2013]. Шапероы включают растворимые белки, такие как gp96 и PRAT4A, которые находятся в ЭПР, а также белки связанные с мембраной ЭПР, такие как UNC93B1 (таблица 1.5) [Brooks et al., 2012; Lee et al., 2012; Ramaiah et al., 2013]. Некоторые из этих белков, например, gp96, участвуют в биогенезе TLR и других гликопротеинов, другие (UNC93B1) избирательно взаимодействуют с TLR и способствуют их перемещению из эндоплазматического ретикулума (ЭПР) в эндолизосомы [Lee et al., 2012]. Эти белки образуют чрезвычайно сложную стартовую площадку для подготовки TLR к их освобождению из ЭПР в правильно собранном виде. [McGettrick and O'Neill et al., 2013]. Некоторые из этих молекул могут оставаться связанными с TLR, пока рецепторы не достигли конечного пункта своего назначения [Lee et al.,2012]. 76 Шаперон эндоплазматичес TLR1, TLR2, не определен [Liu et al., 2010; Gp96 кий ретикулум TLR4, Staron et al., TLR9 2011; Yang et al., 2007] Шаперон эндоплазматичес TLR1, TLR2, PRAT4A кий ретикулум TLR4, Kiyokawa et al., TLR9 2008] UNC93B1 не определен [Liu et al., 2010; эндоплазматичес TLR3, TLR7, не определен [Kim et al., 2008; кий ретикулум, TLR8, Brinkmann et al., эндолизосомы TLR9 2007] Таблица 1.5. Белки, принимающие участие в биосинтезе TLR (обеспечиваие сборку и конформацию белков TLR) и облегчающие перемещение TLR в эносомы и эндолизосомы. [по данным статей Lee et al.,2012; Yang et al., 2007; Liu et al., 2010]. Участие Gp96 и PRAT4A в сборке TLR Gp96 – белок семейства HSP90, существует в виде растворимого гомодимера, состоит из 803 аминокислот, расположен в ЭПР, обеспечивает сборку и сворачивание белков [Brooks et al., 2012; Yang et al., 2007]. Gp96 содержитз N - концевой АТФ связывающий домен, средний домен и С - концевой домен димеризации [Yang et al., 2005]. До сих пор известно ограниченное количество мишеней gp96: интегрины, тромбоцитарные гликопротеины и TLR [Brooks et al., 2012; Liu et al., 2010; Staron et al., 2011; Yang et al., 2007]. Идентифицирован еще один шаперон, требующийся для нормальной сборки внутриклеточных TLR - PRAT4A (protein associated with TLR4A) [Takahashi, et al., 2007]. PRAT4A это широкораспространенный высоко консервативный растворимый белок, сосотоящий из 276 аминокислот, расположенный в просвете ЭПР, который идентифицирован методом ко-иммунопреципитации с TLR4 [Liu et al., 2010; Takahashi, et al., 2007]. PRAT4A и gp96 работают вместе, чтобы обеспечить надлежащую сборку TLR (рисунок 1.15) [Liu et al., 2010]. Функционирование TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR7 и TLR9, но не TLR3, требует наличия gp96 и PRAT4A [Liu et al., 2010; Yang et al., 2007; Yang et al., 2005; Takahashi et al., 2007]. Связывание белков Gp96 и PRAT4A с TLR1, TLR2, TLR4 и TLR9 необходимо для поверхностной экспрессии TLR1, TLR2 и TLR4 и для созревания и расщепления TLR9 [Brooks et al., 2012; Liu et al., 2010; Yang et al., 2007]. 77 Короткие РНК, образующие шпильки (shRNA short hairpin RNA или ShRNA), обуславливающие нокдаун Prat4a в В-клетках, препятствуют прохождению TLR1 и TLR4 через аппарат Гольджи и предотвращают лиганд – индуцированный переход TLR9 из ЭПР к эндолизосомам [Takahashi et al., 2010]. Мутации gp96 (E103A) и PRAT4A (M145K), которые препятствуют выходу TLR из ЭПР, также предотвращают связывание gp96 и PRAT4A in vivo [Liu et al., 2010; Kiyokawa et al., 2008]. Рисунок 1.15. Шапероны ЭПР и их роль в сборке и перемещении TLR в эндолизосомы. Шапероны gp96 и PRAT4A ответственны за надлежащую сборку и функционирование TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 и TLR9, но не TLR3. Белок UNC93B1, связанный с мембраной ЭПР, требуется для транслокации эндосомных TLR7 и TLR9 к эндолизосомам, где эти TLR расщепляются катепсинами и аспарагин-эндопептидазой (AEP - asparagine endopeptidase) и в расщепленном состоянии связывают лиганды (ДНК или РНК). Связывание TLR9 с лигандами запускает TLR9 - и NF-kB - сигнальные пути, что приводит к секреции провоспалительных цитокинов. Адаптерный белок AP3 (adaptor protein 3) опосредует перемещение TLR9 к лизосомам, где инициируется IRF7 сигнальный путь, приводящий к инициированию экспрессии генов интерферона типа I[по статьям Sasai et al., 2013; Lee et al., 2012]. Эктодомены TLR, таким образом, требуют и gp96, и PRAT4A для правильной сборки и скручивания перед выходом из ЭПР, однако, остается еще множество вопросов, связанных с особенностями сборки, димеризации и стабилизации TLR; ролью в этих процессах gp96 и PRAT4A; участием других шаперонов в этих процессах; идентификацией структурного мотива в gp96 и PRATA, узнающего TLR [Lee et al.,2012]. UNC93B1 способствует перемещению TLR к эндолизосомам 78 UNC93B1 (Uncoordinated 93B1) – тренсмембранный гликопротеин, расположенный в ЭПР, содержащий 598 аминокислот и проходящий через мембрану ЭПР двенадцать раз (таблица 1.5) [Tabeta et al., 2006]. У мышей, гомозиготных по миссенс-мутации (H412R), расположенной в девятом трансмембранном домене UNC93B1, нарушается перемещение TLR7 и TLR9 к CpG – содержащим эндолизосомам и передача сигнала через TLR3, TLR7 и TLR9 [Tabeta et al., 2006; Kim et al., 2008]. Клетки человека с мутациями, приводящими к укороченным транскриптам UNC93B1, имеют дефект передачи сигнала через TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9 [Lee et al.,2012]. Таким образом, UNC93B1 требуется для проведения сигнала через эндосомальные TLR (рисунок 1.15), взаимодействие TLR с UNC93B1 осуществляется через трансмембранные домены TLR [Brinkmann et al., 2006]. Таким образом, TLR, связывающие нуклеиновые кислоты, должны взаимодействовать с UNC93B1 через их трансмембранные домены, чтобы UNC93B1 опосредовал их доставку к эндолизосомам, где они могут связывать соответствующие лиганды [Lee et al.,2012; Tabeta et al., 2006; Kim et al., 2008; Brinkmann et al., 2006]. UNC93B1 спсобен различать разные TLR: мутации в разных областях UNC93B1 оказывают влияние на связывание UNC93B1 с конкретным типом TLR, и не оказывает влияния на его связывание с другими TLR [Fukui et al., 2011]. Предстоит ответить на много вопросов относительно роли UNC93B1 в биологии TLR: как клетка воспринимает сигнал, первоначально необходимый для перемещения комплекса UNC93B1-TLR из ЭПР в эндолизосомы; есть ли на поверхности клетки функциональные TLR, связывающие нуклеиновые кислоты, которые могут передавать сигнал внутрь клетки, или в процессе участвуют дополнительные сенсоры нуклеиновых кислот [Lee et al.,2012]. AP3 – фактор переноса TLR9 к лизосомам AP3 (Adaptor protein 3) является необходимым компонентом механизма внутриклеточного перемещения TLR9. Члены семейства Ар - тетрамерные белки, состоящие из четырех субъединиц: δ, µ3A, β3A и σ3, обеспечивают сортировку мембранных белков в секреторном и эндоцитозном направлении [Sasai et al.,2010]. AP3 способствует переносу комплекса TLR9 - CpG из эндосомы в лизосомы и органеллы, связанные с лизосомами (LRO – lysosomerelated organelles) (рисунок 1.15) [Sasai et al.,2010]. В макрофагах, выделенных из костного мозга (BMDM - bone marrow derived macrophage), с отсуствующей субъединицей β3A белка AP3 (Ap3b1 -/-) снижена экспрессия нтерфеона в ответ на стимуляцию клеток CpG, PolyI:С и ЛПС и нарушено перемещение TLR9 в лизосомы [Sasai et al.,2010]. Протеазы, участвующих в расщеплении TLR Протеолитическое расщепление TLR9 в эндосомах/лизосомах с помощью протеаз, 79 таких как катепсины и аспарагин-эндопептидаза (AEP), является ключевым событием в активации TLR9 фрагментами CpG-ДНК [Bauer et al., 2012]. TLR9 подвергается протеолитическому расщеплению по прибытию в эндолизосомальный компартмент и, возможно, в ранние эндосомы с низким рН и протеазами [Bauer et al., 2012; Ewald et al., 2008; Park et al.,2008]. Протеазы, которые процессируют TLR, должны взаимодействовать с TLR9, по крайней мере, временно, и могут считаться кофакторами TLR9 [Ewald et al., 2008]. Эндосомально/лизосомальный комплемент протеаз состоит в основном из катепсинов, катепсины вовлечены в функционирование TLR9 [Park et al.,2008]. Катепсины В, L, S и катепсин F ассоциированы с функционированием TLR9 в Bлмфоцитах, ингибирование этих катепсинов блокирует TLR3 - , TLR7 - и TLR9 – опосредованный ответ [Matsumoto et al.,2008]. Комбинированное действие катепсина L и S в расщеплении TLR9 необходимо для проведения сигнала через TLR9 [Ewald et al., 2008; Park et al.,2008]. Для полноценной активности TLR9 требуется активность нескольких катепсинов, ингибирование отдельных катепсинов не полностью ингибирует расщепление и TLR9 - контролируемый ответ [Bauer et al., 2012; Ewald et al., 2008; Park et al.,2008]. AEP (аsparagine endopeptidase) является лизосомальной протеазой, которая расщепляет C - конец TLR9 по остаткам аспарагина и приводит к его активации в антигенпредставляющих клетках [Ewald et al., 2011]. Для функционирования TLR3 и TLR7 также важен протеолитический процессинг [Ewald et al., 2011; Qi et al., 2013]. Считается, что расщепление TLR в эндосомальном компартменте клеток предотвращает активацию TLR эндогенными нуклеиновыми кислотами в физиологических условиях [Brencicova et al., 2013]. Выявление новых молекул – кофокторов в функционировании TLR и выяснение механизма их действия приведет к более глубокому пониманию биологии TLR [Brencicova et al., 2013; Sasai et al., 2013; Lee et al., 2012]. 1.6.1.6. Как иммунная система отличает нуклеиновые кислоты болезнетворных микроорганизмов и собственные нуклеиновые кислоты Как только стало понятным, что нуклеиновые кислоты эндогенного происхождения могут быть активаторами TLR, расположенных на эндосомах, возник вопрос о том, как же клетки отличают экзогенную ДНК/РНК от вкДНК, образующуюся в результате гибели клеток организма [Brencicova at al., 2013; Theofilopoulos at al., 2011]. Предполагалось, что TLR9 может различать неметилированные бактериальная ДНК, от собственной ДНК, CpG мотивы, которая которыми изобилует у млекопитающих сильно метилирована – это свойство лигандов TLR9 легло в основу создания синтетических 80 лигандов [Kaminski at al., 2013; Krishnamachari at al., 2009; Klinman at al., 2008]. Однако выяснилось, что при ряде патологий в организме накапливаются фрагменты собственной CpG - богатой неметилированной вкДНК, которая может служить лигандом TLR9 [Вейко с соавт., 2006; Вейко с соавт., 2008; Pisetsky, 2010; Pisetsky, 2012]. Связывание комплексов вкДНК с рецепторами клеточной поверхности одинакова как для вкДНК экзогенного происхождения, так и для своей собственной вкДНК [Kostyuk at al., 2013; Brencicova at al., 2013]. Это логично, поскольку организм должен равно избавляться от нуклеиновых кислот микроорганизмов и ДНК погибших клеток [Brencicova at al., 2013]. Однако, процессы, запускаемые в ответ на эндогенную вкДНК и вкДНК экзогенного происхождения должны отличаться, поскольку связывание эндогенной вкДНК антиген-представляющими клетками сопровождается активацией аутоиммунитета [Barrat et al., 2005; Boule et al., 2004]. Показано, что наиболее важным событием в узнавании вкДНК/РНК является перемещение нуклеиновых кислот в эндосомальный компартмент [Brencicova at al., 2013]. Предположили, что в физиологических условиях запрещен доступ собственных нуклеиновых кислот в эндосомы, что предотвращает активацию эндосомальных TLR [Brencicova at al., 2013; Barton and Kagan, 2009]. В отличие от вирусов и бактерий, у которые развиты специализированные механизмы проникновения внутрь клетки, способность эндогенной вкДНК проникать в клетку и попадать в эндосому ограничена [Yasuda et al., 2005; Haas et al., 2008]. В эксперименте in vitro показано увеличение активации TLR9 при использовании веществ, облегчающих доступ вкДНК в клетку [Lande et al., 2007; Sandgren et al., 2004]. Так, комплекс ДНК с LL37 облегчает активацию TLR9 в дендритных клетках человека, поскольку LL37 способствует переносу ДНК на эндосомы [Sandgren et al., 2004]. Аналогично, образование ДНК - DOTAP (cationic lipid) комплексов или иммуноглобулин – хроматин иммунных комплексов также повышает уровень интернализации вкДНК в эндосомы [Yasuda et al., 2005; Haas et al., 2008; Boule et al., 2004]. Однако необходимо помнить, что экспериментальные системы часто не в состоянии передать сложность процессов активации TLR9, происходящих in vivo, поскольку в организме нуклеиновые кислоты образуют сложные комплексы с белками, гликопротеинами и липидами, что усложняет процессы активации TLR естественными лигандами [Barton and Kagan, 2009]. Кроме того, в физиологических условиях "голые" нуклеиновые кислоты, не образующие комплексов с белками и липидами быстро подвергаются деградации внеклеточными эндонуклеазами прежде, чем они смогут получить доступ к эндосомам [Вейко и соавт., 2008; Chan et al., 2005; Suzuki et al., 2008]. 81 При дефекте работы нуклеазной системы опасность активации эндосомальных TLR повышается и возникает риск развития аутоиммунных заболеваний, что и показано на пациентах с СКВ, имеющих мутации в дезоксирибонуклеазе I [Yasutomo et al., 2001]. Кроме того, эффект активации TRL9 синтетическими агонистами нуклеиновых кислот комбинируется с эффектом активации других рецепторов – скавенджер - рецепторов, лектиновых рецепторов С-типа (DEC-205) [Brencicova at al., 2013; Lahoud et al., 2012; Jozefowski et al., 2006; Limmon et al., 2008]. Проникновение в клетку фрагментов эндогенной вкДНК опосредовано эндоцитозом с участием скавенджер-рецепторов и фагоцитозом с участием компонетов комплемента (рисунок 1.10) [Brencicova at al., 2013]. Эффективность работы этих механизмов определяет перемещение вкДНК в эндосомы [Brencicova at al., 2013]. Доставка фрагментов эндогенной вкДНК может регулироваться кофактрами, способствующими перемещению вкДНК к эндосомам: гранулином, HMGB1, LL37 [Lee at al., 2012; Hirata et al., 2013; Lee et al., 2012; Andersson et al., 2011; Gilliet et al., 2008; Baumann et al., 2010]. Перемещение рецептора TLR9 к эндосомам с участием белков UNC93B1 и АР3 и его сборка перед выходом из ЭПР с участием кофакторов gp96, и PRAT4A необходимы для достижения функциональной активности рецептора в эндолизосомах [Brooks et al., 2012; Lee et al., 2012; Ramaiah et al., 2013]. Скоординированная работа всех кофакторов требуется для ответа на фрагменты эндогенной вкДНК [Lee et al., 2012]. Одним из защитных механизмов, позволяющих избежать нежелательной активации TLR эндогенной вкДНК является расщепление TLR при прохождении через ЭПР и аппарат Гольджи [Brencicova at al., 2013]. Еще один механизм, ограничивающий связывание эндогенной вкДНК с TLR9 – пространственная ориентация лиганда и рецкптора [Leifer et al., 2006]. Эффективность связывания ДНК с TLR9 определяется как ориентацией и расположением ДНК в ранних и поздних эндосомах, так и ориентацией трансмембранных и цитоплазматических доменов TLR9 на эндосоме [Leifer et al., 2006]. Одним из основных механизмов, позволяющих клетке адекватно реагировать стимуляцию фрагментами вкДНК экзогенного и эндогенного происхождения является дифференцированная индукция перемещения рецепторов TLR9 из ЭПР к эндолизосомам [Brencicova at al., 2013; Avalos et al., 2013]. Небольшое количество TLR обнаруживается в эндосомах в отсутствие стимуляции, что может свидетельствовать о наличии постоянной низкочастотной стимуляции TLR в норме [Ewald et al., 2008; Park et al., 2008; Chockalingam et al., 2009; Blasius and Beutler, 2010]. Во время инфекции в эндосомах 82 обнаруживается большое количество TLR в эндосомах [Park et al., 2008; Chockalingam et al., 2009]. Индуцируют это перемещение либо внутриклеточные TLR, которые способны перемещаться к клеточной поверхности (например, TLR9), либо мембранные TLR или другие образраспознающме рецепторы [Brencicova at al., 2013; Avalos et al., 2013; Kerrigan and Brown, 2010]. Так, «сторожевые» (gatekeeper) рецепторы, контролирующие сигнальные пути, такие как CD24-Siglec или CLR-Syk, могут модулировать или индуцировать перемещение TLR к эндосомам. [Kerrigan and Brown, 2010]. Присутствие «сторожевых» (gatekeeper) рецепторов со способностью отличать специфические сигналы от экзогенной и от эндогенной вкДНК и способность этих рецепторов регулировать перемещение TLR, вероятно, играет важную роль в защите от аутоиммунной реакции [Dennehy et al., 2008; Meyer-Wentrup et al., 2009; Jahn et al., 2010; Eberle and Dalpke, 2012]. Однако, несмотря на множество уровней регуляции, в соответствующих условиях TLR9 также способны узнавать эндогеную ДНК и инициирорвать развитие аутоиммунного ответа [Barrat et al., 2005]. 1.6.2. Другие рецепторы - кандидаты на роль связывания вкДНК Наиболее изученным мембраносвязанным рецептором, опознающим вкДНК, является TLR9, тем не менее, показано наличие TLR9 – независимых сенсоров ДНК [Vilaysane and Muruve, 2009]. Обнаружение вкДНК внутри клетки инициирует два различных сигнальных каскада: первый включает активацию транскрипционных факторов IRF3 (interferon regulatory factor 3) и ядерного транскрипционного фактора NF-kB (nuclear factor kappa B – NF-kB), которые приводят к транскрипции генов IFN-β, хемокинов и провоспалительных цитокинов [Unterholzner et al., 2013]. Второй сигнальный пути приводит к образованию инфламосомы – белкового комплекса, который активирует каспазу - 1, протеазу, которая процессирует про - интерлейкин (IL)-1β и про - IL-18 до активных цитокинов, готовых к секреции [Unterholzner et al., 2013]. Комплекс инфламмасомы может быть активирован широким спектром стимулов, включая внеклеточный АТФ, пороформирующие токсины, активные формы кислорода, однако для AIM2, образующего инфламмосому, показано прямое связывание двуцепочечной ДНК с рецептором [Latz et al. 2013]. Труднее охарактеризовать сигнальных каскады, приводящие к транскрипции IFN-β и других цитокинов [Unterholzner et al., 2013]. Сигнальные пути, приводящие к синтезу IFN-β при индукции внеклеточной ДНК, включают адаптерный белок STING (stimulator of IFN genes), который находится в эндоплазматическом ретикулуме или связан с мембраной митохондрий [Ishikawa et al., 2009; Sun et al., 2009; Zhang et al., 2011]. N –концевая часть STING содержит четыре трансмембранных домена, а его C- конец, который, как полагают, 83 распространяется в цитоплазму, связывает TBK1 (TANK-binding kinase1) и IRF3, таким образом способствуя фосфорилированию IRF3 по TBK1 [Tanaka and Chen, 2012]. Несколько рецепторов ДНК было предложено в качестве сенсоров, узнающих вкДНК с последующей индукцией STING - зависимого сигнального пути, приводящего к активации факторов транскрипции IRF3, инициирующего транскрипцию мРНК IFN-β и NF-Kb (рисунок 1.16) [Unterholzner et al. 2013]. Рисунок 1.16. Внутриклеточные рецепторы ДНК участвуют в индукции интерферона-β (IFN-β). Несколько рецепторов ДНК было предложено в качестве сенсоров, узнающих вкДНК с последующей индукцией STING - зависимого сигнального пути, приводящего к активации факторов транскрипции IRF3, инициирующего транскрипцию мРНК IFN-β и NF-kB. Циклические GMP-AMP синтазы (cGAS) активируют STING через продукцию циклической ГМФ-AMP (cGAMP) в качестве вторичного мессенджера. Молекулярная основа активации STING другими рецепторами ДНК менее хорошо определена (пунктирные стрелки). РНК-полимеразы III инициирует STING - независимые сигнаьные пути с участием транскрипции поли poly(dA-dT) в дцРНК, которая затем узнается RIG-I. LRRFIP1 чувствителен и к ДНК, и к РНК, и активирует транскрипционный кофактор катенин, который кооперируется с IRF3 в транскрипции промотера IFN-β [Unterholzner et al. 2013]. Транскрипционный фактор NF- kB также активируется двухцепочечной ДНК [Ferguson et al. 2012; Unterholzner et al. 2010]. То же самое справедливо для активации белка МАРК (mitogen activated protein kinases), которые играют важную роль в транскрипционном и пост-транскрипционном ответе на различные патогены и которые также участвуют в ответе на внутриклеточную ДНК [Symons et al. 2006; Patel et al. 2011]. 84 Предстоит выяснить, насколько в активацию МАРК вовлечен адаптер STING [Unterholzner et al. 2013]. STING – независимым способом узнются вкДНК, в частности, с помощью ДНК-геликаз DHX9 и DHX36 в плазмацитоидных дендритных клетках, предположительно, через адаптер TLR MyD88 [Kim et al. 2010]. К внутриклеточным рецепторам, опознающим нуклеиновые кислоты, относят ZBP1 или DAI (DNA-dependent activator of interferon-regulatory factors), AIM2 (absent in melanoma), RIG-1 [Chiu et al., 2009; Li et al., 2013; Kawai and Akira, 2008; Wu et al., 2013]. В сочетании с TLR9, эти рецепторы обеспечивают разнообразный набор механизмов для опознания вкДНК как эндогенного, так и экзогенного происхождения. 1.6.2.1. ZBP1 или DAI – сенсор цитозольной ДНК В 2007 был описан рецептор – сенсор цитозольной ДНК, регулирующий интерферон типа I ответ [Takaoka et al., 2007]. Переименованный в DAI, этот белок был ранее известен под двумя названиями: DLM-1 и ZBP1 (Z-DNA binding protein-) (рисунок 1.17. А) [Rothenburg et al., 2002; Fu et al., 1999]. Рисунок 1.17. А – Проведение сигнала через DAI (или ZBP1). DAI (или ZBP1) связывается с ДНК через Zα, Zβ и D3 домены. NF-kB активация опосредуется взаимодействием RHIM с RIP1и RIP3. Сигнальный путь продукции интерферона типа I опосредуется С-концом белка DAI и вовлекает TBK-1 и IRF3. [Vilaysane et al., 2009]. БAIM2 - инфламмасома. AIM2 связывается с ДНК через домен HIN200. Олигомеризованный белок в комплексе с адаптером ASC связывает прокаспазу 1 через домен CARD – с формированием AIM2-инфламмасомы. Активированная каспаза 1 опосредует процессинг и секрецию про-IL-1β и про-IL-18 и, кроме того, запускает пироптоз [Vilaysane et al., 2009; Miao et al., 2011]. 85 Присутствие ZBP1 было первоначально установлено в опухолевых стромальных клетках, но позднее выяснилось, что он экспрессируется во многих тканях, лимфоцитах и макрофагах [Deigendesch et al., 2006; Rothenburg et al., 2002; Fu et al., 1999]. ZBP1 связывает левозакрученную спираль – Z - форму ДНК с высоким сродством и имеет общие ДНК - связывающие домены (Zα, Zβ и D3) с ферментом ADAR1 (RNA editing enzyme adenosine deaminase acting on RNase1) и вирусным белком E3L (Zα). В ZBP1 присутствует множество С - концевых серин /треониновых сайтов фосфорилирования [Unterholzner, 2013; Ng et al., 2013]. Показана индукция интерферона в DAI (или ZBP1) - сигнальном пути, что свидетельствует о TLR - независимом ДНК - сенсорном механизме [Vilaysane et al., 2009; Fu et al., 1999]. DAI (или ZBP1) также взаимодействует с RIP1 и RIP3 через домен RHIM (RIP homotypic interaction motif), который активирует NF-kB [Kaiser et al., 2008]. Связывание ДНК с DAI (или ZBP1) происходит независимо от последовательности ДНК, но активация интерферона происходит на последовательности ДНК длиной не менее 100 б.п., и лучшими лигандами для DAI служат мультимерные комплексы ДНК [Wang et al., 2008: Takaoka et al., 2008]. 1.6.2.2. Роль рецептора RIG1 в проведении сигнала от вкДНК Непосредственная рассматривалась в активация качестве рецепторов возможной, RIG-1 поскольку фрагментами лигандом вкДНК RIG-I не является двуцепочечная РНК [Sathe and Reddy, 2014; Vabret et al., 2013]. Однако в последнее время был обнаружен еще один возможный механизм активации RIG-I АТ - обогащенной ДНК с участием РНК-полимеразы III (рисунок 1.18) [Chiu et al., 2011; Ablasser et al., 2009]. РНК-полимераза III (РНК Pol III) инициирует путь распознавания ДНК путем конвертации АТ - обогащенной двухцепочечной ДНК в цитоплазме и, потенциально, в ядре в 5 ʽ- дцРНК, которая, в свою очередь, воспринимается рецептором RIGI (retinoic acid inducible gene I) (рисунок1.18) [Chiu et al., 2011; Ablasser et al., 2009]. Кроме того, RIGI может быть активатором адаптерного белка STING [Ishikawa et al., 2009; Sun et al., 2009; Zhang et al., 2011]. STING через C- концевой домен, распространяющийся в цитоплазму, связывает TBK1 (TANK-binding kinase1) и IRF3, таким образом способствуя фосфорилированию IRF3 по TBK1 [Tanaka and Chen 2012], что приводит к синтезу интерферона типа I [Hornung et al., 2010]. 86 Рисунок 1.18. Путь узнавания вкДНК, приводящий к синтезу интерферона типа I с участием РНК-полимеразы III, рецептора RIGI (retinoic acid-inducible gene I) и адаптерного белка STING (stimulator of IFN genes) [по Hornung et al., 2010]. 1.6.2.2. AIM2 и Инфламмасома Рецептор AIM2 идентифицирован как цитоплазматический сенсор, опосредующий NF-kB - сигнальный путь и эффект активации каспазы 1 в ответ на цитоплазматическую двухцепочечную ДНК [Franchi et al., 2009; Burckstummer et al., 2009; Fernandes-Alnemri et al., 2009; Hornung et al., 2009; Roberts et al., 2009]. Для активации AIM2 неважен источник нуклеиновой кислоты – любая двуцепочечная ДНК может вызывать TLR9 - независимую активацию AIM2 [Vladimer et al., 2013]. AIM2 относится к семейству белков NLR (nucleotide-binding domain leucine rich repeat), экспрессируется в цитозоле и содержит домены HIN200 и PYD (рисунок 1.17. Б) [Li et al., 2014; Unterholzner, 2013; Shaw and Liu, 2014; Tang et al., 2012]. Показано, что AIM2 активируется вкДНК как экзогенной, так и эндогенной природы, образующейся в результате гибели собственных клеток организма [Hornung et al., 2010]. Олигомеризация AIM2 способствует связыванию серин/треониновой киназы (RIP2/RICK) с доменом CARD этих рецепторов, что приводит к активации NF-kB (рисунок 1.19) [Franchi et al., 2009]. Связывание дцДНК с AIM2 приводит к образованию протеолитических комплексов – инфламмасом, состоящих из олигомерного рецептора, адаптерного белка ASC и прокаспазы 1 (рисунок 1.19) [Bauernfeind and Hornung, 2013; Di Virgilio, 2013]. Инфламмасома является белковым комплексом, который инициирует протеолитический процессинг Pro-IL-1β и Pro-IL-18 в зрелые воспалительные цитокины, кроме того, инфламмасомы инициируют пироптотическую гибель клеток, независимо от цитокинов (рисунок 1.17. Б) [Vladimer et al., 2013]. Инфламмасома состоит из прокаспазы 1 и AIM2 87 [Vilaysane et al., 2009; Miao et al., 2011]. AIM2 - инфламосоме требуется адаптерный белок ASC, который является медиатором взаимодействия между AIM2 и каспазой 1 [Unterholzner, 2013; Chen, 2011; Choubey, 2012]. Каспаза 1 - провоспалительная каспаза, которая не принимает участия в апоптозе, она активирует процессинг большого количества разнообразных клеточных субстратов, в том числе цитокинов IL- 1β и IL-18 (рисунок1.16) [Vilaysane et al., 2009; Miao et al., 2011]. Рисунок 1.19. Активация ответа клетки на присутствие дцДНК в цитоплазме через цитоплазматический рецептор AIM2. ДНК может поступать в клетку в виде ДНК- содержащих иммунных комплексов и связываться с рецептором AIM2. Связывание лиганда с AIM2 приводит к олигомеризации рецептора, связыванию адаптерного белка ASC и формированию инфламмосомы. Инфламмосома активирует каспазу-1 , которая опосредует расщепление про-цитокинов: интерлейкина-1β (IL-1β) и IL-18, которые затем выходят во внеклеточное пространство. Параллельно образование инфламмасомы AIM2 приводит к активации ядерного фактора транскрипции NF- kB и индукции пироптоза клетки [по Hornung et al., 2010]. 88 Потенциальных мишеней инфламмасомы и каспазы 1 гораздо больше – например, инфламмасома участвует в процессе гликолиза и в воспалительной форме гибели клеток называемой «пироптоз» (от англ. "pyroptosis") [Miao et al., 2011; Shao et al., 2007; Fernandes-Alnemr et al., 2007]. Пироптоз представляет собой запрограммированную гибель клеток, в отличие от апоптоза, связанную с потерей целостности мембраны в сочетании с секрецией IL- 1β и IL- 18 [Miao et al., 2011; Shao et al., 2007; Fernandes-Alnemr et al., 2007]. AIM2 - инфламмасома имеет решающее значение для активации каспазы - 1 и гибели клеток, но не активирует прдукцию интерферона - β в ответ на цитоплазматическую дцДНК [Franchi et al., 2009; Vladimer et al., 2013]. Вероятно существование и других сенсоров вкДНК, поскольку уже обнаруженные рецепторы не объясняют всего разнообразия проявления эффектов вкДНК в отношении биологической активности клеток. 1.7. Внеклеточная ДНК – индуктор окислительного стресса в клетках Показано, что вкДНК может индуцировать окислительный стресс, сопровождаемый продукцией активных форм кислорода в гистологически разных клетках человека [Ermakov et al., 2013; Kosyuk et al., 2013; Loseva et al., 2012; Glebova et al., 2013]. Повышение уровня АФК приводит к окислительному повреждению многих клеточных биомолекул: липидов, белков, ДНК ядер клеток [Glebova et al., 2013; Kosyuk et al., 2013;]. Окисление молекулы ДНК приводит к нарушению геномной стабильности и является угрозой для поддержания клеточного гомеостаза, особенно когда перегружена емкость системы репарации ДНК [Weyemi et al., 2012]. Помимо нарушения клеточного гомеостаза, накопление окислительных повреждений ДНК может способствовать процессу мутагенеза [Sedelnikova et al., 2010]. Хроническое воздействие окислительного стресса может приводить к высокому уровню повреждения ДНК [Lambeth, 2007]. Хорошо известно, что внешние опасные для генома воздействия, такие как ионизирующее излучение, ультрафиолет, многие химические вещества вызывают повышенное образование активных форм кислорода (АФК) [O’Neill et al., 2009, McMillan et al., 2008]. Важным эндогенным источником АФК в клетке являются семейство ферментов NADPH – оксидаз (NOX), которые являются транспортером электронов с NADPH на кислород, что приводит к образованию радикала супероксид-аниона (O2·), который является предшественником многих других активных форм кислорода [Bedard et al., 2007; Chen et al., 2012]. 89 1.7.1. Роль фермента NOX4 в синтезе активных форм кислорода, индуцированном вкДНК. Семейство NADPH - оксидаз включает в себя 5 ферментов NOX 1-5 и DUOX l и 2 [Weyemi et al., 2012]. Все пять ферментов NOX(1-5), в том числе NOX4, являются клеточными трансмембранными оксидоредуктазами, имеют шесть трасмембранных компонентов с двумя железосвязывающими областями, цитоплазматический C- терминальный участок, который содержит ФАД - и НАДФ - связывающие области (рисунок 1,20) [Chen et al., 2012; Kawahara et al., 2007]. Каталитическая активность NADPH - оксидаз обусловлена связыванием NADPH в С-концевой области фермента и переносом электронов через FAD на два железосвязывающих остатка и, в конечном итоге, на молекулярный кислород, образуя короткоживущий O2·, который с участием, или без участия супероксиддисмутаз преобразуется в перекись водорода (H2O2), а затем в радикал гидроксила (·OH-) или при действии каталазы - в кислород и воду [Chen et al., 2012]. Рисунок. 1.20. Структура фермента NOX4. NADPH-связывающий сайт находится в COOH-терминальной, FAD-связывающей области в непосредственной близости от трансмембранного домена, состоящего из шести спиральных трансмембранных последовательностей. [по Chen et al., 2012; Weyemi et al., 2012]. NOX4 является одной из самых распространенных изоформ NOX [Brown et al., 2009; Miller Jr., 2009]. NOX4 локализуется на мембране и непосредственно соединяется с интегральным мембранным белком p22phox, необходимым для активации NOX4 (рисунок 1.20) [Chen et al., 2012, Weyemi et al., 2012]. NOX4 является постоянно активным, это связано с уникальными характеристиками С- концевой области NOX4, которая расположена в цитозоле и является постоянно "включенной" [Nisimoto et al., 2010]. Количество активных форм кислорода (АФК) производимых NOX4, в первую очередь, регулируется на уровне транскрипции [Chen et al., 2012]. Хотя в последнее время 90 появились доказательства посттрансляционного контроля уровня АФК производимых NOX4 [Weyemi et al., 2012]. Еще одной отличительной чертой NOX4 является его способность к быстрой дисмутации O2· прежде, чем он покинет фермент, что связано со строением Е-петли трансмембранных доменов NOX4 [Takac et al., 2011; von Löhneysen et al., 2010]. С этим свойством фермента связано определяемое повышенное содеожание перекиси водорода при активации NOX4 [Brandes et al., 2011]. Ген, кодирующий NOX4, находится на хромосоме 11 и содержит 34 интрона; фермент NOX4 состоит из 578 аминокислот, молекулярная масса – 67 кДа [Chen et al., 2012]. В результате альтернативного сплайсинга образуется 16 изоформ, отличающихся друг от друга отсутствием фрагментов разной длины, разные варианты сплайсинга NOX4 локализуются в разных компартментах клеток [Chen et al., 2012]. NOX4 идентифицирован в клектах эндотелия в клетках гладких мышц, фибробластах, кардиомиоцитах, гемопоэтических стволовых клетках, кератиноцитах, клетках адипоцитах, меланомы, нейронах, эмбриональных стволовых клетках, хондроцитах, звездчатых клетках печени, эпителиальных клетках, подоцитах [Dikalov et al., 2008; Chen et al., 2012; Schroder, et al., 2012]. Показано, что NOX4 локализован не только на мембране клеток, но и на структурах внутри клетки, что может определять различную активность фермента, тип продуцируемых АФК, активацию различных путей передачи сигнала [Weyemi et al., 2012]. Показана локализация NOX4 в ядре и эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) в моноцитах, эндотелиальных клетках, клетках гладких мышц [Lee et al., 2010; Weyemi et al., 2012]; в митохондриях кардиомиоцитов, раковых клеток, клеток коркового слоя почек, нейронов [Case et al., 2013, Weyemi et al., 2012, Graham et al., 2010]. Различная локализация NOX4, вероятно, связана с типом клеток, но механизмы такого разного распределения остаются неясными – так, непонятно, почему митохондриальная локализация NOX4 характерна не для всех типов клеток [Graham et al., 2010]. Возможно, существуют переходы NOX4 из одного внутриклеточного отсека в другой, и некоторые места локализации являются временными [Lyle et al., 2009]. Для поддержания активности фермента NOX4 не требуется цитозольных белков, есть несколько белков, модулирующих его активность. [Lyle et al., 2009; Weyemi et al., 2012]. Показано, что NOX4 может активироваться различными экзогенными факторами, такими как трансформирующий фактор роста бета (TGF- β ), фактор некроза опухоли альфа [Moe et al., 2011; Chen et al., 2012]. Показано, что цитозольная часть TLR4 может взаимодействовать с C - концевой областью NOX4, опосредуя ЛПС - индуцированную 91 продукцию АФК [Park et al., 2004]. Ингибируют активность и экспрессию NOX4 тромбоцитарный фактор роста (PDGF), PPAR –гамма, BMP4 [Chen et al., 2012]. Активность промотора NOX4 регулирует ряд факторов транскрипции: NFkB, SMAD2/3, E2F, HIF1α, Nrf2, пути активации, вероятно, также зависят от стимулов и типа клеток [Buelna-Chontal et al., 2013]. Фрагмены окисленной вкДНК активируют транскрипцию гена NOX4 в фибробластах и клетах аденокарциномы молочной железы [Kostyuk et al., 2013]. Поскольку NOX4 является постоянно активным, изменения в экспрессии NOX4 приводят к изменению уровня АФК [Weyemi et al., 2012; Kostyuk et al., 2013]. NOX4 – опосредованный синтез АФК в клетках может влиять на различные сигнальные пути в зависимости от наличия или отсутствия агонистов [Chen et al., 2012]. Показано, что NOX4 активирует несколько киназ, в том числе p38MAPK, Ras/ERK, JNK и Akt [Chen et al., 2012]. Способность NOX4 регулировать конкретных сигнальные пути и клеточные функции по-видимому, зависит от уровня экспрессии NOX4, внутриклеточной локализации NOX4 и типа клеток [Chen et al., 2012]. Появляется все больше работ о роли продуцируемых NOX4 АФК в повреждении ДНК ядер клеток (рисунок 1.21) [Lener et al., 2009; Kosyuk et al., 2013]. Хотя супероксид – радикал быстро дисмутирует в H2O2, он может реагировать с NO для продукции пероксинитрита, который вызывает сильные повреждения ДНК [Pacher et al., 2007]. Пскольку NOX4 обнаруживают в ближайшем окружении ядра, накапливаются доказательства участия АФК, продуцируемых NOX4, в геномной нестабильности клеток (рисунок 1.21) [Belousov et al., 2006; Anilkumar et al., 2013; Weyemi et al., 2012; Kostyuk et al., 2013]. Фосфорилирование гистонов H2A по Ser139 происходит в ответ на двунитевые разрывы ДНК (DSB) [Rogakou et al., 1998, Gorgoulis et al., 2005]. При активации фермента NOX4 фрагментами вкДНК обнаруживается увеличение фосфорилированной формы гистонов H2A, которая используется для оценки уровня двунитевых разрывов ДНК ядер клеток [Kostyuk et al., 2013]. Таким образом, с одной стороны, вкДНК вызывает активацию АФК [Ermakov et al., 2013; Kosyuk et al., 2013; Loseva et al., 2012; Glebova et al., 2013]. Свободные радикалы приводят к перекисному окислению липидов, окислительному повреждению ДНК и белков и связаны со множеством хронических патологических осложнений, таких как рак, атеросклероз, нейродегенеративные расстройства и старение [Menon et al., 2007]. Однако, вкДНК стимулирует развитие адаптивного ответа у культивируемых клеток in vitro, иниццируя репарацию разрывов ДНК, антиокислительный ответ клеток, экспрессию генов выживания клеток [Kosyuk et 92 al., 2013; Loseva et al., 2012]. ВкДНК является примером противоречия доводу о патологической роли окислительного стресса. Рисунок 1.21. Роль производимых NOX4 активных форм кислорода в повреждении ДНК ядер клеток индуцированном фрагментами внеклеточной ДНК. ВкДНК индуцирует синтез АФК посредством активации NOX4 НАДФН. Поскольку фермент NOX4 локализован, в том числе, и вблизи мембраны ядра, он продуцирует АФК в перинуклеарной области. Эти АФК преодолевают ядерную мембрану и взаимодействуют с ДНК, создавая окислительные кластерные повреждения ДНК, в том числе, образование 8 - оксигуанозина ((8-oxo-dG), что способствует образованию одно - и двунитевых разрывов ДНК. NOX4 считают посредником генотоксического воздействия благодаря ее АФК - производящей активности. Повреждения ДНК ядер активируют репарационную систему клеток, приостанавливая клеточный цикл и активируют гены сигнальных путей, направленных на выживание клеток [по статьям Weyemi et al., 2012; Kosyuk et al., 2013; Glebova et al., 2013]. 1.8. Внеклеточная ДНК принимает участие в регуляции клеточного цикла При повреждении ДНК, вызванном действием фрагментов вкДНК, необходимо, чтобы повреждение было репарировано до начала удвоения хромосом в митозе [Su, 2006]. Если повреждение ДНК не репарировано – клетка активирует контрольную точку повреждения ДНК, при этом клетка перестает делиться – происходит остановка («арест») 93 клеточного цикла, активация систем репарации; при наличии нерепарируемых повреждений активируется механизм апоптоза [Goodarzi and Jeggo, 2013]. Система регуляции клеточного цикла синхронизирует и контролирует упорядоченную последовательность биохимических переключений при удвоении ДНК и разделение удвоенного материала [Abdelalim, 2013]. Клеточный цикл включает несколько фаз: удвоение клеточного содержимого и подготовка к репликации осуществляется в фазе G1, постмитотическое состояние клетки - фаза G0, удвоение ДНК происходит в фазе S, подготовка к митозу происходит в фазе G2, деление клетки осуществляется в фазе М (от «mitosis», эта фаза состоит из деления ядра – митоз и деления цитоплазмы – цитокинез); фазы G1, S и G2 объединяются в интерфазу [Nasmyth, 1996; Abdelalim, 2013]. При условиях, неблагоприятствующих клеточному делению, клетка может замедлить прохождение фазы G1 или войти в фазу G0 на длительное время до возобновления пролиферации [Foijer and Te Riele, 2006; Schnerch at al., 2012]. В конце фазы G1 находится точка коммитирования, известная у млекопитающих как точка рестрикции R1 (рисунок 1.22) – прохождение точки R1 коммитирует клетки к репликации ДНК даже при отсутствии внешних дополнительных сигналов к делению клеток [Schnerch at al., 2012; Nieto-Sampedro at al., 2011; Sherr et al., 2004]. Рисунок. 1.22. Схема точек контроля и фаз клеточного цикла. Клеточный цикл проходит определенную последовательность событий, которая обеспечивает полную и точную репликацию генома в дочерних клетках. Для контроля клеточного цикла на различных его стадиях находятся контрольные точки. Повреждение ДНК активирует не менее 3 контрольных точек клеточного цикла, приводя к остановке или аресту клеточного цикла: в G1/S –фазе (G1-арест), в S фазе и G2/M – фазе (G2-арест). G2арест провоцируется помехами синтеза и репликации ДНК и длится до тех пор, пока репликация ДНК не будет завершена [по статьям Schnerch at al., 2012; Nieto-Sampedro at al., 2011; Grady et al., 2008]. Показаны киназы, участвующие в регуляции клеточного цикла, которые сами имеют сложную систему регуляции [по материалам статей Fisher et al., 2012; Zhong et al., 2012]. 94 Второй точкой, контролирующей переход клеток к митозу, является точка G2/M (рисунок 1.22) [Schnerch at al., 2012; Nieto-Sampedro at al., 2011]. Выход из митоза контролируется в точке М – точке метафазно-анафазного перехода (рисунок 1.22) [Schnerch at al., 2012; Foijer and Te Riele, 2006]. Наличие повреждения ДНК могут провоцировать G1 - арест клеточного цикла, контролируемый белком семейства ретинобластомы pRb, что обеспечивает время для репарации повреждений, после чего прогрессия клеточного цикла может возобновиться. [Foijer and Te Riele, 2006; Schnerch at al., 2012; Nieto-Sampedro at al., 2011; Goodarzi and Jeggo, 2013]. В контрольных точках пересекаются бихимические сигнальные пути, информирующие клетку о необходимости деления, остановки клеточного цикла, о переходе клетки в фазу G0. [Foijer and Te Riele, 2006]. Регулирующие элементы могут остановить деление в любой контрольной точке: R1, G2/M и М [Grady et al., 2008]. Регуляторных белков, регулирующих точность репликации ДНК во время клеточного цикла, временные рамки всех событий клеточного цикла, последовательность событий, завершение инициированных событий, насчитывается более 100 [Grady et al., 2008; Jallepalli et al., 2001; Sato et al., 2001]. К элементам регуляции клеточного цикла относятся белки семейства циклинзависимых киназ (Сdk); циклинов; ингибиторов циклинзависимых киназ (Сdk1), например, белков – производных локуса Ink4 (p15, p16, p18, p19) и белков семейства Cih/Kip: p21Cip1, p27Kip1, p57Kip2; негативных регуляторов пролиферации (белков семейства pRb и р53); убиквитиновых лигаз SCF и APS, участвующих в периодической инактивации белков клеточного цикла [Ewen et al., 2004; Yang et al., 2006; Giacinti and Giordano, 2006]. При инициировании клеточного цикла митогенами активируется синтез циклина D1, белок циклин D1 кодируется геном CCND1 [Velasco-Velбzquez et al., 2011; Betticher et al., 1995; Solomon et al., 2003; Lu et al., 2001; Paronetto et al., 2010]. Циклин D1 запускает фазу G1 клеточного цикла, отменяет ингибирующее пролиферацию действие белков семейства pRb, освобождая транскрипционные факторы E2F из комплекса pRb-E2F [Velasco-Velбzquez et al., 2011; Bieche et al., 2002; Albanese et al., 2003]. Белки E2F способствуют синтезу циклинов Е и А – инициаторов репликации ДНК и митоза [Yu et al., 2010; Li et al., 2006; Fu et al., 2004]. Циклины образуются и разрушаются в течение клеточного цикла, от циклинов зависит активность эффекторных элементов клеточного цикла - циклинзависимых киназ [Schnerch at al., 2012; Nieto-Sampedro at al., 2011; Grady et al., 2008]. 95 Сdk (Cyclin-dependent kinases) фосфорилируют ряд регуляторных белков, в том числе – белки семейства pRb [Giacinti and Giordano, 2006]. Уровень Сdk в клеточном цикле остается неизменным, изменяется их активность [Schnerch et al., 2012]. Комплекс циклина D1 с Cdk4 и Cdk6 регулирует раннюю фазу G1 [Schnerch et al., 2012]. Циклин ECdk2 регулирует инициацию S-фазы [Reed, 2006]. Циклин А вместе с Cdk1 и Cdk2 отвечают за продолжение S-фазы и за переход клетки в митоз, циклины В типа образуют комплекс с Cdk1 и регулирует переход клеток в митоз [Reed, 2006]. Белки семейства Cip/Kip связываются с циклинами D- , А- и Е-типа и ингибируют их активность [van den Heuvel, 2005]. Члены семейства белков INC4 связываются с Cdk4/Cdk6 и разрушают ассоциацию между циклином D и Cdk4/Cdk6 [Abdelalim et al., 2013]. Киназы, участвующие в регуляции клеточного цикла, сами имеют сложную систему регуляции [Fisher et al., 2012]. В регуляции активности Cdk важную роль играют Cak (CDK-activating kinase), [Fisher et al., 2012; Zhong et al., 2012]. Активность комплексов Сdk-циклины регулируется связыванием с СdkI (Cyclin-dependent kinase inhibitor) [van den Heuvel, 2005].. Mежду разными СdkI существуют функциональные различия, так, СdkIp27Kip1 ингибирует G1/S-Сdk и S- Сdk, СdkI семейства Inc4 ингибируют киназы фазы G1 – комплекс циклин D - Сdk4/6, СdkIp21Сip1 ингибирует киназы G1/S-Сdk при повреждении ДНК [van den Heuvel, 2005]. СdkI семейства Cip/Kip взаимодействуют с киназами и циклинами, СdkI семейства Ink4 – только с киназами Сdk4/6 [Abdelalim et al., 2013]. В поздней G1 фазе существует механизм инактивации СdkI: СdkI фосфорилируются Сdk с последующей деградацией в протеасомах [Abdelalim et al., 2013]. Циклины контролируют прохождение точек рестрикции клеточного цикла [Hija et al., 2013; Aleem E et al., 2005]. И G1, и G2 – переход зависит от накопления ингибитора Сdk – p27kip1 [Zhong E et al., 2005]. При дефиците факторов роста в среде культивирования нормальных клеток, разрушение циклина D1 и ингибирование циклина Е при накоплении p27kip1 приводит к гипофосфорилированию рRB, снижению активности E2F и G1-аресту [Zhong E et al., 2005]. В клетках, утративших активность регуляторных элементов точки R1, вступает в игру точка рестрикции R2 [Foijer et al., 2006]. Повышение уровня p21Cip1 и p27kip1 обеспечивает достаточную активность Cdk2, позволяющую клеткам пересечь G1/S границу т завершить S –фазу клеточного цикла [Foijer et al., 2006]. Ингибирование активности циклин A- и B киназ приводит к G2 – аресту клеточного цикла, вероятно, точка рестрикции R2 является резервным механизмом предотвращения неограниченной пролиферации клеток, которые потеряли надлежащую G1/S – регуляцию [Foijer et al., 2006]. Считается, что G2-арест является важным механизмом контроля опухолевого роста [Foijer et al., 2006; Muller et al., 2006]. 96 Дизрегуляция контроля клеточного цикла способствует усилению пролиферации и геномной нестабильности, что является предпосылкой для создания селективных преимуществ частности клонов с пвышенной адаптацией к изменениям микросреды [Schnerch at al., 2012]. Внеклеточная ДНК вызывает в клетках in vitro окислительный стресс, приводящий к разрывам ДНК ядер клеток [Kostyuk et al., 2013; Glebova et al., 2013; Shackelford et al., 2000]. Повреждения ДНК вызывают остановку клеточного цикла в фазе G1/S, S и G2 [Kostyuk et al., 2013]. В регуляции клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК ядер могут участвовать регуляторные киназы семейства PIKK – Atm и Atr, которые играют критическую роль в передаче сигналов контрольной точке повреждения ДНК [Schnerch at al., 2012]. Киназа Atm инициирует ответ на различные повреждения ДНК (двунитевые разрывы ДНК, повреждение нуклеотидов, замедленная вилка репликации), а Atr опосредует ответ специфически – только на наличие двунитевых разрывов ДНК [Segurado and Tercero, 2009; Tanaka, 2010]. Atm и Atr могут вовлекают в ответ на повреждение ДНК супрессоры опухолевого роста – p53 и pRb, опосредующие остановку клеточного цикла, активирующие апоптоз [Schnerch at al., 2012]. Показано, однако, что вкДНК, вызывая остановку клеточного цикла, одноременно блокирует апоптоз, активирует системы репарации повреждений ДНК и инициирует сигнальные пути, направленные на выживание клеток [Костюк с соавт., 2012; Malinovskaya et al., 2010; Kostyuk et al., 2013]. 1.9. Транскрипционные факторы и сигнальные пути, активирующиеся в клетках при действии внеклеточной ДНК Внеклеточная ДНК воздействует на широкий диапазон молекулярных мишеней или взаимодействуя с ними физически, или модулируя транскрипционные факторы, активность ферментов, или экспрессию генов [Костюк с соавт., 2012; Loseva et al., 2010; Kostjuk et al., 2012; Malinovskaya et al., 2010; Kostyuk et al., 2013]. Мишенью вкДНК являются многочисленные сигнальные пути, вкДНК модулирует и регулирует экспрессию генов транскрипционных факторов NF-kB, STAT3, NRF2 и PPARG, регуляторов сигнальных путей и эффекторов [Костюк с соавт., 2012; Loseva et al., 2010; Kostjuk et al., 2012; Kostyuk et al., 2013]. ВкДНК регулирует экспрессию генов про- и противовоспалительных цитокинов (например, TNF, IL-6, IL-10), факторов роста (например, VEGF), ферментов (например, MAPK, каспазы 3), молекул адгезии (например, ICAM-1, VCAM-1, E-селектина), белков, связанных с апоптозом (например, белков семейства Bcl) и белков клеточного цикла (например, циклина D1) [Костюк с соавт., 2012; Loseva et al., 2010; Kostjuk et al., 2012; Kostyuk et al., 2013]. Поскольку вкДНК способна 97 влиять на множество целей и сигнальных путей, есть потенциал для использования вкДНК как мишени воздействия при различных заболеваниях, включая раковые заболевания, артрит, аллергии, атеросклероз, старение, нейродегенеративные заболевания, и аутоиммунные болезни. Транскрипционные факторы - белки, которые связываются с определенной промотреной или энхансерной областью ДНК и регулируют экспрессию различных генов, некоторые транскрипционные факторы – важные цели для терапевтического воздействия при нескольких типах заболеваний [Aggarwal et al., 2006]. ВкДНК влияет на экспрессию генов тренскрипционных фактроов NF-kB, STAT3, Nrf2, PPARG [Loseva et al., 2010; Kostjuk et al., 2012; Kostyuk et al., 2013]. Кроме того, показана транслокация транскрипционных фактров NF-kB, STAT3, Nrf2 в ядро клеток и активация геновмишеней этиф факторов [Loseva et al., 2010; Kostjuk et al., 2012; Kostyuk et al., 2013]. Эти транскрипционные факторы управляют экспрессией многих генов, вовлеченных в пролиферацию, выживание, миграцию клеток в ангиогенез и воспаление [Shishodia et al., 2013]. Воспаление и окислительный стресс - два главных компонента, вовлеченные в реакцию клеток и тканей на присутствие вкДНК [Loseva et al., 2010; Kostjuk et al., 2012]. Важную роль в этой реакции играют сигнальные пути, инициируемы при активации ядерного транскрипционного фактора NF-kB, координирующего экспрессию провоспалительных генов и ядерного фактора Nrf2, ответственного за индуцибельную и конститутивную экспрессию ARE (antioxidant response element) - регулируемых генов [Loseva et al., 2010; Kostjuk et al., 2012; Kostyuk et al., 2013]. Таким образом, вкДНК может регулировать антиокислительные и противовоспалительные ответы клеток [Kostyuk et al., 2013]. Окислительный стресс, инициируемый внеклеточной ДНК, через синтез АФК, которые изменяют окислительно-восстановительный баланс клеток и через механизмы, чувствительные к окислению, участвует в регуляции экспрессии и активности транскрипционных факторов и их генов - мишеней [Massy et al., 2009]. АФК активируют транскрипционный фактор NF-kB, что приводит к повышению экспрессии генов провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли альфа (TNF-a), интерлeйкин (IL) 1, 2, 6, 12 и молекул адгезии. Цитокины могут инициировать синтез АФК, что образует замкнутый порочный круг между окислительным стрессом и продукцией провоспалительных цитокинов [Pedruzzi et al., 2012; Kim et al., 2010]. Инактивация этого порочного цикла может происходить с участием Nrf2, освобожденного от комплекса с его ингибитором Keap1 [Kim and Vaziri, 2010]. Активированный 98 свободный Nrf2 транслоцируется в ядро и активизирует гены, которые кодируют ферменты детоксикации фазы II и антиокислительные ферменты, которые включают хинон NADPH оксидоредуктазу1 (NQO1), S-глутатнонтрансферазу (GST), гемоксигеназу1 (HO-1), глутатнонпероксидазу (GSH-Px), глутаматцистеин лигазу (GCL) и пероксиредуксин I (PRX I), которые играют важную роль в защите клеток, способствуя удалению АФК [Kim et al., 2010; Singh et al., 2010]. Cистема Nrf2-Keap1 является защитным механизмом клеток от окислительного стресса [Pedruzzi et al., 2012]. Кроме того, Nrf2 ингибирует экспрессию провоспалительных цитокинов, хемокинов, молекул адгезии, матричных металлопротеиназ (MMP-9), циклоксигеназы-2 и iNOS регуляцией противовоспалительных ферментов, таких как геммоксигеназа-1 [Kim et al., 2010]. Nrf2 модулирует каскад противовоспалительных цитокинов с помощью ингибирования NF-kB и регулирует антиокислительные клеточные ответы [Pedruzzi et al., 2012; Kim et al., 2010]. 1.9.1. Внеклеточная ДНК вызывает активацию транскрипционного фактора NF-kB Фрагменты вкДНК активируют внутриклеточные ркцепторы TLR9, индуцируют активацию TLR9 - и NF-kB - сигнальных путей (рисунок 1.23) [Kawai and Akira, 2008; Kostjuk et al., 2012]. Рисунок 1.23. Схематичное изображение активации TLR9 - и NF-kB сигнальных путей фрагментами внеклеточной ДНК [по статье [ Kawai and Akira, 2008]. 99 Передача сигнала через TLR осуществляется посредством ряда процессов, главный из которых – обратимая ковалентная модификация путем фосфорилирования и убиквитинирования [Kawai and Akira, 2008; Yamamoto and Takeda, 2010]. Для всех TLR сигнальный путь начинается с IRAK и белков семейства TRAF, далее сигнал передается на киназы промежуточного уровня, такие как ТAK-1 и TBK-1/IKKi, что приводит к активации сигнальных путей через МAР-киназы (JNK, р38 и ERK), IRF (а именно, IRF-3, IRF-5, и IRF-7) и NF-kB (рисунок 1.23) [Kawai and Akira, 2008]. Транслокация NF-kB в ядро является центральным событием активации TLR9 - и NF-kB сигнальных путей, в результате NF-kB взаимодействует со специфическими последовательностями в регуляторных участках генов и активирует транскрипцию определенных групп генов, в частности, цитокинов (TNF-a , IL-1 и др.) [Yamamoto and Takeda, 2010; Kostjuk et al., 2012]. Транскрипционнй фактор NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) состоит из гомо - и гетеродимеров пяти белков: p65 (RelA), RelB, c-Rel, NF-kB1 (p50 и его рецептора p105), и NF-kB2 (p52 и его рецептора p100) [Pedruzzi et al., 2012; Kim et al., 2010]. Все белки NF-kB в своей структуре содержат гомологичный домен Rel, ответственный за димеризацию и связывание с последовательностью ДНК GGGRNNYYCC, (где R - пурины, N - любые основания, Y - пиримидины) [Wakabayashi et al., 2010]. Семейство белков NF-kB может быть разделено на две группы, основанные на присутствии трансактивационного домена: RelA (p65), RelB, и c-Rel содержат домен трансактивации, тогда как p50 и p52 не содержат и требуют гетеромеризации с белками Rel для активации транскрипции [Wakabayashi et al., 2010]. В отсутствие стимулов NF-kB расположен в цитоплазме в виде неактивного комплекса с ингибирующими белками IkB (IkBa, IkBb, IkBg, IkB3), которые могут закрывать область NF-kB, связывающую ДНК, предотвращая транскрипцию [Gloire and Piette, 2009; Salminen et al., 2008]. В ответ на стимуляцию вкДНК, вкРНК, цитокинами, митогенпми, факторами роста, продуктами окислительного стресса, белки IkB быстро фосфорилируются киназой IkB (IKK) по специфическим остаткам серина, убиквитинируются и, в конечном счете, деградируются протеасомой 26S, фактор NF-kB освобождается и перемещается в ядро (рисунок 1.23) [Gloire and Piette, 2009; Salminen et al., 2008; Pedruzzi et al., 2012; Kostjuk et al., 2012; Baud and Jacque, 2008]. Освобождение NF-kB и последующая его транслокация в ядро активирует экспрессию более 200 генов, которые вовлечены в регуляцию врожденного и адаптивного иммунитета, воспаления и выживание клеток, трансформацию и пролиферацию клеток, антиапоптоз, ангиогененез, инвазию и метастазирование [Salminen et al., 2008; Baud and Jacque, 2008]. Дизрегуляция 100 активности NF-kB происходит при многих заболеваниях, особенно раке, хронических и острых воспалительных заболеваниях [Massy et al., 2009; Pedruzzi et al., 2012; Kim et al., 2010; Kim and Vaziri, 2010; Singh et al., 2010; Salminen et al., 2008; Baud and Jacque, 2008]. 1.9.2. Внеклеточная ДНК вызывает активацию ядерного фактора NRF2 Nrf2 в нормальной клетке существует в инактивированном состоянии в результате связывания с белком цитоскелета Keap1 [Hayes and McMahon, 2006; Kensler and Wakabayashi, 2010]. Окислительный стресс стимулирует транслокацию Nrf2 в ядро, связывание с ARE или EpRE (antioxidant response elements или electrophile response elements: 50-NTGAG=CNNNGC-30) генов, кодирующих ферменты детоксикации и цитопротекторные белки, включая гемоксигеназу-1 (HO-1), NADPH хинон оксидоредуктазу-1 (NQO1) и глутатион [Lau et al., 2008; DeNicola, 2011; Zheng et al., 2011; Pickering et al., 2012]. Nrf2 - белок, содержащий 605 аминокислот, экспрессируется в широком диапазоне тканей и типов клеток, относится к семейству транскрипционных факторов, имеющих структурную область CNC (Cap-N-Collar) и область bZIP (basic zipper) [Kansanen et al., 2011; Kensler and Wakabayashi, 2010]. Молекулярная структура Nrf2 состоит из 6 консервативных доменов – Neh 1-6 (Nrf2-ECH homology) [Turpaev, 2013; Kansanen et al., 2011]. Через домен Neh 1 происходит образование гетеродимеров с малыми MAF (musculoaponeurotic fibrosarcoma) [Hayes et al., 2013]. Домен Neh 2 был идентифицирован как отрицательный регулятор Nrf2 – это область взаимодействия с Keap1 [Kansanen et al., 2011; Kensler and Wakabayashi, 2010]. Neh 3 действует как ко-активатор, способствующий транскрипции ARE (antioxidant response elements) [Hayes et al., 2013; Kansanen et al., 2011]. Neh 4 и Neh 5, и индивидуально, и кооперативно связываются с ацетилтрансферазой CREB (cAMP Responsive Element Binding protein), что приводит к деконденсации хроматина и вовлечению в сигнальный каскад следующих транскрипционных факторов [Hayes et al., 2013]. Домен Neh6 также контролирует отрицательную регуляцию Nrf2 и необходим для независимой от репрессора деградации Nrf2 [Kansanen et al., 2011]. Keap1 имеет три главных домена: домен димеризации BTB (BTB dimerization domain, Broad-Complex, Tramtrack, и Bric à brac), богатый цистеином домен IVR (Intervening region), ответственный за репрессию Nrf2, и область Kelch, состоящую из 6 повторов Kelch, через которые Keap1 связывается с Nrf2 [Kansanen et al., 2011]. Keap1 связывается с N-концевой областью субъединицы E3 лигазного комплекса, который представляет собой субстрат для протеасомы, и промотирует убиквитинирование Nrf2. Keap1 функционирует как белок-адаптер между Nrf2 и лигазным комплексом, и эта связь способствуют непрерывной деградации Nrf2 протеасомой в нормальных условиях 101 (рисунок 2.24) [Turpaev, 2013; Kansanen et al., 2011]. Окислительная или ковалентная модификация тиолов в некоторых остатках цистеина приводит к диссоциации Nrf2 из комплекса Nrf2-Keap1 и его транслокации в ядро, что приводит к его связыванию с регуляторными последовательностями ARE или EpRE, расположенными в промотерной области генов, кодирующих антиоксиданты и ферменты 2 фазы детоксикации (рисунок 2.24) [Turpaev, 2013; Kansanen et al., 2011]. Рисунок 2.24 В норме Nrf2 изолирован в цитоплазме в связанном состоянии с белком гена-репрессора Nrf2, Keap1. Keap1 функционирует как адаптер между Nrf2 и лигазным комплексом, и этим закреплением способствуют длительной деградации Nrf2. В ответ на окислительный стресс после гетеродимеризации с MAF, Nrf2 перемещается в ядро, где связывается с ARE (antioxidant response elements) генов-мишеней. Важная роль Nrf2 в уменьшении воспаления связана с его способностью быть антагонистом NF-kB [по статье Pedruzzi et al., 2012]. Эффекты, связанные с активацией генов-мишенй в Nrf2-сигнальном пути: (а) прямой антиоксидантный ответ; (б) кодируются ферменты, которые непосредственно инактивируют оксиданты; (в) повышается уровень синтеза и регенерации глутатиона; (г) стимулируется синтез NADPH; (д) повышается экспорт токсина, (е) усиливается узнавание, репарация и удаление поврежденных белков; (г) повышается уровень репарации нуклеотидов; (д) регулируется экспрессия других факторов транскрипции, факторов роста и их рецепторов, и молекулярных шаперонов, и (я) ингибируется цитокинопосредованное воспаление [Kensler and Wakabayashi, 2010; Lau, et al., 2008; Pedruzzi et al., 2012]. Для взаимодействия с ДНК фактору Nrf2 необходимо образовать гетеродимеры с другими транскрипционными факторами, обладающими доменом bzip, такими как белки 102 семейства малых Maf (MafF, К и G), ATF4 и c-Jun в ядре (Рисунок 2.24) [Pedruzzi et al., 2012; Kansanen et al., 2011]. Ядерная транслокация Nrf2 может также произойти после фосфорилирования некоторых остатков треонина или серина Nrf2 киназами, такими как протеинкиназа C, митоген-активированные протеинкиназы (МАРК), PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase)/Akt, и казеинкиназа 2 [Kensler and Wakabayashi, 2010; Lau, et al., 2008; Pedruzzi et al., 2012]. Активация KEAP1-NRF2 – сигнального пути является адаптивным ответом клеток на эндогенный и экзогенный окислительный стресс и приводит к резистентности против повреждающих и токсических воздействий [Wakabayashi et al., 2010]. KEAP1-NRF2сигнальный путь регулирует сеть цитопротективных генов в большинстве случаев благодаря прямому закреплению тренскрипционного фактора на ARE-областях (antioxidant response elements) промотеров генов-мишеней [Kensler and Wakabayashi, 2010; Lau, et al., 2008]. Однако некоторые защитные эффекты могут проявляться благодаря пересечению NRF2- KEAP1- сигнального пути с другими (NF-kB, p53, Notch1, AhR) сигнальными путями. Эти взаимодействия обеспечивают многоярусный, интегрированный ответ на повреждающие факторы [Wakabayashi et al., 2010]. 1.9.3. Взаимодействие между NRF2 - и NF-kB - сигнальными путями Взаимодействия между различными сигнальными путями могут происходить в разных формах. Процессы пострансляционной модификации, такие как фосфорилирование, играют важную роль в регуляции экспрессии и функции гена [Surh et al., 2008]. Эти ковалентные модификации контролируют внутриклеточное распределение, транскрипционную активность и стабильность транскрипционных факторов, включая NRF2 [Surh et al., 2008]. Некоторые транскрипционные факторы могут быть антагонистами NRF2, или конкурируя за связыание с ARE, или ингибируя NRF2 через физическую ассоциацию [Nguyen et al., 2000]. Белки семейсва малых MAF, BACH1, cFOS и FRA1 могут конкурировать с NRF2 за связывание с ARE [Nguyen et al., 2000]. Кроме того, некоторые транскрипционные факторы, включая ATF3 (activating transcription factor 3), PPARγ (proliferator-activated receptor gamma), RAR (retinoic acid receptor) формируют ингибирующие комплексы с NRF2 [Wang et al., 2007; Zhou et al., 2007; Ansell et al., 2005; Brown et al., 2008]. NRF2 - и NF-kB - сигнальные пути имеют несколько точек пересечения, регулируя транскрипцию и функционирование генов - мишеней. Существует много примеров взаимной активации и репрессии между членами этих сигнальных путей. Вещества, активирующие NRF2 - сигнальный путь часто являются ингибиторами NF-kB – сигнального пути на разных его уровнях. Так, сульфораны снижает связывании NF-kB с 103 ДНК и уменьшает продукцию NO, PGE2, и TNF-a в макрофагах, не затрагивая IkB или ядерной транслокации NF-kB [Heiss et al., 2008]. 3H-1,2-Dithiole-3-thione уменьшает транслокацию в ядро, связывание NF-kB с ДНК и фосфорилирование IkB в ЛПС активированных гепатоцитах [Karuri et al., 2008]. Куркумин (сurcumin) ингибирует NF-kB, блокируя фосфорилирование и деградацию IkB в стимулированных ЛПС макрофагах [Pan et al., 2000]. NRF2 и NF-kB могут взаимодействовать, оказывая прямое влияние на экспрессию генов. NRF2 и NF-kB опосредуют активацию IkB и ARE – сайтов, соответственно, через антагонизм связывания фактора транскрипции с ДНК [Liu et al., 2008]. NF-kB может супрессировать транскрипцию NRF2 - зависимых генов, уменьшая доступные уровни коактиватора и промотируя вовлечение ко-репрессора [Liu et al., 2008]. Факторы p65 и Nrf2 вместе связываются с областью CH1-KIX CREB-связывающего белка (CBP, CREB-binding protein), и после фосфорилирования p65 по Ser276, NF-kB способен супрессировать ARE связанные гены, предотвращая связывание CBP с Nrf2 [Liu et al., 2008]. Еще один механизм трансрипционной репрессии р65 ARE связан с гистон деацетилазой 3 (HDAC3, histone deacetylase 3). Сверхэкспрессированный p65 связывает HDAC3 с ARE, а затем – с CBP или MafK в области димеризации NRF2, что предотвращает активацию Nrf2 [Liu et al., 2008]. Гены-мишени сигнальных путей, инциированных транскрипционными факторами NRF2 и NF-kB могут также взаимодействовать как с молекулами сигнального пути, так и между собой, регулируя активность NRF2 - и NF-kB - сигнальных путей. Индукция HO-1 в результате активации NRF2 – сигнального пути предотвращает фосфорилирование RelA и ингибирует деградацию IkB [Seldon et al., 2007]. Петля обратной связи образуется между HO-1 и iNOS в макрофагах, защищая клетку от действия избытка NO [Seldon et al., 2007]. COX-2, активируемый в NRF-2 сигнальном пути, ингибирует активность фосфатидилинозитол-3-киназы, что уменьшает транскрипцию генов NRF2, NQO1, HO-1, GCLR, и GSTM1 хондроцитов человека [Itoh et al., 2007]. Возможно также повышение уровня NRF2 благодаря прямому транскрипционному действию NF-kB. В промотере гена NRF2 крысы обнаружены сайты связывания NF-kB [Nair et al., 2005]. Связывание NF-kB с промотером гена NRF2 носит характер петли обратной связи – при длительной активности NF-kB усиливается транскрипционная активность NRF2, супрессируя активность NF-kB. Однако абсолютно антагонистический эффект двух факторов во всех ситуациях маловероятен, показано, что такие мультифакториальные стимулы, как АФК, ЛПС, окисленные липопротеины низкой плотности могут вызывать одновременную активацию 104 и NRF2, и NF-kB [Wakabayashi et al., 2010]. И у NRF2, и у NF-kB есть множество целевых генов, регулируемых через действие обоих транскрипционных факторов в области ARE и kB сайтов [Wakabayashi et al., 2010]. Экспрессия цитокина IL-8 может быть увеличена и NRF2, и NF-kB: NF-kB активирует транскрипцию IL-8, связываясь с сайтом kB (82), тогда как NRF2 использует механизм, который стабилизирует IL-8 mRNA [Zhang et al., 2005]. Взаимодействия между молекулами NRF2 и NF-kB – сигнальных путей также модулируют активность других транскрипционных факторов, что добавляет сложности к взаимной регуляции двух сигнальных путей. Показано взаимодействие между NF-kB - и STAT3 – сигнальными путями [Fan et al., 2013]. Интерлейкин 6, секреция которого индуцируется при активации NF-kB – сигнального пути, активирует STAT3 – сигнальный путь и транслокацию транскрипционного фактора STAT3 в ядро [Fan et al., 2013]. Описаны сложные взаимодействия между NRF2 – сигнальным путем и многофункциональным транскрипционным фактором PPARg, принимающем участие в антиокислительном стрессе [Reuter et al., 2010]. Механизмы, лежащие в основе взаимодействия сигнальных путей, нуждаются в дальнейшем исследовании. 1.10. Заключение по данным литературы. Анализ литературы показал важность молекулы внеклеточной ДНК не только как маркера при различных патологиях, но и роль вкДНК в регуляции клеточных функций. Дальнейшее исследование свойств внеклеточной ДНК важно как для разработки точных, быстрых, неинвазивных методов ранней диагностики состояний, сопровждающихся гибелью клеток, так и для понимания процессов в организме, происходящих при накоплении фрагментов вкДНК. Внеклеточная ДНК является биологически активной молекулой. Поиск характеристик, определяющих ее биологическую активность важен для четкого представления о процессах, индуцируемых вкДНК в разных типах клеток. Внеклеточная ДНК активирует в разных клетках большое количество сигнальных путей, исследование механизма действия вкДНК на клетки разных тканей, имеющих разный пролиферативный потенциал, позволит открыть новые возможности для оптимизации терапевтических мер при хронической патологии. Исследование процесса взаимодействия вкДНК с эндотелиальными клетками поможет по-новому взглянуть на причины формирования и течения многих сосудистых заболеваний. Мезенхимные стволовые клетки, попадая в очаг повреждения, контактируют с вкДНК, особенно это актуально при взаимодействия трансплантации вкДНК с МСК МСК «прекондиционированию» МСК. при позволит Ответ различных патологиях. исследование сформировать раковых клеток на новые подходы фрагменты к вкДНК, 105 образующиеся при массовой гибели клеток опухоли, может препятствовать эффективному лечению. Полученные в ходе выполнения работы знания могут позволить сформировать новые схемы для проведения радиотерапии в онкологии: блокирование адаптивного ответа может снизить дозу радиации. 106 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Анализируемая выборка Сбор образцов плазмы крови пациентов с аутоиммунными, сердечно-сосудистыми, онкологическими заболеваниями; лиц, контактировавших с источниками ионизирующего излучения; здоровых доноров и беременных женщин осуществлялся сотрудниками ФБГУ "НИИР им. В. А. Насоновой" РАМН (г. Москва), ФГБУ”РОНЦ им. Блохина” РАМН (г. Москва), кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (г. Москва), ФГБУ НЦН РАМН (г. Москва), ФБГУ ЦКБ РАН (г.Москва), ФГУП ГНЦ РФ ФЭИ (г. Обнинск) и РФЯЦ-ВНИИЭФ (г. Саров) с соблюдением этических норм, от всех пациентов получено добровольное информированное согласие. В исследуемую выборку (1349 человек) были включены следующие группы больных: (1) больные сосудистыми заболеваниями (N=314): атеросклероз мозговых артерий (АС), артериальная гипертензия (АГ) и острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК); (2) – выборка больных с аутоиммунной патологией (N=138): ревматоидный артрит (РА) и системная красная волчанка (СКВ); (3) – выборка больных с сердечно – сосудистыми заболеваниями (N=73): острый инфаркт миокарда и ишемическая болезнь сердца; (4) – беременные женщины с нормально протекающей беременностью (N=103); (5) -выборка лиц, работавших c источниками ионизирующего излучения (N=331) гамма-нейтронного, тритиевого и рентгеновского. Выборка была подразделена на подгруппы согласно остроте, тяжести протекающего процесса, наличию сопутствующей патологии и возрасту. Выборка здоровых доноров (ЗД) включала 390 человек, не имеющих в анамнезе хронических патологий, для каждой группы больных был подобран соответствующий контроль из выборки здоровых доноров (по полу, возрасту и другим показателям). 2.2. Выделение внеклеточной ДНК Выделение внеклеточной ДНК осуществляли с помощью метода фенол хлороформной экстракции, основанном на оригинальной методике [Chomczynski and Sacchi, 1987]. Объем проб - 0,5 мл плазмы периферической крови, добавляли 0,1 мл лизирующего буфера (10% лаурилсаркозилат натрия, 0,1 моль/л ЭДТА) и РНКазу А (75 мкг/мл), инкубировали при 37°С 1 час, гидролизовали протеиназой К (200мкг/мл, 37°С, 24 часа) [Костюк с соавт., 2012]. После экстракции насыщенным фенолом (2 раза) ДНК осаждали 0,8 объемами изопропанола с ацетатом аммония (2 моль/л) и помещали на 20°С. ДНК осаждали центрифугированием, промывали 75% водным этанолом и растворяли в 30 мкл воды [Костюк с соавт., 2012]. 107 2.3. Определение концентрации и размеров фрагментов ДНК вкДНК Концентрацию выделенной вкДНК определяли флуориметрически на люминесцентном спектрометре «LS 55» («PerkinElmer», Англия) c использованием ДНКсвязывающегося красителя RiboGreen («Molecular Probes Europe BV», Нидерланды) или Hoechst 33258 (λвозб=350 нм, λфлу=450 нм) [Wang and Laughton, 2007]. Буфер для красителя – 0,05 моль/л трис-НСl, pH 7,4, 0,5 моль/л NaCl, 1ммоль/л ЭДТА. Фоновые значения – уровень флуоресценции ДНК после исчерпывающего гидролиза ДНКазой 1 [Вейко с соавт., 2006]. Размер фрагментов ДНК определяли с использованием бромистого этидия, метод электрофореза в 1% агарозном геле [Atamaniuk et al., 2006]. 2.4. Определение содержания повторяющихся последовательностей генома в составе вкДНК Содержание повторяющихся последовательностей генома определяли с использованием метода количественной дот-гибридизации на мембранах с использование биотинированных зондов [Вейко и соавт., 2003]. К 10 мкл образца вкДНК добавляли раствор NaOH (1,5 мкл 1 моль/л) на 10 мин, затем нейтрализовали раствора ацетата аммония (8,5 мкл 4 моль/л). Фильтр (Hybond ExtraC, «Amerscham») смачивали буфером (0,15 моль/л цитрата натрия, рН 7, 1,5 моль/л NaCl), наносили на фильтр 1,5 мкл образца вкДНК, иммобилизовали ДНК (1,5 ч при 80°С), смачивали в растворе 2×SSC. Предгибридизацию проводили в течение 1 часа при 42°С в 2,5-ти кратном растворе Денхарда: 2,5 нг/мл BSA; 2,5 нг/мл фикол; 2,5 нг/мл ПВП; 0,05 моль/л фосфат натрия, рН 7,4; 0,65 моль/л NaCl; 50% формамид [Вейко и соавт., 2003]. Количество рДНК (рибосомного повтора) определяли с использованием зонда pHRGВВ-28S (порядковый номер нуклеотидов 9346-10783, HSU 13369, GeneBank) [Вейко и соавт., 2003]. Количество СатIII (субфрагмента сателлита III человека) – с помощью зонда pRt301 [Томилин и соавт., 1984]. Биотинилирование зондов проводили с использованием фотореагента N-(4-азидо-2-гидроксибензоил)-1,7-диаминогептан (уксуснокислая соль) [Вейко и соавт., 2003], денатурировали (0,05M NaОН, 99оС, 4минуты), проводили гибридизацию с биотинилированными зондами в растворе 5% декстрансульфата (42°С, 20 часов). Отмывали фильтр растворами (2×SSC + 0,1% SDS, 2 раза,10 мин и 0,2×SSC + 0,1% SDS,10 мин, 60°С), блокировали 0,1% обезжиренного молока, 0,1% желатина, 0,05 моль/л Трис-НСl, рН 7,5, 0,1 моль/л NaCl. Биотин выявляли коньюгатом стрептавидин – щелочная фосфатаза («Sigma», США), субстрат для фосфатазы BCIP в присутствии NBT, который образует нерастворимый осадок («Sigma», США), промывали раствором NBT (300 мкг/мл, 2 раза), погружали в раствор субстратов 108 (BCIP и NBT) в буфере 0.1 моль/л Трис-HCl, рН 9.5, 0.1 M NaCl, 0.005 M MgCl2. Интенсивность гибридизационного сигнала определяли компьютерным анализом изображения фильтра с помощью программы «Images» (ИнтерЭВМ, Москва). [Вейко Н.Н. и соавт., 2003]. Стандартную ошибку (5 ± 2 %) вычисляли по формуле, учитывающей погрешность измерения гибридизационного сигнала данного образца ДНК и погрешность построения калибровочной кривой [Дерффель, 1994]. 2.5. Определение нуклеазной активности Количественный анализ эндонуклеазной активности (ДНКазы1) в белковых лизатах клеток осуществляли с использованием модельного субстрата – комплекса однонитевой ДНК с 30-звенным олигонуклеотидом R6G- ACCCCCAGCGATTATCCАAGCGCG-BHQ1, включающим флуоресцирующее основание (R6G, 5(6)-карбоксиродамин) и молекулу тушителя (BHQ1, «Синтол», Москва) [Ермаков с соавт., 2008]. Клетки после лизиса: 20 ммоль/л Hepes, рН 7,5, 10 ммоль/л KCl, 1,5 ммоль/л MgCl2, 1 ммоль/л дитиотрейтол, 1 ммоль/л PMSF пять раз замораживали (70°С)/размораживали (37°С), центрифугировали (2700 g), супернатант удаляли. К 20 мкл лизата добавляли 100 мкл раствора: 10 ммоль/л Hepes, рН 7,5, 20 ммоль/л MgCl2, 5 ммоль/л CaCl2, 3 пикомоль/мкл ДНК фага М13 и 2,5 пикомоль/мкл комплементарного ей олигонуклеотида R6G-ACCCCCAGCGATTATCCАAGCGCG-BHQ1 (1 час, 37°С) [Ермаков с соавт., 2008]. включающего флуоресцирующее основание (R6G, 5(6)карбоксиродамин) и молекулу тушителя (BHQ1, «Синтол», Москва). Спектр флуоресценции анализировали с помощью планшетного ридера («EnSpire» , Финляндия), λвозб=524 нм, λфлу=558 нм. 2.6. Метод ИФА на ДНК-связывающих мембранах На мембрану (Hybound ExtraC, «Amersham»), смоченную буфером (1,5 моль/л NaCl, 0,15 моль/л цитрат натрия, рН 7) наносили ДНК в этом же буфере буфере, прогревали при 850С 2 часа) [Вейко и соавт., 2003]. Фильтр блокировали (37°С, 30мин.) 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в буфере (0,01 моль/л фосфат натрия, 0,15 моль/л NaCl, 0,05 % твин-20), добавляли сыворотку (1:200) (30 мин., 37°С), инкубировали с вторичными антителами к иммуноглобулину G, коньюгированными с пероксидазой (30 мин., 37°С), с 1% сухим обезжиренным молоком, отмывали, помещали в раствор субстрата (0,5 мг/мл диаминобензидин, 0,5 мкл/мл 30% Н2О2, 0,1 моль/л имидазол),промывали определяли водой после образования осадка. Интенсивность сигнала с помощью программы компьютерного анализа изображений «Images» («ИнтерЭВМ», Москва). 109 2.7. Культивирование мезенхимных стволовых клеток (МСК) Методическая проблема культивирования МСК – в необходимости элиминации клеток других тканей, контаминирующих с МСК, при подборе оптимальных условий культивирования сопутствующие клетки элиминируются в ходе последующих пассажей [Костюк с соавт., 2012]. МСК получены из жировой ткани операционного материала больных с аденокарциномой молочной железы, доставленного из ФГБУ”РОНЦ им. Блохина” РАМН (г. Москва) в течение часа после резекции опухоли [Костюк с соавт., 2012]. Образец был механически измельчен в среде ДМЕМ (“ПанЭко”, Москва), содержавшей 250 мкг/мл гентамицина, 60 Ед/мл пенициллина и 60 Ед/мл стрептомицина (“ПанЭко”), ферментативную диссоциацию проводили в среде ДМЕМ, инкубируя препарат в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки (“PAA”, Австрия), 0.04% коллагеназы (“Sigma”) и тех же антибиотиков в течение 16 часов при 37°C [Костюк с соавт., 2012]. Клетки центрифугировали (200g, 10 мин), перенсли во флаконы и культивировали при 37°С в среде AmnioMax С-100 Basal Medium (“Gibco”), содержавшей AmnioMax Supplement C-100, 20 мкмоль/л HEPES (“ПанЭко”) и антибиотики [Костюк с соавт., 2012]. 2.8. Культивирование HUVEC (клеток эндотелия из вены пуповины) Клетки эндотелия выделяли из пуповины (здоровые женщины, нормально протекающая беременность, роды в срок и без осложнений, здоровые дети). Взятие материала и выделение клеток – в стерильных условиях, методика адаптирована [Ma., 2011]. Культивирование – в среде 199 («ПанЭко», Россия) с пенициллином (50 ед/мл), стрептомицином (50 мкг/мл), гентамицином (10мкг/мл, «ПанЭко», Россия), HEPES (20 мкл, «ПанЭко», Россия), факторами роста; при температуре 37º (плотность посева 500 тысяч клеток на 25см2). 2.9 Культивирование фибробластов Культивировали две линии клеток – фибробласты кожи взрослого человека 16-20 пассажей (HDF) и эмбриональные фибробласты легкого (HEF) 4-го пассажа. Клетки получены из коллекции культур клеток ФГБУ «МГНЦ» РАМН. Плотность посева 30 тыс/лунку, культивирование при 37 °C в бессывороточной среде «Гибрис» или среде «Гибрис», обогащенной 2% сыворотки. 2.10. Выделение лимфоцитов G0-лимфоциты выделяли в системе фиколл-урографин из периферической крови (гепаринизированной) здоровых доноров. Культивировали лимфоциты (600 тыс/мл) в среде RPMI 1640 (ICN, США) или в среде, содержащей раствор Хенкса и 1 ммоль/л HEPES («Fluka») с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС, HyClone, США). 110 2.11. Приготовление образцов ДНК Для изучения in vitro ответа клеток на присутствие вкДНК использовали: (1) Образцы циркулирующей вкДНК здоровых доноров и больных гипертонией 1-й степени без признаков атеросклероза, ишемическим инсультом на фоне выраженного атеросклероза сосудов, острым инфарктом миокарда (ОИМ), которому предшествовала ишемическая болезнь сердца (ИБС), раком молочной железы (РМЖ), ревматоидным артритом (РА), системной красной волчанкой (СКВ) в стадии обострения. (2) Образцы вкДНК, выделенные из среды культивирования клеток (HUVEC, МСК, первичных маммосферы из операционный материал, РМЖ). Все образцы вкДНК были охарактеризованы по содержанию рДНК и степени окисления. (3) Модельные фрагменты ДНК: (а) Окисленные формы ДНК. Пробы окисленной ДНК для эксперимента были приготовлены 2-мя способами: обработкой образца геномной ДНК 300mM Н2О2/Fe2+/EDTA (гДНКокси 1), или комбинированной обработкой образца гДНК 300mM Н2О2 и ультрафиолетом при длине волны λ = 312 нанометров, что способствует интенсивной деградациии Н2О2 и продукции свободных радикалов (гДНКокси 2) [Kostyuk et al., 2013]. (б) ГЦ-богатые модельные фрагменты, лиганды и ингибиторы TLR9 (Toll-like receptor). В качестве модельной ГЦ–ДНК использовали CpG – богатый фрагмент транскрибируемой области рДНК (участок от 515 до 5321 в соответствии с HSU13369, GeneBank), встроенный в вектор pBR322 (п(рДНК)), длина последовательности 9504 п.н. [Карпухин и соавт., 1994]. В качестве АТ - обогащенной ДНК человека использовали фрагмент 1,77 сателлита III (п(СатIII)) (участок 1q12, хромосомы 1) в векторе рBR322, длина последовательности 5485 п.н. [Карпухин и соавт., 1994]. Модельные образцы ДНК подвергали одинаковой дополнительной очистке от липополисахаридов: последовательно проводили обработку тритоном Х-114 [Вейко с соавт., 2006] и гельфильтрацию на носителе HW-85 [Костюк с соавт., 2010]. Для всех образцов был проведен компьютерный анализ нуклеотидного состава [Костюк с соавт., 2010]. Для визуализации добавляемых фрагментов были получены зонды методом никтрансляции с использованием флуоресцентных меток Spectrum Green и Spectrum Red [Kostyuk et al., 2013]. В качестве модельных меченных фрагментов использовали: а) геномную ДНК здоровых доноров (гДНКGreen/Red); б) ГЦ-богатую ДНК плазмиды п(рДНК)Green и вектора, входящего в состав плазмиды - рBR322Green; в) окисленную ДНК, полученную с помощью отжига смеси денатурированных образцов меченной геномной ДНК и окисленной in vitro ДНК, в результате чего образовалась меченная 111 окисленная гДНКоксиGreen/Red; г) окисленную ГЦ-богатую ДНК плазмиды п(рДНК)оксиGreen полученную методом отжига денатурированных проб: меченной плазмидной ДНК и окисленной in vitro плазмидной ДНК [Kostyuk et al., 2013]. Полученные образцы добавляли к среде культивирования клеток в концентрации 1300 нг/мл , инкубировали различные промежутки времени. 2.12. Определение количества активных форм кислорода Уровень активных форм кислорода (АФК) определяли с помощью красителя: 2,7дихлордигидрофлуоресцеин диацетата (DCFH-DA) («Molecular Probes/Invitrogen», «CA», США) [LeBel et al., 1992; Cossarizza et al., 2009], который под действием АФК окисляется с образованием флуоресцирующего 2,7- дихлорфлуоресцеина (DCF).Краситель добавляется к клеткам, инкубируется заданное время, клетки отмываются раствором версена («ПанЭко», Россия) и 0.25% трипсина («ПанЭко», Россия), 199 средой («ПанЭко». Россия), затем осаждались, анализ проводили в фосфатно-солевом буфере (PBS, «ПанЭко», Россия). Детектировали методом флуоресцентной микроскопии (Axio Vert, «Carl Zeiss Microscopy», Германия), проточной цитометрии (Partec CyFlow® ML, Германия) и с использованием планшетного ридера («EnSpire» , Финляндия). При анализе на проточном цитофлоуриметре Partec CyFlow® ML («Partec», Германия) используются пробирки FACS CyFlow Cube («Partec», Германия). 2.13. Определение уровня окиси азота в клетках Уровень окиси азота (II) определялся с использованием флуоресцентного красителя CuFl («Strem», США) [Efremova et al, 2010] согласно стандартной методике [Lim, 2007]. Метод детекции – флуоресцентная микроскопия (Axio Vert, «Carl Zeiss Microscopy», Германия), проточная цитометрия (Partec CyFlow® ML, Германия) и с использованием планшетного ридера («EnSpire» , Финляндия), λвозб = 495нм, с λэмиссии =526, режим «time-drive». 2.14. Определение количества нитритов и нитратов (метаболитов окиси азота) в среде культивирования Количество нитритов и нитратов определяли методом Грисса с использованием набора Griess Reagent Kit ("Invitrogen") по стандартной методике [Tsikas D., 2007]. Количество NO пересчитывали на количество клеток. Детекцию спектров осуществляли на спектрофотометре «Shimadzu UV-160A» (Япония) λ = 520-550 нм. 2.15. Определение F-актина Окрашивание F-актина цитоскелета осуществлялось по стандартной методике с использованием окраски родамином-фаллоидином («Molecular Probes/Invitrogen», «CA», США) [Wieland et al.,1983]. Клетки фиксировали 4% растворе формальдегида (15 мин при 112 4°С), затем промывали 0,1% раствором тритон-Х-100 («Merck», Германия), добавляли родамин-фаллоидин («Molecular Probes/Invitrogen», «CA», США) в концентрации 0.4 U/ml в растворе 0.02% тритона X-100 («Merck», Германия), 30 мин. Детекцию осуществляли при помощи флуоресцентной микроскопии λex = 520–550 нм и планшетном ридере («EnSpire equipment», Финляндия), λex = 530 нм, λem = 574 нм. 2.16. Определение содержания 8-окси-7,8-дигидрогуанозина (8-oxoG) в составе вкДНК. Для определения содержания 8-oxoG использовали стандартную методику, основанную на комплексообразовании 8-oxoG с белком авидином [Struthers et al., 1998]. Образцы вкДНК в 10-кратном растворе SSC пропускали через фильтр ExtraC, фильтр поместили 80°С, 1 час, промывали раствором 3% БСА (30 мин, 20°C), наносили авидин– FITC («Invitrogen», «CA», США) – 15 мин, 2 мг/мл, промывали 10х раствором SSC, 0.05% Tween-20, помещали в 50 мкл буфера (0.05 M Tris–HCl, pH 8.0, 0.1 M NaCl) в 96-луночный планшета. Детекцию осуществлялась на планшетном ридере («EnSpire equipment», Финляндия), λex = 480 нм, λem = 500–600 нм. 2.17. Определение одно- и двуцепочечных разрывов ДНК в клетках. Метод ДНК-комет (single cell gel electrophoresis) Для определения одно- и двуцепочечных разрывов ДНК использовали стандартный метод ДНК-комет, адаптированный под конкретные условия [Seitz et al., 2007]. Клетки трипсинизировали (0,25% раствором трипсина, «ПанЭко», Россия), помещали в 1% раствор легкоплавкой агарозы («Sigma», США), 30 минут, 37°C,наносили на стекла с 1,5% агарозой («Sigma», США). Препарат обрабатывали 2,5 моль/л NaCl, 0,1 моль/л EDTA (pH 10,0), 10 ммоль/л Tris (pH 9,6), 1% N-лаурилсаркозинат, 10% DMSO, 1% Triton X-100 (25°C, 2 часа), промыли дистиллированной водой, поместили в электрофорезную камеру (щелочном буфер: 0,3 моль/л NaOH, 1 ммоль/л EDTA (pH 10,0), 20 мин, 15°C, 300 mA. Фиксировали препараты 70% этанолом, окрашивали 10% раствором бромистого этидия («ПанЭко», Россия). Детектировали с использованием флуоресцентной микроскопии (увеличениеХ40) и программного обеспечения CASPlab. 2.18. Определение двуцепочечных разрывов ДНК ядер клеток методом иммунофлуоресценции Метод определения двуцепочечных разрывов ДНК ядер клеток помощью антител к фосфорилированной форме гистона H2AX (γH2AX) осуществляли по стандартному протоколу, который основан на том, что высококонсервативный гистоновый белок, участвующий в упаковке ДНК хроматина (Н2АХ), фосфорилируется по остатоку серина 139 в сайте образования разрыва ДНК [Scully et al., 2013; Lobrich et al., 2010]. Клетки 113 фиксировали 2% параформальдегидом («ХимМед», Россия) 15 мин, 25°С, обрабатывали 0,2% раствором Тритон Х-100 («Merck», Германия), отмыты в фосфатно-солевом буфере. Блокировали 3% раствор БСА, инкубировали с первичными антителами, 1 час, 24°С, после отмывки – со вторичными антителами, 45 мин, 24°С, затем окрашивали DAPI (4,6diamidino2phenylindole). Детектировали методом флуоресцентной микроскопии (Axio Vert, «Carl Zeiss Microscopy», Германия), проточной цитометрии (Partec CyFlow® ML, Германия). 2.19. Анализ разрывов ДНК в клетках методом TUNEL Метод TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling staining), позволяющий детектировать разрывы в ядерной ДНК, осуществляли по стандартному протоколу, который основан на способности дезоксинуклеотидил трансферазы присоединять меченный dUTP на свободный 3’ конец ДНК на месте разрыва [Loo, 2011]. В работе использовался CometAssay® Kit 50 Samples («Trevigen Cell Assays», Германия), согласно протоколу производителя (http://www.trevigen.com/item.php/itemsKey=385) 2.20. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) Для анализа структурных изменений в ядрах клеток исследовали положение прицентромерных локусов 1-й хромосомы (район 1q12) в фиксированных ядрах лимфоцитов, как описано ранее [Карпухин и соавт., 1994]. Зонд на прицентромерный локус первой хромосомы (1q12) наносили на препарат, денатурировали 7 мин, 74°С в термостате ThermoBrite («StatSpin», США). Ренатурировали при 42°С, 10 час. во влажной камере, обрабатывали раствором: 2-кратный SSC и 50%-ный формамид 7 мин, 42°С, затем раствором 2-кратного SSC 5 мин, 42°; 0,1% Na-фосфатным буфером, содержащем твин-20, 0,1 моль/л (рН 8), 1 мин. На стекла наносили авидин-FITC в 0,1% Na-фосфатном буфере, содержащем твин-20, 0,1 моль/л (рН 8)А и инкубировали 30 мин, 37°С во влажной камере, отмывали 2 раза по 10 мин 0,1% Na-фосфатным буфером, содержащем твин-20, 0,1 моль/л (рН 8), наносили на стекла раствор пропидиум иодида и DAPI, анализировали под микрпоскопом Axioplan («Opton», Германия), использовали цифровую камеру RETIGA 2000R («IMAGING», Канада ). Перевод 2D изображения в 3D осуществляли с помощью программы анализа изображений («ИнтерЭВМ», Москва). 2.21. Определение ферментативной активности каспазы 3 Активность каспазы 3 определяли в белковых лизатах лимфоцитов с использованием флуоресцирующего субстрата Ac-DEVD-AFC (”Sigma”), λвозб=400 нм, λфлу=490 нм по разработанной методике [Костюк с соавт., 2012]. К летки лизировали (20 ммоль/л Hepes, рН 7,5, 10 ммоль/л KCl, 1,5 ммоль/л MgCl2, 1 ммоль/л дитиотрейтол, 1 ммоль/л PMSF), замораживали при -70°С пять раз, размораживали при 37°С, 114 центрифугировали (2700 g), к 20 мкл лизата добавляли 100 мкл раствора: 50 ммоль/л Hepes, рН 7,5; 10% сахарозы; 1 ммоль/л дитиотрейтола; 0,1% CHAPS и 25 мкл флуоресцирующего субстрата QAc-DEVD-AFC (7-amino-4-trifluoromethylcoumarin, NCBZ-L-aspartil-L-glutamyl-L-valyl-L-aspartic acid amide), λвозб=400 нм, λфлу=490 нм., 1 час, 33°С. Активность каспазы 3 персчитывали на единицу ДНК: уровень выживаемости клеток оценивали с помощью стандартного МТТ-теста [Mosmann, 1983]. 2.22. Определение уровня экспрессии белков Уровень экспрессии белков TLR9, AIM2, iNOS, eNOS, peNOS, NOX4, Ki-67, PCNA, р65(NF-kB), STAT3, NRF2, CD31, CD34, CD45, HLA-ABC, HLA-DR, CD44, CD29, CD49b, CD54, CD90, CD106, CD105, CD117 определяли с использованием метода проточной цитофлоуриметии на приборе Partec CyFlow® ML («Partec», Германия), их локализацию в клетках исследовали с использованием непрямого иммуноцитохимического метода. После инкубации с фрагментами вкДНК, клетки фиксировали раствором формальдегида (для диагностики экспрессии внутриклеточных белков пермеабилизировали 1% раствором Тритона Х100 («Merck», Германия), инкубировали с антителами (первичными, и, при необходимости, вторичными), меченными FITC или фикоэритрином («Sigma», США) согласно стандартной методике [Larsson L.I., 1993]. 2.23. Ингибирование TLR9 клеточного пути TLR9 - сигнальный путь ингибировали путем блокировки TLR9 добавлением олигонуклеотида TCCTGGCGGGGAAGT (2088) («Синтол», Москва) в конечной концентрации 3 мкг/мл [Lenert et al., 2009], или хлорокина («Boots Company PLC», Англия) в концентрации 2 мкг/мл [Huang et al., 2005]. После добавления каждого из них клетки инкубировали до какого-либо воздействия 30 минут при 37°С. Концентрацию РНК опрелеляли с помощью красителя Quant-iT RiboGreen RNA reagent («MoBiTec», Германия), λвозб=487 нм, λфлу=524 нм. 2.24. Оценка уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени Уровень экспрессии генов TLR9, AIM2, RIG1, STING1, TLR1, TLR2, TLR3. TLR4, TLR5, TLR6, TLR7. TLR8. TLR10, NOX4, SOD1, CCND1, CDKN2A, CDKN1A, ТВР, GAPDH, BRCA1, BCL2, BCL2A1(Bfl-1/A1), BCL2L1 (BCL-X), BIRC2(c-IAP1), BIRC3 (c-IAP2), ICAM1, SELE, VCAM1, eNOS, iNOS, NFKB1, ACTB, MYD88, TIRAP, HSPD1, MAP2K3, TICAM, SARM1, TOLLIP, HRAS, HSPA1, MAPK8, EIF2AK2, PPARA ,TRAF6, UBE2, FADD, IRAK1, MAP3K7, IRAK2, IRAK1, PELI1, RIPK2 MAP3K1, MAP4K4, REL, IKBKB, RELA (p65), NFRKB, NFKB2, TNF, IL1B, IL8, IL6, IL-10, IFNG, NRF2, KEAP1, STAT3, PPARG, MYOD1, 115 MYOG, MYF5, MRF4 (MYF6), RUNX2, SPP1, OCN, LPL и АР2 (FABP4) оценивали методом ПЦР в реальном времени [Barbour et al., 2012]. После воздействия на клетки фрагментов внеклеточной ДНК из клеток выделяли РНК с использованием наборов YellowSolve («Клоноген», Россия) или реагента Trizol («Invitrogen») согласно прилагаемой методике (http://tools.lifetechnologies.com/ content/ sfs/ manuals/ trizol_reagent.pdf) осаждением - с последующей фенол - хлороформной экстракцией и хлороформом и изоамиловым спиртом (49:1). Концентрацию РНК опрелеляли с помощью красителя Quant-iT RiboGreen RNA reagent («MoBiTec», Германия), на планшетном ридере («EnSpire equipment», Финляндия) λвозб=487 нм, λфлу=524 нм. Реакцию обратной транскрипции осуществляли с помощью реактивов фирмы «Силекс» (Россия) согласно стандартной методике. ПЦР проводили с использованием соответствующих праймеров (“Синтол”) и интеркалирующего красителя SybrGreen на приборе StepOnePlus («Applied Byosystems», США). Праймеры, использованные в работе (записаны в одинаковом порядке (F;R)): ТВР (F: 5’-GCCCGAAACGCCGAATAT-3’; R 5’-CCGTGGTTCGTGGCTCTCT-3’); GAPDH (GAAGGTGAAGGTCGGAGTC; GAAGATGGTGATGGGATTTC); ACTB (GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC; TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTT); NOX4 (TTGGGGCTAGGATTGTGTCTA; GAGTGTTCGGCACATGGGTA); eNOS (TGGCTGGTACATGAGCACTGAGAT; CACGTTGATTTCCACTGCTGCCTT); iNOS (GCGTTACTCCACCAACAATGGCAA; ATAGCGGATGAGCTGAGCATTCCA); ICAM (CGTGCCGCACTGAACTGGAC; CCTCACACTTCACTGTCACCT); VCAM (GGGAAGCCGATCACAGTCAAG; CTCCAGCCTGTCAAATGGGTA); SELE (CAGCAAAGGTACACACACCTG; CAGACCCACACATTGTTGACTT); AIM2 (CAGAAATGATGTCGCAAAGCAA; TCAGTACCATAACTGGCAAACAG); RIG1 (GAGATTTTCCGCCTTGGCTAT; CCGTTTCACCTCTGCACTGTT); STING1 (CCAGAGCACACTCTCCGGTA; CGCATTTGGGAGGGAGTAGTA); SOD1 (AGGGCATCATCAATTTCGAGC; GCCCACCGTGTTTTCTGGA); Myd88 (GGCTGCTCTCAACATGCGA; TGTCCGCACGTTCAAGAACA); TLR9 (TGAAGACTTCAGGCCCAACTG; TGCACGGTCACCAGGTTGT); BCL2 (TTTGGAAATCCGACCACTAA; AAAGAAATGCAAGTGAATGA); BCL2A1 (TACAGGCTGGCTCAGGACTAT; CGCAACATTTTGTAGCACTCTG); BCL2L1 (CGACGAGTTTGAACTGCGGTA; GGGATGTCAGGTCACTGAATG); NFKB1 (CAGATGGCCCATACCTTCAAAT; CGGAAACGAAATCCTCTCTGTT); MAP4K4 (GAGCCACAGGTACAGTGGTC; AAGCCTTTTGGGTAGGGTCAG); BIRC2 (GAATCTGGTTTCAGCTAGTCTGG; GGTGGGAGATAATGAATGTGCAA); BIRC3 (AAGCTACCTCTCAGCCTACTTT; CCACTGTTTTCTGTACCCGGA); 116 TNF (ATCAATCGGCCCGACTATCTC; GCAATGATCCCAAAGTAGACCTG); IL6 (AAATTCGGTACATCCTCGACGGCA; AGTGCCTCTTTGCTGCTTTCACAC); CCND1 (TTCGTGGCCTCTAAGATGAAGG; GAGCAGCTCCATTTGCAGC); CDKN2A (ATGGAGCCTTCGGCTGACT; GTAACTATTCGGTGCGTTGGG); BRCA1 (GGCTATCCTCTCAGAGTGACATTTTA; GCTTTATCAGGTTATGTTGCATGGT); TIRAP (ATGGTGGCTTTCGTCAAGTCA; TCAGATACTGTAGCTGAATCCCG); NFKB1 (CAGATGGCCCATACCTTCAAAT; CGGAAACGAAATCCTCTCTGTT); NFRKB (GAGGCACCAGAGTTAGTCTGC; GGAGGTGTTCACGTTGAGAATC); REL (GCAGAGGGGAATGCGTTTTAG; AGAAGGGTATGTTCGGTTGTTG); RELA (CCCACGAGCTTGTAGGAAAGG; GGATTCCCAGGTTCTGGAAAC); MAP3K1 (F:TCTCACCATATAGCCCTGAGGA; AGGAAAGAGTTAGGCCCTATCTG); HSPD1 (ATGCTTCGGTTACCCACAGTC; AGCCCGAGTGAGATGAGGAG); MAP2K3 (GACTCCCGGACCTTCATCAC; GGCCCAGTTCTGAGATGGT); TICAM (GCCAGCAACTTGGAAATCAGC; GGGGTCGTCACAGAGCTTG); SARM1 (AGGAACGCGAACCCGTAGA; TCTCCTCCGAATGCTTGAACA); TOLLIP (TCAACCTCGTCATGTCCTACG; TGTGATGGGCACATAGCCAAC); HRAS (GTACTTGGGTGATGGTTACGTT; AGACTTGGCGCTTGTAAAGGA); HSPA1A (CTGCGGCTACACCAGATGATT; CCCAGCTCCTACTGTGTCACT); MAPK8 (TGGAGCACTACGAGTTCCAGA; CTGGTGCAGGGCATTGTACT); EIF2AK2 (GCCGCTAAACTTGCATATCTTCA; TCACACGTAGTAGCAAAAGAACC); PPARA (CGGTGACTTATCCTGTGGTCC; CCGCAGATTCTACATTCGATGTT); TRAF6 (TTGCCATGAAAAGATGCAGAGG; AGCCTGGGCCAACATTCTC); UBE2 (ACTACCCCTATTCACCACCTAC; AGGCGGATGAAGAATCGAAATG); FADD (GTGGCTGACCTGGTACAAGAG; GGTAGATGCGTCTGAGTTCCAT); IRAK1 (CCACCCCAGTTCTATCATACTCC; GGCCAACAAGGTTACAGACTT); MAP3K7 (GTTGTGGCGGTCCTTCTCAA; CCATCCACTGTCGATTTGCATA); IRAK2 (CTGCCACCCCAATGTCTTACC; AGGGAACCATTTGCCATGTAG); IRAK1 (CCACCCCAGTTCTATCATACTCC; GGCCAACAAGGTTACAGACTT); PELI1 (ATGGCTTGACCACTAATGGTG; CGATCTGGTTTCACGTAGGCTA); RIPK2 (GCCCTTGGTGTAAATTACCTGC; GGACATCATGCGCCACTTT); IKBKB (GTCTTTGCACATCATTCGTGGG; GTGCCGAAGCTCCAGTAGTC); NFKB2 (AGAGGCTTCCGATTTCGATATGG; GGATAGGTCTTTCGGCCCTTC); TLR2 (GGCCAGCAAATTACCTGTGTG; AGGCGGACATCCTGAACCT); TLR1 (ATTTCAAACGTGAAGCTACAGGG; CCGAACACATCGCTGACAACT); TLR5 (TGCCTTGAAGCCTTCAGTTATG; CCAACCACCACCATGATGAG); TLR7 (TTACCTGGATGGAAACCAGCTACT; TCAAGGCTGAGAAGCTGTAAGCTAV TLR3 (AAGAGTTTTCTCCAGGGTGTTTT; CAGATTCCGAATGCTTGTGTTTG); TLR6 (GAAGAAGAACAACCCTTTAGGATAGC; AGGCAAACAAAATGGAAGCTT); 117 TLR10 (GATTTACTCTGGGACGACCTTTT; GTCAAGATAAGCCTTACCACCAA); TLR4 (ACCTGAGCTTTAATCCCCTGA; GGCTCTGATATGCCCCATCTT); TLR8 (CCAGAACGGAAATCCCGGTAT; GGGTATTTGGGGTAACTGGTTG); IL1B (TTCGACACATGGGATAACGAGG; TTTTTGCTGTGAGTCCCGGAG); IL8 (GCACCGACTTTGGAGTTGG; GGACCCCTCAAACGACTGT); IFNG (GGCATTTTGAAGAATTGGAAAG; TTTGGATGCTCTGGTCATCTT); IL10 (AAGGCGCATGTGAACTCCC; ACGGCCTTGCTCTTGTTTTC); MYOD1 (GGTCCCTCGCGCCCAAAAGAT; GTTCTCCCGCCTCTCCTAC); MYOG (AGTGCACTGGAGTTCAGCG;TTCATCTGGGAAGGCCACAGA); MYF5 (CTGCCAGTTCTCACCTTCTGA; CGTCCCCAAATTCACCCTCG); MRF4 (AATCTTGAGGGTGCGGATTTC; CTCCTCCTTCCTTAGCCGTTA); RUNX2 (CCGTCTTCACAAATCCTCCCC; CCCGAGGTCCATCTACTGTAAC); SPP1 (CTCCATTGACTCGAACGACTC; GGTCTGCGAAACTTCTTAGAT); OCN (CCCTCACACTCCTCGCCCTATT ; AAGCCGATGTGGTCAGCCAACTCGT); LPL (ACAAGAGAGAACCAGACTCCAA; GGTAGTTAAACTCCTCCTCC); АР2 (TGTGCAGAAATGGGATGGAAA; CAACGTCCCTTGGCTTATGCT); PPARG (ACCAAAGTGCAATCAAAGTGGA; AGGCTTATTGTAGAGCTGAGTCT); NRF2 (TCCAGTCAGAAACCAGTGGAT; GAATGTCTGCGCCAAAAGCTG); STAT3 (GGGTGGAGAAGGACATCAGCGGTAA; GCCGACAATACTTTCCGAATGC); KEAP1 (GTGGTGTCCATTGAGGGTATCC; GCTCAGCGAAGTTGGCGAT). Состав реакционной ПЦР-смеси в объеме 25 мкл: 2,5 мкл ПЦР буфера (700 ммоль/л Tris-HCl, pH 8,6; 166 ммоль/л сульфата аммония, 35 ммоль/л MgCl2), 2 мкл 1,5 ммоль/л раствора dNTP; по 1 мкл 30 пкмоль/л раствора праймеров, кДНК. Условия ПЦР подбирались индивидуально для каждой пары праймеров. Стандартными для большинства праймеров условия: после денатурации (95°С, 4 мин) проводили 40 циклов амплификации в режиме: 94°С – 20 сек, (56 - 62)°С – 30 сек, 72°С - 30 сек. Затем – 72°С в течение 5 мин. Реакцию ПЦР проводили в приборе StepOnePlus («Applied Byosystems», США). Уровень экспрессии генов анализировали в нескольких независимых экспериментах на клетках от разных доноров, обработку результатов осуществляли с помощью программного обеспечения прибора; ошибка составляла 2%. Методы обработки данных ПЦР в реальном времени основаны на применении уравнения: C(T) = - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E. Два основных принципа обработки данных Real-time ПЦР - это: метод калибровочного графика и прямое сравнение данных. Метод калибровочного графика предполагает построение калибровочного графика в координатах C(T) - log P0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P0) в экспериментальных образцах. Поскольку нам было 118 достаточно определить лишь относительную концентрацию субстрата, для построения калибровочного графика мы использовали серию разведений разных экспериментальных образцов и сравнили эффективности. Ошибка определения (разброс значений) при использовании серийных разведений составила 1,2%. Все экспериментальные значения попадали в область построенной линейной калибровочной прямой. Эффективность реакции можно рассчитать как E = 10-1/k, где k берется из уравнения прямой C(T) = k·log P0 + b, полученной путем линейной аппроксимации экспериментальных данных. При E = 2 (максимально теоретически возможном значении) k ~ -3.32. В нашем случае k > -3,8, а эффективность Е >1,82. Условия ПЦР (и, прежде всего, эффективность амплификации) серии стандартов (GAPDH) близки к условиям ПЦР экспериментальных образцов. Поэтому мы провели прямое сравнение данных экспрессии генов TLR9 и GAPDH с помощью программного обеспечения прибора Rotor Gene. Данные, полученные с использованием программы прибора и посчитанные при сравнении концентраций на основе калибровочных кривых, совпадают. В серии опытов получена хорошая воспроизводимость результатов, ошибка составила ~ 2%. 3.25. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку проводили с использованием программы Excel Microsoft Office, Statistica 6.0, StatGraph. При анализе предполагаемых различий между выборками исходили из нуль-гипотезы об отсутствии различий, которую проверяли с помощью расчета U-критерия Манна-Уитни. Различия достоверны при p < 0,05. Распределения параметров сравнивали по методу Колмогорова-Смирнова. 119 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. СВОЙСТВА ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК. ПОИСК СВОЙСТВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ВКДНК В настоящее время в медицинской практике все большее распространение получает диагностика на основании анализа вкДНК. Анализ вкДНК как маркера патологического процесса применяется в онкологии, в пренатальной диагностике, в травматологии [González-Masiá et al., 2013; Kim, 2013; Ulivi and Silvestrini, 2013; Urbanova et al., 2010; Yu 2012; Skibsted et al., 2013; El Messaoudi et al., 2013]. Однако свойства и биологические функции фрагментов вкДНК в норме и при патологии остаются малоизученными. Ранее считали, что вкДНК аналогично ДНК ядер не способна воздействовать на клетки организма. В последние годы было установлено, что вкДНК является не только доступным маркером гибели клеток при патологии, то и активно влияет на функционирование клеток иммунной и сердечно-сосудистой систем [Gahan and Stroun, 2010; Konorova et al., 2008; Bulicheva et al., 2008]. Появилось много исследований, в которых показано, что вкДНК отличается от яДНК по нуклеотидному составу [Gahan and Stroun, 2010; Malik et al., 2013; Rykova et al., 2012]. Изменение нуклеотидного состава вкДНК по сравнению с ДНК ядер клеток и эпигенетические изменения, такие, как окислительные модификации, приводят к тому, что циркулирующая ДНК перестает быть инертной молекулой и становится соединением с выраженной биологической активностью [Ermakov et al., 2013; Kosyuk et al., 2013; Loseva et al., 2012; Glebova et al., 2013]. Мы исследовали, какие свойства вкДНК с наибольшей вероятностью характеризуют «особенности», отличающие ее от ДНК ядер клеток, и представляют те характеристики, которые изменяют инертную гДНК до биологически активной молекулы вкДНК. 3.1.1. Концентрация вкДНК не может служить маркером хронического низкоуровнего повреждающего воздействия или хронически протекающего патологического процесса Повышение концентрации вкДНК в плазме или сыворотке крови является одним из наиболее исследованных маркеров патологического состояния организма. При патологии, травме, беременности, при действии радиации в плазме крови повышается концентрация вкДНК [Gonzalez-Masia et al., 2013; Hong and Zu, 2013; Ghorbian and Ardekani, 2012]. Особенно значительно увеличена концентрация вкДНК при острых состояниях, таких как травма и сепсис в ближайшие часы после воздействия [Swarup et al., 2007; Cui et al., 2013; Ren et al., 2013; Saukkonen et al., 2008]. Возрастание концентрации вкДНК имеет место у 120 онкологических больных, благодаря тому, что в этом случае снижается активность ферментов, отвечающих за элиминацию вкДНК из кровотока [Gormally et al., 2007; Marzese et al., 2013; Ramachandran et al., 2013; Schwarzenbach 2013]. В случае острого лучевого поражения организма ионизирующим излучением, например, при лучевой терапии раковых больных [Cheng et al., 2009] или при облучении экспериментальных животных [Vladimirov et al., 1992] также происходит увеличение концентрации циркулирующей ДНК. Во всех перечисленных выше случаях концентрация вкДНК рассматривается в качестве интегрального показателя, который отражает общий высокий уровень гибели клеток организма на момент анализа. В литературе для определения концентрации вкДНК в крови разрабатываются, как прямые методы, не требующие извлечения ДНК из биожидкости [Goldshtein et al., 2009], так и не прямые [Fleischhacker et al., 2007], которые предполагают очистку ДНК перед определением концентрации. Большинство авторов больше доверяют непрямым методам детекции концентрации вкДНК плазмы/сыворотки крови, поскольку при использовании прямых методов с большей вероятностью возникают артефакты, связанные с присутствием примесей, влияющих на детекцию вкДНК [Urbanova et al., 2010; El Messaoudi et al., 2013]. ВкДНК выделяли из плазмы крови, поскольку согласно литературным данным, в сыворотке крови часто присутствует ДНК клеток, которые частично могут разрушаться при коагуляции белков крови, что приводит к неконтролируемым артефактам при определении концентрации вкДНК [Thierry et al., 2010 Umetani et al., 2006]. В качестве антикоагулянта использовали гепарин, поскольку мы тестировали эндонуклеазную активность плазмы крови, а ЭДТА, связывая ионы магния, блокирует активность эндонуклеаз. ДНК выделяли методом фенольной экстракции, этот метод дает, в среднем, на 20% больший выход вкДНК, чем метод с использованием ДНК-связывающих колонок, что согласуется с данными других авторов [Gormally et al., 2006; Xue et al., 2009; Yuan et al., 2012]. Концентрацию вкДНК определяли с помощью флуоресцирующего красителя RiboGreen, этот краситель одинаково эффективно определяет концентрацию, как длинных (20 т.п.н), так и коротких (менее 100 п.н.) фрагментов ДНК [Puszyk et al., 67]. Значения концентраций вкДНК, определямых методом ПЦР, на порядок ниже, чем при определении с использованием современных флуоресцентных красителей [Костюк с соавт., 2010; El Messaoudi et al., 2013; Chiminqgi et al., 2007; Szpechcinski et al., 2008]. Основные причины этих различий состоят в значительном количестве разрывов во вкДНК, в наличии окислительных модификаций оснований, осложняющих работу Taqполимеразы и в наличии примесей в выделенном образце, которые могут ингибировать 121 фермент [Костюк с соавт., 2010; El Messaoudi et al., 2013]. Еще одна проблема – это изменение содержания уникальных последовательностей в составе вкДНК по сравнению с гДНК, причем эти изменения могут быть индивидуальными, что создает проблему поиска адекватного внутреннего стандарта [Puszyk et al., 2009]. Концентрации вкДНК были нами определены в плазме крови 1349 человек (рисунок 3.1.1). Рисунок 3.1.1. Концентрации циркулирующей вкДНК при различных состояниях организма человека: контроль (практически здоровые доноры), больные сосудистыми заболеваниями (СЗ), больные с аутоиммунной патологией (системная красная волчанка и ревматоидный артрит), больные с сердечнососудистой патологией (острый инфаркт миокарда и ишемическая болезнь сердца), беременные, работники предприятий атомной промышленности. В плазме крови 390 здоровых лиц концентрация циркулирующей ДНК варьировала от 0,2 до ~ 2000 нг/мл, медиана 130 нг/мл, распределение отличается от нормального (рисунок 3.1.1, 3.1.2). 122 Рисунок 3.1.2. Кумулятивные гистограммы распределений концентрации вкДНК в различных подгруппах, входящих в выборки, приведенные на рисунок 3.1.1. А – выборка СЗ: атеросклероз мозговых артерий (АС), артериальная гипертензия (АГ) и острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК) Выборки АГ и АС достоверно отличаются от контрольной и выборки ОНМК (непараметрический критерий Коммогорова – Смирнова, p<<0,0001). Б – выборка больных с аутоиммунной патологией: ревматоидный артрит (РА) и системная красная волчанка (СКВ), p<0,0001. В – выборка облученных лиц, тип источника указан на рисунке. Выборка лиц, работавших с гамма-нейтронными источниками достоверно отличается от контрольной выборки, p< 0,0001. 123 Уровень вкДНК плазмы крови повышается у ~ 20% больных ревматоидным артритом и системной красной волчанкой, у ~ 30% больных с сосудистой патологией. В первые сутки ишемического инсульта концентрация пДНК резко возрастает и вне острой стадии остается повышенной, тем больше, чем тяжелее течение заболевания и хуже прогноз [Ганнушкина и др., 1997]. Мы показали пятикратное увеличение концентрации вкДНК в сыворотке крови больных острым инфарктом миокарда по сравнению со здоровыми лицами. Двукратное увеличение концентрации наблюдалось при хронической ишемической болезни сердца. Полученные нами данные по увеличению уровня вкДНК согласуются с литературными данными, и уровень вкДНК совпадает по значениям с уровнем вкДНК, определяемым другими исследовательскими коллективами аналогичными методами [Ганнушкина и др., 1997]. Однако нами были получены данные, что увеличение концентрации вкДНК, которое часто используют как маркер патологического процесса, не достаточно точно отражает наличие хронической патологии [Вейко с соавт., 2007; Костюк с соавт., 2008]. С течением времени после острого поражения или при развитии в организме хронических заболеваний, которые сопровождаются нерезким, но длительным увеличением уровня гибели клеток организма, происходит увеличение активности системы элиминации вкДНК из кровотока [Костюк с соавт., 2008; Костюк с соавт., 2013]. На гистограммах (рисунок3.3.1 -2) видно, что у части лиц, как облученных, так и больных, концентрации циркулирующей ДНК снижены по сравнению с практически здоровыми лицами [Костюк с соавт., 2008; Костюк с соавт., 2013]. В условиях относительно невысокого уровня гибели клеток больного органа и/или при значительно высоких значениях эндонуклеазной активности крови общая концентрация вкДНК не может служить маркером гибели клеток, а ее сниженные значения могут создать ложное представление о благополучии в организме [Костюк с соавт., 2013]. Мы обнаружили снижение концентрации вкДНК в плазме крови облученных людей и активацию компонентов системы элиминации вкДНК из кровотока на фоне повышенного уровня повреждения ДНК лимфоцитов крови [Костюк с соавт., 2008; Костюк с соавт., 2013]. Мы впервые проанализировали концентрацию вкДНК в выборке людей, которые на протяжении длительного времени с работали с источниками ионизирующего излучения, и сравнили их с концентрацией вкДНК людей того же возраста, проживающих в той же местности, но не контактирующих с источниками ИИ. ВкДНК была выделена из образцов плазмы периферической крови 329 человек, подвергавшихся профессиональному хроническому воздействию ионизирующего 124 излучения (сотрудники предприятия атомной промышленности ГНЦ РФ ФЭИ, г. Обнинск и РФЯЦ-ВНИИЭФ, г. Саров, Россия) и плазмы крови 390 человек контрольной группы. В выборку облученных включены лица, подвергавшиеся профессиональному хроническому воздействию рентгеновского, гамма-нейтронного и тритиевого ионизирующего. Накопленые дозы радиации 0,39-578,6 мЗв, среднее значение кумулятивной дозы радиации для всей выборки облученных равно 108 мЗв, среднее значение годовой дозы 3,2 ± 1,1 мЗв. Средний возраст на момент взятия крови – 52 ± 15 лет (в диапазоне от 17 до 86 лет). В выборке облученных лиц, которые контактировали с источниками внешнего гамма-нейтронного излучения, концентрации вкДНК были ниже, чем в контрольной группе [Костюк с соавт., 2013]. На рисунок 3.1.2. приведены распределения значений концентрации вкДНК плазмы крови в контрольной выборке и в выборке облученных лиц. Таким образом, концентрации вкДНК в плазме крови снижается при периодическом облучении человека на протяжении длительного времени источниками ионизирующей радиации [Костюк с соавт., 2013]. 3.1.1.2. Концентрация вкДНК зависит от нуклеазной активности плазмы крови. Снижение концентрации циркулирующей вкДНК в крови хронически облучаемых лиц может выглядеть неожиданным и парадоксальным. Действительно, по данным литературы облучение вызывает усиление процессов клеточной гибели [Kondo, 2012; Darzynkiewicz et al., 2013]. Следовательно, в крови облученных людей, особенно тех, кто контактировал с источниками ИИ на момент проведения анализа, концентрация вкДНК должна увеличиваться по сравнению с необлученным контролем. Мы предположили, что наряду с усилением процессов гибели клеток, в организме облученного человека активируются системы, направленные на элиминацию фрагментов вкДНК из кровотока [Костюк с соавт., 2013]. Основным фактором, отвечающим за элиминацию вкДНК из кровотока, является активность эндонуклеаз плазмы крови, и, в первую очередь, активность ДНКазы 1, которая гидролизует одну из цепей ДНК, вызывая однонитевые разрывы (SSB) [Kawai et al., 2004; Yasuda et al., 2005]. Накопление однонитевых разрывов в двух цепях ДНК приводит к возникновению двунитевых разрывов (DSB) и фрагментации вкДНК на низкомолекулярные фрагменты, которые элиминируются из кровотока путем почечной фильтрации [Counis and Torriglia, 2000; Baranovskii et al., 2004]. Таким образом, увеличение количества апоптотических клеток при действии радиации приводит к активации систем элиминации ДНК этих клеток из организма и концентрация вкДНК может снижаться [Martínez Valle et al., 2008]. 125 Для того, чтобы подтвердить наше предположение о связи концентрации вкДНК с эндонуклеазной активностью, мы определили активность ДНКазы 1 в плазме крови 285 человек (выборки облученных N=176 и здоровых необлученных доноров N=109) с помощью разработанного нами количественного метода [Ermakov et al., 2008]. В качестве субстрата используются модельные двухцепочечные олигонуклеотиды, содержащие на 5конце флуорохром, а на 3-конце тушитель флуоресценции, который тушит флуоресценцию хромофора по известному механизму «переноса энергии» [Wu et al., 2001; Nagano, 2014]. Если в олигонуклеотиде возникает двойной разрыв вследствие накопления однонитевых разрывов, то флуоресценция красителя увеличивается в несколько раз [Ermakov et al., 2008]. Для калибровки использовали стандартный образец ДНКазы 1 с фиксированной концентрацией. За единицу эндонуклеазной активности принимали активность, соответствующую активности 1нг/мл стандартного раствора ДНКазы 1. На рисунок 3.1.3. приведены данные об активности ДНКазы 1 в двух исследуемых группах. В контрольной группе активность ДНКазы 1 варьирует от 0,2 до 21,1 нг/мл (медиана 2,2 нг/мл). Рисунок 3.1.3. Распределение анализируемых образцов плазмы крови в выборках облученных и контрольных доноров по активности ДНКазы 1. Сравнение распределений по методу Колмогорова-Смирнова (D=0,59, а<<10-5). В группе облученных лиц активность ДНКазы 1 изменяется в интервале от 0,4 до 25,5 нг/мл (медиана 4,5 нг/мл). Оба распределения активности ДНКазы 1 плазмы крови отличаются от нормальных распределений. Как следует из анализа распределений (рисунок 3.1.3) активность ДНКазы 1 плазмы крови облученных людей значительно увеличена по сравнению с активностью ДНКазы 1 необлученных лиц. 126 Таким образом, мы наблюдали снижение концентрации вкДНК в выборке с более высокими значениями активности ДНКазы 1 [Костюк с соавт., 2013]. Факт снижения концентрации вкДНК при повышении эндонуклеазной активности говорит о том, что при данных режимах накопления дозы облучения не происходит одновременно массовой гибели клеток организма, когда не успевает установиться равновесие между гибелью клеток и элиминацией продуктов распада погибших клеток [Костюк с соавт., 2013]. Иная картина наблюдается у больных ревматоидным артритом в период обострения болезни, когда вследствие патологического процесса и лечения цитостатиками в короткий срок гибнет большое количество клеток, и концентрации внДНК возрастают в десятки раз [Вейко с соавт., 2006]. Однако даже в тех случаях, когда повышение концентрации вкДНК регистрируется для большой выборки лиц с активно протекающими процессами апоптоза, в ряде случаев не регистрируется повышение концентрации вкДНК [Вейко и соавт., 2003; Костюк и соавт., 2008]. Это, вероятно, обусловлено активной системой элиминации накапливающихся фрагментов вкДНК [Gahan and Stroun, 2010; Ermakov et al., 2008; Samejima et al., 2005; Костюк с соавт., 2013]. При эффективной системе элиминации концентрация вкДНК не может являться маркером хронического патологического процесса или длительно протекающего апоптоза клеток. Вывод: резкое увеличение концентрации вкДНК – неспецифичный маркер острого состояния с высоким уровнем гибели клеток. Повышение эндонуклеазной активности должно приводить к фрагментации вкДНК. 3.1.2. Длины фрагментов внДНК Внеклеточная ДНК может циркулировать в крови в виде фрагментов разной длины: от 180 до 20000 п.н. Чётко детектируются длинные фрагменты (~20000 п.н.) и фрагменты длиной 180, 360 п.н. и т.д., соответствующие моно- и олигонуклеосомам [Chan et al., 2005; Suzuki et al., 2008]. Анализ длины фрагментов вкДНК методом электрофореза в 1% агарозном геле показал, что вкДНК в крови здоровых доноров циркулирует преимущественно в виде длинных фрагментов (20 и более т.п.н., рисунок 3.1.6). При усилении процесса апоптоза в организме вкДНК При анализе вкДНК с помощью электрофореза можно наблюдать "нуклеосомную лесенку", что свидетельствует об усилении процесса апоптоза в клетках [Radic et al., 2013]. Причиной фрагментации хроматина может быть повышенная нуклеазная активность, которую регистрировали на поздней стадии апоптоза [Ярилин, 2001; Ravid et al., 2003]. 127 Появление при электрофорезе вкДНК "нуклеосомной лесенки" наблюдают при заболеваниях, сопровождающихся повышенным апоптозом: у больных ревматоидным артритом, бронхиальной астмой, при онуологических заболеваниях [Radic et al., 2013; Gonzalez-Masia et al., 2013; Pinzani et al., 2010]. ВкДНК плазмы крови облученных лиц может циркулировать в крови в виде длинных фрагментов (рисунок 3.1.6), однако может наблюдаться и существенное увеличение содержания коротких фрагментов, соответствующих моно- и олигонуклеосомам (рисунок 3.1.6) [Костюк с соавт., 2008; Ermakov et al., 2008]. Поскольку мы наблюдали увеличение нуклеазной активности в выборке облученных лиц, апоптотические фрагменты являются, вероятно, результатом повышенной активности нуклеаз [Ermakov et al., 2008]. Рисунок 1.1.6. Образцы электрофореграмм фрагментов внДНК плазмы крови в 1% агарозном геле. Представлены примеры электрофореграмм образцов вкДНК, полученных из среды облучённых и необлучённых клеток, слева цифрами указана длина фрагментов [Ermakov et al., 2008]. При повышенной нуклеазной активности наиболее важным свойством, отличающим вкДНК от гДНК должно быть содержание во вкДНК плазмы крови последовательностей, которые обладают повышенной устойчивостью к возникновению двунитевых разрывов при действии клеточных и внеклеточных эндонуклеаз. Устойчивость к фрагментации будет приводить к накоплению этих последовательностей в составе вкДНК, по сравнению с их содержанием в составе клеточной (геномной ДНК). 3.1.3. Концентрация повторяющихся последовательностей генома человека в плазме крови В основе поиска устойчивых к двунитевой фрагментации последовательностей ДНК лежит информация, полученная из работ, в которых было впервые показано увеличение содержания ГЦ-пар в составе вкДНК облученных крыс [Vasilyeva, 2001] и больных системной красной волчанкой (СКВ) [Van Helden, 1985]. Факт накопления ГЦ- 128 обогащенных фрагментов в составе вкДНК затем был подтвержден в большом количестве исследований [Li and Steinman, 1989; Sano and Morimoto, 1982; Peters and Pretorius, 2012; Suzuki et al., 2008; Chan et al., 2005]. Содержание ГЦ-обогащенных фрагментов во вкДНК варьирует от 30,5% до 74,8%, среднее значение 53,7%, в то время как одержание ГЦфрагментов в ДНК ядер клеток составляет 38% [Chan et al., 2005; Sano and Morimoto, 1982]. Одной из причин накопления ГЦ–ДНК в составе вкДНК может являться повышенная устойчивость ГЦ–ДНК к фрагментации при накоплении в цепях однонитевых разрывов ДНК [van der Vaart and Pretorius, 2008; Peters and Pretorius, 2012; Suzuki et al., 2008]. Эта устойчивость обусловлена большей энергией связи оснований в ГЦ–паре по сравнению с АТ- парой, в результате чего конкатемерные структуры в ГЦ– ДНК (участки ДНК, содержащие однонитевые разрывы в цепях) имеют более высокую температуру плавления, чем в АТ-ДНК [van der Vaart and Pretorius, 2008]. Cформулированы следующие требования к последовательности, определяющей основные отличия вкДНК от ДНК ядер клеток: - это должна быть ГЦ – богатая последовательность, с повышенной температурой плавления; - последовательность должна быть представлена в геноме в виде повтора, который можно было бы легко определять количественно; - для количественного определения этой последовательности должен быть разработан метод, который, в отличие от ПЦР, не обладает повышенной чувствительностью к повреждениям ДНК - мишени. В литературе приводятся доказательства того, что метод ПЦР дает очень заниженные результаты при определении концентрации вкДНК [Fleischhacker and Schmidt, 2007]. При анализе содержания нескольких повторяющихся последовательностей генома человека в составе ДНК, которая содержит одно- и двунитевые разрывы, ранее было показано, что рибосомный повтор человека, а именно его транскрибируемая область, проявляет повышенную устойчивость к образованию двунитевых разрывов ДНК и удовлетворяет всем перечисленным требованиям [Вейко и Спитковский, 2001]. Рибосомный повтор человека локализован в геноме на 5 парах акроцентрических хромосом в виде тандемных повторов [Hamperl et al., 2013]. Геном человека содержит 300 – 700 копий рибосомного повтора (среднее 420 копий на диплоидный геном) [Вейко с соавт., 2003]. Общая длина рибосомного повтора – 42999 п.н., при этом он состоит из двух частей – транскрибируемой области длиной 13 314 п.н., содержащей гены 18S, 5,8S, 28S рРНК и нетранскрибируемого спейсера [Вейко с соавт., 2001]. Участки 129 транскрибируемой области рибосомного повтора содержат от 60 до 85% GC- пар, что позволяет предположить высокую температуру плавления этой структуры [Вейко с соавт., 2001]. Большинство копий рибосомного повтора в геноме человека не содержат метилированных оснований цитозина в транскрибируемой области [Вейко с соавт., 2003; Hamperl et al., 2013]. Для оценки количественного содержания рибосомного повтора был разработан метод нерадиоактивной гибридизации на мембранах [Вейко Н.Н. с соавт., 2003]. Этот метод мало подходит для анализа уникальных последовательностей генома вследствие более низкой чувствительности, чем ПЦР, но при анализе повторов, таких, как рибосомный повтор, этот метод дает хорошо воспроизводимые результаты [Вейко Н.Н. и соавт., 2003]. Метод нерадиоактивной количественной гибридизации подробно описан в главе «материалы и методы» и обладает рядом преимуществ по сравнению с методом ПЦР при анализе матрицы вкДНК, поврежденной активными формами кислорода (АФК), (рисунок 3.1.7). [Fleischhacker and Schmidt, 2007]. Рисунок 3.1.7. Сравнение двух методов анализа содержания ТОрДНК в поврежденных образцах ДНК. А – (1) Длины фрагментов образцов гДНК. Интакный образец (дорожка 1), ДНК окислена метиленовым синим (дорожка 2) и пероксидом водорода при облучении 321 нм (дорожка 3). (2) - Определение содержания рДНК методом ПЦР. В рамке приводится содержание в образцах маркера окисления 8-oxodG, определенное методом масс-спектрометрии. Б – Определение содержания ТОрДНК в геномной ДНК, выделенной из молодых (5 пассаж) и старых (достигших предела Хейфлика) фибробластов кожи взрослых людей (три различных линии клеток). В рамке указан метод. При патологии и действии ионизирующего излучения очень часто в организме повышается уровень АФК, которые окисляют клеточную ДНК. Поэтому вкДНК при патологии и внешнем воздействии сильно повреждена и является плохой матрицей для фермента Taq-полимеразы. Поскольку метод гибридизации не предполагает применения фермента, то он гораздо менее чувствителен к окислительным повреждениям ДНК и к 130 однонитевым разрывам ДНК (рисунок 3.1.7). На уровень сигнала степень фрагментации ДНК - мишени в широком диапазоне длин фрагментов практически не влияет, в отличие от метода ПЦР [Вейко Н.Н. и соавт., 2003; Костюк с соавт., 2010]. мембраны удерживают Современные фрагменты ДНК длиной от 30 нуклеотидов, а использование длинного зонда позволяет нивелировать наличие окисленных оснований. Таким образом, рибосомный повтор, устойчивый к гидролизу, представленный в геноме в виде повтора, может накапливаться в составе вкДНК плазмы крови облученных лиц в условиях повышенной нуклеазной активности и отражать реальный уровень гибели клеток, в отличие от тотальной вкДНК, содержание которой снижается. 3.1.3.1. ГЦ-богатая последовательность рибосомного повтора накапливается в составе вкДНК Чтобы доказать, что рибосомный повтор накапливается в составе вкДНК методом нерадиоактивной гибридизации были проанализированы 736 образцов вкДНК, выделенных из плазмы крови человека, и 716 образцов геномной ДНК, выделенной из лимфоцитов человека (таблица 3.1). Содержание ТОрДНК, пг/нг (± SE) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Практически здоровые доноры Ишемическая болезнь сердца Ревматоидный артрит Беременность Атеросклероз мозговых артерий Артериальная гипертензия Инсульт Острый инфаркт миокарда Геном человека Ионизирующая радиация 2,9 ± 0,6 18,0 ± 6,1 6,6 ± 0,9 7,0 ± 1,0 16,6 ± 6,5 10,2 ± 3,0 2,2 ± 0,6 9,6 ± 5,7 1,7 ± 0,5 4,8 ± 0,5 Содержание ТОрДНК, относительно генома 1,7 10 4 4 9 6 1,2 5 1 3 N 187 18 14 68 30 64 19 7 716 329 Таблица. 3.1. Определение содержания ТОрДНК в образцах вкДНК человека. * Строка 9: распределение не отличалось от нормального (p > 0,7, критерий Стьюдента). (p< 0,001, критерий Манна-Уитни). Строки 1 – 8 и 10: распределения соднржания рДНК в составе вкДНК отличаются от распределения содержания рДНК в составе вкДНК (p<< 0,0001, критерий Манна-Уитни, строки 1 – 8; статистика Колмогорова- Смирнова, α << 10-10). Источники ДНК: 1 - Коллекция образцов вкДНК плазмы здоровых людей (МГНЦ РАМН); 2, 8 - Образцы плазмы получены из клинической больницы РАН; 3 -Образцы плазмы получены из НИИ Ревматологии РАМН; 4 - Коллекция образцов вкДНК 131 беременных женщин (МГНЦ РАМН); 5, 6, 7 – Образцы получены из НИИ Неврологии; 9 Коллекция образцов ДНК здоровых людей (МГНЦ РАМН); 10 - Образцы плазмы получены из Медицинского радиологического научного центра РАМН, Обнинск РФ, ФЭИ, г. Обнинск и РФЯЦ-ВНИИЭФ, г. Саров, Россия. Выборка образцов вкДНК включала образцы вкДНК плазмы крови: практически здоровых лиц (строка 1, таблица 3.1); больных ишемической болезнью сердца и ревматоидным артритом с хроническим, неострым течением заболеваний (строки 2 и 3); пациентов с атеросклерозом сосудов головы и артериальной гипертензией (строки 5 и 6); беременных женщин (1 триместр беременности, строка 4); больных острым инфарктом миокарда на фоне хронической ишемической болезни сердца и инсультом в острой фазе течения заболевания (строки 7 и 8). Кроме того, подробно проанализированы образцы вкДНК лиц, которые работают с источниками рентгеновского излучения, получая небольшие дозы радиации в течение продолжительного времени (строка 7). ВкДНК выделяли из плазмы периферической крови и гДНК выделяли из лейкоцитарной массы, применяя стандартный метод фенольной экстракции [Chomczynski and Sacchi, 1987; Gormally et al., 2006]. Содержание в составе вкДНК и гДНК ГЦ-богатой, устойчивой к двунитевым разрывам транскрибируемой области рибосомного повтора (рДНК) исследовали методом нерадиоактивной количественной гибридизации [Вейко c соавт., 2003]. Для определения количества рДНК использовали зонд pHRGBB-28S, содержащий клонированный фрагмент гена 28S рРНК. Мы показали, что процесс накопления рДНК в составе вкДНК по сравнению с геномной ДНК – общебиологическое явление, которое происходит и в норме, и при патологии. Все случаи, приведенные в строках 2-6 таблицы, характеризуются сравнительно небольшим, но хроническим повышением уровня гибели клеток в организме, который, однако, не сопровождается увеличением общей концентрации вкДНК плазмы крови. В группе здоровых доноров (167 человек) содержание рДНК в гДНК варьировало от 0,82 до 2,99 пг/нг общей ДНК (среднее 1,72 ± 0,50 пг/нг), в группе больных (строки 2 -8 таблицы 3.1, N=220) и облученных (N = 329) содержание рДНК варьировало от 0,83 до 3,98 пг/нг (среднее 1,73 ± 0,45 пг/нг). Все распределения не отличались от нормального и с высокой вероятностью не отличались между собой (p > 0,7, критерий Стьюдента). Наиболее информативным показатель накопления ГЦ-богатой рДНК может быть в условиях снижения концентрации вкДНК при высокой активности нуклеаз крови, т.е. в выборке лиц, длительное время контактировавших с ИИ. ВкДНК была выделена из 132 образцов плазмы периферической крови 329 человек, подвергавшихся профессиональному хроническому воздействию ионизирующего излучения и плазмы крови 187 здоровых доноров. Распределения содержания рДНК в циркулируюшей вкДНК в контрольной группе и группе облученных доноров отличались от нормальных распределений, значительно отличались от соответствующих распределений содержания рДНК в геномной ДНК (статистика Колмогорова-Смирнова, α << 10-10) и различались между собой (рисунок 3.1.8). В контрольной группе лиц содержание рДНК в циркулирующей вкДНК варьировало от 0,7 до 14 пг/нг общей ДНК (медиана 2,9 пг/нг), в группе облученных содержание рДНК варьировало от 0,4 до 400 пг/нг (медиана 4,8 пг/нг). Рисунок. 3.1.8. Распределение содержания рДНК в составе циркулирующей ДНК в образцах плазмы крови групп облученных и контрольных лиц. Распределения статистически значимо различаются между собой (статистика КолмогороваСмирнова, α << 10-10) При хронических процессах содержание рДНК в составе вкДНКможет возрастать в несколько раз по сравнению с содержанием рДНК во вкДНК здоровых людей (p<< 0,0001, критерий Манна-Уитни). Так, при хроническом течении ишемической болезни сердца и ревматоидного артрита содержание рДНК во вкДНК превышала содержание в гДНК в 10 и 4 раза соответственно (таблица 3.1) [Вейко с соавт., 2007]. При атеросклерозе сосудов головы и артериальной гипертензии содержание рДНК повышено в 16 и 10 раз по отношению к содержанию рДНК в гДНК. В первом триместре беременности содержание рДНК во вкДНК превышает содержание рДНК в гДНК в 7 раз. Острый инфаркт миокарда на фоне хронической ишемической болезни сердца характеризуется высоким содержанием рДНК во вкДНК (в 9,6 раз превышающим 133 содержание рДНК в гДНК) на фоне высоких значений активности ДНКазы 1 (p<< 0,0001, критерий Манна-Уитни). При остром инсульте содержание рДНК во вкДНК в 1,2 раза выше, чем в гДНК, но не превышает значений рДНК во вкДНК выборки здоровых доноров (p< 0,01, критерий Манна-Уитни). Таким образом, в составе циркулирующей ДНК накапливается ГЦ-богатая последовательность рДНК. Рибосомный повтор может рассматриваться в качестве потенциального, сравнительно устойчивого, биомаркера гибели клеток, который можно использовать при анализе циркулирующей ДНК на фоне очень высоких значений эндонуклеазной активности крови. Причем содержание рДНК особенно высоко в циркулирующей ДНК плазмы крови у значительной части облученных людей. Мы полагаем, что накопление рДНК есть следствие повышенной устойчивости ГЦ-богатых последовательностей генома к фрагментации при накоплении однонитевых разрывов ДНК, в результате гидролиза фосфодиэфирной связи эндонуклеазами крови Если этот механизм реально работает in vivo, то, наряду с обогащением циркулирующей ДНК ГЦ-богатыми повторами генома, мы должны зафиксировать снижение содержания на единицу веса циркулирующей ДНК последовательностей, не обогащенных ГЦ - парами. 3.1.3.2. Содержание АТ-богатой последовательности генома в циркулирующей вкДНК плазмы крови лиц, подвергавшихся профессиональному хроническому воздействию ионизирующего излучения снижено по сравнению с контрольной группой В качестве последовательности, не обогащкнной ГЦ – парами, мы выбрали повтор, входящий в состав субфракции сателлита III, который локализован в прицентромерном районе 1q12 первой хромосомы человека (СатIII) и представлен в геноме несколькими тысячами копий [Richard et al., 2008]. Данный фрагмент клонирован в вектор pBR322. Вставка содержит 60,5 % АТ-пар и гибридизуется in situ только с участком 1q12. Для анализа содержания этого повтора в геномной и циркулирующей ДНК мы применили тот же метод нерадиоактивной количественной гибридизации, что и в случае анализа рДНК [Вейко с соавт., 2003]. Для определения количества СатIII использовался зонд рRt301, содержащий клонированный фрагмент субфракции сателлита 3 [Томилин и соавт., 1984]. Распределения содержания СатIII в составе гДНК 329 человек, подвергавшихся профессиональному хроническому воздействию ионизирующего излучения и плазмы крови 109 здоровых доноров не отличались от нормального и с высокой вероятностью не отличались между собой (p > 0,5, критерий Стьюдента). В контрольной группе лиц 134 содержание СатIII в геномной ДНК варьировало от 9 до 33 пг/нг общей ДНК (среднее 21 ± 5 пг/нг), в группе облученных содержание СатIII варьировало от 10 до 40 пг/нг (среднее 24 ± 6 пг/нг). Распределения содержания СатIII в циркулируюшей вкДНК в группе облученных (N=329) и в контрольной группе (N=109) отличались от нормальных распределений, значительно отличались от соответствующих распределений содержания СатIII в геномной ДНК (статистика Колмогорова-Смирнова, α << 10-7) и различались между собой (рисунок 3.1.9). В контрольной группе лиц содержание СатIII в циркулирующей вкДНК варьировало от 1,2 до 84 пг/нг общей ДНК (медиана 19 пг/нг), в группе облученных содержание SatIII варьировало от 0,01 до 124 пг/нг (медиана 6 пг/нг). Рисунок 3.1.9. Сравнение содержания СатIII в составе циркулирующей ДНК плазмы крови в исследуемых выборках: контрольной и лиц, облученных ИИ. Распределеня различаются между собой (статистика Колмогорова-Смирнова, α << 10-7). Таким образом, увеличение содержания ГЦ - богатой последовательности генома (ГЦ–ДНК) в составе циркулирующей внеклеточной ДНК плазмы периферической крови является маркером хронических неострых процессов в организме, которые сопровождаются увеличением уровня гибели клеток организма, но не приводят к существенному увеличению общей концентрации циркулирующей ДНК. Увеличение уровня гибели клеток, которое тестируется по увеличению содержания в вкДНК фрагментов ГЦ-ДНК, может происходить при хронических заболеваниях, при физиологических состояниях (беременность) и при хроническом действии на организм неблагоприятных факторов окружающей среды, например, радиационном фоне [Костюк с соавт., 2008; Вейко с соавт., 2007]. при повышенном 135 3.1.4. Окислительная модификация вкДНК. Известно, что многие хронические заболевания сопровождаются увеличением степени окисления геномной ДНК [Roszkowski et al., 2014; Ermakov et al., 2013; Collado et al., 2011; Haider et al., 2011; Yurdakul et al., 2011; Yen et al., 2004]. В условиях окислительного стресса в той или иной степени способны окисляться все основания ДНК [Rodriguez et al., 2013]. Основными продуктами окисления клеточной ДНК являются тимидингликоль и 8 - гидрокси - 2'- дезоксигуанозин (8-oxodG), который является широко используемым "маркером" для определения окислительных повреждений ДНК [Russo et al., 2004; Speina et al., 2005]. В составе вкДНК содержание маркера окисления ДНК - 8охоdG достигает 300 и более на миллион нуклеотидов [Loseva et al., 2012]. Особенно высоко содержание 8-охоdG во вкДНК онкологических больных и больных сердечнососудистыми заболеваниями и может достигать 3000 8-oxodG на миллион нуклеотидов [Loseva et al., 2012]. Основная причина обогащения вкДНК маркером окисления 8-oxodG – это преимущественная гибель клеток с высоким уровнем окисления клеточной ДНК и увеличение содержания ГЦ-богатых последовательностей в составе вкДНК по сравнению с ядерной ДНК [Ermakov et al., 2013 Loseva et al., 2012]. Также в окисленную фракцию вкДНК вносит вклад митохондриальная ДНК с повышенным содержанием 8-oxodG [Cossarizza et al., 2011]. Повышение содержания 8-охоdG в составе вкДНК может свидетельствовать об окислительном стрессе в организме. Мы определили уровень 8-охоdG вкДНК больных острым инфарктом миокарда и раком молочной железы. Анализ содержания маркера 8-oxodG в образцах методом массспектрометрии (ESI-MS/MS) проводился старшим научным сотрудником МГНЦ РАМН к.б.н. Г.В.Байдаковой. Количество 8-охоdG в неокисленной гДНК было 0.1 на миллион неокисленных нуклеозидов (нижний порог чувствительности применяемого метода). При избирательном окислении гуанозина до 8-OHdG в ДНК с использованием метиленового синего уровень окисления гуанозина в гДНК возрос до 6500 8-OHdG на миллион неокисленных нуклеозидов (таблица 1.2) [Loseva et al., 2012]. ВкДНК больных острым инфарктом миокарда содержала 2100 8-охоdG на 1 миллион неокисленных нуклеозидов; вкДНК больных раком молочной железы содержала 8000-8200 8-охоdG на 1 миллион нуклеозидов (таблица 1.2) [Loseva et al., 2012]. Эти данные согласуются с данными литературы [Guz et al., 2008; Mangal et al., 2009]. 136 Тип ДНК (1) Не окисленная ДНК (2) Окисленная ДНК Источник ДНК 8-oxo-dG/dG (·104) Среда культивирования HUVEC < 0.001 Среда культивирования МСК < 0.001 Геномная ДНК из HUVEC < 0.001 Среда культивирования первичных маммосфер 2.2 Циркулирующая ДНК из плазмы крови больных раком молочной железы 8.0 8.2 ДНК плазмы больного ОИМ 21 Геномная ДНК окислена метиленовым синим или Н2О2 65 Среда культивирования HUVEC, обработанных Н 2О 2 130 Таблица 3.2. Уровень окисления образцов вкДНК. Кроме того, мы определили, что среда культивирования МСК и HUVEC, полученных от здоровых доноров, содержит минимальное количество 8-оксигуанозина 0.1 на миллион неокисленных нуклеозидов (таблица 1.2) [Loseva et al., 2012]. HUVEC подвергали кратковременному действию Н2О2 с последующей сменой среды и культивированием в течение двух суток, за это время часть клеток погибала и в среде возрастала концентрация вкДНКокси(HUVEC), которая содержала 8-OHdG. Мы определили, что вкДНК из среды HUVEC, в которых индуцирован окислительный стресс, содержит повышенное количество 8-OHdG - 13000 на миллион неокисленных G (таблица 1.2) [Loseva et al., 2012]. Среда культивирования первичных маммосфер, полученных из оперативного матерала пациентов с РМЖ содержит также повышенное количество 8OHdG – 220 (8-OHdG)/106 нуклеотидов (таблица 1.2) [Loseva et al., 2012]. Таким образом, содержание 8-охоdG в составе внеклеточной ДНК может служить маркером окислительного стресса в организме. Поскольку повышенные концентрации вкДНК регистрируются при остро протекающем патологическом процессе, а фрагменты рДНК накапливаются при хроническом процессе повышенной клеточной гибели, в организме должны существовать механизмы, блокирующие фрагменты вкДНК и рДНК в плазме крови. Одним из вариантов защиты является повышенная эндонуклеазная активность, вторым механизмом служит связывание вкДНК антителами. Показано, что вкДНК не является биологически инертной молекулой и может передавать клеткам иммунной системы сигналы «опасности», предупреждая возможное повреждение организма, что вызывает выработку антител к вкДНК [Pisetsky, 2012; Pisetsky and Jiang, 2006]. 137 3.1.5. Фрагменты рДНК, накапливающейся в составе вкДНК, образует в крови комплексы с антителами. Поскольку в организме человека присутствуют антитела к вкДНК [Pisetsky, 2012; Pisetsky and Jiang, 2006], мы предположили, что поскольку в составе вкДНК накапливаются фрагменты рДНК, в организме могут образовываться антиткла к рДНК [Вейко с соавт., 2007] Поиск антител к фрагментам рДНК в сыворотке мы проводили с использованием варианта ИФА на ДНК-связывающих мембранах (рисунок 3.1.10). Рисунок 3.1.10. В сыворотке здоровых доноров присутствуют антитела к рДНК, отличающиеся от антител к вкДНК больных СКВ. А. Образцы ДНК нанесены на 4 фильтра (1 – 4) в трех повторах (60 нг/пятно). ss – одноцепочечная ДНК (денатурированная), ds – двуцепочечная ДНК (нативная). Сывороткой больного СКВ обрабатывали фильтры 1, 3; сывороткой здорового донора – фильтры 2, 4 (разведение сывороток – 1:200). Фильтры 3, 4 отмывали солевым раствором, фильтры 1, 2 – нет. Б. Средние интенсивности пятен на фильтрах 1 и 2. Красные столбики – фильтр обработан сывороткой больного СКВ (фильтр 1), зеленые – фильтр обработан сывороткой хдорового донора (фильтр 2). Одинаковое количество денатурированной и нативной рДНК и гДНК человека наносили на фильтр, обрабатывали сывороткой здоровых доноров и больных СКВ (системной красной волчанкой), комплекс Аг-Ат выявляли с помощью вторичных антителами к иммуноглобулину G, конъюгированных с пероксидазой [Вейко с соавт., 2007]. При обработке фильтрв сывороткой больного СКВ (рисунок 3.1.10, фильтр 1) для 138 всех образцов ДНК регистрировали одинаковые сигналы (рисунок 3.1.10 Б, красные столбики) – эти данные согласуются с литературными о наличии в сыворотке больного СКВ аД-аутоантител, узнающих конформацию ДНК, независимо от последовательности оснований [Pisetsky and Jiang, 2006; Pisetsky et al., 2012]. Отмывка фильтра раствором с высокой ионной силой сигналы уменьшаются, причем в большей степени снижается интенсивность сигналов на геномной ДНК (рисунок 3.1.10 А, фильтр 3) [Вейко с соавт., 2007]. При обработке фильтра сывороткой здоровых людей мы обнаружили сильные сигналы на образцах рДНК и слабые сигналы на денатурированной геномной ДНК (рисунок 3.1.10 А, фильтр 2) [Вейко с соавт., 2007]. Сигналов на образцах гДНК не появлялось при отмывке фильтра 1,5 M NaCl (рисунок 3.1.10 А, фильтр 4). Присутствие в сыворотке здоровых доноров антител, специфичных к рДНК, подтвердили методом ELISA на полистирольных планшетах, обработанных протамин сульфатом [Вейко с соавт., 2007]. Чтобы подтвердить специфичность антител к фрагментам вкДНК, образующихся в сыворотке здоровых доноров, мы нанесли на фильтр 8 образцов двуцепочечной ДНК (рисунок 3.1.11): п(рДНК) и 28SрДНК (вектор pBR322, вставки: участки рДНК (HSU 13369, GeneBank) от -515 до 5321 в п(рДНК) и 9346 – 10783 в 28SрДНК), pUC19, pBR322, р601 (последовательность кластера гистоновых генов (Н2А, Н2В, Н3 и Н4) в pBR322), геномная ДНК человека, ДНК фага лямбда и ДНК E.coli [Вейко с соавт., 2007]. Рисунок 3.1.11. Интенсивность сигналов, полученных при обработке сывороткой больного СКВ (черные столбики) и сывороткой здорового донора (зеленые столбики) (в разведении 1: 200) 8 образцов ДНК (100 нг). Образцы наносились на один фильтр в трех повторах [Вейко с соавт., 2007]. 139 Все 8 образцов ДНК связываются с аД-антителами сыворотки больного СКВ (рисунок 3.1.11) – отмечаются сигналы высокой интенсивности для всех образцов ДНК. Только два образца – п(рДНК) и ДНК E.coli дают воспроизводимый сигнал при обработке сывороткой здоровых доноров (рисунок 3.1.11). Таким образом, обнаруженные антитела специфично нарабатываются в организме в ответ на присутствие ГЦ-обогащенных последовательностей рДНК [Вейко с соавт., 2007]. Антитела в сыворотке больного СКВ обладают более широкой специфичностью по сравнению с антителами сыворотки здорповых доноров. Это подтвердили в экспериментах по конкурентному связыванию аД-антител с ДНК-антигеном на фильтре и в растворе (рисунок 3.1.12) [Вейко с соавт., 2007]. Рисунок 3.1.12. Конкурентное связывание аД-антител сыворотки больного СКВ (А) и сыворотки здорового донора (Б) с ДНК-антигеном на фильтре и в растворе. В – интенсивность сигнала при обработке фильтров с нанесенными образцами сывороткой больного СКВ (разведение 1:200) без предварительного инкубирования с антигеном фильтр А (1), синие столбики и с предварительной обработкой pBR322 (100 мкг/мл) – фильтр А (2), желтые столбики. Г - интенсивность сигнала при обработке фильтров с нанесенными образцами сывороткой здорового предварительного инкубирования с антигеном донора (разведение 1:200) без - фильтр Б (1), синие столбики и с предварительной обработкой pBR322 (100 мкг/мл) – фильтр Б (2), желтые столбики. В качестве конкурирующей последовательности за связывание с аД-антителами использовали pBR322 или ДНК человека. На фильтры наносили образцы ДНК: pBR322, ДНК E.coli и п(рДНК) (40 нг/пятно). Фильтры инкубировали в присутствии pBR322, затем 140 обрабатывали или сывороткой больного СКВ, или сывороткой здорового донора (рисунок 3.1.12) [Вейко с соавт., 2007]. При инкубировании иммобилизованных на фильтре образцов ДНК с pBR322 и последующей обработке сывороткой больного СКВ интенсивность сигнала уменьшается, что свидетельствует об уменьшении количества комплексов ДНК - аД-антитело (рис 3.1.12 В, А, фильтр 2), слабый по интенсивности сигнал регистрируется образцах прДНК) и ДНК E.coli, но не на pBR322. При обработке фильтров сывороткой здоровых доноров после предварительного инкубирования с pBR322 интенсивность сигналов на п(рДНК) и ДНК E.coli. снижалась незначительно (рисунок 3.1.12 Б, фильтр 4, Г), т.е. pBR322 не является конкурентом для п(рДНК) и ДНК E.coli за связывание с аД-антителами. Аналогичную картину мы регистрировали при использовании в качестве конкурирентной последовательности геномную ДНК. Эти эксперименты подтверждают наличие в сыворотке здоровых доноров специфичных антител к рДНК и ДНК E.coli. Основная часть аД-антител в сыворотке больных СКВ связывается с эпитопами ДНК с определенной конформацией ДНК, независимо от последовательности оснований [Вейко с соавт., 2007]. А также в сыворотке больных СКВ присутствуют специфичные антитела к рДНК и ДНК E.coli, аналогичные антителам, обнаруженным у здоровых доноров, поскольку не до конца снижался сигнал на этих образцах в присутствии конкурирующей ДНК [Вейко с соавт., 2007]. На рисунок 3.1.13 А приводятся зависимости интенсивности сигнала от количества рДНК в пятне, полученные для разных разведений сыворотки [Вейко с соавт., 2007]. Для количественной оценки взаимодействия аД-антител с рДНК использовали упрощенную модель, в которой взаимодействие антиген - антитело рассматривается как гомогенный, равновесный, одноступенчатый процесс с однородной степенью связывания, что позволяет применить уравнение Скэтчарда [Пол, 1989]. Нижние значения константы ассоциации (Касс) комплекса аД-антител с п(рДНК) 5х109 М-1 [Вейко с соавт., 2007]. При прогреве сыворотки (55°С, 30мин.) Касс не изменялась. Предварительная обработка сыворотки ДНКазой 1 и последующая инактивация фермента прогреванием, приводит к увеличению сигнала в среднем в 1,4 раза (рисунок 3.1.13). Следовательно, антитела к рДНК в сыворотке здоровых доноров могут присутствовать как в свободном виде, так и связаными с фрагментами внеклеточной ДНК. 141 Рисунок 3.1.13. Определение константы ассоциации антител в сыворотке здорового донора с рДНК. А - Зависимость интенсивности сигнала от количества ДНК в пятне, полученная при разных разведений сыворотки. Каждое значение – средняя интенсивность пяти пятен ДНК. SD = 10 ± 5 %. Б - Зависимость сигнала от количества рДНК в пятне (Б), полученная для интактной ( ) и обработанной ДНКазой1 ( ) сыворотки (разведение 1: 400) [Вейко с соавт., 2007]. 3.1.5.1. Титры антител к рДНК в выборке облученных лиц выше, чем в контрольной Мы определили титр антител к рибосомному повтору в двух выборках – лиц, контактировавших с источниками ионизирующего излучения (N=329) и контрольной (N=109). Для определения титра антител в качестве мишени на планшет наносили линеаризованную плазмиду п(рДНК), содержащую вектор pBR322 и вставку - фрагмент транскрибируемой области рибосомного повтора длиной 5,4 т.п.н. Данный фрагмент определяет как антитела широкой специфичности к ДНК, которые малочувствительны к последовательности оснований, так и антитела, связывающиеся с ГЦ-богатыми фрагментами, причем комплексы, образуемые специфичными антителами к рДНК с фрагментами вкДНК более прочные, чем аД-антитела - ДНК. Об уровне антител к рДНК можно судить, проанализировав отношение сигнала, получаемого при использовании в иммуноферментном анализе в качестве мишени рДНК к сигналу, получаемому при использовании в качестве мишени геномную ДНК. На рисунок 3.1.14 приводятся распределения титра антител к рДНК в исследуемых выборках. 142 Рисунок 3.1.14. Определение титра антител к рДНК в выборке облученных лиц и в контрольной. Распределение отношений титров ДНК к рДНК и к геномной ДНК различаются между собой (статистика Колмогорова-Смирнова, α < 0,001). Титры антител к рДНК в выборке облученных выше, чем в контрольной. Распределения достоверно различаются между собой (α < 0,001). Перечисленные выше свойства вкДНК делают ее не только значимым маркером при патологии, но и определяют ее выраженную биологическую активность. Мы исследовали 2 свойства вкДНК, которые превращают ее из инертной в биологически активную молекулу: 1. Повышенное содержание ГЦ-богатой рДНК в составе вкДНК. 2. Повышенный уровень окислительных модификаций вкДНК. Варьирование этих свойств и концентрации вкДНК позволило выявить выраженную биологическую активность вкДНК в отношении культур клеток человека. 143 3.2. ВЛИЯНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ГЕНОМА ГИСТОЛОГИЧЕСКИ РАЗЛИЧНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА С РАЗНЫМ ПРОЛИФЕРАТИВНЫМ ПОТЕНЦИАЛОМ. 3.2.1. Общая схема эксперимента Для изучения влияния вкДНК на активность транскриптома МСК использовали 17 клеточных линий МСК (1-3 пассаж), охарактеризованных по ряду СД-маркеров (таблица 3.2.1) [Loseva et al., 2012; Kostjuk et al., 2012]. В среде культивирования МСК присутствуют фрагменты собственной вкДНК в концентрации 5 ± 4 нг/мл, уровень маркера окисления 8-oxodG в составе вкДНК культур МСК не превышает 0,01 8-oxodG на 106 нуклеозидов (таблица 3.2.2) [Loseva et al., 2012]. В среду культивирования МСК добавляли различные образцы ДНК (табл.3.2.3) в концентрации 10 - 250 нг/мл и анализировали ранний ответ (до 24 часов культивирования) и поздний ответ (свыше 3-х суток). Для изучения влияния вкДНК на транскриптом и функциональную активность клеток эндотелия использовали 9 культур эндотелиальных клеток пупочной вены человека – HUVEC (human umbilical vein endothelial cell), полученных из образцов пуповины здоровых доноров (нормально протекающие беременности, благополучные роды, здоровые новорожденные) [Ermakov et al., 2010; Alekseeva et al., 2010; Kostyuk et al., 2012]. В экспериментах использовали субконфлуентные культуры не старше 4 пассажа (однородность слоя клеток сопоставима со слоем клеток в сосудах) [Kostyuk et al., 2012]. Клетки культивировали в стандартных условиях в отсутствие дополнительных стрессирующих факторов. Концентрация фрагментов собственной внеклеточной ДНК в среде культивирования – в среднем 10 ± 4 нг/мл, что составляет 1,4% от всей ДНК ядер клеток [Kostyuk et al., 2012]. Уровень маркера окисления 8-oxodG в составе вкДНК HUVEC не превышал 0,01 8-oxodG на 106 нуклеозидов [Loseva et al., 2012]. В среду культивирования HUVEC добавляли образцы ДНК с разными свойствами в концентрации 5 - 250 нг/мл и анализировали ответ через 0,5 -72 часов. Для исследования действия вкДНК на функциональную активность генома лимфоцитов периферической крови человека клетки лимфоидного ряда были выделены из свежей крови здоровых доноров в течение 1 часа после забора крови с помощью фиколверографина [Ермаков с соавт., 2008; Ermakov et al., 2009]. Действие вкДНК исследовалось на выделенных de novo лимфоцитах человека без пересева и смены среды [Ermakov et al., 2009]. Образцы ДНК с различными свойствами добавляли к 144 инкубируемым при 37ºС лимфоцитам в концентрации 50 нг/мл и культивировали в течение 0,5 -24 часов. Исследовали влияние вкДНК на клетки двух линий – фибробласты кожи взрослого человека (HDF – human dermal fibroblasts), культивируемые в течение 16-20 пассажей и эмбриональные фибробласты легкого (HEF – human embryonic fibroblasts), 4-го пассажа [Kostyuk et al., 2013]. Клетки наносили в лунки шестилуночного планшета (30 тыс/лунку), вносили пробы ДНК в концентрации 5 - 200 нг/мл и анализировали показатели через 3 суток [Kostyuk et al., 2013]. Влияние вкДНК на культуру раковых клеток – аденокарциномы молочной железы – MCF-7 исследовали после внесения в среду культивирования образцов вкДНК в концентрации 5-200 нг/мл [Kostyuk et al., 2013]. Среда культивирования MCF-7 содержит высокий уровень собственной эндогенной вкДНК (140 ± 4 нг/мл) [Kostyuk et al., 2013]. Эффекты вкДНК на MCF-7 исследовали спустя 30 минут – 48 часов инкубации клеток с фрагментами вкДНК. 3.2.2. Характеристика культивируемых клеток Различные аспекты биологического действия вкДНК исследовались на гистологически различающихся культивируемых клетках с разным пролиферативным потенциалом: 1. Недиференцированные клетки: А - Мезенхимные стволовые клетки (N=17), полученные из различных источников и охарактеризованные по поверхностным маркерам (тпблица 3.2.1) [Loseva et al., 2012]. N Клетки Источник Поверхностые маркеры 1 МСК ЖТ(*) (N=9) Жировая ткань молочных желез CD34 – , CD45 –, HLA-ABC+, HLA-DR –, CD44 +, CD29 +, CD49b low, CD54 low, CD90 +, CD106 –, CD105+, CD117– . 2 МСК(*) (N=5) Пуповинная кровь и вена пупопины CD34 –, CD45 –, HLA-ABC+, HLA-DR –, CD44 +, CD29 +, CD90 +, CD105+, CD117– . 3 МСК(**) (N=2) Дельтовидная мышца CD34–, CD45–, HLA-ABC+, HLA-DR–, CD15+, CD13+, CD56–, CD133–, CD90+, CD106–, CD105+, CD117-. 4 МСК (hMADs) (**) (N=1) Жировая ткань CD34–, CD15–, HLA-ABC low, HLA-DR–, CD44+, CD13+, CD49b+, CD133–, CD90+, CD105+ ,CD117–. Таблица 3.2.1 Характеристика МСК, используемых в работе, по поверхностным маркерам. (*) – коллекция клеточных культур ФГБУ «МГНЦ» РАМН, (**) – образцы МСК получены из коллекции клеток Университета Ниццы — София Антиполис, Ницца, Франция. 145 Исследование экспрессии клетками поверхностных белков проводили методом проточной цитофлюоримертии с использованием соответствующих антител на приборе CyFlow (PARTEC, Германия) [Loseva et al., 2012]. Материал для выделения МСК нормальная жировая ткань операционного материала больных с аденокарциномой молочной железы, доставленная из РОНЦ РАМН в течение часа после резекции опухоли (1), материал вены пуповины и пуповинная кровь, предоставленные кафедрой акушерства и гинекологии РГМУ им. Пирогова (2). МСК, предоставленые из коллекции Университета София Антиполис, Ницца, Франция — дельтовидная мышца (3) и подкожная жировая ткань [Loseva et al., 2012]. Было показано, что на поверхности всех МСК присутствуют молекулы ГКГ (главного комплекса гистосовместимости): HLA-ABC +, молекулы адгезии:CD44 +, CD54 (low), CD90 +, CD106 + , интегрины CD29 +, CD49b (low), ростовые факторы: CD105 (low), но отсутствуют маркеры гемопоэтических клеток CD34 -, CD45 -, HLA-DR – и маркер к CD117 -. Полученный профиль (табл. 3.2.1) характерен для МСК [Костюк c соавт., 2012]. Кроме того, клетки в присутствии соответствующего индуктора дифференцировались в адипоциты [Костюк c соавт., 2012]. Б - CD34+ клетки костного мозга (N=2), охарактеризованные по маркеру CD34-. CD34+ клетки костного мозга относят к наименее дифференцированной популяции [Faridi et al., 2013]. Считается, что CD34+ клетки содержат ГСК (гемопоэтические стволовые клетки), они обладают высокой гемопоэтической активностью и терапевтическим потенциалом [Vrtovec et al., 2013]. Клетки предоставлены ФБГУ "НИИР им. В. А. Насоновой" РАМН. 2. Дифференцированные клетки: А – Культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека – HUVEC (N=7), получены из 9 различных образцов вены пуповины (нормально протекающие беременности, благополучные роды, здоровые новорожденные) [Ermakov et al., 2011]. Материал для выделения HUVEC предоставлен кафедрой акушерства и гинекологии РГМУ им. Пирогова. Клетки HUVEC охарактеризованы по маркеру CD31+. Б - Фибробласты кожи взрослого человека (HDF) (N=4), полученные из коллекции клеточных культур ФГБУ «МГНЦ» РАМН [Kostyuk at al., 2013]. В - Эмбриональные фибробласты легкого (HEF) (N=3), полученные из коллекции клеточных культур ФГБУ «МГНЦ» РАМН [Kostyuk at al., 2013]. Г – Лимфоциты периферической крови здоровых доноров (N=21). Лимфоциты выделялись из периферической крови здоровых людей, от которых было получено 146 информированное согласие. Биологическое действие вкДНК исследовалось на первичных культурах лимфоцитов [Ermakov et al., 2008]. Д – Лимфоциты периферической крови трех больных СКВ в период обострения заболевания (N=3). Клетки предоставлены ФБГУ "НИИР им. В. А. Насоновой" РАМН. Е – Мононуклеары костного мозга (N=3). Клетки предоставлены ФБГУ "НИИР им. В. А. Насоновой" РАМН. Мононуклеарами, выделенными из костного мозга, называют круглые одноядерные клетки лимфоидного характера с круглым или овальным ядром и с цитоплазмой, лишенной специфической зернистости [Сергеевичев с соавт., 2010]. Во фракцию мононуклеаров входят лимфоциты, моноциты, лимфобласты, миелобласты, плазматические клетки. 3. Раковые клетки. А - Клетки аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 - получены из коллекции клеточных культур ФГБУ «МГНЦ» РАМН. На поверхности клеток MCF-7 присутствовали характерные молекулы эстрогенового рецептора (ER+) [Lv et al., 2013]. 3.2.3. Характеристика образцов вкДНК и модельных фрагментов На основании выводов, сделанных при изучении свойств вкДНК, определили наиболее значимые характеристики вкДНК, которые могут вызывать биологические ответы клеток разных типов: (1) высокая общая концентрация вкДНК [Костюк с соавт., 2013]; (2) увеличенное содержание ГЦ-ДНК в составе вкДНК, в частности, повышенное содержание рДНК во вкДНК [Вейко с соавт., 2006; Костюк с соавт., 2013]; (3) увеличенное содержание окисленных фрагментов ДНК [Loseva et al., 2012]. Для изучения ответа клеток разных типов на присутствие вкДНК использовали: 1. Образцы циркулирующей вкДНК здоровых доноров и больных людей. Образцы вкДНК были выделены из плазмы крови: − больного гипертонией 1-й степени без признаков атеросклероза (I); − трех больных ишемическим инсультом, который развился на фоне выраженного атеросклероза сосудов (II, III и IV) [Костюк с соавт., 2010]; − 20 больных острым инфарктом миокарда (ОИМ), которому предшествовала ишемическая болезнь сердца (ИБС); − четырех больных раком молочной железы (РМЖ) 3-ей степени; − восьми больных ревматоидным артритом и − трех больных системной красной волчанкой (СКВ) в стадии обострения. В составе вкДНК I - IV определено содержание двух ГЦ - богатых повторов генома – рибосомного и теломерного [Костюк с соавт., 2010]. В составе вкДНК образца I 147 содержится меньше ГЦ - рДНК, чем в составе вкДНК образцов II-VI (рисунок3.2.1) [Костюк с соавт., 2010]. Все образцы вкДНК были охарактеризованы по содержанию рДНК и степени окисления. ВкДНК больных острым инфарктом миокарда и раком молочной железы содержали большое количество окисленных dG (400-2100 8охоdG/106 нуклеозидов и 8000-8200 8-охоdG/106, соответственно) [Loseva et al., 2012]. Во всех образцах отмечался повышенный уровень ГЦ-богатой рДНК. Образцы вкДНК больных острым инфарктом миокарда и раком молочной железы имели в 1,7 – 4,5 раз повышенное содержание рДНК, в образцах больных РА и СКВ содержание рДНК было повышено в 5 – 14 раз. Рисунок 3.2.1. содержание двух ГЦ - богатых повторов генома – рибосомного и теломерного в составе вкДНК I - IV (объяснения в тексте). Содержание двух ГЦ – ДНК на единицу веса ДНК определяли методом количественной гибридизации, приведены SE. Для сравнения приводится среднее содержание двух ГЦ – ДНК в геномах 250 человек (±SD), определенное ранее [Костюк с соавт., 2010]. Исследовали зависимость ответа клеток разных типов от концентрации и времени воздействия вкДНК, полученной из разных источников. 2. Образцы вкДНК, выделенные из среды культивирования клеток разного типа: − нормальные культивируемые клетки различного типа; − культивируемые HUVEC, в которых был индуцирован окислительный стресс путем обработки Н2О2 с последующей сменой среды и культивированием в течение двух суток. За это время часть клеток погибала и в среде возрастала концентрация вкДНКокси (HUVEC), которая содержала 8-охоdG (табл. 3.2.2.) [Loseva et al., 2012]. − первичные маммосферы (операционный материал, РМЖ), содержали также повышенное количество 8-охоdG (табл. 3.2.2.) [Loseva et al., 2012]. Мы охарактеризовали вкДНК среды культивирования клеток по содержанию 8oxodG на 106 нуклеозидов последовательности вкДНК. 148 Тип ДНК (1) Не окисленная ДНК (2) Окисленная ДНК Источник ДНК Содержание 8-oxodG на 106 нуклеозидов ДНК < 0.001 < 0.001 220 Среда культивирования HUVEC Среда культивирования МСК Среда культивирования первичных маммосфер Среда культивирования HUVEC, обработанных Н2О2 1300 Таблица 3.2.2. Характеристика образцов вкДНК из среды культивирования разных типов клеток по уровню окисления по 8-oxo-dG. 3. − Модельные фрагменты ДНК: Окисленные формы ДНК. Поскольку вкДНК при патологии и опасных для генома воздействиях содержит повышенное количество окисленных оснований, для исследования действия на разные типы клеток окисленных образцов ДНК были in vitro приготовлены модельные окисленные формы ДНК (табл. 3.2.3) [Loseva et al., 2012]. Использование в эксперименте модельной гДНКокси, окисленной окисленную Н2О2 in vitro исключает действие других возможных факторов, влияющих на свойства вкДНК, таких, как изменение уровня метилирования или изменение содержания различных последовательностей. № Обозначение Содержание 8-oxodG на 106 нуклеозидов ДНК 1 2 3 4 5 гДНК (контроль) ДНКокси1 ДНКокси2 (или ДНКокси) ДНК8-oxodG п(рДНК)окси менее 0,01 400 1400 700 50 000 Таблица 3.2.3. Уровень содержания маркера окисления 8-oxodG в образцах ДНК Условия окисления гДНК выбирали таким образом, чтобы уровень маркера окисления 8-оксигуанозина в окисленной гДНКокси примерно соответствовал реально встречающемуся содержанию 8-оксигуанозина во вкДНК при заболеваниях, которые сопровождаются окислительным стрессом. Мы проанализировали методом массспектрометрии (ESI-MS/MS) содержание 8--оксигуанозина во вкДНК плазмы больных раком молочной железы и острым инфарктом миокарда. На 106 нуклеозидов во вкДНК приходится соответственно 800 и 2100 8-oxodG [Loseva et al., 2012]. Пробы окисленной ДНК для эксперимента были приготовлены 2-мя способами: обработкой образца геномной ДНК 300mM Н2О2/Fe2+/EDTA (гДНКокси 1), или комбинированной обработкой образца гДНК 300mM Н2О2 и ультрафиолетом при длине волны λ = 312 нанометров, что способствует интенсивной деградациии Н2О2 и продукции свободных радикалов (гДНКокси 2) [Kostyuk et al., 2013]. Измерили уровень содержания маркера окисления – 8-oxodG в полученных образцах ДНК методом масс-спектрометрии 149 (ESI-MS/MS) (определение 8-oxodG проводила с.н.с. ФГБУ «МГНЦ» РАМН к.б.н. Г.В.Байдакова) [Loseva et al., 2012]. В интактной гДНК содержание 8-оксигуанозина было ниже пороговой чувствительности анализа, которая составляла 0,1(8-oxodG)/106 нуклеозидов, первый образец гДНКокси 1 содержал ~ 400 (8-oxodG) на 106 нуклеозидов (слабоокисленная ДНК), второй образец гДНКокси 2 содержал ~ 2900 (8-oxodG)/106 нуклеозидов (сильноокисленная ДНК) [Loseva et al., 2012]. При окислении Н2О2 кроме 8-oxodG в молекуле ДНК присутствуют другие окислительные модификации, поскольку Н2О2 являетя неспецифичным окислителем. Окислить ДНК с получением только 8-oxodG можно с помощью метода окисления ДНК метиленовым синим [Buchko et al., 1995]. ДНК, окисленная таким способом (ДНК8-oxodG) содержит только 8-oxodG ~ 700 (8-oxodG)/106 и позволяет выяснить вклад окислительной модификации 8-oxodG в эффекты, вызываемые в клетках окисленной вкДНК. Кроме того, окисляли последовательность п(рДНК), чтобы получить ГЦ_богатую окисленную ДНК, содержащую очень высокий уровень окисления - 50 000/106 [Loseva et al., 2012]. − ГЦ-богатые модельные фрагменты, лиганды и ингибиторы TLR9. Мы определили, что в составе вкДНК при патологии, при беременности и при действии повреждающих факторов накапливаются ГЦ-богатые фрагменты рДНК и снижается количество АТ-богатых фрагментов СатIII. Были сконструированы модельные фрагменты – плазмиды, содержащие в качестве вставок фрагменты рДНК и СатIII. В качестве модельной ГЦ–ДНК использовали CpG – богатый фрагмент транскрибируемой области рДНК (участок от 515 до 5321 в соответствии с HSU13369, GeneBank), встроенный в вектор pBR322 (п(рДНК)), длина последовательности 9504 п.н. [Костюк с соавт., 2010]. В качестве АТ - обогащенной ДНК человека использовали фрагмент 1,77 сателлита III (п(СатIII)) (участок 1q12, хромосомы 1) в векторе рBR322, длина последовательности 5485 п.н. [Костюк с соавт., 2010]. Модельные образцы ДНК подвергали одинаковой дополнительной очистке от липополисахаридов: последовательно проводили обработку тритоном Х-114 [Вейко с соавт., 2006] и гельфильтрацию на носителе HW-85 [Костюк с соавт., 2010]. Компьютерный анализ нуклеотидного состава п(рДНК) выявил в составе рДНК наличие неметилированных CpG –последовательностей - участков связывания с рецептором семейства TLR – TLR9 [Костюк с соавт., 2010]. Провели подробный компьютерный анализ используемых модельных образцов – плазмид на наличие участков связывания с TLR9 и наличие последовательностей–ингибиторов TLR9. 150 Лигандом для TLR9 человека является последовательность GTCGTT и/или TCGTA [Vollmer et al., 2006; Krieg, 2012; Peter et al., 2008]. Иммуностимулирующим CрG-мотивом считается R1R2CGY1Y2, где R1 — пурин (предпочтительно G), R2 — пурин или Т, а Y1 и Y2 — пиримидины, которые образуют комплекс с TLR9 человека с меньшей константой ассоциации, чем GTCGTT-мотив последовательностями для TLR9 [Krieg, могут 2006; Bauer, 2012]. Ингибиторными быть последовательности Gn (n>5), и последовательности CCN(A/G/T)(A/G/T)NNGGGN и CC(A/G/T)(A/G/T)NGGGNN [Peter et al., 2008; Ashman et al., 2005; Trieu et al., 2006]. Выбранные нами плазмидные ДНК содержат вектор pBR322, в котором представлены 7 сайтов – лигандов TLR9 человека, АТ- богатая вставка плазмиды п(СатIII) не содержит ни участков GTCGTT, ни ингибиторов, содержащих Gn [Костюк с соавт., 2010]. Плазмида п(рДНК) содержит CpG – богатый фрагмент рибосомного повтора (есть и сайты связывания и последовательности - ингибиторы) [Костюк с соавт., 2010]. В качестве положительного контроля связывания с TLR9 в работе была использована ДНК E. Coli, как природный лиганд TLR9. ДНК E. coli выделяли из штамма MG 1655 методом фенольной экстракции и гидролизовали эндонуклеазой до фрагментов 5-10 т.п.н., сопоставимых по длине с другими пробами [Костюк с соавт., 2010]. Характеристики модельных образцов ДНК представлены на рисунок 3.2.2. Рисунок 3.2.2. Содержание последовательностей - лигандов и последовательностей - ингибиторов TLR9 в модельных плазмидах, используемых в работе п(СатIII) и п(рДНК) и в ДНК E.coli (а-г), определенное с помощью компьютерного анализа. Определяемые последовательности указаны на рисунке, приведено их содержание на 1000 п.н. в исследуемых образцах [Костюк с соавт., 2010]. 151 − Все образцы ДНК включают примерно одинаковое число участков - лигандов TLR9 на 1 т.п.н, но значительно различаются по количеству участков - ингибиторов TLR9 [Костюк с соавт., 2010]. ДНК плазмиды п(рДНК) содержит примерно 15 участков – ингибиторов на 1 участок GTCGTT, п(СатIII) – 3 ингибитора, ДНК E. сoli - всего 1 ингибитор на 1 участок – лиганд [Костюк с соавт., 2010]. Флуоресцентномеченные модельные фрагменты. Для визуализации добавляемых фрагментов были синтезированы совместно с сотрудниками лаборатории пренатальной диагностики (ФГБУ МГНЦ РАМН) зонды, содержащие флуоресцентную метку. Зонды были получены методом ник-трансляции с использованием флуоресцентных меток Spectrum Green и Spectrum Red [Kostyuk et al., 2013]. В качестве модельных меченных фрагментов использовали: а) геномную ДНК здоровых доноров (гДНКGreen/Red); б) GC-богатую ДНК плазмиды п(рДНК)Green и вектора, входящего в состав плазмиды - рBR322Green; в) окисленную ДНК, полученную с помощью отжига смеси денатурированных образцов меченной геномной ДНК и окисленной in vitro ДНК, в результате чего образовалась меченная окисленная гДНКоксиGreen/Red. г) окисленную ГЦ-богатую ДНК плазмиды п(рДНК)оксиGreen полученную методом отжига денатурированных проб: меченной плазмидной ДНК и окисленной in vitro плазмидной ДНК. Меченную экзогенную ДНК добавляли к среде культивирования клеток разных типов (концентрация 50 нг/мл, время культивирования - 30 минут или 2 часа). Флуоресценцию анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии на клетках, зафиксированных формальдегидом. С целью нивелировать эффекты, которые могут быть вызваны действием белков и других биополимеров, способных связываться с нуклеиновыми кислотами, все образцы ДНК были депротеинезированы, а образцы плазмидной ДНК дополнительно очищены от липополисахаридов [Kostyuk et al., 2013]. гДНК была гидролизована ДНКазой 1 до размера фрагментов, аналогичным тем, которые присутствуют в образце гДНКокси (от 0.2 до 15 kb) [Kostyuk et al., 2013]. В работе проведено дополнительное исследование влияния длины фрагментов на активацию рецепторов клеток. Для этого п(рДНК), имеющую размер 10000 п.о. обработали рестриктазами RsaI и MspI. Не было выявлено различий в действии на клетки коротких и длинных фрагментов. Видимо, вкДНК в среде культивирования расщепляется нуклеазами 152 до коротких фрагментов, и нет необходимости в дополнительном гидролизе добавляемых фрагментов. 3.2.4. Локализация окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК в клетках разных типов Для исследования локализации образцов внеклеточной ДНК с разными свойствами в клетках, образцы экзогенной ДНК с заданными характеристиками добавляли к культуре клеток эндотелия здорового человека и к культуре клеток аденокарциномы молочной железы - MCF-7. Чтобы выяснить, зависит ли локализация внеклеточной ДНК от ее последовательности, в частности от ГЦ-состава и от наличия окисленных оснований в составе молекулы ДНК, были использованы флуоресцентномеченые зонды (раздел 3.2.3). Рисунок 3.2.3. Взаимодействие неокисленой гДНК с клетками HUVEC (А) и MCF-7 (Б), ядра окрашены DAPI (увеличение Х40). Концентрация всех проб ДНК в среде культивирования: 50 нг/мл; время инкубирования с клетками – 0.5 час. Клетки фиксировали 3% формальдегидом. Меченную экзогенную ДНК добавляли к среде культивирования HUVEC и MCF-7 (концентрация 50 нг/мл, время культивирования - 30 мин). Флуоресценцию анализировали в клетках, зафиксированных формальдегидом. Геномная ДНК (гДНК) здоровых доноров, ГЦ-богатая ДНК п(рДНК)Green и пBR322Green спустя 30 мин культивирования с клетками HUVEC и MCF-7 демонстрируют примерно одинаковую картину связывания с клетками (рисунок3.2.3. и рисунок 3.2.4): сигналы располагаются в виде отдельных гранул в основном по периферии цитоплазмы и наблюдаются примерно в 70% клеток. Таким образом, 95 - 97% неокисленных экзогенных фрагментов ДНК через 30 минут после добавления 153 преимущественно локализуется на поверхности клеток HUVEC (рисунок 3.2.3 А) и MCF7 (рисунок 3.2.3 Б) и только 3 - 5% окрашенных фрагментов проникает внутрь клеток, располагаясь преимущественно вблизи цитоплазматической мембраны (рисунок 3.2.4) [Kostyuk at al., 2013]. Более детальный анализ локализации неокисленной ДНК на клетках MCF-7 показал, что связывание вкДНК с клеткой зависит от последовательности оснований (рисунок 3.2.4). Не все сигналы, наблюдаемые в клетке при связывании с зондами гДНКRed и пBR322Green, совпадают, причем сигналы зонда гДНКRed более многочисленны и занимают большую площадь. Кроме того, при большом увеличении можно увидеть очень слабое окрашивание вблизи клеточного ядра, т.е. небольшое количество молекул зонда проникает внутрь клетки (рисунок 3.2.4) [Kostyuk at al., 2013]. Рисунок 3.2.4. Совместное действие гДНКRed и пBR322Green на клетки MCF-7 (увеличение Х200) . Для определения локализации окисленных фрагментов ДНК в клетках HUVEC и MCF-7, были получены смешанные зонды ДНКоксиGreen и ДНКоксиRed путем медленной ренатурации меченных неокисленных фрагменов ДНК и немеченой окисленной ДНК. Через 30 минут инкубации HUVEC и MCF-7 в присутствии меченных окисленных фрагментов 90% зонда ДНКоксиGreen/ДНКоксиRed локализовано внутри цитоплазмы (в ～30% клеток HUVEC и MCF-7), чаще в районах вблизи ядра (рисунок3.2.5) [Kostyuk at al., 2013]. Около 10% окисленной меченной ДНКоксиGreen/ДНКоксиRed располагается в виде отдельных гранул по периферии цитоплазмы, как и неокисленные фрагменты ДНК. Поскольку окисленная ДНК (ДНКоксиGreen/ДНКоксиRed) содержит 8-oxodG, то она может также быть визуализирована путем взаимодействия с антителами к 8-oxodG, конъюгированными с FITС (рисунок3.2.5. Б). Таким образом, окисленные фрагменты ДНК, в отличие от неокисленных, проникают внутрь клетки и локализуется в цитоплазме, в том числе, и [Kostyuk at al., 2013]. вблизи ядра 154 Рисунок 3.2.5. Взаимодействие окисленной ДНК с клетками HUVEC (А) и MCF7 (Б), 8-oxodG выявляли антителами, коньюгированными с FITC (увеличение Х200), ядра окрашены DAPI. Концентрация всех проб ДНК в среде культивирования: 50 нг/мл; время инкубирования с клетками – 0.5 час. Клетки фиксировали 3% формальдегидом. Одним из способов доставки соединений внутрь клетки является эндоцитоз. Образование новых эндосом сопровождается увеличением экспрессии белка EEA1, который является маркером ранних эндосом [Dumas et al., 2001]. Методом проточной цитофлоуметрии было показано, что через 30 мин после добавления гДНКокси к клетками MCF-7 и МСК более, чем в 2 раза возрастает количество клеток с увеличенной экспрессией этого белка (рисунок 3.2.6. А-Г), что дополнительно подтверждает факт проникновения гДНКокси в цитоплазму клетки [Kostyuk at al., 2013]. Окисленные ГЦбогатые фрагменты через 30 минут также повышают экспрессию ЕЕА1 в МСК (рисунок 3.2.6. Г). Неокисленные фрагменты гДНК и п(рДНК) повышают экспрессию маркера ранних эндосом ЕЕА1 только через 3 часа, что позволяет предположить, что за это время неокисленные фрагменты вкДНК могли окислиться и активировать прцесс эндоцитоза (рисунок3.2.6. Г) [Kostyuk at al., 2013]. В процессе культивирования в среде присутствует эндогенная ДНК, в концентрации: (23 ± 6) нг/мл в культуре клеток HUVEC (среднее значение для трех разных культур), 6 ± 5 нг/мл в культуре МСК (среднее значение для 6 разных культур), 140 ± 20 нг/мл в культуре клеток MCF-7. Эта вкДНК образуется в результате естественной гибели клеток в процессе культивирования [Вейко и соавт., 2006; Pisetsky, 2012] или синтезируется живыми клетками, согласно одной из гипотез образования вкДНК [Gahan et al., 2010]. 155 Рисунок 3.2.6. Анализ содержания в клетках маркера ранних эндосом EEA1, метод проточной цитофлоуметрии. А - распределение клеток MCF-7 по интенсивности сигнал флуоресценции FL1(ЕЕА1). Указана область R, которая содержит клетки с высоким уровнем экспрессии EEA1. Б – частота встречаемости клеток MCF-7 области R. В - распределение клеток MCF-7 по интенсивности флуоресценции (окраска антителами к ЕЕА1). Концентрация всех образцов ДНК в среде культивирования: 50 нг/мл; время инкубирования с клетками – 0.5 час. Клетки фиксировали 3% формальдегидом. Г - распределение клеток МСК по интенсивности флуоресценции (окраска антителами к ЕЕА1) выделена область R, которая содержит клетки с высоким уровнем экспрессии EEA1, Д - средние значения интенсивности флуоресценции клеток МСК области R, окрашенных антителами к ЕЕА1. Концентрация всех образцов ДНК в среде культивирования: 50 нг/мл; время инкубирования с клетками – 0.5 час и 3 часа. Клетки клеточной культуры или клетки организма связывают эндогенную внеклеточную/циркулирующую ДНК [Rukova et al., 2012]. По-видимому, клетки адаптируются к присутствующей в среде вкДНК и находятся в неактивированном состоянии. В неактивном состоянии на поверхности клетки остаются потенциальные сайты связывания ДНК, не заблокированные эндогенной ДНК. При увеличении концентрации вкДНК в несколько раз (in vitro – при добавлении экзогенной ДНК в среду культивирования, или in vivo при массовой гибели при остром патологическом процессе) происходит связывание дополнительного количества ДНК с поверхностью клетки. 156 Процесс связывания вкДНК с клеткой быстрый – в течение первых 30 минут после появления экзогенной ДНК в среде культивирования практически вся вкДНК локализуется на/в клетках, в среде культивирования уровень вкДНК падает ниже контрольных значений. При действии окисленных (гДНКокси, п(рДНК)окси) и неокисленных ГЦ-богатых ДНК концентрация вкДНК через 30 минут снижается соответственно: в 2 и 1,5 раза ( HUVEC, N=3); в 3,5 и 2 раза (МСК,N=5) и в 3 и 1,8 раза в культуре (MCF-7). Неокисленная вкДНК взаимодействует с поверхностью клеток, а окисленная вкДНК транспортируется в цитоплазму клеток, вероятно, путем эндоцитоза. ВкДНК может связываться с фосфолипидами клеточной мембраны через бивалентные катионы [Rykova et al., 2012; Beliaev et al., 1998]. Возможно, вкДНК связывается с поверхностью клеток через мембранные рецепторы. Полагают, что в роли рецепторов на мембране клеток могут выступать альбумин, цитокератины, скавенджер (scavenger) - рецепторы, моэзин (moesin) и эзрин (ezrin) [Rykova et al., 2012; Chelobanov et al., 2006], другие, пока не идентифицированные, рецепторы. ДНК-связывающие рецепторы на поверхности клеток могут не только связывать вкДНК, но и обеспечивать интернализацию ДНК в клетки, как это было показано для цитокератинов [Rykova et al., 2012; Laktionov et al., 2003]. Другой пример кандидатов - транспортеров вкДНК внутрь клетки – гистоны, расположенные на мембране клеток и способствующие проникновению вкДНК в клетку потенциал - зависимым способом, независимо от эндоцитоза [Evans et al., 2009]. Полученные нами результаты по экспрессии маркера ранних эндосом ЕЕА1 позволяют предположить, что окисление связанной с поверхностью неокисленной вкДНК с последующим транспортом уже окисленной вкДНК с помощью эндосом – также вероятный механизм доставки вкДНК с поверхности клеток в цитоплазму [Kostyuk at al., 2013]. Таким образом, при контакте вкДНК с клетками разного типа окисленная вкДНК транспортируется в цитоплазму клеток и локализуется вблизи поверхности ядра. Вероятно, проникновение в цитоплазму клеток окисленных фрагментов внеклеточной ДНК осуществляется путем эндоцитоза. Неокисленные фрагменты вкДНК связываются с поверхностью клеток разного типа. 3.2.5. Изменение уровня активных форм кислорода в разных типах клеток при действии окисленных и неокисленных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК. Н2О2 и другие активные формы кислорода (АФК) имеют большое значение для функционирования клеток. При физиологических условиях АФК регулируют клеточный цикл, активность протеинкиназ и генную экспрессию. Увеличение синтеза АФК приводит 157 к развитию окислительного стресса и патологии [Weyemi et al., 2012; Sedelnikova et al., 2010; Lambeth, 2007]. Для изучения возможного влияния вкДНК с различными свойствами на изменение внутриклеточного уровня АФК, использовали известный реагент - H2DCFH-DA (2,7 dichlorofluorescin diacetate или 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат), который с 1992 года используется для определения АФК в клетках [LeBel et al., 1992; Cossarizza et al., 2009]. Этот краситель быстро проникает через мембрану клеток и подвергается деацетилированию внутриклеточными эстеразами [LeBel et al., 1992; Royall et al., 1993]. В цитозоле нефлуоресцирующий дихлордигидрофлуоресцеин DCFH является чувствительным внутриклеточным маркером окислительного стресса при его окислении до дихлорфлуоресцеина (DCF) различными радикалами АФК [Zhu et al., 1994]. В ряде работ было показано, что окисление DCFH неспецифично и появление сигнала DCF в клетках отражает общий уровень АФК [Royall et al., 1993; Zhu et al., 1994]. Детекцию АФК осуществляют разными методами. Инкубация клеток c H2DCFHDA приводит к возникновению в клетках флуоресцентного сигнала. Метод флуоресцентной микроскопии позволяет проанализировать локализацию в клетках сигналов, отражающих синтез АФК. Метод проточной цитометрии позволяет определить среднее количество АФК в клетке. Метод детекции флуоресценции с использованием планшетного ридера, в отличие от проточной цитометрии, дает возможность количественно определить суммарный уровень АФК в культуре клеток. Этот метод позволяет одновременно проанализировать синтез АФК в большом количестве образцов в одинаковых условиях и оптимален для первичного анализа действия образцов вкДНК на синтез АФК в клетках. Мы проанализировали и АФК в HUVEC, МСК, MCF-7, HEF и HDF при действии фрагментов вкДНК. 3.2.5.1. Количество АФК в HUVEC определяется свойствами вкДНК. Проанализировали изменение количества АФК в клетках HUVEC при добавлении к среде культивирования клеток образцов вкДНК здоровых доноров (ЗД), больных острым инфарктом миокарда (ОИМ) и модельных фрагментов с разным содержанием ГЦпоследовательностей и окисленных оснований (рисунок 3.2.7). В качестве известного стимулятора продукции АФК в HUVEC использовали Н2О2 в концентрации 40мкМ и малые дозы (10сГр) ионизирующего излучения. Кроме того, измерили уровень синтеза АФК в клетках HUVEC при добавлении к клеткам вкДНК из среды культивирования облученных в дозе 10сГр эндотелиоцитов (рисунок 3.2.7) [Kosyuk et al., 2012]. Концентрация добавляемых образцов 20 нг/мл, уровень эндогенной вкДНК в среде культивирования HUVEC 23 ± 5 нг/мл, т.е. добавление экзогенной ДНК повышает 158 уровень вкДНК приблизительно в 2 раза. Одновременно с образцами ДНК в среду культивирования добавляли реагент H2DCFH-DA, культивировали при температуре 37°С 1 час. Для детекции уровня АФК использовали планшетный ридер (длина волны возбуждения 487 нм, эмиссии - 526 нм). Рисунок 3.2.7. Уровень АФК использованием планшетного ридера в клетках HUVEC, детектируемый с (краситель - H2DCFH-DA). Концентрация добавляемых образцов - 20 нг/мл, время культивирования в присутствии каждого образца – 1 час. Образцы ДНК анализировали в 8-ми повторах, на графике – средние значения сигнала относительно контроля – культивируемых интактных клеток HUVEC, приведены средние данные ± SD. ,(*) – данные достоверно отличаются от контроля, p<0,05. При анализе полученных результатов, представленных на рисунок 3.2.7, были выявлены следующие закономерности: - в наименьшей степени (менее, чем на 20%) синтез АФК в клетках стимулируют гДНК, вкДНК здоровых доноров и вкДНК среды культивирования интактной культуры HUVEC [Kosyuk et al., 2012]; - 7 из 10 образцов вкДНК больных острым инфарктом миокарда (ОИМ) стимулировали повышение синтеза АФК в HUVEC на 30-150%. В составе вкДНК больных ОИМ повышено содержание ГЦ-ДНК и отмечается высокий уровень окислительных модификаций вкДНК. Уровень 8-oxodG в образце 24 вкДНК больного ОИМ, вызывавшем наиболее сильный синтез АФК в HUVEC был измерен и составил 410 (8-oxodG) на 106 нуклеозидов ДНК; - модельные ГЦ-обогащенные фрагменты ДНК - п(рДНК), ДНК E.coli и п(СатIII), содержащие лиганды рецепторов TLR9, стимулируют усиление синтеза АФК в HUVEC на 30-40%, при этом в меньшей степени стимулировал синтез АФК образец п(рДНК), 159 содержащий в своем составе ингибирующие TLR9 последовательности. Уровень синтеза АФК, индуцируемый малыми дозами ионизирующей радиации (10сГр) сравним с количеством АФК, синтезируемом клетками HUVEC при воздействии ГЦ-ДНК и вкДНК больных острым инфарктом миокарда; - окисленные в разной степени модельные образцы гДНКокси1 и гДНКокси2, вкДНК из среды культивирования облученных эндотелиоцитов стимулировали синтез АФК в большей степени, чем неокисленные образцы (соответственно, гДНК и вкДНК интактных эндотелиоцитов). Образец гДНКокси1, содержащий 400 (8-oxodG) на 106 нуклеозидов вызывал такое же усиление синтеза АФК в клетках, как и образец вкДНК №24, имеющий такой же уровень окисления 8-oxodG. гДНКокси2 содержала 2900 (8OHdG) на 106 нуклеозидов и вызывала синтез синтез АФК, сопоставимый с воздействием Н2О2 в концентрации 40мкМ [Kosyuk et al., 2012]. Таким образом, повышение уровня вкДНК в среде культивирования более чем в 2 раза, стимулирует в разной степени синтез АФК в HUVEC. Уровень АФК зависит от свойств добавляемой экзогенной вкДНК. ГЦ-богатая ДНК усиливает синтез АФК в клетках. Максимальным стимулирующим действием на синтез АФК в HUVEC обладают фрагменты окисленной ДНК [Kosyuk et al., 2012; Аlekseeva et al., 2010]. Процесс активации синтеза АФК в HUVEC при повышении концентрации вкДНК, изменении ГЦ-состава, степени окисления вкДНК в среде культивирования носит транзиторный характер (рисунок 3.2.8). Рисунок 3.2.8. Уровень АФК в клетках HUVEC, детектируемый с использованием планшетного ридера (краситель - H2DCFH-DA) через 1, 3 и 5 часов после добавления фрагментов вкДНК. Концентрация добавляемых образцов - 20 нг/мл. Образцы ДНК анализировали в 8-ми повторах, на графике – средние значения сигнала (± SD) относительно контроля – культивируемых интактных клеток HUVEC. (*) – данные достоверно отличаются от контроля, p<0,05. 160 В течение 1-3 часов уровень АФК в клетках возрастает, но уже через 5 часов наблюдается обратный процесс: уровень АФК падает в присутствие всех типов экзогенной вкДНК ниже контрольных значений (уровня АФК, синтезируемого интактными клетками) (рисунок 3.2.8). Полученные с помощью планшетного ридера данные подтвердили методом флуоресцентной микроскопии, который позволяет исследовать локализацию в клетках сигналов, соответствующих синтезу АФК. Окраска DCF выявляет светящиеся участки в перинуклеарной области цитоплазмы (рисунок 3.2.8). Окрашены также участки в примембранной области клеток. Подробный анализ клеточной культуры HUVEC позволил выявить 2 популяции эндотелиоцитов: слабо синтезирующие АФК клетки (2030% всей популяции) и интенсивно продуцирующие АФК клетки (70-80% всей популяции) (рисунок 3.2.9). Кроме того, около 3% всей популяции составляют нефлуоресцирующие клетки. Рисунок 3.2.9. Локализация АФК в HUVEC (увеличение Х100). Метод флуоресцентной микроскопии, использовался краситель H2DCFH-DA. Пример фракций клеток с низким и высоким уровнем синтеза АФК. Активация АФК в HUVEC окисленными образцами гДНКокси и вкДНК больного острым инфарктом миокарда (ОИМ) (50 нг/мл, 30 мин). Через 0,5-1 час после добавления к HUVEC окисленной ДНК (50 нг/мл) увеличивается количество клеток с высоким уровнем сигнала ( рисунок 3.2.9 , 3.2.10. А). При этом наблюдается прокрашивание ядра клеток и околоядерной области цитоплазмы клеток, что свидетельствует о том, что АФК активно синтезируются вблизи мембраны ядра и потенциально могут преодолевать ядерную мембрану и проникать в ядро клеток (рисунок 3.2.9). Синтез АФК неокисленными образцами стимулируется в меньшей степени ( рисунок 3.2.10. А). 161 Рисунок 3.2.10. Уровень АФК в HUVEC (увеличение Х64). Метод флуоресцентной микроскопии, использовался краситель H2DCFH-DA. Концентрация добавляемых образцов ДНК (указаны на рисунке) - 50 нг/мл, время - 1 час (А) или 24 часа (Б). Фотографирование проводилось при одинаковой выдержке. После 24 часов культивирования HUVEC с образцами экзогенной ДНК с разными свойствами наблюдалось снижение уровня синтеза АФК в клетках по сравнению с контролем - интактными эндотелиоцитами (рисунок 3.2.10. Б). Краситель H2DCFH-DA добавлялся за 30 мин до регистрации результатов. Наиболее значительное снижение уровня АФК наблюдается при долговременном действии окисленной ДНК, в меньшей степени уровень АФК снижался в присутствии неокисленных образцов ДНК. Использование красителя DAPI для окраски ядер клеток дало дополнительное подтверждение тому, что некоторая часть АФК, окрашиваемых DCF, локализована в ядре. Было показано, что DCF тушит флуоресценцию DAPI - чем сильнее флуоресцирует DCF, тем слабее прокрашивались ядра клеток красителем DAPI. Этот эффект можно объяснить переносом энергии: спектр эмиссии DAPI перекрывается со спектром возбуждения DCF, что вызывает тушение сигнала DAPI. Перенос энергии возможен только на коротком расстоянии, что свидетельствует о близком расположении обоих красителей в ядре. Таким образом, данные флуоресцентной микроскопии коррелируют с данными, полученными на флуоресцентном ридере и позволяют более детально описать процесс синтеза АФК клетками HUVEC. Эффективное снижение уровня АФК при культивировании клеток в присутствии окисленных фрагментов спустя 5-12 часов после 162 их добавления в среду культивирования свидетельствует о развитии сильного антиокислительного ответа в клетках. В интактных клетках процесс синтеза АФК наблюдается не только вблизи ядра, но и на поверхности клеток, что может способствовать окислению гДНК неокисленных фрагментов ДНК в области мембраны клеток и более пролонгированному действию постепенно окисляющейся ДНК. Метод проточной цитофлуориметрии (рисунок 3.2.11) позволяет количественно оценить уровень АФК в клетках. Однако часть DCF может диффундировать из клеток в среду при повреждении клеточной мембраны при избытке АФК в клетке [Royall at al., 1993], поэтому полученные с помощью этого метода данные о синтезе клетками АФК при сильном окислительном стрессе могут быть заниженными. Рисунок 3.2.11. Уровень АФК в HUVEC. Метод проточной цитофлуориметрии. А - интенсивность сигнала DCF (по оси Y), по оси Х - размер клеток. Б, В, - распределение клеток по интенсивности сигнала при добавлении соответственно гДНК или гДНКокси1 в концентрации 20 нг/мл ДНК, время культивирования - 1 час. 0 – клетки, не окрашенные DCF (контроль); 1 – популяция клеток с низким уровнем синтеза АФК; 2- популяция клеток с высоким уровнем синтеза АФК. Г – изменение интенсивности флуоресценции DCF при добавлении образцов ДНК к HUVEC. (*) – данные достоверно отличаются от контроля (p < 0.001). Тем не менее, метод проточной цитофлоуриметрии подтверждает данные о наличии двух популяций клеток – с высоким уровнем синтеза АФК – 30-40% клеток от всей клеточной популяции (рисунок 3.2.10. А, субпопуляция 2) и с низким уровнем 163 синтеза АФК (рисунок 3.2.10. А, субпопуляция 1). Средний сигнал клеток с высоким уровнем АФК в 3-4 раза выше, чем клеток с низким уровнем АФК. Данные проточной цитофлуориметрии также подтверждают вывод о более сильной стимуляции синтеза АФК в HUVEC фрагментами окисленной ДНК по сравнению с неокисленными фрагментами ДНК (рисунок 3.2.11). При внесении в среду культивирования HUVEC фрагментов внеклеточной ДНК (20 нг/мл, 1 час) из среды культивирования контрольных клеток не происходит стимуляции синтеза АФК. Геномная ДНК (20 нг/мл, 1 час) стимулирует синтез АФК клетками незначительно - на 20 - 40% за счет увеличения субпопуляции клеток с высоким уровнем синтеза АФК (рисунок 3.2.11). В то же время образцы окисленной ДНК (внДНК из среды облученных клеток, гДНКокси1, гДНКокси2, 20 нг/мл) через 1 час вызывают сильную стимуляцию синтеза АТФ клетками, увеличивая размер субпопуляции клеток с высоким уровнем синтеза АФК на 70-100%. Добавление неокисленной ДНК в среду культивирования HUVEC в условиях окислительного стресса, вызванного экзогенным действием перекиси водорода, значительно увеличивало окислительный стресс и приводило к увеличению уровня АФК. Для оценки уровня АФК, наблюдаемого в клетках после воздействия неокисленной ДНК на фоне добавления окислителя, провели модельный эксперимент, воздействуя на клетки HUVEC окислителем Н2О2 в концентрации 10 и 100 мкМ (рисунок 3.2.12. А). Рисунок 3.2.12. Влияние H2O2 на количество АФК в эндотелиальных клетках, определяемое DCF-DA. А - Метод проточной цитофлуориметрии, ось Y - интенсивность сигнала DCF, ось Х - размер клеток (100 тыс. клеток). В Интенсивности суммарной флуоресценции клеток и среды, детектируемой с использованием планшетного ридера (краситель - H2DCFH-DA). H2O2 вводили в среду культивирования и культивировали ЕС 2 часа, далее на 1 час добавляли 4мкМ DCF-DA при 37оС. 1- контроль (интактные клетки HUVEC), 2- 10мкМ H2O2, 3 – 100мкМ H2O2, 410мкМ H2O2 и 20нг/мл неокисленной гДНК. (*) – данные достоверно отличаются от контроля (p < 0.001). 164 Эта модельная система подробно изучена [Thomas et al., 2005; Cai, 2005, Drummond et al., 2000]. Концентрация перекиси 10мкМ (2 часа) вызывает в эндотелиальных клетках более интенсивный синтез АФК, чем радиация (10сГр), вкДНКрад и вкДНКокси. Методом проточной цитофлуориметрии было показано, что практически вся клеточная популяция значительно увеличила интенсивность свечения. При этом появилась субпопуляция клеток (примерно 5-10%) с очень низким уровнем сигнала DCF (рисунок 3.2.12. А), чего мы не наблюдали ранее (рисунок 3.2.12. А). Большие дозы перекиси (100 мкМ, 2 часа) увеличивают число нефлуоресцирующих клеток до 95%. Суммарное же свечение клеток, детектируемое с использованием планшетного ридера, возрастает ( рисунок3.2.12. В). Наблюдаемый эффект связан с вытеканием в межклеточную среду из эндотелиальных клеток DCF, вероятно, вследствие значительного увеличения проницаемости клеточной мембраны. Такие эффекты ранее были описаны для эндотелиальных клеток [Royall at al., 1993]. Если Н2О2 (10мкМ) действует в присутствии неокисленной гДНК, то суммарный сигнал, определяемый с использованием планшетного ридера, в 3 раза превышает сигнал, детектируемый только при действии Н2О2,. Содержание нефлуоресцирующих клеток, определяемых методом проточной цитометрии, присутствии неокисленных фрагментов гДНК достигает 50%. Таким образом, в Н2О2 индуцирует гораздо больший окислительный стресс. Этот эффект можно объяснить окислительной модификацией ДНК активными формами кислорода и азота в процессе культивирования и вторичным действием на клетки окисленной ДНК, которое усиливает окислительный стресс, вызываемый перекисью водорода. Через 5 часов после добавления ДНК в концентрации 50 нг/мл уровень АФК снижается по сравнению с уровнем синтеза АФК в контроле за счет увеличения нефлуоресцирующей фракции клеток R2, составляющей около 3% всех клеток в контроле (рисунок 3.2.12 А, Б). Количество клеток нефлуоресцирующей фракции R2 возрастает в ряду: Контроль < гДНК < п(рДНК) < п(рДНК)окси ≤ гДНКокси (рисунок 3.2.13. Б). При этом снижается интенсивность окраски клеток флуоресцирующих субпопуляций (R1) через 5 часов при добавлении любых образцов экзогенной вкДНК ( рисунок 3.2.13. А, В). Снижение уровня синтеза АФК в клетках при длительном культивировании HUVEC с образцами экзогенной окисленной ДНК свидетельствует о развитии эффективного антиокислительного ответа после первичного кратковременного (1-3 часа) повышения уровня синтеза АФК при действии окисленной ДНК. 165 Рисунок3.2.13. Уровень АФК в HUVEC через 5 часов после добавления экзогенной ДНК в концентрации 20 нг/мл. Метод проточной цитофлуориметрии. H2DCFH-DA добавляли за 30 мин. до окончания эксперимента. А – интенсивность сигнала DCF (по оси Х), по оси Y - размер клеток, R1 – субпопуляции клеток, синтезирующих АФК, R2 фракция клеток с заблокированным синтезом АФК (сигнал DCF в этих клетках на уровне фона). Б – размер нефлуоресцирующей фракции R1; В – средние значения интенсивности флуоресценции популяции R1 при добавлении образцов ДНК к HUVEC. (*) – данные достоверно отличаются от контроля (p < 0.001). Таким образом, повышение концентрации вкДНК в среде культивирования HUVEC приводит к развитию окислительного стресса в клетках. Окисленные фрагменты вкДНК в большей степени стимулируют синтез АФК в HUVEC, чем ГЦбогатые фрагменты. Синтез АФК в HUVEC носит транзиторный характер (1-3 часа после начала воздействия), через 5 часов уровень синтеза АФК снижается. 3.2.5.2. Синтез АФК в МСК при воздействии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК Исследовали изменение уровня АФК в 6-ти культурах МСК при добавлении к клеткам вкДНК с малым содержанием окисленных оснований (вкДНК(HUVEC), вкДНК(МСК), п(рДНК) и вкДНК с повышенным содержанием окисленных оснований, в том числе, вкДНК культивируемых первичных раковых клеток, вкДНК раковых больных и окисленную in vitro гДНКокси [Loseva et al., 2012]. Концентрация эндогенной вкДНК среды культивирования интактных МСК составляла в среднем 6 ± 5 нг/мл (N = 6). Синтез АФК анализировали в тех же условиях, что и для HUVEC: концентрация добавленных экзогенных образцов ДНК (10 нг/мл) повышает уровень вкДНК приблизительно в 2 раза, одновременно с образцами к МСК добавляли краситель H2DCFH-DA, детекцию АФК осуществляли с использованием планшетного ридера. Экзогенная ДНК стимулирует синтез АФК в МСК намного быстрее, чем в HUVEC. Уже через 5 минут наблюдалось увеличение уровня АФК на 100 – 150% по сравнению с 166 контролем, как при добавлении неокисленных образцов экзогенной ДНК (гДНК, вкДНК(HUVEC); 10 нг/мл), так и при добавлении окисленной ДНК (гДНКокси, вкДНКокси(HUVEC); 10 нг/мл), рисунок 3.2.14. А [Loseva et al., 2012]. ВкДНК плазмы больных РМЖ вызывала увеличение синтеза АФК на 20% ( рисунок 3.2.14. А). Относительная скорость увеличения сигнала ( v = ∆I(dcf)/τ, рисунок 3.2.14. Б) максимальна в начале измерения – через 5 мин; через 15 мин она уменьшается в 3-10 раз (3.2.14. Б). Рисунок 3.2.14. А - Кинетика изменения уровня АФК в МСК в первые 15 минут инкубации клеток с фрагментами экзогенной ДНК в концентрации 10 нг/мл. Краситель H2DCFH-DA, детекцию осуществляли с использованием планшетного ридера. Образцы ДНК анализировали в 8-ми повторах, на графике – средние значения сигнала относительно контроля – культивируемых интактных МСК. Б – Отношение скорости изменения IDCF экспериментальных образцов (V) к скорости изменения IDCF в контроле (VK) через 5, 10 и 15 минут. Эксперимент поставлен на 2-х культурах МСК. (*) не отличается от контроля (р > 0,5). Результаты, подтверждены окисленной и полученные методом с проточной неокисленной ДНК использованием планшетного цитофлуориметрии (рисунок 3.2.15.). для ридера, были модельных образцов Максимальное различие интенсивности флуоресценции экспонированных и контрольных клеток наблюдалось в первые 5 минут инкубации ( рисунок 3.2.15. Б, В) [Loseva et al., 2012]. Через 15 минут относительная скорость накопления DCF в клетках значительно уменьшалась ( рисунок 3.2.15. В) [Loseva et al., 2012]. Через 30 минут количество АФК в клетках, к среде культивирования которых добавлялись фрагменты окисленной ДНК ( гДНКокси, вкДНКокси(HUVEC); 10 нг/мл), было снижено по сравнению с контролем (рисунок 167 3.2.15. Б) [Loseva et al., 2012]. Таким образом, и интактная, и окисленная ДНК стимулируют в МСК быстрое кратковременное увеличение уровня АФК по сравнению с контролем. Рисунок 3.2.14. Кратковременное повышение уровня АФК в МСК при действии вкДНК, метод проточной цитофлоуметрии. А - Однородность клеточной фракции (FSCSSC диаграмма) и окрашенная фракция клеток (SSC-FL1 диаграмма). МСК обрабатывали 10 мкМ H2DCFH-DA. Б. - Отношение скорости изменения экспериментального образца к контролю. В. – Кумулятивная гистограмма распределения интенсивности окрашивания DCF. Клетки предварительно обрабатывали H2DCFH-DA в течение одного часа, а затем одним из трех образцов ДНК в течение 5 или 30 минут. Светло-серым, темносерым и черным цветом обозначено время инкубации с ДНК - 5, 10 и 15 минут соответственно. Метод проточной цитофлуориметрии. Эксперимент поставлен на 3-х культурах МСК. (*) не отличается от контроля (р> 0,5). На рисунке флуоресцентной 3.2.16 микроскопии показан результат в живых клетках анализа МСК. уровня АФК Краситель методом H2DCFH-DA окрашивает отдельные гранулы в контрольных клетках, образцы окисленной гДНКокси 168 (50 нг/мл) через 30 минут снижают уровень фоновой флуоресценции, наблюдаемый в контрольных клетках. Геномная ДНК вызывает появление АФК, которые выявляются H2DCFH-DA и проявляются повышенным по сравнению с контролем уровнем флуоресценции. Риснок 3.2.16. Влияние окисленных и неокисленных образцов ДНК на уровень АФК в МСК (метод флуоресцентной микроскопии). В среду культивирования одновременно добавляли H2DCFH-DA и по 50нг/мл гДНК (Б) или гДНКокси (В) и инкубировали 0.5 часа. Г – МСК в видимом свете. Увеличение Х100. Д – уровень флуоресценции H2DCFH-DA, посчитанный вручную (среднее для 100 клеток). (*) – отличия от контроля достоверны (p < 0,1). Если экзогенная вкДНК (10 нг/мл) воздействовала на МСК более 2 часов до момента добавления H2DCFH-DA, то мы наблюдали значительную разницу в продукции АФК в МСК в присутствии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК (рисунок3.2.17) [Loseva et al., 2012]. Пробы вкДНК(HUVEC), вкДНК(МСК) и гДНК, которые содержат малое количество 8-oxodG, через 2 часа стимулировали повышенную продукцию АФК в экспонированных клетках по сравнению с контрольными клетками. Пробы вкДНКокси(HUVEC), гДНКокси и вкДНК РМЖ, которые содержат окисленные основания, достоверно снижали скорость изменения флуоресценции DCF на 20 - 50%, что говорит о снижении продукции АФК через 2 часа после воздействия окисленной ДНК на МСК (рисунок3.2.17) [Loseva et al., 2012]. 169 Рисунок 3.2.17. А - Кинетика изменения уровеня АФК в МСК. 10 мкМ H2DCFH-DA добавляли после двух часов инкубации МСК с фрагментами экзогенной ДНК в концентрации 10 нг/мл, детекцию осуществляли с использованием планшетного ридера. Образцы ДНК анализировали в 8-ми повторах, на графике – средние значения сигнала (IDCF) относительно контроля – культивируемых интактных МСК. Б – Отношение скорости изменения IDCF экспериментальных образцов (V) к скорости изменения IDCF в контроле (VK), светло-серый цвет соответствуют 10 нг / мл, темно-серый - 100 нг/мл добавленной экзогенной ДНК в среду культивирования МСК. Отличия от контроля обнаружены для всех образцов ДНК (p < 0,05).Эксперимент поставлен на 3-х культурах МСК. Этот результат был подтвержден методом проточной цитометрии для модельных образцов гДНКокси и гДНК (рисунок3.2.18). Инкубация МСК с неокисленными образцами гДНК в течение 3 и 24 часов (концентрации 150 и 250 нг/мл) приводила к увеличению продукции АФК в 1,5 – 8 раз в зависимости от концентрации ДНК и индивидуальных особенностей клеточной линии [Loseva et al., 2012]. Продукция АФК при концентрации гДНК 25 нг/мл через 3 часа увеличивалась на 40 - 60% (различия с контролем не достоверны, p>0,05) [Loseva et al., 2012]. Окисленные образцы гДНКокси достоверно не увеличивали средний уровень сигнала в экспонированных клетках по сравнению с контролем, даже при очень высоких концентрациях (p>0,05) (рисунок3.2.17) [Loseva et al., 2012]. 170 Риунок 3.2.18. Неокисленные образцы гДНК увеличивают синтез АФК в МСК. А, Б – Значение средних значений IDCF экспериментальных образцов по отношению к средним значениям IDCF в контроле. Светло-серым и черным цветом обозначено время инкубации с гДНК и гДНКокси - 3 и 24 часа соответственно. Эксперимент поставлен на 3-х культурах МСК. *) наблюдается отличие от контроля (U-критерий Манна-Уитни, р<0,05). Таким образом, в первые минуты после добавления любых фрагментов ДНК в среду в концентрации в 2 раза превышающей концентрацию эндогенной вкДНК в МСК резко увеличивается уровень АФК. Но, уже через 10 минут скорость продукции добавочных АФК значительно уменьшается. Поскольку процесс очень быстрый, то можно предположить, что первичная активация продукции АФК не связана с изменением экспрессии ферментов, продуцирующих АФК вблизи цитоплазматической мембраны, например, ферментов семейства NOX (NADPH-оксидаз) [Loseva et al., 2012]. Возможно, ДНК изменяет их ферментативную активность, взаимодействуя с мембранными комплексами белков. Спустя 1-2 часа в клетках наблюдается умеренно повышенный уровень АФК в том случае, если вкДНК не содержит окисленных оснований. Если же в среде присутствует вкДНК апоптотических клеток, которые погибли в результате окислительного стресса, то скорость продукция АФК уменьшается по сравнению с контролем. Такой же эффект наблюдается для гДНКокси и для вкДНК больных раком молочной железы (РМЖ). Образцы гДНКокси содержат примерно один-два 8-oxo-dG на тысячу пар оснований ДНК. Молекула окисленной ДНК реально состоит из двух типов последовательностей – неокисленных участков ДНК, которые вызывают повышение 171 АФК, и участков с 8-oxo-dG, которые компенсируют действие первых. Суммарный эффект - снижение уровня АФК при культивировании МСК с окисленной ДНК. Разница между двумя типами ДНК особенно заметна при действии больших концентраций ДНК (рисунок3.2.18). Реакция МСК на окисленную ДНК значительно отличается от реакции дифференцированных клеток. Синтез АФК в МСК при действии экзогенной ДНК смещен в сторону более раннего временного промежутка. При аналогичных условиях образцы окисленной ДНК через 1-2 часа вызывали в HUVEC гораздо больший синтез АФК, чем образцы неокисленной ДНК. Основной причиной быстрого снижения уровня АФК в МСК в присутствии фрагментов окисленной ДНК является, вероятно, выраженный антиокислительный ответ. Таким образом, повышение концентрации вкДНК в среде культивирования МСК вызывает быстрый, выраженный, но очень кратковременный (в течение 5-15 минут) синтез АФК в клетках. На более позднем отрезке времени окисленные фрагменты вкДНК ингибируют синтез АФК в МСК, неокисленные фрагменты вкДНК стимулируют синтез АФК в прямой зависимости от добавляемой концентрации. 3.2.5.3. Окисленные вкДНК индуцируют в раковых клетках MCF-7 кратковременный окислительный стресс Обнаружив заметное влияние образцов окисленной и неокисленной ДНК на продукцию АФК, как в недифференцированных (МСК), так и в дифференцированных клетках (HUVEC), исследовали возможное влияние гДНК и гДНКокси на уровень АФК в культуре раковых клеток (MCF-7) [Kostyuk at al., 2013]. Исследование эффектов вкДНК на опухолевые клетки остается мало изученным, несмотря на очевидную актуальность этой модели при терапии злокачественных опухолей человека, в частности, из-за обилия опубликованных наблюдений, свидетельствующих о повышении концентрации вкДНК в плазме крови больных раком [ Zhong at al., 2007; Fleischhacker and Schmidt, 2007; Hashad at al., 2012; Gong at al., 2012; Agostini at al., 2011; Swystun at al., 2011; Roth at al., 2011]. Раковые клетки отличаются от нормальных клеток более высоким уровнем АФК, а также значительно более высоким уровнем окисления клеточной ДНК [Kostyuk at al., 2013]. При облучении и при химиотерапии рака происходит массовая гибель клеток и образуется большое количество окисленной вкДНК. Эта окисленная вкДНК небезразлична для раковых клеток, против которых и направлено изначальное химиотерапевтическое воздействие. Концентрация вкДНК в среде культивирования интактных MCF-7 - 140 ± 20 нг/мл [Kostyuk at al., 2013]. Эффекты гДНК и гДНКокси оценивались после добавления 172 различных концентраций (50 нг/мл или 5 нг/мл) образцов ДНК с временем экспозиции от 30 минут до 48 часов. На рисунке 3.2.19 показан результат анализа уровня АФК методом флуоресцентной микроскопии в живых клетках MCF-7. Риунок 3.2.19. Влияние окисленных и неокисленных образцов ДНК на уровень АФК в клетках MCF-7 (метод флуоресцентной микроскопии). В среду культивирования одновременно добавляли H2DCFH-DA и по 50нг/мл гДНК или гДНКокси (a) и инкубировали 0.5 часа, либо сначала добавляли 50нг/мл ДНК на 0,5 часа, а затем H2DCFH-DA на 0,5 часа (гДНКокси (b)). Краситель H2DCFH-DA окрашивает контрольные клетки преимущественно по поверхности клеточной мембраны, причем после отмывки PBS интенсивность окраски значительно уменьшается. Образцы неокисленной гДНК (50 нг/мл) вызывают появление небольшого количества окрашенных гранул в цитоплазме, окраска этих гранул более стойкая и выдерживает отмывки PBS (рисунок 3.2.19). Образцы окисленной гДНКокси (50 нг/мл) стимулируют образование большого количества центров синтеза АФК в цитоплазме клеток ( рисунок3.2.19, гДНКокси (а)) [Kostyuk at al., 2013]. При этом наблюдаются морфологические признаки сильной активации клеток: увеличение размера ядра и набухание цитоплазмы. Ответ клеток на действие гДНКокси развивается очень быстро. Мы наблюдали описанную картину только в случае практически одновременного добавления гДНКокси и H2DCFH-DA в среду культивирования MCF-7. Если клетки сначала инкубировали с гДНКокси в течение 1 часа, а затем добавляли краситель H2DCFH-DA, то количество центров синтеза АФК в клетках уменьшалось, и интенсивность окраски была слабее (рисунок3.2.19 гДНКокси (б)) [Kostyuk at al., 2013]. 173 Кроме того, в популяции появлялись клетки, в которых синтез АФК был блокирован, даже по сравнению с контролем (темные пятна на зеленом фоне рисунок3.2.19 гДНКокси (б)). Обнаруженный эффект был подтвержден в дополнительных опытах с использованием планшетного флуоресцентного ридера (рисунок 3.2.20), который позволяет исследовать кинетику синтеза DCF при добавлении к клеткам образцов ДНК. При добавлении образцов ДНК после введения в среду H2DCFH-DA, мы наблюдали увеличение сигнала по сравнению с контролем [Kostyuk at al., 2013]. Максимальная скорость синтеза DCF наблюдалась в течение первых 20 мин после добавления ДНК (константа k1, рисунок 3.2.19 А, таблица). Затем наклон кривых уменьшался в несколько раз (константа k2, рисунок 3.2.19 А, таблица). Значения констант k1 и k2 зависели от окисления и концентрации добавленной ДНК и изменялись в ряду: гДНКокси (5 нг/мл) > гДНК (5 нг/мл) ≥ гДНКокси (50 нг/мл) > гДНК (50 нг/мл) > контроль [Kostyuk at al., 2013]. Если клетки сначала инкубировали с пробами ДНК в течение 1 часа, а затем добавляли H2DCFH-DA, то эффект отсутствовал ( рисунок3.2.19. Б). Рисунок 3.2.20. Анализ уровня АФК методом флуоресценции с использованием планшетного ридера. А. - К клеткам добавляли H2DCFH-DA и через 3 минуты добавляли образцы ДНК (5 и 50 нг/мл). Б. - Клетки инкубировали с образцами ДНК (5 нг/мл, 1 час), далее добавляли H2DCFH-DA и анализировали изменение сигнала. (*) p < 0.05 по сравнению с контрольными клетками, непараметрический U-тест. Таким образом, гДНКокси является сильным индуктором синтеза АФК в клетках MCF-7. Синтез активных форм кислорода наблюдается в клетках MCF-7 в первые 30 минут после добавления к клеткам окисленной вкДНК. Параллельно с активным синтезом АФК в клетках инициируется процесс, направленный на снижение уровня АФК. Этот процесс развивается тем быстрее, чем выше концентрация добавленной в среду ДНК. 174 Одним из основных источников АФК в цитоплазме клеток являются митохондрии. Усиление окислительных процессов в митохондриях может способствовать увеличению уровня АФК, диффузии АФК в цитоплазму и их детектированию с помощью DCF вблизи митохондрий. Это предположение проверили, последовательно окрасив клетки, обработанные в течении 0,5 часа 50 нг/мл гДНКокси, красителем митохондрий Mito-tracker Red 580 (TMRM red) и DCF (рисунок 3.3.21. А). Большинство сигналов Mitotracker и DCF локализованы вблизи друг друга и частично перекрываются (желтая окраска, рисунок 3.2.21. А) [Kostyuk at al., 2013]. Краситель H2DCFH-DA в интактной клетке не окрашивает митохондрии (рисунок3.2.21, контроль). Поскольку локализация экзогенной гДНКокси совпадает с местами локализации DCF, и, соответственно, с расположением митохондрий, то, видимо, основным источником АФК при действии на клетки окисленной ДНК могут являться митохондрии [Kostyuk at al., 2013]. Рисунок 3.2.21. Митохондрии - основной источник АФК при действии на клетки окисленной ДНК. А - Клетки MCF-7 последовательно обрабатывали гДНКокси (30 мин, 50 нг/мл), красителем митохондрий - Mito-tracker Red 580 (TMRM red) (15 мин) и H2DCFH-DA (15 мин). (увеличение х200). Б – Колокализация гДНКred-окси (50 нг / мл) и DCF. Б – Фрагменты неокисленной гДНКred расположены в местах синтеза АФК (окраска DCF). Колокализация гДНКred-окси (50 нг/мл) и DCF. В среду культивирования одновременно добавляли H2DCFH-DA и 50нг/мл гДНК и инкубировали 0,5 часа, метод флуоресцентной микроскопии, увеличение Х200. При добавлении к клеткам 50 нг/мл флуоресцентномеченной неокисленной гДНК только небольшое количество окрашенных гранул гДНК обнаруживается в цитоплазме, а основная часть (70%) неокисленной гДНК расположена по поверхности клетки, однако, и 175 для неокисленных фрагментов гДНК показали, что расположение зеленых гранул DCF, в основном, совпадает с расположением меченного ДНК-зонда гДНКred ( рисунок 3.2.21. Б) [Kostyuk at al., 2013]. По-видимому, взаимодействие гДНК также стимулирует синтез АФК в месте контакта. Источником АФК вблизи клеточной мембраны обычно являются ферменты семейства NOX [Weyemi et al., 2012]. Кроме того, было показано, что вблизи клеточной мембраны и в митохондриях раковых клеток расположены ферменты NOX4 [Case et al., 2013, Weyemi et al., 2012, Graham et al., 2010]. NOX4 идентифицирован в клетках сердечно-сосудистой системы, гемопоэтических стволовых клетках, в почках, кератиноцитах, клетках меланомы, нейронах, адипоцитах, эмбриональных стволовых клетках, хондроцитах, звездчатых клетках печени, эпителиальных клетках, подоцитах [Chen et al., 2012]. Наиболее представлен NOX4 в эндотелиальных клетках и фибробластах [Schroder, et al., 2012]. 3.2.5.4. Изменение уровня активных форм кислорода в фибробластах при действии гДНК и гДНКокси Для исследования влияния окисленных и неокисленных фрагментов ДНК на уровень АФК в клетках в условиях хронического окислительного стресса, присутствующего в организме человека при многих хронических патологических процессах, были проведены эксперименты на фибробластах [Kostyuk at al., 2013]. Фибробласты кожи взрослого человека (HDF) и эмбриональные фибробласты легкого (HEF) культивировали до состояния субконфлуентности (~ 60-80%) в среде «Гибрис», которая не содержит сыворотки, но включает в своем составе факторы роста. Концентрация вкДНК в среде культивирования интактных фибробластов кожи взрослого человека (HDF) и эмбриональных фибробластов легкого (HEF) в среднем составляла 14±2 нг/мл и 8 ± 2 нг/мл, соответственно [Kostyuk at al., 2013]. Для исследования влияния окислительной модификации вкДНК на синтез АФК в условиях хронического окислительного стресса дополнительно к собственной вкДНК фибробластов в среду культивирования однократно, в начале культивирования, вводили гДНК или ДНКокси1/ДНКокси2 в различной концентрации. Анализ уровня АФК в клетках проводили спустя 72 часа после культивирования в присутствии фрагментов ДНК [Kostyuk at al., 2013]. В случае HDF исследовали действие гДНК и ДНКокси при концентрации 10, 20 и 100 нг/мл среды. В случае HEF исследовали действие гДНК и ДНКокси в концентрации 20 нг/мл. В качестве контроля использовали интактные HDF и HEF, которые 176 культивировали либо в присутствии 2% сыворотки, либо без сыворотки (рисунок 3.2.22). Все ДНК содержали фрагменты примерно одинакового размера от ~ 0,5 до ~ 10 kb. Рисунок 3.2.21. Влияние образцов окисленной и неокисленной ДНК на уровень АФК в в HDF и HEF. Метод проточной цитофлуориметрии. А - интенсивность сигнала DCF (по оси Y), по оси Х - размер клеток. R1 – основная, сильнофлуоресцирующая фракция клеток. В - кривые распределения клеток фракции R1 в популяции HDF и HEF, соответственно, по интенсивности сигнала FL1(АФК) при добавлении фрагментов гДНК или гДНКокси1 в концентрации 20 нг/мл ДНК, время культивирования - 72 часа. Обозначения кривых: фон - окраска вторичными антителами, 2% сыворотки - клетки культивировали в среде с добавлением сыворотки, контроль - в бессывороточной среде. Б – средние значения интенсивности флуоресценции клеток HDF основной фракции R1. Серые столбики – концентрация образцов ДНК - 20 нг/мл, черные – 100нг/мл. (*) достоверное отличие от контроля, непараметрический U-тест (p < 0.05). На рисунке 3.2.22. А представлен анализ уровня активных форм кислорода в нефиксированных клетках. Основная фракция клеток (область R1) обладает интенсивной флуоресценцией. На рисунке 3.2.22 В приведены гистограммы интенсивности флуоресценции DCF для клеток HDF и HEF (рисунок3.2.22 В) в присутствии образцов 177 ДНК (20 нг/мл). Отсутствие сыворотки в среде сопровождается значительным увеличением АФК в фибробластах [Kostyuk at al., 2013]. Геномная ДНКокси стимулирует дополнительно увеличение уровня АФК и в HEF, и в HDF (рисунок 3.2.22 Б, В, С) [Kostyuk at al., 2013]. Кривые распределения клеток фракции R1 в популяции HDF и HEF сдвигаются в сторону больших значений и для HEF, и для HDF при действии гДНКокси. Средние значения интенсивности сигнала при добавлении в среду культивирования гДНКокси (10, 20 и 100нг/мл) увеличиваются на ~20%. (рисунок 3.2.31 В, приведены данные для HDF). гДНК (20 и 100 нг/мл), напротив, на 30% снижает уровень АФК [Kostyuk at al., 2013]. Через 72 часа после начала воздействия окисленных фрагментов ДНК наблюдается активация антиокислительных систем. Активация антиокислительного ответа должна бы сопровождаться снижением уровня АФК в присутствии гДНКокси. Однако в реальности мы наблюдали и в HDF, и в HEF увеличение уровня АФК при действии гДНКокси и снижение в присутствии гДНК [Kostyuk at al., 2013]. Можно высказать предположение, что гДНКокси и гДНК влияют на разные сигнальные пути в клетке, ассоциированные с синтезом АФК [Kostyuk at al., 2013]. Суммарный уровень АФК, который мы детектировали, используя H2DCFH-DA, определяется, прежде всего, по реакции очень активного супероксиданиона с реагентом. Скорость реакции перекиси водорода с H2DCFH ниже. При условии снижения количества SOD1 в присутствии гДНКокси в клетках может увеличиваться концентрация супероксиданиона, поскольку данный фермент катализирует переход O2− в H2O2. Увеличение сигнала DCF при действии гДНКокси на клетки может отражать изменение химической природы АФК в клетках, например, увеличение количества супероксиданиона и снижение концентрации H2O2. Таким образом, окисленные фрагменты вкДНК стимулируют повышенный синтез АФК при культивировании эмбриональных фибробластов и фибробластов кожи взрослого человека в условиях хронического окислительного стресса. Неокисленные фрагменты вкДНК при подобных условиях снижают уровень АФК в фибробластах. Общим выводом для всех изученных типов клеток является то, что фрагменты вкДНК вызывают в разных типах клеток кратковременный окислительный стресс. Время развития окислительного стресса зависит от типа клеток и, вероятно, от разной активности антиоксидантных систем в разных типах клеток. Фрагменты окисленной вкДНК индуцируют повышение уровня активных форм кислорода в HUVEC в течение первых 3 часов, в МСК - в первые 15 минут, в MCF-7 – в течение 178 30 минут после начала воздействия. Воздействие вкДНКокси на фибробласты, культивируемые в условиях окислительного стресса, стимулировало синтез АФК через 72 часа инкубации. Неокисленные фрагменты вкДНК в HUVEC и MCF-7 стимулируют синтез АФК такое же время, что и окисленные фрагменты, но в меньшей степени. В МСК неокисленные фрагменты вкДНК, в отличие от окисленных, вызывают синтез АФК длительное время, при этом синтез АФК тем выше, чем выше концентрация неокисленной вкДНК. Добавление неокисленных фрагментов к фибробластам, культивируемым в условиях окислительного стресса, снижало синтез АФК. 3.2.6. Окислительные модификации вкДНК индуцируют повышение уровня окислительных модификаций собственной ДНК в ядрах клеток Наиболее сильная индукция активных форм кислорода на присутствие в среде культивирования окисленной ДНК наблюдалась в раковых клетках MCF-7 сразу после добавления ДНКокси [Kostyuk at al., 2013]. Вполне вероятно, интенсивный синтез АФК в клетках в первые минуты после добавления в среду гДНКокси может вызывать окисление и повреждению ДНК ядер клеток (рисунок 3.2.23) [Kostyuk at al., 2013]. Рисунок 3.2.23. Анализ содержания 8-oxodG в клетках, культивируемых в присутствии образцов ДНК. А - Окраска клеток антителами к 8-оксигуанозину, ядра окрашены DAPI. Клетки инкубировали с фрагментами гДНК и гДНКокси(50нг/мл) в течение 1 часа, фиксировали формальдегидом, обрабатывали 0.1 % тритоном Х100 и антителами к 8-oxodG (вторичные антитела коньюгированы с РЕ). Б – типы окраски клеток, обработанных гДНКокси, антителами к 8-oxodG (1 - окрашены ядра клеток; 2 окрашена цитоплазма клеток; 3 - окрашены микроядра в цитоплазме клеток). B. Частота ядер, содержащих 8-oxodG. (*) - достоверное отличие от контроля, непараметрический U-тест (p < 0.05). 179 В качестве маркера окисления мы использовали распространенный маркер окисления ДНК - 8-oxodG, который определяли в фиксированных клетках с помощью антител к 8-oxodG, меченных фикоэритрином (PE) (рисунок 3.2.23). Как гДНК, так и гДНКокси, вызывают увеличение количества окрашенных антителами к 8-оксигуанозину клеток MCF-7 по сравнению с контролем ( рисунок 3.2.23. А). Анализ клеток, обработанных гДНКокси, при большом увеличении позволяет выявить 3 основных типа окраски клеток: (1) - окрашены ядра клеток; (2) - окрашена цитоплазма клеток; (3) - окрашены микроядра в цитоплазме клеток ( рисунок 3.2.23. Б) [Kostyuk at al., 2013]. В контрольных клетках мы детектировали преимущественно третий тип окраски. При действии гДНКокси увеличивается количество окрашенных ядер ( рисунок 3.2.23. А, С). Поскольку гДНКокси локализована в цитоплазме и не проникает в ядро клетки, мы полагаем, что наблюдаемая окраска ядер связана с окислением ДНК в ядрах клеток [Kostyuk at al., 2013]. Таким образом, интенсивный синтез АФК в клетках в присутствии гДНКокси повышает уровень окисления ДНК ядер клеток. Поскольку было установлено, что митохондрии увеличивают синтез АФК в присутствии гДНКокси (рисунок3, 3. 21), то цитоплазматическое окрашивание по 8- oxodG может быть вызвано не только локализацией в цитоплазме экзогенной гДНКокси, но и увеличением уровня окисления митохондриальной ДНК. Об этом свидетельствуют также данные рисунок 3.2.5. Б: не все сигналы от зонда гДНКred-окси и 8-oxodG совпадают [Kostyuk at al., 2013]. Мы проверили это предположение, последовательно окрасив клетки красителем митохондрий - Mito-tracker-ом и антителами к 8-oxodG, меченными FITC (рисунок 3.2.24). Рисунок 3.2.24. Ко-локализация в клетках митохондрий и 8-oxodG. Клетки сначала инкубировали 30 минут с гДНКокси (50 нг/мл), далее на 15 минут добавляли Mitotracker (30 n), и клетки фотографировали. Далее клетки фиксировали 3% формальдегидом, обрабатывали 0,1 % тритоном Х100 и и антителами к 8-oxodG, меченными FITC и снова фотографировали. 180 Клетки сначала инкубировали 30 минут с гДНКокси (50 нг/мл), далее на 15 минут добавляли Mito-tracker и клетки фотографировали. Далее клетки фиксировали формальдегидом, обрабатывали тритоном Х100 и и антителами к 8-oxodG, меченными FITC и снова фотографировали. Как следует из рисунок 3.2.24, часть сигналов, но не все, от красителя Mito-tracker и 8-oxodG перекрывается (желтое окрашивание) [Kostyuk at al., 2013]. Таким образом, увеличение уровня АФК при действии на клетки гДНКокси приводит к окислению мтДНК в части митохондрий. Уровень окисления клеточной ДНК, индуцируемый гДНКокси, можно значительно снизить, применив блокатор АФК. С этой целью клетки перед добавлением гДНКокси 0,5 часа инкубировали в присутствии 0,15 мM N-ацетил-цистеина (N-acetylcysteine, NAC). Метод проточной цитометрии подтвердил данные флуоресцентной микроскопии. Культивирование клеток в присутствии гДНКокси сопровождалось появлением фракции клеток с увеличенным содержанием 8-oxodG, рисунок 3.2.25. А, сплошная кривая [Kostyuk at al., 2013]. Если клетки культивировали в присутствии NAC и гДНКокси, то количество клеток с высоким содержанием 8-oxodG снижалось, рисунок 3.2.25.А, пунктир. Снижалось также и количество ядер, в которых мы визуально тестировали наличие 8-oxodG, рисунок 3.2.25. Б [Kostyuk at al., 2013]. Рисунок 3.2.25. А – Влияние NAC на содержание в клетках 8-oxodG. Метод проточной цитометрии. Клетки инкубировали 30 минут в присутствии 0,15 мM NAC, далее добавляли гДНКокси на 1 час и анализировали с помощью антител к 8-oxodG и РЕконъюгированных вторичных антител. Фоновая флуоресценция – флуоресценция РЕконъюгированных вторичных антител (зеленый цвет). Б – Относительное содержание ядер, содержащих 8-oxodG в необработанных клетках, клетках, обработанных гДНК и гДНКокси (серые столбики). Светло-серый столбик: перед добавлением гДНКокси клетки инкубировали 30 минут в присутствии 0,15 мM NAC. (*) –достоверные отличия с контрольными клетками, p < 0.05, непараметрический U-тест. 181 Таким образом, транзиторное увеличение уровня АФК вблизи митохондрий в районах цитоплазмы, сближенных с ядром, сопровождается окислительной модификацией ДНК ядер. 3.2.7. Окисленные фрагменты вкДНК индуцируют кратковременную экспрессию NOX4 в разных типах клеток. При физиологических условиях NADPH - оксидазы (NOX) являются важным источником АФК. Семейство NADPH – оксидаз включает в себя 5 ферментов NOX 1-5 и DUOX l и 2 [Weyemi et al., 2012]. NOX(1-5) являются клеточными трансмембранными оксидоредуктазами, их каталитическая активность обусловлена связыванием NADPH в Сконцевой области фермента и переносом электронов на молекулярный кислород с образованием короткоживущего O2·, который затем преобразуется в перекись водорода (H2O2) и радикал гидроксила (· OH-) [Chen et al., 2012; Kawahara et al., 2007]. HUVEC. В клетках сосудистой системы, в том числе, в эндотелиальных клетках, наиболее распространенной изоформой NOX является NOX4 [Schroder, et al., 2012]. В эндотелиальных клетках NOX4 может быть локализован как на мембране клеток, так и на структурах внутри клетки (в эндоплазматическом ретикулуме), а также около и внутри ядра, что может определять различную активность фермента, тип продуцируемых АФК, активацию различных путей передачи сигнала [Weyemi et al., 2012]. NOX4 является постоянно активным ферментом, количество активных форм кислорода (АФК), производимых NOX4, в первую очередь регулируется на уровне транскрипции [Chen et al., 2012]. Уровень экспрессии NOX4 динамически регулируется в ответ на широкий спектр воздействий, в том числе, и на воздействие ионизирующего излучения [Lyle et al., 2009]. Мы предположили, что образцы вкДНК также могут изменять уровень экспрессии гена NOX4. К клеткам HUVEC были добавлены образцы вкДНК и модельной ДНК с различными свойствами, клетки инкубировали 3 часа, затем измеряли количество РНК NOX4 методом ПЦР в реальном времени [Kostyuk et al., 2011]. В качестве контроля использовали клетки, культивируемые в тех же условиях, но без добавления экзогенной ДНК. Для сравнения брали клетки через 1 час после облучения ионизирующей радиацией в дозе 10 сГр. При анализе полученных результатов, представленных на рисунок 3.2.26, были выявлены следующие закономерности. На экспрессию РНК гена NOX4 в HUVEC не оказывают влияния геномная ДНК, вкДНК, полученная из среды культивирования интактных HUVEC и вкДНК, выделенная из плазмы здоровых доноров [Kostyuk et al., 2011]. 182 Рисунок 3.2.26. Уровень экспрессии РНК гена NOX4 в HUVEC при инкубировании клеток с окисленными и неокисленными фрагментами вкДНК. Образцы вкДНК добавляли к клеткам эндотелия (концентрации обозначены на рисунке), экспрессию гена NOX4 измеряли через 3 часа инкубации. Эксперимент повторен 3 раза на 3-х культурах HUVEC. Сокращения: ИИ – ионизирующее излучение, ЗД – здоровые доноры, ОИМ – острый инфаркт миокарда. (*) –достоверные отличия с контрольными клетками, p < 0.05, непараметрический U-тест. Изменение свойств вкДНК среды культивирования приводит к изменению уровня экспрессии гена NOX4. Культивирование клеток в присутствии вкДНК из среды культивирования облученных в дозе 10 сГр клеток HUVEC, приводит к повышению количества РНК гена NOX4 в 3 раза – в той же степени, что и действие стандартного индуктора окислительного стресса – ионизирующего излучения в малых дозах [Kostyuk et al., 2011]. Образцы вкДНК больных ОИМ с высоким содержанием окислительных модификаций (410 (8-oxodG)/106 нуклеозидов ДНК) наиболее сильно стимулировали повышение уровня экспрессии РНК NOX4 – более, чем в 6 раз. В составе вкДНК среды культивирования облученных клеток накапливаются окислительные модификации [Kostyuk et al., 2011], в составе вкДНК больных ОИМ также повышен уровень окислительных модификаций [Loseva et al., 2012] и ГЦ-богатых последовательностей. Поэтому представлялось целесообразным исследование влияния модельных ДНК с измененными свойствами на экспрессию гена NOX4 (рисунок 3.2.26). Анализ полученных результатов выявил следующее: 183 - Модельные ГЦ-обогащенные фрагменты ДНК – п(рДНК), стимулируют экспрессию гена NOX4 в 2-4 раза, при этом с повышением концентрации ГЦ-фрагментов возрастает и экспрессия гена NOX4 [Kostyuk et al., 2011]. - Низкие концентрации окисленной ДНК действуют эффективнее, чем высокие концентрации. Сильно окисленная ДНК (2900 (8-oxodG)/106 нуклеозидов) в низкой концентрации повышает экспрессию гена NOX4 более, чем в 7 раз, слабо окисленная ДНК (400 (8-oxodG)/106 нуклеозидов, концентрация – 20 нг/мл) – повышают экспрессию гена NOX4 в 3 раза – примерно в той же степени, что и малые дозы радиации, и вкДНК облученных клеток. С увеличением концентрации окисленной ДНК, ее влияние на экспрессию гена NOX4 уменьшается, а высокая концентрация слабо окисленной ДНК – 250 нг/мл не влияет на количество РНК гена NOX4 [Kostyuk et al., 2011]. Вероятнее всего, действие вкДНК больных ОИМ на экспрессию гена NOX4 связано с синергическим действием, как окисленных фрагментов, так и ГЦ-богатых последовательностей. Мы сравнили уровень АФК и уровень экспрессии гена NOX4 при добавлении различных образцов ДНК в концентрации 20 нг/мл в среду культивирования HUVEC. Наблюдалась положительная корреляция между увеличением экспрессии гена NOX4 и количеством АФК определяемых в HUVEC (рисунок 3.2.27). Рисунок 3.2.27. Зависимость уровня АФК в клетках от уровня экспрессии гена NOX4. Сокращения: ЗД – здоровые доноры, ОИМ – острый инфаркт миокарда, К – контроль (интактные клетки). Приведены данные линейной регрессии. Это подтверждает наше предположение, что образцы окисленной ДНК, так же, как и ГЦ-богатые фрагменты в составе ДНК стимулируют образование АФК в культуре HUVEC, главным образом, за счет индукции гена NOX4. 184 Поскольку показано, что уровень мРНК NOX4 не всегда коррелирует с уровнем экспрессии белка [Chen et al., 2012], исследовали изменение экспрессии фермента NOX4 в HUVEC при неокисленных добавлении образцов в среду ДНК. культивирования Для выявления экзогенных белка окисленных NOX4 и методом иммунофлуоресценции использовали антитела к NOX4, меченые флуоресцеином (рисунок3.2.28). Рисунок3.2.28. Экспрессия фермента NOX4 в HUVEC (увеличение Х100). Использовались антитела к NOX4, меченые флуоресцеином, ядра окрашены DAPI. Концентрация добавляемых образцов ДНК (указаны на рисунке) - 50 нг/мл, время – 1час. Фотографирование проводилось при одинаковой выдержке. Фермент NOX4 в HUVEC локализован в цитоплазме и вблизи клеточной мембраны. Через 1 час после добавления в среду вкДНКокси1 в концентрации 50 нг/мл наблюдается высокий уровень экспрессии белка NOX4 в значительном количестве клеток. Экспрессия NOX4 усиливается и на поверхности клеток, и в участках цитоплазмы, сближенных с ядром, где окраской DCF детектировалось увеличение количества АФК. В меньшей степени стимуляция экспрессии NOX4 в HUVEC происходит при добавлении неокисленной гДНК. Было высказано предположение, что фермент NOX4, может окислять неокисленные образцы экзогенной ДНК, связанные с поверхностью клеток, что может вызывать пролонгированную во времени продукцию АФК, наблюдаемую в присутствие фрагментов неокисленной ДНК. Поэтому была исследована колокализация неокисленного меченного образца гДНКred и фермента NOX4 (рисунок 3.2.29). Часть сигналов от гДНКred и NOX4 в клетках совпадали, что подтверждает наше предположение – в некоторых местах связывания неокисленной ДНК с клеткой расположены ферменты NOX4, продуцирующие супероксиданион, являющийся активным окислителем. NOX4 продуцирует АФК, которые могут окислять часть молекул вкДНК, связанных с клеткой, превращая вкДНК в биологически активную молекулу. MCF-7. Мы обнаружили, что в клетках МСF-7 H2DCFH-DA окрашивает контрольные клетки преимущественно по поверхности клеточной мембраны, причем после отмывки 185 PBS интенсивность окраски значительно уменьшается [Kostyuk et al., 2013]. Источником АФК вблизи клеточной мембраны обычно являются ферменты семейства NOX [Weyemi et al., 2012]. гДНК (50 нг/мл) вызывает появление небольшого количества окрашенных гранул в цитоплазме, окраска этих гранул более стойкая и выдерживает отмывки PBS [Kostyuk et al., 2013]. Рисунок 3.2.29. Локализация в HUVEC меченой пробы гДНКred и NOX4 - фермента, продуцирующего АФК. Клетки культивировали в присутствии образца гДНКRed, введенного на 1 час в среду культивирования клеток в концентрации 50 нг/мл. Области совместной локализации фрагментов ДНК и NOX4 окрашены в желтый цвет. Расположение этих зеленых гранул производного DCF, в основном, совпадает с расположением меченного ДНК-зонда гДНКred, рисунок3.2.20.Б. По-видимому, взаимодействие гДНК с клеточными структурами стимулирует синтез АФК в месте контакта [Kostyuk et al., 2013]. Кроме того, показано, что в раковых клетках NOX4 может иметь митохондриальную локализацию [Graham et al., 2010]. Вероятно, «взрывы» синтеза АФК в MCF-7 могут быть обусловлены воздействием вкДНКокси на изоформу NOX4, расположенного в митохондриях, в результате такого воздействия начинается активная продукция АФК. 186 Поскольку уровень фермента NOX4 регулируется на уровне транскрипции, мы исследовали уровень экспрессии гена NOX4 в MCF-7 при действии неокисленных ГЦбогатых и окисленных фрагментов вкДНК (рисунок3.2.30). Рисунок 3.2.30. Уровень экспрессии гена NOX4 в клетках MCF-7 при действии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК. Количество РНК NOX4 - среднее значение экспрессии гена NOX4 при воздействии образца вкДНК (три эксперимента) по отношению к экспрессии гена NOX4 в контроле – интактных MCF-7. В качестве гена внутреннего стандарта использован ген ТВР. Клетки MCF-7 культивировали 30 минут и 2 часа в присутствии образцов ДНК в концентрации 50 нг/мл. (*) – достоверные отличия с контрольными клетками, p < 0.001, непараметрический U-тест. ГЦ-богатых фрагментов вкДНК – п(рДНК) и pBR322 уровень экспрессии NOX4 в течение 2-х часов статистически значимо не изменяется. МСК. Аналогичная картина изменения экспрессии гена NOX4 при действии окисленных фрагментов ДНК обнаружена в МСК (рисунок 3.2.31): гДНКокси и п(рДНК)окси, вкДНК больных РМЖ и ОИМ индуцируют повышение уровня экспрессии гена NOX4 в 2,5 -3 раза через 20 минут, а через 1 час уровень экспрессии NOX4 снижается. Однако уровень экспрессии NOX4 в МСК возрастает при действии неокисленных фрагментов гДНК и ГЦ-богатой п(рДНК) в 2 – 2,5 раза через 1 час после добавления образцов (рисунок 3.2.31). Уровень экспрессии гена NOX4 повышен при действии гДНКокси и п(рДНК)окси в 2,5 – 3 раза в первые 30 минут и снижается через 2 часа после добавления окисленных ДНК к среде культивирования MCF-7. При действии неокисленных фрагментов гДНК. 187 Рисунок 3.2.31. Уровень экспрессии гена NOX4 в клетках MCК при действии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК. Количество РНК NOX4 - среднее значение экспрессии гена NOX4 при воздействии образца вкДНК (от трех экспериментов) по отношению к экспрессии гена NOX4 в контроле – интактных MCК. В качестве гена внутреннего стандарта использован ген ТВР. МСК культивировали 20 минут и 1 час в присутствии образцов ДНК в концентрации 50 нг/мл. (*) – достоверные отличия с контрольными клетками, p < 0.001, непараметрический U-тест. Таким образом, в клетках разных типов окисленные фрагменты вкДНК вызывают кратковременное повышение экспрессии гена NOX4. В HUVEC окисленные фрагменты вкДНК стимулируют повышение экспрессии NOX4 в течение часа, в МСК и MCF-7 – в течение 20-30 минут. Неокисленные фрагменты в HUVEC и MCF-7 не стимулировали экспрессию в течение первых 3-х часов после добавления в среду культивирования, а в МСК воздействие неокисленных и ГЦ-богатых фрагментов приводит к стимуляции экспрессии NOX4 уже через 1 час после добавления. 3.2.7. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают быстро репарируемые разрывы ДНК ядер клеток Накопление в составе вкДНК ГЦ-последовательностей и/или окислительных модификаций стимулирует ранний ответ клеток разных типов, сопровождающийся накоплением АФК в околоядерном пространстве клеток. АФК вызывают окислительную модификацию ядерной ДНК. Окислительная модификация может приводить к появлению в цепи ДНК одно- и двунитевых разрывов [Weyemi et al., 2012].. Чтобы проверить это предположение, оценили уровень повреждения ДНК в ядрах клеток тремя методами – методом комет, методом анализа фосфорилированной формы гистона Н2АХ и TUNELметодом. 188 Повреждение ДНК обычно измеряется на уровне отдельных клеток с использованием метода комет (гель-электрофорез одиночных клеток) [Lorenzo et al., 2013]. Щелочной вариант метода комет позволяет оценить суммарное количество одно- и двунитевых разрывов в клетках и широко используется для оценки повреждения ДНК [Lorenzo et al., 2013; Collins 2013; Vasquez 2012]. Исследуемые клетки лизируют, затем подвергают щелочному электрофорезу в агарозном геле, окрашенном ДНК-связывающим красителем (например, бромистым этидием). Петли ДНК, содержащие разрывы, находятся в релаксированном состоянии и перемещаются к аноду, образуя кометоподобные изображения, анализируемые с помощью флуоресцентной микроскопии [Vasquez 2012]. Степень повреждения ДНК (разрывы нити) выражается в виде процента флуоресцирующей ДНК в хвосте кометы [Lorenzo et al., 2013]. Чем больше разрывов ДНК содержится в ядерной ДНК, тем длиннее следы выброса ДНК из ядер (момент хвоста кометы) [Lorenzo et al., 2013]. Кометы с небольшой “головой” и длинным и широким хвостом в англоязычной литературе принято называть ‘hedgehog’ (“еж”) или ‘ghosts’ (“призрак”), или ‘clouds’ (“облако”) [Collins 2013; Vasquez 2012]. Считается, что кометы ‘hedgehog’ образуются после умеренного воздействия на клетки, например, H2O2, но если клетки инкубировать какое-то время после воздействия, комет подобного вида становится меньше. Предполагается, что это происходит не потому, что ДНК деградирует дальше и исчезает из геля, а потому, что ДНК репарируется [Lorenzo et al., 2013]. Метод комет может обнаруживать и ДНК ядер клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза, но в таком случае видно скорее не комету, а мазок непривязанной к ядру ДНК. Наблюдаемые же ‘hedgehog’ кометы соответствовуют одному уровню из континуума генотоксических повреждений, но не являются диагностическим признаком апоптоза, и их не следует рассматривать как индикатор цитотоксичности [Lorenzo et al., 2013]. 3.2.8.1. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают в ядрах HUVEC быстро репарируемые разрывы ДНК На рисунок3.2.32. приведены фотографии, полученные при использовании щелочного варианта метода комет после обработки клеток HUVEC перекисью водорода и клеток, которые инкубировали с различными пробами ДНК. В качестве контроля использовались интактные клетки эндотелия. Форма комет при культивировании с различными образцами ДНК отличается от комет, которые детектировали при использовании окислителя Н2О2 (рисунок 3.2.32), и указывает на неравномерную фрагментацию ДНК по всему объему ядра. Не наблюдается характерной для действия Н2О2 деконденсации хроматина по объему ядра. Видимо, существуют участки с повышенной фрагментацией хроматина, не затрагивающей остальные участки. Можно 189 предположить, что фрагментация ДНК происходит вблизи ядерной мембраны, где наблюдается повышенный уровень синтеза АФК в результате воздействия образцов ДНК. Более выраженным хвост кометы был при действии ДНКокси, что соответствует более высокому уровню синтеза АФК, индуцируемому окисленной ДНК. Рисунок 3.2.32. Примеры комет для HUVEC через 30 минут после добавления к клеткам образцов вкДНК (50 нг/мл) и Н2О2 (100 мкМ), щелочной вариант. Окраска бромистым этидием. Увеличение ×100. Количественная оценка «момента хвоста кометы» и «% ДНК в хвосте кометы» для клеток HUVEC, культивируемых 30 минут, 1 час и 3 часа с образцами неокисленной гДНК, ГЦ-богатой п(рДНК) и ДНКокси в концентрации 50 нг/мл показана на рисунке 3.2.33. В качестве контроля использовались интактные клетки, в качестве положительного контроля – HUVEC, обработанные Н2О2. Через 30 минут от момента добавления в среду культивирования HUVEC окисленной гДНКокси (50 нг/мл) значительно увеличивается количество разрывов хроматина, причем не обнаруживается существенной разницы между образцами гДНК, ГЦ-богатой вкДНК и гДНКокси. Распределения «моментов хвоста кометы» и «% ДНК в хвосте кометы» при действии всех образцов вкДНК не различаются между собой (р > 0,5), но отличаются от контроля и от распределения при действии Н2О2 (р < 0,01). Через 3 часа культивирования количество разрывов хроматина снижается в присутствии всех образцов ДНК практически до контрольного уровня (рис 3.2.33). При этом распределения «моментов хвоста кометы» и «% ДНК в хвосте кометы» при действии гДНК, гДНКокси не различаются между собой и не отличаются от контроля (р>0,5), распределения при действии п(рДНК) отличается от контроля (р>0,5), что свидетельствует о более пролонгированном повреждающем воздействии п(рДНК) на ядра клеток HUVEC. 190 Таким образом, было показано, что изменение ГЦ - состава и уровня окисления ДНК в среде культивирования вызывает быстрый ответ клеток - возрастает количество ядер, которые содержат разрывы ДНК (рис 3.2.33). Рисунок 3.2.33. Количественный анализ характеристик комет, которые образуются при действии на HUVEC 50 нг/мл образцов вкДНК, время действия указано на рисунке. Данные статистической обработки – в тексте (тест КолмогороваСмирнова). Накопление однонитевых разрывов потенциально может приводить к увеличению количества двунитевых разрывов (ДР) в ДНК ядер клеток, что представляет наибольшую опасность для жизнедеятельности клетки. Поэтому, мы проанализировали, вызывает ли вкДНК с измененными свойствами, индуцирующая окислительный стресс, образование двунитевых разрывов (ДР) хроматина. Один из способов выявления ДР ДНК основан на 191 том, что высококонсервативный гистоновый белок, участвующий в упаковке ДНК хроматина (Н2АХ), фосфорилируется по остатоку серина 139 в сайте образования разрыва ДНК [Scully et al., 2013; Lobrich et al., 2010]. Реакция быстро распространяется, за минуту в нее оказывается вовлечено от сотен до тысяч молекул Н2АХ, что может составлять несколько мегабаз ДНК хроматина, эквивалентно фланкирующего сайт ДР [Bonner, 2003], после чего связанные с меченными антителами фосфорилированные гистоны, называемые γ-Н2АХ-фокусами (γ-фокусы), доступны для визуализации в клеточном ядре [Scully et al., 2013]. При окраске DAPI с использованием антител к гистону γ-Н2АХ в контроле наблюдаются ядра клеток 5-ти типов (рисунок 3.2.34). Рисунок 3.2.34. А - Основные типы ядер клеток HUVEC, окрашенных с использованием меченых FITC антител к гистону γ-Н2АХ. Ядра окрашены DAPI. (1) – большинство ядер не содержат двунитевых разрывов (ДР); (2) – ядро содержит 1-2 ДР; (3) – ядро содержит несколько ДР; (4) – ядра с множественными ДР. Б, С - Окисленная гДНКокси (50 нг/мл, 40 минут) стимулирует в HUVEC увеличение ядер 2 и 3 типа с несколькими гамма-фокусами. Б – ядра клеток с сохранившейся мембраной; С (5) – клетки с фрагментированным хроматином. 192 (1) – большинство ядер не содержат ДР; (2) – ядро содержит 1-2 ДР; (3) – ядро содержит несколько ДР; (4) – ядра с множественными ДР; (5) – апоптотические тельца, которые содержат сливающиеся сигналы ДР (рисунок 3.2.34) [Ermakov et al., 2011]. Неспецифическую сорбцию оценивали с помощью мышиных иммуноглобулинов, меченых FITC [Ermakov et al., 2011]. В популяции контрольных клеток HUVEC присутствуют, в основном, клетки 1 типа, не содержащих фокусов гистона γ-Н2АХ. Приблизительно 5 % клеток имеют ядра 2го и 3-го типа с одним или несколькими гамма фокусами на ядро. В ядрах примерно 2 % клеток присутствуют множественные гамма-фокусы, распределенные по объему ядра (рисунок 3.2.34) [Ermakov et al., 2011]. Действие образцов окисленной ДНК, ГЦ-ДНК и, в меньшей степени, гДНК (в концентрации 50 нг/мл, 40 минут) на клетки HUVEC сопровождается увеличением фракции клеток с ядрами 2 – 4 типов [Ermakov et al., 2011]. То есть окисленная ДНК стимулирует образование двунитевых разрывов хроматина в части клеток. При этом гамма фокусы локализуются преимущественно в районах хроматина, расположенных вблизи ядерной мембраны (рисунок 3.2.34 Б). В перинуклеарном пространстве клеток наблюдалось накопление АФК при действии окисленных фрагментов ДНК и ГЦ-богатых фрагментов ДНК на HUVEC [Ermakov et al., 2011]. Вероятно, окислительный стресс, вызываемый вкДНК с измененными свойствами, индуцирует повреждение ядерной ДНК клеток с образованием одно- и двунитевых разрывов. Кроме того, при действии окисленной ДНКокси на клетки в популяции HUVEC возростает количество апоптотических телец, содержащих значительные количества гамма-фокусов, которые являются результатом фрагментации хроматина апоптотических клеток (рисунок 3.2.34 С), что свидетельствует о гибели части клеток в результате накопления нерепарируемых двунитевых разрывов ДНК ядер. Для количественной оценки динамики накопления двунитевых разрывов ДНК при действии на HUVEC образцов окисленной ДНК и ГЦ-ДНК в концентрации 50 нг/мл использовали метод проточной цитометрии (рисунок 3.2.35). Для определения количества ДНК в ядре фиксированные клетки окрашивали пропидий йодидом, количество двунитевых разрывов определяли с помощью антител к гистону γ-Н2АХ – уровень флуоресценции клетки зависит от количества гамма - фокусов в ядре. С помощью метода проточной цитометрии в HUVEC выделили три субпопуляции клеток. Фракция R1 содержит клетки с низким уровнем флуоресценции. Это либо неокрашенные клетки, либо клетки с малым числом гамма-фокусов (типы 1 и 2, рисунок3.2.34, 3.2.35). Фракция R2 содержит клетки с большим количеством двунитевых разрывов, но с сохраненным 193 хроматином (типы 3 и 4, рисунок 3.2.34, 3.2.35). Фракция R3 – это клетки, которые потеряли часть ДНК, апоптотические тельца. В ядрах клеток фракции R3 самое высокое содержание гистона на единицу ДНК, это клетки, погибающие в результате накопления двунитевых разрывов ДНК. Рисунок 3.2.35. Анализ двунитевых разрывов ДНК в HUVEC методом проточной цитометрии. Условия: 50 нг/мл ДНК, время действия указано на рисунке. (а) – данные о количестве ДНК и уровне ДР; вся популяция HUVEC разделена на три субпопуляции, обозначенные R1-R3. Условия: 50 нг/мл ДНК, 1 час; (б) – средние значения интенсивности сигнала клеток основной фракции R1; (в) – размер фракции клеток с высоким количеством ДР; (г) – размер фракции гиподиплоидных клеток. (*) – достоверные отличия с контрольными клетками, p < 0.001, непараметрический U-тест. При действии на HUVEC образцов окисленной ДНК, ГЦ-ДНК и, в меньшей степени, гДНК в концентрации 50 нг/мл наблюдалось увеличение количества двунитевых разрывов ДНК. Через 30 минут происходит увеличение числа клеток фракции R2 с большим количеством двунитевых разрывов ДНК в 3-4 раза в случае действия ДНКокси и ГЦ-ДНК, в 2 – 2, 5 раза – в случае действия гДНК (В и Б, рисунок 3.2.35). Незначительно, приблизительно в 1,5 раза увеличивается число клеток фракции R1 с единичными разрывами ДНК при действии ДНКокси и ГЦ-ДНК. При этом количество гиподиплоидных клеток не изменялось. Через 1 час количество клеток с ДР ДНК снижается, при этом наблюдается увеличение числа гиподиплоидных клеток. Это может указывать на дальнейшую фрагментацию хроматина части апоптотических клеток фракции R2 с множественными разрывами ДНК. Через 3 часа инкубации с образцами ДНК количество клеток с разрывами ДНК снижается до контрольного уровня и ниже. 194 С помощью двух независимых методов показано образование одно- и двунитевых разрывов ДНК вследствие действия на клетки вкДНК с измененными свойствами. Изменение ГЦ-состава, окислительная модификация вкДНК приводит к образованию активных форм кислорода в клетках, которые накапливаются в околоядерной области клеток [Kostyuk at al., 2011]. Активные формы кислорода вызывают окислительную модификацию оснований ДНК в ядре, что приводит к повреждению хроматина и образованию одно- и двунитевых разрывов [Ермаков с соавт., 2011]. Двунитевые разрывы образуются преимущественно в примембранных областях ядра. Это, с одной стороны, может быть связано с доступностью этих участков хроматина активным формам кислорода, а с другой стороны – с тем, что примембранные области ядра обогащены АТбогатыми центромерными повторяющимися последовательностями генома, в которых гораздо легче образуются двунитевые разрывы при накоплении однонитевых [Вейко, Спитковский, 2001]. Образование разрывов носит временный характер – уже через 3 часа их количество снижается в результате активации процессов репарации и системы антиоксидантного ответа [Kostyuk at al., 2011]. Целостность ядер большинства клеток популяции HUVEC восстанавливается, число гиподиплоидных клеток снижается. Таким образом, ГЦ-богатые и, в большей степени, окисленные фрагменты вкДНК вызывают в ядрах HUVEC быстрорепарируемые разрывы ДНК. 3.2.8.2. Внеклеточная ДНК с измененными свойствами стимулирует образование и репарацию разрывов хроматина культивируемых мезенхимных стволовых клеток человека При повреждении тканей в организме человека накапливается вкДНК с измененными свойствами. МСК перемещаются к очагу повреждения [Sohni and Verfaillie, 2013], где потенциально могут взаимодействовать с вкДНК. Ответ недифференцированных клеток на присутствие вкДНК с измененными свойствами может отличаться от ответа дифференцированных клеток. Поэтому мы исследовали ранний ответ МСК на изменение свойств вкДНК. Концентрацию и состав вкДНК изменяли, добавляя экзогенные фрагменты вкДНК. Концентрация эндогенной вкДНК при культивировании МСК составляет 23 ± 3 нг/мл. При добавлении образцов экзогенных фрагментов в концентрации 50 нг/мл, концентрация вкДНК в среде культивирования увеличивалась ~ в 3 раза. ГЦ-состав вкДНК изменяли добавлением ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК). Наличие суммарного количества одно- и двунитевых разрывов хроматина в МСК исследовали с использованием щелочного варианта метода комет. В качестве воздействия, которое достоверно сопровождается возникновением разрывов ДНК, использовали ионизирующее излучение в дозе 10 сГр. При анализе препаратов в популяции МСК 195 встречаются клетки 4-х типов. Клетки 1-го типа не содержат разрывов ДНК. Клетки 2-го типа содержат небольшое количество разрывов ДНК. В клетках 3-го типа ДНК сильно фрагментирована. Тип 4-й – это апоптотические клетки с очень высоким уровнем фрагментации ДНК ( рисунок 3.2.36. А). В контроле популяция МСК состоит на 90% из клеток 1-го типа ( рисунок 3.2.36. А). Добавление в среду культивирования МСК ГЦ-богатой п(рДНК) в первые 30 минут увеличивало число клеток 2-го типа, содержащих небольшое количество разрывов ДНК. Облучение МСК дозой 10сГр стимулировало образование множественных разрывов ДНК - в популяции облученных клеток через 30 минут после облучения содержались клетки преимущественно 3-го типа. На рисунок 3.2.36. Б приводятся данные, отражающие изменения суммарного количества клеток, которые содержат разрывы ДНК (2-3 типов), при добавлении в среду ГЦ-ДНК или при облучении. Через 3 часа после добавления ГЦДНК, так же, как и через 3 часа после облучения, количество клеток, содержащих разрывы ДНК, снижалось и приближалось к контрольному уровню, 3.2.36. Б. Рисунок 3.2.36. Анализ разрывов ДНК МСК методом комет (щелочной гельэлектрофорез). А – типы ядер клеток, которые встречаются на препаратах: (1) – ядра не содержат разрывов ДНК, (2) - ядра содержат небольшое количество разрывов ДНК, (3) – ядра сильно фрагментированы, (4) апоптотические клетки с очень высоким уровнем фрагментации ДНК. Б - изменение суммарного содержания ядер типов 2 и 3 в популяции МСК, культивируемых в присутствии ГЦ-ДНК (пунктир) или после облучения в дозе 10 сГр (сплошная линия). Суммированы данные трех независимых опытов. (*) пробы достоверно отличаются от контроля, p<0,05 (U – тест). Количество двунитевых разрывов в МСК анализировали в фиксированных клетках методом проточной цитометрии с помощью антител к гистона H2AX (γH2AX) (рисунок 3.2.37). фосфорилированной форме При анализе уровня флуоресценции были выделены две субпопуляции клеток: с высоким уровнем сигнала (R1) и основная фракция 196 МСК с низкой флуоресценцией (R2) (рисунок 3.2.37. А). В контроле фракция R1 составляет в среднем 6 ± 1% от всей популяции. Эта фракция содержит клетки с большим количеством маркера γH2AX. Количество таких клеток и уровень их флуоресценции возрастает более чем в 2 раза уже через 30 минут после увеличения концентрации любой ДНК в среде, а через 1 час начинает снижаться, к 3 часам достигая уровня контроля, рисунок3.2.37. Б, Г [Ермаков с соавт., 2010]. Средняя интенсивность флуоресценции клеток основной, слабофлуоресцирующей фракции R2 в первые минуты после добавления неокисленой вкДНК снижается ( рисунок 3.2.36. Б, Г), видимо, за счет увеличения фракции R1, содержащей двунитевые разрывы. Рисунок 3.2.37. Уровень ДР в МСК при культивировании клеток в присутствии образцов ДНК (50 нг/мл). Метод проточной цитометрии. Использовали антитела к гистону γH2AX, коньюгированные с ФИТЦ. А – контрольные МСК. R1 - субпопуляция клеток с высоким уровнем флуоресценции, R2 – фракция клеток с низким уровнем флуоресценции. Б, В – изменение средних значений интенсивности флуоресценции клеток фракции R1 (Б) и R2 (В) во времени. Г - зависимость количества клеток фракции R1 и изменение средних значений интенсивности флуоресценции клеток фракции R2 от времени инкубирования МСК с образцами неокисленной ДНК (гДНК и п(рДНК). Кривые построены по данным трех независимых опытов. Приводятся средние значения и стандартное отклонение. (*) - пробы достоверно отличаются от контроля, p<0,05 (U – тест). Далее интенсивность флуоресценции клеток R2 возрастает максимум на 30 % и через 2,5 часа снижается до уровня контроля. Таким образом, при увеличении концентрации вкДНК в среде культивирования в части клеток временно возрастает общее количество гистона γH2AX. Эффект наблюдается не более 1,5 - 2 часов от момента 197 добавления ДНК в среду культивирования. Снижение количества однонитевых разрывов через 3 часа после воздействия на МСК окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК регистрировали и методом TUNEL (рисунок 3.2.38). Метод проточной цитометрии позволяет оценить среднее содержание гистона γH2AX в клетке, которое не всегда отражает реальное повреждение клеточной ДНК [McManus et al., 2005]. Чтобы прояснить, чем вызваны количественные изменения уровня γH2AX в клетках сразу же после увеличения концентрации вкДНК в среде культивирования, мы проанализировали фиксированные и окрашенные антителами к γH2AX МСК методом флуоресцентной микроскопии (рисунок 3.2.39). Рисунок3.2.38. Однонитевые разрывы ДНК в МСК, тестируемые методом TUNEL. Время воздействия фрагментов вкДНК - 3 часа. Н2О2 – МСК, обработанные 40 мМ пероксидом водорода. (*) - отличия достоверны, p<0,05 (U – тест). Метод проточной цитометрии позволяет оценить среднее содержание гистона γH2AX в клетке, которое не всегда отражает реальное повреждение клеточной ДНК [McManus et al., 2005]. Чтобы прояснить, чем вызваны количественные изменения уровня γH2AX в клетках сразу же после увеличения концентрации вкДНК в среде культивирования, мы проанализировали фиксированные и окрашенные антителами к γH2AX МСК методом флуоресцентной микроскопии (рисунок 3.2.39). При анализе воздействия вкДНК на содержание γH2AX в популяции МСК методом флуоресцентной микроскопии получены те же результаты, что и при использовании проточной цитофлуориметрии. В контроле 12 ± 3 % всех клеток окрашены, т.е. содержат повышенные количества γH2AX. При добавлении любой ДНК в среду количество клеток с экспрессией γH2AX через 30 минут возрастает более чем в 2 раза, но через 2 часа снижается (рисунок 3.2.39 А). Снижение более выражено в случае ГЦ-ДНК. Детальный анализ позволил выделить 4 основных типа окраски ядер МСК антителами к γH2AX (рисунок 3.2.39 Б). Ядра 1-го типа содержат заметные количества γH2AX, но при этом не наблюдаются выраженные гамма – фокусы, которые обычно указывают на место двунитевого разрыва в ДНК. Клетки 2-го типа содержат выраженные 198 гамма-фокусы, распределенные по всему ядру. В контроле фракция окрашенных клеток содержит 30, 55, 8 и 7 % соответственно клеток 1-4 типов (рисунок 3.2.39 В), что составляет 3,6; 6,6; 1,0 и 0,8 % от общего количества клеток популяции. Рисунок 3.2.39. Содержание гистона γH2AX в МСК при культивировании клеток в присутствии образцов ДНК (50 нг/мл), метод флуоресцентной микроскопии. А - относительные количества окрашенных клеток. Обозначения: геномная ДНК (сплошная линия); ГЦ-ДНК (пунктирная линия). Кривые построены по данным трех независимых опытов. Приводятся средние значения и стандартное отклонение. Б - Основные типы ядер контрольных клеток МСК, окрашенных с использованием антител к гистону γН2АХ. (1) – ядра содержат γH2AX, но при этом не наблюдаются выраженные гамма – фокусы, (2) – ядра содержат гамма-фокусы, (3) – ядра апоптотических клеток, которые содержат сливающиеся гамма-фокусы, (4) – ядра клеток в состоянии митоза. В - частота встречаемости типов ядер 1-4 в субпопуляции окрашенных клеток. По оси Х указан тип ДНК и цифрами обозначено время инкубирования. (*) - пробы достоверно отличаются от контроля, p<0,05 (U – тест). При добавлении образцов неокисленной ДНК в среду культивирования МСК в первые 30 минут наблюдается снижение количества клеток 1-го типа и увеличение количества клеток 2-го типа. Эффект более выражен в случае ГЦ – богатой п(рДНК). Через 3 часа наблюдается обратная картина – увеличение количества клеток 1-го типа и снижение количества клеток 2-го и 3-го типа ниже контрольного уровня. Таким образом, увеличение концентрации вкДНК способствует кратковременному увеличению числа клеток с четкими гамма-фокусами, что указывает на увеличение 199 количества клеток с двунитевыми разрывами ДНК, количество которых в случае ДНК и ГЦ-ДНК достигает соответственно 15 и 19% от всей популяции МСК. Суммируя данные для МСК, полученные тремя независимыми методами, можно сделать следующий вывод. При резком изменении концентрации внеклеточной ДНК в среде культивирования МСК наблюдается образование одно- и двунитевых разрывов ДНК в первые 30 минут. В это же время происходит значительное увеличение уровня АФК в МСК. Более выражен синтез АФК при действии на МСК неокисленных образцов ДНК, и кратковременное образование быстро репарируемых двунитевых разрывов более выражено в случае действия на МСК неокисленных образцов вкДНК. Таким образом, так же, как и в случае клеток эндотелия, синтез АФК может быть одной из причин образования разрывов ДНК в МСК. МСК являются пулом резервных клеток, использующимся организмом в критической ситуации и обладающим высоким пролиферативным потенциалом [Nagaria et al., 2012]. Первые минуты после изменения свойств вкДНК, могут являться критичными для МСК, поскольку возникающие разрывы хроматина опасны с точки зрения хромосомных перестроек и встраивания по местам разрывов последовательностей ДНК [Nagaria et al., 2012]. 3.2.8.3. Окисленные вкДНК стимулируют увеличение количества разрывов ДНК в ядрах клеток MCF-7 При действии образцов экзогенной ДНК на культуру раковых клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 показано окисление ДНК ядер, которое может так же, как в случае других клеток, сопровождаться появлением разрывов ДНК [Kostyuk et al., 2013]. Щелочным вариантом метода комет определили изменение суммарного содержания одно- и двунитевых разрывов в ДНК клеток MCF-7 при действии неокисленных и окисленных образцов ДНК (гДНК и гДНКокси). На препаратах МСF7 тестировали три основных типа ядер клеток: интактные ядра (рисунок 3.2.40 А, тип I), ядра со слабой фрагментацией хроматина (рисунок 3.2.40 А, тип II) и ядра с высоким уровнем фрагментации (рисунок 3.2.40 А, тип III) [Kostyuk et al., 2013]. Контрольные клетки МСF7 содержали преимущественно ядра I и II типов, что говорит о невысоком уровне фрагментации хроматина [Kostyuk et al., 2013]. Повышение в среде культивирования МСF7 концентрации гДНК приводило через 30 минут к незначительному увеличению количества разрывов ДНК в клетках –увеличивалось число клеток III-го типа, содержащих разрывы, рисунок 3.2.40 Б, В [Kostyuk et al., 2013]. Окисленные фрагменты ДНК в значительной степени стимулировали в МСF7 образование разрывов ДНК - ядра третьего типа в большом количестве встречались в клетках, 200 обработанных гДНКокси, причем их количество зависело от времени воздействия [Kostyuk et al., 2013]. На рисунке 3.2.40 Б, В приводятся данные количественного анализа показателей комет: момент хвоста кометы и процент ДНК в хвосте кометы. 30-ти минутная инкубация клеток с гДНКокси приводит к значительному увеличению количества разрывов ДНК клеток. Двухчасовая инкубация клеток с гДНК и гДНКокси приводит к сильному уменьшению количества разрывов ДНК, уровень фрагментации хроматина ядер падает ниже контрольных значений [Kostyuk et al., 2013]. Рисунок 3.2.40. Анализ разрывов ДНК в клетках MCF7, инкубированных с гДНК и гДНКокси (50нг/мл; 30 мин и 2 часа) методом комет в щелочных условиях. А Фотография основных типов ядер; Б - кумулятивные гистограммы для параметров комет: момент хвоста кометы и процент ДНК в хвосте кометы. Обозначения: 1контроль, 2гДНК, 3гДНКокси – фрагменты действовали на MCF-7 30 минут; 2а, 3а – гДНК и гДНКоки, соответственно, действовали на клетки 2 часа. В - Достоверность различий с контролем в полученных распределениях проанализирована с помощью статистики Колмогорова-Смирнова (в таблице приведены значения D и α). Двунитевые разрывы хроматина выявляли с помощью антител к гистону γH2AX, фосфорилированному по серину-139 [Lobrich et al, 2010]. Обнаружено несколько типов ядер MCF7, которые выявляются с помощью FITC - конъюгированных антител к гистону γН2АХ (рисунок 3.2.41). (1) – ядра клеток не содержат двунитевых разрывов; (2) ядра клеток имеют единичные ДР (1-2 на клетку); (3) – ядра клеток имеют несколько ДР (2 - 10 очагов γН2АХ на клетку); (4) - клетки с множественными ДР (рисунок 3.2.41) [Kostyuk et al., 2013]. При действии окисленной ДНК в первые 30 минут в популяции MCF-7 в 1,5 – 2 раза увеличивается количество клеток 4 типа и уменьшается число клеток 2-го типа [Kostyuk et al., 2013]. Через 2 часа после действия гДНКокси процентное соотношение разных типов клеток было таким же, как в контроле [Kostyuk et al., 2013]. Геномная ДНК способствовала увеличению количества клеток с множественными γН2АХ в меньшей степени, чем гДНКокси. 201 Рисунок 3.2.41. Двунитевые разрывы ДНК, возникающие при действии на MCF7 гДНКокси (50 нг/мл, 1 час). Клетки обрабатывали антителами к γH2AX, конъюгированными с FITC. Цифрами обозначены основные типы ядер: (1) – ядра клеток не содержат двунитевых разрывов (ДР); (2) ядра клеток имеют единичные ДР (1-2 на клетку); (3) – ядра клеток имеют несколько ДР (2 - 10 очагов γН2АХ на клетку); (4) γН2АХ - позитивные клетки с множественными двунитевыми разрывами, часть микроядер содержат двунитевые разрывы ДНК. Методом проточной цитометрии в культуре MCF- 7 выявили 3 фракции клеток, имеющих разный уровень флуоресценции (рисунок 3.2.42). Рисунок 3.2.42. Анализ гамма-фокусов методом проточной цитометрии. А основные фракции клеток. Б - распределение клеток по интенсивности свечения FL1γH2AX. С - содержание клеток во фракциях R1-R3. (*) - пробы достоверно отличаются от контроля, p<0,05 (U – тест). 202 Фракция R1 содержит наибольшее количество клеток (70-80%, рисунок 3.2.42 С), не имеющих гамма-фокусов, а следовательно, и двунитевых разрывов (соответствует 1-му типу ядер) (рисунок 3.2.42 и 3.2.41) [Kostyuk et al., 2013]. Фракция R2 содержит клетки, имеющие несколько ДР на клеточное ядро, в эту фракцию включены клетки с ядрами 2-го и 3-го типа (рисунок 3.2.40 и 3.2.41). Клетки, относящиеся к фракции R3, содержат ядра 4го типа с множественными двунитевыми разрывами, что соответствует максимальной флуоресценции FL1 (рисунок 3.3.42 и 3.2.41) [Kostyuk et al., 2013]. Воздействие гДНКокси на клетки популяции MCF-7 приводит к увеличению клеток фракции R3 примерно в 1,5 раза через 1 час после добавления фрагментов ДНК (рисунок 3.2.42 С). Параллельно снижается содержание клеток фракции R2 [Kostyuk et al., 2013]. Через 24 часа инкубации MCF7 с гДНКокси количество клеток с множественными разрывами ДНК снижается ниже контрольного уровня (рисунок 3.5.11 С) [Kostyuk et al., 2013]. гДНК вызывает в клетках MCF7 похожий, но менее выраженный ответ, изменения по сравнению с контролем недостоверны (р> 0,05). Таким образом, кратковременная (0.5 – 1 час) инкубация клеток MCF7 с гДНКокси приводит к возникновению разрывов ДНК. При более длительном воздействии гДНКокси (2 и 24 часа) в клетках развивается ответ, направленный на снижение уровня фрагментации хроматина. Уменьшение количества клеток, содержащих разрывы ДНК, может быть объяснено, как репарацией разрывов ДНК, так и апоптозом и/или откреплением клеток от носителя. В последнем случае клетки с поврежденной ДНК могут быть потеряны для анализа. Мы проанализировали количество клеток, которые остаются в среде культивирования после ее отделения от клеток и однократной промывки клеток PBS. Через 2 часа количество клеток в среде, в которой культивировали контрольные клетки, или клетки в присутствии гДНК и гДНКокси оставалось примерно одинаковым (p>0.05) и составляло около 2 % от общего количества клеток в культуре [Kostyuk et al., 2013]. Аналогичный результат был получен при оценке количества апоптотических клеток – число апоптотических клеток в культуре не изменялось [Kostyuk et al., 2013]. Таким образом, снижение количества клеток с разрывами ДНК в течение достаточного короткого времени культивирования с гДНК и гДНКокси происходит, вероятнее всего, благодаря репарации ДНК. Таким образом, краткосрочное воздействие гДНКокси на клетки популяции MCF-7 приводит к накоплению одно-и двунитевых разрывов цепи ДНК. Более длительное воздействие образцов ДНК (от 2 до 24 часов) вызывает компенсаторную 203 реакцию, которая приводит к снижению уровня фрагментации хроматина в клеточной популяции. 3.2.8.4. Окисленные фрагменты вкДНК снижают уровень двунитевых разрывов в HEF и HDF , культивируемых в условиях окислительного стресса Для исследования влияния вкДНК с окислительной модификацией на образование ДР в условиях хронического окислительного стресса дополнительно к собственной вкДНК фибробластов в среду культивирования однократно, в начале культивирования, вводили гДНК или ДНКокси1/ДНКокси2 в различной концентрации. Анализ уровня АФК в клетках проводили спустя 72 часа после культивирования в присутствии фрагментов ДНК [Kostyuk et al., 2013]. Исследовали действие гДНК и ДНКокси на клетки популяции фибробластов кожи взрослого человека (HDF) при концентрации 10, 20 и 100 нг/мл среды. В культуре клеток эмбриональных фибробластов легкого человека (HEF) исследовали действие гДНК и ДНКокси в концентрации 20 нг/мл (рисунок 3.2.43). Рисунок3.2.43. Двунитевые разрывы в фибробластах, тестируемые антителами к фосфорилированному гистону H2AX. Фотография контрольных клеток в видимом свете (а), в УФ-диапазоне с использованием красителя Н33258 (б) и при длине волны возбуждения 480, FITC (в). 1, 2, 3 – основные типы ядер с гамма-фокусами, встречающиеся в фибробластах. Клетки фиксировали парафармальдегидом (PFA), пермеабилизировали 0,1% тритоном X-100 и обрабатывали антителами к γ H2AX, конъюгированными с FITC. В качестве контроля использовали интактные HDF и HEF, которые культивировали либо в присутствии 2% сыворотки, либо без сыворотки [Kostyuk et al., 2013]. Все ДНК 204 содержали фрагменты примерно одинакового размера от ~0,5 до ~10 kb. На рисунке 3.2.43 (а-в) приведены фотографии фибробластов, окрашенных FITC- антителами к фосфорилированной форме гистона Н2АХ. В популяции фибробластов присутствуют клетки трех разных типов, содержащие ДР (рисунок 3.2.43). Большинство ядер фибробластов, составляющих фракцию окрашенных клеток при культивировании в присутствие сыворотки, содержат один или несколько гамма-фокусов (тип 1, рисунок 3.2.43). В клетках, культивируемых в бессывороточной среде, в условиях хронического окислительного стресса, чаще встречаются ядра типа (2), рисунок 3.2.43, которые содержат более десяти отдельных гамма – фокусов по всему пространству ядра. В популяции фибробластов также встречаются ядра, содержащие множественные гамма-фокусы, сливающиеся между собой (тип 3, рисунок 3.2.43). Такие клетки ярко флуоресцируют и часто имеют неправильную форму [Kostyuk et al., 2013]. Количество ДР в клетке пропорционально количеству гамма-фокусов, а значит интенсивности флуоресценции клетки, окрашенной флуорохромированными антителами к гистону [Darzynkiewicz et al., 2011]. В популяции клеток HDF и HEF мы выделили 3 фракции клеток с разным уровнем флуоресценции, рисунок3.2.44. А [Kostyuk et al., 2013].Наиболее многочисленная область R1 содержит интактные клетки без ДР, и клетки, флуоресценция которых увеличена не столь сильно, чтобы образовать отдельную область (1 и 2 тип ядер, рисунок3.2.43). Исследовали фракцию R1, построив для параметра FL1(γH2AX) гистограммы (рисунок 3.2.44. Б.). Добавление в среду гДНК и гДНКокси приводит к небольшому сдвигу гистограммы в сторону меньших значений. Анализ средних значений интенсивности флуоресценции клетки не выявил достоверных различий сигнала в этой фракции, что указывает на отсутствие значимых различий в содержании клеток с небольшим числом ДР (р >0.05) [Kostyuk et al., 2013]. Фракция R3 сдержит клетки, обладающие самым высоким показателем FL1(γH2AX)/FL2(содержание ДНК), т.е. содержащие множественные ДР, что указывает на причину их гибели – нерепарируемые повреждения, приводящие к апоптозу и потере части хроматина [Kostyuk et al., 2013]. Фракция R2 включает клетки с сохраненным хроматином, но многочисленными ДР (тип 3 ядер, рис 3.2.43). Отсутствие сыворотки стимулирует увеличение ДР в клетках фракции R2 в 2,5 раза в HDF и в 4,5 раза в HEF [Kostyuk et al., 2013]. При длительном культивировании фибробластов (в течение 72 часов) с гДНКокси происходит уменьшение числа клеток с множественными разрывами (фракции R2 ) в HDF в 2 раза, а в HEF в 4 раза по сравнению с контролем – клетками, культивируемыми в бессывороточной среде; гДНК в низкой концентрации (20нг/мл) также уменьшает число клеток фракции R2, но лишь в 205 1,5 раза, а культивирование 72 часа с гДНК в высокой концентрации (100 нг/мл) стимулирует увеличение количества таких клеток на 40 – 50% [Kostyuk et al., 2013]. Рисунок 3.2.44. Двунитевые разрывы, выявляемые методом проточной цтитофлоуметрии по связыванию антител γH2AX в пространстве клеточного ядра HDF и HEF. А – основные фракции фибробластов кожи взрослого человека (HDF) и эмбриональных фибробластов легкого человека (HEF). Распределение контрольных клеток HDF, метод проточной цитофлоуметрии. По оси Х (FL2) – содержание ДНК в клетках, по оси Y (FL1)-флуоресценция анител к(γH2AX). R1– основная фракция клеток, содержащая ядра 1 и 2-го типов и ядра без двуеитевых разрывов (ДР). R2 – клетки с множественными ДР (тип 3, рисунок3.2.43.). R3 - фракция клеток, содержащая ядра апоптотические клетки. Б – Распределение клеток HDF фракции R3 по интенсивности флуоресценции FL1. Клетки культивировали 72 часа с образцами ДНК, указанными справа на рисунок В. Г - содержание клеток фракции R2 (множественные ДР) в HDF and HEF. Серые столбики (D) – 20 нг/мл, черные – 100 нг/мл. (*) отличие от контроля достоверно (p < 0.05). 206 Таким образом, окисленные фрагменты вкДНК снижают содержание клеток с множественными двунитевыми разрывами в популяциях HDF и HEF, культивируемых в условиях хронического окислительного стресса в течение длительного времени. Неокисленная гДНК в высокой концентрации увеличивает количество таких клеток. На основании полученных результатов можно сделать общий вывод, что кратковременное образование быстрорепарируемых разрывов ДНК ядер клеток разных типов - одинаковый ответ клеток разных типов на воздействие окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК. Двунитевые разрывы образуются через 30 минут после начала воздействия вкДНК во всех исследованных типах клеток и к 3 часам после начала воздействия их количество снижается. 3.2.9. Окисленные вкДНК повышают уровень нестабильности генома Одно- и двунитевые разрывы ДНК, возникающие в клетках в течение 30 минут после резкого изменения свойств вкДНК путем введения в среду культивирования клеток образцов окисленной и ГЦ - обогащенной вкДНК способствуют дестабилизации генома [Kostyuk et al., 2013]. К признакам нестабильности генома относят образование микроядер, выпячивание ядерной мембраны, образование мостиков хроматина между ядрами. [Fenech et al., 2001]. Считается, что этот эффект особенно ярко проявляется в пролиферирующих клетках [Fenech et al., 2001]. Наиболее сильные повреждения хроматина с образованием одно- и двунитевых разрывов при введении в среду культивированя окисленных фрагментов ДНК наблюдаются в культурах HUVEC и MCF7 [Kostyuk et al., 2013]. Анализируя ядра MCF7, которые инкубировали с гДНКокси, мы заметили выраженные признаки нестабильности генома, рисунок 3.2.45. А [Kostyuk et al., 2013]. Мы наблюдали образование множественных микроядер (рисунок 3.2.45. (2)) и других ядерных аномалий, таких как образование мостиков хроматина между ядрами, выпячивание ядерной мембраны (рисунок 3.2.45. А (3)), и деконденсацию хроматина клеток в фазе митоза (рисунок 3.2.45. А (4)) [Kostyuk et al., 2013]. Если гДНКокси в концентрации 50 нг/мл воздействовала на клетки MCF7 при низкой плотности культуры в первые 2-е суток после пересева, то изменения хроматина клеток были очень значительными, рисунок 3.2.45.Б [Kostyuk et al., 2013]. Вероятно, наблюдающаяся нестабильность хроматина может являться признаком репликативного стресса, который развивается в активно пролиферирующей культуре при действии повреждающих факторов [Fenech et al., 2001]. Однако и клетки со сниженной 207 пролиферативной активностью (высокая плотность клеток) демонстрировали изменения хроматина ядер, но эти изменения были менее выражены, рисунок 3.2.45.(В). Рисунок 3.2.45. гДНКокси индуцирует нестабильность генома MCF7. А - Примеры образования микроядер (2), мостиков хроматина (2), деконденсации хроматина в Мфазе цикла (4) после действия гДНКокси на активно делящиеся клетки MCF7 (малая плотность культуры); (1) – контроль. Увеличение Х100. Концентрация гДНКокси 50нг/мл, время инкубации 24 часа. Содержание фракции клеток с микроядрами в популяции активно пролиферирующих контрольных клеток (Б) и клеток со сниженной пролиферативной активностью (В), обработанных гДНК и гДНКокси (50нг/мл; 24 часа). (*) отличия от контроля достоверны (p < 0,005). Мы провели количественный анализ клеток с микроядрами, рисунок 3.2.45. (Б, В). В контроле частота клеток MCF7 с микроядрами составляет около 7%, что соответствует данным других авторов [Xu et al., 2001]. В присутствии гДНКокси более 40% клеток активно пролиферирующей культуры и около 25% клеток со сниженной пролиферативной активностью содержат микроядра [Kostyuk et al., 2013]. гДНК также повышает количество клеток с микроядрами, но отличия с контролем в этом случае недостоверны. Признаки нестабильности хроматина были также обнаружены в клетках HUVEC через 30 минут – 1 час инкубации с окисленными и неокисленными ГЦ-богатыми образцами ДНК, введенными в среду культивирования в концентрации 50 нг/мл. Все образцы экзогенной ДНК вызывали изменения, отражающие образование микроядер, рисунок3.2.46. В. Максимальный эффект мы наблюдали через час после добавления в среду культивирования HUVEC окисленных образцов (гДНКокси и п(рДНК)окси) – в 8-10 208 раз возрастало количество микроядер и фрагментации хроматина с образованием микроядер (рисунок 3.2.46. В). Рисунок 3.2.46. Нестабильность генома HUVEC в присутствии образцов ДНК. А (1-4) – примеры образования микроядер путем выпячивание ядерной мембраны в клетках HUVEC, обработанных окисленной ДНК; Б – фрагментация хроматина клеток HUVEC без признаков конденсации хроматина, которые характерны для апоптоза (а) и ядра клетки в состоянии апоптоза с конденсированным хроматином (б). Увеличение Х100. В – содержание в популяции HUVEC клеток с признаками нестабильности хроматина. Концентрация образцов ДНК – 50 нг/мл, время – 1 час. (*) отличия от контроля достоверны (p < 0.001). Однако, в отличие от MCF7, не было обнаружено различий в количестве микроядер в пролиферирующей и конфлуентной популяции клеток HUVEC. Также не обнаружили мостиков хроматина между ядрами, образующихся при делении клеток в процессе митоза. 209 Образование микроядер, таким образом, в большей степени связано с наличием двунитевых разрывов хроматина в примембранной области ядра клетки, чем с процессами деления клеток. Различные этапы образования микроядер в HUVEC можно проследить на рисунке 3.2.46. А. Сначала наблюдается деконденсация хроматина и выпячивание ядерной мембраны (рисунок 3.2.46 (1)), затем происходит образование гранулы - часть хроматина ядра, окруженная ядерной мембраной, связана с мембраной клетки (рисунок 3.2.46 (2)), гранулы отделяются от ядерной мембраны и перемещаются за пределы мембраны клетки ( рисунок 3.2.46 (3)), гранулы могут перемещаться на значительные расстояния от клетки (рисунок 3.2.46. (4)). Значительная часть микроядер, образующихся после действия гДНКокси на MCF7 и HUVEC, имеет признаки окислительной модификации ДНК – содержит маркер окисления 8-oxodG (рисунок 3.2.47. А) и содержит двунитевые разрывы хроматина, тестируемые антителами к гистону γH2AX (Рисунок 3.2.47. Б, В) [Kostyuk et al., 2013]. Рисунок 3.2.47. Микроядра, образующихся после действия гДНКокси на MCF7 (А, Б) и HUVEC (В), имеют признаки окислительной модификации ДНК и содержат ДР. А – Микроядра в MCF-7 содержат маркер окисления 8-oxodG. Б, В – Колокализация окраски хроматина микроядер и двунитевых разрывов, детектируемых антителами к гистону Н2АХ в MCF7 (Б) и HUVEC (В). При действии ДНКокси на клеточную популяцию HUVEC, кроме образования микроядер, мы обнаружили фрагментацию ядер (рисунок 3.2.46. Б, а), которая не 210 сопровождалась конденсацией хроматина, характерной для процесса апоптоза, рисунок 3.2.46. Б, б. Фрагментация хроматина приводит к образованию большого количества микроядер, которые могут перемещаться за пределы клеток, рисунок 3.2.46. Б, а. Таким образом, воздействие окисленной фракции вкДНК индуцирует в клетках нестабильность генома, обусловленную разрывами хроматина. 3.2.9.1. Окисленные фрагменты вкДНК транзиторно увеличивают содержание фракции subG1 в разных типах клеток. Методом проточной цитометрии определили динамику изменения количества микроядер и гиподиплоидных клеток в популяции HUVEC при культивировании с образцами окисленной и неокисленной ДНК, рисунок 3.2.48. А (б). В популяции клеток присутствует фракция subG1, включающая микроядра различного размера и клетки со сниженным содержанием ДНК, рисунок 3.2.48. А (а) для HUVEC. Рисунок 3.2.48. А – Динамика изменения количества гиподиплоидных HUVEC и MCF7 в присутствии образцов ДНК (50 нг/мл); (а) - распределение клеток по количеству ДНК; (б) – зависимость размера фракции гиподиплоидных клеток от времени воздействия образцов ДНК. Б – Влияние гДНК и гДНКокси (48 час, 50 нг/мл) на содержание фракции subG1/G0 в MCF-7. Метод проточной цитометрии. Клетки окрашены иодистым пропидием. (*) – отличия от контроля достоверны (p < 0.05). Окисленные образцы – ДНКокси и п(рДНК)окси в первые 30 минут после введения в среду культивирования HUVEC вызывают увеличение размера фракции subG1 (рисунок 3.2.48. А (б)). Неокисленные образцы ДНК действуют медленнее – увеличение размера фракции subG1 наблюдается через 1 час инкубирования с образцами гДНК и п(рДНК). При культивировании клеток HUVEC с образцами окисленной ДНК в течение 3-х часов 211 происходит снижение количества гиподиплоидных клеток и частиц до уровня контроля. Неокисленные образцы снижают размер фракции subG1 до контрольных значений (в случае добавления в среду культивирования гДНК) и ниже контрольных значений (в случае культивирования с п(рДНК)) за более длительный промежуток времени – в течение 48 часов (рисунок 3.2.48. А (б)). Мы оценили изменение количества клеток фракции subG1 в популяции MCF7 при изменении свойств вкДНК ( рисунок 3.2.48.Б). При действии на MCF7 гДНКокси в концентрации 50 нг/мл в течение 48 часов наблюдается увеличение количества subG1/G0 клеток 2 раза по сравнению с контролем, гДНК в меньшей степени стимулировала увеличение фракции subG1/G0 клеток (различие с контролем недостоверно) [Kostyuk et al., 2013]. Поскольку при действии окисленной ДНК значительно возрастает количество микроядер разного размера, в том числе и в межклеточном пространстве, увеличение фракции subG1 подтверждает обнаруженную нами нестабильность генома MCF7 [Kostyuk et al., 2013]. При культивировании фибробластов кожи человека (HDF) и эмбриональных фибробластов легкого (HEF) в условиях хронического окислительного стресса – при отсутствии сыворотки в среде культивирования - увеличивается количество клеток фракции subG1 (рисунок 3.2.49). Это также является показателем того, что окислительный стресс стимулирует повреждение хроматина ядер культивируемых клеток и способствует нестабильности генома [Kostyuk et al., 2013]. Анализ количества ДНК в клетках проводили с использованием метода окраски фиксированных ядер пропидий-йодидом. Образцы окисленной ДНК, добавленные однократно, вызывали через 72 часа в клетках HDF и HEF снижение количества клеток фракции subG1, рисунок 3.2.49. Б, В [Kostyuk et al., 2013]. В культуре фибробластов (HDF) уменьшение фракции subG1 ~ на 40% наблюдалось после добавления ДНКокси в концентрации 20 -100 нг/мл, рисунок 3.2.49. Б [Kostyuk et al., 2013]. Наиболее выраженное снижение содержания клеток фракции subG1 – на 55% наблюдалось через 3 суток после добавления ДНКокси в концентрации 20 нг/мл к эмбриональным фибробластам легкого (HEF), рисунок 3.2.48. В [Kostyuk et al., 2013]. Геномная ДНК (100 нг/мл) увеличивает количество клеток фракции subG1 в HDF на ~ 50% [Kostyuk et al., 2013]. 212 Рисунок 3.2.49. Содержание в фибробластах субпопуляции subG1, определяемое по окраске ДНК пропидий йодидом. Метод проточной цитометрии. А (HDF) распределение клеток по содержанию ДНК. Б – Влияние гДНК и гДНКокси (72 часа, 20 нг/мл) на содержание фракции subG1 HDF. В – Влияние образцов гДНКокси на содержание фракции subG1 HEF. Концентрация образцов ДНК обозначена на рисунке, 72 часа. (*) - достоверное отличие от контроля (p < 0.05). Таким образом, анализ динамики изменения содержания в клетках разных типов фракции subG1, включающей микроядра различного размера и клетки со сниженным содержанием ДНК, также показал транзиторное увеличение фракции subG1 при действии на клетки окисленной фракции вкДНК. 3.2.10. Изменение свойств вкДНК влияет на пролиферацию разных типов клеток Известно, что окислительный стресс, вызывающий повреждения хроматина ядер, приводит к остановке клеточного деления на всех стадиях клеточного цикла и блокированию пролиферации [Shackelford et al., 2000]. Мы проанализировали влияние различных образцов ДНК на количество пролиферирующих клеток в культурах HUVEC, MCF7, МСК, HDF и HEF, используя метод проточной цитометрии и антитела к маркеру пролиферации Ki-67 [Gerdes et al., 1984; Guillaud et al., 1989] and PCNA [Bologna-Molina et al., 2013; Naryzhny et al., 2008]. Все типы клеток экспрессируют маркеры Ki-67 и PCNA на всем протяжении клеточного цикла [Bologna-Molina et al., 2013; Naryzhny et al., 2008]. Для определения количества ДНК клетки окрашивали пропидий йодидом. 3.2.10.1. Снижение содержания Ki-67 в клетках в ответ на присутствие вкДНК При анализе клеток на содержание маркера Ki-67 методом проточной цитометрии для разных типов клеток была выделена область Ki-67+, включающая пролиферирующие клетки, которые экспрессируют маркер Ki-67 (рисунок 3.2.50). 213 Рисунок 3.2.50. Данные о содержании Ki-67+ субпопуляции в клетках разных типов. Б, В - фиксированные клетки MCF7 и МСК обрабатывали антителами к Ki-67, меченными FITC. Фоновая флуоресценция была оценена с помощью вторичных антител, конъюгированных FITC (серый цвет). A, Г, Д - распределения клеток по содержанию Ki67: по оси У отложены значения FL1 (Ki-67) для клеток HUVEC, HDF, HEF; по оси Х – FL2 (содержание ДНК в клетке). При действии образцов окисленной и неокисленной ДНК в концентрации 50 нг/мл на субконфлуентные клетки HUVEC уровень экспрессии Ki-67 снижается через 30 минут и продолжает снижаться с течением времени ( 1 и 2 часа, рисунок3.2.51. А). Рисунок3.2.51. Днамика изменения фракции пролиферирующих клеток (фракция Ki-67+) в популяции HUVEC во времени. Метод проточной цитофлоуметрии. Концентрация ДНК и время воздействия указаны на рисунке. (*) - достоверное отличие от контроля (p < 0.05). 214 При длительной (48 часов) инкубации субконфлуентных клеток с модельными образцами ДНК и вкДНК больных ОИМ эффект сохраняется, хотя и уменьшается ( рисунок 3.2.51. Б). При культивировании HUVEC в течение 72 часов после однократного добавления образцов экзогенной вкДНК, количество пролиферирующих клеток отличается от контроля недостоверно ( рисунок 3.2.51. В), т.е. клетки, длительное время культивируемые в присутствии измененной вкДНК среды, адаптируются к новым условиям. Клетки аденокарциномы молочной железы MCF7 отвечали аналогичным образом при добавлении окисленных и неокисленных фрагментов ДНК к среде культивирования. На рисунок 3.2.52 показано распределение клеток по содержанию маркера Ki-67. Белок Ki-67 экспрессируют около 45% контрольных клеток. При инкубации клеток MCF7 с гДНКокси (50 нг/мл) в течение 48 часов количество клеток фракции (Ki-67+) уменьшается до 30% , рисунок 3.2.52. А [Kostyuk et al., 2013]. Мы наблюдали также снижение на 40% средней интенсивности флуоресценции клеток фракции Ki-67+ в присутствии окисленной ДНК ( рисунок 3.2.52. Б), что говорит о снижении количества белка Ki-67 [Kostyuk et al., 2013]. Рисунок 3.2.52. Пролиферация клеток MCF-7 и МСК, подвергавшихся воздействию гДНК или гДНКокси в конечной концентрации 50 нг/мл. Метод проточной цитофлоуметрии. А – Количество Ki-67+ - позитивных клеток в общей популяции клеток MCF7. Б, В – средние значения интенсивности сигнала фракции клеток Ki-67+ (FL1) MCF-7 и МСК. Б - Клетки MCF-7 культивировали в отсутствие (темносерые столбики) и в присутствии блокатора АФК - 0.15 mM NAC (светло-серые столбики). Время воздействия образцов вкДНК на MCF-7 - 48 часов, на МСК – указано на рисунке (В - темно-серые столбики -30 минут, светло-серые – 3 часа). Эксперимент повторен 3 раза, использованы 2 разные культуры МСК. (*) – достоверное отличие от контроля (p < 0,05). Первичной причиной блокирования пролиферации в части клеток MCF7, которые культивировали в присутствии гДНКокси, является повышение уровня АФК [Kostyuk et 215 al., 2013]. Если мы добавляли гДНКокси к клеткам, которые предварительно инкубировали с блокатором АФК (0.15мM NAC), то не наблюдалось достоверного снижения уровня экспрессии маркера Ki-67 в таких клетках (рисунок 3.2.52. А, Б) [Kostyuk et al., 2013]. В МСК внесение образцов неокисленной гДНК и окисленной гДНКокси в среду культивирования кратковременно блокировало экспрессию маркера пролиферации Ki-67 – средняя интенсивность сигнала Ki-67+ - фракции клеток снижалась на 20-25% через 30 минут после добавления гДНК и гДНКокси и уже через 3 часа возвращалась до нормальных значений ( рисунок 3.2.52. В). Воздействие ГЦ-богатых фрагментов вкДНК – п(рДНК) на временном промежутке 30 минут - 3 часа не блокировало экспрессию маркера пролиферации Ki-67, средняя интенсивность сигнала Ki-67+ клеток повышалась в 1,35 раза (рисунок 3.2.52. В). Оценили влияние образцов окисленной и неокисленной ДНК на пролиферацию клеток в культуре фибробластов (HDF и HEF) через 72 часа от начала культивирования в среде, не содержащей сыворотки, т.е. в условиях хронического окислительного стресса. Клетки, экспрессирующие Ki-67 (Ki-67+) образуют область R (рисунок 3.2.50). Данные о величине фракции Ki-67+ клеток, выраженные в % от общего количества клеток, приведены на рисунок3.2.53 А (для фибробластов кожи – HDF) и Б (для эмбриональных фибробластов – HEF) [Kostyuk et al., 2013]. Рисунок 3.2.53. Снижение содержания субпопуляции клеток, экспрессирующих Ki-67 в культуре фибробластов кожи – HDF (А) и эмбриональных фибробластов – HEF (Б) при действии образцов гДНК и гДНКокси в концентрациях, указанных на рисунке через 72 часа после начала инкубации. (*) - пробы достоверно отличаются от контроля (p < 0,05). 216 Отсутствие сыворотки способствует уменьшению количества пролиферирующих клеток по сравнению с контролем, содержащим сыворотку (рисунок 3.2.53). Особенно сильно этот эффект выражен в случае HEF. При культивировании в бессывороточной среде в присутствии гДНКокси количество клеток HDF и HEF, экспрессирующих Ki-67, снижается на 20 – 50% (рисунок 3.2.53), гДНК практически не влияла на количество Ki67+ клеток [Kostyuk et al., 2013]. 3.2.10.2. Изменение экспрессии маркера пролиферации и репарации PCNA в клетках в ответ на присутствие фрагментов вкДНК. Мы исследовали содержание в разных типах клеток другого белка, количество которого увеличивается при пролиферации – PCNA [Naryzhny et al., 2008]. При анализе клеток на содержание маркера PCNA методом проточной цитометрии для разных типов клеток аналогично была выделена область PCNA+, которая включает клетки с повышенной интенсивностью флуоресценции по сравнению с фоновым уровнем (рисунок 3.2.54). Интенсивность флуоресценции остальной части популяции клеток не отличается от фоновых значений флуоресценции вторичных антител, конъюгированных с FITC. Рисунок 3.2.54. Данные о содержании PCNA+ субпопуляции в контрольных клетках разного типа. А - фиксированные клетки MCF7 и МСК обрабатывали антителами к PCNA, меченными флуоресциином. Фоновая флуоресценция была оценена с помощью вторичных антител, конъюгированных FITC (серый цвет). Б, В - по оси У отложены значения FL1 (PCNA) для клеток HDF и HEF; по оси Х – FL2 (содержание ДНК в клетке). Выделена фракция PCNA+ клеток (область R для МСК). Однако при исследовании действия образцов окисленной и неокисленной ДНК на экспрессию белка PCNA в различных культурах были получены результаты, отличные от результатов, полученных при анализе экспрессии белка Ki-67. Так, добавление окисленных и неокисленных образцов ДНК к субконфлуентным клеткам HUVEC, не только не уменьшает экспрессию PCNA, но в ряде случаев ее повышает (рисунок 3.2.55). Поскольку PCNA является фактором транскрипции полимеразы дельта, которая принимает участие и в репарации ДНК [Moore et al., 2004; Shivji et al., 1992], наблюдаемые 217 различия в содержании двух маркеров при действии гДНКокси можно объяснить усилением процесса репарации на фоне снижения пролиферативной активности клеток в результате ареста клеточного цикла. Если клетки HUVEC длительное время – в течение 72 часов после пересева культивировали в присутствии проб ДНК, то данные об изменении экспрессии двух маркеров пролиферации Ki-67 и PCNA совпадали, рисунок 3.2.51. В и рисунок 3.2.55. Б, что указывает на снижение активации репарации с участием фактора PCNA с течением времени. Рисунок 3.2.55. Динамика изменения фракции PCNA+ клеток в популяции HUVEC во времени. Метод проточной цитометрии. На графиках приведены средние значения сигнала флуоресценции антител к PCNA. Концентрация ДНК и время воздействия указаны на рисунке. (*) - пробы достоверно отличаются от контроля (p < 0,05). При действии образцов экзогенной вкДНК на МСК общий уровень PCNA снижается, что может указывать на остановку деления клеток ( рисунок 3.2.56. А). Рисунок 3.2.56. Динамика изменения экспрессии маркера PCNA в МСК. Метод проточной цитофлоуметрии. На графиках приведены средние значения сигнала флуоресценции антител к PCNA общей популяции МСК и субпопуляции PCNA+ (R – на рисунок 3.2.54). Концентрация ДНК 50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке. (*) – отличие от контроля достоверно (p < 0,05). 218 С другой стороны, популяция контрольных МСК включает 2 субпопуляции – экспрессирующие PCNA (обозначена, как R на рисунок 3.2.54), и не экспрессирующие. В контрольных клетках PCNA экспрессируется в 25 % клеток. При действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов в МСК через 30 минут повышается средний уровень флуоресценции PCNA во флуоресцирующей фракции клеток, рисунок3.2.59.Б. Получается, что число экспрессирующих PCNA клеток повышается, но количество белка PCNA на клетку ниже, чем в контрольной фракции R. Такая картина, скорее всего, свидетельствует о том, что в МСК в ответ на добавление фрагментов вкДНК возрастает фракция клеток с репаративным синтезом с участием полимеразы дельта, фактором транскрипции которой является PCNA. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК, по данным экспрессии маркеров Ki-67 и PCNA, стимулируют пролиферацию МСК уже через 30 минут после добавления к среде культивирования. Аналогичный результат был получен при исследовании действия окисленных и неокисленных фрагментов ДНК на фибробласты человека (HDF и HEF), инкубированные в условиях хронического окислительного стресса – в бессывороточной среде. В присутствии 2% сыворотки количество клеток HDF и HEF, экспрессирующих PCNA, увеличено по сравнению с контролем (культивируемым без сыворотки), что коррелирует с данными, полученными при анализе Ki-67 (рисунок 3.2.57 и рисунок 3.2.53). Рисунок 3.2.57. Содержание субпопуляции клеток, экспрессирующих PCNA в культуре фибробластов кожи - HDF (А) и эмбриональных фибробластов - HEF (Б) при действии образцов гДНК и гДНКокси в концентрациях, указанных на рисунке через 72 часа после начала инкубации. (*) - пробы достоверно отличаются от контроля (p < 0.05). При добавлении гДНК (20 нг/мл) или гДНКокси (20 нг/мл) к среде культивировании HDF и гДНКокси (10 нг/мл) к среде культивирования HEF количество PCNA в клетках обоих линий возрастает на 60 – 80 % по сравнению с соответствующими 219 контролями, рисунок 3.2.57. А и Б. При дальнейшем увеличении концентрации ДНК эффект снижается. Этот результат так же, как в случае с HUVEC, отличается от результата, полученного с применением маркера Ki-67 (рисунок 3.2.57 и рисунок 3.2.53) и, вероятнее всего, также связан с активацией репаративного синтеза с участием полимеразы дельта. Культивирование клеток MCF7 c образцами окисленной ДНК в течение длительного времени – 48 часов приводит к снижению уровня маркера пролиферации PCNA на 40-50% (рисунок 3.2.58). гДНК вызывает тот же ответ клеток MCF7, что и гДНКокси0, - снижает уровень пролиферирующих клеток, определяемый по количеству маркера PCNA, но эффект менее выражен (рисунок 3.2.58). Таким образом, увеличение концентрации и уровня окисления внеклеточной ДНК путем добавления в среду гДНКокси или гДНК сопровождается блокированием пролиферативной активности значительной части клеток MCF7. При этом, вероятно, не происходит активации репаративного синтеза с участием PCNA. Рисунок 3.2.58. Пролиферация клеток MCF-7, подвергнутых воздействию гДНК или гДНКокси в конечной концентрации 50 нг/мл в течение 48 часов. Метод проточной цитометрии, окраска антителами к PCNA. А – Количество PCNA - позитивных клеток в общей популяции клеток MCF7. Б. – средние значения интенсивности сигнала фракции клеток PCNA + (FL1). Таким образом, воздействие образцов окисленной и ГЦ-богатой ДНК в клетках эндотелия, фибробластах и раковых клетках MCF-7 (а в случае МСК только окисленной ДНК) вызывает кратковременное блокирование пролиферативной активности, которое, вероятно, связано с активацией процессов репарации повреждений ДНК ядер клеток, индуцированных АФК. 220 3.2.11. ВкДНК вызывает остановку клеточного цикла Снижение пролиферативной активности чаще всего обусловлено так называемым «арестом» клеточного цикла – блокированием клеточного цикла на всех стадиях [Wells et al., 2013]. Мы исследовали, в какой фазе клеточного цикла происходит его остановка при действии окисленных фрагментов ДНК на гистологически различающиеся клетки. Для этого сравнивали содержание ДНК в ядрах клеток и уровень белка Ki-67 при действии фрагментов вкДНК. В культуре клеток HUVEC на стадии субконфлуэнтности (~ 70%) присутствуют клетки с разным количеством ДНК, которые условно можно разделить на 4 типа (рисунок 3.2.59 А): I - гиподиплоидные клетки (фракция subG1); II – клетки, содержащие диплоидное количество ДНК, находящиеся в фазе клеточного цикла G0 или G1 (фракция G0/G1); III - клетки в процессе репликации, которые содержат большее, чем 2n количество ДНК (фракция S); IV – клетки, находящиеся в фазе клеточного цикла G2/M, имеющие удвоенное количество ДНК 4n (фракция G2/M). Рисунок 3.2.59. Влияние окисленных и неокисленных образцов ДНК на клеточный цикл в HUVEC. Метод проточной цитометрии. А - фиксированные клетки окрашены антителами к Ki-67 (ось Y) и пропидий йодидом (ось Х), количество клеток – 10000. Окраска клеток фракции Ki-67- совпадает с фоновыми значениями. Б, В – содержание в популяции клеток HUVEC с количеством ДНК, соответствующим G1-, S и G2/M –фазам клеточного цикла. Б – Концентрация образцов ДНК 50 нг/мл, время воздействия - 48 часов, В - Концентрация образцов ДНК 5 и 50 нг/мл, время воздействия – 72 часа. (*)p < 0.05 - достоверное отличие от контроля, непараметрический U-тест. По содержанию маркера пролиферации Ki-67 клетки с одинаковым количеством ДНК были разделены на Ki-67+ (пролиферирующие) и Ki-67- (не пролиферирующие). 221 Изменение количества клеток этих 4-х типов при действии вкДНК с измененными свойствами позволяет определить, в какой фазе происходит остановка клеточного цикла. Поскольку известно, что ионизирующее излучение вызывает арест клеточного цикла [Martin et al., 2013], в качестве контроля остановки клеточного цикла использовали HUVEC после облучения рентгеновским излучением в повреждающей дозе 2Гр. В облученных HUVEC наблюдался G1- , S - и G2/M –арест клеточного цикла (рисунок 3.2.59 Б). Через 48 часов после добавления к HUVEC фрагментов ГЦ-богатой и окисленной ДНК, а также вкДНК больных острым инфарктом миокарда (ОИМ) в клетках наблюдается остановка в G1- , S - и G2/M фазах клеточного цикла - снижается количество клеток, экспрессирующих Ki-67 (рисунок 3.2.59 Б). При действии вкДНК с измененными свойствами на клетки HUVEC происходит не столь сильное ингибирование пролиферации через 48 часов, как при действии рентгеновского излучения, часть клеток продолжает деление. Более длительное культивирование HUVEC в присутствии образцов окисленной и ГЦ-ДНК (72 часа) оказывало незначительное влияние на клеточный цикл (рисунок 3.2.59 В). Если через 48 часов окисленные и ГЦ-богатые фрагменты в большей степени вызывали G1- и S - арест клеточного цикла (рисунок 3.2.59 Б), то через 72 часа ГЦбогатая ДНК на 20% увеличивала число клеток в состоянии G2/M – ареста (рисунок 3.2.59 В). Подобное действие экзогенная вкДНК оказывает и на клетки MCF-7. На блокирование клеточного цикла и, как следствие, пролиферации в части клеток культуры MCF7, обработанной гДНКокси, указывают данные по анализу количества ДНК в клетках MCF7, окрашенных пропидий йодидом (рисунок 3.2.60) [Kostyuk et al., 2013]. В культуре клеток MCF7 так же, как и в культуре HUVEC были выделены 4 типа клеток (рисунок 3.2.60 А, Г): subG1, G0/G1, S и G2/M фракции, и все клетки были разделены на пролиферирующие, экспрессирующие маркер Ki-67 (Ki-67+) и не пролиферирующие (Ki67-). Общее количество (Ki-67+) клеток уменьшается от 60% в контроле до 40% при инкубировании MCF7 с гДНКокси в течение 48 час (рисунок 3.2.60. Б) [Kostyuk et al., 2013]. При этом количество G0/G1(Ki-67+) клеток снижается в 3 раза, соответственно возрастает количество клеток G0/G1(Ki-67-) (рисунок 3.2.60. Б, В). Этот факт указывает на состояние G0/G1 ареста клеточного цикла в части клеток [Kostyuk et al., 2013]. Кроме того, при инкубировании MCF7 с гДНКокси в 2 раза возрастает содержание клеток S+G2/M (Ki-67-), что указывает на арест и в S- , и в G2/M – фазах клеточного цикла [Kostyuk et al., 2013]. 222 Рисунок 3.2.60. Влияние гДНК и гДНКокси (48 час, 50 нг/мл) на клеточный цикла в MCF7. Метод проточной цитометрии. А - фиксированные клетки окрашены антителами к Ki-67 (ось У) и пропидий йодидом (ось Х). На рисунках представлено одинаковое количество клеток – 10000. Окраска клеток фракции Ki-67- совпадает с фоновыми значениями. Б – содержание Ki-67+ клеток в популяции и во фракции G0/G1. В – содержание G0/G1 (Ki-67-) и S+G2/M (Ki-67-) клеток. Г – распределение интенсивности флуоресценции антител к Ki-67 (ось Х) в клетках, окрашенных пропидий йодидом (ось Y). Д – содержание в популяции клеток с количеством ДНК, соответствующим G1-, S and G2/M –фазам клеточного цикла. (*)p < 0.05 - достоверное отличие от контроля, непараметрический U-тест. При инкубации MCF7 с гДНКокси в течение 48 часов общее количество клеток в G0/G1 фазе клеточного цикла возрастало, а количество клеток MCF7 в S- и G2/M фазах клеточного цикла снижалось (рисунок 3.2.60 Г). В меньшей степени этот эффект выражен при культивировании MCF7 48 часов в присутствии неокисленной гДНК (рисунок 3.2.60 Б, В, Д) [Kostyuk et al., 2013]. Таким образом, в значительной части ранее пролиферирующих клеток MCF-7 воздействие гДНКокси и, в меньшей степени, гДНК, блокирует клеточный цикл в G0/G1фазе [Kostyuk et al., 2013]. 223 Полученные результаты мы подтвердили данными об изменении экспрессии генов, участвующих в регуляции клеточного цикла. 3.2.11.1. Изменение экспрессии генов, участвующих в регуляции клеточного цикла при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК Регулирующие элементы клеточного цикла отвечают за временные рамки всех событий клеточного цикла, за последовательность событий, за то, чтобы каждое событие происходило только один раз за цикл, за завершение инициированных событий [Grady et al., 2008]. Регулирующие элементы могут остановить деление в любой контрольной точке: G1, G2/M и М [Grady et al., 2008]. Список генов-кандидатов регуляторных элементов насчитывает более 100 и включает в себя гены, контролирующие структуру и функцию кинетохор, центросом и микротрубочек; конденсацию хромосом, поведение сестринских хроматид; точки рестрикции клеточного цикла [Grady et al., 2008; Jallepalli et al., 2001; Sato et al., 2001]. При повреждении ДНК происходит временная остановка клеточного цикла с помощью регуляторных механизмов, что обеспечивает время для репарации повреждений, после чего прогрессия клеточного цикла может возобновиться [Foijer and Te Riele, 2006; Schnerch at al., 2012; Nieto-Sampedro at al., 2011; Goodarzi and Jeggo, 2013]. При инициировании клеточного цикла активируется синтез белка циклина D1, который кодируется геном CCND1 [Velasco-Velбzquez et al., 2011; Paronetto et al., 2010]. Циклин D1 запускает фазу G1 клеточного цикла, играет ключевую роль в регуляции перехода клеток из фазы клеточного цикла G1 в фазу S через образование активного комплекса с циклин-зависимыми киназами, CDK4 и CDK6 [Shishodia 2013; VelascoVelázquez et al., 2011]. Циклины синтезируются в течение клеточного цикла, уровень экспрессии белка циклина D1 регулируется на стадии транскрипции, поэтому уровень экспрессии гена CCND1 играет ключевую роль в прогрессии клеточного цикла [Shishodia 2013; Velasco-Velázquez et al., 2011] В культуре клеток эндотелия (HUVEC) и окисленные, и ГЦ-обогащенные фрагменты вкДНК через 30 минут снижают экспрессию гена CCND1. Окисленные фрагменты вызывают уменьшение экспрессии CCND1 на 60%, ГЦ-богатые вкДНК – п(рДНК) и pBR322 – на 40%, гДНК уменьшает экспрессию гена незначительно (рисунок 3.2.62. А). Через 48 часов при действии гДНК, ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) и окисленных образцов гДНКокси экспрессия гена CCND1 начинает возрастать. Вектор pBR322 не индуцирует повышение уровня мРНК CCND1 при воздействии на HUVEC в течение 72 часов ( рисунок 3.2.62. А). 224 Рисунок 3.2.62. Динамика изменения уровня экспрессии гена циклина CCND1 в клетках HUVEC, MCF-7 и МСК. Результат представлен как изменение экспрессии гена в стимулированных клетках по отношению к нестимулированным (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная зеленая линия 1 ± 0,1). Экспрессия гена была исследована в 3-х независимых экспериментах на культурах клеток от разных доноров (4 культуры МСК и 3 – HUVEC). Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения. (*) – экспрессия гена достоверно отличаются от контроля (p < 0.005). При действии ГЦ-богатой п(рДНК) и окисленных фрагментов п(рДНК)окси и гДНКокси эскпрессия гена CCND1 через 30 минут снижается приблизительно на 40% и в 225 клетках культуры MCF-7 (рисунок 3.2.62. Б) [Kostyuk et al., 2013]. Через 2 часа после воздействия фрагментов вкДНК уровень экспрессии гена CCND1 в MCF-7 возвращается к уровню контрольных значений. [Kostyuk et al., 2013]. Вектор и гДНК мало влияют на уровень мРНК CCND1.Через 48 часов наблюдается повышение экспрессии гена CCND1 при действии ГЦ-богатых фрагментов ( рисунок 3.2.62. Б). В МСК при действии как окисленных, так и не окисленных фрагментов вкДНК не происходит значимого снижения уровня экспрессии гена CCND1 через 30 минут после добавления фрагментов в среду культивирования клеток ( рисунок 3.2.62. В). ГЦ-богатые фрагменты п(рДНК) повышают уровень экспрессии гена CCND1 в 1,4 раза через 2 часа после начала воздействия (рисунок 3.2.62. В). Через 24 часа уровень экспрессии CCND1 в МСК возрастает в среднем в 1,5 раза при действии гДНК, вектора pBR322 и гДНКокси, и в 2,2 раза при действии ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) (рисунок 3.2.62. В). Таким образом, в клетках эндотелия (HUVEC) и в раковых клетках мы обнаружили ингибирование экспрессии гена CCND1 в первые часы после воздействия как окисленных, так и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК, что подтверждает остановку клеточного цикла в фазе G1. В культуре МСК мы не зарегистрировали снижения уровня экспрессии гена CCND1 при действии фрагментов вкДНК. К регулирующим элементам клеточного цикла принадлежат ингибиторы циклинзависимых киназ (CDKI - cyclin-dependent kinase inhibitors), к которым относят INK CDKI и WAF/Kip CDKI [Ewen et al., 2004; Yang et al., 2006]. К семейству INK CDKI относятся белки – производных локуса Ink4 (p15, p16, p18, p19) [Giacinti and Giordano, 2006]. Ген CDKN2 кодирует белок р16, регулятор клеточного цикла, который, связываясь с CDK4 и CDK6, нарушает связывание циклина D1 с CDK [Pei et al., 2005]. Белок р21 относится к семейству WAF/Kip CDKI, и кодируется геном CDKN1A. Ингибитор киназ р21 оказывает негативное воздействие на активность комплексов циклин-зависимых киназ (CDK2) в фазе G1 клеточного цикла и комплексов циклин-зависимых киназ (CDK1) во время G2 фазы клеточного цикла [Velasco-Velázquez et al., 2011]. Экспрессия этого гена контролируется белком р53, повышение экспрессии гена CDKN1A может приводить к G1аресту [Valentino et al., 2013]. Экспрессия генов CDKN2 и CDKN1A значительно возрастает в клетках HUVEC и MCF-7 в присутствии всех образцов ДНК, независимо от ГЦ - состава и уровня окисления в течение 3 - 48 часов, что может указывать на блокирование перехода G1/S, что согласуется с данными по экспрессии гена CCND1, а также данными, полученными 226 другими методами. К 72 часам экспрессия генов CDKN2 и CDKN1A в клетках HUVEC и MCF-7 снижается до уровня контроля (рисунок 3.2.63. А). Рисунок 3.2.63. Динамика изменения уровня экспрессии генов CDKN2 и CDKN1A в клетках разных типов: HUVEC, MCF-7 и МСК. Результат представлен как изменение экспрессии гена в стимулированных клетках по отношению к нестимулированным. Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на разных культурах клеток. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартное отклонение. В МСК экспрессия генов CDKN2 и CDKN1A возрастает в 1,6 – 1,9 раза в течение первого часа в присутствии образцов гДНКокси и незначительно в присутсвие гДНК (в 1,2 – 1,4 раза), рисунок 3.2.63. В. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК – п(рДНК) и вектор pBR322 статистически значимо не влияли на экспрессию генов CDKN2 и CDKN1A (рисунок 3.2.63, В). Увеличение количества РНК генов CDKN2 и CDKN1A в клетках эндотелия и клетках MCF-7 подтверждает полученный выше результат о снижении пролиферативной активности клеток и блокирование деления в фазе G1 при увеличении в несколько раз концентрации внеклеточной ДНК. 227 3.2.12. Активация процессов репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК Повреждение ДНК ядер клеток в результате индуцируемого внеклеточной ДНК окислительного стресса активирует в клетках сигнальные каскады, которые контролируют остановку клеточного цикла и репарацию ДНК [Goodarzi and Jeggo, 2013]. Двунитевые разрывы ДНК (ДР) составляют одну из самых опасных форм повреждения ДНК [Mermershtain and Glover, 2013]. BRCA1, ядерный белок, продукт гена BRCA1, принимает участие в регуляции клеточного цикла и репарации двунитевых разрывов ДНК путем гомологичной рекомбинации [Mermershtain and Glover, 2013; Wu et al., 2013]. Одновременно с изменением экспрессии генов, контролирующих клеточный цикл, при увеличении концентрации вкДНК в среде культивирования клеток возрастает экспрессия гена BRCA1 (рисунок 3.2.65) [Kostyuk et al., 2013]. Этот факт подтверждает вывод, сделанный при анализе белка PCNA, о переключении процессов клеточного деления на процессы, связанные с репаративным синтезом, при изменении концентрации вкДНК. При действии образцов вкДНК, независимо от ГЦ-состава и уровня окислительных модификаций, на культуру HUVEC повышается экспрессия гена BRCA1 в 1,8 – 2 раза через 3 часа инкубации ( рисунок 3.2.65. А). Повышенная экспрессия гена BRCA1 сохраняется более 48 часов. Окисленные фрагменты вызывают повышение экспрессии гена BRCA1 в MCF-7 в 5-6,5 раз через 2 часа после начала воздействия, к 48 часам экспрессия гена BRCA1 падает. Неокисленные ГЦ-богатые фрагменты стимулируют повышение экспрессии гена BRCA1 и MCF-7 позже – через 48 часов экспрессия BRCA1 повышена в 2-3 раза при действии ГЦбогатой п(рДНК) и pBR322 (рисунок 3.2.65. Б). Геномная ДНК не влияла на экспрессию гена BRCA1 в MCF-7 [Kostyuk et al., 2013]. В МСК ГЦ-богатые фрагменты п(рДНК) вызывают наибольшее повышение экспрессии гена BRCA1 - через 3 часа уровень экспрессии гена BRCA1 повышен в 6,7 раза (рисунок 3.2.65 B). Окисленные фрагменты гДНКокси, вкДНК(HUVEC) и п(рДНК)окси индуцируют повышение экспрессии гена BRCA1 в МСК в 3 – 4,5 раза. Неокисленные фрагменты вкДНК также повышают экспрессию BRCA1, но в меньшей степени, чем окисленные. Фрагменты вкДНК, содержащие окисленные основания (вкДНК РМЖ и вкДНК ОИМ), стимулируют увеличение мРНК гена BRCA1 в 2,5 – 3 раза ( рисунок 3.2.65. В). 228 Рисунок 3.2.65. Динамика изменения уровня экспрессии гена BRCA1 в клетках разных типов: HUVEC (А), MCF-7 (Б) и МСК (B). Результат представлен как изменение экспрессии гена в стимулированных клетках по отношению к нестимулированным. Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на разных культурах клеток. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения. Г – фото гель-электрофореза ПЦРфрагментов кДНК гена BRCA1 и гена внутреннего стандарта GAPDH. Е – уровень экспрессии BRCA1 в культуре МСК с мутацией в BRCA1(5382insC), 3 часа, 50 нг/мл. 229 Необходимо отметить, что в культуре МСК с мутацией в одном из аллелей гена (МСК BRCA1mut – 5382insC) уровень экспрессии гена BRCA1 повышается сильнее, чем в культуре без мутации. Вероятно, наличие только 1 немутантного аллеля приводит к тому, что усиливается функционал гена при поврежденной матрице (рисунок 3.2.65. Е). Таким образом, как окисленные, так и неокисленные фрагменты вкДНК активируют в клетках репарационные системы, что в конечном итоге приводит к уменьшению через 3 часа разрывов ДНК ядер клеток. 3.2.12.1. Изменение пространственного положения локусов прицентромерного гетерохроматина района 1q12 при действии фрагментов вкДНК. Ранее было показано, что окислительный стресс вызывает изменение положения участков хроматина в интерфазном ядре. Перемещение локусов гомологичных хромосом является одним из признаков развития адаптивного ответа при действии малых доз ионизирующего излучения [Ermakov et al., 2009] и связано с активацией репарационной системы клетки. Для клеток разных типов мы обнаружили сближение локусов 1-й хромосомы и их перемещение к центру ядра при действии фрагментов вкДНК [Ермаков с соавт., 2007; Ермаков с соавт., 2010; Ермаков с соавт., 2011]. Локализацию в ядре прицентромерных локусов хромосомы 1 (1q12) определяли с помощью метода FISH (см. рисунок 3.2.66. Б, В) [Ермаков с соавт., 2010]. Данные представляли в виде гистограмм частотного распределения гибридизационного сигнала (для 500 клеток) по нормированному радиус-вектору (r) клеточного ядра [Ермаков с соавт., 2007; Ermakov et al., 2008]. Сравнили гистограммы частотного распределения значений r интактных лимфоцитов и лимфоцитов, которые культивировали в присутствие п(рДНК) и вкДНК, выделенной из плазмы крови больного ревматоидным артритом, обогащенной фрагментами рДНК (рисунок 3.2.66. А, Б) и [Ermakov et al., 2008]. Культивирование лимфоцитов здоровых доноров в присутствие вкДНК больного РА и п(рДНК) в течение 2х часов приводит к перемещению гомологов 1-й хромосомы к центру ядра – изменяется профиль распределения нормированного радиус-вектора r: число клеток с локализацией прицентромерных локусов около ядерной мембраны (r∈[0,8; 1]) снижается с 60 – 67 % до 15 – 19 % (D=0,30; P<0,05) и увеличивается число клеток с локализацией прицентромерных локусов вутри ядра (r < 0,8) (рисунок 3.2.66. А, Б) [Ermakov et al., 2008]. Локусы 1q12 1-й хромосомы не только перемещались к центру ядра лимфоцитов при действии ГЦ-обогащенных фрагментов вкрДНК, но и сближались между собой – уменьшался угол сближения (между нормированными радиус-векторами, D=0,47; P<0,05). Количество клеток, в которых наблюдалось сближение локусов гомологов 1-й хромосомы и их перемещение к центру ядра при действии фрагментов вкДНК в 230 одинаковом диапазоне концентраций уменьшалось в ряду: рДНК ≈ вкДНК больных ревматоидным артритом > вкДНК здоровых доноров > вектор (pBR322) > ДНК E.coli > гДНК ≈ 0; гДНК не влияет на перемещение хромосом. Рисунок 3.2.66. Гистограммы распределения частоты среднего гибридизационного сигнала лимфоцитов 6-ти здоровых доноров по нормированному радиус-вектору (r) клеточного ядра (А). Зеленым цветом обозначена частота сигналов с локализацией метки вблизи ядерной мембраны (т.е. с нормированным радиус-вектором 0,8-1,0). Б – Иллюстрация изменений, происходящих при культивировании лимфоцитов в присутствии внеклеточной ДНК больного ревматоидным артритом (РА) – перемещение 1q12-локусов 1-й хромосомы к центру ядра и сближение гомологов 1-й хромосомы. В – Обозначены радиус-вектора 2-х меток – на гомологах 1-й хромосомы (r1 и r2) и радиус (R) ядра клеток [Ermakov et al., 2008]. Изменение положения 1q12 – сближение локусов хромосом и их перемещение к центру - было обнаружено и в ядрах HUVEC при действии окисленной вкДНК, вкДНК из среды облученных облучённых HUVEC и ГЦ-богатой рДНК (D = 0,33, α< 0,00001; D = 0,29, α < 0,00005 и D = 0,26, α < 0,0006, соответственно), при этом форма ядра изменялась с эллипсоидной на более сферическую (рисунок 3.2.67) [Ermakov et al., 2011]. Сближение локусов 1q12 и их перемещение к центру ядра в HUVEC опосредовано рецепторами TLR9 – при действии ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК на фоне заблокированных рецепторов TLR9 ингибиторным олигонуклеотидом 2088 и хлорокином гомологи 1-й хромосомы не сближались и не наблюдалось их перемещения к центру ядра (рисунок 3.2.67. В - Д). Изменения формы ядра с эллипсоидной на круглую при блокировании TLR9 не наблюдалось, видимо, этот изменение этого параметра ядра не зависит от TLR9 (рисунок 3.2.67. В - Д). 231 Рисунок 3.2.67. А - Микрофотографии ядер клеток эндотелия, в которых визуализированы методом FISH-гибридизации локусы 1q12 хромосомы. Окраска ядер пропидия йодидом, FISH-гибридизация. Б – Фотография ядер клеток HUVEC с обозначениями исследуемых параметров, где r1 и r2 – расстояние между метками (локусами 1q12) и центром фигуры, d – расстояние между сигналами, a и b – наибольшая и наименьшая оси эллипса. В - Д - Кумулятивные гистограммы распределения значений гибридизационного сигнала, характеризующего положение локусов 1q12 хромосомы 1 в ядрах клеток культуры эндотелия, где R – значения стандартизованного радиус-вектора (Г), D - расстояние между метками (Д) и a/b характеризует форму ядра клеток. Аналогичное воздействие окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК оказывают на локусы 1q12 в ядах МСК, однако и сближение 1-х хромосом, и их перемещение к центру менее выражено по сравнению с другими типами клеток (рисунок 3.2.68). В последнее время в литературе сближение локусов 1q12 гомологичных хромосом и их перемещение в структуре ядра связывают с двумя процессами – репарации и регуляции транскрипции генов [Спитковский с соавт., 2002; Тырсина с соавт., 2006; Fournier et al., 2010; Barascu et al., 2012]. Районы 1q12 наиболее подвержены перестройкам и возникновению двунитевых разрывов, их перемещение при действии ГЦбогатых и окисленных фрагментов вкДНК может свидетельствовать об активации репарации разрывов ДНК [Спитковский с соавт., 2002; Barascu et al., 2012]. 232 Рисунок 3.2.68. Кумулятивные гистограммы частоты распределения значений гибридизационного сигнала, характеризующего положение локусов 1q12 хромосомы 1 в ядрах МСК, где А – угол между метками. Б - расстояние между метками. R – значения стандартизованного радиус-вектора (В, Г). При действии фрагментов вкДНК активируется транскрипция многих генов, для связывания транскрипционного фактора с промотором гена - мишени происходят конформационные изменения структуры хроматина, чтобы сделать промоторную область доступной для фактора транскрипции [Fournier et al., 2010]. Возможно, наблюдаемые нами явления перестройки хроматина связаны с двумя этими явлениями. Таким образом, вкДНК вызывает сближение гомологов 1-й хромосомы в ядре клеток и их перемещение к центру ядра, что, вероятнее всего, обусловлено активацией процессов репарации в клетках. 3.2.13. ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК снижают уровень гибели клеток разных типов. Поскольку изменение свойств вкДНК – обогащение ГЦ-ДНК и окислительные модификации приводит к нестабильности генома, снижению пролиферативной активности клеток и аресту клеточного цикла, логично было бы предположить уменьшение клеточной популяции при действии ГЦ-ДНК и ДНКокси за счет гибели клеток. Однако спустя 48 часов после добавления вкДНК с измененными свойствами в среду культивирования HUVEC (в концентрации 50 нг/мл) не наблюдается снижения общего количества клеток в культуре, напротив, наблюдается тенденция к увеличению числа клеток ( рисунок 3.2.69. А). Количество гиподиплоидных клеток также 233 возвращается к контрольным значениям через 48 часов после добавления окисленных и ГЦ-богатых образцов ДНК ( рисунок 3.2.69. Б). Рисунок 3.2.69. А - общее число клеток в популяции HUVEC, которые культивировали в присутствии окисленных и неокисленных образцов вкДНК (50 нг/мл, 48 часов). Б – Количество гиподиплоидных клеток в той же популяции HUVEC. В – концентрация вкДНК в среде культивирования HUVEC в присутствии образцов ДНК (50 нг/мл, время культивирования обозначено на рисунке). (*) - достоверно отличается от контроля, контроль – культивируемые клетки в среде без сыворотки (статистика Мана-Уитни, p < 0.05). Уровень гибели клеток можно оценить по количеству ДНК в среде культивирования. Исследовали динамику изменения концентрации вкДНК в среде культивирования HUVEC во времени после изменения свойств вкДНК путем добавления образцов ДНК в концентрации 50 нг/мл ( рисунок 3.2.69. В). Суммарная концентрация выделенной из среды вкДНК слагается из концентрации собственной вкДНК, принятой за 234 1 (зеленая линия на рисунок 21), и концентрации добавленной ДНК (50 нг/мл, красная линия на рисунок 3.2.69. В). Через 3 часа после добавления экзогенной ДНК в среду общая концентрация вкДНК снижается, что говорит о связывании новой ДНК клетками. Через 24 часа мы наблюдали значительное увеличение общей концентрации вкДНК в случае ГЦ-ДНК и гДНКокси, что указывает на повышение уровня фрагментации хроматина и/или активацию апоптотической гибели. Однако через 48 часов количество вкДНК снижалось ниже контрольного уровня. Это снижение можно объяснить гидролизом ДНК эндонуклеазами и снижением уровня гибели клеток. Аналогичное снижение уровня вкДНК наблюдалось в среде культивирования МСК. Через 3часа после добавления окисленных (гДНКокси) и ГЦ-богатых п(рДНК) снижался уровень вкДНК в среде культивирования МСК - на 30% и на 25%, соответственно (рисунок 3.2.70. А, Б). Через 48 часов культивирования МСК в присутствии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов регистрируется увеличение количества клеток популяции МСК – в 1,2 раза (изменение не достоверно) и в 1,5 раза, соответственно ( рисунок 3.2.70. В). Рисунок 3.2.70. Электрофорез (А) и концентрация (Б) вкДНК в среде культивирования МСК в присутствии образцов ДНК (50 нг/мл, 3 часа). В - общее число клеток в популяции МСК, которые культивировали в присутствии окисленных и неокисленных образцов вкДНК (50 нг/мл, 48 часов). (*) - достоверно отличается от контроля, контроль – культивируемые клетки в среде без сыворотки (статистика МанаУитни, p < 0.05). Окисленные фрагменты вкДНК, стимулируя повреждение хроматина и образование разрывов ДНК, могут усиливать процесс гибели клеток культуры MCF7. Однако этого не происходит – количество клеток популяции MCF7 при действии гДНК не уменьшается, а при действии гДНКокси увеличивается примерно на 10% ( рисунок 3.2.71. А). 235 Рисунок 3.2.71. Влияние гДНК и гДНКокси (48 час, 50 нг/мл) на уровень гибели клеток MCF7. А - общее число клеток в популяции MCF7, после культивирования 48 часов в присутствии 50 нг/мл образцов ДНК. Электрофорез (А) и концентрация (Б) вкДНК, выделенной из среды культивирования клеток. Пунктиром обозначены контрольные значения с учетом дополнительно добавленной в среду гДНК или гДНКокси. (*) - достоверно отличается от контроля, контроль – культивируемые клетки в среде без сыворотки (статистика Мана-Уитни, p < 0.05). ДНК погибших в результате апоптоза клеток должна переходить в среду культивирования, увеличивая пул внеклеточной ДНК. Мы выделили вкДНК из среды культивирования контрольных и обработанных гДНК или гДНКокси клеток MCF7 и проанализировали размеры фрагментов методом электрофореза в геле ( рисунок3.2.71. Б). Размеры фрагментов вкДНК среды контрольных клеток варьируют от, примерно, 15 kb до 0.1 kb, при этом на дорожке геля видны моно- и динуклеосомные фрагменты ДНК (рисунок 3.2.71. В). Количество таких фрагментов значительно уменьшается в среде клеток, которые культивировали в присутствии гДНК, и, особенно, гДНКокси. При этом уменьшается и общее количество вкДНК. Концентрацию вкДНК оценили с использованием красителя RiboGreen. Общая концентрация вкДНК в среде клеток, к которым добавили гДНК или гДНКокси должна составлять 143 (контроль) + 50 (проба) = 195 нг/мл среды. В присутствии гДНК или гДНКокси реальная концентрация вкДНК снижена по сравнению с ожидаемой соответственно в 1.7 и 6.5 раза, что указывает на снижение уровня гибели клеток в культуре [Kostyuk et al., 2013]. Уменьшение вкДНК в среде культивирования при внесении в среду фрагментов экзогенной вкДНК может наблюдаться как вследствие снижения процесса апоптоза, так и вследствие того, что изменение свойств ДНК в среде культивирования может способствовать лучшему проникновению вкДНК в клетки и адгезии вкДНК на поверхности клеток. 236 Окисленные фрагменты вкДНК стимулирует увеличение количества клеток HDF и HEF, культивируемых в бессывороточной среде – в условиях хронического окислительного стресса. При культивировании HDF в среде «Гибрис» с 2% сыворотки количество клеток через трое суток увеличивается в 5 ± 0.5 раза, в бессывороточной среде – в 2.6 ± 0.3 раза. В присутствии гДНК и гДНКокси (20 нг/мл) количество клеток возрастает соответственно на 14 (p>0.05) и на 60% (p<0.01) по сравнению с контролем (при культивировании в среде без сыворотки). В присутствии гДНК и гДНКокси (100 нг/мл) количество клеток снижалось по сравнению с контролем на 5 – 10 % (p > 0.05) (рисунок 3.2.72. А) [Kostyuk et al., 2013]. Рисунок 3.2.72. Зависимость числа клеток в HDF (A) и HEF (Б) от присутствия в бессывороточной среде культивирования образцов гДНК и гДНКокси. ДНК вводили в среду в начале культивирования, клетки культивировали 72 часа. (*)достоверно отличается от контроля (контроль – культивируемые клетки в среде без сыворотки) (статистика Мана-Уитни, p < 0.05). При культивировании HEF в среде «Гибрис» с 2% сыворотки количество клеток через трое суток увеличивается в 12 ± 1 раз, в бессывороточной среде – в 4,5 ± 0.5 раза. На рисунок3.2.72. приведены данные для гДНКокси, введенной в среду HEF ( 5 - 50 нг/мл). Количество клеток возрастает максимум на 40% при добавлении 20 нг/мл гДНКокси к среде культивирования MCF-7 и снижается при введении 50 нг/мл гДНКокси ( рисунок 3.2.72. Б) [Kostyuk et al., 2013]. Таким образом, окисленные фрагменты вкДНК в концентрации 20 нг/мл, стимулирует увеличение количества клеток HDF and HEF. Наблюдаемый ответ может быть связан с двумя процессами: стимулирование пролиферативной активности клеток и/или снижение интенсивности гибели клеток при культивировании в бессывороточной среде. Поскольку в большинстве случаев не наблюдается процесса активации 237 пролиферативной активности, происходит арест клеточного цикла, т.е. замедляется деление клеток, логично предположить, что увеличение популяции клеток при действии фрагментов вкДНК происходит благодаря супрессии процесса гибели клеток. Таким образом, ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК снижают уровень гибели клеток разных типов. 3.2.14. ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК снижают количество клеток с признаками апоптоза в разных клеточных популяциях. Различают 2 основных механизма гибели клеток - некроз и апоптоз. Некроз – смерть клетки в результате токсического или механического повреждения, обычно сопровождается воспалением и повреждением окружающих клеток; апоптоз – механизм программируемой клеточной гибели [Booth et al., 2013]. При апоптозе не происходит повреждения окружающих клеток, ядро клетки в состоянии апоптоза конденсируется, цитоскелет и ядерная оболочка разрушается, ДНК ядра фрагментируется [Sinha et al., 2013]. На поверхности клетки, находящейся в состоянии апоптоза, экспрессируются фосфатидилсерины и другие молекулы, которые позволяют фагоцитировать погибающую клетку до ее разрушения [Sinha et al., 2013]. В культуре клеток при действии образцов вкДНК мы не наблюдали массовой гибели клеток путем некроза. Апоптоз – пролонгированный процесс, уровень апоптоза оценивают с помощью маркеров апоптоза, одним из которых является анексин, который взаимодействует с фосфатидилсериновым остатком [Wlodkowic et al., 2013]. Рисунок 3.2.73. Динамика изменения количества апоптотических клеток в культуре HUVEC во времени с использованием белка анексина 5 - маркера раннего апоптоза (Б). А - по оси Y – флуоресценция анексина, по оси Х - размер клеток, отмечена фракция R – клеток с признаками апоптоза. Все кривые достоверно отличаются от контроля (p < 0.05). 238 Через 30 минут после добавления фрагментов ДНК в среду культивирования HUVEC уменьшается количество клеток с признаками апоптоза ( фракция R на рисунок 3.2.73. А), особенно выражен этот эффект в случае добавления ГЦ-ДНК (рисунок3.2.73. Б (б)). Однако через 3 часа количество апоптотических клеток увеличивается при добавлении любой ДНК. Таким образом, увеличение количества гиподиплоидных клеток, входящих в фракцию subG1 соответствует снижению количества клеток с признаками апоптоза, т.е. образование гиподиплоидных клеток и частиц происходит не в результате апоптоза. Количество МСК с признаками апоптоза после воздействия неокисленных, ГЦбогатых и окисленных фрагментов вкДНК также оценивали с использованием белка анексина 5. Рисунок 3.2.74. Образцы вкДНК снижают уровень апоптоза в МСК. Уровень апоптоза оценивался с использованием белка анексина 5 - маркера раннего апоптоза. Концентрация добавляемых фрагментов 50 нг/мл, время воздействия 3 часа. А распределение клеток по флуоресценции анексина, отмечена фракция R – клеток с признаками апоптоза. (*) - достоверно отличаются от контроля (p < 0.05). Воздействие окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК снижает уровень апоптоза в МСК через 3 часа на 40 – 50%. ГЦ-богатые окисленные и неокисленные фрагменты (п(рДНК) и п(рДНК)окси) после 3-х часового воздействия снижают количество клеток с признаками апоптоза в большей степени – на 70-80%. Количество апоптотических клеток в популяции MCF-7 оценивали, проанализировав морфологию ядер, окрашенных красителем Hoechst258. Наличие конденсированного и фрагментированного хроматина указывает на гибель клетки по механизму апоптоза (рисунок3.2.75. А). В присутствии гДНКокси (50 нг/мл) количество апоптотических ядер уменьшается в 3 раза (рисунок3.2.75. Б) [Kostyuk et al., 2013]. 239 Рисунок 3.2.75. Влияние гДНК и гДНКокси на уровень апоптотических клеток MCF-7 (48 час, 50 нг/мл). A – Пример ядра с конденсированным хроматином (окраска Hoechst 33342). Б - Подсчет количества ядер с конденсированным хроматином. (*) достоверно отличаются от контроля (p < 0.01). Данные, представленные на рисунок 3.2.75. B, C, говорят в пользу того, что при действии гДНКокси, и, в меньшей степени, гДНК в концентрации 50 нг/мл снижается уровень гибели клеток в культуре MCF-7 [Kostyuk et al., 2013]. При культивировании фибробластов (HDF) в условиях хронического окислительного стресса (в бессывороточной среде) приблизительно 10% клеток показывают типичные морфологические признаки апоптоза, включая конденсацию хроматина ядер, визуализируемую при окрашивании Hoechst 33342 ( рисунок 3.2.76. А). Через 72 часа после однократного добавления в бессывороточную среду культивирования гДНКокси в концентрации 20 нг/мл количество поврежденных ядер с признаками конденсированного хроматина уменьшилось в 2 раза, рисунок 3.2.76. Б). В то же время культивирование HDF в присутствии гДНК (20 нг/мл или 100 нг/мл) или гДНКокси (100 нг/мл) не оказывало влияния на количество поврежденных ядер [Kostyuk et al., 2013]. 240 Рисунок 3.2.76. Влияние гДНК и гДНКокси на уровень апоптотических клеток HDF (20 и 100 нг/мл, 72 часа). A – Морфологические изменения в ядрах в HDF, пример ядра с конденсированным хроматином (окраска Hoechst 33342). Б - Подсчет количества ядер с конденсированным хроматином. *) - достоверные отличия от контроля (р <0,05), непараметрический U-тест. Таким образом, фрагменты вкДНК, особенно ГЦ-богатая и окисленная фракции, снижают количество клеток в состоянии апоптоза в клетках разного типа. 3.2.14.1. ВкДНК снижает активность каспазы 3 в клетках разных типов Мы проследили изменения активности одного из ферментов апоптоза – каспазы 3 при действии вкДНК и модельных фрагментов вкДНК: п(рДНК) и п(СатIII) и ДНК Е.coli (50 нг/мл, 3 часа) на лимфоциты, МСК и HUVEC с помощью флуоресцирующего субстрата QAc-DEVD-AFC. Действие ГЦ-богатой п(рДНК) на лимфоциты 6-ти разных доноров сопровождается небольшим снижением активности каспазы 3 в клеточных лизатах на (23 ± 9)% (P=0,95; t=2,7>2,1) (рисунок 3.2.77. А). В присутствии ДНК E.coli активность каспазы 3 возрастает в среднем на (20 ± 8)% (P=0,95; t=3,12>1,9). Таким образом, ДНК E.coli в концентрации 50 нг/мл индуцирует апоптоз в части клеток, в отличие от п(рДНК), которая снижает уровень спонтанного апоптоза в лимфоцитах (рисунок 3.2.77. А). Суммируя результат трех независимых экспериментов на трех различных культурах МСК, выявили ( рисунок 3.2.77. Б), что действие всех проб ДНК снижало активность каспазы 3 в клеточных лизатах: п(рДНК) - на (12 ± 3)% (P=0,95; t=5,7>1,9), п(СатIII) – на (40 ± 17)% (P=0,95; t=9,9>1,9), а ДНК Е.coli – на (31 ± 7)% (P=0,95; t=16,3>1,9). 241 Рисунок 3.2.77. Активность каспазы 3 в клеточных белковых лизатах после 3-х часовой инкубации лимфоцитов ЗД, МСК и HUVEC в присутствии образцов вкДНК и в контроле, отн ед (±SЕ). Объединены данные 3-х независимых опытов на культурах клеток разных доноров для каждого типа клеток. (*) - достоверные отличия от контроля, объяснения в тексте. Все модельные пробы ДНК и вкДНК здоровых доноров и больных РМЖ приводили к снижению активности каспазы 3 в клеточных лизатах HUVEC на 20-50% (P=0,95; t>1,9). Наиболее сильным ингибирующим действием на активность каспазы 3 обладала вкДНК больного РМЖ, которая содержала и ГЦ-богатые, и окисленные основания. Таким образом, фрагменты ГЦ-богатой и окисленной фракций вкДНК снижали активность фермента апоптоза каспазы 3. Воздействие вкДНК на активность каспазы 3 при действии вкДНК на фоне хронического окислительного стресса зависит от концентрации и степени окисления фрагментов вкДНК, низкие концентрации окисленной вкДНК ингибировали апоптоз и в этом случае. 3.2.14.2. Изменение экспрессии генов, участвующих в регуляции апоптоза при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК. Белки семейства Bcl2 играют ключевую роль в регуляции выживания клетки и апоптоза и включают три взаимодействующих и функционально различных группы, содержащих в своей структуре 1-4 консервативных домена ВН (Bcl homology) [Gross et al. 1999; Cory et al. 2003]. Белок Bcl-2 и четыре родственных ему белка (BCL -XL , Bcl -W , A1, и Mcl- 1) способствуют выживанию клетки [Cuconati and White 2002]. Другие 2 группы Bcl-2 белков, наоборот, активируют гибель клетки. Одна группа состоит из белков Bax , Bak и Вох, это белки, схожие с Bcl-2 по последовательности и структуре и содержат три консервативных домена BH1 , BH2 и BH3 [Suzuki et al., 2000]. Вторая 242 группа проапоптотических белков включает 8 белков: Bik, Bad и Bim, Puma, Bid, Noxa, Hrk, Bmf, содержащих только один ВН домен (BH3-only proteins) [Adams et al., 2003]. Белки семейства Bcl-2 контролируют апоптоз, по крайней мере, двумя путями. Вопервых, белки Bcl-2, Bcl-xL и Bax могут формировать ионные каналы, либо участвовать в их формировании [Adams et al., 2003] и, во-вторых, белки семейства Bcl-2 могут выступать в роли адаптеров связывающихся с белками, участвующими в процессе апоптоза [Muñoz-Pinedo, 2012; Adams et al., 2003]. Ингибиторы белков апоптоза (IAP - inhibitors of apoptosis proteins,) подавляют активность каспаз −3, −7, −9 [Silke and Meier, 2013]. Структура IAP содержит от 1-3 Nконцевых BIR-домена, которые связывают активные сайты каспаз, а RING-домены участвуют в деградации каспаз за счёт убиктивин-лигазной активности [Silke and Meier, 2013]. В условиях стресса, когда активируются процессы, направленные на выживаемость популяции клеток, происходит активация экспрессии антиапоптотических генов [MuñozPinedo, 2012]. Мы исследовали активацию экспрессии генов антиапоптотических белков семейства BCL-2, BIRC2(c-IAP1) и BIRC3 (c-IAP2) при действии на клетки разных типов ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК. Анализ количества мРНК BCL2, BCL2A1(Bfl-1/A1), BCL2L1 (BCL-X), BIRC2(c-IAP1) и BIRC3 (c-IAP2) в HUVEC показал, что в ответ на изменение концентрации вкДНК в клетках значительно активируются процессы, направленные на предотвращение апоптоза, что согласуется с данными об отсутствии значимых изменений в общем количестве клеток, не смотря на блокирование пролиферации. Экспрессия генов семейства BCL2 возрастает через 3 часа и остается повышенной в 1,5 – 3 раза на протяжении 72 часов после добавления к HUVEC как окисленных, так и неокисленных образцов вкДНК (рисунок 3.2.79. А). Экспрессия генов BIRC2 и BIRC3 возрастает в течение 48 и 24 часов, соответственно, после действия фрагментов вкДНК ( рисунок 3.2.79. Б). Активация экспрессии антиапоптотических генов наблюдается и при действии вкДНК на культуру MCF-7. При действии окисленных фрагментов (гДНКокси и п(рДНК)окси) и ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) на MCF7 уже через 0,5 часа количество мРНК BCL2, BCL2A1(Bfl-1/A1), BCL2L1(BCL-X) возрастает в 1,5 – 2 раза, повышаясь к 48 часам в 2-4 раза (рисунок 3.2.80. А), при этом ГЦ-богатые фрагменты в меньшей степени стимулируют экспрессию гена BCL2L1(BCL-X), чем окисленные [Kostyuk et al., 2013]. Неокисленная гДНК и pBR322 значимо (в 1.9 -3.5 раза) стимулируют повышение экспрессии генов семейства BCL2 только через 48 часов ( рисунок 3.2.80. А). 243 Рисунок 3.2.79. A -Уровень экспрессии генов семейства BCL2: BCL2, BCL2А1, BCL2L1; Б - Уровень экспрессии генов BIRC2(c-IAP1) и BIRC3 (c-IAP2) при действии окисленных и неокисленных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК на HUVEC (концентрация 50 нг/мл, время действия указано на рисунке). Приведены средние значения 3-х независимых экспериментов на культрах HUVEC, полученных от 3-х разных доноров. В качестве гена внутреннего стандарта использовали ТВР. Горизонтальная зеленая линия – средний уровень экспрессии генов интактных клеток эндотелия (1 ± 0,2 отн. ед.) (*) - значения достоверно отличающиеся от контроля (p<0.05, критерий Мана-Уитни). 244 Рисунок 3.2.80. A -Уровень экспрессии генов семейства BCL2: BCL2, BCL2А1, BCL2L1; Б - Уровень экспрессии генов BIRC2(c-IAP1) и BIRC3 (c-IAP2); В - Уровень экспрессии проапоптотического гена ВАХ при действии окисленных и неокисленных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК на клетки культуры MCF-7 (концентрация 50 нг/мл, время действия указано на рисунке). Приведены средние значения 3-х независимых экспериментов. В качестве гена внутреннего стандарта использовали ТВР. Горизонтальная зеленая линия – средний уровень экспрессии генов интактных клеток эндотелия (1 ± 0,2 отн. ед.) *) – значения, достоверно отличающиеся от контроля (p<0.05, критерий Мана-Уитни). 245 + Рисунок 3.2.81. A -Уровень экспрессии гена BCL2 при действии окисленных и неокисленных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК на МСК (концентрация 50 нг/мл, время действия указано на рисунке). Сокращения: ОИМ – острый инфаркт миокарда, РМЖрак молочной железы, вкДНК(HUVEC) – вкДНК среды культивирования эндотелиоцитов. Б - Уровень экспрессии генов BCL2, BCL2А1, BCL2L1, BIRC2(c-IAP1) и BIRC3 (c-IAP2) при действии гДНКокси и ГЦ-богатой п(рДНК) на МСК (концентрация 50 нг/мл, время воздействия 3 часа). Приведены средние значения 3-х независимых экспериментов на культрах МСК, полученных от 3-х разных доноров. В качестве внутреннего стандарта использовали ген ТВР. В – фотография гель-электофореза ПЦР-фрагментов кДНК генов BCL2 и BCL2А1 по сравнению с геном внутреннего стандарта GAPDH при действии ГЦбогатой п(рДНК) и гДНКокси. Г – экспрессия генов BCL2, BCL2А1, BCL2L1 в культурах МСК с гетерозиготными мутациями в генах BRCA1 (5382insC) и p53 (миссенс-мутация L145p в 5-ом экзоне); (*) - значения достоверно отличающиеся от контроля (p<0.005, критерий Мана-Уитни). В меньшей степени окисленные фрагменты вкДНК повышают экспрессию генов BIRC2(c-IAP1) и BIRC3 (c-IAP2). Неокисленные фрагменты гДНК и pBR322 повышают 246 экспрессию BIRC2 и BIRC3 в 2-3 раза через 48 часов ( рисунок 3.2.80. Б). При действии на клетки MCF-7 ГЦ-богатых фрагментов вкДНК экспрессия гена BIRC2 повышается в 2 раза уже через 30 минут и падает к 48 часам. Экспрессия гена BIRC3, наоборот, повышается только через 48 часов ( рисунок 3.2.80. Б) [Kostyuk et al., 2013]. При действии вкДНК на MCF7 не возрастает, или незначительно снижается экспрессия проапоптотического гена BAX ( рисунок 3.2.80. В). Активация антиапоптотических генов и супрессия гена BAX согласуется с полученными нами данными о возрастании количества клеток популяции MCF-7 при действии фрагментов вкДНК. В клетках MCF-7, так же, как и в HUVEC, вкДНК блокирует процесс апоптоза. В МСК тоже возрастает экспрессия антиапототических генов при действии вкДНК. Экспрессия гена ВCL2 возрастает через 1 час в среднем в 1,5 – 2 раза после добавления окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК, к 3-м часам экспрессия гена ВCL2 повышается в 3,5 – 5 раз и сохраняется на том же уровне через 24 часа (рисунок 3.2.81.А). При действии гДНК и вкДНК больного острым инфарктом миокарда (ОИМ) экспрессия гена BCL2 через 3 часа повышается только в 1,5 – 2,5 раза. К 24 часам экспрессия BCL2 при действии гДНК на МСК возрастает почти в 4 раза (рисунок 3.2.81). Таким образом, экспрессия гена ВCL2 повышается в МСК значительно - в 3,5 – 4,5 раза при действии любой вкДНК, отличаясь только временем воздействия. Уровень экспрессии генов BCL2, BCL2А1, BCL2L1, BIRC2(c-IAP1) и BIRC3 (c-IAP2) в МСК повышается в 3 – 6 раз через 3 часа после начала воздействия гДНКокси и ГЦбогатой п(рДНК) на МСК, гДНК повышает экспрессию перечисленных генов, в среднем, только в 2 раза. В культурах МСК с мутациями в генах BRCA1 (5382insC) и p53 (миссенс-мутация L145p в 5-ом экзоне) наблюдается более активная экспрессия антиапоптотических генов BCL2, BCL2А1, BCL2L1 – экспрессия этих генов возрастает примерно в 2 раза сильнее, чем в культурах МСК без мутации в генах BRCA1 и p53. Вероятно, столь сильный антиапоптотический ответ в культурах МСК с мутациями в генах BRCA1 и p53 и активация гена репарации BRCA1 направлены на выживание клеток с дефектом в генах репарации и регуляции апоптоза. Таким образом, анализ количества мРНК антиапоптотических генов показал, что в ответ на изменение концентрации вкДНК в клетках разных типов значительно активируются процессы, направленные на предотвращение апоптоза, что согласуется с данными об отсутствии значимых изменений в общем количестве клеток, не смотря на блокирование пролиферации. 247 3.2.15. ВкДНК повышает транскрипционную активность клеток ВкДНК стимулирует в разных клетках развитие одинакового ответа: в клетках происходит активный синтез АФК, возникают разрывы ДНК ядер, снижается пролиферативная активность, происходит арест клеточного цикла, при этом ингибируется апоптоз и активируются системы репарации поврежденной ДНК – т.е. клетки прекращают деление и активируют процессы, направленные на выживание. Активация сигнальных путей, направленных на выживание клеток, должна сопровождаться повышенной транскрипционной активностью. Уровень транскрипции генома отражает количество РНК, образующейся в клетках. При анализе изменений количества РНК в клетке после воздействия фрагментов вкДНК мы использовали специфичный для РНК краситель Quant-iTTM RiboGreen RNA (рисунок 3.2.82). Рисунок 3.2.82. Количество РНК в клетке после культивирования лимфоцитов ЗД (А, 1), HUVEC (Б, 1), МСК (В, 1), MCF-7 (Г) в течение 3 часов в присутствие окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК, отн. ед (± SЕ). Объединены данные двух независимых опытов. Фотография активации ядрышка лимфоцитов (А, 2) и HUVEC (Б, 2) после инкубации клеток 3 часа с ГЦ-богатыми фрагментами п(рДНК). В (2) - Количество 28SрРНК (отн. ед.), полученное методом нерадиоактивной количественной гибридизации. * – средние значения достоверно различаются по t-критерию (P=0,99; t>2,4). 248 Мы показали, что окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК стимулируют синтез общей РНК в клетке в 1,4 – 1,7 раза, это характерно для клеток разных типов: для лимфоцитов ЗД (рисунок 3.2.82. А (1)), HUVEC (рисунок 3.2.82. Б (1)), МСК ( рисунок 3.2.82. В (1)) [Костюк с соавт., 2012], MCF-7 (рисунок 3.2.82. Г). Стимуляция синтеза РНК в клетках сопровождается изменениями структуры ядрышка, отражающими активацию синтеза рРНК: увеличением числа центров, окрашенных нитратом серебра, и увеличением их суммарной площади [Ochs and Smetana, 1989]. Селективную окраску фиксированных ядер клеток с использованием азотнокислого серебра осуществляла научный сотрудник ФГБУ «МГНЦ» РАМН Н.А. Еголина по специально разработанной методике [Ляпунова с соавт., 1998]. На рисунок 3.2.82. А (2) и Б (2) приводятся фотографии ядер лимфоцитов после окраски серебром – интактных и после инкубации в течение 3 часов в присутствии вкДНК больного ревматоидным артритом (РА), обогащенной рДНК (А, 2), и НUVEC после 3-х часовой инкубации с фрагментами гДНКокси (Б, 2) [Вейко с соавт., 2006; Ермаков с соавт., 2011]. При действии ГЦ-богатых фрагментов вкДНК на лимфоциты здоровых доноров и окисленных фрагментов вкДНК на клетки эндотелия (HUVEC) мы наблюдали увеличение количества ядер с признаками активации ядрышка: значительно возрастает число серебрящихся центров и их суммарная площадь (рисунок 3.2.82 А (2), Б (2)) [Вейко с соавт., 2006; Ермаков с соавт., 2011]. Полученные результаты были подтверждены на МСК и с помощью метода нерадиоактивной количественной гибридизации суммарной РНК с зондами, содержащими фрагменты 18SрРНК и 28рSРНК [ Костюк с соавт., 2012]. 28SрРНК в большей степени отражает целостность мРНК по сравнению с 18SрРНК и ее содержание выше в пуле суммарной РНК (10 мкг суммарной РНК в среднем содержит 6 мкг 28SрРНК и 2 мкг18SрРНК) [Костюк с соавт., 2012]. Мы обнаружили, что при инкубации МСК с ГЦбогатой п(рДНК) и АТ-богатой п(СатIII) концентрация 28рРНК возрастает в 1,55 (P=0,99; t=13,6>2,4) и в 1,76 (P=0,99; t=17,8>2,4) раза, соответственно [Костюк с соавт., 2012]. При культивировании МСК с фрагментами ГЦ-обогащенной бактериальной ДНК (E.coli) уровень 28РНК возрастает не столь значительно - в 1,3 раза (P=0,99; t=8,5>2,4) (рисунок 3.2.82. В (2)), что, вероятно, связано с активацией других генов и сигнальных путей в клетке фрагментами бактериальной ДНК, по сравнению с эндогенной ДНК [Костюк с соавт., 2012]. 249 Таким образом, мы показали, что при контакте клеток разных типов с фрагментами вкДНК значительно повышается транскрипционная активность генома. Повышение транскрипционной активности должно сопровождаться активацией сигнальных путей в клетках. Мы провели определение возможных известных клеточных сигнальных путей, через которые реализуется стимулирующее действие фрагментов вкДНК на клетки человека. Мы выявили, что в клетах разных типов повышается экспрессия генов сигнальных путей, направленных на выживание клеток (NF-kB-, NRF2-, STAT3-, PPARγ – и других сигнальных путей). Индукция экспрессии генов сигнальных путей происходит в результате связывания фрагментов вкДНК с рецепторами в клетках. Мы провели поиск нутриклеточных рецепторов, активирующихся при действии ГЦбогатых и окисленных фрагментов вкДНК из числа рецепторов, связывающих экзогенные нуклеиновые кислоты. ВкДНК, проникая внутрь клетки либо посредством эндоцитоза, либо при помощи мембранных рецепторов, активирует сигнальные пути, связываясь с внутриклеточными рецепторами. Кандидатами для связывания вкДНК являются рецепторы, расположенные на мембране эндосом: TLR9, цитозольный рецептор AIM2, RIG1 и неидентифицированный рецептор, адаптером которого служит STING. 3.2.16. TLR9 – рецептор, через который фрагменты вкДНК реализуют стимулирующее действие Известно, что фрагменты ДНК, содержащие неметилированные CpG-мотивы, обладают способностью связываться с белками семейства «Toll-like» рецепторов - TLR9 [Lee et al., 2012]. Показано, что ядерная ДНК не способна активировать клетки иммунной системы из-за ее гиперметилированности и обедненности CpG динуклеотидами [Stacey et al., 2003]. Однако состав вкДНК отличается от ядерной ДНК – во вкДНК накапливаются ГЦ-богатые, устойчивые к нуклеазному гидролизу последовательности, способные взаимодействовать с TLR9 [Вейко с соавт., 2006]. Анализ первичной последовательности рДНК и литературных данных по метилированию рДНК человека, выявил присутствие большого количества неметилированных CрG-содержащих мотивов связывания с TLR9 в составе рДНК [Костюк с соавт., 2010]. Таким образом, изменение состава вкДНК по сравнению с яДНК делает ее потенциальным лигандом TLR9 [Костюк с соавт., 2010; Костюк с соавт., 2010]. TLR9 являются трансмембранными внутриклеточными рецепторами, расположенными на мембране эндосом, они содержат повтор для закрепления лиганда и внутриклеточную высококонсервативную область, опосредующую 250 при участии адаптерных молекул взаимодействия между рецепторами и молекулами сигнального пути [Sasai et al., 2013; Lee et al., 2012]. Связывание с TLR9 сопровождается активацией протеинкиназ семейства МАРК, фактора транскрипции NF-kB, увеличением индукции ряда цитокинов и выработкой активных форм кислорода [Kawai and Akira, 2008; Yamamoto and Takeda, 2010]. 3.2.16.1. ВкДНК больных ревматоидным артритом, модельные ГЦ- богатые фрагменты увеличивают экспрессию гена TLR9 в лимфоцитах человека Одним из первых объектов, который мы использовали для идентификации рецепторов, через которые реализует свое действие вкДНК, были лимфоциты периферической крови здорового донора. Лимфоциты были выбраны как объект воздействия вкДНК, поскольку изначально было показана экспрессия TLR9 в макрофагах, плазмацитоидных дендритных клетках и В-лимфоцитах [Hartmann et al., 2000]. Исследовали активацию рецептора TLR9 на уровне гена и на уровне белка при действии вкДНК больных ревматоидным артритом, для которых было показано увеличенное содержание фрагментов рДНК в составе вкДНК, и модельных фрагментов. Плазмида п(рДНК) моделирует действие вкДНК, поскольку фрагменты вставки - рДНК накапливаются в составе вкДНК [Вейко и др., 2007] и устойчивы к двунитевым разрывам при нуклеазном гидролизе [Вейко и др., 2000]. Кроме того, п(рДНК) может выступать в качестве лиганда рецептора TLR9, так как содержит высокий процент ГЦ- пар и обогащена неметилированными СpG – динуклеотидами; некоторые участки вставки рДНК содержат последовательности - супрессоры TLR9 (короткие повторы с общей формулой (G)n), которые могут конкурентно ингибировать действие TLR9-активирующих участков последовательности р(рДНК) [Костюк с соавт., 2010]. Для того, чтобы исключить влияние вектора pBR322, содержащего сайты связывания с рецептором TLR9, использовали сам вектор pBR322 и плазмиду п(СатIII), в состав которой входит АТбогатая последовательность саттелита III (область 1q12 1-й хромосомы человека), которая не содержат ни лигандов, ни супрессоров TLR9 и вектор pBR322 [Костюк с соавт., 2012]. В качестве известного лиганда TLR9 использовали ДНК Е.coli [Magnusson et al., 2007]. Мы исследовали уровень экспрессии гена TLR9 в ответ на стимуляцию лимфоцитов здоровых доноров фрагментами ГЦ- обогащенной внеклеточной ДНК больных ревматоидным артритом (вкДНК РА), п(рДНК) и ДНК Е.coli (50 нг/мл, 30 минут и 3 часа). Для оценки уровня экспрессии гена TLR9 применяли метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (РВ). В реакции ПЦР-РВ использовали модифицированный олигонуклеотид, содержащий на 5’- конце флуоресцеиновую группу (FAM), а на 3’- конце – тушитель флуоресценции. В качестве внутреннего стандарта выбрали ген GAPDH, при 251 действии фрагментов вкДНК и других стимулов экспрессия GAPDH в лимфоцитах не изменялась, что совпадает с литературными данными [Костюк с соавт., 2012; LandoltMarticorena et al., 2011]. Количество мРНК GAPDH в ПЦР-РВ определяли с использованием олигонуклеотида, меченного карбоксиметилфлуоресцеином (R6G). Все эксперименты ставили не менее чем в 3-х повторах и не менее чем в 3-х независимых опытах на лимфоцитах, полученных от разных здоровых доноров. При действии фрагментов вкДНКРА, п(рДНК) и ДНК Е.coli на лимфоциты наблюдается увеличение количества мРНК TLR9 соответственно в 3,2; 2,8 и в 5,4 раза относительно контрольных клеток (рисунок 3.2.83. А) [Костюк с соавт., 2012]. Рисунок 3.2.83. А - Уровень экспрессии TLR9 в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров при действии вкДНК больных ревматоидным артритом (РА), ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК), гДНК, гДНКокси, вектора рBR322 и ДНК E.coli. через 30 минут и через 3 часа после начала воздействия. Б – уровень экспрессии TLR9 при действии п(рДНК) и вкДНК РА на фоне хлорокина. Данные приведены относительно контроля – необработанных лимфоцитов того же донора и нормализованы по GAPDH. Приведены средние значения для 3-х доноров, эксперимент повторен 6 раз (для каждого эксперимента лимфоциты выделялись заново из свежей крови). В - Уровень экспрессии TLR9 в эмбриональных фибробластах легкого человека (HEF) при действии ГЦбогатых фрагментов п(рДНК), вектора рBR322 и ДНК E.coli. через 3 часа после начала воздействия. Данные приведены относительно контроля – интактных фибробластов того же донора и нормализованы по GAPDH. Горизонтальная зеленая линия – средний уровень экспрессии генов интактных клеток. Приведены средние значения для 3-х независимых экспериментов. (*) – данные достоверно отличаются от контроля, p<0,001. Фрагменты вектора pBR322 без вставки, гДНК и гДНКокси не индуцировали статистически значимого повышения экспрессии TLR9 в лимфоцитах человека [Костюк с 252 соавт., 2012]. Таким образом, взаимодействие ГЦ-богатых фрагментов рДНК, входящих в состав вкДНК, с лимфоцитами сопровождается активацией транскрипции гена TLR9, однако ДНК Е.coli. в большей степени активирует экспрессию гена TLR9, чем п(рДНК). При ингибировании рецепторов TLR9 лимфоцитов здоровых доноров хлорокином количество мРНК TLR9 уменьшалось в несколько раз и достигало уровня контрольных значений (рисунок 3.2.83 Б). Хлорокин меняет рН в эндосомах, блокируя связывание лиганда с рецептором. Хлорокин добавлялся к клеткам в концентрации 2 мкг/мл за 30 минут до внесения фрагментов п(рДНК) и вкДНК РА в среду культивирования. 3.2.16.2. ГЦ-ДНК усиливает экспрессию TLR9 в эмбриональных фибробластах легкого человека С целью выяснить, как влияет изменение характеристик вкДНК (добавление к среде культивирования ГЦ-обогащенных и окисленных фрагментов вкДНК) на экспрессию гена TLR9 в других клетках человека, не иммунной природы, мы проанализировали действие фрагментов ДНК на культивируемые эмбриональные фибробласты легкого человека ( HEF, рисунок 3.2.83. В). ГЦ- обогащенные фрагменты п(рДНК) стимулируют повышение уровня экспрессии гена TLR9 в 3,7 раз по сравнению с контролем, ДНК E.coli повышает экспрессию гена TLR9 в 5,6 раз по сравнению с контролем. Таким образом, экзогенная бактериальная ДНК (E.coli) в большей степени активирует транскрипцию гена TLR9, так же, как в лимфоцитах [Костюк с соавт., 2012]. Возможно, не столь высокая экспрессия гена TLR9 при действии эндогенной рДНК по сравнению с экзогенной ДНК E.coli – один из вариантов приспособительной реакции организма на накопление продуктов разрушения собственных клеток. В связи с этим предположением мы провели эксперимент на культуре лимфоцитов, полученных от пациентов с системной красной волчанкой (СКВ). СКВ (SLE - Systemic lupus erythematosus) циркулирующей характеризуется ДНК и наличием наработкой повышенной аутоантител концентрации против фрагментов односпиральной и двухспиральной «собственной» ДНК организма [Pisetsky and Jiang, 2006]. 3.2.16.3. ГЦ-ДНК снижает экспрессию TLR9 в лимфоцитах больного СКВ. В сыворотке крови пациентов с СКВ обнаруживаются высокие концентрации циркулирующей ДНК, что позволяет предположить, что ДНК активирует иммунную систему [Pisetsky, 2012; Pisetsky and Jiang, 2006]. Показано, что в процессе активации иммунной системы больных СКВ существенную роль играет TLR9, опознающий присутствующие в сыворотке больных СКВ фрагменты вкДНК [Chauhan et al., 2013]. 253 Стимуляция TLR9 активирует TLR9- и NF-kB- сигнальные пути, приводит к перемещению транскрипционного фактора NF-kB в ядро и выброс клетками большого количества провоспалительных цитокинов, что ведет к прогрессии заболевания [Celhar et al., 2012]. Рисунок 3.2.84. А , Б - Уровень экспрессии TLR9 в лимфоцитах здорового донора (А) и больного СВК (Б) без воздействия и через 3 часа после добавления ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) и вектора рBR322 в концентрации 50 нг/мл. Количество мРНК гена TLR9 нормализовано по гену GAPDH, уровень которого одинаков и у здоровых доноров, и у больных СКВ. Данные приведены относительно контроля – необработанных лимфоцитов здорового донора. Приведены средние значения для 3-х здоровых доноров и 2х доноров с СКВ, эксперимент повторен 3 раза (для каждого эксперимента лимфоциты выделялись заново из свежей крови). Сокращения: ЗД – здоровые доноры, СКВ – больные системной красной волчанкой. В, Г - Уровень экспрессии TLR9 в СD34+ – клетках и мононуклеарах костного мозга при действии ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК), вектора рBR322 и АТ-богатой плазмиды п(CатIII), содержащей в своем составе вектор рBR322 (50 нг/мл, 3 часа). Данные приведены относительно контроля – интактных клеток того же донора и нормализованы по GAPDH. Приведены средние значения для 2-х доноров, эксперимент повторен 3 раза. Д – фотография геля после электорофореза ПЦРфрагментов кДНК гена TLR9 в контроле, после 3-х часовой инкубации с фрагментами п(рДНК) и п(СатIII). Горизонтальная зеленая линия – средний уровень экспрессии генов интактных клеток. (*) - значения достоверно отличающиеся от контроля (p<0.05, критерий Мана-Уитни). 254 Уровень экспрессии гена TLR9 в лимфоцитах периферической крови при СКВ повышен в 3,2 раза по сравнению с уровнем экспрессии гена TLR9 в лимфоцитах здоровых доноров (рисунок3.2.84 А и Б). Количество мРНК гена TLR9 нормализовано по гену GAPDH, уровень которого одинаков и у здоровых доноров, и у больных СКВ. Мы исследовали влияние ГЦ-богатых фрагментов рДНК на лимфоциты больных СКВ. Лимфоциты больных СКВ на однократное добавление п(рДНК) отвечали незначительным снижением уровня экспрессии гена TLR9 по сравнению с активированным контролем – необработанными лимфоцитами больных СКВ. Однако, уровень экспрессии гена TLR9 оставался повышенным – он в 2,9 раза превышал уровень нормированной по GAPDH экспрессии гена TLR9 в контрольных лимфоцитах здорового донора (рисунок 3.2.84. Б) и совпадал со значениями экспрессии TLR9, полученными после 3 часов воздействия п(рДНК) на лимфоциты здорового донора. Добавление вектора рBR322 незначительно снижало изначально повышенную по сравнению с интактным контролем экспрессию гена TLR9 ( рисунок 3.2.84. Б). Экспрессии гена TLR9 в клетках повышена. Новые порции стимулятора в виде ГЦ - обогащенных фрагментов вкДНК через TLR9 запускают механизмы обратной связи, регулирующие количество рецептора TLR9 на уровне транскрипции. Вероятно, это проявление приспособительной реакции клеток на повышенную концентрацию вкДНК в организме больного СКВ. Механизмы реализации приспособительной реакции еще не исследованы, и их изучение требует серьезного подхода и осмысления. Возможно, регуляция экспрессии гена TLR9 происходит при активации других рецепторов, избирательно связывающих фрагменты вкДНК. Поступающие экзогенные фрагменты вкДНК являются дополнительным сигналом “опасности”, приводящим к блокированию уже активированных систем. Или, возможно, в регуляцию процесса вовлечены эффекторы и адаптеры TLR9 - сигнального пути. Вероятно, действие ГЦ - богатых фрагментов, накапливающихся в составе вкДНК носит не активирующий, а регулирующий характер, что усложняет анализ ответа клеток на присутствие вкДНК. 3.2.16.4. ГЦ-ДНК усиливает экспрессию TLR9 в СD34+ клетках и мононуклеарах костного мозга. Чтобы ответить на вопрос, задействован ли рецептор TLR9 в проведении индуцируемого вкДНК сигнала в малодифференцированных клетках, мы проанализировали изменение уровня экспрессии гена TLR9 в клетках костного мозга при добавлении ГЦ-богатых фрагментов рДНК. Для этой цели нами были получены СD34+ клетки и мононуклеары костного мозга (материал предоставлен ФГБУ "НИИР" РАМН им. В. А. Насоновой). 255 Мононуклеары костного мозга морфологически являются круглыми одноядерными клетками лимфоидного характера, имеющие круглое или овальное ядро и цитоплазму без специфической зернистости [Terai et al., 2014; Сергеевичев с соавт., 2010]. Во фракцию мононуклеаров входят лимфоциты, моноциты, лимфобласты, миелобласты, плазматические клетки [Сергеевичев с соавт., 2010]. CD34+ клетки костного мозга считаются наименее дифференцированной фракцией клеток, содержащей гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), обладающие терапевтическим потенциалом [Vrtovec et al., 2013]. При действии ГЦ- богатых фрагментов рДНК, накапливающихся в составе вкДНК, как в СD34+ клетках, так в мононуклеарах костного мозга наблюдается увеличение экспрессии гена TLR9 в 2,7 и 3,1 раза, соответственно (рисунок 3.2.64. В, Г). АТ- богатая плазмида п(CатIII) увеличивает экспрессию гена TLR9 в СD34+ клетках и мононуклеарах костного мозга в меньшей степени – в 1,5 - 1,8 раза, соответственно (рисунок 3.2.64. В, Г). АТ- богатые фрагменты в составе вкДНК опосредовано, возможно, через инициацию перекрывающихся сигнальных путей, вносят небольшой вклад в инициацию TLR9 сигнального пути. Вектор рBR322 не оказывал влияния на экспрессию гена TLR9. 3.2.16.5. При действии ГЦ-богатых фрагментов вкДНК активируются рецепторы TLR9 в МСК. Показано, что МСК экспрессируют все известные рецепторы семейства TLR [Pevsner-Fischer et al., 2007]. Высказываются предположения, что активация TLRсигнального пути играет существенную роль в защите МСК от апоптоза [Wang et al., 2009]. Поэтому мы предположили, что изменения в функциональной активности МСК в присутствии проб ДНК происходят с участием TLR9 - сигнального пути. Для того, чтобы ответить на вопрос, активируется ли TLR9 - сигнальный путь при действии фрагментов вкДНК на МСК, мы исследовали влияние образцов вкДНК (50 – 100 нг/мл, 3 часа), полученной из плазмы крови больных и здоровых доноров, на экспрессию гена TLR9 в МСК (рисунок 3.2.85). Для МСК в качестве гена внутреннего стандарта был выбран ген ТВР (TATAA-box binding protein), поскольку согласно данным литературы и в результате наших экспериментов ген ТВР оказался наиболее стабильным из трех генов (TBP, GAPDH и AKTB), обычно использующихся для нормирования результатов ПЦР-РВ по исследованию экспрессии [ Костюк с соавт., 2012; Fink et al., 2008]. ВкДНК больных острым инфарктом миокарда, ревматоидным артритом и раком молочной железы повышает экспрессию гена TLR9 в 2-3 раза (p < 0.05), вкДНК больных СКВ повышает экспрессию гена TLR9 в 4 раза(p < 0.05). ВкДНК первичных раковых клеток увеличивает экспрессию TLR9 в 3,8 раза (p < 0.05), вкДНК здоровых доноров 256 статистически значимо не влияла на экспрессию TLR9 (рисунок 3.2.85). Ранее нами было показано, что во вкДНК больных аутоиммунными заболеваниями, при ОИМ, при раке молочной железы во вкДНК накапливается ГЦ-богатые неметилированные фрагменты рДНК, которые являются потенциальными лигандами TLR9. При хронических заболеваниях содержание рДНК во вкДНК выше, чем при острых состояниях. Мы обнаружили, что и экспрессия гена TLR9 при хронических заболеваниях возрастает сильнее. По-видимому, активирующее действие вкДНК больных обусловлено наличием в составе вкДНК лигандов TLR9 - ГЦ-богатых неметилированных последовательностей, накапливающихся во вкДНК, в том числе - рДНК. Рисунок 3.2.85. Уровень экспрессии гена TLR9 при культивировании МСК в присутствии гДНК, вкДНК больных и здоровых доноров, модельных фрагментов (п(рДНК) и п(СатIII)) и ДНК E. сoli (концентрация добавляемых фрагментов 50 нг/мл, время воздействия 3 часа). Количественное измерение кДНК TLR9 проводилось методом ПЦР в реальном времени на приборе StepOnePlusTM Real-Time PCR System ("Applied Biosystems"). Приводятся средние значения и SD для N (количество указано в скобках под столбиком) образцов добавляемой ДНК (гДНК и вкДНК) и для трех независимых экспериментов с модельной ДНК. Сокращения: ЗД – здоровые доноры, СКВ – системная красная волчанка, РА – ревматоидный артрит, ХИБС – хроническая ишемическая болезнь сердца, РМЖ – рак молочной железы, РСК – раковые стволовые клетки. Ген внутреннего стандарта – ТВР. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Для подтверждения нашего предположения, использовали модельные фрагменты п(рДНК). При действии фрагментов п(рДНК) и ДНК Е.coli в концентрации 50нг/мл на МСК наблюдается увеличение количества мРНК TLR9 через 3 часа после добавления образцов ДНК соответственно в 3,0 и в 2,9 раза по сравнению с контролем (p < 0.05), АТ- 257 богатая п(СатIII) и вектор pBR322 не оказывает влияния на экспрессию гена TLR9 (рисунок 3.2.85). Таким образом, ГЦ-обогащенная вкДНК больных людей и модельный фрагмент - п(рДНК) стимулируют увеличение экспрессии TLR9 в той же, или даже большей степени, что и природный лиганд ДНК Е.coli [Костюк и соавт., 2012]. В последние годы появились статьи, в которых было показано, что окисление лигандов TLR9 усиливало экспрессию генов рецепторов TLR9. Нами было показано, что во вкДНК РМЖ и вкДНК ОИМ накапливаются окислительные модификации – возрастает уровень 8-оксигуанозина во вкДНК. Мы исследовали, влияет ли окислительная модификация на уровень экспрессии TLR9. К среде культивирования МСК добавляли фрагменты окисленной геномной ДНК и окисленной вкДНК (окисление проводили тем же способом, что и окисление гДНК), вкДНКокси1 – слабо окисленные фрагменты, вкДНКокси2 –сильно окисленные фрагменты вкДНК, способ окисления изложен в главе «Материалы и методы»). Окисление вкДНК приводило к более сильной стимуляции TLR9 в МСК в первый час после добавления. Однако повышение уровня экспрессии TLR9 при действии окисленных фрагментов в МСК носит очень кратковременный характер - через 3 часа уровень экспрессии TLR9 снижается, и уже через 3 часа окисленные фрагменты повышают уровень экспрессии TLR9 в меньшей степени, чем неокисленные аналоги (рисунок 3.2.86). Действие ГЦ-богатых фрагментов на МСК стимулировало повышение экспрессии гена TLR9 длительное время – в течение 24 часов сохранялась высокая экспрессия гена TLR9 (рисунок 3.2.86). Возможно, столь кратковременное повышение экспрессии гена TLR9 в МСК на воздействие окисленных фрагментов связано со способностью МСК быстро справляться с последствиями окислительного стресса. Мы исследовали на модельной системе, влияет ли уровень окисления фрагментов вкДНК на индукцию этими фрагментами экспрессии гена TLR9. Окисленная п(рДНК)окси индуцирует повышение экспрессии TLR9 через час в 4,8 раз, однако, и неокисленная п(рДНК) стимулирует экспрессию TLR9 в 4,2 раза по сравнению с контролем (рисунок 3.2.86). Поэтому мы имеем дело с кумулятивным эффектом, складывающимся из действия ГЦ-ДНК и ДНКокси. Повышение степени окисления фрагментов вкДНК снижает способность окисленных фрагментов стимулировать экспрессию гена TLR9. Так, слабо окисленные фрагменты вкДНК(HUVEC)окси1 и сильно окисленные фрагменты вкДНК(HUVEC)окси2 через 1 час увеличивают количество РНК TLR9 в 3,1 и 1,75 раз, соответственно (рисунок 3.2.86). Неокисленная вкДНК(HUVEC) повышала за 1 час уровень экспрессии TLR9 в МСК только в 1,3 раза. Наиболее показательно действие окисленной геномной ДНК. Неокисленная гДНК не влияет на экспрессию гена TLR9, 258 слабоокисленные фрагменты увеличивают уровень экспрессии TLR9 в 2,9 раза, повышение уровня окисления приводит к снижению стимулирующей способности гДНКокси (гДНКокси2 повышает уровень экспрессии TLR9 только в 1,4 раза) (рисунок 3.2.86). Рисунок 3.2.86. Уровень экспрессии гена TLR9 при культивировании МСК в присутствии неокисленных и окисленных фрагментов вкДНК и модельных фрагментов (концентрация добавляемых фрагментов 50 нг/мл, время воздействия 3 часа). Количественное измерение кДНК TLR9 проводилось методом ПЦР в реальном времени. Результат представлен как изменение экспрессии гена в стимулированных клетках по отношению к нестимулированным (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная зеленая линия 1 ± 0,3). Приводятся средние значения и SD для трех/шести независимых экспериментов. Сокращения: ОИМ – острый инфаркт миокарда. Ген внутреннего стандарта – ТВР. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Избирательное окисление 8-оксигуанозина гДНК индуцирует возрастание уровня экспрессии в 2 раза (рисунок 3.2.86). Таким образом, окисленная ДНК обладает стимулирующим действием на TLR9 только в определенных пределах, повышение и снижение уровня окисления уменьшает активирующее действие вкДНК. Это, вероятно, также является приспособительной реакцией клеток на изменение состава вкДНК – низкий уровень окисления не является индуктором увеличения экспрессии TLR9, а слишком высокий уровень окисления является опасным и клетка сдерживает экспрессию TLR9, возможно, за счет петли отрицательной обратной связи. 259 Рисунок 3.2.87. Уровень экспрессии гена TLR9 при культивировании МСК в присутствии разных концентраций фрагментов вкДНК (концентрации указаны на рисунке, время воздействия 3 часа). Обозначения п(рДНК)msp1 и п(рДНК)rsa1- п(рДНК) после рестрикции, соответственно, рестриктазами Msp1 и Rsa1. Количественное измерение кДНК TLR9 проводилось методом ПЦР в реальном времени. Результат представлен как изменение экспрессии гена в стимулированных клетках по отношению к нестимулированным (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная зеленая линия 1 ± 0,3). Приводятся средние значения и SD для трех независимых экспериментов на трех разных культурах. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,005). Б - Уровень экспрессии гена TLR9 в культурах МСК, имеющих мутации в генах BRCA1 (5382insC) и р53 (миссенс-мутация L145p в 5-ом экзоне), при действии ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК)(концентрация 50 нг/мл, время воздействия 3 часа). Результат представлен как изменение экспрессии гена в стимулированных клетках по отношению к нестимулированным (контроль – интактные клетки). Приводятся средние значения и SD для трех независимых экспериментов на шести разных культурах без мутации, двух культурах, имеющих мутацию в гене BRCA1, и одной культуре с мутацией в гене р53. (*) - Различия между значениями экспрессии гена TLR9 в культуре без мутации и с мутациями статистически значимы (р <0,05). Регулирующее действие эндогенной вкДНК показано и при увеличении концентрации ГЦ-богатой п(рДНК), фрагмент которой входит в состав вкДНК. Наиболее сильным активирующим действием на экспрессию TLR9 обладает п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл, с увеличением концентрации стимулирующее действие уменьшается и при концентрации п(рДНК) 200 нг/мл достоверно не отличается от контрольных значений (рисунок 3.2.87. А) [Костюк и соавт., 2012]. В то же время, увеличение концентрации ГЦ-богатой ДНК E.coli, являющейся патогенном для клетки, 260 сопровождается усилением экспрессии TLR9 ( рисунок 3.2.87. А). Наблюдаемые эффекты могут быть связаны с наличием в составе ГЦ-богатой эукариотической ДНК, наряду с лигандами рецепторов TLR9, большого количества последовательностей-ингибиторов TLR9 [Костюк и соавт., 2010]. В составе бактериальной ДНК последовательности – ингибиторы мало представлены. Кроме того, проверили предположение, что более мелкие фрагменты более доступны для связывания внутриклеточным рецептором за счет более легкой их доставки в клетку. Для снижения молекулярной массы обработали п(рДНК) рестриктазами Msp1 и Rsa1. Не было обнаружено разницы в стимуляции экспрессии генов рецепторов TLR9 плазмидой п(рДНК) до и после гидролиза (рисунок 3.2.87. А). Возможно, внутри- и внеклеточные нуклеазы достаточно эффективно расщепляют вкДНК до коротких фрагментов, поэтому, уровень экспрессии TLR9 не зависит от длины добавляемых фрагментов вкДНК. При исследовании действия ГЦ-богатой п(рДНК) на уровень экспрессии TLR9 в МСК, имеющих мутации в генах BRCA1 (5382insC) и р53 (миссенс-мутация L145p в 5-ом экзоне), было показано, что культура с делецией в гене белка р53 отвечает повышенным уровнем экспрессии на действие ГЦ-богатых фрагментов (рисунок 3.2.87. Б). Возможно, дефект гена р53, активирующего апоптоз в клетках, способствует более сильной активации сигнальных путей, направленных на выживание клеток, при стрессорном воздействии вкДНК. Уровень экспрессии TLR9 в ответ на ГЦ-рДНК в клетках МСК с мутацией и без мутации в гене BRCA1 различается недостоверно ( рисунок 3.2.87. Б). Рисунок 3.2.88. Определение рецепторов ТЛР9 с помощью антител к TLR9, меченных флуоресцирующим красителем фикоэритрином - PE-anti-TLR9. А, В – контрольные клетки, С, Д – МСК после действия фрагмента п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл, 3 часа. А, С – фото в видимом свете (увеличение Х100), В, Д – флуоресценция ( возбуждение 495 нм). Е - Средняя интенсивность флуоресценции в расчете на одну клетку (I- интенсивность флуоресценции, отн. ед.). (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). 261 Для визуализации рецепторов TLR9 и подтверждения активации экспрессии генов этих рецепторов фрагментами рДНК на уровне синтеза белка, были использованы антитела к TLR9, меченные флуоресцирующим красителем фикоэритрином - PE-antiTLR9 (рисунок 3.2.88). Интенсивность флуоресценции клеток возрастала в 1,7 (р<0.05) раза после культивирования МСК в присутствии п(рДНК) (рисунок 3.2.88). Полученные для мРНК TLR9 данные подтвердились при исследовании динамики накопления белка TLR9 в МСК методом проточной цитометрии ( рис 3.2.88. Б, B, Г). Рисунок 3.2.88. А - Динамика накопления мРНК TLR9 во времени при инкубации МСК в присутствии ГЦ-богатых фрагментов - п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. Результат представлен как изменение экспрессии гена в стимулированных клетках по отношению к нестимулированным (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная зеленая линия 1 ± 0,2). Приводятся средние значения и SD для трех независимых экспериментов (*) - Различия статистически значимы (р <0,05). Б, В Определение уровня белка TLR9 в МСК с помощью антител к TLR9, меченных флуоресцентным фикоэритрином. Б – Данные проточной цитометрии. Область R – фракция клеток, экспрессирующих TLR9. В – Динамика накопления во времени (в области R) МСК, экспрессирующих TLR9 при добавлении п(рДНК) и гДНК (50 нг/мл). (*) Различия статистически значимы (р <0,5). - 262 Для визуализации TLR9 использованы антитела PE-anti-TLR9 ( рисунок 3.2.88. Б). Количество белка TLR9 в МСК повышалось через 0,5 часа культивирования МСК в присутствии п(рДНК), достигало максимума через 1 час, через 3 часа после начала воздействия п(рДНК) уровень TLR9 снижался, но превышал уровень рецептора в контрольных клетках (рисунок 3.2.88 В) [Костюк и соавт., 2012]. Добавление в среду культивирования МСК фрагментов гДНК снижало уровень экспрессии белка TLR9 (рисунок 3.2.88 В). За три часа инкубации МСК в присутствии окисленных фрагментов п(рДНК)окси и гДНКокси не обнаружено увеличения количества белка рецептора TLR9, а отмечается снижение экспрессии TLR9 (рисунок 3.2.89. А, Б). Повышение экспрессии гена TLR9, вызванное вкДНК с повышенным содержанием ГЦ-богатых последовательностей, сохраняется более 2-х часов, снижаясь через 3 суток, и потом в процессе длительного культивирования (6 суток) экспрессия TLR9 не повышается ( рисунок3.2.89. А). Рисунок 3.2.89. А, Б - Определение уровня белка TLR9 в МСК при действии окисленных фрагментов вкДНК. А – Распределение клеток, данные проточной цитометрии. Область R – фракция клеток, экспрессирующих TLR9. В – средние значения флуоресценции TLR9 МСК в присутствии ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК в концентрации 50 нг/мл, время действия указано на рисунке. (*) - Различия статистически значимы (р <0,05). В - Уровень экспрессии TLR9 в МСК при длительном культивировании с образцами окисленной и неокисленной вкДНК не отличается от контроля (концентрация образцов 50 нг/мл, время инкубации указано на рисунке). Измерения уровня экспрессии гена TLR9 проводились через 3, 24 часа, 3 и 6 суток после однократного добавления образцов. Данные нормализованы по ТВР (контроль – на графиках горизонтальная зеленая линия 1 ± 0,2). Приведены средние значения для 5-ти доноров, каждый эксперимент повторен 3 раза. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,001). 263 Оценили изменение экспрессии гена TLR9 при использовании ингибирующего ОДН 2088 (TCCTGGCGGGGAAGT) из класса B (B - 'broadly reactive'), так как инг-ОДН этого класса блокируют TLR9-опосредованную активацию всех TLR9-экспрессирующих клеток многих видов млекопитающих, в том числе, человека [Krieg, 2012; Vollmer, 2006]. Ингибирование конкурентоспособно и обратимо [Krieg, 2012]. Инг-ОДН вносили в среду культивирования клеток за 30 минут до введения фрагментов вкДНК. Изменения экспрессии TLR9 проводили через 3 часа после инкубации на фоне ингибитора. Инг-ОДН, вызывают повышение экспрессии гена TLR9 в 1,5 раза (рисунок 3.2.90). Добавление п(рДНК) и п(рДНК) окси на фоне инг-ОДН увеличивало экспрессию TLR9 в 1,8 и в 1,3 раза, соответственно, относительно контроля (рисунок 3.2.90). Рисунок 3.2.90. Уровень экспрессии TLR9 в МСК через 3 часа после введения в среду культивирования неокисленных и окисленных фрагментов вкДНК в концентрации 50 нг/мл на фоне инг-ОДН 2088 и хлорокина. Данные приведены относительно контроля (необработанные МСК того же донора, то же время культивирования) и нормализованы по ТВР (контроль – на графиках горизонтальная зеленая линия 1 ± 0,2). Приведены средние значения для МСК 2-х доноров, каждый эксперимент повторен 3 раза. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Это, вероятно, обусловлено конкурентным воздействием инг-ОДН и п(рДНК) – новые лиганды требуют новых мест связывания, в результате активируется транскрипция TLR9. Вероятно, ингибирующий эффект инг-ОДН обусловлен отсутствием проведения сигнала по TLR9-сигнальному пути, а не ингибированием транскрипции TLR9; гДНК и гДНКокси на фоне инг-ОДН не влияли на экспрессию гена TLR9 (рисунок 3.2.90). 264 Хлорокин нарушает рН внутри эндосом, препятствуя связыванию лигандов, находящихся внутри эндосом, с рецепторами TLR9. Ни сам хлорокин, ни введение гДНК или гДНКокси на фоне хлорокина не вызывали активацию транскрипции гена TLR9. Совсем незначительно снижалась экспрессия гена TLR9 при добавлении п(рДНК) или п(рДНК)окси. Таким образом, при изменении рН эндосом вкДНК теряет способность активировать экспрессию гена TLR9. 3.2.16.6. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК реализуют свое активирующее действие на HUVEC с участием TLR9 Чтобы определить, участвуют ли рецепторы TLR9 в проведении сигнала от вкДНК в эндотелиальных клетках, в среду культивирования субконфлуентной культуры HUVEC добавляли следующие образцы ДНК: п(рДНК) (1 – 250 нг/мл); п(СатIII) (5-50 нг/мл); ДНК Е.coli (5-50 нг/мл); вкДНК больных острым инфарктом миокарда (ОИМ) (1-6 - для которых определено количество ГЦ-последовательностей) (5 нг/мл); гДНК (5 и 50 нг/мл); гДНКокси2 (50 нг/мл); п(рДНК)окси (50нг/мл). Клетки культивировали в течение 3 часов, уровень экспрессии гена TLR9 определяли методом ПЦР в реальном времени (рисунок 3.2.91). Рисунок 3.2.91. Уровень экспрессии TLR9 в HUVEC при действии неокисленных ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК в концентрации 5-50 нг/мл (концентрация указана на рисунке, 3 часа). Данные приведены относительно контроля – интактных клеток эндотелия того же донора и нормализованы по GAPDH (контроль – на графиках горизонтальная зеленая линия). Приведены средние значения для 2-х доноров, эксперимент повторен 3 раза. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Таким образом, ГЦ - обогащенные последовательности как эндогенной вкДНК, так и экзогенной вкДНК (ДНК E.сoli) в концентрации 50 нг/мл повышают уровень экспрессии 265 TLR9 в HUVEC через 3 часа после их добавления к среде культивирования. Окисление ГЦ-богатых последовательностей усиливает их стимулирующий эффект на экспрессию гена TLR9 в HUVEC (рисунок 3.2.91). Через 24 часа культивирования клеток эндотелия в присутствии фрагментов ГЦ – обогащенной вкДНК сохранялся повышенный уровень экспрессии TLR9 в HUVEC, а спустя 48 часов культивирования – снижался до контрольных значений (рисунок 3.2.92. А), сохраняясь на уровне значений контроля в процессе дальнейшего культивирования. Рисунок 3.2.92. А - Уровень экспрессии гена TLR9 в HUVEC при действии ГЦобогащенных и окисленных последовательностей вкДНК в течение 24 - 72 часов (концентрация 50 нг/мл). Измерения уровня экспрессии гена TLR9 после добавления образцов ДНК. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток эндотелия того же донора и нормализованы по GAPDH (контроль – на графиках горизонтальная зеленая линия). Приведены средние значения для 2-х доноров, эксперимент повторен 3 раза. (*) - Различия статистически значимы (р <0,001). Б Уровень экспрессии TLR9 в HUVEC через 3 часа после введения в среду культивирования неокисленных и окисленных фрагментов вкДНК в концентрации 50 нг/мл без ингибиторов и через 30 мин после добавления к HUVEC хлорокина. Данные приведены относительно контроля – интактных HUVEC того же донора ( то же время культивирования) и нормализованы по GAPDH. Приведены средние значения для 3-х экспериментов. (*) - Различия статистически значимы (р <0,05). Вероятно, снижение уровня экспрессии гена TLR9 носит компенсаторный характер в эндотелиальных клетках при хронических заболеваниях сердечно - сосудистой системы, при которых показано повышение уровня ГЦ - богатых последовательностей в составе вкДНК [Вейко и соавт., 2008]. Хлорокин блокировал увеличение экспрессии гена TLR9 при добавлении вкДНК больных ОИМ в среду культивирования HUVEC на фоне блокатора. При этом без блокатора вкДНК больных ОИМ индуцировала повышение экспрессии гена TLR9 в 2,5 раза (рисунок 3.2.92. Б). 266 3.2.16.6.1. Изменение уровня экспрессии белка TLR9 при действии на HUVEC вкДНК с измененными свойствам Мы исследовали, индуцирует ли повышение уровня экспрессии гена TLR9 при действии ГЦ - обогащенных фрагментов вкДНК усиление синтеза белка TLR9 в HUVEC. Использовали антитела к TLR9, конъюгированные с FITC или PE, визуализировали антитела с помощью метода флуоресцентной микроскопии. В контрольной популяции HUVEC были обнаружены единичные клетки с высоким уровнем TLR9, большинство клеток имело слабую окраску, часть эндотелиоцитов не содержала TLR9. Через 3 часа после добавления к среде культивирования HUVEC фрагментов ГЦ - обогащенной п(рДНК) количество сильно окрашенных клеток возрастало в 2,2 раза (р<0.001) (рисунок 3.2.93) [Kostyuk et al., 2012]. Рисунок 3.2.93. Определение рецепторов ТЛР9 в HUVEC с помощью антител к TLR9, меченных PE. А – контрольные клетки, Б – HUVEC после действия фрагмента п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл, 3 часа, флуоресцентная микроскопия (длина волны возбуждения 495 нм, увеличение Х48), В - средняя интенсивность флуоресценции в расчете на одну клетку (IPE). Приведены данные для 100 клеток и стандартное отклонение (*) - Различия статистически значимы (р <0,001). Методом проточной цитометрии количественно оценили изменение уровня TLR9 в HUVEC при инкубации клеток эндотелия в присутствии фрагментов окисленной и неокисленной вкДНК в фиксированных и окрашенных антителами клетках (рисунок 3.2.94). 267 Рисунок3.2.94. Анализ содержания рецептора TLR9 в HUVEC методом проточной цитометрии. В среду культивирования добавляли пробы, перечисленные на рисунок, клетки инкубировали 3 часа (А-Д) и 48 часов (Е,Ж). А – анализируемая популяция HUVEC (параметры, отражающие размер клеток и свойство поверхности). Б – координаты – размер клеток (ось Х) и интенсивность сигнала фикоэритрина (осьУ). В – распределение клеток по интенсивности сигнала, обозначены фракции клеток с различным содержанием белка. (Г или Е) – среднее значение интенсивности сигнала клеток фракции 2 (с низким содержанием TLR9). (Д или Ж) - частота фракции 3 (R, много белка). 268 Популяция HUVEC по уровню флуоресценции антител к TLR9 разделяется на клетки трех типов (рисунок 3.2.94 В): фракция 1 (клетки не экспрессируют бедок TLR9), фракция 2 – умеренная экспрессия TLR9 и фракция 3 с высоким уровнем экспрессии TLR9 (в контроле – 7 - 10% клеток). Образцы гДНК, гДНКокси и п(рДНК) через 3 часа стимулируют увеличение фракции 2 в 1,4 - 1,6 раз, что подтверждает активацию синтеза белка TLR9 в результате повышения экспрессии гена TLR9 (рисунок 3.2.94. Г, Д и рисунок 3.2.91). Фрагменты окисленной ГЦ- богатой п(рДНК)окси не стимулируют синтеза белка TLR9, несмотря на увеличение экспрессии гена TLR9 (рисунок 3.2.94. Г, Д и рисунок 3.2.91). Возможно, в данном случае происходит блокирование трансляции TLR9 и, как результат, накопление мРНК TLR9. Вероятно, в этом случае мы имеем дело с «готовностью» клеток эндотелия встретить CpG - богатую вкДНК экзогенного или эндогенного происхождения и быстро ответить активацией синтеза белка TLR9. Через 48 часов после однократного добавления фрагментов ДНК; п(рДНК), гДНК и гДНКокси к среде культивирования HUVEC в концентрации 50 нг/мл происходит снижение количества клеток фракции 2 - с относительно высоким уровнем экспрессии TLR9 (рисунок3.2.94. Е, Ж). Вектор pBR322 не ингибировал уровень белка TLR9. Мы также проанализировали изменение уровня белка TLR9 при длительном культивировании HUVEC. Образцы гДНК, гДНКокси и п(рДНК) через 2 суток после однократного их добавления в среду культивирования вызывают уменьшение количества клеток, экспрессирующих рецептор. Вектор pBR322 не оказывает ингибирующего действия на уровень белка TLR9. Таким образом, при действии ГЦ - обогащенных и окисленных ДНК в HUVEC увеличивается экспрессия TLR9 на уровне РНК и на уровне белка. 3.2.16.7. Изменение уровня экспрессии TLR9 в MCF7 при действии вкДНК с измененными свойствами Вопрос, через какие сенсоры проводит сигнал вкДНК в раковых клетках, важен для разработки подхода к терапии онкологических заболеваний. В литературе имеются разные точки зрения на этот вопрос. В некоторых статьях показано, что TLR9 экспрессируется на высоком уровне в клетках рака молочной железы [Qiu et al., 2009] и СpGолигонуклеотиды могут изменять уровень экспрессии TLR9 в MCF-7 [Qiu et al., 2009]. Согласно другим источникам уровень экспрессии гена и белка TLR9 в MCF-7 очень низкий или не детектируется [Shatz et al., 2012; Sandholm et al., 2012]. Мы также получили низкие значения для количества РНК TLR9 в MCF7 – уровень экспрессии гена TLR9 составлял только 20% уровня экспрессии гена ТВР и 1% экспрессии гена GAPDH [Kostyuk at al., 2013]. Чувствительность метода (ПЦР в реальном времени) позволяла 269 определить изменения экспрессии гена TLR9 в MCF7, хотя вклад генов с такой низкой экспрессией в развитие ответа клетки на стимуляцию вкДНК весьма мал. Однако, поскольку мы проводили поиск рецепторов, опосредующих действие вкДНК, вовлеченность TLR9 в ответ клеток разных типов, включая раковые клетки (даже при слабом ответе) была важна для понимания механизмов распознавания клетками фрагментов вкДНК. Мы проанализировали изменение уровня экспрессии гена TLR9 в MCF-7 при действии фрагментов окисленной и неокисленной ГЦ- богатой ДНК (рисунок 3.2.95). Рисунок 3.2.95. Уровень экспрессии гена TLR9 в MCF7 через 3 часа после добавления гДНК, ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК), вектора рBR322 и окисленных фрагментов (гДНКокси и п(рДНК)окси) в концентрации 50 нг/мл. Количество мРНК гена TLR9 нормализовано по гену ТВР. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток MCF7 (контроль – на графиках горизонтальная линия 1,0 ± 0,3 отн.ед.). Приведены средние значения для 3-х экспериментов. (*) - Различия статистически значимы (р <0,01). Уровень конститутивной экспрессии TLR9 в MCF-7 очень низкий по сравнению с другими типами клеток и требует подбора условий ПЦР для анализа изменений экспрессии. Неокисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК в концентрации 50 нг/мл вызывают незначительное, примерно в 1,5 раза повышение экспрессии гена TLR9 через 2 часа после добавления (рисунок 3.2.95). Затем уровень экспрессии гена TLR9 в MCF-7 снижается и через 48 часов приближается к уровню базовой экспрессии. Мы обнаружили, что гДНКокси стимулирует увеличение в 2,5 - 3 раза количества мРНК белка TLR9 уже через 30 минут после добавления, п(рДНК)окси изменяет концентрацию РНК TLR9 270 постепенно и с увеличением концентрации п(рДНК)окси уровень экспрессии TLR9 возрастает, увеличиваясь в 2-3 раза через 2 часа после добавления п(рДНК)окси (рисунок 3.2.95) [Kostyuk at al., 2013]. При использовании метода проточной цитометрии было показано, что белок TLR9 экспрессируется в MCF7 в контроле в малом числе клеток и в небольшом количестве. Уровень экспрессии белка зависит от плотности культуры ( рис 3.2.96. А) [Kostyuk at al., 2013]. Несмотря на увеличение количества мРНК TLR9 в присутствии окисленных фрагментов гДНКокси, количество самого белка остается неизменным в присутствии как гДНК, так и гДНКокси (рисунок 3.2.96) [Kostyuk at al., 2013]. Рисунок 3.2.96. Анализ содержания рецептора TLR9 в MCF7 методом проточной цитометрии. В среду культивирования добавляли пробы, перечисленные на рисунке, клетки инкубировали 2 часа и 24 часа. А – анализируемая популяция HUVEC (параметры, отражающие размер клеток и свойство поверхности); Б - среднее значение интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных антителами к TLR9 (PE). В Распределение интенсивности сигнала флуоресценции клеток, окрашенных антителами к TLR9(PE). Г – частота клеток MCF7, экспрессирующих TLR9. *p < 0.05 по отношению к контролю, непараметрический U-тест. 271 TLR9 в неконфлуентных клетках MCF-7 экспрессируется в низких количествах (рисунок 3.2.96.Б,Г) - примерно в 20% клеток, что совпадает с данными других авторов [Sandholm et al., 2012]. В конфлуентной контрольной культуре по сравнению с неконфлуентной количество клеток, экспрессирующих белок TLR9, возрастает до 40% (рисунок 3.2.96.Б, Г) [Kostyuk at al., 2013]. Увеличивается и количество белка, которое содержится в TLR9 – позитивной клетке (рисунок 3.2.96.Б). Окисленная ДНК стимулирует увеличение количества РНК TLR9 через 2 часа. При этом количество белка в клетке практически не увеличивается. Вероятно, в этом случае, так же, как и в клетках эндотелия, мы обнаружили стимуляцию экспрессии гена TLR9 в результате действия окисленных фрагментов вкДНК и блокирование синтеза белка TLR9, возможно, через другие, не-TLR9 – сигнальные пути. Этот диссонанс между уровнем экспрессии гена и белка TLR9 может объясняться активацией транскриптома клеток для быстрого ответа клеток на последующее повышение концентрации эндогенной вкДНК или на поступление в циркуляцию экзогенной – бактериальной вкДНК. Вероятно, активация транскриптома без реализации синтеза белка в клетках - это один из механизмов развития адаптивного ответа в клетках при действии вкДНК, позволяющих быстро и своевременно отвечать на последующее воздействие. Длительное культивирование MCF-7 с гДНК и с окисленной гДНК по сравнению с контролем приводит к снижению количества белка и мРНК TLR9 в клетках TLR9позитивной фракции MCF-7 (рисунок 3.2.96.Б). Такой же ответ мы наблюдали при исследовании длительного действия гДНК и гДНКокси на культивируемые фибробласты человека [Kostyuk et al., 2013]. 3.2.16.8. ГДНК и гДНКокси снижают уровень сенсора ДНК TLR9 в культивируемых фибробластах при длительном культивировании Для исследования влияния вкДНК с окислительной модификацией на экспрессию внутриклеточных ДНК-сенсоров TLR9 при длительном культивировании в условиях хронического окислительного стресса (в бессывороточной среде) дополнительно к собственной вкДНК фибробластов в среду культивирования однократно, в начале культивирования, вводили гДНК или ДНКокси1/ДНКокси2 в различной концентрации. Анализ уровня экспрессии TLR9 на уровне белка и на уровне гена в клетках проводили спустя 72 часа после культивирования в присутствии фрагментов ДНК. Исследовали действие гДНК и ДНКокси в концентрации 20 и 100 нг/мл на фибробласты кожи человека (HDF) и действие гДНК и ДНКокси в концентрации 5 - 50 нг/мл на эмбриональные фибробласты легкого (НEF). Все ДНК содержали фрагменты 272 примерно одинакового размера от ~ 0,5 до ~ 10 kb. В качестве контроля использовали интактные HDF and HEF, которые культивировали в отсутствие сыворотки. На рисунок 3.2.97 приведены результаты анализа TLR9 c применением антител, коньюгированных с фикоэритрином. Рисунок 3.2.97. Влияние гДНК и гДНКокси на количество белка TLR9 в HDF (A-В) и HEF (Г). A - – анализируемая популяция контрольных HDF (параметры, отражающие размер клеток и свойство поверхности). Б - Распределение интенсивности сигнала флуоресценции клеток HDF, окрашенных антителами к TLR9 (PE) при действии фрагментов вкДНК с разными свойствами. В, Г - средние значения интенсивности флуоресценции клеток HDF и HEF, окрашенных антителами к TLR9. Образцы вкДНК и концентрации обозначены на рисунке. (*) достоверное отличие от контроля (p < 0.05). Рисунок 3.2.97. Б отражает распределение интенсивности сигнала для HDF в присутствии гДНК и гДНКокси. В контрольных клетках есть две субпопуляции клеток с разным уровнем экспрессии TLR9. Примерно 40% клеток экспрессируют ТЛР9 в относительно больших количествах. В отсутствие сыворотки средняя интенсивность 273 флуоресценции клеток, окрашенных антителами к TLR9 (рисунок 3.2.97 В, Г), в 2 раза выше, чем в клетках, которые культивировали в присутствие сыворотки. Геномная ДНК и гДНКокси значительно уменьшают уровень TLR9 в HDF, причем эффект от гДНК более выражен (рисунок 3.2.97) [Kostyuk at al., 2013]. Таким образом, длительное культивирование фибробластов в присутствии экзогенной гДНК и гДНКокси в условиях хронического стресса в течение 72 часов сопровождается значительным уменьшением уровня TLR9 по сравнению с контрольными клетками [Kostyuk at al., 2013]. Мы проанализировали, изменяется ли уровень РНК TLR9 при длительном культивировании фибробластов с фрагментами вкДНК. Оказалось, что уровень экспрессии гена TLR9 в HDF также снижается в присутствии как неокисленной ДНК, так и окисленной ДНК в низкой концентрации – 20 нг/мл (рисунок 3.2.98). Высокая концентрация ДНКокси не вызывала изменений уровня экспрессии гена TLR9 (рисунок 3.2.98). Рисунок 3.2.98. Уровень экспрессии гена TLR9 в HDF через 72 часа после добавления гДНК и гДНКокси 20 и 100 нг/мл. Количество мРНК гена TLR9 нормализовано по гену ТВР. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток HDF, культивируемых в отсутствие сыворотки. Приведены средние значения для 2-х экспериментов. (*) - достоверное отличие от контроля (p < 0.05). Таким образом, TLR9 – рецепторы быстрого реагирования на изменение свойств вкДНК в среде. Спустя 3 часа наблюдается повышенная экспрессия рецепторов как на уровне гена, так и на уровне белка в ответ на присутствие в среде неметилированных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК в клетках разного типа. Однако спустя 48 часов уровень экспрессии TLR9 снижается часто даже ниже контрольного уровня. При повышенном уровне экспрессии гена TLR9 добавление ГЦ-богатых фрагментов вкДНК спустя 3 часа снижает уровень экспрессии рецепторов. Возможно, клетки пытаются на уровне мРНК рецептора (возможно, усиливая процесс деградации мРНК) предотвратить проведение дополнительного стимула от поступающих de novo 274 фрагментов при уже активированном TLR9 – сигнальном пути. Таким образом, через TLR9 вкДНК может выполнять регулирующую функцию, блокируя ответ TLR9сигнального пути при его длительной активации. 3.2.17. Участие рецепторов АIМ2 в проведении сигнала от вкДНК в клетках человека ВкДНК, попадая в клетку в виде ДНК-содержащих иммунных комплексов, может взаимодействовать с цитозольным рецептором AIM2. Лигандом рецептора AIM2 служит дцДНК независимо от ее размера и источника [Hornung et al., 2009]. Связывание дцДНК с AIM2 приводит к активации NF-kB, образованию инфламмосомы, активации каспазы 1 и индукции пироптоза - запрограммированной гибели клеток, связанной с потерей целостности мембраны [Vladimer et al., 2013; Hornung et al., 2009] 3.2.17.1. Влияние фрагментов вкДНК на уровень экспрессии гена рецептора AIM2 в МСК Исследовали экспрессию гена рецептора AIM2 при культивировании МСК в присутствие образцов вкДНК здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда и раком молочной железы, а также при добавлении в среду культивирования окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК. В МСК обнаруживают высокий уровень базовой экспрессии AIM2 [Chen et al., 2012]. Через 1 час после добавления к МСК вкДНК здоровых доноров и вкДНК, выделенной из среды культивирования HUVEC, уровень экспрессии AIM2 возрастал незначительно – в 1,5 раза, а через 24 часа снижался до контрольного уровня (рисунок 3.2.99). Действие вкДНК больных ОИМ и РМЖ, вкДНК среды культивирования РСК и окисленной вкДНКокси среды культивирования HUVEC стимулировало повышение экспрессии гена AIM2 в МСК в 2 - 3,5 раза (рисунок 3.2.99). Поскольку, и во вкДНК больных ОИМ и РМЖ, и во вкДНК среды культивирования РСК много окислительных модификаций, а уровень их воздействия на транскрипцию гена AIM2 сопоставим с действием окисленной вкДНКокси (HUVEC)1/2, предположили, что в большей степени стимулирует повышение экспрессии AIM2 в МСК именно окисленная вкДНК. Исследовали действие неокисленных ГЦ-богатых и окисленных модельных фрагментов на уровень экспрессии гена цитозольного рецептора AIM2 в МСК. Действительно, окисленные образцы модельных фрагментов ДНК вызывали повышение уровня экспрессии гена AIM2. Окисленный образец п(рДНК)окси увеличивал экспрессию AIM2 почти в 3 раза через 2 часа после добавления в среду культивирования МСК, неокисленный повышал уровень экспрессии AIM2 МСК максимум в 1,4 раза через 20 минут после добавления. Геномная ДНК стимулировала уровень экспрессии AIM2 только 275 в 1,3 раза, а гДНКокси – в 2,8 раза через 2 часа инкубирования МСК с образцами ДНК (рисунок 3.2.100). Рисунок 3.2.100. Уровень экспрессии гена AIM2 при культивировании МСК в присутствии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК (50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке) методом ПЦР в реальном времени. Количество мРНК гена AIM2 нормализовано по гену ТВР. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток MCК (контроль – на графиках горизонтальная линия 1,0 ± 0,3 отн.ед.). Приводятся средние значения и SD для трех независимых экспериментов на трех разных культурах. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Уровень экспрессии гена рецептора AIM2 может изменяться не только при непосредственном контакте с фрагментами вкДНК, но и опосредованно – через адаптерные молекулы и пересечение сигнальных путей. Уровень экспрессии гена AIM2 не чувствителен к нуклеотидному составу вкДНК – и ГЦ-богатые, и АТ-богатые неокисленные фрагменты вкДНК одинаково незначительно индуцируют транскрипцию гена AIM2 (рисунок 3.2.100). Радиация (в дозе 50 сГр), обладая способностью индуцировать окислительный стресс, также повышает уровень экспрессии гена AIM2 в 2,2 раза через 3 часа после экспозиции (рисунок 3.2.100). К 48 часам после добавления любых фрагментов вкДНК уровень экспрессии гена AIM2 снижался, возвращаясь до контрольных значений. Таким образом, любая вкДНК обладает индуцирующим действием на транскрипцию гена AIM2, однако, окисленная вкДНК сильнее стимулирует повышение 276 экспрессии гена рецептора AIM2, чем неокисленные аналоги вкДНК. Видимо, более сильное влияние вкДНКокси связано с более быстрым проникновением окисленных фрагментов внутрь клетки, в результате чего они становятся либо более доступными для цитозольного рецептора AIM2, либо быстрее связываются с другими рецепторами и могут опосредованно влиять на экспрессию гена AIM2. Рисунок 3.2.101. Уровень экспрессии гена AIM2 при культивировании МСК в присутствии окисленных и неокисленных модельных фрагментов ДНК (50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке) и после воздействия радиации в дозе 50 сГр, метод ПЦР-РВ. Количество мРНК гена AIM2 нормализовано по гену ТВР. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток MCК (контроль – на графиках горизонтальная линия 1,0 ± 0,3 отн.ед.). Приводятся средние значения и SD для трех независимых экспериментов на трех разных культурах. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). 3.2.17.2. ВкДНК повышает уровень экспрессии гена рецептора AIM2 в HUVEC Значимые изменения экспрессии гена AIM2 при инкубировании HUVEC с образцами неокисленной вкДНК наблюдаются не ранее, чем через 3 часа инкубации (рисунок3.2.101). Образцы окисленной вкДНК стимулируют повышение уровня экспрессии AIM2 уже через 1 час после добавления. Экспрессия AIM2 под действием всех образцов ДНК увеличивается в 2-3 раза в первые 24 часа после добавления образцов ДНК. К 48 часам экспрессия гена AIM2 снижается практически до контрольных значений (рисунок 3.2.101). Возможно, стимуляция транскрипции гена AIM2 в присутствии вкДНК 277 связана с необходимостью активировать NF-kB - сигнальный путь, направленный на выживание клетки. Рисунок 3.2.101. Уровень экспрессии гена AIM2 при культивировании HUVEC в присутствии окисленных и неокисленных модельных фрагментов ДНК (50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке). Количество мРНК гена AIM2 нормализовано по гену ТВР. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток (контроль – на графиках горизонтальная линия 1,0 ± 0,3 отн.ед.). Приводятся средние значения и SD для трех независимых экспериментов на трех разных культурах. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Поскольку фрагменты вкДНК стимулируют транскрипционную активность гена AIM2, проанализировали изменение экспрессии белка AIM2 при действии вкДНК (рисунок 3.2.102). Согласно данным проточной цитометрии 25 % клеток популяции HUVEC не экспрессируют белок AIM2 (RN1 - область на гистограмме). Приблизительно в 1% клеток содержится значительное количество рецептора AIM2 (RN3 - область). Остальная часть популяции HUVEC экспрессирует AIM2 в детектируемых количествах (RN2 - область). Через 48 часов инкубации клеток эндотелия в присутствии любых фрагментов вкДНК (в концентрации 5 и 50 нг/мл) увеличивается уровень экспрессии белка AIM2 в большинстве клеток (рисунок 3.2.102), одновременно небольшая часть HUVEC перестает экспрессировать рецептор AIM2. Вектор pBR322 супрессирует экспрессию белка AIM2 в HUVEC: уменьшается размер фракции клеток с сильной 278 флуоресценцией, увеличивается количество нефлуоресцирующих клеток, снижается средний уровень сигнала в клетках эндотелия (рисунок 3.2.102). Рисунок 3.2.102. Изменение количества белка рецептора AIM2 в HUVEC при воздействии образцов вкДНК (48 часов, концентрация 5 или 50 нг/мл). Метод проточной цитометрии. А – распределение клеток по интенсивности в HUVEC, выделены области с разным уровнем флуоресценции; Б – частота неэкспрессирующих AIM2 клеток; В – средние значения сигнала фракции HUVEC, экспрессирущей AIM2 в детектируемых количествах (RN2 - область); Г – частота клеток эндотелия с высоким уровнем экспрессии белка AIM2. (*) - Различия с контролем статистически значимы (р <0,05). Исследовали влияние образцов окисленной и неокисленной ДНК на уровень экспрессии белка AIM2 в растущей популяции HUVEC. Образцы ДНК добавляли через 2 часа после прикрепления клеток к пластику, HUVEC культивировали в присутствии вкДНК в период активного роста. Уровень белка AIM2 анализировали с использованием антител к AIM2 через 3 суток после добавления фрагментов. Анализировали клетки, конститутивно экспрессирующие рецептор AIM2 – фракция R (рисунок 3.2.103). Средние значения уровня флуоресценции при добавлении образцов гДНК, гДНКокси и п(рДНК) оставались повышенными (рисунок 3.2.102). Вектор не влиял на экспрессию белка AIM2. Возможно, в растущей популяции HUVEC увеличение экспрессии рецепторов AIM2 направлено на выживание клеток в окислительного стресса, вызываемого вкДНК, и сохраняется длительное время. условиях 279 Рисунок 3.2.103. Уровень экспрессии белка AIM2 в растущей популяции HUVEC через 3 суток после добавления в среду культивирования образцов ДНК в концентрации 5 или 50 нг/мл. Анализ проводился методом проточной цитометри. А – распределение клеток по интенсивности сигнала, анализируемая область обозначена R; Б – частота клеток, экспрессирующих AIM2. (*) - Различия с контролем статистически значимы (р <0,05). Поскольку образцы вкДНК вызывают увеличение экспрессии ДНК-сенсора AIM2 и на уровне мРНК и на уровне самого белка, исследовали, связывает ли рецептор AIM2 молекулы вкДНК, или экспрессия AIM2 в HUVEC повышается опосредованно. Для этого мы использовали два зонда – гДНКRed и гДНКоксиRed. На рисунок 3.2.104 показано совместное определение локализации ДНК-зонда и рецептора AIM2 в HUVEC. Рисунок 3.2.104. Колокализация внутриклеточных рецепторов AIM2 и меченых окисленных и неокисленных ДНК - зондов в HUVEC. Клетки эндотелия инкубировали в присутствии окисленных и неокисленнх образцов ДНК (в концентрации 50 нг/мл, время воздействия - 3 часа). Клетки, фиксированные с помощью формальдегида, обрабатывали тритоном Х-100 (0,1 %) и антителами к рецепторам AIM2, конъюгированными с флуоресцеином, ядра окрашены DAPI. 280 Для неокисленой гДНКRed связывание с рецептором AIM2 не выявлено (нет колокализации зеленого и красного цвета). Окисленная ДНК (гДНКоксиRed) способна проникать в клетку и частично колокализуется с рецептором AIM2: детектируется смешанное (желтое) окрашивание в HUVEC (рисунок 3.2.104). Таким образом, окисленные фрагменты вкДНК являются потенциальными стимуляторами рецепторов AIM2. Неокисленная ДНК, окисляясь с поверхности клеток, может затем проникать в клетки и также выступать в качестве потенциального лиганда рецептора AIM2. 3.2.17.3. Изменение экспрессии рецептора AIM2 на уровне гена и на уровне белка при действии фрагментов вкДНК на культуру раковых клеток MCF-7 Уровень экспрессии гена AIM2 в неконфлуентных клетках MCF-7 низкий. Об этом говорит низкое количество РНК AIM2 (составляющее только 0,6% количества РНК гена GAPDH) и низкое количество белка (рисунок 3.2.106.А) в клетках. При такой разнице в экспрессии контрольного гена и гена внутреннего стандарта вероятность получить адекватный результат мала, поэтому для нормировки результатов ПЦР РВ, мы выбрали ген ТВР в качестве гена внутреннего контроля (уровень экспрессии AIM2 составлял 15% уровня экспрессии ТВР) (рисунок 3.2.105) [Kostyuk et al., 2013]. Рисунок 3.2.105. Уровень экспрессии гена AIM2 при культивировании МСF7 в присутствии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК (50 и 250 нг/мл, время воздействия указано на рисунке). Количественное измерение кДНК AIM2 проводилось методом ПЦР в реальном времени. Количество мРНК гена AIM2 нормализовано по гену ТВР. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток (контроль – на графиках горизонтальная линия 1,0 ± 0,3 отн.ед.). Приводятся средние значения и SD для трех независимых экспериментов. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,005). 281 Кроме того, согласно данным литературы, в клетках МСF7 уровень экспрессии гена TBP стабилен [Chey et al., 2010; Chua et al., 2011]. Мы исследовали влияние образцов вкДНК на динамику изменения уровня экспрессии гена AIM2 во времени в МСF7 (рисунок 3.2.105). Неокисленные образцы вкДНК незначительно влияли на транскрипцию гена AIM2 в МСF7: при действии ГЦ-богатой ДНК (п(рДНК)) уровень его экспрессия повышался примерно в 1,5 раза, снижаясь к 48 часам до уровня контроля; гДНК и вектор рBR322 не оказывали влияния на уровень экспрессии гена AIM2. В то же время окисленные образцы: гДНКокси и п(рДНК)окси повышали количество мРНК AIM2 в 2 - 3,5 раза (рисунок 3.2.105) [Kostyuk et al., 2013]. С помощью антител к AIM2, оценили уровень экспрессии белка AIM2 при действии окисленных фрагментов вкДНК (рисунок 3.2.106). Этот рецептор экспрессируется примерно в 50 % клеток в конфлуентной культуре МСF7 (по сравнению с 25% клеток растущей популяции МСF7) [Kostyuk et al., 2013]. Количество белка AIM2 в клетках напрямую зависит от количества клеток в культуре, а, следовательно, и от количества собственной вкДНК (рисунок 3.2.106.Б - Д). Окисленная ДНК в первые часы после добавления в среду культивирования MCF-7 стимулирует увеличение экспрессии белка AIM2 (рисунок 3.2.106.Б - Д), что совпадает с результатами, полученными для уровня экспрессии гена AIM2 [Kostyuk et al., 2013]. Через 48 часов культивирования клеток в присутствии неокисленной гДНК и окисленной гДНКокси наблюдается снижение по сравнению с контролем количества белка в AIM2позитивной фракции клеток (рисунок 3.2.107.Б, В, Д) [Kostyuk et al., 2013]. Можно предположить, что воздействие вкДНК с течением времени активирует в клетках процесс, препятствующий увеличению количества белка AIM2, которое мы наблюдаем в контрольных клетках по мере увеличения их конфлуентности. Для рецептора AIM2 известны ситуации диспропорции в уровне белка и РНК в фибробластах, однако, механизм этого явления до сих пор не понятен [Duan et al., 2011]. 282 Рисунок 3.2.106 гДНК окси (50 нг/мл) транзиторно увеличивает экспрессию цитоплазматического ДНК-сенсора AIM2. Клетки окрашены антителами к AIM2. A – сравнение интенсивности сигнала AIM2 (PE) контрольных клеток, клеток, обработанных в течение 2 часов гДНК и гДНКокси. Б – - Распределение интенсивности сигнала флуоресценции клеток, окрашенных антителами к AIM2(PE). В - частота клеток MCF7, экспрессирующих AIM2. Г – анализируемая популяция МСF7 в контроле (параметры, отражающие размер клеток и свойство поверхности), через 2 часа и 48 часов после начала культивирования. Д - среднее значение интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных антителами к AIM2(PE). (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,005). Мы исследовали, связано ли увеличение экспрессии рецептора AIM2 с его непосредственным взаимодействием с молекулами окисленной гДНКокси. Провели совместное определение в MCF7 рецепторов AIM2 с помощью антител, конъюгированных 283 с FITC и меченого зонда гДНКокси(Red). (рисунок 3.2.107). Значительная часть сигналов, но не все, перекрываются, что может указывать на взаимодействие гДНКокси с рецепторами AIM2 (рисунок 3.2.107) [Kostyuk et al., 2013]. Таким образом, окисленная вкДНК связывается с рецепторами AIM2 в клетках МСF7, что сопровождается усилением экспрессии гена и белка рецептора AIM2 [Kostyuk et al., 2013]. Активация AIM2 приводит к формированию инфламмосомы, активации NF-kB - сигнальныного пути, но может приводить и к гибели клетки путем пироптоза. Через 2 суток воздействия экспрессия белка снижается по сравнению с контролем. Рисунок 3.2.107. Локализация AIM2 (FITC) и зонда гДНКокси(Red) в клетках MCF7. Клетки инкубировали в присутствии окисленных образцов ДНК (в концентрации 50 нг/мл, время воздействия - 3 часа). Клетки, фиксировали с помощью формальдегида, обрабатывали тритоном Х-100 (0,1 %) и антителами к рецепторам AIM2, конъюгированными с флуоресцеином, ядра окрашены DAPI. Вероятно, длительная активация окисленной ДНК AIM2 – сигнального пути приводит к запуску механизмов, ингибирующих длительную экспрессию рецепторов AIM2. Такая тонкая регуляция экспрессии рецепторов AIM2 при действии ДНКокси, видимо, направлена на выживание клеток в условиях окислительного стресса, создаваемого вкДНК. 3.2.17.4. Геномая ДНК и гДНКокси снижают уровень сенсора ДНК AIM2 в культивируемых фибробластах при длительном культивировании Исследовали влияние окисленной вкДНК на экспрессию AIM2 в клетках в условиях хронического окислительного стресса. Культивирование фибробластов кожи (HDF) в среде без сыворотки приводит к хроническому стрессу. Однократно в бессывороточную среду культивирования фибробластов добавляли гДНК или ДНКокси1/ ДНКокси2 в различной концентрации (20 и 100 нг/мл), через 72 часа измеряли уровень экспрессии гена AIM2 (рисунок 3.2.108). 284 Рисунок 3.2.108. Уровень экспрессии AIM2 в HDF через 72 часа после добавления гДНК и гДНКокси 20 и 100 нг/мл. Количество мРНК гена AIM2 нормализовано по гену ТВР. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток HDF, культивируемых в отсутствие сыворотки. Приведены средние значения для 2-х экспериментов. Количество мРНК AIM2 уменьшается при введении в среду культивирования фибробластов дополнительно фрагментов окисленной ДНК независимо от концентрации, повышение концентрации вкДНК за счет введения гДНК в концентрации 100 нг/мл также снижает уровень экспрессии гена AIM2 (рисунок 3.2.108) [Kostyuk et al., 2013]. Таким образом, рецептор AIM2 является внутриклеточным рецептором, опосредующим действие вкДНК на клетки разных типов. Уровень экспрессии рецептора AIM2 в разных типах клеток, вероятно, обуславливает вклад этого рецептора в ответ клеток на действие фрагментов вкДНК. Рецептор AIM2 связывает попадающую в цитоплазму ДНК независимо от ее нуклеотидной последовательности. Мы показали, что наиболее сильно рецептор AIM2 активируют окисленные формы вкДНК. Вероятно, это связано с более легким проникновением окисленной ДНК в клетки разных типов, что делает взаимодействие вкДНКокси и рецептора AIM2 более вероятным. Кроме того, было показано, что существуют пути регуляции активации AIM2 по принципу обратной связи – со временем снижается его экспрессия и на уровне гена, и на уровне белка. Этот механизм также, видимо, направлен на сохранение клеток в условиях длительного окислительного стресса. 3.2.18. Роль рецептора RIG1 в проведении сигнала от вкДНК Ожидается, что существуют дополнительные, пока еще не определенные, рецепторы, опознающие и связывающие вкДНК, которые функционируют в цитоплазме или в ядре. Предполагалось, что возможно пересечение TLR9 – сигнального пути и RIG1зависимого сигнального пути, поскольку при активации TLR9 активируются адаптерные молекулы RIGI – сигнального пути [Selvarajoo 2011]. Поскольку лигандом RIGI является 285 двуцепочечная РНК, непосредственная активация рецепторов RIG-1 фрагментами вкДНК не рассматривалась в качестве возможной, однако в последнее время был обнаружен механизм активации RIG-I АТ-богатой ДНК с участием РНК-полимеразы III, конвертирующей АТ- богатую двухцепочечную ДНК в цитоплазме (или, потенциально, в ядре) в 5 ʽ- дцРНК, узнаваемую рецептором RIGI (retinoic acid‑inducible gene I) [Ablasser et al., 2009]. Мы рассмотрели, участвуют ли рецепторы RIGI в проведении сигнала, инициируемого вкДНК. 3.2.18.1. Влияние фрагментов вкДНК на уровень экспрессии гена RIG1 в МСК Исследовали влияние на экспрессию гена RIG1 образцов вкДНК здоровых доноров и больных ОИМ. Кроме того анализировали действие вкДНК, выделенной из среды культивирования HUVEC (вкДНК(HUVEC)); HUVEC, обработанных пероксидом водорода вкДНК((HUVEC)окси1/2); первичных клеток опухоли РМЖ - маммосфер (вкДНК(РСК)) и из среды клеток опухоли, облученных ионизирующим излучением в дозе 10сГр. Все образцы вызывали повышение экспрессии гена RIG1 через 1 час после начала воздействия, неокисленные – в 1,5 – 1,8 раза, окисленные – в 2 - 2,5 раза (рисунок 3.2.109). Рисунок 3.2.109. Уровень экспрессии гена RIG1 при культивировании МСК в присутствии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК (50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке). Количественное измерение кДНК RIG1 проводилось методом ПЦР в реальном времени. Количество мРНК гена AIM2 нормализовано по гену ТВР (контроль – на графиках горизонтальная линия 1,0 ± 0,3 отн.ед.). Приводятся средние значения и SD для трех независимых экспериментов на трех разных культурах. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). 286 Через 24 часа после добавления фрагментов неокисленной вкДНК уровень экспрессии RIG1 остается повышенным, действие окисленных фрагментов – краткосрочное, к 24 часам уровень РНК RIG1 снижается до уровня контрольных значений (рисунок 3.2.109). Исследовали действие неокисленной и окисленной ГЦ-богатой п(рДНК), п(СатIII), гДНК и гДНКокси, выделенной из РСК РНК и вкРНК из среды культвирования РСК (рисунок 3.2.109) на транскрипцию гена RIG1. Все образцы РНК незначительно (в 1,5 – 1,8 раза) в первые сутки после воздействия повышают уровень экспрессии гена RIG1. Выделяемая из клеток и из среды РНК не является лигандом рецептора RIG1, однако, может незначительно стимулировать экспрессию гена RIG1 из-за наличия в клетках взаимопересекающегося воздействия сигнальных путей (рисунок 3.2.109). Двуцепочечная гДНКокси повышает уровень экспрессии гена RIG1 в течение 1-3 часов примерно в 2,5 раза, к 24 часам уровень мРНК RIG1 падает до уровня контроля (рисунок 3.2.109). Геномная ДНК стимулирует повышение уровня экспрессии гена RIG1 постепенно – к 24 часам после начала воздействия уровень экспрессии гена RIG1 повышается в 2,2 раза и снижается к 48 часам (рисунок 3.2.109). Таким образом, любая вкДНК повышает уровень экспрессии гена RIG1 в МСК в 1,5 – 2,5 раза. Окисленные фрагменты быстрее и легче проникают внутрь клетки и включают механизмы, стимулирующие транскрипцию гена RIG1. Уровень экспрессии гена RIG1 в ответ на присутствие ДНКокси повышается быстрее и включает механизмы, регулирующие транскрипцию гена RIG1 по принципу обратной связи, в результате действие вкДНКокси краткосрочное. ГЦ- ДНК незначительно стимулирует экспрессию гена RIG1, вероятно, через пересечение TLR9-сигнального пути и RIG1-пути. В таком случае блокирование рецептора TLR9 с помощью ингибиторного ОДН и проведения путей передачи сигнала через мембранные эндосомные рецепторы (такие как TLR) с помощью хлорокина, не будет влиять на активацию экспрессии гена RIG1 в присутствии ДНК.Действительно, наше предположение о том, что п(рДНК) и п(рДНК)окси стимулируют экспрессию гена RIG1 через пересечение с TLR-сигнальным путем, подтверждается, поскольку при использовании инг-ОДН, блокирующих TLR9, и хлорокина, изменяющего рН в эндосомах, п(рДНК) и п(рДНК)окси не стимулируют повышения экспрессии гена RIG1 (рисунок 3.2.110). 287 Рисунок 2.2.110. Уровень экспрессии RIG1 в МСК через 3 часа после введения в среду культивирования неокисленных и окисленных фрагментов вкДНК в концентрации 50 нг/мл без ингибиторов, через 30 мин после добавления к МСК ингОДН и хлорокина. Данные приведены относительно контроля (необработанные МСК того же донора) и нормализованы по ТВР (контроль – на графиках горизонтальная линия 1,0 ± 0,3 отн.ед.). Приведены средние значения для МСК 2-х доноров, каждый эксперимент повторен 3 раза. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). При этом сохраняется, хоть и в меньшей степени, активирующее воздействие гДНК и гДНКокси, что свидетельствует о TLR9 - независимой активации транскрипции гена RIG1 фрагментами ДНК (рисунок 3.2.110). Хотя, возможно, повышение экспрессии гена RIG1 при действии гДНК и гДНКокси складывается из TLR- независимой стимуляции транскрипции гена RIG1 и TLR- опосредованно через пересечение RIG1- и TLRсигнальных путей. 3.2.18.2. Влияние фрагментов вкДНК на экспрессию рецепторов RIG1 в HUVEC Действие фрагментов вкДНК на экспрессию гена RIG1 исследовали на культуре HUVEC. Увеличение количества РНК RIG1 в 1,5 – 2,3 раза в эндотелиальных клетках обнаруживалось только при действии гДНК. При этом гДНКокси стимулировала повышение экспрессии гена RIG1 в 2,3 раза уже через 1 час, через 24 часа уровень экспрессии гена RIG1 в ответ на добавление гДНКокси снижался до уровня контрольных значений; гДНК повышала уровень экспрессии гена RIG1 постепенно, количество РНК гена RIG1 увеличивалось вдвое через 24 часа, через 2 суток уровень экспрессии гена RIG1 снижался до уровня контроля (рисунок 3.2.111). 288 Рисунок 3.2.111. Уровень экспрессии гена RIG1 при культивировании HUVEC в присутствии окисленных и неокисленных модельных фрагментов ДНК (50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке). Данные приведены относительно (интактные эндотелиоциты того же донора) и нормализованы по ТВР (контроль – на графиках горизонтальная линия 1,0 ± 0,4 отн.ед.). Количественное измерение кДНК RIG1 проводилось методом ПЦР в реальном времени. Приводятся средние значения и SD для трех независимых экспериментов на трех разных культурах. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Вероятно, окисленная ДНК быстро попадает в клетку и через, неизвестные пока, механизмы стимулирует экспрессию гена RIG1. Неокисленная ДНК связывается с поверхностью клетки, окисляется мембранными ферментами NOX4 и, окисленная, проникает в клетку. Поэтому активация экспрессии гена RIG1 происходит медленнее. Механизм стимуляции транскрипции гена RIG1 окисленной и неокисленной гДНК не известен, предполагается участие РНК-полимеразы III в этом процессе [Ablasser et al., 2009]. 3.2.18.3. Влияние вкДНК на экспрессию рецепторов RIG1 в MCF7 и HDF При исследовании влияния фрагментов вкДНК на культуру раковых клеток MCF7 мы обнаружили, что гДНКокси, так же, как и в случае HUVEC и МСК, сильнее стимулирует экспрессию гена RIG1 по сравнению с неокисленными фрагментами ( рисунок 3.2.112.А), что, как мы считаем, связано со способностью окисленной ДНК быстро проникать в разные типы клеток [Kostyuk et al., 2013]. Однако уровень конститутивной экспрессии гена RIG1 в MCF7 слишком мал (составляет лишь 2% уровня экспрессии ТВР), поэтому говорить о существенном вкладе RIG1-сигнального пути в реализацию ответов MCF7 на присутствие вкДНК не приходится. 289 Рисунок 3.2.112. А - Уровень экспрессии гена RIG1 при культивировании МСF7 в присутствии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК (50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке), метод ПЦР в реальном времени. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток и нормализованы по ТВР (контроль – на графиках горизонтальная линия 1,0 ± 0,4 отн.ед.). Б - Уровень экспрессии RIG1 в HDF через 72 часа после добавления гДНК и гДНКокси 20 и 100 нг/мл. Количество мРНК гена RIG1 нормализовано по гену ТВР. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток HDF, культивируемых в отсутствие сыворотки. Приведены средние значения для 2-х экспериментов. Приводятся средние значения и SD для трех независимых экспериментов. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). При культивировании фибробластов кожи человека в условиях окислительного стресса в присутствии гДНК и гДНКокси, экспрессия RIG1 снижается через 72 часа после начала культивирования (рисунок 3.2.112.А). Это согласуется с полученными нами, данными для разных типов клеток, поскольку экспрессия гена RIG1 на всех исследованных типах клеток повышалась транзиторно. Таким образом, RIG1 участвует в проведении сигнала от вкДНК, запуская сигнальные пути в клетках. Окисленная вкДНК быстрее активирует транскрипцию гена RIG1, поскольку окисленные фрагменты обладают способностью быстро проникать в клетки, но ее действие краткосрочное. 3.2.19. Роль STING в проведении сигнала от вкДНК Мы показали, что вкДНК может активировать ДНК – рецепторы RIG1, инициирующие синтез IFN. RIGI (и неизвестный цитоплазматический рецептор, 290 Рисунок 3.2.113. Уровень экспрессии гена STING при культивировании МСК (А), HUVEC (Б), МСF7 (Г), в присутствии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК (50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке), метод ПЦР в реальном времени. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток того же донора и нормализованы по ТВР (горизонтальная линия 1,0 ± 0,3 отн.ед.). Приведены средние значения для МСК 3-х доноров, HUVEC 2-х доноров, каждый эксперимент повторен 3 раза. В - Уровень экспрессии STING в HDF через 72 часа после добавления гДНК и гДНКокси 20 и 100 нг/мл. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток HDF, культивируемых в отсутствие сыворотки. Приведены средние значения для 2-х экспериментов). (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). 291 возможно, DAI) может быть активатором адаптерного белка STING (stimulator of IFN genes), расположенного трансмембранно в ЭПР [Ishikawa et al., 2009; Sun et al., 2009; Zhang et al., 2011]. STING через C- концевой домен, распространяющийся в цитоплазму, связывает TBK1 (TANK-binding kinase1) и IRF3, таким образом, способствуя фосфорилированию IRF3 по TBK1 [Tanaka and Chen 2012], что приводит к синтезу интерферона типа I [Hornung et al., 2009]. Мы исследовали активацию транскрипции гена STING при действии вкДНК на разные типы клеток (рисунок 3.2.113). При добавлении неокисленных фрагментов вкДНК в среду культивирования МСК происходит незначительное (в 1,5 раза) увеличение экспрессии гена STING в МСК через 3 часа после начала воздействия (рисунок 3.2.113.А). Окисленные фрагменты оказывали меньшее влияние на повышение экспрессии гена STING по сравнению с неокисленными (изменение экспрессии недостоверно). Аналогичная ситуация обнаружена при введении фрагментов окисленной и неокисленной ДНК в среду культивирования HUVEC и MCF7 (рисунок 3.2.113.Б, Г). Неокисленные образцы ДНК, независимо от состава, в слабой степени стимулируют транскрипцию гена STING, окисленные образцы вкДНК не влияют на транскрипцию STING. В фибробластах кожи человека (HDF), культивируемых в условиях окислительного стресса, уровень экспрессии гена STING практически не изменяется через 72 часа после добавления гДНК и гДНКокси (рисунок 3.2.113.В). Таким образом, вклад сенсорной системы, адаптором которой служит молекула STING, в реализацию функциональной активности вкДНК мал. 3.2.20. Влияние вкДНК на экспрессию белков семейства TLR Нами было показано, что МСК, независимо от происхождения, экспрессируют все рецепторы TLR, уровень экспрессии генов TLR1-10 сопоставим с уровнем экспрессии гена ТВР (количество РНК TLR1-10 составляет (0,5 – 4)х количества мРНК ТВР), что согласуется с литературными данными [Костюк с соавт., 2012; Pevsner-Fischer et al., 2007]. TLR1, 2, 4, 5, 6 располагаются на поверхности клеток, TLR 3, 7, 8, и 9 локализованы в эндосомах, их лигандами служат нуклеиновые кислоты [Sasai et al., 2013]. Отмечается синергизм действия TLR – как внутриклеточных рецепторов между собой; так и внутриклеточных, расположенных на эндосоме, с рецепторами, расположенными на мембране клеток [He et al., 2013]. TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9, расположенные внутриклеточно на эндосомах, эволюционно консервативны и высоко гомологичны, между ними обнаружены кооперативные взаимодействия, приводящие к модулированию TLR- сигнализации [Swathi et al., 2013]. Структурно TLR содержат уникальную повторяющуюся последовательность, отвечающую за связывание с лигандом 292 – LRR (xLxxLxLxx[N/L]x+xx+xxxxFxxLx, где x - любая аминокислота, а + - гидрофобная аминокислота) [Swathi et al., 2013]. Иинсерции в позиции 10 LRR в TLR 2, 5 и 8 создают потенциальные места связывания CpG-ДНК – лиганда TLR9 [Swathi et al., 2013]. Инсерция в 8-й позиции LRR обеспечивает связывание CpG-ДНК с помощью транскрипционного активатора, названного CpG-связывающим белком [Swathi et al., 2013]. Предполагается, что активация различных TLR рецепторов лигандами TLR9 может промотировать TLR9-сигнальный путь и способствовать более эффективному ответу клеток на присутствие неметилированных CpG-мотивов [Swathi et al., 2013]. Однако показано, что рецепторы TLR7 и TLR8 могут не только усиливать активацию TLR9 за счет перекрестной активации пересекающихся сигнальных путей, но и ингибировать TLR9-сигнальный путь [Wang et al., 2006]. Так, TLR8 может ингибировать TLR7 и TLR9, в свою очередь TLR9 ингибирует TLR7 [Wang et al., 2006]. Эти ингибирующие взаимодействия являются результатом прямого физического или косвенного взаимодействия между TLR [Wang et al., 2006]. При исследовании влияния окисленных и ГЦ – обогащенных фрагментов вкДНК на экспрессию генов рецепторов TLR, показано, что в присутствии ГЦ-богатой п(рДНК) и окисленных фрагментов (гДНКокси и п(рДНК)окси) через 24 часа в МСК увеличивается экспрессия генов не только TLR9, но и других TLR [Kostjuk et al., 2012]. При действии неокисленных ГЦ-богатых фрагментов на МСК через 24 часа в клетках возрастает количество РНК генов внутриклеточных рецепторов TLR3 и TLR7, а также генов TLR5, TLR6 и TLR1 - трансмембранных рецепторов клеточной поверхности (рисунок 3.2.114.А) [Kostjuk et al., 2012]. При действии окисленных фрагментов вкДНК увеличивается экспрессия генов эндосомальных TLR3, TLR7 и TLR8 и поверхностных TLR4 и TLR6 (рисунок 3.2.114.А) [Kostjuk et al., 2012]. Вероятно, вкДНК стимулирует не только TLR9, но и другие рецепторы семейства TLR. Показано, что существует перекрестная активация TLR - рецепторов [Kawai et al., 2011]. Сложные сети взаимодействий внутриклеточных рецепторов могут модулировать проведение сигнала внеклеточной ДНК через TLR9-сигнальный путь, как усиливая, так и ингибируя сигнал. Повышение экспрессии генов TLR, локализованных на поверхности клетки, может быть связано с передачей сигнала от вкДНК с поверхности клетки для инициации процесса перемещения TLR9 к эндосомам из ЭПР. Так в литературе описано участие TLR4 в проведении сигнала от комплекса вкДНК-HMGB1 [Brencicova at al., 2013]. 293 Рисунок 3.2.114. А - Уровень экспрессии генов TLR1-10 при культивировании МСК в присутствии неокисленных и окисленных фрагментов вкДНК (концентрация добавляемых фрагментов 50 нг/мл, время воздействия 24 часа). Б – Динамика изменения уровня экспрессии генов внутриклеточных рецепторов TLR3, TLR7 и TLR8 во времени при добавлении ГЦ-богатой п(рДНК) и окисленных фрагментов ДНКокси (концентрация добавляемых фрагментов 50 нг/мл), метод ПЦР в реальном времени. Уровень экспрессии TLR в МСК через 24 часа после введения в среду культивирования неокисленных и окисленных фрагментов вкДНК в концентрации 50 нг/мл через 30 мин после добавления к МСК инг-ОДН (В) и хлорокина (Г). Приводятся средние значения и SD для трех/шести независимых экспериментов. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток того же донора и нормализованы по ТВР (контроль – на графиках горизонтальная линия 1,0 ± 0,3 отн.ед.). (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Была исследована динамика роста экспрессии генов внутриклеточных рецепторов TLR3, TLR7 и TLR8 при добавлении ГЦ-богатых и окисленных фрагментов (рисунок 294 3.2.114.Б) [Костюк с соавт., 2012]. В первые 3 - 4 часа после добавления в среду культивирования МСК ГЦ-богатых и окисленных фрагментов возрастает экспрессия генов TLR3 и TLR7 (и TLR8 при добавлении ДНКокси), достигающая максимальных значений к 24 часам (рисунок 3.2.114.Б) [Kostjuk et al., 2012]. Через трое суток после начала воздействия любой вкДНК экспрессия генов TLR снижалась (рисунок 3.2.114.Б). Поскольку увеличение количества мРНК TLR3, TLR7 и TLR5 происходило позже, чем увеличение экспрессии гена TLR9, мы полагаем, что активация транскрипции других, не TLR9, рецепторов носит вторичный характер и запускается активацией общих адаптерных молекул TLR-сигнальных путей [Kostjuk et al., 2012]. Для проверки этого предположения мы блокировали проведение сигнала через TLR9 с помощью ингибиторных ОДН и хлорокина. И инг-ОДН, и хлорокин блокировали увеличение экспрессии генов внутриклеточных рецепторов TLR3, 7 и 9; и рецепторов клеточной поверхности (рисунок 3.2.114.В, Г). Только у гена TLR1 на фоне блокаторов наблюдалась остаточная экспрессия (не более, чем в 1,4 раза превышающая контрольные значения). Полученный результат свидетельствует о вторичном повышении экспрессии генов внутриклеточных TLR3, TLR7 и TLR8 и генов рецепторов TLR клеточной поверхности по отношению к TLR9. Однако, при наличии сайтов связывания CpG-ДНК у других внутриклеточных TLR [Swathi et al., 2013] возможна активации транскрипции генов TLR3, TLR7 и TLR8 при непосредственном связывании ГЦ-богатых фрагментов вкДНК соответствующими рецепторами. Возможно, наблюдаемый нами эффект связан с регуляторным воздействием вкДНК на клетки и вовлечение сети рецепторов TLR в регуляцию проведения сигнала через TLR9 – один из путей реализации регулирующего действия вкДНК [Kostjuk et al., 2012]. Аналогичное действие фрагменты вкДНК оказывали на экспрессию генов внутриклеточных рецепторов TLR в HUVEC. Неокисленные ГЦ-богатые фрагменты п(рДНК) и окисленные фрагменты гДНКокси через 24 часа стимулировали транскрипцию генов TLR3 и TLR7, но в меньшей степени, чем в МСК (рисунок 3.2.115. А). Окисленные образцы, кроме того, стимулировали повышение экспрессии гена TLR8. Однако, в отличие от МСК, в HUVEC статистически значимо не повышалась экспрессия генов TLR, расположенных на клеточной поверхности. 295 Рисунок 3.2.115. А - Уровень экспрессии генов TLR3, 7, 8 и 9 в HUVEC и (Б) генов TLR 2-4 и TLR 6-8 в MCF7 через 24 часа после добавления неокисленных ГЦбогатых и окисленных фрагментов вкДНК в концентрации 50 нг/мл. Данные приведены относительно контроля – необработанных клеток того же донора и нормализованы по гену GAPDH (для HUVEC) и по гену ТВР (для MCF7). Контроль – на графиках горизонтальная линия 1,0 ± 0,2 отн.ед. Приведены средние значения для 2-х доноров HUVEC. Приведены средние значения для 3-х экспериментов. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). В культуре раковых клеток MCF7 фрагменты вкДНК независимо от нуклеотидного состава и степени окисления стимулировали экспрессию генов внутриклеточных рецепторов TLR8 и TLR3 в 1,3 – 1,8 раза через 24 часа после начала воздействия (рисунок 3.2.115). Окисленные фрагменты индуцировали повышение экспрессии гена мембранного рецептора клеточной поверхности TLR4, и, в меньшей степени, TLR2 и TLR6 (только в 296 1,2-1,7 раз), ГЦ-богатые неокисленные фрагменты существенного влияния на транскрипцию поверхностных TLR не оказывали (рисунок 3.2.124). Таким образом, мы наблюдали повышение экспрессии генов внутриклеточных эндоплазматических рецепторов TLR3, TLR7 и TLR8 в ответ на воздействие как ГЦ-богатых, так и окисленных фрагментов вкДНК в разных типах клеток. Кроме того, в присутствии вкДНК возрастает экспрессия генов рецепторов клеточной поверхности TLR6 и, в меньшей степени, TLR1 и TLR5. При действии окисленных фрагментов возрастает экспрессия гена TLR4. Однако, повышение экспрессии генов семейства TLR возникает вторично после активации TLR9. Блокирование TLR9 ингибирует проведение сигнала и через остальные TLR. Связывание вкДНК с рецептором запускает каскад активированных молекул сигнальных путей, которые инициируют переход транскрипционных факторов в ядро клетки и активацию генов-мишеней этих сигнальных путей. Мы рассмотрели активацию 4-х транскрипционных факторов в результате проведения сигнала вкДНК через соответствующие сигнальные пути: NF-kB, NRF2, STAT3 и PPARG2. 3.2.21. ВкДНК активирует TLR-сигнальный путь После связывания лиганда TLR образуют гомо- и гетеродимеры, которые передают сигнал внутрь клетки посредством гомотопического связывания TIR-TIR с одним из TIRсодержащих адапторных белков (MyD88, TRIF/TICAM-1, TIRAP/MAL и TRAM/TICAM2/TIRP) или с комбинацией этих белков [Yamamoto et al., 2010; Kostjuk et al., 2012]. Все TLR, за исключением TLR3, который передает сигнал через TRIF, используют один и тот же сигнальный путь и MyD88 в качестве адаптера [Yamamoto et al., 2010; Akira et al., 2001]. Передача сигнала через TLR осуществляется посредством ряда процессов, главный из которых - обратимая ковалентная модификация путем фосфорилирования и убиквитинирования. Для всех TLR сигнальный путь начинается с IRAK и белков семейства TRAF. Далее сигнал передается на киназы промежуточного уровня, такие как ТAK-1 и TBK-1/IKKi, что приводит к активации сигнальных путей через МAР-киназы (JNK, р38 и ERK), IRF (а именно, IRF-3, IRF-5, и IRF-7) и NF-kB [Takagi et al., 2011; Akira et al., 2003] (рис 3.2.125), что сопровождается повышением экспрессии генов и синтезом цитокинов и хемокинов. 3.2.21.1. Изменение уровня экспрессии гена MyD88 –адаптера TLRсигнального пути в ответ на стимуляцию МСК фрагментами п(рДНК). Мы исследовали кинетику изменения количества мРНК адаптера TLR-сигнального пути – MyD88 в ответ на стимуляцию МСК фрагментами п(рДНК) [Kostjuk et al., 2012].. 297 Изменение уровня экспрессии гена MyD88 в МСК при действии п(рДНК) повторяет динамику роста уровня экспрессии гена TLR9, однако, смещено во времени. Количество мРНК MyD88 повышается (в 4,6 раза), достигая максимума к 3 часам, сохраняется на максимальном уровне в течение 24 часов и снижается через 3 дня (рис 3.2.116.А). Рисунок 3.2.116. А - Динамика накопления мРНК MyD88 (красные столбики) на фоне TLR9 (серые столбики) во времени при инкубации МСК в присутствии ГЦбогатых фрагментов - п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. Данные приведены относительно контроля – интактных МСК того же донора и нормализованы по ТВР. Приведены средние значения для МСК 2-х доноров, каждый эксперимент повторен 3 раза. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Б - Уровень экспрессии гена MyD88 в МСК при действии ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) и АТ- богатой п(СатIII) и ДНК E.coli. (*) – средние значения достоверно различаются (p<0,05). При культивировании МСК в присутствии п(рДНК), п(СатIII) и ДНК Е.coli наблюдается увеличение количества мРНК MyD88 соответственно в 5,0; 4,8 и в 3,0 раза по отношению к контролю, соответственно (рисунок 3.2.116.Б) [Костюк с соавт., 2012]. Уровень экспрессии гена MyD88, индуцируемой ГЦ-богатой и окисленной вкДНК, превышает значения экспрессии гена MyD88 после стимуляции TLR9 экзогенным бактериальным лигандом – ДНК E.coli [Костюк с соавт., 2012]. Вероятно, повышение уровня экспрессии гена MyD88 при действии вкДНК складывается из кумулятивного действия вкДНК на TLR9 и другие рецепторы, использующие MyD88 в качестве адаптерной молекулы. Повышение уровня экспрессии гена MyD88 в ответ на АТ-богатую п(СатIII), не изменяющую экспрессию TLR9, подтверждает возможность активации MyD88 не только через TLR9 – сигнальный путь [Костюк с соавт., 2012]. 298 Исследовали динамику изменения экспрессии гена MyD88 в первые 3 часа после добавления окисленной вкДНК к среде культивирования МСК (рисунок 3.2.117.Б). Рисунок 3.2.117. Уровень экспрессии гена MyD88 - адаптера TLR9 – сигнального пути при культивировании МСК в присутствии неокисленных и окисленных фрагментов (50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке). Метод ПЦР в реальном времени. Приводятся средние значения и SD для N образцов добавляемой ДНК (гДНК и вкДНК) и для трех независимых экспериментов с модельной ДНК. Сокращения: ОИМ – острый инфаркт миокарда, РА – ревматоидный артрит. Б - Уровень экспрессии MyD88 в МСК через 3 часа после введения в среду культивирования неокисленных и окисленных фрагментов вкДНК в концентрации 50 нг/мл без ингибиторов, через 30 мин после добавления к МСК инг-ОДН и хлорокина. Данные приведены относительно контроля – необработанных МСК того же донора и нормализованы по ТВР (горизонтальная зеленая линия 1 ± 0,3). Приведены средние значения для МСК 2-х доноров, каждый эксперимент повторен 3 раза. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). 299 Кратковременно в 2 - 2,5 раза уровень экспрессии гена MyD88 повышался через 1 час после добавления окисленной вкДНК (гДНКокси, вкДНКОИМ, п(рДНК)окси, вкДНК(HUVEC)окси), через 3 часа уровень экспрессии гена MyD88 снижался и превышал контрольные значения только в 1,5 раза (рис 3.2.117.А). Образцы ГЦ-богатой вкДНК больных ревматоидным артритом так же, как и модельные ГЦ-богатые фрагменты п(рДНК) вызывают повышение уровня экспрессии гена MyD88 в 4 - 4,5 раза позже (через 3 часа после их добавления в среду культивирования МСК). Действие вкДНК больных ОИМ обусловлено одновременно повышением содержания ГЦ-последовательностей и окислительными модификациями, при действии вкДНК ОИМ на МСК уровень экспрессии гена MyD88 повышается через 3 часа в 2 раза. Для определения вклада TLR9 – сигнального пути в повышение уровня экспрессии гена MyD88, использовали ингибиторы TLR9 - сигнального пути – инг-ОДН и хлорокин. Инг-ОДН и хлорокин блокировали проведение сигнала через TLR9-сигнальный путь при добавлении окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК (рисунок 3.2.117.Б). Наиболее показательно отсутствие повышения уровня экспрессии гена MyD88 при добавлении фрагментов п(рДНК) (рисунок 3.2.117.Б). Поскольку уровень экспрессии гена MyD88 повышается позже, чем гена TLR9, 24 часа посчитали оптимальным временем воздействия п(рДНК) на МСК для изучения транскрипционной активности генов молекул TLR-сигнального пути. Мы использовали наборы “SABiosciences' Pathway-Focused Arrays” для первичного скрининга уровня экспрессии генов TLR - пути, активирующихся в МСК в ответ на добавление п(рДНК) [Kostjuk et al., 2012]. Из 86 проанализированных генов TLR – сигнального пути были выявлены гены, отвечающие повышением количества мРНК в МСК при действии п(рДНК), уровень экспрессии этих генов исследовали в серии отдельных экспериментов на трех культурах МСК с одинаковыми поверхностными маркерами. Мы обнаружили изменение уровня экспрессии генов адаптеров TLR-пути в ответ на добавление ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) к среде культивирования МСК ЖТ. Через 24 часа после начала культивирования МСК в присутствии ГЦ-ДНК количество мРНК MYD88, TIRAP, HSPD1, MAP2K3 возрастает в 5-9 раз ( рисунок 3.2.118.А), количество мРНК TICAM2, SARM1, TOLLIP, HRAS, HSPA1A и MAPK8IP3 повышается в 2-3,5 раза (рис 3.2.118) [Kostjuk et al., 2012. А]. В 1,5 раза увеличивается уровень экспрессии генов PELI1 и RIPK2 (рис 3.2.118.А) [Kostjuk et al., 2012]. 300 Рисунок 3.2.118. Уровень экспрессии генов адаптеров и эффекторов TLR9 – сигнального пути при культивировании МСК в присутствии ГЦ-богатых модельных фрагментов п(рДНК) (50 нг/мл, 24 часа), определяемый методом ПЦР в реальном времени. Результат представлен как изменение экспрессии гена в стимулированных клетках по отношению к нестимулированным (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,2). Приводятся средние значения и SD для трех/четырех независимых экспериментов. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Через 24 часа после добавления ГЦ-богатой п(рДНК) повышается также уровень экспрессии генов эффекторов TLR-сигнального пути. Обогащение среды культивирования МСК ГЦ-богатыми фрагментами рДНК вызывает увеличение количества мРНК генов EIF2AK2, PPARA в клетках в 3,5 – 5 раз (рисунок 3.3.118.Б) [Kostjuk et al., 2012]. Уровень 301 экспрессии генов TRAF6, UBE2N повышается в 2 раза, в 1,7-2 раза возрастает количество мРНК FADD, IRAK1, MAP3K7IP1, IRAK2 и IRAK1 (рисунок 3.3.118.Б) [Kostjuk et al., 2012]. Таким образом, ГЦ-богатые фрагменты вкДНК, вслед за повышением экспрессии TLR9 в МСК, инициируют проведение сигнала через TLR9 – сигнальный путь. 3.2.21.2. Динамика изменения количества мРНК гена MyD88 – адаптера TLRсигнального пути в ответ на стимуляцию HUVEC и MCF7 фрагментами вкДНК. При введении в среду культивирования HUVEC в концентрации 50 нг/мл все неокисленные образцы ДНК (п(рДНК), рBR322, гДНК) вызывают увеличение уровня экспрессии гена MyD88 – адаптера TLR9 - сигнального пути. ГЦ-богатая п(рДНК) активирует TLR9 - сигнальный путь быстро – уровень экспрессии гена MyD88 возрастает почти в 3 раза уже через 3 часа после начала воздействия, постепенно снижалась со временем и через 72 часа только в 1,5 раза превышает уровень экспрессии гена MyD88 контрольных клеток (рисунок 3.2.119. А), pBR322 и гДНК повышают уровень экспрессии гена MyD88 в 2,5 раза только через 24 часа, к 72 часам уровень экспрессии гена MyD88 возвращается к контрольным значениям (рисунок 3.2.119. А). Рисунок 3.2.119. Динамика накопления мРНК MyD88 на фоне TLR9 (серые столбики) во времени при инкубации HUVEC (А) и МСF7 (Б) в присутствии неокисленной гДНК, ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) и рBR322 и окисленных фрагментов гДНКокси в концентрации 50 нг/мл. Приведены средние значения для HUVEC 3-х доноров, каждый эксперимент повторен 3 раза. Результат представлен как изменение экспрессии гена в стимулированных нестимулированным (контроль – интактные клетки – клетках по отношению к на графиках горизонтальная зеленая линия 1 ± 0,3). Приводятся средние значения и SD для трех/четырех независимых экспериментов. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). 302 Окисленные образцы гДНКокси слабо стимулируют проведение сигнала через TLR9 - сигнальный путь, что подтверждает наше предположение о реализации ответа клеток HUVEC на окисленную ДНК отличным от TLR9- сигнального пути способом. Окисленные образцы вкДНК при введении в среду культивирования MCF7 в концентрации 50 нг/мл через 2 часа стимулируют увеличение уровня экспрессии гена MyD88. Через 2 часа инкубации MCF7 в присутствии гДНКокси уровень экспрессии гена MyD88 возрастает в 3,6 раза, в присутствии п(рДНК)окси – в 1,6 раза (рисунок 3.2.119. Б) [Kostyuk et al., 2012]. Неокисленные фрагменты гДНК и ГЦ-богатой п(рДНК) стимулируют транскрипцию гена MyD88 медленнее – только через 48 часов количество РНК MyD88 возрастает в 1,7 – 2 раза (рисунок 3.2.119. Б). Таким образом, в отличие от МСК и HUVEC, в MCF7 образцы окисленной вкДНК стимулируют TLR9- сигнальный путь быстрее и эффективнее, чем неокисленные и ГЦ-богатые фрагменты. 3.2.21.3. Влияние фрагментов вкДНК на активацию адаптера TLR9 сигнального пути – MyD88 на уровне транскрипции в лимфоцитах, CD34+ клетках костного мозга и фибробластах. Через 3 часа инкубации лимфоцитов здоровых доноров и СD 34+ клеток костного мозга в присутствии ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) наблюдается повышение уровня экспрессии гена MyD88 приблизительно в 3,5 раза (рисунок 3.2.120). Рисунок 3.2.120. Уровень экспрессии гена MyD88 в лимфоцитах (А) и СD 34+ клетках (Б) костного мозга (3 часа;50 нг/м)л. Серые столбики – уровень экспрессии TLR9 в тех же клетках при тех же условиях (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная зеленая линия 1 ± 0,3). В - Уровень MyD88 в фибробластах кожи (HDF) через 72 часа после добавления гДНК и гДНКокси (20 и 100 нг/мл). Количество мРНК гена MyD88 нормализовано по гену ТВР. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток HDF, культивируемых в отсутствие сыворотки. Приведены средние значения для 4-х экспериментов). (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). 303 ВкДНК больных РА, обогащенная ГЦ-ДНК, также увеличивает уровень экспрессии гена MyD88 в 4 раза в лимфоцитах здоровых доноров. ДНК E.coli, признанный лиганд TLR9, повышала уровень РНК MyD88 в 5 раз (рисунок 3.2.120). Окисленные фрагменты ДНК не вызывали активацию TLR9- сигнального пути в лимфоцитах (рисунок3.2.120). Фибробласты кожи человека инкубировали в условиях окислительного стресса - 3 суток в бессывороточной среде в присутствии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК. Уровень экспрессии гена MyD88 не изменялся при действии длительное время низких концентраций (20 нг/мл) как неокисленной, так и окисленной экзогенной вкДНК, высокие концентрации гДНК и гДНКокси (100 нг/мл) снижают уровень РНК MyD88 (рис). Это также свидетельствует об отсутствии проведения сигнала через TLR9 спустя 72 часа после добавления фрагментов в среду культивирования HDF. Таким образом, связывание фрагментов вкДНК с TLR9 приводит к активации TLR-сигнального пути. Известно, что результатом активации TLRсигнального пути является проведение сигнала через каскад молекул NF-kB – сигнального пути. 3.2.22. ВкДНК активирует NF-kB- сигнальный путь в разных типах клеток Мы обнаружили, что ГЦ – богатые фрагменты вкДНК активируют TLR9 сигнальный путь в МСК, максимум воздействия ГЦ-богатых фрагментов приходится на 324 часа после начала воздействия. Действие окисленных фрагментов вкДНК на TLR9сигнальный путь раннее и краткосрочное – активация происходит в первый час после начала воздействия и снижается уже к 3-м часам. ГЦ-богатые фрагменты оказывают слабое активирующее воздействие на рецепторы AIM2, окисленные фрагменты в первые часы после их добавления в среду культивирования МСК, инициируют AIM2 – сигнальный путь. И TLR9-сигнальный путь, и AIM2 приводят к активации NF-kB - сигнального пути. TLR9 активирует хорошо изученный сигнальный каскад, ассоциированный с фактором транскрипции NF-kB. Активированные в TLR9 - сигнальном пути киназы МАРЗК прямо или опосредованно активируют комплекс IκB киназ (IKK). В результате активации происходит фосфорилирование IκB по двум остаткам серина Ser32 и Ser36, что инициирует убиквитинирование и протеосомную деградацию IκB и высвобождение NFkB, который перемещается в ядро и индуцирует транскрипцию генов-мишеней (цитокинов, факторов роста, молекул адгезии) [Salminen et al., 2008; Baud and Jacque, 2008]. 3.2.22.1. ВкДНК активирует экспрессию генов NF-kB - сигнального пути в МСК. 304 При действии ГЦ-богатой п(рДНК) на МСК мы наблюдали активацию транскрипции генов NF-kB - сигнального пути, количество мРНК MAP3K1, MAP4K4, NFKB1A, REL возрастало в 3,5 – 5,5 раз, мРНК IKBKB, RelA (p65), NFRKB, NF-KB1 и NF-KB2 в 2 – 3 раза (рисунок 3.2.121). Рисунок 3.2.121. Стимуляция TLR9 п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл индуцирует в МСК повышение экспрессии генов NF-kB-сигнального пути (время воздействия 24 часа). Изменение экспрессии генов в стимулированных МСК по отношению к контролю ( интактные клетки, горизонтальная линия 1 ± 0,2). Экспрессия генов была проверена в 5-ти независимых экспериментах на разных культурах МСК. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Таким образом, ГЦ-богатые последовательности ДНК, накапливающиеся в составе вкДНК, повышают экспрессию большинства генов молекул, участвующих в проведении сигнала через NF-kB - сигнальный путь. Поскольку вкДНК характеризуется не только накоплением ГЦ-богатых последовательностей в своем составе, но и окислительными модификациями, исследовали влияние окисленных и ГЦ-обогащенных фрагментов в составе вкДНК на активацию транскрипции 4-х генов NF-kB – сигнального пути. Наибольшее изменение экспрессии генов NF-kB – сигнального пути вызывают ГЦбогатые фрагменты вкДНК через 3 - 24 часа после начала воздействия (рисунок 3.2.136). Так, и вкДНК больных РА, и модельные ГЦ-богатые фрагменты вкДНК стимулируют повышение уровня экспрессии генов MАР4K4 (в 4-5,5 раз), MAP3K1 (в 4-5 раз), NFKB1 (в 2-3 раза), RELА (в 2,2-3,2 раза). 305 Рисунок 3.2.122. Динамика изменения экспрессии генов NF-kB-сигнального пути окисленными и ГЦ-богатыми фрагментами ДНК (в концентрации 50 нг/мл; время воздействия указано на рисунке). Результат представлен как отношение экспрессии генов в стимулированных МСК по отношению к экспрессии генов в интактных МСК (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,2). Экспрессия генов была проверена в 4-х независимых экспериментах на разных культурах МСК. Количество доноров, от которых получены фрагменты вкДНК, использованные в этом эксперименте, указаны на рисунке в скобках; сокращения: ОИМ – острый инфаркт миокарда, РА – ревматоидный артрит, ЗД – здоровые доноры. Данные представлены как среднее значение 4-х экспериментов и стандартного отклонения. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Окисленные фрагменты вкДНК стимулируют повышение экспрессии генов NF-kB – сигнального пути уже через час, короткое время и в меньшей степени, чем ГЦ-богатые фрагменты (рисунок 3.2.122). В первый час после добавления в среду культивирования МСК окисленная ДНК (гДНКокси, п(рДНК)окси и вкДНК ОИМ) вызывают повышение уровня экспрессии генов MАР4K4, MAP3K1 и RELА в 1,6 - 2 раза, гена NFKB1 примерно в 1,5 раз. Через 24 часа после добавления вкДНК больных острым инфарктом миокарда (ОИМ), а также окисленных фрагментов в среду культивирования МСК, уровень экспрессии генов NF-kB - сигнального пути снижается до контрольных значений (рисунок 3.2.122). 306 Провели эксперимент по блокированию NF-kB - сигнального пути с помощью ингОДН и хлорокина. Ингибиторы добавлялись к клеткам за 30 минут до введения в среду культивирования фрагментов вкДНК. Добавление ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) на фоне инг-ОДН или хлорокина не приводит к возрастанию уровня экспрессии генов NF-kB - сигнального пути: MАР4K4, MAP3K1, RELА и NFKB1 (рисунок 3.2.123). При введении гДНКокси на фоне инг-ОДН или хлорокина сохраняется остаточный уровень повышенной экспрессии генов MАР4K4, MAP3K1, RELА, NFKB1. Видимо, гДНКокси стимулирует экспрессию генов NF-kB - сигнального пути не только через TLR9 (рисунок 3.2.123). Рисунок 3.2.123. Уровень экспрессии MАР4K4, MAP3K1, RELА и NFKB1 в МСК через 2 часа после введения в среду культивирования неокисленных и окисленных фрагментов вкДНК в концентрации 50 нг/мл без ингибиторов, через 30 мин после добавления к МСК инг-ОДН и хлорокина. Данные приведены относительно контроля – интактных МСК того же донора спустя то же время культивирования и нормализованы по ТВР (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,2). Приведены средние значения для МСК 2-х доноров, каждый эксперимент повторен 3 раза. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Окислительнвя модификация вкДНК способствует быстрому проникновению вкДНК в МСК, где фрагменты вкДНКокси активирует NF-kB – сигнальный путь быстро и недолго, вероятно, используя сигнализацию от двух типов внутриклеточных рецепторов, стимулирующих NF-kB - сигнальный путь – TLR9 и AIM2. Повышение ГЦ-богатых фрагментов в составе вкДНК инициирует продолжительную и более сильную активацию NF-kB - сигнального пути в МСК, что способствует выживанию МСК в условиях окислительного стресса. 307 3.2.22.2. Фрагменты вкДНК активируют экспрессию транскрипционного фактора NF-kB (RelА или p65) и его перемещение в ядро в МСК Мы проанализировали количество белкового компонента NF-kB – субъединицы RelА (p65) в МСК (рисунок 3.2.124. А), с помощью метода флуоресцентной микроскопии, используя антитела к NF-kB (р65), конъюгированные с FITC [Kostjuk et al., 2012]. После 3-х часовой инкубации с п(рДНК), средняя интенсивность флуоресценции МСК усилилась в 4 раза, что указывает на увеличение содержания p65 в клетке, которое коррелирует с усилением транскрипции гена Rel А (рисунок 3.2.122) [Kostjuk et al., 2012]. При добавлении в среду культивирования МСК гДНК количество белка p65 в клетках увеличивалось в меньшей степени, чем при действии ГЦ-богатой ДНК - в 1,6 раза по сравнению с контролем (интактными МСК без добавления фрагментов) [Kostjuk et al., 2012]. Окисленные фрагменты увеличивают количество белка р65 в МСК только в первые часы после их добавления в среду культивирования клеток, через 3 часа количество компонента р65 возвращается к контрольному уровню (рисунок3.2.124.Б,В) [Kostjuk et al., 2012]. Подобная динамика изменения количества белка транскрипционного фактора NFkB свидетельствует о быстром включении механизмов регуляции NF-kB - сигнального пути в МСК в ответ на присутствие в околоклеточном пространстве окисленных фрагментов вкДНК [Kostjuk et al., 2012]. Рисунок 3.2.124. А - Накопление в МСК компонента р65 тнскрипционнго фактора NFkB при инкубации клеток в присутствии п(рДНК) и гДНК в концентрации 50 нг/мл в течение 3 часов. Данные проточной цитофлуориметрии. Б – Увеличение в МСК компонента р65 NF-kB при инкубации клеток в присутствии гДНКокси и гДНК в концентрации 50 нг/мл (время инкубации – 1 час (Б) и 3 часа (В)) (*) Отличия от контроля статистически значимы (р <0,05). Эксперимент был независимо выполнен на двух культурах МСК в 3-х повторах. Мы проанализировали изменение числа клеток с увеличенным содержанием фактора NF-kB через 3 часа после добавления окисленных и неокисленных фрагментов 308 вкДНК к культивируемым МСК, содержащим, и не содержащим мутацию в гене р53 (рисунок 3.2.125). При культивировании МСК в присутствии п(рДНК) возрастает число клеток, содержащих белок NF-kB: почти в 4 раза для культуры с мутацией в гене р53 (миссенс-мутацией L145p в 5-ом экзоне), и более, чем в 2 раза для культур без мутации в гене р53 (рисунок 3.2.125). Вероятно, мутация в гене р53 в большей степени активирует пути выживания в клетках, одним из которых является NF-kB – сигнальный путь. Окисленная ДНК (гДНКокси и ДНК8oxodG) в меньшей степени увеличивает число клеток с повышенной экспрессией NF-kB (рисунок 3.2.125). Рисунок 3.2.125. Частота клеток с высоким уровнем экспрессии NF-kB при действии на МСК фрагментов окисленной, неокисленной и ГЦ-обогащенной ДНК в культуре МСК с мутацией в гене р53 (миссенс-мутацией L145p в 5-ом экзоне) (Б) и без мутации (А). Слева - распределение клеток по интенсивности сигнала, обозначены анализируемые области клеток с повышенным содержанием NF-kB. Эксперимент был независимо выполнен на двух культурах МСК в 3-х повторах. Сокращения: МВ – ДНК, окисленная избирательно метиленовым синим по 8-oxod-G. (*) - Отличия от контроля статистически значимы (р <0,05). 309 Транскрипционный фактор NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-kB) в отсутствие стимулов присутствует в цитоплазме клеток в виде неактивного комплекса, состоящего из Rel-родственных белков, включая р65 (RelА) и р50 с ингибирующими белками IkB (IkBa, IkBb, IkBg, IkB3), закрывающими сайты связывания с ДНК, что предотвращает активацию транскрипции [Gloire and Piette, 2009; Salminen et al., 2008]. Активация NF-kВ - сигнального пути приводит фосфорилированию белка IkB IkB-киназой (IKK) и его протеасомной деградации, фактор NF-kB освобождается и перемещается в ядро [Gloire and Piette, 2009; Pedruzzi et al., 2012; Kostjuk et al., 2012]. Транслокация NF-kВ приводит к его взаимодействию с промотерными участками более 200 генов, контролирующих клеточные функции (цитокинов, фактров роста, молекул адгезии и других) [Salminen et al., 2008; Baud and Jacque, 2008]. Перемещение NF-kB в ядро – центральное событие активации NF-kB - сигнального каскада, поэтому мы исследовали перемещение NF-kB из цитоплазмы в ядро МСК [Kostjuk et al., 2012]. В фиксированных клетках транскрипционный фактор NF-kB окрашивали антителами к NF-kB (р65) с использованием вторичных антител, конъюгированных с FITC. Локализацию NF-kB определяли с помощью флуоресцентной микроскопии (рисунок 3.2.126.А, Б). В интактных МСК 65 ± 10% общего количества клеток содержат низкое количество NF-kB в цитоплазме, в 20 ± 5% клеток NF-kB присутствует в цитоплазме, но не в ядре. В 15 ± 5% клеток NF-kB локализуется в ядре [Kostjuk et al., 2012]. Воздействие п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл на МСК в течение 30 минут приводит к увеличению числа клеток с NF-kB, локализованным в цитоплазме, в то время как число клеток с NF-kB в ядре остается таким же, как в контроле (р> 0,05) [Kostjuk et al., 2012]. В промежуток времени от 1 часа и до трех часов после начала воздействия п(рДНК) на МСК (50 нг/мл) происходит транслокация NF-kB в ядро из цитоплазмы - NFkB локализован в ядре почти у всех клеток популяции МСК (рисунок 3.2.126. Б, В); через 24 часа число активированных клеток снижается в 2 раза и вместе с этим снижается средняя интенсивность флуоресценции [Kostjuk et al., 2012]. При действии гДНК не регистрируется изменение локализации NF-kB по сравнению с контролем (рисунок 3.2.126.Б, В) [Kostjuk et al., 2012]. Примечательно, что несмотря на то, что активация экспрессии TLR9 наблюдается не во клетках при действии п(рДНК) на МСК, транслокации NF-kB в ядро наблюдается во всех клетках исследованной популяции МСК [Kostjuk et al., 2012]. 310 Рисунок 3.2.126. Внутриклеточная локализация компонента р65 NFkB в МСК при инкубации клеток в присутствии п(рДНК) и гДНК в концентрации 50 нг/мл в течение 3 часов. Клетки фиксировали 3% формальдегидом, пермеабилизировали с помощью 0,1% Тритона-X100, а затем инкубировали с антителами к NF-кВ и с вторичными антителами, меченными FITC. А - Данные флуоресцентной микроскопии, увеличение Х100 . Справа - стрелки указывают на МСК с различной локализацией р65: 1 клетки содержат очень низкое количество NF-kB в цитоплазме, 2 - NF-kB присутствует в цитоплазме, но не в ядре, 3- NF-kB локализуется в ядре. Б – Динамика ядерной транслокации NFkB при действии п(рДНК) и гДНК – доля клеток, содержащих NF-kB в ядре посчитана вручную. * Отличия от контроля статистически значимы (р <0,05). Эксперимент был независимо выполнен на двух культурах МСК. В, Г – Данные флуоресцентной микроскопии, соответственно увеличение 40 (В) и 100 (Г): п(рДНК) вызывает транслокацию в ядро NF-kB через 1-3 часа после начала воздействия, гДНК не меняет количество клеток с внутриядерной локализацией NF-kB. 311 При добавлении окисленных фрагментов к среде культивирования МСК уже через 20 - 30 минут в 2 раза повышается количество клеток с внутриядерной локализацией NFkB (рисунок3.2.127.Б,В), через 1-2 часа число клеток с внутриядерной локализацией р65 увеличивается втрое (рисунок 3.2.127. А - В), а через 3 часа NF-kB частично снова перемещается в цитоплазму (только в 1,5 раза увеличено число клеток с внутриядерной локализацией р65), и к 24 часам NF-kB регистрируется в незначительном количестве только в цитоплазме клеток (рисунок 3.2.127. Б, В). Таким образом, окисленная ДНК также вызывает транслокацию NF-kB в ядро, но раньше и в меньшем количестве клеток, чем ГЦ-богатые фрагменты рДНК. Рисунок 3.2.127. А - Внутриклеточная локализация компонента р65 NFkB при инкубации клеток в присутствии гДНКокси и гДНК в концентрации 50 нг/мл, время инкубации 2 часа, флуоресцентная микроскопия, увеличение Х40. Б – Динамика ядерной транслокации NF-kB при действии гДНКокси – доля клеток, содержащих NF-kB в ядре посчитана вручную. * Отличия от контроля статистически значимы (р <0,05). Эксперимент был независимо выполнен на двух культурах МСК. В – Данные флуоресцентной микроскопии, динамика ядерной транслокации NFkB при действии гДНКокси, увеличение Х40, время воздействия обозначено на рисунке: гДНКокси вызывает транслокацию в ядро NFkB через 0,5 - 2 часа после начала воздействия. Транслокация NF-kB в ядро может регулироваться растворимыми факторами, которые секретируются в результате активации NF-kB-сигнального пути [Kostjuk et al., 2012]. В МСК одним из вероятных кандидатов на роль растворимого активирующего агента является фактор некроза опухоли (TNFa - tumor necrosis factor a), секреция 312 которого возрастает при на стимуляции NF-kB в МСК. [Raicevic et al., 2010; Kostjuk et al., 2012]. 3.2.22.3. Активация процессов транскрипции генов цитокинов при действии фрагментов п(рДНК) на МСК. Активация синтеза цитокинов - IL10 и TNFα фрагментами ГЦ-обогащенной вкДНК Перемещение NF-kB в ядро сопровождается активацией транскрипции провоспалительных цитокинов [Salminen et al., 2008; Baud and Jacque, 2008; Sharif et al., 2004]. Показано также, что перемещение субъединицы р65 транскрипционного фактора NF-kB в ядро приводит к ее связыванию с локусом IL-10 на 4,5 кб выше начальной точки активации транскрипции и инициирует синтез IL-10 в макрофагах [Saraiva et al., 2005]. Мы проанализировали уровень секреции цитокинов: фактора некроза опухоли альфа (TNF альфа), интерлейкинов (IL - interleukin) IL1B, IL8, IL6 и IL-10 в ответ на присутствие фрагментов вкДНК в среде культивирования МСК (рисунок 3.2.128) [Kostjuk et al., 2012]. Рисунок 3.2.128. Уровень экспрессии генов мишеней NF-kB – cигнального пути: TNFa, IL1B, IL8, IL6 и IL-10 при культивировании МСК в присутствии ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК (50 нг/мл, время воздействия 3 часа).. Данные приведены относительно контроля – интактных МСК того же донора и нормализованы по ТВР (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,2). Приводятся средние значения и SD для трех/шести независимых экспериментов. (*) Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Б – схема временного регулирования про- и антивоспалительных цитокинов [по статье Chi et al., 2006] 313 Через 3 часа после добавления к среде культивирования МСК ГЦ-богатые фрагменты п(рДНК) индуцируют повышение уровня экспрессии генов про- воспалительных цитокинов: TNF (в 3,9 раза), IL1B (в 2,4 раза), IL8 (в 2,8 раз), IL6 (в 1,7 раз), TNFRSF1A (рецептора TNF альфа – в 3,2 раза) и гена противовоспалительного цитокина IL-10 (в 1,7 раз) (рисунок 3.2.128.А) [Kostjuk et al., 2012]. Окисленные фрагменты вкДНК через 3 часа после их добавления в среду культивирования МСК индуцируют повышение экспрессии мишеней NF-kB – cигнального пути в меньшей степени, чем ГЦ-богатые фрагменты (рисунок 3.2.128. А). Повышается уровень экспрессии генов провоспалительных цитокинов TNF альфа (в 2,1 раза), IL1B (в 1,6 раз), IL8 (в 2,3 раза), IL6 (в 2 раза) и TNFRSF1A (в 1,9 раз), а гена противовоспалительного цитокина IL-10 в 2,3 раза (рисунок 3.2.128). Согласно литературным данным, в клетках существует временное регулирование синтеза про - и противовоспалительных цитокинов при активации NF-kB – cигнального пути [Chi et al., 2006]. Провоспалительные цитокины, такие как TNFa, относят к ранним, а противовоспалительные цитокины, такие как IL10 - к поздним медиаторам иммунного ответа [Chi et al., 2006]. Мы исследовали динамику изменения уровня экспрессии генов цитокинов TNF альфа и IL-10 и их секрецию МСК в динамике при действии ГЦ - богатых фрагментов вкДНК [Kostjuk et al., 2012]. При добавлении в среду культивирования МСК ГЦ-обогащенных п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл через 3 часа возрастал уровень экспрессии гена TNF в 4 раза, через 24 часа – в 1,9 раз по сравнению с контролем (рисунок 3.2.129. А). Через 3 часа культивирования МСК в присутствии п(рДНК) экспрессия гена IL10 возрастала в 1,7 раз, через 24 часа - в 9 раз (рисунок 3.2.129. Б) [Kostjuk et al., 2012]. Кроме того, методом иммуноферментного анализа (ИФА) показано, что секреция белков - цитокинов TNFa и IL-10 в среде культивирования МСК при действии п(рДНК) также повышается по сравнению с контролем [Kostjuk et al., 2012]. Концентрация TNF альфа в среде культивирования МСК в присутствии п(рДНК) повышается в 1,5 раза по сравнению с контролем через 3 часа и в 2 раза через 24 часа; концентрация IL-10 возрастает почти в 3 раза через 3 часа в 1,6 раза - через 24 часа (рисунок 3.2.143). Геномная ДНК не влияла ни на уровень транскрипции генов, ни на на уровень секреции цитокинов TNFa и IL-10 при действии п(рДНК) (рисунок 3.2.129). 314 Рисунок 3.2.129. А, Б - Увеличение уровня мРНК IL-10 (А) и TNFa (Б) в МСК через 3 и 24 часа после начала воздействия п(рДНК). Приведены средние значения и SD для трех независимых экспериментов. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). В, Г - Уровень цитокинов IL-10 (В) и TNFa (Г) в среде культивирования МСК после стимуляции п(рДНК) (50 нг / мл), определяемый с помощью метода ELISA. (*) Отличие от контроля статистически значимо (р <0,05). Высокий уровень синтеза IL10 через 3 часа после добавления фрагментов п(рДНК), вероятно, связан с выбросом «предсуществующего» цитокина в клетке, поэтому мы обнаруживаем такую диспропорцию в активации транскрипции гена IL10 и синтезом белка. Вероятно, процесс активации транскрипции генов TNF и IL-10 более точно отражает предложенную в литературе модель временного регулирования синтеза цитокинов [Chi et al., 2006]. Мы проследили путь активации ГЦ-обогащенными фрагментами внеклеточной ДНК TLR9 – и NF-kB – сигнальных путей в МСК, на уровне транскриптома клеток: активацию транскрипции генов рецептора, молекул сигнальных каскадов, транслокацию фактора NF-kB в ядро, транскрипцию генов цитокинов. Мы показали, что активация транскриптома МСК реализуется в синтезе клетками белковых активных молекул – цитокинов, которые принимают участие в запуске большого количества пересекающихся сигнальных путей. 315 3.2.22.4. Изменение экспрессии генов молекул сигнального каскада, контролирующего транскрипционный фактор NF-kB, в HUVEC при действии фрагментов вкДНК Мы проанализировали изменение в экспрессии в HUVEC 4-х генов, которые задействованы в процессе активации фактора NF-kB: NFKB1, MАР4K4, RELA и MAP3К1. Образцы ДНК (pBR322, п(рДНК), гДНК и гДНКокси) в концентрации 50 нг/мл вводили в среду культивирования HUVEC, клетки культивировали 1, 3, 24, 48 или 72 часа. Исследовали также изменение транскрипции генов цитокинов TNFa и IL6, молекулмишеней NF-kB – сигнального пути. Рисунок 3.2.130. Динамика изменения уровня экспрессии генов NF-kBсигнального пути окисленными и ГЦ-богатыми фрагментами ДНК (в концентрации 50 нг/мл; время воздействия указано на рисунке). Результат представлен как отношение экспрессии генов в стимулированных HUVEC по отношению к экспрессии генов в интактных HUVEC (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,3). Экспрессия генов была проверена в серии независимых экспериментах на 3-х разных культурах HUVEC. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Все неокисленные образцы ДНК стимулировали увеличение количества РНК генов NFKB1, MАР4K4, RELA и MAP3К1. Наиболее сильно увеличивала уровень экспрессии 316 этих генов ГЦ-обогащенная п(рДНК): уже через 1 час уровень РНК NFKB1, MАР4K4, RELA и MAP3К1 возрастал в 3 - 4 раза, через 3 часа уровень экспрессии генов NF-kB – сигнального пути оставался повышенным (в 1,8 – 3 раза), через 48 часов снижался до уровня контрольных значений. Неокисленные образцы гДНК и pBR322 медленнее активировали NF-kB – сигнальный путь – максимум экспрессии генов NFKB1, MАР4K4, RELA и MAP3К1 наблюдался через 24 часа культивирования (рисунок 3.2.129). Окисленный образец гДНК слабо стимулировал экспрессию лишь некоторых из анализируемых генов в течение непродолжительного времени - (рисунок 3.2.130). Таким образом, при действии неокисленных, а особенно – ГЦ-обогащенных вкДНК в HUVEC активируется на уровне транскриптома NF-kB – сигнальный путь. Окисленные образцы вкДНК в меньшей степени активируют транскрипцию молекул NF-kB – сигнального каскада. 3.2.22.5. Влияние фрагментов вкДНК на количества белка р65 и его локализацию в HUVEC Активация NF-kB – сигнального каскада на уровне транскриптома необходима для транслокации транскрипционного фактора NF-kB из цитоплазмы в ядро клеток, где он инициирует транскрипционную активность многих генов - мишеней. Локализацию в HUVEC фактора NF-kB проанализировали с применением антител к NF-kB с помощью метода флуоресцентной микроскопии. В контрольных клетках эндотелия в цитоплазме содержится незначительное количество белка р65 (рисунок3.2.131). Геномная ДНК и вектор pBR322 (50 нг/мл) через 1 час после их добавления к среде культивирования клеток эндотелия, вызывают увеличение количества NF-kB в цитоплазме клеток, где он расположен в виде гранул (рисунок 3.2.131). ГЦ-обогащенные фрагменты п(рДНК) стимулируют через 1 час воздействия в концентрации 50 нг/мл значительное увеличение количества NF-kB в ядре HUVEC. причем практически весь белок локализован в клеточном ядре. Окисленные фрагменты вкДНК (1 час воздействия, 50 нг/мл) значительно увеличивают количество NFkB в HUVEC, однако он накапливается в цитоплазме свидетельствует о неактивном состоянии NF-kB (рисунок 3.2.131). эндотелиоцитов, что 317 Рисунок 3.2.131. Локализация NF-kB (компонента р65) NF-kB в клетках эндотелия при инкубации HUVEC в присутствии окисленных и неокисленных образцов вкДНК ( концентрация 50 нг/мл, время воздействия - 1 час). Клетки фиксировали 3% формальдегидом, пермеабилизировали с помощью 0,1% Тритон -X100, а затем инкубировали с антителами к NF-кВ и меченными FITC вторичными антителами. Данные флуоресцентной микроскопии, увеличение Х100. В некоторых случаях при культивировании HUVEC с окисленной ДНК, NF-kB оказывается локализован в ядрах клеток эндотелия (рисунок 3.2.131), более детальный анализ показал, что NF-kB находится в ядрышках клеток (рисунок 3.2.132). Процесс секвестрирования белка в ядрыщках описан как вариант его инактивации [Mijatovic et al., 2008]. При соответствующих условиях возможен процесс миграции секвестрированных в ядрышке белков в ядро, при этом они не теряют своей активности [Mijatovic et al., 2008]. 318 Рисунок 3.2.132. Локализация р65 в ядрышке HUVEC при их инкубации с окисленной гДНКокси (см.рисунок3.2.130).Увеличение Х200 Мы также проанализировали влияние образцов вкДНК больных ОИМ на активность фактора NF-kB. Образец вкДНК больного острым инфарктом миокарда (ОИМ1), содержащий мало окисленных оснований, так же, как неокисленные образцы вкДНК незначительно увеличивал количество NF-kB, расположенного в цитоплазме клеток (рисунок 3.2.131). Образцы вкДНК других больных острым инфарктом миокарда (ОИМ2 и ОИМ3), содержащие много окисленных оснований (около 400 на 106 нуклеозидов), стимулировали увеличение количества р65 в ядре. Фосфорилирование р65 по Ser529 с помощью фермента казеинкиназы II в присутствии активаторов, например, фактора некроза опухоли альфа также считается маркером, отражающим активность NF-kB [Wang, Baldwin, 1998]. Мы использовали антитела к соответствующей фосфорилированной форме NF-kB Ser529(р65) и с помощью метода проточной цитометрии показали, что образцы гДНК, п(рДНК) и два образца вкДНК ОИМ2 и вкДНК ОИМ3, присутствующие в среде культивирования HUVEC в течение 48 часов (в концентрации 50 нг/мл), вызывали повышение содержания в клетках фосфорилированной формы р65. (рисунок 3.2.133), что подтверждает увеличение активности фактора. Таким образом, мы показали, что ГЦ-богатые фрагменты вкДНК в наибольшей степени активируют NF-kB – сигнальный путь в HUVEC на уровне транскриптома, перемещения NF-kB в ядро и увеличения фосфорилированной (активной) фракции NF-kB в ядре. Окисленные фрагменты в меньшей степени активирует транскрипцию генов NFkB – сигнального пути, но уровень белка NF-kB при этом повышается; NF-kB при действии на клетки эндотелия окисленной вкДНК присутствует в цитоплазме и ядрышке клеток в неактивном состоянии. ВкДНК больных острым инфарктом миокарда частично проявляет свойства в зависимости от уровня окисления, однако характер воздействия 319 вкДНК ОИМ на клетки эндотелия более сложный и связан с динамичностью пула вкДНК, описанной для этой патологии [Arnalich et al., 2010]. Рисунок 3.2.133. Уровень фосфорилированной формы NF-kB р65(Ser529) в HUVEC, при добавлении образцов вкДНК (50 нг/мл, 48 часов) определяемый с помощью метода проточной цитофлоуметрии. А - распределение клеток по интенсивности сигнала, обозначена анализируемая область клеток с повышенным содержанием фосфорилированного NF-kB. Эксперимент был независимо выполнен на двух культурах в 3-х повторах. Зеленая лгоризонтальная линия – уровень фосфорилированной формы NFkB в интактных эндотелиоцитах. (*) - Отличия от контроля статистически значимы (р <0,05). 3.2.22.6. ВкДНК повышает экспрессию генов цитокинов IL8, IL6, IL10 и TNFа в HUVEC. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК стимулируют повышение уровня экспрессии генов цитокинов в HUVEC в результате активации NF-kB – сигнального пути. ГЦ- богатые фрагменты активируют NF-kB – сигнальный путь рано, максимальная экспрессия генов адаптеров NF-kB – сигнального пути при действии ГЦ-богатой п(рДНК) отмечается через 1 - 3 часа после начала воздействия (рисунок 3.2.134). Повышение экспрессии генов цитокинов IL8, IL10 и TNFа при действии ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) в 2,5; 4,5 и в 2,8 раз, соответственно, отмечается уже через 3 часа инкубации HUVEC с п(рДНК). Через 24 часа уровень экспрессии генов цитокинов при действии ГЦ- 320 богатых фрагментов остается повышенным: уровень экспрессии гена IL6 повышен в 2,4 раза, IL8 – в 2,9 раз, IL10 – в 3,4 раза, а TNF – в 2,8 раз (рисунок 3.2.134). Рисунок 3.2.134. ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК стимулируют повышение уровня экспрессии цитокинов в HUVEC (концентрация образцов вкДНК - 50 нг/мл; время воздействия указано на рисунке). Результат представлен как отношение экспрессии генов в стимулированных HUVEC и в интактных HUVEC. Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на 3-х разных культурах HUVEC. (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,3). Данные представлены как среднее значение экспериментов и стандартного отклонения (*) Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Окисленные фрагменты вкДНК повышают уровень экспрессии генов цитокинов позже, чем ГЦ- богатые фрагменты вкДНК. При инкубации HUVEC с гДНКокси через 24 часа повышается уровень экспрессии IL6 (в 2 раза), IL10 (в 2,5 раза), TNF (в 2,5 раза). Уровень экспрессии гена IL8 при действии фрагментов окисленной вкДНК повышается в меньшей степени. Через 3 часа уровень экспрессии IL8 повышен в 1,8 раз, через 24 – в 1,5 раза (рисунок 3.2.134). При действии фрагментов гДНК и pBR322 на HUVEC экспрессия исследуемых генов цитокинов повышалась незначительно – в 1,5 – 1,8 раз спустя 24 часа после начала воздействия (рисунок 3.2.134). 321 Таким образом, стимуляция экспрессии генов цитокинов в HUVEC при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК свидетельствует о реализации инициирующего действия вкДНК на уровне генов - мишеней NF-kB – сигнального пути. 3.2.22.7. Изменение уровня экспрессии генов молекул адгезии: ICAM1, SELE и VCAM1, контролируемых фактором NF-kB, при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК в HUVEC Одним из эффектов активации NF-kB – сигнального пути в HUVEC является повышение уровня экспрессии молекул адгезии [Textor 2011]. Мы проанализировали изменение экспрессии генов молекул адгезии: ICAM1, SELE и VCAM1 в HUVEC при действии фрагментов вкДНК (рисунок 2.3.135). Все три молекулы находятся под регулирующим действием транскрипционного фактора NF-kB, на их активацию в большой степени влияет секреция фактора некроза опухоли альфа [Huang et al., 2012; Lu et al., 2012]. Рисунок 3.2.135. Уровень экспрессии генов молекул адгезии: ICAM1, SELE и VCAM1 при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК в HUVEC (концентрация образцов вкДНК - 50 нг/мл; время воздействия 3 часа). Результат представлен как отношение экспрессии генов в стимулированных HUVEC к экспрессии генов в интактных HUVEC. Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на 3-х разных культурах HUVEC (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,2). Данные представлены как среднее значение экспериментов и стандартного отклонения (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Неокисленные ГЦ – обогащенные фрагменты п(рДНК) вызывают повышение уровня экспрессии всех трех генов ICAM1, SELE и VCAM1 в HUVEC через 3 часа (в 322 концентрации 50 нг/мл) 2,3 – 3 раза, окисление п(рДНК) снижает активирующее действие ГЦ-богатых фрагментов (рисунок 3.2.135). Вектор (рBR322), п(рДНК)окси и гДНКокси повышают в HUVEC незначительно только уровень экспрессии гена ICAM1 в 1,4 раза. Геномная неокисленная ДНК в большей степени, чем окисленная гДНК (в 1,8 раза) вызывала повышение уровня экспрессии гена ICAM1, вкДНК больного острым инфарктом миокарда стимулирует в 2 раза увеличение количества РНК гена ICAM в HUVEC (рисунок 3.2.135). Образцы гДНК, рBR322, п(рДНК)окси и гДНКокси не оказывали существенного влияния на уровень экспрессии генов SELE и VCAM1 в HUVEC (рисунок 3.2.135). Таким образом, ГЦ-обогащенные фрагменты вкДНК, оказывающие существенное влияние на транскрипцию генов NF-kB – сигнального пути стимулируют и транскрипционную активность молекул адгезии ICAM1, SELE и VCAM1. 3.2.22.8. ГЦ-обогащенная п(рДНК) активирует NF-kB - сигнальный путь в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров ГЦ-обогащенные фрагменты в составе вкДНК активируют TLR9 - сигнальный путь в лимфоцитах здоровых доноров (ЗД), что инициирует активацию NF-kB - сигнального пути. Мы исследовали изменение уровня экспрессии генов NF-kB- сигнального пути: NFKB1, M4K4 и RELA и генов – мишеней NF-kВ – IL6 и TNF через 3 и 24 часа инкубации лимфоцитов ЗД в присутствии ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) (рисунок 3.2.149). Рисунок 3.2.136. Уровень экспрессии генов MАР4K4, RELА, NFKB1, IL6 и TNFa в лимфоцитах ЗД через 3 и 24 часа после введения в среду культивирования неокисленных ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл Данные приведены относительно контроля – необработанных МСК того же донора спустя то же время культивирования и нормализованы по GAPDH. Приведены средние значения для лимфоцитов 4-х здоровых доноров, каждый эксперимент повторен 3 раза. Все значения достоверно отличаются от контроля по U-критерию Манна-Уитни (р<0,05). 323 Уровень экспрессии генов MАР4K4, RELА, NFKB1 повышен в среднем в 3 - 3, 5 раза через 3 часа после начала воздействия ГЦ-богатой п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл на лимфоциты ЗД и остается повышенным через 24 часа инкубации (рисунок 3.2.136). Уровень экспрессии гена IL6 повышается в 2 раза через 3 часа, и в 3,7 раза через 24 часа поле добавления фрагментов п(рДНК). Уровень экспрессии гена TNFa повышается через 3 часа воздействия п(рДНК), а через 24 часа снижается, превышая контрольные значения только в 1,7 раза (рисунок 3.2.149). IL6 относится к плейотропным цитокинам, опосредующим межклеточные взаимодействия. IL6 контролирует процессы роста и дифференцировки разных типов клеток, относится к провоспалительным цитокинам [Palucka et al., 2005]. Уровень IL6 в среде культивирования лимфоцитов определяли через 24 часа после воздействия фрагментов вкДНК (п(рДНК), гДНК, ДНК E.coli и рBR322, в концентрации 200 нг/мл). Рисунок 3.2.137. Уровень синтеза IL6 (А) и активность TNFa (Б) в среде культивирования лимфоцитов ЗД через 24 часа после добавления ГЦ-богатых фрагментов вкДНК: п(рДНК), рBR322, ДНК E.coli, гДНК. Приведены данные для лимфоцитов 4-х различных ЗД в 3-х независимых экспериментах. В - Активность TNFa среде культивирования лимфоцитов ЗД через 24 часа после добавления ГЦ-богатых фрагментов вкДНК и после добавления п(рДНК) на фоне инг-ОДН и хлорокина. Приведены данные для лимфоцитов 2-х различных ЗД в 3-х независимых экспериментах. (*) - значения достоверно отличаются от контроля по U-критерию Манна-Уитни (р<0,05). ГЦ-богатые фрагменты п(рДНК) стимулирует синтез значительно большего количества IL6 по сравнению с ДНК E.coli и ДНК вектора, гДНК не индуцирует синтез IL6 (рисунок 3.2.137. А). Активность TNFα в среде культивирования лимфоцитов ЗД определялась по степени лизиса клеток фибросаркомы мыши L-929 чувствительных к TNFα Калашниковой Е.М. [Ruff et al., 1981]. В качестве стандарта использовали 324 рекомбинантный TNFα человека. Через 24 часа культивирования лимфоцитов ЗД в присутствии ГЦ- богатой вкДНК в концентрации 200 нг/мл наблюдали увеличение активности TNFα. ДНК E.coli в большей степени стимулировала синтез TNFα, чем п(рДНК) (рисунок 3.2.137. Б). Таким образом, при действии на лимфоциты ГЦ-богатых фрагментов рДНК через 24 часа наблюдается сильная активация синтеза IL6 и слабая активация синтеза TNFα. Поскольку показано, что IL6 обладает способностью ингибировать секрецию TNFα [Schindler et al., 1990], более низкий уровень секреции TNFα в ответ на добавление ГЦ-богатой п(рДНК) к лимфоцитам может быть следствием активации сложной системы регуляции, активирующейся в присутствии вкДНК и возникать в результате сильной активации синтеза IL6. Для того, чтобы показать, что синтез TNFα инициируется ГЦ-богатыми фрагментами вкДНК через TLR9 – сигнальный путь, применили инг-ОДН (3мкг/мл), избирательно блокирующий TLR9 – сигнальный путь (2088, 15-звенный олигонуклеотид TCC TGG CGG GGA AGT) без изменения рН в эндосомах и хлорокин (chloroquine) в концентрации 2ммоля/л, который изменяет рН в эндосомах, где происходит связывание CpG – ДНК с TLR9. Изменение рН в эндосомах приводит к блокированию сигнальных путей всех рецепторов, расположенных на эндосомах. Хлорокин или инг-ОДН добавлялись за 30 минут до внесения п(рДНК) к лимфоцитам и активность TNFα измерялась через 24 часа после начала воздействия ГЦп(рДНК). Хлорокин и инг-ОДН полностью блокировали активность TNFα (рисунок 3.2.137. В). Таким образом, активация NF-kB – сигнального пути при действии ГЦ- богатой вкДНК индуцируется в результате инициации TLR9 - сигнального пути в лимфоцитах. 3.2.22.9. Активация экспрессии генов NF-kB – сигнального пути образцами окисленной и неокисленной вкДНК в MCF7 Мы проанализировали влияние образцов окисленной и неокисленной вкДНК на экспрессию 4-х генов NF-kB – сигнального пути в MCF7: M4K4F, МАР3К1, NFKB1 и RELA. Были также проанализированы гены цитокинов TNF и IL6, которые являются мишенями NF-kB. Через 2 часа после воздействия окисленных фрагментов вкДНК (гДНКокси и п(рДНК)окси) в среднем в 2 - 2,5 раза возрастает уровень экспрессии всех 4-х генов (рисунок 3.2.138). К 48 часам после добавления окисленных фрагментов вкДНК к среде культивирования MCF7 количество РНК генов M4K4F, МАР3К1, NFKB1 и RELA снижается и превышает уровень РНК этих генов в контрольных MCF7 в 1,3 – 1,5 раз ( рисунок 3.2.138). Уровень экспрессии генов M4K4F, МАР3К1, NFKB1 и RELA при 325 действии неокисленных фрагментов гДНК, п(рДНК) и рBR322 возрастает более медленно и только через 48 часов после добавления фрагментов увеличивается приблизительно в 1,5 раза (рисунок 3.2.138). Рисунок 3.2.138. Динамика изменения уровня экспрессии генов NF-kB сигнального пути в МСF7 окисленными и ГЦ-богатыми фрагментами ДНК (в концентрации 50 нг/мл; время воздействия указано на рисунке). Результат представлен как отношение экспрессии генов в стимулированных МСК к экспрессии генов в интактных МСF7. Данные представлены как среднее значение трех независимых экспериментов и стандартного отклонения (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,3). (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). По данным проточной цитометрии количество белка NF-kB (p65) в клетках MCF7 при действии гДНК и гДНКокси через 2 часа увеличивается в 1,5 раза (рисунок 3.2.139), через 48 часов уменьшается [Kostyuk et al., 2013]. Известно, что NF-kB (р65) активируется путем фосфорилирования, что играет ключевую роль в регуляции его транскрипционной активности и транслокации в ядро. Например, TNF стимулирует фосфорилирование NF- 326 kB по Ser529 (р65) с помощью казеинкиназы II [Lee et al., 2010]. Мы оценили количество MCF7, которые содержат фосфорилированный Ser529 (р65) (рисунок 3.2.139). Нами было показано с помощью метода проточной цитометрии, что гДНКокси приводит к увеличению доли клеток, которые содержат фосфорилированный Ser529 (р65), это подтверждает транскрипционную активность NF-kB [Lee et al., 2010] в MCF7 после воздействия окисленной вкДНК [Kostyuk et al., 2013]. Добавление неокисленных фрагментов гДНК к среде культивирования MCF7 не увеличивает долю клеток, содержащих фосфорилированный Ser529 (р65) [Kostyuk et al., 2013]. Рисунок 3.2.139. гДНКокси клетках MCF7. стимулирует активность фактора NF-kB в A, В - Средние значения интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных антителами к NF-kB (А) и к фосфорилированной форме NF-kB (В) при инкубации клеток с образцами неокисленной гДНК и окисленной гДНКокси в концентрации 50 нг/мл. А - время действия указано на рисунке. Б, В – время воздействия образцов ДНК – 2 часа. Б - Распределение интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных антителами к фосфорилированной форме NF-kB (зеленый цвет) или вторичными антителами, конъюгированными с FITC (серый цвет) R - Доля клеток, позитивных по фосфорилированному Ser529 р65 в общей численности популяции MCF7. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). Если клетки перед добавлением гДНКокси обрабатывали блокатором АФК (NAC), то в этом случае не наблюдали увеличения уровня фосфорилированной по Ser529 форме NF-kB по сравнению с контрольными клетками (рисунок 3.2.140) [Kostyuk et al., 2013]. Таким образом, можно предположить, что одной из причин активации NF-kB в присутствии внеклеточной окисленной ДНК является увеличение уровня АФК. 327 Рисунок 3.2.140. Увеличение уровня АФК является одной из причин активации NF-kB в присутствии внеклеточной окисленной вкДНК. А – Частота встречаемости клеток, позитивных по фосфорилированному Ser529 р65 в общей численности популяции MCF7. Б - Средняя интенсивность сигналов FL1 клеток, позитивных по фосфорилированному Ser529 р65. Клетки культивировали либо в отсутствие (темно-серые столбики) или в присутствии 0,15 мМ NAC (светло-серые столбики). (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р<0,05). Рисунок 3.2.141. Транслокация фактора NF-kB из цитоплазмы в ядро в клетках MCF7, через 2 часа после воздействия гДНКокси в концентрации 50 нг/мл. А – Клетки популяции MCF7, окрашенные антителами к р65, конъюгированными с FITC (увеличение x40) в контроле, при действии гДНК и гДНКокси, метод флуоресцентной микроскопии. Б – Графическое изображение доли клеток с ядерным расположением NF-kB в трех изученных культурах MCF7. (*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05). 328 Подтверждением активации NF-kB в MCF7 в присутствии гДНКокси является транслокация этого фактора из цитоплазмы в ядро, визуализируемая методом флуоресцентной микроскопии (рисунок 3.2.141) [Kostyuk et al., 2013]. В контроле NF-kB тестируется в цитоплазме MCF7. Через 2 часа после воздействия гДНКокси количество клеток с внутриядерной локализацией этого фактора возрастает с 12% до 56% (рисунок 3.2.141) [Kostyuk et al., 2013]. Геномная ДНК не оказывает существенного влияния на расположение NF-kB в клетках популяции MCF7. 3.2.22.10. Влияние окисленных фрагментов вкДНК на активность NF-kB – сигнального пути в фибробластах в условиях окислительного стресса Повышение уровня АФК в клетках приводит к активации NF-kB [Gloire et al., 2009]. Исследовали активность этого фактора транскрипции на фибробластах, выращиваемых в условиях окислительного стресса, при действии неокисленных фрагментов гДНК и окисленных фрагментов гДНКокси [Kostyuk et al., 2013]. Рисунок 3.2.142. Воздействие гДНКокси снижает активность NF-kB в HDF, культивируемых в бессывороточной среде. Клетки, выращиваемые в бессывороточной среде, обрабатывали гДНК или гДНКокси в течение 72 часов. Нижний ряд – фотографии фибробластов кожи (HDF) при длине волны возбуждения 480 нм (окраска DAPI), увеличение × 100. Клетки фиксировали формальдегидом, пермеабилизовали с помощью 0,1% Triton X-100 и окрашивали антителами к NF-kB (с использованием вторичных антител конъюгированных с FITC). При культивировании фибробластов кожи (HDF) и эмбриональных фибробластов (HEF) в присутствии 2% сыворотки, клетки экспрессируют относительно низкое количество NF-kB (рисунок 3.2.142). При культивировании HDF и HEF в бессывороточной среде уровень NF-kB (р65) существенно увеличивается и NF-kB регистрируется в ядре (рисунок 3.2.142). Добавление гДНК в концентрации 20 и 100нг/мл к бессывороточной среде культивирования HDF и HEF не изменяет уровня экспрессии или локализации NF-kB (р65) в клетках (рисунок 3.2.142 для HDF) [Kostyuk et al., 2013]. 329 Воздействие гДНКокси в концентрации 20 и 100 нг/мл приводит к снижению уровня p65 в большинстве клеток HDF и HEF, выращиваемых в среде без добавления сыворотки. При этом 5-10% клеток популяции HDF и HEF в присутствии гДНКокси в бессывороточной среде поддерживает относительно высокий уровень NF-kB (p65), однако при этом NF-kB (р65) расположен в цитоплазме и не наблюдается его транслокации в ядро ( рисунок 3.2.142 для HDF) [Kostyuk et al., 2013]. NF-kB (p65) активируется путем фосфорилирования, которое играет ключевую роль в регуляции его транскрипции и связано с ядерной транслокацией NF-kB. Методом проточной цитометрии количественно оценили долю клеток популяций HDF и HEF, которые содержат фосфорилированную по Ser529 форму NF-kB (р65). Было показано, что при культивировании HDF и HEF в среде без сыворотки происходит существенное увеличение доли клеток, содержащих фосфорилированную по Ser529 форму р65 (рисунок 3.2.143) [Kostyuk et al., 2013], что подтверждает транскрипционную активность NF-kB [Wang et al., 1998] в условиях окислительного стресса, вызванного недостатком питания при отсутствии сыворотки. Рисунок 3.2.143. гДНКокси снижает активность фактора NF-kB при длительном культивировании (72 часа) HDF и HEF в бессывороточной среде. А, В Распределение интенсивности флуоресценции HDF и HEF, окрашенных антителами к фосфорилированной форме NF-kB (S529 (p65) NF-kB). R - Доля клеток, позитивных по фосфорилированной форме р65 в общей численности популяции. Б, Г - Средние значения интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных антителами к фосфорилированной форме NF-kB при инкубации HDF и HEF клеток с образцами неокисленной гДНК и окисленной гДНКокси в концентрации 20 и 100 нг/мл, время действия 72 часа. Воздействие гДНК в концентрации 20 и 100 нг/мл в бессывороточной среде культивирования не меняет пропорцию HDF и HEF клеток, содержащих фосфорилированную форму р65 (по Ser529), а воздействие гДНКокси в концентрации 20 330 нг/мл уменьшает долю клеток, содержащих транскрипционно активный NF-kB [Kostyuk et al., 2013]. При действии гДНКокси в более высокой концентрации (100 нг/мл) эти эффекты были менее выражены (рисунок 3.2.143). Активация NF-kB приводит к увеличению уровня экспрессии провоспалительных цитокинов, в том числе TNFα и IL6 [Hayden et al., 2012]. Мы измерили концентрацию 2-х цитокинов - TNFα и IL6 в среде культивирования HDF и HEF при длительном культивировании клеток (72 часа) в бессывороточной среде в присутствии фрагментов окисленной и неокисленной ДНК (Рисунок 3.2.158) с помощью ИФА. Рисунок 3.2.144. Изменение содержания TNFα (А) и IL6 (Б, В) в среде культивирования без сыворотки HDF (А, Б) и HEF (В) при действии гДНК и гДНКокси в в концентрации 20 и 100 нг/мл, время действия 72 часа. Метод ИФА. (*) достоверно отличается от контроля, р <0,05, непараметрический U-тест. Методом ИФА показано, что в бессывороточной среде HDF секретируют TNFα в 3,5 раза больше, чем клетки, выращенные в среде, содержащей 2 % сыворотки. Инкубация в течение 72 часов HDF с гДНК (20 нг/мл) не влияет на уровни TNFα, в то время как воздействие гДНКокси в концентрации 20 и 100 нг/мл и гДНК в концентрации 100 нг/мл , приводит к снижению продукции TNFα более, чем в 2 раза (рисунок 3.2.144). Добавление гДНКокси в концентрации 20 и 100 нг/мл к бессывороточной среде культивирования HDF и HEF клеток приводит к снижению уровня синтеза IL6 в 1,5 - 2,0 раза, гДНК (20 нг/мл ), не влияет на уровень IL-6 (рисунок 3.2.144). При добавлении гДНК в концентрации 100 нг/мл к бессывороточной среде культивирования HDF и HEF, через 72 часа снижается уровень IL6 в HEF и не изменяется в HDF (рисунок 3.2.144). Таким образом, показано, что воздействие гДНКокси на фибробласты, культивируемые в условиях окислительного стресса, приводит к снижению активности 331 NF- kB – сигнального пути: снижается уровень p65 в клетках; уменьшается доля клеток, содержащих фосфорилированную форму NF-kB (p65) и отсутствует транслокация в ядро NF-kB. Зависимая от гДНКокси супрессия NF-kB – сигнального пути коррелирует с сопутствующим снижением секреции цитокинов TNFa и IL6 в клетках HDF и HEF, культивируемых длительное время (72 часа) в обедненной сывороткой среде в присутствии окисленных фрагментов гДНКокси. Таким образом, на разных типах клеток нами была показана активация NFkB – сигнального пути при воздействии ГЦ-богатой фракции вкДНК, окисленные фрагменты вкДНК также активируют NF-kB - сигнальный путь, но в меньшей степени и раньше, чем ГЦ-богатые фрагменты. В условиях окислительного стресса может наблюдаться блокирование этого пути фрагментами окисленной ДНК. 3.2.23. Активация фрагментами вкДНК NRF2 – сигнального пути Транскрипционный фактор Nrf2, ответственен за индуцибельную и конститутивную экспрессию ARE (antioxidant response element) - регулируемых генов [Pedruzzi et al., 2012]. Таким образом, Nrf2 может регулировать антиокислительные и противовоспалительные ответы клеток [Lau, et al., 2008]. Окислительный стресс вовлечен в патогенез и развитие различных заболеваний, АФК изменяют окислительно-восстановительный баланс клеток и через механизмы, чувствительные к окислению, регулируют экспрессию и активность транскрипционных факторов и регулируемых ими генов [Massy et al., 2009]. АФК активируют NF-kB – сигнальный путь, что приводит к повышению экспрессии большого количества провоспалительных цитокинов, таких как TNFa, IL 1, 2, 6, 12 и молекул адгезии. Цитокины могут инициировать синтез АФК, что образует замкнутый порочный круг между окислительным стрессом и продукцией провоспалительных цитокинов [Kim et al., 2010]. Прервать этот порочный круг может Nrf2, освобожденный из комплекса с его ингибитором Keap1 [Liu et al., 2008]. Активированный свободный Nrf2 транслоцируется в ядро и активирует гены, которые кодируют ферменты детоксикации фазы II и антиокислительные ферменты, которые включают хинон NADPH оксидоредуктазу 1 (NQO1), S-глутатнонтрансферазу (GST), гемоксигеназу-1 (HO-1), глутатнонпероксидазу (GSH-Px), глутаматцистеин лигазу (GCL) и пероксиредуксин I (PRX I), которые играют важную роль в защите клеток, способствуя удалению АФК [Kim et al., 2010; Singh et al., 2010]. Система Nrf2-Keap1 признана окислительного стресса [Liu et al., 2008]. провоспалительных цитокинов, главным механизмом защиты клеток от Кроме того, Nrf2 ингибирует экспрессию хемокинов, молекул адгезии, матричных металлопротеиназ (MMP-9), циклоксигеназы-2 и iNOS [Kim et al., 2010]. Nrf2 модулирует 332 каскад противовоспалительных цитокинов с помощью ингибирования NF-kB и регулирует антиокислительные клеточные ответы [Liu et al., 2008]. 3.2.23.1. вкДНК активирует NRF2 – сигнальный путь в МСК Чтобы понять причины изменения скорости продукции АФК в МСК в присутствии образцов окисленной и неокисленной вкДНК, мы исследовали изменения в количестве мРНК нескольких генов, которые принимают участие в раннем клеточном ответе на изменение уровня АФК (рисунок 3.2.145). Рисунок 3.2.145. Динамика изменения уровня экспрессии генов NRF2сигнального пути окисленными и ГЦ-богатыми фрагментами ДНК (50 нг/мл; время воздействия указано на рисунке). Результат представлен как отношение экспрессии генов в стимулированных МСК по отношению к экспрессии генов в интактных МСК. Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на разных культурах МСК (2303, 2330 или 2331). Представленные данные – средние значения ± SD для трех культур в трех повторах. (*) – достоверные различия с контрольными клетками, Uкритерию Манна-Уитни (р <0,05). 333 МСК инкубировали с 50 нг/мл неокисленной (вкДНК (HUVEC), гДНК, п(рДНК), вкДНК РА) или окисленными образцами вкДНК (вкДНК (HUVEC), вкДНК РМЖ, гДНКокси, п(рДНК)окси) в течение 20 минут, 1, 2, 3, 24 и 72 часов. Методом RT-PCR определяли количество мРНК генов в экспонированных клетках относительно контроля. Стресс-активированный фактор транскрипции NRF2 является центральным медиатором системы антиоксидантного ответа [Zheng et al., 2011]. NRF2 управляет базальной и индуцибельной активностью антиоксидантной защиты клетки [Lau et al., 2008]. Окисленные образцы ДНКокси - вкДНКокси (HUVEC), вкДНК РМЖ, гДНКокси, п(рДНК)окси стимулировали транскрипцию гена NRF2 в МСК быстрее и более эффективно, чем образцы неокисленной вкДНК. В результате воздействия на МСК образцов вкДНКокси (HUVEC); гДНКокси и п(рДНК)окси количество мРНК гена NRF2 через 1 час инкубации увеличивалось в 5,4; 3,6 и 2,7 раз; через 2 часа инкубации возрастало в 11,2; 7,6 и 5,3 раза; через 3 часа - в 6,5; 2,9 и 6,7 раз, соответственно (рисунок 3.2.145). ВкДНК больных РМЖ содержит большое количество окисленных оснований и изменяла уровень экспрессии гена NRF2 так же, как окисленная вкДНК: уровень экспрессии NRF2 в МСК увеличивался в 3,5; 5,2 и 5,1 раз через 1, 2 и 3 часа после добавления вкДНК РМЖ в среду культивирования клеток [Loseva et al., 2012]. Через 24 часа после начала воздействия окисленных образцов вкДНК уровень экспрессии гена NRF2 возвращается к контрольным значениям. При добавлении неокисленных образцов ДНК к культурам МСК экспрессия гена NRF2 возрастала медленнее и в меньшей степени. После добавления гДНК и вкДНК (HUVEC) к культивируемым МСК уровень экспрессии гена NRF2 через час увеличивается только в 1,4 - 1,6 раза; через 3 и 24 часа возрастает в 1,8 - 2 раза, снижаясь до контрольного уровня через 72 часа после добавления образцов вкДНК (рисунок 3.2.145) [Loseva et al., 2012]. ГЦ-богатые фрагменты увеличивали уровень экспрессии гена NRF2 в МСК в большей степени, чем гДНК: через 2 часа культивирования МСК в присутствии п(рДНК) и вкДНК РА количество РНК гена NRF2 увеличивалось в 1,9 и 2,6 раз, через 3 часа уровень экспрессии гена NRF2 возрастает в 2,7 и 3,2 раза, а через 24 часа достигает максимальных значений и превышает уровень контроля в 3,6 и 3,8 раз, соответственно (рисунок 3.2.145) Keap1 является цитозольным ингибитором NRF2, который связывает NRF2 в цитоплазме и сохраняет его в неактивном состоянии [Kansanen et al., 2011]. И окисленные, и неокисленные образцы ДНК стимулировали повышение экспрессии гена KEAP1. Наиболее сильно повышалась экспрессия гена KEAP1 в МСК в ответ на добавление образцов окисленной вкДНК: повышение уровня экспрессии гена КЕАР1 в 3-5 раз 334 регистрировалось уже через 20 минут - 1 час после добавления окисленной вкДНК (рисунок 3.2.145). Через 3 часа после начала воздействия окисленной вкДНК экспрессия гена КЕАР1 достигала своих максимальных значений – ее уровень возрастал в 5-6 раз, что сопровождалось супрессией транскрипции гена NRF2. При действии окисленных фрагментов уровень экспрессии КЕАР1 оставался повышенным в 2 - 3 раза и через 24 часа после их добавления в среду культивирования. Через 1 час после добавления в среду культивирования МСК неокисленных фрагментов гДНК и вкДНК (HUVEC) уровень экспрессии КЕАР1 повышался в среднем в 2 раза и оставался повышенным в течение 24 часов (рисунок 3.2.145). Вероятно, длительная повышенная экспрессия КЕАР1 способствует поддержанию гена NRF2 в неактивном состоянии. При действии ГЦ-богатых фрагментов экспрессия гена КЕАР1 возрастала в меньшей степени, достигая максимума через 3 - 24 часа после начала воздействия. Более поздняя активация NRF- сигнального пути ГЦ-богатыми фрагментами по сравнению с окисленными фрагментами вкДНК коррелирует с более поздней стимуляцией транскрипции гена КЕАР1, что, вероятно, связано со сложной регуляцией ответа клетки на присутствие вкДНК с измененными свойствами в среде культивирования МСК. Основным событием, отражающим активацию антиоксидантного ответа, является транслокация транскрипционного фактора NRF2 в ядро [Pedruzzi et al., 2012]. Для анализа влияния окисленной вкДНК на локализацию NRF2 в МСК, был использован метод флуоресцентной микроскопии с применением антител к NRF2 (рисунок3.2.146.В). Для оценки уровня экспрессии белка NRF2 использовали метод проточной цитометрии (рис 3.2.146.Б). Контрольные клетки содержат небольшое количество белка NRF2. Добавление образцов гДНК или гДНКокси приводит к увеличению уровня экспрессии NRF2 и на уровне белка, и на уровне гена (рисунок 3.2.145, 3.2.146.А,Б). Увеличение уровня мРНК гена NRF2 носит преходящий характер и достигает максимума через 3 ч после начала экспозиции (рисунок 3.2.145.). Уровень белка NRF2 через 3 часа после добавления гДНК и гДНКокси увеличивается в 1,5 раза. Не обнаружили разницы в ответе МСК на окисленные и неокисленные фрагменты в культурах с миссенс-мутацией L145p в 5-ом экзонегена р53 (и без мутации (рисунок 3.2.146.В).Распределение NRF2 внутри клеток МСК, обработанных гДНК (50 нг/мл, 3 ч) аналогично распределению NRF2 в контрольных клетках, в то время как добавление окисленных фрагментов гДНКокси приводит к транслокации NRF2 в ядро в большинстве клеток (рисунок 3.2.147). Таким образом, увеличение концентрации 335 вкДНК стимулирует экспрессию мРНК и белка NRF2, в то время как присутствие во внеклеточной среде окисленной ДНК индуцирует транслокацию белка NRF2 из цитоплазмы в ядро. Рискнок 3.2.146. Уровень белка NRF2 в МСК, метод проточной цитометрии. А – частота клеток с высоким уровнем экспрессии NRF2. Б, Г -Распределение клеток по интенсивности флуоресценции FL1 ( NRF2 -FITC ) при действии окисленных и неокисленных образцов вкДНК ( 50 нг/мл , 3 ч ) на культуру МСК с мутацией в гене BRCA (5382insC),(Г) и без мутации (Б) . В, Д - среднее значение интенсивности флуоресценции клеток по сравнению с фоном. Средние значения от трех повторяющихся экспериментов на трех разных культурах МСК. Рисунок 3.2.147. Внутриклеточная локализация NRF2 в МСК в присутствии гДНК и гДНКокси ( 50 нг/мл , 3 ч, увеличение Х40). Клетки фиксировали с помощью 3% PFA , обрабатывались 0,1 % Тритоном Х-100 в PBS, а затем инкубировали с антителами к NRF2 и после отмывки – с FITC- конъюгированными козьими антителами к IgG. 336 NRF2 является транскрипционным фактором системы антиоксидантного ответа клеток. Под действием окисленных или неокисленных образцов ДНК увеличивается экспрессия NRF2 и на уровне мРНК, и на уровне белка. Однако культивирование МСК 1 3 ч в присутствии окисленной ДНК приводит к транслокации NRF2 в ядро, и это изменение локализации NRF2 идет параллельно с уменьшением уровня АФК, в то время как в присутствии неокисленной ДНК внутриклеточный уровень АФК в МСК остается увеличенным в течение длительного времени, несмотря на активацию NRF2. Это наводит на мысль, что в МСК окисленная и неокисленная ДНК стимулируют различные сигнальные пути. Очевидно, должны существовать специфические рецепторы для окисленной ДНК, активация которых вызывает транслокацию NRF2. 3.2.23.2. Активация NRF2- сигнального пути фрагментами вкДНК в HUVEC Nrf2 – сигнальный путь защищает эндотелиальные клетки от действия провоспалительных цитокинов через супрессию p38/VCAM1- и NF-kB - сигнального пути [Wakabayashi et al., 2010]. В большинстве работ Nrf2 рассматривается как антагонист NFkB [Liu et al., 2008], однако, в некоторых исследованиях отмечается увеличение уровня провоспалительных цитокинов при активации Nrf2 [Barajas et al., 2011]. Мы исследовали активацию NRF2 - сигнального пути в HUVEC при действии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК во времени. Наиболее сильно и быстро активируют NRF2 - сигнальный путь окисленные фрагменты вкДНК. Через 1 час после добавления гДНКокси в среду культивирования HUVEC уровень экспрессии гена NRF2 возрастает в 2,5 раза, через 3 часа уровень экспрессии гена NRF2 достигает максимума и увеличивается в 3,3 раза по сравнению с контролем (рисунок 3.2.148). Уровень экспрессии гена NRF2 при инкубации с окисленными образцами гДНКокси снижается медленно и через 24 и 48 часов остается увеличенным в 2,6 и 1,8 раз по сравнению с контролем. При действии ГЦ-богатых фрагментов вкДНК на клетки популяции HUVEC уровень экспрессии гена NRF2 повышается в 2,5 раза через 3 часа, к 24 и 48 часам уровень экспрессии NRF2 остается повышенным в 1,8 и 1,4 раза и снижается к 72 часам до уровня контрольных значений (рисунок 3.2.148). NRF2 – сигнальный путь активируется и при действии неокисленных фрагментов гДНК и ГЦ-обогащенной плазмиды, однако уровень экспрессии гена NRF2 повышается в 2-3 раза только через 24 и 48 часов после начала воздействия гДНК и pBR322 (рисунок 3.2.148). Контроль за активацией NRF2 – сигнального пути осуществляется через связывание NRF2 с молекулой KЕАР1, которая промотирует убиквитинирование и протеасомную деградацию Nrf2 [Kansanen et al., 2011]. Уровень экспрессии гена КЕАР1 возрастает в HUVEC при действии как окисленных, так и неокисленных фрагментов 337 вкДНК. Максимальное повышение (в 2,5 - 4 раза) уровня экспрессии гена КЕАР1 при действии окисленных образцов гДНКокси наблюдается через 3 часа, неокисленных образцов п(рДНК) и рBR322– через 24 часа, гДНК – через 48 часов после начала воздействия (рисунок 3.2.148). Рисунок 3.2.148. Динамика изменения уровня экспрессии генов NRF2сигнального пути в HUVEC окисленными и ГЦ-богатыми фрагментами ДНК (50 нг/мл; время воздействия указано на рисунке). Результат представлен как отношение экспрессии генов в стимулированных HUVEC к экспрессии генов в интактных HUVEC (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,3). Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на разных культурах HUVEC. Представленные данные – средние значения ± SD для трех культур в трех повторах. (*) – достоверные различия с контрольными клетками, U-критерию Манна-Уитни (р <0,05). 338 Активация NRF2 – сигнального пути сопровождается транслокацией транскрипционного фактора NRF2 в ядро, где он активирует гены, кодирующие ферменты детоксикации фазы II и антиокислительные ферменты, которые играют важную роль в защите клеток, способствуя удалению АФК [Kim et al., 2010]. С помощью флуоресцентной микроскопии проанализировали внутриклеточную локализацию NRF2 в популяции HUVEC. HUVEC инкубировали с окисленными и неокисленными образцами вкДНК в течение 24 часов, затем клетки фиксировали и окашивали антителами к NRF2, конъюгированными с FITC. В контроле и при действии pBR322 NRF2 локализован в цитоплазме НUVEC. Через 24 часа после начала воздействия ГЦ-богатых последовательностей п(рДНК) и вкДНК больного ОИМ1, содержащей много неокисленных ГЦ-пар, Nrf2 локализован, в основном, в ядре HUVEC (рисунок 3.2.149). Рисунок 3.2.149. Внутриклеточная локализация NRF2 в HUVEC в присутствии окисленных и неокисленных образцов вкДНК ( 50 нг/мл , 24 ч ). Метод флуоресцентной микроскопии (увеличение Х40). Клетки фиксировали с помощью 3% PFA , обрабатывались 0,1 % Тритоном Х-100 в PBS, а затем инкубировали с антителами к NRF2 конъюгированными с FITC. 339 Окисленная гДНКокси активирует NRF2 – сигнальный путь в более раннее время, транслокация NRF2 в ядро носит транзиторный характер, и к 24 часам после начала воздействия гДНКокси и вкДНК ОИМ2 (содержащей 400/1 млн. нуклеозидов) NRF2 обнаруживается, в основном, в цитоплазме и, частично, в ядре HUVEC (рисунок 3.2.149). Таким образом, как окисленные, так и неокисленные образцы вкДНК активируют в HUVEC NRF2 – сигнальный путь. Однако окисленные фрагменты вкДНК стимулируют NRF2 - сигнальный путь в HUVEC раньше и большей степени, чем ГЦ- богатые фрагменты. 3.2.23.3. Окисленные и неокисленные образцы вкДНК снижают активность транскрипционного фактора NRF2 и активируют транскрипционный фактор STAT3 в клетках MCF7 Поскольку NF-E2-related factor 2 принимает участие в развитии адаптивного ответа в мезенхимных стволовых клетках и эндотелиоцитах, которые культивировали в присутствии гДНКокси, мы исследовали активацию NRF2 – сигнального пути и в раковых клетках MCF7. При действии гДНКокси на MCF7 через 2 часа увеличивается количество мРНК NRF2 в 2,3 раза (рисунок 3.2.150). Рисунок 3.2.150. Изменение уровня экспрессии генов NRF2-сигнального пути в MCF7 окисленными и ГЦ-богатыми фрагментами ДНК (в концентрации 50 нг/мл; время воздействия указано на рисунке). Результат представлен как отношение экспрессии генов после добавления фрагментов к экспрессии генов в интактных MCF7 (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,3).. Представленные данные – средние значения ± SD для 3-х экспериментов. (*) – достоверные различия с контрольными клетками по U-критерию (р <0,05). 340 Параллельно, в в 3,5 раза повышается уровень экспрессии гена KEAP1, белок которого образует комплекс с NRF2 в цитоплазме, блокируя активность этого транскрипционного фактора [Pedruzzi et al., 2012]. В 1,8 раз увеличивается экспрессия гена NRF2 при инкубации MCF7 c фрагментами рДНК. Уровень экспрессии гена КЕАР1 при этом не изменяется (рисунок 3.2.150). С помощью метода проточной цитометрии было показано, что количество белка NRF2 в MCF7 практически не изменяется при действии гДНК или гДНКокси (рисунок 3.2.151). Рисунок 3.2.151. гДНК и гДНКокси (50 нг/мл, 2 часа) снижают активность транскрипционного фактора NRF2 в клетках MCF7. A - средние значения интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных антителами к NRF2, время действия показано на рисунке. Б – Частота клеток с ядерным расположением NF-kB в MCF-7. В – Локализация NRF2 в клетках MCF-7, через 2 часа после воздействия гДНК и гДНКокси в концентрации 50 нг/мл, данные флуоресцентной микроскопии. Клетки MCF7 окрашены антителами к р65, конъюгированными с FITC (увеличение x40). 341 В контрольных клетках белок NRF2 присутствует и в ядре (～50% клеток), и в цитоплазме (рисунок 3.2.151.B). В присутствии гДНК доля клеток с ядерным содержанием NRF2 снижается в 2 раза по сравнению с контролем; при действии гДНКокси на MCF7 мы наблюдали локализацию фактора исключительно в цитоплазме, что говорит о блокировании активности NRF2 – сигнального пути при действии окисленной вкДНК в MCF-7. 3.2.23.4. Окисленные вкДНК активируют NRF2 – сигнальный путь в фибробластах При культивировании в бессывороточной среде фибробласты находятся в условиях голодания и хронического окислительного стресса. При добавлении гДНКокси или гДНК в среду культивирования, не содержащую сыворотки, количество мРНК NRF2 в фибробластах кожи HDF увеличивается в 3 - 4,5 раза (рисунок 3.2.152, А). Количество РНК KEAP1 - ингибитора NRF2 увеличивается по сравнению с контролем в 3 раза только при действии 100 нг/мл гДНКокси; гДНК и гДНКокси в низкой концентрации (20 нг/мл) повышали уровень экспрессии гена КЕАР незначительно – менее, чем в 1,5 раза (рисунок 3.2.152. Б). Рисунок 3.2.152. А, Б - Экспрессия гена NRF2 (А) и КЕАР (Б) в HDF при действии гДНК и гДНКокси (20 и 100 нг/мл; 72 часа). В - средние значения интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных антителами к NRF2, при действии гДНК и гДНКокси (20 и 100 нг/мл; 72 часа), метод проточной цитометрии. Представленные данные – средние значения ± SD для 3-х экспериментов. (*) – достоверные различия с контрольными клетками по U-критерию Манна-Уитни (р <0,05). Методом проточной цитометрии показано, что общий уровень флуоресценции клеток, окрашенных с помощью антител к NRF2, увеличивается через 72 часа после 342 воздействия гДНК в 2,3 – 2,8 раза, после воздействия гДНКокси в концентрации 20 и 100 нг/мл - в 2,5 и 4,5 раза, соответственно (рисунок 3.2.152.В) Методом флоуресцентной микроскопии проанализирована внутриклеточная локализация NRF2 при действии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК. При культивировании HDF в среде, содержащей 2%-ную сыворотку, почти все клетки экспрессируют Nrf2 в ядрах (рисунок 3.2.153), в то время как в бессывороточной среде NRF2 – сигнальный путь супрессирован из-за локализации NRF2 в цитоплазме клеток. Воздействие как гДНК, так и гДНКокси приводит к перемещению NRF2 в ядро HDF (рисунок 3.2.153.А), что говорит об активации данного сигнального пути. Таким образом, в условиях окислительного стресса любые фрагменты вкДНК активируют NRF2 – сигнальный путь. Повышение концентрации вкДНКокси приводит к большей активации NRF2 – сигнального пути. Рисунок 3.2.153. Воздействие гДНКокси активирует NRF2 – сигнальный путь в HDF, культивируемых в бессывороточной среде. Клетки обрабатывали гДНК или гДНКокси в течение 72 часов. Нижний ряд –HDF при длине волны возбуждения 480 нм (окраска DAPI), увеличение × 100. Клетки фиксировали ПФА, пермеабилизовали с помощью 0,1% Triton X-100 и окрашивали антителами к NRF2 (с использованием вторичных антител конъюгированных с FITC). 3.2.23.5 Изменение уровня экспрессии гена SOD1 при действии ГЦ-богатых и окисленных ДНК в разных типах клеток Cu/Zn супероксиддисмутаза (SOD1) представляет собой растворимый белок, катализирущий реакцию дисмутации продуктов NOX4 - супероксидных радикалы в менее активные соединения - молекулярный кислород и перекись водорода [Costa et al., 2013]. Этот процесс позволяет регулировать в клетках уровень АФК [Milani et al., 2013]. SOD1 играет важную роль в таких заболеваниях, как сердечная недостаточность, рак, сахарный диабет, синдромом Дауна и боковой амиотрофический склероз [Glasauer et al., 2013; Costa et al., 2013; Nanou et al., 2013]. Было показано, что NRF2 контролирует экспрессию SOD1 343 на уровне гена и белка путем непосредственной индукции транскрипции [Milani et al., 2013]. Поскольку показано, что в ответе на окислительный стресс в МСК задействован NRF2 – cигнальный путь, мы исследовали изменение уровня экспрессии гена SOD1 в МСК при действии ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК. И окисленные, и неокисленные образцы вкДНК стимулировали в МСК транскрипцию гена SOD1, участвующего в антиокислительном ответе клеток. Максимум уровня экспрессии гена SOD1 при действии как окисленных, так и неокисленных фрагментов вкДНК отмечался через 2 часа инкубации МСК с фрагментами вкДНК (рисунок 3.2.154). Рисунок 3.2.154. Уровень экспрессии гена SOD1 в МСК при действии вкДНК. Образцы ДНК были добавлены к МСК в концентрации 50 нг/мл. Время действия вкДНК 20 минут, 1, 2, 3 и 24 часа. Гистограммы отражают относительные уровни экспрессии по сравнению с контрольными клетками (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,3). Представленные данные – средние значения ± SD для трех культур в трех повторах. (*) – достоверные различия с контрольными клетками, по Uкритерию Манна-Уитни (р <0,05). И окисленные, и неокисленные образцы вкДНК стимулировали в МСК транскрипцию гена SOD1. Максимум уровня экспрессии гена SOD1 отмечался через 2 часа инкубации МСК с вкДНК (рисунок 3.2.154). Неокисленные ГЦ-богатые фрагменты п(рДНК) и вкДНК среды культивирования HUVEC стимулировали повышение уровня экспрессии гена SOD1 в 4 раза, в то время как окисленная вкДНК (вкДНКокси(HUVEC), гДНКокси, п(рДНК)окси) вызывали повышение уровня экспрессии гена SOD1 только в 2 раза. ВкДНК больных РМЖ стимулирует повышение уровня РНК SOD1 в МСК через 2 часа инкубации более, чем в 5 раз (рисунок 3.2.154). Это объясняется как кумулятивным 344 действием окисленных и ГЦ-богатых фрагментов в составе вкДНК РМЖ, так и более сложными модификациями реальной вкДНК по сравнению с модельными образцами. В результате активации NRF2 – сигнального пути в HUVEC при действии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК может изменяться экспрессия гена SOD1. Мы обнаружили, что как ГЦ-богатая п(рДНК), так и окисленные фрагменты гДНК в концентрации 50 нг/мл вызывают увеличение количества мРНК SOD1 (рисунок 3.2.155). Окисленные фрагменты вкДНК повышают уровень экспрессии гена SOD1 через 3 часа инкубации в 3,5 раза [Костюк с соавт., 2010]. Через 24 часа после добавления гДНКокси к HUVEC уровень экспрессии гена SOD1 остается повышенным в 2,5 раза, снижаясь к 48 часам после начала воздействия гДНКокси (рисунок 3.2.155). Рисунок 3.2.155. Изменение количества РНК SOD1 в клетках HUVEC в присутствии 50 нг/мл различных образцов ДНК. Время культивирования указано на рисунке. Гистограммы отражают относительные уровни экспрессии по сравнению с контрольными клетками (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,4). Средние значения ± SD для трех культур в трех повторах. (*) – достоверные различия с контрольными клетками, по U-критерию (р <0,05). Повышение уровня экспрессии гена SOD1 коррелирует с увеличением активности NRF2, поскольку SOD1 активируется в результате инициации фрагментами окисленной вкДНК NRF – сигнального пути. ГЦ-богатые фрагменты п(рДНК) увеличивают уровень экспрессии гена SOD1 уже через 1ч после добавления в среду культивирования HUVEC уровень экспрессии гена SOD1 в 3 раза, через 3 часа – в 2,7 раза, а через 24 – в 1,7 раза (рисунок 3.2.155). NRF2 – сигнальный путь при действии ГЦ-богатых фрагментов активируется позже – экспрессия NRF2 возрастает только к 3 часам после начала воздействия ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК), поэтому, вероятно, активация SOD1 неокисленными ГЦ-богатыми фрагментами вкДНК происходит не только через NRF2 - 345 сигнальный путь. Возрастание уровня экспрессии гена SOD1 при действии неокисленной гДНК и рBR322 наблюдается только через 48 часов после начала воздействия и совпадает с увеличением экспрессии гена NRF2. Таким образом, активация окислительных процессов в HUVEC, связанных с синтезом АФК, включает механизмы защиты от чрезмерного окисления [Костюк с соавт., 2010]. Чем больше стимулируется окислительный стресс, обусловленный увеличением экспрессии NOX4, тем активнее экспрессируется мРНК SOD1, вероятно, это необходимо для утилизации чрезмерного количества АФК [Костюк с соавт., 2010]. ВкДНК, особенно окисленные фрагменты в составе вкДНК, при действии на клетки MCF7 блокирует активность NRF2 – сигнального пути: мы наблюдали кратковременную подкрепленную стимуляцию наработкой экспрессии белкового гена NRF2 продукта. фрагментами Отсутствие вкДНК, активации не NRF2 сопровождается отсутствием активации транскрипции гена SOD1 при воздействии окисленных и ГЦ-фогатых фрагментов вкДНК на MCF7 (рисунок 3.2.156). и Рисунок 3.2.156. Изменение количества РНК SOD1 в MCF7 в присутствии 50 нг/мл различных образцов ДНК. Время культивирования указано на рисунке. Гистограммы отражают относительные уровни экспрессии по сравнению с контрольными клетками (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,4). Представленные данные – средние значения ± SD для трех культур в трех повторах. (*) – достоверные различия с контрольными клетками (р <0,05). При действии как окисленных, так и неокисленных вкДНК на культивируемые в условиях хронического окислительного стресса фибробласты активируется NRF2 – сигнальный путь и происходит транслокация транскрипционного фактора NRF2 в ядро клеток. Чтобы подтвердить, что перемещение Nrf2 активирует гены-мишени NRF2 – сигнального пути, мы проанализировали уровень экспрессии гена SOD1, промотор которого регулируется NRF2 [DeNicola, 2011]. 346 Рисунок 3.2.157. Изменение количества РНК SOD1 в HDF через 72 часа культивирования в среде без сыворотки в присутствии 20 и 100 нг/мл различных образцов ДНК. Cредние значения (± SD) для 3-х экспериментов. (*) р <0,05. Воздействие окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК (20 нг/мл) в течение 72 часов на фибробласты кожи человека, культивируемые в условиях окислительного стресса, приводит к увеличению уровня экспрессии гена SOD1 (рисунок 3.2.157). Мы обнаружили, что гДНК является более сильным стимулятором транскрипции гена SOD1, чем гДНКокси. Неокисленная гДНК ( 20 и 100 нг/мл) повышала уровень экспрессии гена SOD1 в фибробластах через 72 часа инкубации в 2 – 2,5 раза, окисленные фрагменты гДНКокси стимулировали повышение экспрессии гена SOD1 только в концентрации 20 нг/мл. ДНКокси в высокой концентрации (100 нг/мл) блокировала транскрипцию гена SOD1 [Kostyuk et al., 2013]. Таким образом, участки, содержащие окисленные основания в составе вкДНК, возможно, блокируют стимулирующее действие неокисленных районов вкДНК на экспрессию гена SOD1. 3.2.24. Активация STAT3 - сигнального пути фрагментами вкДНК в разных типах клеток Активация транскрипционного фактора NF-kB может приводить к перекрестной активации фактора транскрипции STAT3. Механизмов, через которые могут взаимодействовать факторы транскрипции, описано много. Одним из вариантов взаимодействия между факторами транскрипции NF-kB и STAT3 может быть связывание с промоторной областью друг друга, что приводит к взаимной активации сигнальных путей, регулируемых этими факторами [Mantovani, 2010]. STAT3 - один из семи белков семейства STAT, охарактеризованных в настоящее время у млекопитающих, гиперэкспрессия STAT3 обнаруживается в большинстве клеточных линий рака человека и в опухолевых тканях [Kamran et al., 2013]. В покоящихся клетках STAT3 находится в цитоплазме в неактивном состоянии, STAT3 347 активируется фосфорилированием остатка тирозина в положении 705 киназами семейства JAK [Kamran et al., 2013]. Фосфорилированный STAT3 образует гомо- или гетеродимеры с другими белками STAT. Димеры STAT3 перемещаются в ядро и связываются с промотерными областями генов- мишеней [Sellier et al., 2013]. STAT3 – сигнальный путь усиливает активность циклина D1 и экспрессию cMyc, способствует ускорению и прогрессии клеточного цикла [Sellier et al., 2013]. Кроме того, передача сигналов STAT3 обеспечивает выживаемость и подавляет апоптоз через экспрессию Bcl2, BclxL, MCL1, и cIAP2 [Sellier et al., 2013]. STAT3 модулирует секрецию провоспалительных цитокинов: IL-6 и TNF и является прямым активатором транскрипции гена VEGF [Sellier et al., 2013]. Исследовали активацию транскрипционного фактора STAT3 в МСК при действии окисленных и ГЦ - богатых фрагментов вкДНК. 3.2.24.1. Активация экспрессии STAT3 фрагментами вкДНК в МСК И окисленные, и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК увеличивали уровень экспрессии гена STAT3 в МСК в 2 - 2,5 раза уже через 3 часа инкубации. ВкДНК больных ОИМ и РМЖ увеличивала уровень экспрессии гена STAT3 в 1,7 – 1,8 раза (рисунок3.2.158.А). Р исунок 3.2.158. Динамика изменения уровня экспрессии STAT3 окисленными и ГЦбогатыми ДНК в концентрации 50 нг/мл в первые сутки инкубации (время воздействия указано на рисунке) – (А) и спустя 7 суток (Б). Результат представлен как отношение экспрессии генов в стимулированных МСК по отношению к экспрессии генов в интактных МСК (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,3). Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на разных культурах МСК. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения(р <0,05). Неокисленные гДНК, вкДНК(МСК) и pBR322 также стимулировали повышение уровня экспрессии гена STAT3 в 1,5 – 1,7 раза за счет увеличения концентрации вкДНК в 348 среде культивирования МСК. Через 24 часа после добавления окисленных фрагментов вкДНК (вкДНК(МСК)окси и гДНКокси) и образцов вкДНК, содержащих окисленные основания (вкДНК РМЖ и вкДНК ОИМ) экспрессия гена STAT3 увеличивалась в 2,4 – 3 раза (рисунок 3.2.158.А). ГЦ-богатые фрагменты п(рДНК) и вкДНК(МСК) через 24 часа культивирования увеличивали уровень экспрессии гена STAT3 в 2,2 – 2,3 раза, неокисленные образцы гДНК и pBR322 индуцировали повышение уровня экспрессии гена STAT3 через 24 часа инкубации только в 1,5 раза (рисунок3.2.158.А). ВкДНК больных ОИМ и РМЖ, содержащая и окисленные, и ГЦ-богатые последовательности вкДНК, также как модельные фрагменты окисленной гДНКокси и фрагменты ГЦ-богатой п(рДНК), стимулировали повышение уровня экспрессии гена STAT3 спустя 7 суток культивирования в 2 – 2, 5 раза (рисунок 3.2.158.Б). Повышение концентрации вкДНК за счет добавления фрагментов неокисленной гДНК и pBR322 не изменяло уровень экспрессии гена STAT3 через 7 суток инкубации (рисунок 3.2.158 Б). Таким образом, в первые сутки культивирования МСК в присутствии фрагментов вкДНК возрастает уровень экспрессии гена STAT3. Наиболее сильно (в 2-3 раза) уровень экспрессии гена STAT3 возрастает через 24 часа инкубации МСК в присутствии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов. Экспрессия гена STAT3 сохраняется повышенной при культивировании МСК в присутствии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов в течение длительного времени (7 суток). 3.2.24.2. Активация STAT3 - сигнального пути фрагментами вкДНК в HUVEC Путь, активирующий ядерный транскрипционный фактор NF-kB, играет существенную роль при действии окисленных и, особенно, ГЦ-богатых фрагментов на HUVEC. IL6, экспрессирующийся в результате активации NF-kB – сигнального пути, может служить триггером для фосфорилирования и димеризации STAT3 и индуцировать его перемещение в ядро [Kamran et al., 2013]. В HUVEC транскрипционный фактор STAT3 не только индуцирует экспрессию генов семейства Bcl2, но и может служить активатором транскрипции гена VEGF - ключевого медиатора ангиогенеза. Через 24 часа инкубации HUVEC в присутствии образцов окисленной и неокисленной вкДНК отмечалось повышение уровня экспрессии гена транскрипционного фактора STAT3 в 1,5 – 2,5 раза, причем неокисленные образцы гДНК служили более сильными стимуляторами транскрипции гена STAT3 (рисунок 3.2.159). Исследовали влияние образцов окисленной и неокисленной ДНК на уровень экспрессии белка STAT3 в растущей популяции HUVEC. Образцы ДНК добавляли через 2 часа после прикрепления клеток к пластику, HUVEC культивировались в присутствии 349 вкДНК в период активного роста. Уровень белка STAT3 анализировали с использованием антител к STAT3 через 3 суток после добавления фрагментов. Рисунок 3.2.159. Динамика изменения уровня экспрессии STAT3 в HUVEC в присутствии вкДНК (50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке). Результат представлен как отношение экспрессии генов в стимулированных HUVEC и в интактных HUVEC (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,3). Экспрессия генов была проверена в независимых экспериментах на 3-х разных культурах HUVEC. (*) - Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения (р <0,05). Уровень экспрессии STAT3 в растущей популяции HUVEC увеличивается на уровне белка на 25 - 50% (рисунок 3.2.160) при добавлении фрагментов вкДНК, независимо от степени окисления, состава и концентрации добавляемых фрагментов. Рисунок. 3.2.160. Уровень экспрессии белка STAT3 в растущей популяции HUVEC через 3 суток после добавления в среду культивирования образцов ДНК в концентрации 5 или 50 нг/мл. Анализ проводился методом проточной цитометрии. А – распределение клеток по интенсивности сигнала, анализируемая область обозначена R; Б – частота клеток, экспрессирующих STAT3. Среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения (*) р <0,05. 350 Однако, поскольку неокисленные фрагменты в HUVEC, связываясь с поверхностью клеток, активно подвергаются окислению ферментами NOX4, за 3 суток культивирования вся вкДНК могла окислиться и наблюдаемое повышение экспрессии белка STAT3 может быть обусловлено действием окисленных фрагментов. Таким образом, вкДНК по-разному действует на популяцию клеток эндотелия. В состоянии активного роста HUVEC все фрагменты вкДНК длительное время (3 суток) активируют экспрессию STAT3 в клетках. Действие вкДНК на клетки HUVEC в состоянии конфлуэнтности носит транзиторный характер – уровень экспрессии гена STAT3 возрастает через 24 часа после начала воздействия и к 48 -72 часам снижается до уровня контроля. Вероятно, в растущей популяции транскрипционный фактор STAT3 индуцирует ускорение и прогрессию клеточного цикла в ответ на появление в среде культивирования дополнительных количеств вкДНК 3.2.24.3. Активация STAT3 - сигнального пути фрагментами вкДНК в MCF-7 Повышенная экспрессия STAT3 обнаружена во многих линиях раковых клеток и в опухолевых тканях [Kamran et al., 2013]. Аномальная активация STAT3 в опухолевых клетках связана с пролиферацией и выживаемостью клеток, инвазией, ангиогенезом и метастазированием [Kamran et al., 2013]. Рисунок 3.2.161. Изменение уровня экспрессии STAT3 в MCF7 в присутствии вкДНК (50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке), метод – ПЦР в реальном времени. Среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения (контроль – интактные клетки – на графиках горизонтальная линия 1 ± 0,3). (*) р <0,05. Окисленные фрагменты вкДНК: гДНКокси и п(рДНК)окси вызывают увеличение количества мРНК STAT3 в MCF7 в 3 и 1,8 раз, соответственно (рисунок 3.2.161). ГЦ- 351 богатые п(рДНК), pBR322 и неокисленная гДНК активируют экспрессию STAT3 (в 1,5 – 2 раза) только через 48 часов. Данные проточной цитометриии и флуоресцентной микроскопии показывают, что контрольные MCF7 экспрессируют белок STAT3 в довольно больших количествах (рисунок 3.2.162), причем белок локализован в ядрах клеток (рисунок 3.2.163). Рисунок 3.2.162. гДНК и гДНКокси (50 нг/мл) стимулируют активность STAT3 в MCF7. A – распределение интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных антителами к STAT3, Б - средние значения интенсивности флуоресценции клеток MCF7, метод проточной цитометрии. В - Локализация STAT3 в ядре в присутствии гДНКокси (2часа). Ядра окрашены DAPI. Для оценки фона клетки были обработаны IgG кролика и вторичными антителами, конъюгированными с FITC. (*) - р <0,05. В присутствии гДНКокси и гДНК через 2 часа количество белка в клетках значительно увеличивается, и он по-прежнему локализован в ядре (рисунок 3.2.163). Через сутки количество белка снижается и через 48 часов достигает контрольных значений (рисунок 3.2.162.Б). Эффект более выражен в присутствии гДНКокси по сравнению с гДНК. 352 Рисунок 3.2.163. Сравнение интенсивности сигнала контрольных MCF7 и MCF7 обработанных гДНК и гДНКокси в течение 2 часов. Метод флуоресцентной микроскопии (увеличение x20). MCF7 обрабатывали антителами к STAT3 (1) – необработанные контрольные клетки и клетки через 2 часа после добавления в среду культивирования гДНК и гДНКокси (в концентрации 50 нг/мл); (2) - MCF7 предварительно обрабатывали 30 минут 0.15mM NAC, затем инкубировали с гДНК или гДНКокси в течение 2 часов. Мы обнаружили, что в контрольных клетках STAT3 локализован в ядре, что говорит об активности данного фактора. Данные литературы об активности STAT3 в клетках MCF7 варьируют. Некоторые авторы обнаруживали активацию STAT3 в MCF7 [Lee et al., 2010]. Однако имеются данные и о низком уровне активности этого фактора в MCF7 [Dien et al., 2006]. Поскольку активность STAT3 зависит от факторов роста и цитокинов [He et al., 2011], то наблюдаемые различия могут быть связаны с различными условиями культивирования, в частности с использованием различных образцов сыворотки для опытов. Мы обнаружили, что обработка клеток блокатором АФК сопровождается значительным снижением активности STAT3 (рисунок 3.2.163. (2)) – фактор обнаруживается в ядрах всего лишь 15 - 20% клеток [Kostyuk et al., 2013]. Если клетки предварительно обрабатывали 0.15 mM NAC, а затем инкубировали 2 часа с гДНК и гДНКокси, то активации фактора в присутствии образцов вкДНК не наблюдалось – количество клеток, содержащих STAT3 в ядре, не изменялось (p>0.05) [Kostyuk et al., 2013]. Таким образом, АФК являются необходимым триггерным фактором, вызывающим активацию в раковых клетках MCF7 сигнальных путей, приводящих к выживанию клеток. 353 3.2.25. Активация транскрипционного фактора PPARG2 фрагментами вкДНК в клетках разных типов Помимо NRF2-сигнального пути в регуляции ответа клеток на окислительный стресс принимает участие транскрипционный фактор PPARG2 [Gummersbach et al., 2009]. PPARG2 регулирует липогенез, метаболизм глюкозы и воспалительные реакции. Активация PPARG2 снижает экспрессию генов провоспалительных медиаторов, супрессируя NF-kB-сигнальный путь [Park et al., 2010]. PPARG2 ингибируют экспрессию провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли α, интерлейкин (ИЛ)-1β и IL-6 [Schmidt et al., 2010]. Мы исследовали ранний (в течение нескольких часов) и поздний (через несколько суток, в течение нескольких недель) ответ МСК на стресс, индуцированный образцами вкДНК. МСК инкубировали с 50 нг/мл неокисленной вкДНК(huvec) или окисленными пробами вкДНК (вкДНК (huvec)окси и вкДНК РМЖ) в течение 20, 60 и 120 мин. Методом ПЦР в реальном времени определяли количество мРНК гена PPARG2 в экспонированных клетках относительно контроля. Окисленные образцы ДНК стимулировали увеличение количества мРНК PPARG2 в большей степени, чем неокисленные образцы вкДНК(huvec) [Loseva et al., 2012]. Через 2 ч после воздействия окисленных ДНК экспрессия гена PPARG2 в МСК увеличилась на 20 - 40%, в то время как воздействие неокисленной вкДНК(HUVEC) не влияет на уровень мРНК PPARG2 (рисунок 3.2.164) [Loseva et al., 2012]. Рисунок 3.2.164. Относительные уровни РНК гена PPARG2. Образцы ДНК были добавлены к МСК в концентрации 50 нг/мл. Клетки фиксировали через 20 (белые столбики), 60 (светло-серые столбики) и 120 (темно-серые столбики) минут инкубации. Гистограммы отражают относительные уровни экспрессии по сравнению с контрольными клетками. Представленные данные – средние значения 3-х независисых экспериментов, деленные на значения в контроля - 1 ( ± SD) для трех культур в трех повторах. (*) – достоверные различия с контрольными клетками, по U-критерию МаннаУитни (р <0,05). 354 PPARG2 ранее был идентифицирован как ключевой регулятор адипогенной дифференцировки и метаболизма глюкозы [Gummersbach et al., 2009]. При адипогенной дифференцировке экспрессия PPARG2 возрастает. В таблице 3.2.4 приведены данные о влиянии различных проб ДНК на уровень мРНК PPARG2 и маркеров адипогенеза (aP2 и LPL) при длительном культивировании клеток в присутствии образцов ДНК [Loseva et al., 2012]. Таблица. 3.2.4. Уровень экспрессии маркеров гена PPARG2 и маркеров адипогенной дифференцировки aP2 и LPL при длительном воздействии на МСК вкДНК РМЖ и вкДНК(huvec)окси. Суммируя результаты, представленные в таблице 3.2.4 для 6 различных клеточных линий, можно сделать следующие выводы. Пробы ДНК с невысоким уровнем окисления оснований - вкДНК(huvec) и гДНК в концентрации 10, 20 или 100 нг/мл практически не изменяют уровень экспрессии PPARG2 при длительном культивировании (3 суток – 2 недели). Среднее количество мРНКPPARG2 по отношению к контролю составило 1.04±0.40 (N=9, p>0.1) [Loseva et al., 2012]. Модельные пробы окисленной ДНК - вкДНКокси(huvec) и гДНКокси при длительном культивировании увеличивали уровень мРНКPPARG2 в 2.7 ± 0.7 раза (N=6, p< 0.002) [Loseva et al., 2012]. Образцы вкДНК раковых клеток и вкДНК больных (вкДНК(рак) и вкДНК1,2) стимулировали повышение уровня мРНК PPARG2 в 4.7±1.5 раза по сравнению с контролем и образцами неокисленной ДНК (N=12, p< 0.0015) [Loseva et al., 2012]. 355 В присутствии неокисленных, окисленных и раковых проб ДНК средний уровень мРНК маркера адипогенной дифференцировки aP2 через 3-14 суток составил соответственно 0.9±0.3 (N=6), 0.8 ± 0.3(N=6) и 1.1±0.5 (N=6), т.е. не отличался от контроля (p>0.1). Уровень мРНК другого маркера адипогенеза LPL через 3-14 суток инкубации с гДНК, ДНКокси и вкДНК(РМЖ) составил соответственно 0.8 ± 0.3(N=6), 0.9±0.2 (N=4) и 0.7±0.3 (N=9) и также не отличался от контроля (p>0.5) [Loseva et al., 2012]. Таким образом, при длительном культивировании образцы окисленной ДНК и вкДНК(РМЖ) стимулировали увеличение количества мРНКPPARG2, но этот ответ не сопровождался адипогенной дифференцировкой МСК. Чтобы проверить эту гипотезу, к МСК были добавлены образцы гДНК, гДНКокси и вкДНК (HUVEC)окси в концентрации 10 и 50 нг/мл и клетки инкубировались в присутствии образцов добавленной ДНК в течение 10 дней, затем МСК окрашивали OilRed O (рисунок 3.2.165). Рисунок 3.2.165. Образцы ДНК не вызывают адипогенной дифференцировки в МСК. Клетки выращивали на 96-луночном планшете до конфлюэнтного состояния, образцы ДНК были добавлены в концентрации 10 нг/мл (светло-серые столбцы) или 50 нг/мл (темно-серые столбцы). На 10-й день липогенеза МСК окрашивались красителем Oil Red O, окрашивающим вакуоли с липидами. На рисунке приводятся средние значения от восьми опытов на разных культурах клеток. (*) – отличия от среднего значения однодневной культуры (р <0,05). Измерение оптической плотности и исследование морфологии клеток подтвердили низкий уровень адипогенной дифференцировки МСК в присутствии образцов ДНК. Таким образом, несмотря на индукцию экспрессии гена PPARG2 в присутствии окисленной ДНК, не происходит дифференцировки в адипоциты [Loseva et al., 2012]. Возможно, что высокие уровни экспрессии этого фактора в присутствии окисленных и раковых проб ДНК направлены на поддержание антиокислительного ответа 356 клеток на действие этих проб ДНК. Активация PPARG2 наблюдалась также при действии окисленных и неокисленных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК на клетки MCF7 и HUVEC (рисунок 3.2.166). Рисунок 3.2.166. Изменение уровня экспрессии гена PPARG2 в MCF7 и HUVEC фрагментами вкДНК (50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке), метод – ПЦР в реальном времени. Среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения. (*) р <0,05. При действии ГЦ-богатых фрагментов на MCF7 уровень экспрессии гена PPARG2 возрастает в 2 раза через 30 минут и в 6 раз через 2 часа. Окисленные фрагменты гДНКокси повышают экспрессию PPARG2 в MCF7 быстро – через 30 минут экспрессия повышается 3,5 раза, но краткосрочно – уже через 2 часа уровень мРНК PPARG2 снижается и превышает контрольные значения только в 1,5 раза. Неокисленные фрагменты гДНК и вектора мало влияли на экспрессию PPARG2 в MCF7. В HUVEC экспрессия гена PPARG2 повышается в 1,7 - 2,4 раза через 2 часа после повышения концентрации вкДНК, независимо от ГЦ-состава и степени окисления. Таким образом, транскрипционный фактор PPARG2 играет роль на ранних этапах появления окисленной вкДНК в среде и в защите клеток культуры MCF7 от действия ГЦ-богатой вкДНК. Мы рассмотрели сигнальные пути NF-kB и NRF2, которые активируются в клетках человека при повышении в циркуляции концентрации внеклеточной ДНК или при накоплении в составе вкДНК ГЦ-обогащенных последовательностей и/или окислительных модификаций. Четыре транскрипционных фактора: NF-kВ, NRF2, STAT3 и PPARG2 активируются в клетках при изменении свойств вкДНК. Существует сложная система взаимодействий между транскрипционными факторами при регуляции транскриптома клеток. В эту систему взаимодействий включено большое количество других сигнальных путей (это и PI3K -, и AKT - , и IRF- , и МАРК - и многие другие), рассмотрение которых довольно сложно уместить в объем одной работы. Сложная сеть взаимодействий 357 сигнальных путей и транскрипционных факторов направлена на повышение выживаемости клеток после контакта с фрагментами вкДНК. Внеклеточная ДНК является молекулой сигнализации, передающей клеткам дистантно сигнал «опасности», свидетельствующий о гибели клеток. Этот сигнал активирует в здоровых клетках организма сигнальные пути, способствующие выживанию «инициированных» клеток в неблагоприятных условиях. 3.2.26. Окисленная вкДНК – фактор стресс-сигнализации в передаче сигнала при радиационно-индуцируемом эффекте свидетеля Эффект передачи информации от облученных клеток (клеток-мишеней) необлученным (клеткам-свидетелям) получил название «эффекта свидетеля» (ЭС). ЭС показан для повреждающих агентов как физической, так и химической природы, для многих типов клеток а также для ряда передаваемых реакций и эффектов, в том числе, и адаптивного ответа (АО). В результате индукции малыми дозами ионизирующей радиации адаптивной реакции в клетках развивается устойчивость к последующему облучению в высоких (повреждающих) дозах. Например, адаптирующим предоблучением на 50-60% может быть снижено количество ожидаемых от повреждающих доз генных и хромосомных мутаций. АО может передаваться интактным клеткам по механизму ЭС [Ermakov et al., 2010]; обе реакции (АО и ЭС) тесно взаимосвязаны биологически и имеют много сходных черт и характерных признаков [Ermakov et al., 2010; Ermakov et al., 2013]. Исследование роли вкДНК, циркулирующей в крови здоровых людей и при патологии, позволили предположить, что вкДНК может являться растворимым фактором стресс-сигнализации и вызывать, таким образом, развитие эффекта свидетеля и адаптивный ответ [Ermakov et al., 2013]. Первым доказательством того, что внеклеточная ДНК среды облученных клеток является фактором стресс-сигнализации в ЭС, благодаря ее окислительной модификации, служит тот факт, что вкДНК из среды облученных клеток стимулирует увеличение уровня АФК в клетках примерно в той же степени, что и малые дозы радиации, окисленная in vitro геномная ДНК и Н2О2. Нами показано, что радиация в дозе 10 сГр вызывает в лимфоцитах появление окисленной вкДНК, которая обладает тем же эффектом на клетки, что и облучение в малой дозе [Ermakov et al., 2013]. Было показано, что окисленная вкДНК из среды культивирования облученных лимфоцитов, так же, как и окисленная геномная ДНК, вызывает те же эффекты в клетках разных типов (эндотелиальных, мезенхимных стволовых, лимфоцитах), что и прямое воздействие малых доз ионизирующей радиации [Ermakov et al., 2013]. Неокисленная ДНК таких эффектов не вызывает. Таким, образом, окислительные модификации 358 вкДНК превращают ее в фактор стресс-сигнализации в организме или клеточной культуре. 3.2.27. Окисленная вкДНК повышает устойчивость HDF к ионизирующей радиации Чтобы подтвердить высказанное нами предположение о роли окисленной вкДНК, как фактора сигнализации в радиационном эффекте свидетеля, составляющей которого при действии малых доз радиации является адаптивный ответ [Ермаков с соавт., 2007], мы подвергли фибробласты кожи человека (HDF) действию ионизирующего излучения в дозе 1.2Гр (рисунок 3.2.167). HDF культивировали 48 часов в бессывороточной среде (1), с добавлением гДНК (2) и гДНКокси (3) в концентрации 20 и 100 нг/мл. Затем клетки облучили и далее культивировали еще 60 часов. Анализ жизнеспособности клеток провели с использованием стандартного МТТ-теста [Коstyuk et al., 2013]. Рисунок 3.2.167. Влияние гДНК и гДНКокси на количество жизнеспособных клеток HDF (МТТ–тест), облученных в дозе 1.2 Gy. Клетки культивировали в бессывороточной среде 48 часов в присутствии гДНК(2) или гДНКокси (3), облучали и вновь культивировали 60 часов. Далее проводили МТТ - тест. А (0)i, А(1.2Gy)i поглощение раствора производного МТТ, нормированное на количество клеток в пробе, в необлученных и облученных клетках, которые культивировали с одним и тем же образцом ДНК. Cерые столбики – 20 нг/мл DNA, черные - 100 нг/мл. Достоверность отличия от контроля (1): (*) p<0.01; (**) p< 0.0001, N=8. Облучение дозой 1.2 Гр в контрольных клетках вызвало гибель ~20% клеток (рисунок 3.2.167) по сравнению с необлученным контролем. гДНК усилила этот ответ – погибало 30 - 40% клеток, которые культивировали до облучения с гДНК. Клетки, которые культивировали в присутствии гДНКокси, продемонстрировали повышенную устойчивость к ионизирующему излучению в дозе 1.2 Гр. Таким образом, совокупность всех полученных данных позволяет утверждать, что окисленная внеклеточная ДНК среды облученных клеток, являясь фактором стресс-сигнализации в ЭС, может стимулировать в 359 необлученных клетках-свидетелях адаптивный ответ, который является причиной устойчивости клеток к последующим более высоким дозам радиации [Коstyuk et al., 2013]. В присутствии гДНКокси одновременно снижаются все показатели поврежденности клеток. Уменьшается количество апоптотических клеток со сниженным содержанием ДНК и большим количеством ДР, клеток в состоянии G2/M-ареста и клеток с нормальным содержанием ДНК, но с множественными ДР. гДНКокси существенно увеличивают экспрессию белка PCNA в HDF и HEF (см. выше) на фоне снижения другого маркера пролиферации Ki-67. PCNA участвует в репарации, увеличение уровня этого белка наблюдали при действии на клетки ионизирующей радиации [Moore et al., 2004]. Антиапоптотическое действие гДНКокси гДНКокси на HDF корреллирует с увеличенной экспрессией генов, которые относятся к регуляторам апоптоза (BCL2 и APAF-1) и антиокислительного ответа (фактор транскрипции NRF2). Адаптивный ответ HDF, стимулируемый гДНКокси, включает активацию экспрессии TNF-α. TNF-α рассматривается в качестве возможной сигнальной молекулы в радиационном эффекте свидетеля [Ермаков с соавт., 2010; Коstyuk et al., 2013]. Ранее было показано, что внеклеточная ДНК среды облученных лимфоцитов стимулирует увеличение активности TNF-α в среде культивирования необлученных лимфоцитов – свидетелей [Ермаков с соавт., 2008]. Таким образом, экспрессия TNF-α может регулироваться уровнем окисления вкДНК, что дополнительно подтверждает значимую роль вкДНК среды облученных клеток, как фактора сигнализации в цепи событий, наблюдаемых в эффекте свидетеля. Основной вывод проведенного исследования – окислительная модификация внеклеточной ДНК стимулирует в клетках адаптивный ответ. Этот ответ проявляется в большей выживаемости клеток в условиях хронического окислительного стресса, вызванного отсутствием сыворотки, и в повышенной устойчивости клеток к последующему действию ионизирующего излучения. 3.2.28. Воздействие ГЦ- ДНК улучшает выживаемость МСК после облучения Выше мы показали, что при действии ГЦ-богатой п(рДНК) в МСК активируются сигнальные пути, направленные на выживание клеток. Воздействие ГЦ-богатой п(рДНК) активирует в МСК NF–кВ - сигнальный путь с последующим синтезом цитокинов [Kostjuk at al., 2012]. Предобработка МСК п(рДНК) может влиять на выживание клеток при неблагоприятных условиях среды. На МСК воздействовали ионизирующим излучением в дозе 2 Гр. После этого клетки культивировали в течение суток. Уровень повреждений оценивали по количеству двунитевых разрывов хроматина ядер (рисунок3.2.168.А). Двойные разрывы ДНК анализировали с использованием антител к 360 фосфорилированной форме гистона Н2АХ методом проточной цитометрии (рисунок3.2.168.Б и В) [Kostjuk at al., 2012]. Рисунок 3.2.168. А, Б – Определение двунитевых разрывов хроматина с использованием антител к фосфорилированной форме гистона Н2АХ методом микроскопии (А) и проточной цитофлуориметрии (Б, обозначена область, содержащая клетки с двунитевыми разрывами хроматина). В - количественный анализ содержания клеток фракции R в популяции облученных МСК, которые культивировали 2 часа после облучения. Перед облучением клетки культивировали в присутствии проб ДНК (3 часа, 50 нг/мл среды). (*) p<0,05. Г – Влияние гДНК или п(рДНК) на выживаемость МСК после облучения в дозе 2 Гр. Клетки сначала культивировали 24 часа в присутствии проб ДНК (50 нг/мл), далее облучали, меняли среду на свежую и культивировали 48 часов. Использовали стандартный МТТ-тест. А(0)i, А(2Гр)i – поглощение производного МТТ в контрольных и облученных клетках. (*) p<0,01. На рисунок 3/2/168. Б приводится зависимость флуоресценции клеток, меченых флуорохромированными антителами к Н2АХ, от содержания ДНК в клетках, окрашенных дополнительно пропидий йодидом. Обозначена зона R, которая содержит клетки с двунитевыми разрывами. Перед облучением клетки культивировали три часа в отсутствии экзогенной ДНК (контроль), в присутствии 50 нг/мл ДНК. Далее клетки облучали и культивировали еще 2 часа, после чего анализировали уровень двунитевых разрывов, 361 который пропорционален количеству гистона Н2АХ в клетках [Lobrich et al., 2010]. После облучения количество контрольных клеток, содержащих двунитевые разрывы, увеличивается в 2 раза. Обработка МСК пробой п(рДНК) достоверно снижает количество клеток с двунитевыми разрывами, причем размер фракции R уменьшается, даже по сравнению с необлученным контролем [Kostjuk at al., 2012]. Был проведен стандартный спустя 48 часов после облучения планшете. После облучения МТТ-тест на жизнеспособность облученных клеток [Mosmann, 1983]. Тест проводили в 96-луночном уровень окраски снижается на 17%, что соответствует уменьшению количества жизнеспособных клеток на 33 % [Kostjuk at al., 2012]. Геномная ДНК практически не влияла на жизнеспособность облученных клеток. Предварительная обработка клеток п(рДНК) в концентрации 10-50 нг/мл в течение 24 часов значительно уменьшала токсический эффект от действия ионизирующего излучения в дозе 2 Гр – уровень окраски клеток снижался только на 6% (рисунок 3.2.168. Г). 3.2.29. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК стимулируют в МСК устойчивость к повреждающему действию этанола. Стволовые клетки обладают чувствительностью к действию этилового спирта в концентрации 1% и выше. Спустя трое суток после культивирования МСК в присутствии 2% этанола клетки открепляются от носителя, их количество уменьшается, клетки обладают морфологическими признаками апоптотических клеток (рисунок 3.2.169). Рисунок 3.2.169. Влияние п(рДНК) на выживаемость МСК в присутствии 2% этилового спирта в среде культивирования. Варианты опыта указаны на рисунке. Пробы ДНК (50 нг/мл) культивирования клеток добавляли за 1 час до добавления в присутствии этанола – 72 часа. этанола. Время Далее фотографировали, используя микроскоп с фазовым контрастом (увеличение 20). клетки 362 При пересеве такой культуры в среде, не содержащей этанол, не наблюдалось роста клеток. Если в среду культивирования за 1 час до добавления 2% этанола вводили п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл, то уровень гибели клеток значительно уменьшался, значительная часть клеток продолжала деление. При пересеве такой культуры, уровень пролиферации клеток не отличался от уровня контрольных. Геномная ДНК обладала очень слабым цитопротекторным действием [Kostyuk at al., 2012]. Было показано (см. рисунок 3.2.170), что в МСК, которые культивировали в присутствии 2% этанола и 50 нг/мл п(рДНК) (вводили за 1 час до этанола) в течение трех часов, увеличена экспрессия антиапоптотических генов BCL2, BIRC3 и гена, участвующего в репарации ДНК BRCA1. Кроме того, наблюдали снижение экспрессии гена FAS, который участвует в индукции апоптоза [Kostyuk at al., 2012]. Рисунок 3.2.170. Влияние п(рДНК) на экспрессию антиапоптотических генов (BIRC,BCL2), гена репарации ( BRCA1 ) и гена FASв МСК, культивируемых в присутствии 2% этанола. Клетки культивировали 1 час в присутствии проб ДНК (50 нг/мл), далее добавляли 2 % этанола и культивировали 3 часа. РНК анализировали методом ПЦР в реальном времени. Таким образом, можно предложить альтернативную стратегию повышения жизнеспособности МСК, применяемых в трансплантологии и для лечения заболеваний, сопровождающихся дегенерацией тканей – краткосрочную (3-24 часа) предобработку культуры МСК плазмидой п(рДНК) в низких концентрациях (50 нг/мл) [Kostjuk at al., 2012]. Преимущества использования плазмиды – низкая действующая концентрации (синтетические ГЦ-олигонуклеотиды применяют в концентрации выше 1000 нг/мл [Tomchuck, 2008]) и высокая устойчивость ГЦ-пДНК к нуклеазному гидролизу. 363 3.2.30. Влияние изменения свойств вкДНК на специфическую функциональную активность клеток. 3.2.30.1. Изменение свойств вкДНК влияет на количество окиси азота в HUVEC. Для определения NO в живых клетках эндотелия мы применили реагент CuFL, который был разработан Липпардом и соавт. [Lim, 2007]. Соединение CuFL с низкой флуоресценцией (Φ=0.077) при взаимодействии с NO образует сильно флуоресцирующий NO-FL (Φ=0.58). Реагент специфичен в отношении NO на фоне других RNS и ROS, включая позволяет H2O2, HNO, NO2−, NO3−, and ONOO− [Lim, 2007]. Показано, что CuFL в режиме реального конститутивной и индуцибельной времени детектировать NO–синтазами, NO, синтезируемую соответственно в клетках нейробластомы и макрофагов мыши [Lim, 2007]. Рисунок3.2.171. Анализ окиси азота в HUVEC с использованием реагента CuFL. А, Б – фотографии клеток при увеличении 64 и 100. В – распределение клеток по интенсивности флуоресценции NO-FL (метод проточной цитометрии). Инкубация HUVEC с CuFL сопровождается появлением зеленой флуоресценции. Интенсивность свечения снижается при использовании ингибитора синтеза NO (Nω-NitroL-arginine) [Баскова с соавт., 2012]. С точки зрения узора окраски и интенсивности свечения клеточную популяцию, достигшую состояния конфлуентности, можно условно разделить на две субпопуляции (рисунок 3.2.171, А) [Alekseeva et al., 2010]. Клетки с очень ярким свечением (примерно 10 % ) имеют размытые контуры и признаки сорбции NO-FL вне клеток и на поверхности клеток (рисунок 3.2.171. Б). Эти клетки как бы «фонтанируют» на поверхности большими количествами окиси азота. Остальные клетки имеют более слабое свечение, при этом хорошо различимы структуры, где происходит синтез NO: сеть «каналов» вблизи ядерной мембраны и отдельные компактные включения по периферии клеток [Alekseeva et al., 2010]. Наблюдаемая картина полностью 364 соответствует описанной ранее схеме распределения молекул активной eNOS [Fulton 2002]. Одна часть молекул eNOS локализована в районе цитоплазматической мембраны, другая - в Golgi комплексе [Fulton 2002]. Наличие двух фракций клеток, которые в несколько раз интенсивности свечения NO-FL, подтверждается данными различаются по проточной цитометрии (рисунок3-171, В) [Ефремова с соавт., 2010]. Клеточная популяция содержит до 10 – 15 % клеток с очень интенсивным свечением (плечо 2 на гистограмме) [Alekseeva et al., 2010]. Число клеток фракций 1 и 2, зависит от длительности культивирования ЕС в условиях конфлуентного состояния. HUVEC, которые культивировали 5 дней после достижения состояния контактного ингибирования, содержат более 70% клеток 2-й фракции (рисунок 3.2.178.В). Такая культура продуцирует большее количество NO, что соответствует полученным ранее данным других авторов [Kondrikov 2006; Govers 2002]. В наших дальнейших экспериментах мы работали с клетками, которые достигли конфлуентного состояния. Это дало возможность проследить за реакцией на воздействие проб ДНК обоих типов клеток – с высоким и относительно низким уровнем синтеза NO [Костюк с соавт., 2010]. Данные микроскопии показали (рисунок 3.2.171), что до момента взаимодействия с CuFL часть молекул NO из клеток с интенсивным синтезом NO успевает мигрировать в межклеточное пространство [Костюк с соавт., 2010]. Снижение скорости синтеза NO может приводить и к уменьшению скорости его диффузии за пределы клетки. Поэтому более точно изменения в количестве NO можно оценить, измеряя суммарную интенсивность флуоресценции NO-FL в не отмытых от реагента клетках и в среде культивирования, используя планшетный флуоресцентный ридер [Костюк с соавт., 2010]. На рисунок 3.2.172 приведены данные об изменении уровня NO в клетках при изменении концентрации, GC-состава и степени окисления вкДНК среды культивирования. Анализ этих данных позволил сделать следующие выводы: - GC- ДНК в низких концентрациях (5 – 10 нг/мл) значительно стимулируют синтез NO в HUVEC. Из трех образцов GC- ДНК наибольшим эффектом обладает образец, содержащий фрагмент рибосомного повтора. Увеличение концентрации GCДНК сопровождается уменьшением эффекта [Костюк с соавт., 2010; Alekseeva et al., 2010]. - образцы окисленной ДНК (гДНКОХ1, гДНКОХ2, вкДНК среды облученных клеток (вкДНК10сГр)) снижают количество NO в клетках, в отличие от неокисленных образцов гДНК или вкДНКК. Аналогично действуют малые дозы рентгеновского излучения [Костюк с соавт., 2010; Alekseeva et al., 2010]; 365 - вкДНК здоровых молодых доноров стимулирует в различной степени увеличение количества NO. ВкДНК больных артериальной гипертензией и ИБС снижает уровень NO [Ефремова с соавт., 2010]. Рисунок 3.2.172. Определение количества NO в HUVEC, которые культивировали в присутствии образцов ДНК, указанных в таблице на рисунке. Метод флуоресценции с использованием планшетного ридера. Время культивирования – 2 часа. Известно, что при ССЗ возрастает уровень окисления клеточной ДНК, а также циркулирующей вкДНК. Кроме того, значительно возрастает содержание GC-ДНК в составе вкДНК [Булычева и соавтр., 2008]. По-видимому, суммирование двух факторов приводит к тому, что циркулирующая ДНК больных ССЗ снижает количество окиси азота в эндотелиальных клетках. Количество NO в эндотелиальной клетке определяется уровнем его синтеза из Lаргинина и последующими процессами его утилизации клетками. В эндотелиальных клетках основной фермент, отвечающий за синтез NO при нормальных условиях – это эндотелиальная NO– синтаза (eNOS). Активность eNOS регулируется транскрипции гена и на уровне посттранскрипционных и модификаций [Yan et al., 2013]. на уровне посттрансляционных Мы проанализировали изменение количества мРНК eNOS при изменении свойств вкДНК среды культивирования методом ПЦР в реальном времени варианте Taq Man (рисунок 3.2.173) [Kostyuk et al., 2012; Alekseeva et al., 2010]. 366 Рисунок 3.2.173. Анализ экспрессии гена еNOS в клетках, которые культивировали в присутствии образцов ДНК. Условия: 50 нг/мл ДНК, 3 часа. GC-ДНК увеличивают количество мРНК, окисленные образцы (гДНКОХ1, гДНКОХ2, вкДНК10сГр) снижают уровень РНК фермента. Как следует из рисунок 3.2.174, изменения в количестве окиси азота положительно коррелируют с изменениями в количестве мРНКeNOS и отрицательно с уровнем АФК, который был определен для тех же проб в тех же условиях [Kostyuk et al., 2012; Alekseeva et al., 2010]. Рисунок 3.2.174. Зависимость количества окиси азота в HUVEC, которые культивировали в присутствии различных образцов ДНК, от количества РНКeNOS (а) и количества АФК (б) в клетках, определяемых с помощью реагента DCF. 367 С целью выяснения более отдаленных последствий влияния окислительной модификации вкДНК на общее количество фермента eNOS в HUVEC, мы проанализировали методом проточной цитометрии уровень eNOS через 48 часов культивирования HUVEC с гДНК, гДНКох1 и гДНКох2 (рисунок 3.2.175). В популяции HUVEC около 15 % клеток содержат малые количества белка eNOS. Культивирование с неокисленной ДНК практически не влияет на содержание клеток с низким уровнем экспрессии eNOS, но культивирование с окисленными формами ДНК в 1,5-2 раза увеличивает количество клеток этой фракции (рисунок 3.2.182 А(2)) [Kostyuk et al., 2012; Alekseeva et al., 2010]. Рисунок 3.2.175. Влияние окисленной и неокисленной ДНК на экспрессию белка eNOS (А) и относительное количество неактивной формы белка peNOS (Б) в клетках HUVEC (метод проточной цитометрии). Клетки культивировали 48 часов, концентрация образцов ДНК – 50 нг/мл среды. А(1), Б(1) - по оси Х отложены размеры контрольных клеток, по оси У – интенсивность флуоресценции клеток, окрашенных антителами к соответствующей форме eNOS. А(2), Б(2) - распределения клеток по содержанию соответствующих форм eNOS. Серым цветом обозначена область фоновых значений флуоресценции клеток. А(3) – медианы интенсивности флуоресценции клеток. Б(3) отношение медиан интенсивности клеток, окрашенных антителами к peNOS и к eNOS. 368 При этом сокращается не только общее количество клеток с активной экспрессией eNOS, но и уменьшается среднее количество молекул фермента в одной клетке. Общий уровень экспрессии eNOS в культуре HUVEC может быть охарактеризован медианой значений флуоресценции клеток (рисунок3.2.182.А(3)) [Alekseeva et al., 2010]. Популяция HUVEC содержит ～40% клеток с большим количеством фосфорилированной малоактивной формы рeNOS. Количество клеток этой фракции увеличивается в среднем на 35% в присутствии как неокисленного, так и окисленных образцов ДНК [Kostyuk et al., 2012]. Мы проанализировали изменения относительного содержания рeNOS в популяции всех молекул eNOS, определив соотношение показателей, характеризующих общий уровень экспрессии двух форм фермента в клетках (рисунок 3.2.175. Б(3)) [Kostyuk et al., 2012]. Увеличение содержания клеток малоактивной фракции р-eNOS в присутствии окисленной ДНК сопровождается увеличением среднего содержания неактивных молекул рeNOS в клетках в 2,5 – 3,5 раза (рисунок3.2.175. Б) [Kostyuk et al., 2012]. Уменьшение количества NO в эндотелиальных клетках при увеличении уровня окислительной модификации вкДНК позволяет предположить, что окисленная вкДНК, а также клеточный сигнальный путь, который эта ДНК активирует и возможные рецепторы, узнающие окисленную ДНК, могут являться терапевтической мишенью при патологии, приводящей к эндотелиальной дисфункции, например при сердечнососудистых заболеваниях. 3.2.30.2. Изменение уровня экспрессии и полимеризации актина В транскрипционной, посттранскрипционной и посттрансляционной регуляции активности eNOS большая роль отводится белку актину и его состоянию (глобулярный Gактин и полимерный F-актин). F-актин в эндотелиальной клетке существует в двух формах: стресс–волокна, связанные с клеточной мембраной в местах адгезии, и кортикальный F-актин, связанный с субдоменными областями плазматической мембраны [Dudek and Garcia 2001]. Мы показали, что суммарное количество полимерного актина значительно возрастает при действии дозы радиации 0,1 Гр и вкДНК среды облученных клеток [Ermakov et al., 2010]. Анализ данных микроскопии позволяет проследить за изменением соотношения двух форм F –актина при изменении свойств вкДНК [Ermakov et al., 2010]. На рисунок 3.2.176 приводятся данные для HUVEC, которые культивировали 3 часа в присутствии 50 нг/мл неокисленной вкДНКК и окисленной вкДНКR [Ermakov et al., 2010]. 369 Рисунок 3.2.176. Анализ изменения экспрессии и уровня полимеризации актина при действии на HUVEC образцов ДНК. (А) – определение полимерного актина с использованием фаллоидин- родамина. (Б) - определение уровня окраски F- актина методом флуоресценции с использованием планшетного ридера. (В) - определение уровня РНК гена бета- актина методом реал ПЦР. Условия: 50 нг/мл образцов ДНК; 3 часа. Аналогичный результат был получен в случае GC-ДНК и окисленных форм гДНК: мы наблюдали образование стресс - волокон F-актина [Ermakov et al., 2010]. Контрольная ДНКК и гДНК не изменяла состояние F-актина, по сравнению с интактными клетками [Ermakov et al., 2010]. Известно, что образование стресс – волокон актина коррелирует с уменьшением активности eNOS, которая в клетке непосредственно связана с различными формами актина [Kondrikov, 2006]. Таким образом, образование стресс-волокон актина может являться второй (после снижения уровня мРНКeNOS) причиной уменьшения количества NO при действии окисленных образцов ДНК [Ermakov et al., 2010]. Известно, что уменьшение стабильности мРНКeNOS, зависит от количества Gактина в клетке. Образование комплекса G-актина с 3 – нетранслируемым участком мРНК eNOS приводит к значительному уменьшению времени полужизни мРНК eNOS [Kostyuk et al., 2012]. В связи с этим мы оценили уровень экспрессии одной из основных изоформ актина (бета-актина) по количеству мРНК AKTB в HUVEC, подвергнутых воздействию радиации и проб ДНК. Образцы GC-ДНК, вкДНКR, вкДНК OX, а также образец вкДНК больных ОИМ, стимулируют экспрессию актина на уровне транскрипции [Kostyuk et al., 2012]. 370 3.2.30.3. Повышение экспрессии генов миогенной дифференцировки при действии вкДНКокси на МСК В МСК были описаны 4 скелетно-мышечных регуляторных фактора MyoD, Myf5, миогенин, Mrf4 [Olson and Klein, 1994], каждый из которых способен активировать транскрипцию генов скелетных мышц (рисунок 3.2.177). Эти транскрипционные факторы выявляют 80%-ую идентичность аминокислотной последовательности в мотиве bHLH, который опосредует димеризацию и связывание ДНК [Olson and Klein, 1994]. Транскрипционные факторы bHLH формируют гетеродимеры с убиквинтиновыми белками семейства Е, в форме гетеродимеров они активируют транскрипцию мышечноспецифичных генов при связывании с последовательностью CANNTG (Е-боксы) в промотерах и энхансерах генов скелетных мышц. Рисунок 3.2.177. Роль тканеспецифических факторов семейства MyoD в мышечной дифференцировке [по статье Olson and Klein, 1994]. Мы показали, что при длительном культивировании МСК (10-14 дней) в присутствии окисленных фрагментов вкДНК происходит детерминирование клеток в сторону миогенной дифференцировки. В 2-3 раза повышается уровень экспрессии генов транскрипционных факторов, определяющих мигенную дифференцировку: MYOD1, MYOG, MYF5, MRF4 и снижена или не изменяется уровень экспрессии генов факторов, определяющих остеогенную дифференцировку: RUNX2, SPP1, OCN и адипогеную: LPL и АР2 (FABP4) (рисунок 3.2.178). Подобные изменения происходят как при добавлении модельных окисленных фрагментов (гДНКокси, п(рДНК)окси, при добавлении окисленной среды культивирования МСК и HUVEC, так и при добавлении вкДНК больных ОИМ и РМЖ, с высоким уровнем окислительных модификаций (рисунок 3.2.178). 371 Рисунок 3.2.178. Уровень экспрессии генов миогенной, адипогенной и остеогенной дифференцировки после 14 дней культивирования МСК с фрагментами окисленной вкДНК. . На рисунке приводятся средние значения от восьми опытов на 4-х разных культурах клеток. (*) – отличия от среднего значения культуры (р <0,05). Возможно, направленная регуляция в сторону миогенной дифференцировки связана с активностью фактора STAT3 [Jang and Baik, 2013; Sun et al., 2007]. Роль JAK/STAT – сигнального пути в миогенной дифференцировке сложна. Во-первых, JAK1/STAT1/STAT3 способствует пролиферации и препятствует преждевременной дифференцировке миобластов [Sun et al., 2007]. Показано, что ингибирование JAK1 приводит к ускоренной экспрессии MyoD и MEF2 и повышенной экспрессии MEF2 зависимых генов. Кроме того, усиливалась экспресия p21Cip1 и p27Kip1. антидифференцировочный эффект JAK1 опосредует STAT1 [Jang and Baik, 2013]. 372 Комплекс JAK1 - STAT1 - STAT3 участвует в миогенной регенерации, необходимой для миобластов пролиферации и служит одним из основных КПП для предотвращения преждевременной дифференцировки миобластов [Sun et al., 2007]. Кроме того, показано, что IL6 тормозит дифференцировку миобластов через активацию JAK1 STAT1 - STAT3 – пути [Jang and Baik, 2013]. STAT1, взаимодействуя с MEF2 способен ингибировать миогенную дифференциацировку, супрессируя транскрипционную активность MEF2. STAT3 не принимает участия в ингибировании миогенный дифференцировки [Jang and Baik, 2013]. Во-вторых, JAK2 - STAT2 - STAT3 инициирует миогенную дифференцировку [Trenerry et al., 2011]. Экспрессия MHC, MGN, MEF2 и MyoD снижается после обработки клеток ингибитором JAK2. Показано, что про-дифференцировочный эффект сигнального пути JAK2 - STAT2 - STAT3 частично опосредован MyoD и MEF2. MyoD непосредственно связывается с MEF2 и повышает MEF2 -зависимую транскрипцию через свою собственную транскрипционную активность, что приводит к активации MyoD/MEF2 - зависимой миогенной дифференцировке. Поэтому JAK2 - STAT2 - STAT3 сигнальный путь является необходимым условием для миогенной дифференцировки [Trenerry et al., 2011]. В-третьих, отмечается негативная роль JAK3 в миогенной дифференцировке [Jang and Baik, 2013]. Ингибирование JAK3 способствует преждевременной миогенной дифференцировке и играет важную роль в терминальной миогенной дифференцировке ингибирует образование многоядерных мышечных трубок. AKT и ERK – сигнальные пути также способствуют миогенной дифференцировке через супрессию JAK3. Ингибирование JAK3 увеличивает экспрессию маркера ранней дифференцирорвки, MGN и маркера поздней дифференцировки, МНС [Jang and Baik, 2013]. Ингибирование JAK3 приводит к супрессии STAT1 и усилению активности STAT3, однако до сих пор не ясно, как активация STAT1 и STAT3 регулируется в противоположных направлениях [Jang and Baik, 2013]. Другие регуляторные пути также играют роль в миогенной дифференцировке через регуляцию синтеза многих гормонов и факторов роста. К путям, регулирующим миогенную дифференцировку, относят ERK/МАРК - , p38 МАРК - и PI3K/AKT пути. ERK/MAPK – сигнальный путь индуцирует или ингибирует дифференцировку в отсутствие или присутствии митогенов [Keren et al., 2006]. р38/МАРК путь необходим для миогенной дифференцировки и дифференцировки скелетных мышц, поскольку он активирует MEF2 (myocyte enhancer-binding factor [Keren et al., 2006]. PI3K/AKT – сигнальный путь позитивно регулирует миогенную дифференцировку при 373 активированном факторе IGF (insulin-like growth factor) [Jang and Baik, 2013]. IRS/PI3K/AKT - сигнальный путь индуцирует миогенную дифференцировку через регуляцию экспрессии миогенина [Jang and Baik, 2013]. В нашем исследовании мы обнаружили увеличение уровня экспрессии гена STAT3 при действии фрагментов окисленной вкДНК на МСК (рисунок 3.2.158). Возможно, процесс миогенной дифференцировки инициируется транскрипционным фактором STAT3, однако этот вопрос требует всесторонней проработки. Роль всех сигнальных путей в регуляции миогенной дифференцировки неоднозначна, регулирование процессов дифференцировки – многоуровневый процесс с развитыми механизмами обратной связи. 374 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. В области повреждения тканей организма, а также при патологии и опасных для генома воздействиях возрастает уровень гибели клеток [Schwarzenbach, 2013; GonzálezMasiá et al., 2013; Jung et al., 2010; Zhang et al., 2010]. Внеклеточная ДНК (вкДНК), в образовании которой значительная роль отводится макрофагам [Pisetsky, 2012] – это, в основном, продукт деградации погибших в результате некроза или апоптоза клеток организма. Высказано также предположение, что вкДНК может выделяться живыми клетками (метаболическая ДНК) [Gahan and Stroun, 2010]. Свойства и биологические функции фрагментов вкДНК в норме и при патологии к моменту начала данного исследования были мало изучены. Большинство авторов полагали, что состав вкДНК идентичен составу яДНК, которая не способна воздействовать на клетки организма вследствие низкого ГЦ-состава и высокого уровня метилирования. Немногочисленные исследования указывали на увеличение общего ГЦсостава вкДНК при патологии и при действии ионизирующего излучения. Чтобы выявить свойства, определяющие биологическую активность вкДНК, было проведено исследование 736 образцов вкДНК, выделенных из плазмы крови человека и 716 образцов геномной ДНК, выделенной из лейкоцитов человека. Коллекция исследованных образцов включала вкДНК здоровых доноров, беременных женщин, больных различными заболеваниями – ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, артериальной гипертензией, острым инфарктом миокарда, раком молочной железы и лиц, работающих с источниками ионизирующего излучения. Нами были описаны следующие характеристики вкДНК, которые потенциально могут влиять на ее биологическую активность: 1. Концентрация вкДНК. Повышение концентрации вкДНК в плазме крови наблюдается при острой патологии, например при остром инфаркте миокарда и при остром нарушении мозгового кровообращения. При хронической патологии (ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия, ревматоидный артрит), при хроническом действии малых доз ионизирующего излучения концентрация вкДНК может значительно снижаться по сравнению с концентрацией вкДНК в плазме крови здоровых лиц. Этот эффект связан с активацией компонентов системы элиминации вкДНК из кровотока. 2. Увеличение ГЦ-состава вкДНК. В качестве маркерной последовательности была выбрана транскрибируемая область рибосомного повтора (рДНК). На фоне 375 снижения общей концентрации вкДНК в составе вкДНК увеличивается содержание рДНК. Высокое содержание рДНК является маркером хронически протекающего патологического процесса. При хронической патологии, которая сопровождается усилением гибели клеток (ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия, ревматоидный артрит), а также при внешнем хроническом воздействии (малые дозы ионизирующего излучения) содержание этих ГЦ-богатых маркерных последовательностей в составе вкДНК крови по сравнению с ДНК ядер клеток увеличивается в 10 и более раз. На основании повышения в составе вкДНК содержания рДНК нами был предложен эффективный способ определения уровня гибели клеток при хронических заболеваниях, при физиологических состояниях (беременность) и при хроническом действии неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека, и подана заявка № на патент. 3. Окислительная модификация оснований. ВкДНК содержит значительное количество окисленных оснований по сравнению с геномной клеточной ДНК. Маркером окисления является содержание 8-охоdG в составе вкДНК. Содержание 8-охоdG в ДНК ядер клеток в норме и при патологии варьирует в среднем от 1 до 10 на миллион нуклеотидов, в составе вкДНК содержание 8-охоdG достигает 300 и более на миллион нуклеотидов. Особенно высоко содержание 8-охоdG во вкДНК онкологических больных и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. 4. Фрагментация. ВкДНК, в отличие от геномной ДНК, содержит фрагменты длиной от 15-20 т.п.н. до 100 п.н. На основании анализа свойств вкДНК мы предложили следующий механизм образования пула вкДНК с измененными свойствами, который отражен на схеме (рисунок 4.1). Допустим, на организм подействовали агентом, который вызвал гибель большого количества клеток (ионизирующее излучение). В первые минуты после воздействия в кровь поступает ДНК погибших клеток и ее концентрация значительно возрастает. Если измерить в этот момент содержание маркера рДНК в составе вкДНК, то получим значения, примерно равные содержанию рДНК в геноме. Это состояние - острый процесс гибели клеток, которое вызывается облучением, инсультом, инфарктом, сепсисом и т.д. (мы обозначили как I на рисунке 4.1). Высокий уровень концентрации циркулирующей ДНК, относительно низкие уровни эндонуклеазной активности крови и титра антител, отсутствие накопления существенных изменений в содержании ГЦ-богатой рДНК и АТДНК в составе циркулирующей ДНК – признаки острого процесса. 376 Рисунок 4.1. Схематическое представление образование пула вкДНК в организме, который подвергается действию повреждающего фактора (например, ионизирующего излучения). С течением времени, после купирования острого процесса, общая концентрация вкДНК начинает снижаться за счет работы систем элиминации. Основные ферменты этой системы – ДНКазы крови, которые в крови начинают гидролизовать фрагменты ДНК путем внесения однонитевых разрывов. По мере накопления однонитевых разрывов, последние реализуются в двунитевые разрывы, и молекулярный вес фрагментов вкДНК начинает уменьшаться. Мелкие фрагменты ДНК выводятся из кровотока с мочой. Особенностью ГЦ-ДНК (прежде всего рДНК, которая содержит местами до 80% ГЦ – пар) является то, что при накоплении однонитевых разрывов они гораздо медленнее реализуются в двунитевые разрывы. Таким образом, несмотря на однонитевые разрывы, молекулярный вес ГЦ-ДНК остается относительно высоким и она не фильтруется почками, продолжая циркулировать в крови. Естественно, если прекратить всякое поступление вкДНК в кровь, то, в конце концов, фрагментироваться и элиминироваться будут и эти фрагменты, но такого в организме не происходит. Даже у здоровых людей ежедневно гибнет большое число клеток, ДНК поступает в кровь, в том числе и вследствие чисто физиологических процессов – созревание эритроцитов из бластных клеток, функционирование нейтрофилов и т.д. Таким образом, даже у здоровых людей содержание ГЦ-ДНК обычно превышает содержание в геноме. Другой компонент системы элиминации – антитела к тотальной ДНК и к ГЦ-ДНК. В крови даже здоровых людей циркулирует небольшое количество антител (АТ) к тотальной ДНК и к ГЦ-ДНК. Причем константа связывания АТ с ГЦ-ДНК на порядок больше соответствующей 377 константы к суммарной ДНК. Часть антител связана с фрагментами вкДНК (у здоровых доноров – примерно 30%), остальная часть – циркулирует в несвязанном виде. При переходе острого процесса в хронический процесс имеет место значительное изменение свойств циркулирующей ДНК (стадия II на рисунке 4.1). Большие количества вкДНК на стадии I стимулируют увеличение экспрессии эндонуклеаз, кроме того, часть эндонуклеаз могут поступать из апоптотических клеток. Усиливается общая нуклеазная активность крови. Резкое усиление активности ДНКазы1 описано для больных инфарктом и при пережатии сосуда при операции (когда имеет место острая ишемия). Процесс селекции ГЦ-ДНК (их накопление в крови) усиливается – результатом является увеличение ГЦ-богатой рДНК в составе вкДНК по сравнению с содержанием той же последовательности в ДНК ядер клеток. Таким образом, были определены наиболее значимые характеристики вкДНК (обозначенные, как свойства вкДНК), которые могут вызывать биологические ответы клеток разных типов: (1 общая концентрация вкДНК; (2) увеличенное содержание ГЦ-ДНК (маркер – рДНК) в составе вкДНК; (3) увеличенное содержание окисленных фрагментов ДНК (маркер – 8-oxo-dG). Далее была сформулирована основная задача исследования: определить, как изменяется состояние и функциональная активность клеток различного типа при изменении концентрации, ГЦ-состава и уровня окисления вкДНК в среде культивирования. Мы исследовали влияние ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК на функционирование клеток разного типа: дифференцированных (клеток эндотелия (N=9), фибробластов, лимфоцитов), недифференцированных мезенхимных стволовых клеток (N=17) и раковых (клеток линии аденокарциномы молочной железы). На клетки действовали как образцами вкДНК (здоровых доноров и больных острыи инфарктом миокарда, ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, раком молочной железы), так и модельными фрагментами (окисленной разными способами вкДНК и ГЦ-богатыми фрагментами). Варьировали концентрацию, уровень окисления и содержание рДНК внеклеточной ДНК при действии на клетки разного типа. Проанализировав эффекты, вызываемые различными образцами вкДНК в различных типах клеток in vitro, мы определили общебиологический ответ клеток любого типа на изменение свойств вкДНК. Ниже приводится общая схема, отражающая суммарное действие окисленной и ГЦ-обогащенной ДНК в «адаптивной» концентрации на клетки разного типа (рисунок 4.2) 378 Рисунок 4.2. Схематическое действие окисленной ДНК на разные типы клеток. Основные этапы развития ответа на действие вкДНК суммированы ниже: 1. При контакте вкДНК с клетками разных типов окисленная вкДНК транспортируется в цитоплазму клеток путем эндоцитоза и локализуется вблизи поверхности ядра. Неокисленные ГЦ-богатые фрагменты вкДНК связываются с поверхностью клеток разного типа. Ранний ответ (30мин - 3 часа) клеток любого типа на действие окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК включает следующие эффекты: - Транзиторное увеличение уровня АФК вблизи митохондрий в районах цитоплазмы, сближенных с ядром. В синтезе АФК задействованы ферменты семейства NOX, в частности NOX4. Время развития окислительного стресса зависит от типа клеток и, вероятно, от разной активности антиоксидантных систем в разных типах клеток. Фрагменты окисленной вкДНК индуцируют повышение уровня в HUVEC в течение первых 3 часов, в МСК - в первые 15 минут, в MCF-7 – в течение 30 минут после начала воздействия. Воздействие окисленной внеклеточной ДНК (вкДНКокси) на фибробласты, культивируемые в условиях окислительного стресса, стимулировало синтез АФК через 72 часа инкубации. Неокисленные фрагменты вкДНК в HUVEC и MCF-7 стимулируют синтез АФК такое же время, что и окисленные фрагменты, но в меньшей степени. В МСК неокисленные фрагменты вкДНК, в отличие от окисленных, вызывают синтез АФК длительное время, при этом синез АФК тем выше, чем выше концентрация неокисленной вкДНК. Добавление неокисленных фрагментов к 379 фибробластам, культивируемым в условиях окислительного стресса, снижало синтез АФК. - Увеличение уровня АФК сопровождается окислительной модификацией ДНК ядер, возникновением быстро репарируемых одно- и двунитевых разрывов ДНК и нестабильностью генома. 2. «Сильноокисленная» ДНК в высокой концентрации (250 нг/мл и выше) и высокие концентрации рДНК (> 300 нг/мл) в составе вкДНК стимулировали увеличение клеточной гибели. ВкДНК в широком диапазоне концентраций (5-200 нг/мл), ГЦ-богатые фрагменты вкДНК в концентрации 5-200 нг/мл и «слабоокисленная» ДНК (в концентрации 5-200 нг/мл, содержание 8-oxodG - 400 на миллион нуклеозидов) вызывают во всех типах клеток адаптивный ответ, который сопровождается следующими эффектами: - Воздействие образцов окисленной и ГЦ-обогащенной ДНК (а в случае МСК только окисленной ДНК) вызывает в клетках разных типов кратковременное блокирование пролиферативной активности, остановку клеточного цикла и активацию процессов репарации разрывов ДНК ядер, сопровождающуюся пространственной перестройкой хроматина. - Во всех типах клеток фрагменты ГЦ-богатой и окисленной вкДНК вызывают адаптивный ответ, который сопровождается блокированием апоптоза и активацией процессов транскрипции генома; - Активирующее действие фрагментов вкДНК реализуетсячерез внутриклеточные рецепторы, в основном, через эндосомальный рецептор TLR9, при этом возрастает уровень экспрессии генов рецепторов AIM2, RIG1 и, в меньшей степени, адаптерной молекулы STING. Существует разница в активации экспрессии генов разных рецепторов фрагментами окисленной и ГЦ-богатой вкДНК. Уровень экспрессии цитозольного рецептора AIM2 повышается и на уровне гена, и на уровне белка в ответ на присутствие окисленных фрагментов вкДНК, и, в гораздо меньшей степени – на ГЦ-рДНК. И окисленные, и неокисленные фрагменты двуцепочечной вкДНК активируют экспрессию гена RIG1. Уровень экспрессия гена адаптерной молекулы STING возрастает в присутствии неокисленной вкДНК. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК и окисленные фрагменты вызывают активацию взаиморегулирующихся сигнальных путей, направленных на выживание клеток. Мы исследовали активацию сигнальных путей: NF-kB (Nuclear factor kappa B) – сигнального пути, 380 Nrf2 (NF-E2-related factor 2) – сигнального пути. Активацию NF-kB - сигнального пути исследовали, начиная со стимуляции рецепторов TLR9 фрагментами неметилированной ГЦ-богатой вкДНК, исследовали активацию транскриптома адаптеров и эффекторов TLR9 – и NF-kB – сигнальных путей. Активация NF-kB - и Nrf2 - сигнальных путей фрагментами вкДНК сопровождается транслокацией в ядро соответствующих транскрипционных факторов с последующей регуляцией генов – мишеней. Мы исследовали динамику изменения локализации транскрипционных факторов NF-kB и Nrf2 (из цитоплазмы в ядро и обратно в цитоплазму) при действии фрагментов вкДНК во времени. Исследовали изменение экспрессии генов – мишеней NF-kB - и Nrf2 - сигнальных путей (про- и противовоспалительных цитокинов, молокул адгезии и фермента СОД, соответственно) и проследили динамику изменения синтеза некоторых цитокинов в присутствии фрагментов вкДНК. Кроме того, мы показали, что вкДНК стимулирует повышение экспрессии транскрипционного фактора STAT3 - (Signal transducer and activator of transcription 3) на уровне гена и на уровне бела с его транслокацией в ядро; и транскрипционного фактора PPARγ - (Peroxisome proliferator-activated receptor-γ). В большинстве работ описывают работу NF-kB – и Nrf2 – сигнальных путей в противофазе. [Nguyen et al., 2000; Liu et al., 2008]. На промоторе гена NRF2 крысы обнаружены сайты связывания NF-kB [Nair et al., 2005]. Связывание NF-kB с промотером гена NRF2 носит характер петли обратной связи – при длительной активности NF-kB усиливается транскрипционная активность NRF2, супрессируя активность NF-kB [Nair et al., 2005]. Но абсолютно антагонистический эффект двух факторов во всех ситуациях маловероятен: мультифакториальные агенты и стимулы, такие как АФК, ЛПС, окисленные ЛПНП вызывают одновременную активацию и NRF2, и NF-kB [Wakabayashi et al., 2010]. Мы рассмотрели динамику изменения активности транскрипционных факторов NF-kB и Nrf2 на уровне экспрессии их генов. Показали, что уровни экспрессии генов адаптеров и эффекторов NF-kB – и Nrf2 – сигнальных путей, несмотря на разную амплитуду изменения экспрессии генов, в динамике изменяются аналогично уровням экспрессии соответствующих транскрипционных факторов в разных типах клеток. В МСК при действии окисленных фрагментов активация транскрипции генов NFkB и Nrf2 происходит рано. Однако уровень экспрессии транскрипционного фактора NFkB повышается лишь незначительно через 30 минут после начала воздействия и быстро – через 1 час - ингибируется при повышении транскрипции NRF2 (рисунок. 4.3 Б, 4.4). 381 Рисунок 4.3. Динамика изменения активности транскрипционных факторов NF-kB и Nrf2 на уровне экспрессии их генов при действии ГЦ-богатых (А) и окисленных фрагментов (Б, В) в мезенхимных стволовых клетках (МСК). При действии ГЦ-богатых фрагментов на МСК активация транскрипции NF-kB и Nrf2 смещена в сторону более позднего времени. Уровень экспрессии NF-kB возрастает через 3 - 24 часа, Транскрипция NRF2 только начинает активироваться к 24 часам. И в этом случае мы наблюдаем частичное перекрывание профилей экспрессии генов NF-kB и Nrf2 (рисунок 4,3 А) При действии ГЦ-богатых и окисленных фрагментов на клетки эндотелия (HUVEC), уровень экспрессии гена NRF2 возрастает через 2-3 часа. Транскрипция гена NF-kB при действии ГЦ-богатых фрагментов активируется к 3 часам, но уровень экспрессии выше примерно в 2 раза чем гена NRF2. – в этом случае профили экспрессии двух исследуемых факторов транскрипции частично перекрываются (рисунок 4.5. А). При действии окисленных фрагментов уровень экспрессии гена NF-kB возрастает позднее – через 24 часа на стадии снижения транскрипционной активности NRF2 (рисунок 4.5. Б). 382 Рисунок 4.5. Взаимодействие двух сигнальных путей NRF2 и NF-kB в HUVEC при действии ГЦ-богатых (А) и окисленных фрагментов (Б) в клетках эндотелия (HUVEC). При действии фрагментов окисленной вкДНК и неокисленной ДНК наблюдается кратковременный подъем уровня экспрессии гена NRF2 - максимум экспрессии гена NRF2 приходится на 2 часа, затем происходит снижение количества РНК NRF2. .При действии ГЦ-богвтых фрагментов подъем уровня экспрессии гена NF-kB происходит поздно, достигая максимума к 24 часам, и сохраняется долго. При действии окисленных фрагментов максимум приходится на 3 часа и наблюдается частичное перекрывание профилей экспрессии NF-kB и Nrf2 (рисунок 4.6). Рисунок 4.6. Взаимодействие двух сигнальных путей NRF2 и NF-kB в MCF-7 при действии ГЦ-богатых (А) и окисленных фрагментов (Б) в клетках аденокарциномы молочной железы (MCF-7). В фибробластах, культивируемых в условиях длительного окислительного стресса, при действии окисленных фрагментов ингибируется транскрипционная активность гена NF-kB и активируется - NRF2 (рисунок 4.7) 383 Рисунок 4.7. Взаимодействие двух сигнальных путей NRF2 и NF-kB в HDF и HEF при действии окисленных фрагментов ДНК в эмбриональных фибробластах легкого и фибробластах кожи взрослого человека. Внеклеточная ДНК с умеренно повышенным ГЦ - содержанием и слабоокисленная ДНК, способствуют повышению выживаемости клеток. Наиболее выражен этот эффект в условиях сильного окислительного стресса (ионизирующее излучение или 5% этилового спирта). ВкДНК с умеренно повышенным ГЦ-содержанием и слабоокисленная ДНК вызывали адаптивный ответ в клетках, «защищая» культуру клеток от гибели – выживало более 50% всех клеток, в то время, как подобное воздействие приводило к гибели интактных клеток (без добавления вкДНК). Обнаруженный эффект действия малых доз вкДНК на МСК позволяет предложить альтернативную стратегию повышения жизнеспособности МСК, применяемых в трансплантологии и для лечения заболеваний, сопровождающихся дегенерацией тканей – краткосрочную (3-24 часа) предобработку (прекондиционирование) культуры МСК плазмидой GC-пДНК в низких концентрациях (50 нг/мл). Преимущества использования плазмиды – низкая действующая концентрации и высокая устойчивость к нуклеазному гидролизу. «Сильноокисленнная» ДНК в высокой концентрации (250 нг/мл и выше) и высокие концентрации ГЦ-ДНК в составе вкДНК вызывали апоптоз клеток. Введение специфичных антител к вкДНК или блокирование сигнала от вкДНК на уровне рецепторов может нейтрализовать негативное действие высоких концентраций вкДНК. Действие окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК может значительно изменять функциональную активность клеток различного типа. Например, циркулирующая ДНК больных острым инфарктом миокарда и ишемической болезнью 384 сердца и окисленная вкДНК негативно влияют на функциональную активность клеток сосудистого эндотелия: снижает уровень NO/eNOS, что приводит к дисфункции клеток эндотелия. В совокупности с увеличением уровня активных форм кислорода и реорганизацией цитоскелета это приводит к нарушению проницаемости эндотелия и развитию патологии. При этом вкДНК плазмы крови здоровых доноров и ГЦ-ДНК в биологической концентрации, наоборот, повышают уровень NO. Таким образом, циркулирующая окисленная ДНК – потенциальная мишень для терапии при сердечнососудистой патологии. Мы показали, что окисленная ДНК активирует в МСК гены транскрипционных факторов миогенной дифференцировки (MyoD1, MyoG, MYF5, MRF). С другой стороны, было установлено, что окисленная ДНК является фактором, повышающим жизнеспособность раковых клеток (MCF7). Причем, эта устойчивость развивается на фоне индуцированной нестабильности генома клеток. Такое опасное сочетание может приводить к появлению еще более агрессивных клонов опухоли. Таким образом, при проведении лучевой терапии необходимо принимать в расчет образование значительных количеств окисленной ДНК, которая является фактором, стимулирующим выживание поврежденных клеток 385 ВЫВОДЫ 1. На основании сравнения количества ГЦ-богатой последовательности рибосомного повтора в составе вкДНК и гДНК у 736 человек (больных аутоиммунными, сердечно-сосудистыми заболеваниями, беременных женщин, лиц, контактировавших с ионизирующим излучением, и здоровых доноров) показано увеличение содержания ГЦ-богатой последовательности рибосомного повтора в составе циркулирующей вкДНК плазмы периферической крови по сравнению с гДНК независимо от статуса здоровья (α<<10-10). 2. Концентрация ГЦ-богатой последовательности рибосомного повтора в составе циркулирующей вкДНК плазмы периферической крови достоверно выше в группах больных заболеваниями, сопровождающимися увеличением клеточной гибели (ревматоидный артрит, атеросклероз сосудов головного мозга, артериальная гипертония, ОИМ, ИБС), лиц, подвергшихся воздействию ионизирующего облучения, и беременных женщин по сравнению с выборкой здоровых доноров (α<<10-10). В составе вкДНК больных ОИМ и РМЖ обнаружено накопление окисленных остатков дезоксигуанозина (р<0,05). Выраженная биологическая активность внДНК обусловлена накоплением ГЦ-богатой ДНК рибосомного повтора и окисленных оснований в её составе. 3. Окисленные фрагменты вкДНК обладают большей проникающей способностью как в нормальные сравнению с (HUVEC), так и в злокачественные клетки (MCF-7) по неокисленными фрагментами вкДНК, (р<0,05). Окисленные фрагменты проникают в цитоплазму и локализуются вблизи ядра, неокисленные связываются с мембраной клетки. 4. Показан новый, ранее не описанный ответ клеток на фрагменты вкДНК: ГЦобогащенные и окисленные фрагменты вкДНК вызывают в злокачественных (MCF-7) и нормальных клетках (HUVEC, МСК, фибробластах человека) кратковременный (от 15-30 минут в МСК и MCF7, до 3 часов – в HUVEC) синтез активных форм кислорода рядом с ядерной мембраной (р<0,05). Синтез активных форм кислорода связан с митохондриями (в MCF-7) и ассоциирован с повышением уровня экспрессии гена NOX4 (в HUVEC, МСК, MCF-7) и количества белка NOX4 (в HUVEC). 5. Окисленные фрагменты вкДНК вызывают окислительную модификацию ДНК в ядрах раковых (MCF-7) и нормальных клеток (HUVEC, МСК), что сопровождается транзиторным образованием быстрорепарируемых одно- и двунитевых разрывов 386 ДНК и нестабильностью генома, которая сильнее выражена в раковых клетках MCF-7. 6. В клетках эндотелия человека, фибробластах и злокачественных клетках линии MCF-7 окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают кратковременное блокирование пролиферативной активности, сопровождающееся повышением уровня экспрессии гена CCND1 (р<0,05). Фрагменты окисленной и, в меньшей степени, ГЦ-богатые фрагменты вкДНК блокируют клеточный цикл в клетках линии MCF-7 в G0/G1- фазе, в культуре клеток HUVEC – в G1- , S - и G2/M фазах клеточного цикла. 7. Общей закономерностью реакции клеток разного типа на окислительный стресс, вызываемый ГЦ-богатыми и окисленными фрагментами в составе вкДНК, на уровне транскриптома является адаптивный ответ. Характерной особенностью адаптивного ответа является достоверное повышение уровня экспрессии антиапоптотических генов BCL2, BCL2А1, BCL2L1, BIRC2(c-IAP1) и BIRC3 (cIAP2), гена репарации BRCA-1, 30 генов адаптеров, костимуляторов и эффекторов сигнального пути NF-kB и генов транскрипционных факторов PPARG и STAT3. Результатом изменений транскриптома является повышение выживаемости всех типов клеток. 8. В клетках МСК, HUVEC и MCF-7 достоверно изменяется транскрипционная активность генов NFKB1 и мастер-регулятора антиокислительного ответа клеток NRF2. Реакция транскриптома клеток на воздействие ГЦ-богатых и окисленных фрагментов различается по длительности и амплитуде профиля экспрессии генов транскрипционных факторов NRF2 и NF-kB (р<0,05). 9. Развитие инициируемого вкДНК адаптивного ответа клеток человека сопровождается перемещением транскрипционных факторов NF-kB, NRF2 и STAT3 из цитоплазмы в ядро в клетках MCF-7, HUVEC, МСК и в фибробластах, что приводит к усилению экспрессии генов SOD1, цитокинов (TNF, IL1B, IL8, IL6, IL-1), молекул адгезии (ICAM1, VCAM1, VEGF в HUVEC) и повышению синтеза цитокинов. 10. Действие на клетки фрагментов вкДНК вызывает повышение уровня экспрессии внутриклеточных рецепторов TLR9, AIM2 и RIG1 (р<0,05), участвующих в распознавании чужеродных нуклеиновых кислот. 11. Эпигенетическая модификация фрагментов вкДНК, вызванная окислением, блокирует их способность стимулировать синтез в клетках эндотелия человека низкомолекулярного сигнального медиатора внутриклеточных и внеклеточных 387 процессов – оксида азота II (р<0,05). Окисленные фрагменты вкДНК повышают в МСК экспрессию генов ключевых транскрипционных факторов миогенной дифференцировки (MYOD1, MYOG, MYF5, MRF4) (р<0,05). 12. Фрагменты вкДНК с умерено повышенным содержанием ГЦ (5 – 150 нг/мл) или слабым окислением остатков гуанозина (до 400 8-oxodG на 106 нуклеозидов) обладают способностью защищать клетки от гибели при воздействии химических и физических повреждающих факторов. 388 ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 1. Результаты исследования, вошедшие в диссертацию, могут быть использованы при разработке тест-систем для диагностики хронических патологических процессов и состояний, характеризующихся повышенным уровнем гибели клеток организма. Часть результатов диссертационной работы была получена и использована в рамках выполнения прикладных разработок по Государственному Контракту № 14.512.11.0090 на выполнение поисковых научноисследовательских работ по теме «Разработка высокоточной тест-системы для оценки и прогнозирования индивидуальной радиочувствительности человека». 2. При выполнении диссертационной работы выявлено, что в составе внеклеточной ДНК накапливаются ГЦ-обогащенные фрагменты транскрибируемой области рибосомного повтора. Этот факт является базой для разработки диагностических систем эпигенетических маркеров. По результатам работы зарегистрирован патент регистрационный номер 2013147906/20 (074505). «Определение содержания GC-богатой последовательности генома (GC-ДНК) в составе циркулирующей внеклеточной ДНК плазмы периферической крови как способ определения уровня гибели клеток при хронических заболеваниях, при физиологических состояниях (беременность) и при хроническом действии неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека». 3. В диссертационной работе показано, что фрагменты внеклеточной ДНК с умеренно повышенным содержанием ГЦ-обогащенных и окисленных фрагментов могут повышать жизнеспособность клеток. На основании этого факта было разработана альтернативная стратегия «прекондиционирования» мезенхимных стволовых клеток при трансплантации и подана заявка на патент регистрационный номер 2013147907/20 (074506) « Применение фрагмента ДНК транскрибируемой области рибосомного повтора для повышения устойчивости мезенхимных стволовых клеток к действию агрессивных факторов окружающей среды». 4. Обнаруженный при выполнении диссертационной работы факт повышения выживаемости раковых клеток при контакте с фрагментами внеклеточной ДНК может привести к коррекции схем проведения радиотерапевтических процедур при лечении в онкологии. Внедрение С использованием результатов работы в ходе выполнения государственного контракта № 14.512.11.0090 (МОН РФ, 2013 г) разработана тест-система для оценки индивидуальной радиочувствительности человека. 389 Благодарности: Искренне благодарю Вейко Наталью Николаевну, моего научного консультанта, за неоценимые советы и помощь при выполнении диссертационной работы. Благодарю сотрудников лаботатории молекулярой биологии, включая группу работы с культурами клеток, и всех сотрудников ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН за помощь и поддержку при выполнении экспериментальной части работы и мудрые советы на всех этапах написания этой работы. Отдельная благодарность д.б.н., проф. В.М Писареву за внимательное рецензирование диссертационной работы и ценные советы. Часть материалов работы была получена и использована в рамках выполнения прикладных разработок по Государственному Контракту № 14.512.11.0090 на выполнение высокоточной поисковых научно-исследовательских тест-системы для радиочувствительности человека». оценки и работ по прогнозирования теме «Разработка индивидуальной 390 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Баскова, И.П. Применение нового реагента Cu-FL для анализа стимуляции синтеза NO секретом слюнных клеток медицинской пиявки в эндотелии человека (HUVEC) и кардиомиоцитах крысы/ И.П. Баскова, А.Ю.Алексеева, С.В. Костюк, М.Е. Неверова, Т.Д. Смирнова, Н.Н. Вейко // Биомедицинская химия – 2012. – Т. 58. – № 1. – С. 65-76. 2. Вейко, Н.Н. Cтимулирующее действие фрагментов транскрибируемой области рибосомного повтора на лимфоциты периферической крови человека/ Н.Н. Вейко, Е.А. Калашникова, С.Н. Кокаровцева, С.В. Костюк, А.В. Ермаков, С.М. Иванова, Т.А. Рязанцева, Н.А. Еголина, Н.А. Ляпунова, Д.М. Спитковский // БЭБиМ. – 2006. – Т. 10. – С. 410-414. 3. Вейко, Н.Н. ДНК сыворотки крови больных ревматоидным артритом значительно обогащена фрагментами рибосомных повторов, содержащих иммуностимулирующие CpG–мотивы/ Н.Н. Вейко, Н.О. Шубаева, С.М. Иванова, А.И. Сперанский, Н.А. Ляпунова, Д.М. Спитковский // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. – 2006. – № 9. – С. 313-316 4. Вейко, Н.Н. Изменение свойств внеклеточной ДНК периферической крови при ревматоидном артрите/ Н.Н. Вейко, С.В. Костюк, Н.О. Шубаева, С.М. Иванова, А.И. Сперанский // Иммунология. – 2007. – Т. 28. – № 3. – С. 389-394. 5. Вейко, Н.Н. Количественное определение повторяющихся последовательностей в геномной ДНК человека. Обнаружение увеличенного количества рибосомных повторов в геномах больных шизофренией (результаты молекулярного и цитогенетического анализа)/ Н.Н. Вейко, Н.А. Еголина, Г.Г. Радзивил и др. // Молекулярная биология. – 2003. – Т. 37. – № 3. – С. 409-419. 6. Вейко, Н.Н. Сыворотка периферической крови здоровых людей содержит антитела к фрагменту транскрибируемой области рибосомного повтора/ Н.Н. Вейко, С.В. Костюк, А.В. Ермаков, Е.А. Калашникова, Т.А. Рязанцева, А.И. Сперанский // БЭБиМ. – 2007. – Т. 9. – С. 277-282. 7. Вейко, Н.Н. Фрагменты транскрибируемой области рибосомного повтора в составе внеклеточной ДНК - маркёр гибели клеток организма/ Н.Н. Вейко, Н.В. Булычева, О.А. Рогинко, Р.В. Вейко, Е.С. Ершова, О.А. Коздоба, В.А. Кузьмин, А.М. Виноградов, А.А. Юдин, А.И. Сперанский/ Биомед. химия. – 2008. – Т. 54. – № 1. – С. 78-92. 8. Дарий, М.В. Димерные бисбензимидазолы: цитотоксичность и влияние на метилирование ДНК в нормальных и раковых клетках человека/ М.В. Дарий, А.Р. 391 Рахимова, В.Н. Ташлицкий, С.В. Костюк, Н.Н. Вейко, Ф.Ф. Иванов, А.Л. Жузе, Е.С. Громова // Молекулярная биология, – 2013. – Т. 47. – № 2. – С. 292-301 9. Дерффель, К. Статистика в аналитической химии/ К. Дерффель //— M.: Мир, 1994. — 268 с 10. Ермаков, А.В. Развитие адаптивного ответа и эффекта свидетеля в мезенхимальных стволовых клетках человека после воздействия рентгеновского излучения в малой дозе/ А.В. Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Р.В. Вейко, И.Ю. Кубасова, Л.Н. Любченко, Н.Н. Вейко // Радиац. биология. Радиоэкология. – 2010. – Т. 50. – № 1. – С. 42–51. 11. Ермаков, А.В. CpG-ДНК ингибирует клеточные реакции, сопровождающие развитие адаптивного ответа в лимфоцитах человека после воздействия рентгеновского излучения в малых дозах/ А.В.Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Е.А. Калашникова, С.Н. Кокаровцева, Н.А. Еголина, Н.Н. Вейко // Радиац. биология. Радиоэкология. – 2009. – Т. 49. – № 1. – С. 34-41. 12. Ермаков, А.В. ДНК-сигнальный путь, обеспечивающий развитие радиационного эффекта свидетеля в клетках человека/ А.В. Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Н.Н. Вейко // Радиац. биология. Радиоэкология. – 2011, – Т. 51. – № 6. – С. 651-659. 13. Ермаков, А.В. Развитие эффекта свидетеля в мезенхимальных стволовых клетках человека после воздействия рентгеновского излучения в малой дозе/ А.В. Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Р.В. Вейко, И.Ю. Кубасова, Л.Н. Любченко, Н.Н. Вейко // Радиац. биология. Радиоэкология. – 2010. – Т. 50. – № 1. – С. 42-51. 14. Ермаков, А.В. Реакция раковых стволовых клеток человека на воздействие ионизирующего излучения в малых дозах/ А.В. Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Е.С. Ершова, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Л.В. Ефремова, Л.Н. Любченко, Н.Н. Вейко // Радиац. биология. Радиоэкология. – 2009. – Т. 49. – № 5. – С. 528-537. 15. Ермаков, А.В. Сигнализация между лимфоцитами человека после индукции эффекта свидетеля ионизирующей радиацией в адаптирующих дозах/ А.В. Ермаков, С.В. Костюк, Н.А. Еголина, Е.А. Калашникова, С.Н. Кокаровцева, Е.М. Малиновская, Н.Н. Вейко // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2007. – Т. 47б. – № 6. – С. 650-657. 16. Ермаков, А.В. Субпопуляция лимфоцитов периферической крови человека, экстремально отвечающая на воздействие малых доз ионизирующей радиации, интерлейкина–2 и совместное влияние этих факторов/ А.В. Ермаков, Н.И. 392 Поспехова, Д.М. Спитковский // Радиац. биология. Радиоэкология. – 2000. – Т. 40. – № 1. – С. 62-70. 17. Ермаков, А.В. Фрагменты внеклеточной ДНК из среды культивирования лимфоцитов человека, облученных в малых дозах, запускают развитие окислительного стресса и адаптивного ответа в необлученных лимфоцитах – свидетелях/ А.В. Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Н.А. Еголина, Н.Н. Вейко // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2008. – Т. 48. – С. 485-496. 18. Ермаков, А.В. Фрагменты ДНК, обнаруживаемые в среде после воздействия ионизирующей радиации в адаптирующих дозах, являются фактором стресссигнализации между лимфоцитами и клетками-свидетелями/ А.В. Ермаков, С.В. Костюк, Н.А. Еголина Е.М. Малиновская, Н.Н. Вейко, Д.М. Спитковский // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2007. – Т. 47. – № 2. – С. 133-140. 19. Ефремова, Л.В. Внеклеточная ДНК влияет на количество NO в эндотелиальных клетках человека/ Л.В. Ефремова, А.Ю. Алексеева, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Е.С. Ершова, Т.Д. Смирнова, И.Л. Конорова, Н.Н. Вейко // БЭБиМ. – 2010. – Т. 149. – № 9. – С. 156-162. 20. Карпухин, А.В. Анализ взаиморасположения гомологичных хромосом в интерфазных ядрах лимфоцитов человека/ А.В. Карпухин, А.Г. Салимов, Н.Н. Вейко, С.А. Карпухин, А.И. Богуш // Генетика. – 1994. – Т. 30. – С. 66. 21. Карпухин, А.В. Нерадиоактивная детекция ДНК-зондов при гибридизации in situ с помощью нового фотоактивируемого реагента для биотинирования нуклеиновых кислот/ А.В. Карпухин, А.Г. Салимов, Н.Н. Вейко и др .// Мол. генетика, микробиология и вирусология. – 1991. – № 11. – С. 13-14. 22. Костюк, С.В. Изменение свойств внеклеточной ДНК периферической крови и частоты TCR-мутантных клеток при ионизирующей радиации/ С.В. Костюк, действии на организм человека И.А. Замулаева, Р.К. Агапова, А.В. Ермаков, А.С. Саенко, Н.В. Орлова, С.Г. Смирнова, Н.Н. Вейко, Д.М. Спитковский // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2008. – Т. 48. – С. 5-13. 23. Костюк, С.В. Внеклеточная ДНК влияет на функциональную активность клеток эндотелия/ С.В. Костюк, А.Ю. Алексеева, М.С. Конькова, Т.Д. Смирнова, А.В. Ермаков, Л.В. Ефремова, И.Л. Конорова, Н.Н. Вейко // Медицинская генетика. – 2010. – Т. 1. – С. 38-46. 24. Костюк, С.В. Увеличение экспрессии iNOS в эндотелиальных клетках человека при длительном культивировании с фрагментами внеклеточной ДНК/ С.В. Костюк, 393 Т.Д. Смирнова, Л.В. Ефремова, М.С. Конькова, А.Ю. Алексеева, Л.В. Каменева, Н.Н. Вейко // БЭБиМ. – 2010. – Т. 149. – № 9. – С. 151-156. 25. Костюк, С.В. Фрагменты внеклеточной ДНК усиливают транскрипционную активность генома мезенхимальных стволовых клеток человека, активируют TLRзависимый сигнальный путь и ингибируют апоптоз/ С.В. Костюк, Е.М. Малиновская, А.В. Ермаков, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, О.В. Чвартацкая, П.А. Лосева, Е.С. Ершова, Л.Н. Любченко, Н.Н. Вейко // Биомедицинская химия. – 2012. – Т. 58. – № 6. – С. 673-683. 26. Костюк, С.В. Хроническое действие ионизирующего излучения вызывает значительное снижение концентрации циркулирующей ДНК плазмы крови / С.В. Костюк, Е.С. Ершова, Н.Н. Вейко // Медицинская генетика. – 2013. – Т.12. – № 137. – С. 29-35. 27. Костюк, С.В.. Хроническое действие ионизирующего излучения вызывает увеличение содержания рибосомного повтора в составе циркулирующей ДНК плазмы крови/ С.В. Костюк, Е.С. Ершова, И.Л. Конорова, Н.Н. Вейко // Медицинская генетика. – 2013. – Т. 12. – № 138 – С. 20-28. 28. Ляпунова, Н.А. Ядрышкообразующие районы (ЯОР) хромосом человека: опыт количественного цитологического и молекулярного анализа/ Н.А. Ляпунова, Н.А. Еголина, Т.Г. Цветкова и др., // Биологические мембраны. – 2001. – Т. 18. – С. 189199. 29. Малиновская, Е.М. Изменения комплекса рибосомных генов человека при старении/ Е.М. Малиновская, Т.Д. Смирнова, Н.А. Еголина, Т.Г. Цветкова, Н.В. Косякова, И.А. Мандрон, Е.В. Мхитарова, С.В. Костюк, С.М. Терехов, Г.М. Местергази, Н.Н. Вейко, Н.А. Ляпунова // Медицинская генетика. – 2008. – Т. 7. – № 2. – С. 10–16. 30. Пол У. // Иммунология. – 1989. – Т. 3. – С. 358. 31. Сергеевичев, Д.С. Молекулярный анализ экспрессии генов семейства VEGF в мононуклеарных клетках костного мозга человека после плеттинга/ Д.С. Сергеевичев П.М. Ларионов, Д.В. Субботин, Р.Б. Новрузов, Е.Н. Кливер, А.М. Караськов // Патология кровообращения и кардиохирургия. – 2010. - № 1. – С. 7075. 32. Спитковский, Д.М. Концепция действия малых доз ионизирующих излучений на клетки и её возможные последствия к трактовке медико-биологических последствий/ Д.М. Спитковский// Радиац. биол. Радиоэкология. – 1992. – Т. 32. – № 3. – С. 382-400. 394 33. Томилин, Н.В. Генетическая трансформация соматических клеток/ Н.В. Томилин, О.И. Подгорная, Д.С. Абрамян, О.К. Глебов // Цитология. – 1984. – Т. XXVII. – № 5. – С. 554-564. 34. Тырсина, Е.Г. Структурные перестройки хроматина в ходе адаптивного ответа в двух генетически родственных линиях фибробластов джунгарского хомячка с различной радиочувствительностью/ Е.Г. Тырсина, Е.Д. Алипов, Т.В. Иваненко // Радиац.биология.Радиоэкология. – 2006. – Т. 46. – № 6. – C. 697-706 35. Ярилин, А.А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии/А.А. Ярилин // Актуальные проблемы патофизиологии. Под ред. Б.Б.Мороза. – М.: Медицина. – 2001. – С. 13-56. 36. Abdelalim, E.M. Molecular Mechanisms Controlling the Cell Cycle in Embryonic Stem Cells/ E.M. Abdelalim // Stem Cell Rev. – 2013. – V. 9. – № 6. – Р. 764-773. 37. Ablasser, A. RIG-I-dependent sensing of poly(dA:dT) through the induction of an RNA polymerase III-transcribed RNA intermediate/ A. Ablasser, F. Bauernfeind, G. Hartmann, E. Latz, K.A. Fitzgerald, V. Hornung // Nat. Immunol. – 2009. – V. 10. – Р. 1065–1072. 38. Adams, J.M. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis/ J.M. Adams // Genes Dev. – 2003. – V. 17. – № 20. – P. 2481-2495. 39. Aggarwal, B. B. Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer/ B.B. Aggarwal, S. Shishodia, // Biochem. Pharmacol. – 2006. – V. 71. – P. 1397-1421. 40. Agostini, M. Circulating cell-free DNA: a promising marker of pathologic tumor response in rectal cancer patients receiving preoperative chemoradiotherapy/ M. Agostini, S. Pucciarelli, M.V. Enzo, P. Del Bianco, M. Briarava, C. Bedin, I. Maretto, M.L. Friso, S. Lonardi, C. Mescoli, P. Toppan, E. Urso, D. Nitti // Ann Surg Oncol. – 2011. – V. 18. – P. 2461-2468. 41. Akira, S. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity/ S. Akira, K. Takeda, T. Kaisho. // Nat Immunol. – 2001. – V.2. – P. 675–680. 42. Al Nakib, M. Total and fetal cell-free DNA analysis in maternal blood as markers of placental insufficiency in intrauterine growth restriction/ M. Al Nakib, R. Desbrière, N. Bonello, F. Bretelle, L. Boubli, J. Gabert, A. Levy-Mozziconacci // Fetal Diagn Ther. – 2009. – V. 26. – № 1. – P. 24-28. 43. Alekseeva, A.Y. Cell Free DNA (cfDNA) Influences Nitric Oxide and ros Levels in Human Endothelial Cells/ A.Y. Alekseeva, N.V.Bulicheva, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, N.N. Veiko // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. – 2011. – V. 31. – P. 219-223. 395 44. Andersen, J.M. Innate immunity at the mucosal surface: role of toll-like receptor 3 and toll-like receptor 9 in cervical epithelial cell responses to microbial pathogens / J.M. Andersen, D. Al-Khairy, R.R. Ingalls // Biol. Reprod. – 2006. – V.74. – № 5. – P. 824831. 45. Andersson, U. HMGB1 is a therapeutic target for sterile inflammation and infection/ U. Andersson, K.J. Tracey // Annu Rev Immunol. – 2011. – V. 29. – P. 139–162. 46. Anilkumar, N. 28-kDa splice variant of NADPH oxidase-4 is nuclear-localized and involved in redox signaling in vascular cells/ N. Anilkumar, G. San Jose, I. Sawyer, C.X. Santos, C. Sand, A.C. Brewer, D. Warren, M.A. Shah // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2013. – V. 33. – № 4. – P. 104-112. 47. Ansell, P.J. Repression of cancer protective genes by 17beta-estradiol: ligand-dependent interaction between human Nrf2 and estrogen receptor alpha/ P.J. Ansell, S.C. Lo, L.G. Newton, C. Espinosa-Nicholas, D.D. Zhang, J.H. Liu, M. Hannink, D.B. Lubahn // Mol Cell Endocrinol. – 2005. – V. 243. – P. 27–34. 48. Antunes, F. Redox regulation of NF-kappaB: from basic to clinicalresearch/ F. Antunes, D. Han // Antioxid. Redox Signal. – 2009. – V. 11. – P. 2055-2056. 49. Armant, M.A. Toll-like receptors: a family of pattern-recognition receptors in mammals/ M.A. Armant, M.J. Fenton // Genome Biol. – V. 3. – P. 3011-3016. 50. Arnalich, F. Prognostic value of cell-free plasma DNA in patients with cardiac arrest outside the hospital: an observational cohort study / F.Arnalich, M. Menendez, V. Lagos, E. Ciria, A. Quesada, R. Codoceo, J.J.Vazquez, E. Lopez-Collazo, C.Montiel // Crit. Care. – 2010. – V.14. – № 2. –P. 47-54. 51. Arroyo, J.D. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma/ J.D. Arroyo, J.R. Chevillet, E.M. Kroh, I.K. Ruf, C.C. Pritchard, D.F. Gibson, P.S. Mitchell, C.F. Bennett, E.L. PogosovaAgadjanyan, D.L. Stirewalt, J.F. Tait, M. Tewari // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2011. – V. 108. – P. 5003-5008. 52. Ashman, R. F. Sequence requirements for oligodeoxyribonucleotide inhibitory activity/ R.F. Ashman, J. A. Goeken, J. Drahos, P. Lenert // International Immunology. – 2005. – V. 17. – № 4. – P. 411–420. 53. Ashman, R. F. Structural requirements and applications of inhibitory oligodeoxyribonucleotides/ R.F. Ashman, P. Lenert // Immunologic Research. – 2007. – V. 39. – № 1–3. – P. 4–14. 396 54. Atamaniuk, J. Cell-free plasma DNA: a marker for apoptosis during hemodialysis/ J. Atamaniuk, K. Ruzicka, K.M. Stuhlmeier et al. // Clin. Chem. – 2006. – V. 52. – № 3. – P. 523-526. 55. Avalos, A. M. Cell-specific TLR9 trafficking in primary APCs of transgenic TLR9-GFP mice/ A.M. Avalos, O. Kirak, J.M. Oelkers, M.C. Pils, Y.M. Kim, M. Ottinger M, et al. // J. Immunol. – 2013. – V. 190. – P. 695–702. 56. Avalos, A. M. Differential cytokine production and bystander activation of autoreactive B cells in response to CpG-A and CpG-B oligonucleotides/ A.M. Avalos, E. Latz, B. Mousseau, et al. // Journal of Immunology. – 2009. – V. 183. – № 8. – P. 6262–6268. 57. Avalos, A.M. RAGE-independent autoreactive B cell activation in response to chromatin and HMGB1/DNA immune complexes/ A.M. Avalos et al. // Autoimmunity. – 2010. – V.43. – P. 103–110. 58. Banáth, J.P. Explanation for excessive DNA single-strand breaks and endogenous repair foci in pluripotent mouse embryonic stem cells/ J.P. Banáth, C.A. Bañuelos, D. Klokov, S.M. MacPhail, P.M. Lansdorp, P.L. Olive // Exp Cell Res. – 2009. – V. 315. – № 8. – P. 1505-1520. 59. Barajas, B.N. NF-E2-related factor 2 promotes atherosclerosis by effects on plasma lipoproteins and cholesterol transport that overshadow antioxidant protection/ B.N. Barajas, F. Che, A. Yin, L.D. Rowshanrad, K.W. Orozco, X. Gong, L.W. Wang, K. Castellani, A.J. Reue, J.A. Lusis, K.M. Araujo // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2011. – V. 31. – P. 58-66. 60. Baranovskii, A.G. Human deoxyribonucleases/ A.G. Baranovskii, V.N. Buneva, G.A. Nevinsky // Biochemistry. – 2004. – V. 69. – № 6. – P.587-601. 61. Barascu, A. Oxydative stress alters nuclear shape through lamins dysregulation: a route to senescence/ A. Barascu, C. Le Chalony, G. Pennarun, D. Genet, N. Zaarour, P. Bertrand // Nucleus. – 2012. – V. 3. – № 5. – P. 411-417. 62. Barber, G.N. Cytoplasmic DNA innate immune pathways/ G.N. Barber // Immunol Rev. – 2011. – V. 243. – № 1. – P. 99-108. 63. Barber, G.N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses/ G.N. Barber // Curr Opin Immunol. – 2011. – V. 23. – № 1. – P. 10-20. 64. Barrat, F. J. Nucleic acids of mammalian origin can act as endogenous ligands for Tolllike receptors and may promote systemic lupus erythematosus/ F.J. Barrat, T. Meeker, J. Gregorio, et al. // Journal of Experimental Medicine. – 2005. – V. 202. – № 8. – P. 1131– 1139. 397 65. Barrat, F. J. Treatment of lupus-prone mice with a dual inhibitor of TLR7 and TLR9 leads to reduction of autoantibody production and amelioration of disease symptoms/ F.J. Barrat, T. Meeker, J.H. Chan, C. Guiducci, R.L. Coffmann // European Journal of Immunology. – 2007. – V. 37. – № 12. – P. 3582–3586. 66. Barrat, F.J. Nucleic acids of mammalian origin can act as endogenous ligands for Tolllike receptors and may promote systemic lupus erythematosus/ F.J. Barrat, T. Meeker, J. Gregorio, J.H. Chan, S. Uematsu, S. Akira et al. // J Exp Med. – 2005. – V. 202. – P. 1131–1139. 67. Barrett, A.N. Implementing prenatal diagnosis based on cell-free fetal DNA: accurate identification of factors affecting fetal DNA yield/ A.N. Barrett, B.G. Zimmermann, D. Wang, A. Holloway, L.S. Chitty // PLoS One. – 2011. – V. 6. – P. 252-258. 68. Barton, G.M. A cell biological view of Toll - like receptor function: regulation through compartmentalization/ G.M. Barton, J.C. Kagan // Nat.Rev.Immunol. – 2009. – V. 9. – P. 535–542. 69. Basith, S. Evolutionary, structural and functional interplay of the IκB family members/ S. Basith, B. Manavalan, V. Gosu, S. Choi // PLoS One. – 2013. – V. 8. – P. 541-543. 70. Basnakian, A.G. DNase I-like endonuclease in rat kidney cortex that is activated during ischemia/reperfusion injury/ A.G. Basnakian, N. Ueda, G.P. Kaushal, M.V. Mikhailova, S.V. Shah // J Am Soc Nephrol. – 2002. – V. 13. – P. 1000-1007. 71. Baud, V. The alternative NF-kB activation pathway and cancer: friend or foe?/ V. Baud, E. Jacque // Med. Sci. – 2008. – V. 24. – P. 1083-1088. 72. Bauer, S. Toll-like receptor 9 processing: the key event in Toll-like receptor 9 activation?/ S. Bauer // Immunol Lett. – 2013. – V. 149. – P. 85-87. 73. Bauernfeind, F. Of inflammasomes and pathogens--sensing of microbes by the inflammasome/ F. Bauernfeind, V. Hornung // EMBO Mol Med. – 2013. – V.5. – P. 814826. 74. Beck, J. Next generation sequencing of serum circulating nucleic acids from patients with invasive ductal breast cancer reveals differences to healthy and nonmalignant controls/ J. Beck, H.B. Urnovitz, W.M. Mitchell, E. Schutz // Mol Cancer Res. – 2010. – V. 8. – P. 335-342. 75. Beck, J. Profile of the circulating DNA in apparently healthy individuals/ J. Beck, H.B. Urnovitz, J. Riggert, M. Clerici, E. Schutz // Clin Chem. – 2009. – V. 55. – P. 730-738. 76. Bedard, K. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology/ K. Bedard, K.H. Krause // Physiol Rev. – 2007. – V.87. – № 1. – P. 245-313. 398 77. Behrens, M.I. Roe CMA common biological mechanism in cancer and Alzheimer's disease?/ M.I. Behrens, C. Lendon // Curr Alzheimer Res. – 2009. – V. 6. – № 3. – P. 196-204. 78. Beliaev, N.D. Mg2+- dependent interaction of DNA with eukaryotic cells/ N.D. Beliaev, V.G. Budker, O.E. Gorokhova, A.V. Sokolov et al. // Mol Biol. – 1988. – V. 22. – P.1667-1672. 79. Belousov, V.V. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide/ V.V. Belousov, A.F. Fradkov, K.A. Lukyanov, D.B. Staroverov, K.S. Shakhbazov, A.V. Terskikh, S. Lukyanov, Genetically // Nat. Methods. – 2006. – V. 3. P. 281–286. 80. Beyer, C. The extracellular release ofDNA and HMGB1 from Jurkat T cells during in vitro necrotic cell death / C. Beyer, N.A. Stearns, A. Giessl, J.H. Distler, G. Schett, D. Pisetsky // Innate Immun. – 2012. – V. 18. – № 5. – P. 727-737. 81. Bianchi, A. Ku binds telomeric DNA in vitro/ A. Bianchi A. T. De Lange // Journal of Biological Chemistry. – 1999. – V. 274. – № 30. – P. 21223–21227. 82. Bidard, F.C. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uveal melanoma/ F.C. Bidard, J. Madic, P. Mariani, S. PipernoNeumann, A. Rampanou, V. Servois, N. Cassoux, L. Desjardins, M. Milder, I. Vaucher, J.Y. Pierga, R. Lebofsky, M.H. Stern, O. Lantz // Int J Cancer. – 2014. – V. 134. - №. 5. – P. 1207-1213. 83. Bierhaus, A. Understanding RAGE, the receptor for advanced glycation end products/ A. Bierhaus et al. // Mol Med. – 2005. – V. 83. – P. 876–886. 84. Blasco, M. A. Telomeres and telomerase/ M.A.Blasco, S. M. Gasser, J. Lingner // Genes and Development. – 1999. – V. 13. – P. 2353–2359. 85. Blasius, A. L. Intracellular toll-like receptors/ A.L. Blasius, B. Beutler // Immunity 32. – 2010. – V. 10. – P. 305–315. 86. Bliksøen, M. Increased circulating mitochondrial DNA after myocardial infarction/ M. Bliksøen, L.H. Mariero, I.K. Ohm, F. Haugen, A. Yndestad, S. Solheim, I. Seljeflot, T. Ranheim, G.Ø. Andersen, P. Aukrust, G. Valen, L.E. Vinge. J. Int // Cardiol. – 2012. - V. 158. – № 1. – P. 132-134. 87. Bloomer, R.J. Blood oxidative stress biomarkers: influence of sex, exercise training status, and dietary intake/ R.J. Bloomer, K.H. Fisher-Wellman // Gend Med. – 2008. – V. 3. – P. 218-228. 399 88. Bodera, P. Ynthetic immunostimulatory oligonucleotides in experimental and clinical practice/ P. Bodera, W. Stankiewicz, J. Kocik // Pharmacol Rep. – 2012. – V. 64. – №. 5. – P. 1003-1010. 89. Bologna-Molina, R. Comparison of the value of PCNA and Ki-67 as markers of cell proliferation in ameloblastic tumors / R. Bologna-Molina, A. Mosqueda-Taylor, N. Molina-Frechero, A.D. Mori-Estevez, G. Sбnchez-Acuсa // Med. Oral Patol. Oral. Cir. Bucal. – 2013. – V. 18. – № 2. – P. 174-179. 90. Bonner, W.M. Low-dose radiation: thresholds, bystander effects, and adaptive responses/ W.M. Bonner // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2003. – V. 100. – P. 4973-4975. 91. Booth, L.A. The role of cell signalling in the crosstalk between autophagy and apoptosis/ L.A. Booth, S. Tavallai, H.A. Hamed, N. Cruickshanks, P. Dent // Cell Signal. – 2013. – V. 26. – № 3. – P. 549-555. 92. Borissoff, J.I. Elevated Levels of Circulating DNA and Chromatin Are Independently Associated With Severe Coronary Atherosclerosis and a Prothrombotic State/ J.I. Borissoff, I.A. Joosen, M.O. Versteylen, A. Brill, T.A. Fuchs, A.S. Savchenko, M. Gallant, K. Martinod, H. Ten Cate, L. Hofstra, H.J. Crijns, D.D. Wagner, B.L. Kietselaer // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2013. – V. 33. – P. 2032-2040. 93. Boule, M.W. Toll-like receptor 9-dependent and -independent dendritic cell activation by chromatin-immunoglobulin G complexes/ M.W. Boule, C. Broughton, F. Mackay, S. Akira, A. Marshak-Rothstein, I.R. Rifkin // J Exp Med. – 2004. – V. 199. – №. 12. – P. 1631–1640. 94. Boyd, J.H. Toll-like receptor stimulation in cardiomyoctes decreases contractility and initiates an NF-kappaB dependent inflammatory response/ J.H. Boyd, S. Mathur, Y. Wang, R.M. Bateman, K.R.Walley // Cardiovasc Res. – 2006. – V. 72. – № 3. – P. 384393. 95. Breitbach, S. Circulating cell-free DNA: an up-coming molecular marker in exercise physiology/ S. Breitbach, S. Tug, P. Simon // Sports Med. – 2012. – V. 42. – № 7. – P. 565-586. 96. Brencicova, E. Nucleic acids and endosomal pattern recognition: how to tell friend from foe?/ E. Brencicova, S.S. Diebold // Front Cell Infect Microbiol. – 2013. – V. 3. – P. 3037. 97. Brenner, D.J. Biomarkers specific to densely-ionising (high LET) radiations/ D.J. Brenner, N. Okladnikova, P. Hande, L. Burak, C.R. Geard, T. Azizova // Radiat Prot Dosimetry. – 2001. – V. 97. – № 1. – P. 69-73. 400 98. Brinkmann, M.M. The interaction between the ER membrane protein UNC93B and TLR3, 7, and 9 is crucial for TLR signaling/ M.M. Brinkmann et al. // J Cell Biol. – 2007. – V. 177. – P. 265–275. 99. Brooks, J.C. Heat shock protein gp96 regulates Toll-like receptor 9 proteolytic processing and conformational stability/ J.C. Brooks, W. Sun, G. Chiosis, C.A. Leifer // Biochem Biophys Res Commun. – 2012. – V. 18. – № 4. – P. 780-784. 100. Brown, D.I. Nox proteins in signal transduction/ D.I. Brown, K.K. Griendling // Free Radic. Biol. Med. – 2009. – V. 47. – P. 1239–1253. 101. Brown, S.L. Activating transcription factor 3 is a novel repressor of the nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2 (Nrf2) - regulated stress pathway/ S.L. Brown, K.R. Sekhar, G. Rachakonda, S. Sasi, M.L. Freeman // Cancer Res. – 2008. – V. 68. – P. 364– 368. 102. Buchko, G.W. Methylene blue-mediated photooxidation of 7,8-dihydro-8-oxo-2'deoxyguanosine / G.W. Buchko, J.R. Wagner, J. Cadet, S. Raoul, M. Weinfeld // Biochim. Biophys. Acta. – 1995. – V. 1263. – № 1. – P.17-24. 103. Buelna-Chontal, M. Redox Activation of Nrf2 & NF-κB: A double end sword?/ M. Buelna-Chontal, C. Zazueta. // Cell Signal. – 2013. – V. 13. – P. 242-248. 104. Bulicheva, N. Effect of cell-free DNA of patients with cardiomyopathy and rDNA on the frequency of contraction of electrically paced neonatal rat ventricular myocytes in culture/ N. Bulicheva, O. Fidelina, N. Mkrtumova, M. Neverova, A. Bogush, M. Bogush, O. Roginko, N. Veiko // Ann N Y Acad Sci. – 2008. – V. 1137. – P. 273-277. 105. Burckstummer, T. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome/ T. Burckstummer, C. Baumann, S. Bluml, E. Dixit, G. Durnberger, H. Jahn et al. // Nat Immunol. – 2009. – V. 10. – № 3. – P. 266-272. 106. Cai, H. Hydrogen peroxide regulation of endothelial function: origins, mechanisms, and consequences/ H. Cai // Cardiovasc Res. – 2005. – V. 68. – № 1. – P. 26-36. 107. Canick, J.A. DNA sequencing of maternal plasma to identify Down syndrome and other trisomies in multiple gestations/ J.A. Canick, E.M. Kloza, G.M. Lambert-Messerlian, J.E. Haddow, M. Ehrich, D. van den Boom, A.T. Bombard, C. Deciu, G.E. Palomaki // Prenat Diagn. – 2012. – V. 8. – P. 730-734. 108. Casadio, V. Urine Cell-Free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: Preliminary data/ V. Casadio, D. Calistri, M. Tebaldi, S. Bravaccini, R. Gunelli, G. Martorana, A. Bertaccini, L. Serra, E. Scarpi, D. Amadori, R. Silvestrini, W. Zoli // Urol Oncol. – 2013. – V. 31. – № 8. – P. 1744-1750. 401 109. Casciano, I. Circulating Tumor Nucleic Acids: Perspective in Breast Cancer/ I. Casciano, A.D. Vinci, B. Banelli, C. Brigati, A. Forlani, G. Allemanni, M. Romani // Breast Care. – 2010. – V. 5. – P. 75-80. 110. Case, A.J. Mitochondrial-localized NADPH oxidase 4 is a source of superoxide in angiotensin II-stimulated neurons/ A.J. Case, S. Li, U. Basu, J. Tian, M.C. Zimmerman // Am J Physiol Heart Circ Physiol. – 2013. – V. 305. – №. 1. – P. 19-28. 111. Cassinotti, E. DNA as a biomarker of colorectal cancer/ E. Cassinotti, L. Boni, S. Segato, S. Rausei, A. Marzorati, F. Rovera, G. Dionigi, G. David, A. Mangano, D. Sambucci, R. Dionigi // Int J Surg. – 2013. – V. 1. – P. 54-57. 112. Cassinotti, E. DNA methylation patterns in blood of patients with colorectal cancer and adenomatous colorectal polyps/ E. Cassinotti, J. Melson, T. Liggett, A. Melnikov, Q. Yi, C. Replogle, S. Mobarhan, L. Boni, S. Segato, V. Levenson // Int J Cancer. – 2012. – V. 131. – № 5. – P. 1153-1157. 113. Celhar, T. TLR7 and TLR9 in SLE: when sensing self goes wrong/ T. Celhar, R. Magalhães, A.M. Fairhurst // Immunol Res. – 2012. – V. 53. – P. 58-77. 114. Chan, K.C. Circulating tumour-derived nucleic acids in cancer patients: potential applications as tumour markers/ K.C. Chan, Y.M. Lo // Br J Cancer. – 2007. – V. 96. – P. 681-685. 115. Chan, K.C. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood/ K.C. Chan, S.W. Yeung, W.B. Lui, T.H. Rainer, Y.M. Lo // Clin Chem. - 2005. V. 51. - P. 781-784 116. Chan, K.C. Investigation of the genomic representation of plasma DNA in pregnant women by comparative genomic hybridization analysis: a feasibility study/ K.C. Chan, A.B. Hui, N. Wong, T.K. Lau, T.N. Leung, K.W. Lo, Y.M. Lo // Clin Chem. – 2005. – V. 51. – P. 2398-2401. 117. Chan, K.C. Persistent aberrations in circulating DNA integrity after radiotherapy are associated with poor prognosis in nasopharyngeal carcinoma patients/ K.C. Chan, S.F. Leung, S.W. Yeung, A.T. Chan, Y.M. Lo // Clin Cancer Res. – 2008. – V. 14. – P. 41414145. 118. Chan, K.C. Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma/ K.C. Chan, J. Zhang, A.B. Hui, N. Wong, T.K. Lau, T.N. Leung, K.W. Lo, D.W. Huang, Y.M. Lo // Clin Chem. – 2004. – V. 50. – P. 88-92. 119. Chang, C.P. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction/ C.P. Chang, R.H. Chia, T.L. Wu, K.C. Tsao, C.F. Sun, J.T. Wu // Clin Chim Acta. – 2003. – V. 327. – P. 95–101. 402 120. Chang, D. The evaluation of the oxidative stress parameters in patients with primary angle-closure glaucoma/ D. Chang, Q. Sha, X. Zhang, P. Liu, S. Rong, T. Han, P. Liu, H. Pan // PLoS One. – 2011. – V. 6. – P. 11-12. 121. Chaudhary, P.M. Cloning and characterization of two Toll/interleukin-1 receptor-like genes TIL3 and TIL4: evidence for a multi-gene receptor family in humans/ P.M. Chaudhary, C. Ferguson, V. Nguyen et al. // Blood. – 1998. – V.91. – P.4020-4027. 122. Chaudhry, M.A. Differential DNA methylation alterations in radiation-sensitive and resistant cells/ M.A. Chaudhry, R.A. Omaruddin // DNA Cell Biol. – 2012. – V. 31. – P. 908-916. 123. Chauhan, S.K. Distinct autoantibody profiles in systemic lupus erythematosus patients are selectively associated with TLR7 and TLR9 upregulation/ S.K. Chauhan, V.V. Singh, R. Rai, M. Rai, G. Rai // J Clin Immunol. – 2013. – V. 33. – № 5. – P. 954-964. 124. Chelobanov, B.P. Proteins involved in binding and cellular uptake of nucleic acids/ B.P. Chelobanov, P.P. Laktionov, V.V. Vlassov // Biochemistry. – 2006. – V. 71. – № 6. – P. 583-596 125. Chen, F. From form to function: the role of Nox4 in the cardiovascular system/ F. Chen, S. Haigh, S. Barman, D.J. Fulton // Front Physiol. – 2012. – V. 1. – № 3. – P. 412. 126. Chen, G.Y. Inflammasomes in intestinal inflammation and cancer/ G.Y. Chen, G. Núñez // Gastroenterology. – 2011. – V. 141. – № 6. – P. 1986-1999. 127. Chen, G.Y. The role of high mobility group box chromosomal protein 1 in rheumatoid arthritis/ G.Y. Chen, W. Sun, R. Gao, Y. Su, H. Umehara, L. Dong, F. Gong // Rheumatology. – 2013. – V. 52. – № 10. – P. 1739-1747. 128. Chen, Y. Identification of methylated CpG motifs as inhibitors of the immune stimulatory CpG motifs/ Y. Chen, P. Lenert, R. Weeratna, et al. // Gene Therapy. – 2001. – V. 8. - № 13. – P. 1024–1032. 129. Cheng, C. Quantification of circulating cell-free DNA in the plasma of cancer patients during radiation therapy/ C. Cheng, M. Omura-Minamisawa, Y. Kang, T. Hara, I. Koike, T. Inoue // Cancer Sci. – 2009. – V. 100. – № 2. – P. 303-309. 130. Chey, S. Validation and application of normalization factors for gene expression studies in rubella virus-infected cell lines with quantitative real-time PCR/ S. Chey, C. Claus, U.G. Liebert // J Cell Biochem. – 2010. – V. 110. –№ 1. – P. 118-128. 131. Chi, H. Dynamic regulation of pro- and anti-inflammatory cytokines by MAPK phosphatase 1 (MKP-1) in innate immune responses/ H. Chi, S.P. Barry, R.J. Roth, J.J. Wu, E.A. Jones, A.M. Bennett, R.A. Flavell // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2006. – V. 103. – № 7. – P. 2274-2279. 403 132. Chiminqgi, M. Specific real-time PCR vs. fluorescent dyes for serum free DNA quantification/ M. Chiminqgi, S. Moutereau, P. Pernet, M. Conti, V. Barbu, J. Lemant, M. Sacko, M. Vaubourdolle, S. Loric // Clin Chem Lab Med. – 2007. – V. 45. – № 8. – P. 993-995. 133. Chiu, R.W. Clinical applications of maternal plasma fetal DNA analysis: translating the fruits of 15 years of research/ R.W. Chiu, Y.M. Lo // Clin Chem Lab Med. – 2013. – V. 51. – P. 197-204. 134. Chiu, Y.H. RNA polymerase III detects cytosolic DNA and induces type I interferons through the RIG-I pathway/ Y.H. Chiu, J.B. Macmillan, Z.J. Chen // Cell. – 2009. – V. 138. – № 3. – P. 576-591. 135. Chockalingam, A. TLR9 traffics through the Golgi complex to localize to endolysosomes and respond to CpG DNA/ A. Chockalingam, J.C. Brooks, J.L. Cameron, L.K. Blum, C.A. Leifer // Immunol. Cell Biol. – 2009. – V. 87. – P. 209–217. 136. Choi, J.J. Release of DNA from dead and dying ymphocyte and monocyte cell lines in vitro?/ J.J. Choi, C.F. Reich 3rd, D.S. Pisetsky // Scand J Immunol. – 2004. – V. 60. – P. 159–166. 137. Choi, J.J. The role of macrophages in the in vitro generation of extracellular DNA from apoptotic and necrotic cells/ J.J. Choi, C.F. Reich 3rd, D.S. Pisetsky // Immunology. – 2005. – V. 115. – P. 55–62. 138. Chomczynski, P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenol-chloroform extraction/ P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal Biochem. – 1987. – V. 162. – P. 156-159. 139. Choubey, D. DNA-responsive inflammasomes and their regulators in autoimmunity/ D. Choubey // Clin Immunol. – 2012. – V. 142. – № 3. – P. 223-231. 140. Chua, S.L. UBC and YWHAZ as suitable reference genes for accurate normalisation of gene expression using MCF7, HCT116 and HepG2 cell lines/ S.L. Chua, W.C. See Too, B.Y. Khoo, L.L. Few // Cytotechnology. – 2011. – V. 63. – № 6. – P. 645-654. 141. Chuang, T.H. Cloning and characterization of a sub-family of human Toll-like receptors: hTLR7, hTLR8 and hTLR9/ T.H. Chuang, R.J. Ulevitch // Europ. Cytokine Netw. – 2000. – V.11. – P. 372-378. 142. Collado, R. Early ROS-mediated DNA damage and oxidative stress biomarkers in Monoclonal B Lymphocytosis/ R. Collado, I. Oliver, C. Tormos, M. Egea, A. Miguel, C. Cerdá, D. Ivars, S. Borrego, F. Carbonell, G.T. Sáez // Cancer Lett. – 2012. –V. 317. - № 2. – P. 144-149. 404 143. Collins, A.R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay/ A.R. Collins // Biochim Biophys Acta. – 2013. – V. 13. – P. 150-155. 144. Cooper, P.R. Neutrophil extracellular traps as a new aradigm in innate immunity: friend or foe?/ P.R. Cooper, L.J. Palmer, I.L. Chapple // Periodontol. – 2000. – V. 63. – № 1. – P . 165-197. 145. Cory, S. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis/ S. Cory, D.C. Huang, J.M. Adams // Oncogene. – 2003. – V. 22. – № 53. – P. 590-607. 146. Cossarizza, A. Increased plasma levels of extracellular mitochondrial DNA during HIV infection: a new role for mitochondrial damage-associated molecular patterns during inflammation/ A. Cossarizza, M. Pinti, M. Nasi, L. Gibellini, S. Manzini, E. Roat, S. De Biasi, L. Bertoncelli, J.P. Montagna, L. Bisi, L. Manzini, T. Trenti, V. Borghi, C. Mussini // Mitochondrion. – 2011. – V. 11. – P. 750-755. 147. Cossarizza, A. Simultaneous analysis of reactive oxygen species and reduced glutathione content in living cells by polychromatic flow cytometry/ A. Cossarizza, R. Ferraresi, L. Troiano, E. Roat, L. Gibellini, L. Bertoncelli, M. Nasi, M. Pinti // Nat Protoc. – 2009. – V. 4. – № 12. – P. 1790-1797. 148. Costa, A.C. Prospects for improving brain function in individuals with Down syndrome/ A.C. Costa, J.J. Scott-McKean // CNS Drugs. – 2013. – V. 27. – № 9. – P. 679-702. 149. Counis, M.F. DNases and apoptosis/ M.F. Counis, A. Torriglia // Biochem Cell Biol. – 2000. – V. 78. – № 4. – P. 405-414. 150. Cui, M. Cell-Free circulating DNA: a new biomarker for the acute coronary syndrome/ M. Cui, M. Fan, R. Jing, H. Wang, J. Qin, H. Sheng, Y. Wang, X. Wu, L. Zhang, J. Zhu, S. Ju. // Cardiology. – 2013. – V. 124. – № 2. – P. 76-84. 151. Darzynkiewicz, Z. Analysis of individual molecular events of DNA damage response by flow- and image-assisted cytometry/ Z. Darzynkiewicz, F. Traganos, H. Zhao, H.D. Halicka, J. Skommer, D. Wlodkowic // Methods Cell Biol. – 2011. – V. 103. – P. 115147. 152. Darzynkiewicz, Z. DNA damage signaling assessed in individual cells in relation to the cell cycle phase and induction of apoptosis/ Z. Darzynkiewicz, H. Zhao, H.D. Halicka, P. Rybak, J. Dobrucki, D. Wlodkowic // Crit Rev Clin Lab Sci. – 2012. – V. 49. – № 5-6. – P. 199-217. 153. Degli-Esposti, M.A. Close encounters of different kinds; dendritic cells and NK cells take centre stage/ M.A. Degli-Esposti, M.J. Smyth // Nat. Rev. Immunol. – 2005. – V. 5 – P. 112–24. 405 154. DeNicola, G.M. Oncogene-induced Nrf2 transcription promotes ROS detoxification and tumorigenesis/ G.M. DeNicola et al. // Nature. – 2011. – V. 475. – P. 106. 155. Dennehy, K. M. Syk kinase is required for collaborative cytokine production induced through Dectin-1 and Toll-like receptors/ K.M. Dennehy, G. Ferwerda, I. Faro-Trindade I, E. Pyz, J.A. Willment, P.R. Taylor et al. // Eur. J. Immunol. – 2008. – V. 38. – P. 500– 506. 156. Di Virgilio, F. The therapeutic potential of modifying inflammasomes and NOD-like receptors/ F. Di Virgilio // Pharmacol Rev. – 2013. – V. 65. – № 3. – P. 872-905. 157. Dien, J. Signal transducers and activators of transcription-3 up-regulates tissue inhibitor of etalloproteinase-1 expression and decreases invasiveness of breast cancer/ J. Dien, H.M. Amin, N. Chiu, W. Wong et al. // Am J Pathol. – 2006. – V. 169. – P. 633-642. 158. Dikalov, S.I. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogenperoxideproduction/ S.I. Dikalov, A.E. Dikalova, A.T. Bikineyeva, H.H. Schmidt, D.G. Harrison, K.K. Griendling, // FreeRadic.Biol.Med. 2008. – V. 45. – P. 1340–1351. 159. Dobrzycka, B. Circulating free DNA, p53 antibody and mutations of KRAS gene in endometrial cancer/ B. Dobrzycka, S.J. Terlikowski, A. Mazurek, O. Kowalczuk, W. Niklinska, L. Chyczewski, M. Kulikowski // Int J Cancer. – 2010. – V. 127. – № 3. – P. 612-621. 160. Dong, L. Suppressive oligodeoxynucleotides delay the onset of glomerulonephritis and prolong survival in lupus-prone NZB x NZW mice/ L. Dong, S. Ito, K. J. Ishii, and D. M. Klinman // Arthritis and Rheumatism. – 2005. – V. 52. – № 2. – P. 651–658. 161. Drummond, G.R. Transcriptional and posttranscriptional regulation of endothelial nitric oxide synthase expression by hydrogen peroxide/ G.R. Drummond, H. Cai, M.E. Davis, S. Ramasamy, D.G. Harrison // Circ Res. – 2000. – V. 86. – № 3. – P. 347-354. 162. Du, X. Three novel mammalian toll-like receptors: gene structure, expression, and evolution/ X. Du, A. Poltorak, Y. Wei, B. Beutler, // Europ. Cytokine Netw. – 2000. – V.11. – P. 362-371. 163. Duan, X. Differential roles for the interferon-inducible IFI16 and AIM2 innate immune sensors for cytosolic DNA in cellular senescence of human fibroblasts/ X. Duan, L. Ponomareva, S. Veeranki, R. Panchanathan, E. Dickerson, D. Choubey // Mol Cancer Res. – 2011. – V. 5. – P. 589-602. 164. Dudek, S.M. Cytoskeletal regulation of pulmonary vascular permeability/ S.M. Dudek, J.G. Garcia // J Appl Physiol. – 2001. – V. 4. – P. 1487-1500. 406 165. Duramad, O. K. Inhibitors of TLR-9 act on multiple cell subsets in mouse and man in vitro and prevent death in vivo fromsystemic inflammation/ O.K. Duramad, K. L. Fearon, B. Chang et al. // Journal of Immunology. – 2005. – V. 174. – № 9. – P. 5193–5200. 166. Dwivedi, D.J. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis/ D.J. Dwivedi, L.J. Toltl, L.L. Swystun, J. Pogue, K.L. Liaw, J.I. Weitz, D.J. Cook, A.E. Fox-Robichaud, P.C. Liaw // Crit Care. – 2012. – V. 16. – P. 151. 167. Eberle, M.E. Dectin-1 stimulation induces suppressor of cytokine signaling 1, thereby modulating TLR signaling and T cell responses/ M.E. Eberle, A.H. Dalpke // J. Immunol. – 2012. – V. 188. – P. 5644–5654. 168. Efremova, L.V. Accumulating fragments of extracellular DNA (ecDNA) influence rat primary cerebellum granule cell culture/ L.V. Efremova, S.V. Kostyuk, I.L. Konorova, G.P. Khaspekov, N.N. Veiko // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. – 2010. – V. 29. – P. 213-218. 169. Ehrlich, M. DNA hypomethylation in cancer cells/ M. Ehrlich // Epigenomics. – 2009. – V. 1. – P. 239-259. 170. El Messaoudi, S. Circulating cell free DNA: Preanalytical considerations/ S. El Messaoudi, F. Rolet, F. Mouliere, A.R. Thierry // Clin Chim Acta. – 2013. – V. 424C. – P. 222-230. 171. Ellinger, J. Circulating mitochondrial DNA in serum: a universal diagnostic biomarker for patients with urological malignancies/ J. Ellinger, D.C. Muller, S.C. Muller, S. Hauser, L.C. Heukamp, A. von Ruecker, P.J. Bastian, G. Walgenbach-Brunagel // Urol Oncol. – 2012. – V. 30. – P. 509-515. 172. El-Zein, R.A. Rapid method for determination of DNA repair capacity in human peripheral blood lymphocytes amongst smokers/ R.A. El-Zein, C.M. Monroy, A. Cortes, M.R. Spitz, A. Greisinger, C.J. Etzel // BMC Cancer. – 2010. – V.10. – P. 439. 173. Ermakov, A.V. An extracellular DNA mediated bystander effect produced from low dose irradiated endothelial cells/ A.V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, E.M. Malinovskaya, L.V. Efremova, N.N. Veiko // Mutat Res. – 2011. – V. 712. – P. 1-10. 174. Ermakov, A.V. Development of the adaptive response and bystander effect induced by low-dose ionizing radiation in human mesenchymal stem cells/ A.V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, L.V. Efremova, L.N. Lyubchenko, N.N. Veiko // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. – 2010. – V. 29. – P. 225-231. 175. Ermakov, A.V. Extracellular DNA Fragments Factors of Stress Signaling between XIrradiated and Nonirradiated Human Lymphocytes/ A.V. Ermakov, S.V. Kostyuk, M.S. 407 Konkova, N.A. Egolina, E.M. Malinovskaya, N.N. Veiko // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2008. – V. 1137. – P. 41–46. 176. Ermakov, A.V. Oxidative stress as a significant factor for development of an adaptive response in irradiated and nonirradiated human lymphocytes after inducing the bystander effect by low-dose X-radiation/ A.V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, N.A. Egolina, L.V. Efremova, N.N. Veiko // Mutat. Res. - Fund. Mol. M. – 2009. – V. 669. № 1-2. – Р. 155–161. 177. Ermakov, A.V. Oxidized extracellular DNA as a stress signal in human cells/ A.V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, V.L. Izevskaya, A. Baranova, N.N. Veiko // Oxid Med Cell Longev. – 2013. – V. 2013. – P. 649-747. 178. Estecio, M.R. Genome architecture marked by retrotransposons modulates predisposition to DNA methylation in cancer/ M.R. Estecio, J. Gallegos, C. Vallot, R.J. Castoro, W. Chung, S. Maegawa, Y. Oki, Y. Kondo, J. Jelinek, L. Shen, H. Hartung, P.D. Aplan, B.A. Czerniak, S. Liang, J.P. Issa // Genome Res. – 2010. – V. 20. – P. 1369-1382. 179. Evans, D.L. Cellular expression and antimicrobial function of a phylogenetically conserved novel histone 1x-like protein on mouse cells: a potential new class of pattern recognition receptor/ D.L. Evans, M.A. Connor, L.D. Moss, S.Lackay, J.H. Leary 3rd, T. Krunkosky, L. Jaso-Friedmann // J Leukoc Biol. – 2009. – V. 86. – № 1. – P. 133-141. 180. Ewald, S.E. The ectodomain of Toll-like receptor 9 is cleaved to generate a functional receptor/ S.E. Ewald, B.L. Lee, L. Lau, K.E. Wickliffe, G.P. Shi, H.A. Chapman et al. // Nature. – 2008. – V. 456. – P. 658–662. 181. Ewald. S.E. Nucleic acid sensing Toll-like receptors in autoimmunity/ S.E. Ewald, G.M. Barton // Curr Opin Immunol. – 2011. – V. 1. – P. 3-9. 182. Fan, Y. NF-κB and STAT3 signaling pathways collaboratively link inflammation to cancer/ Y. Fan, R. Mao, J. Yang // Protein Cell. – 2013. – V. 4. – № 3. – P. 176-185. 183. Faridi, F. Aberrant epigenetic regulators control expansion of human CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells/ F. Faridi, K. Ponnusamy, I. Quagliano-Lo Coco, L. Chen-Wichmann, M. Grez, R. Henschler, C. Wichmann // Front Genet. – 2013. – V. 4. – P. 254. 184. Faulkner, G.J. The regulated retrotransposon transcriptome of mammalian cells/ G.J. Faulkner, Y. Kimura, C.O. Daub, S. Wani, C. Plessy, K.M. Irvine, K. Schroder, N. Cloonan, A.L. Steptoe, T. Lassmann, K. Waki, N. Hornig, T. Arakawa, H. Takahashi, J. Kawai, A.R. Forrest, H. Suzuki, Y. Hayashizaki, D.A. Hume, V. Orlando, S.M. Grimmond, P. Carninci // Nat Genet. – 2009. – V. 41. – № 5. – P. 563-571. 408 185. Fenech, M. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells/ M. Fenech, M. Kirsch-Volders, A.T. Natarajan, J. Surralles, J.W. Crott et al. // Mutagenesis. - 2011. – V. 26. – P. 125-132. 186. Feng, J. The role of DNA methylation in the central nervous system and neuropsychiatric disorders/ J. Feng, G. Fan // Int Rev Neurobiol. – 2009. – V. 89. – P. 67-84. 187. Fernandes-Alnemri, T. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation/ T. Fernandes-Alnemri, J. Wu, J.W. Yu, P. Datta, B. Miller, W. Jankowski, S. Rosenberg, J. Zhang, E.S. Alnemri // Cell Death Differ. - 2007. – V. 14. – № 9. – P. 1590-1604. 188. Fernando, M.R. A new methodology to preserve the original proportion and integrity of cell-free fetal DNA in maternal plasma during sample processing and storage/ M.R. Fernando, K. Chen, S. Norton, G. Krzyzanowski, D. Bourne, B. Hunsley, W.L. Ryan, C. Bassett // Prenat Diagn. – 2010. – V. 30. – P. 418-424. 189. Fink, T. Instability of standard PCR reference genes in adipose-derived stem cells during propagation, differentiation and hypoxic exposure/ T. Fink, P. Lund, L. Pilgaard, J.G. Rasmussen, M. Duroux, V. Zachar // BMC Mol Biol. – 2008. – V. 9. – P. 98. 190. Fisher, R.P. The CDK Network: Linking Cycles of Cell Division and Gene Expression/ R.P. Fisher // Genes Cancer. – 2012. – V. 3. – № 11-12. – P. 731-738. 191. Fleischhacker, M. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer--a survey/ M. Fleischhacker, B. Schmidt // Biochim Biophys Acta. – 2007. – V. 1775. – P. 181-232. 192. Fleissner, F. Microvesicles as novel biomarkers and therapeutic targets in transplantation medicine/ F. Fleissner, Y. Goerzig, A. Haverich, T. Thum // Am J Transplant. – 2012. – V. 2. – P. 289-297. 193. Foijer, F. Restriction beyond the restriction point: mitogen requirement for G2 passage/ F. Foijer, H. Te Riele // Cell Div. – 2006. – V. 18. – P. 1-8. 194. Fournier, A. 1q12 chromosome translocations form aberrant heterochromatic foci associated with changes in nuclear architecture and gene expression in B cell lymphoma/ A. Fournier, A. McLeer-Florin, C. Lefebvre, S. Duley, L. Barki, J. Ribeyron, K. Alboukadel, S. Hamaidia, A. Granjon, R. Gressin, A. Lajmanovich, T. Bonnefoix, S. Chauvelier, A. Debernardi, S. Rousseaux, F. de Fraipont, M. Figeac, J.P. Kerckaert, J. De Vos, Y. Usson, K. Delaval, A. Grichine, C. Vourc'h, S. Khochbin, R. Feil, D. Leroux, M.B. Callanan // EMBO Mol Med. – 2010. – V. 5. – P. 159-171. 195. Fox, C.E. Maternal cell-free messenger RNA in twin pregnancies: the effects of chorionicity and severe twin to twin transfusion syndrome (TTTS)/ C.E. Fox, A. 409 Sekizawa, S.J. Pretlove, B.C. Chan, T. Okai, M.D. Kilby // Acta Obstet Gynecol Scand. 2012. – V. 91. – № 10. – P. 1206-1211. 196. Franchi, L. Function of Nod-like receptors in microbial recognition and host defense/ L. Franchi, N. Warner, K. Viani, G. Nunez // Immunol Rev. – 2009. – V. 227. – № 1. – P. 106–128. 197. Fraser, D.A.r ,A.J. C1q differentially modulates phagocytosis and cytokine responses during ingestion of apoptotic cells by human monocytes, macrophages, and dendritic cells/ D.A. Fraser, A.K. Laust, E.L. Nelson, A.J. Tenner // J. Immunol. – 2009. – V. 183. – P. 6175–6185. 198. Frattini, M. Quantitative analysis of plasma DNA in colorectal cancer patients: a novel prognostic tool/ M. Frattini, G. Gallino, S. Signoroni, D. Balestra, L. Battaglia, G. Sozzi, E. Leo, S. Pilott, M.A. Pierotti // Ann N Y Acad Sci. – 2006. – V. 1075. – P. 185-190. 199. Fu, M. Cyclin D1 represses p300 transactivation through a cyclin-dependent kinaseindependent mechanism/ M. Fu, C. Wang, M. Rao et al. // J. Biol. Chem. – 2005. – V. 280. – № 33. - 29728–29742. 200. Fukui, R. Unc93B1 restricts systemic lethal inflammation by orchestrating Toll-like receptor 7 and 9 trafficking/ R. Fukui et al. // Immunity. – 2011. – V. 35. – P. 69–81. 201. Fulton, D. Localization of endothelial nitric-oxide synthase phosphorylated on serine 1179 and nitric oxide in Golgi and plasma membrane defines the existence of two pools of active enzyme / D. Fulton, J. Fontana, G. Sowa, J.P. Gratton, M. Lin, K.X. Li, B. Michell, B.E. Kemp, D. Rodman, W.C. Sessa // J. Biol. Chem. – 2002. – V.277. – № 6. – P. 4277-4284. 202. Gahan, P.B. Biology of circulating nucleic acids and possible roles in diagnosis and treatment in diabetes and cancer/ P.B. Gahan // Infect Disord Drug Targets. – 2012. – V. 12. – № 5. – P. 360-370. 203. Gahan, P.B. Circulating nucleic acids in plasma and serum: applications in diagnostic techniques for noninvasive prenatal diagnosis/ P.B. Gahan //. Int J Womens Health. – 2013. – V. 5. – P. 177-186. 204. Gahan, P.B. Metabolic DNA as the origin of spontaneously released DNA?/ P.B. Gahan, P. Anker, M. Stroun // Ann N Y Acad Sci. – 2008. – V. 1137. – P. 7-17. 205. Gahan, P.B. The virtosome - a novel cytosolic informative entity and intercellular messenger/ P.B. Gahan, P. Anker, M. Stroun // Cell Biochem Funct. – 2010. – V. 28. – № 7. – P. 529-538. 410 206. Gaipl, U.S. Cooperation between C1q and DNase I in the clearance of necrotic cellderived chromatin/ U.S. Gaipl, T.D. Beyer, P. Heyder, S. Kuenkele, A. Bottcher, R.E. Voll et al. // Arthritis Rheum. – 2004. – V. 50. – P. 640–649. 207. Galeazzi, M. Dosage and characterization of circulating DNA: present usage and possible applications in systemic autoimmune disorders/ M. Galeazzi, G. Morozzi, M. Piccini, J. Chen , F. Bellisai, S. Fineschi, R. Marcolongo // Autoimmun. Rev. – 2003. – V.2. – № 1. – P. 50-55. 208. Ganguly, D. Self-RNA-antimicrobial peptide complexes activate human dendritic cells through TLR7 and TLR8/ D. Ganguly // J Exp Med. – 2009. – V. 206. – P. 1983-1994. 209. Gao, Y.J. Increased integrity of circulating cell-free DNA in plasma of patients with acute leukemia/ Y.J. Gao, Y.J. He, Z.L. Yang, H.Y. Shao, Y. Zuo, Y. Bai, H. Chen, X.C. Chen, F.X. Qin, S. Tan, J. Wang, L. Wang, L. Zhang // Clin Chem Lab Med. – 2010. – V. 48. – P. 1651-1656. 210. Garcia-Olmo, D.C. Cell-free nucleic acids circulating in the plasma of colorectal cancer patients induce the oncogenic transformation of susceptible cultured cells/ D.C. GarciaOlmo, C. Dominguez, M. Garcia-Arranz, P. Anker, M. Stroun, J.M. Garcia-Verdugo, D. Garcia-Olmo // Cancer Res. – 2010. – V. 70. – P. 560-567. 211. Gerdes, J Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67/ J. Gerdes, H. Lemke, H. Baisch, H.H. Wacker, U. Schwab et al. // J Immunol. – 1984. – V. 133. – P. 1710–1715. 212. Ghorbian, S. Non-Invasive Detection of Esophageal Cancer using Genetic Changes in Circulating Cell-Free DNA/ S. Ghorbian, A.M. Ardekani // Avicenna J Med Biotechnol. – 2012. – V. 4. – P. 3-13. 213. Giacinti, C. RB and cell cycle progression/ C. Giacinti, A. Giordano // Oncogene. – 2006. – V. 25. – P. 5220-5227. 214. Gilliet, M. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation/ M. Gilliet, R. Lande // Curr Opin Immunol. – 2008. – V. 20. – P. 401–407. 215. Glasauer, A. ROS/ A. Glasauer, N.S. Chandel // Curr Biol. – 2013. – V. 4. – № 3. – P. 100-102. 216. Glebova, K. Oxidized extracellular DNA as a stress signal that may modify response to anticancer therapy/ K. Glebova, N. Veiko, S. Kostyuk, V. Izhevskaya, A. Baranova // Cancer Lett. – 2013. – V.S0304-3835. – № 13. – P. 658-667. 217. Gloire, G. Redox regulation of nuclear post-translational modifications during NFkappaB activation/ G. Gloire, J. Piette // Antioxid. Redox Signal. – 2009 – V. 11. – P. 2209-2222. 411 218. Goldshtein, H. A rapid direct fluorescent assay for cell-free DNA quantification in biological fluids/ H. Goldshtein, M.J. Hausmann, A. Douvdevani // Ann Clin Biochem. – 2009. – V. 46. – № 6. – P. 488-494. 219. Gong, B. Cell-free DNA in blood is a potential diagnostic biomarker of breast cancer/ B. Gong, J. Xue, J. Yu, H. Li, H. Hu et al. // Oncol. – 2012. – V. 3. – P. 897-900. 220. González-Masiá, J.A. Circulating nucleic acids in plasma and serum (CNAPS): applications in oncology/ J.A. González-Masiá, D. García-Olmo, D.C. García-Olmo // Onco Targets Ther. – 2013. – V. 8. – № 6 – P. 819-32. 221. Goodarzi, A.A. The repair and signaling responses to DNA double-strand breaks/ A.A. Goodarzi, P.A. Jeggo // Adv Genet. – 2013. – V. 82. – P. 1-45. 222. Gorgoulis, V.G. Activation of the DNA damage checkpoint and genomic instability in human precancerous lesions/ V.G. Gorgoulis, L.V. Vassiliou, P. Karakaidos, P. Zacharatos, A. Kotsinas, T. Liloglou, M. Venere, R.A. Ditullio, N.G. Kastrinakis Jr., B. Levy, D. Kletsas, A. Yoneta, M. Herlyn, C. Kittas, T.D. Halazonetis // Nature. – 2005. – V. 434. – P. 907–913. 223. Gormally, E. TP53 and KRAS2 mutations in plasma DNA of healthy subjects and subsequent cancer occurrence: a prospective study/ E. Gormally, P. Vineis, G. Matullo, F. Veglia, E. Caboux, E. Le Roux, M. Peluso, S. Garte, S. Guarrera, A. Munnia, L. Airoldi, H. Autrup, C. Malaveille, A. Dunning, K. Overvad, A. Tjonneland, E. Lund, F. Clavel-Chapelon, H. Boeing, A. Trichopoulou, D. Palli, V. Krogh, R. Tumino, S. Panico, H.B. Bueno-de-Mesquita, P.H. Peeters, G. Pera, C. Martinez, M. Dorronsoro, A. Barricarte, C. Navarro, J.R. Quiros, G. Hallmans, N.E. Day, T.J. Key, R. Saracci, R. Kaaks, E. Riboli, P. Hainaut // Cancer Res. – 2006. – V. 66. – P. 6871-6876. 224. Goulopoulou, S. Toll-like receptor 9 activation: a novel mechanism linking placentaderived mitochondrial DNA and vascular dysfunction in pre-eclampsia/ S. Goulopoulou, T. Matsumoto, G.F. Bomfim, R.C. Webb // Clin Sci. – 2012. – V.123. – № 7. – P. 429435. 225. Govers, R. Endothelial nitric oxide synthase activity is linked to its presence at cell-cell contacts / Govers R, Bevers L, de Bree P, Rabelink TJ // Biochem J. – 2002. – V. 361. – P. 193–201, 226. Grady, W.M. Genomic and epigenetic instability in colorectal cancer pathogenesis/ W.M. Grady, J.M. Carethers // Gastroenterology. – 2008. – V. 135. - № 4. – P. 1079-1099. 227. Graham, K.A. NADPH oxidase 4 is an oncoprotein localized to mitochondria/ K.A. Graham, M. Kulawiec, K.M. Owens, X. Li, M.M. Desouki, D. Chandra et al. // CancerBiol.Ther. – 2010. – V. 10. – P. 223–231. 412 228. Griffith, T.S. Cell death in the maintenance and abrogation of tolerance: the five Ws of dying cells/ T.S. Griffith, T.A. Ferguson // Immunity. – 2011. – V. 35. – P. 456-466. 229. Gross, A. Bcl-2 family members and the mitochondria in apoptosis/ A. Gross, J.M. McDonnell, S.J. Korsmeyer, // Genes & Dev. – 1999. – V. 13. – P. 1899–1911. 230. Guiducci, C. Properties regulating the nature of the plasmacytoid dendritic cell response to Toll-like receptor 9 activation/ C. Guiducci, G. Ott, J.H. Chan et al. // Journal of Experimental Medicine. – 2006. – V. 203. – № 8. – P. 1999–2008. 231. Guillaud, P. Quantification and topographical description of Ki-67 antibody labelling during the cell cycle of normal fibroblastic (MRC-5) and mammary tumour cell lines (MCF-7)/ P. Guillaud, S. du Manoir, D. Seigneurin // Anal Cell Pathol. – 1989. – V. 11. – P. 25–39. 232. Gummersbach, C. New aspects of adipogenesis: radicals and oxidative stress/ C. Gummersbach, K. Hemmrich, K.D. Kroncke et al. // Differentiation. - 2009. – V. 77. № 2. – P. 115-120. 233. Gursel, I. Repetitive elements in mammalian telomeres suppress bacterial DNA-induced immune activation/ I. Gursel, M. Gursel, H. Yamada, K.J. Ishii, F. Takeshita, D.M. Klinman // J Immunol. – 2003. – V. 17. – P. 1393–1400. 234. Guz, J. The relationship between 8-oxo-7, 8-dihydro-2’- deoxyguanosine level and extent of cytosine methylation in leukocytes DNA of healthy subjects and in patients with colon adenomas and carcinomas/ J. Guz, M. Foksinski, A. Siomek, et al. // Mutat Res. - 2008. –V. 640. – № 1-2. – P. 170-173. 235. Haas, T. The DNA sugar back bone 2’deoxyribose determines toll-like receptor 9 activation/ T. Haas, J. Metzger, F.Schmitz, A. Heit, T. Muller, E. Latz, et al. // Immunity. – 2008. – V. 28. – P. 315–323. 236. Hahn, S. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies and Mendelian disorders: new innovative strategies/ S. Hahn, L.G. Jackson, V. Kolla, A.P. Mahyuddin, M. Choolani // Expert Rev Mol Diagn. – 2009. – V. 9. – № 6. – P. 613-621. 237. Haider, L. Oxidative damage in multiple sclerosis lesions/ L. Haider, M.T. Fischer, J.M. Frischer, J. Bauer, R. Höftberger, G. Botond, H. Esterbauer, C.J. Binder, J.L. Witztum, H. Lassmann //. Brain. – 2011. – V. 134. – № 7. – P. 1914-1924. 238. Haimovitz-Friedman, A. Imaging radiotherapy-induced apoptosis/ A. Haimovitz- Friedman, T.J. Yang, T.H. Thin, M. Verheij // Radiat Res. – 2012. – V. 177. – № 4. – P. 467-482. 413 239. Halpern, M.D. In vitro inhibition of murine IFNγ production by phosphorothioate deoxyguanosine oligomers/ M.D. Halpern, D.S. Pisetsky // Immunopharmacology. – 1995. – V. 29. – № 1. – P. 47– 52. 240. Hamperl, S. Chromatin states at ribosomal DNA loci/ S. Hamperl, M. Wittner, V. Babl, J. Perez-Fernandez, H. Tschochner, J. Griesenbeck // Biochim Biophys Acta. – 2013. – V. 1829. – № 3-4. – P. 405-417. 241. Hamurcu, Z. Micronucleus frequency in lymphocytes and 8-hydroxydeoxyguanosine level in plasma of women with polycystic ovary syndrome/ Z. Hamurcu, F. Bayram, G. Kahriman, H. Dönmez-Altuntas, G. Baskol // Gynecol Endocrinol. – 2010. – V. 8. – P. 590-595. 242. Han, K. DNA methylation of mobile genetic elements in human cancers/ K. Han, J. Lee, H.S. Km, K.M. Yang, J.M. Yi // Genes Genom. – 2013. – V. 35. – P. 265–271. 243. Hanaoka, H. Okazaki Y, Satoh T, Kaneko Y, Yasuoka H, Seta N, Kuwana M. Circulating anti-double-stranded DNA antibody-secreting cells in patients with systemic lupus erythematosus: a novel biomarker for disease activity/ H. Hanaoka, Y. Okazaki, T. Satoh, Y.Kaneko, H. Yasuoka, N. Seta, M. Kuwana // Lupus. – 2012. – V. 21. – № 12. – P. 1284-1293. 244. Harberts, E. TLR signaling and DNA repair: are they associated?/ E. Harberts, A.A. Gaspari // J Invest Dermatol. – 2013. – V. 133. – № 2. – P. 296-302. 245. Harris, H.E. HMGB1: a multifunctional alarmin driving autoimmune and inflammatory disease/ H.E. Harris, U. Andersson, D.S. Pisetsky // Nat Rev Rheumatol. – 2012. – V. 10. – P. 1038. 246. Hartmann, G. Rational design of new CpG oligonucleotides that combine B cell activation with high IFN-alpha induction in plasmacytoid dendritic cells/ G. Hartmann, J. Battiany, H. Poeck, M. Wagner, M. Kerkmann, N. Lubenow, S. Rothenfusser, S. Endres // Eur J Immunol. – 2003. – V. 33. – № 6. – P. 1633-1641. 247. Harvey, S.A. The transcriptomic response of rat hepatic stellate cells to endotoxin: implications for hepatic inflammation and immune regulation/ S.A. Harvey, A. Dangi, A. Tandon, C.R. Gandhi // PLoS One. – 2013. – V. 8. – № 12. – P. 821-859. 248. Hasan, U. Human TLR10 is a functional receptor, expressed by B cells and plasmacytoid dendritic cells, which activates gene transcription through MyD88/ U. Hasan, C. Chaffois, C. Gaillard et al. // J. Immun. – 2005. – V. 174 – P. 2942-2950. 249. Hashad, D. Free circulating tumor DNA as a diagnostic marker for breast cancer/ D. Hashad, A. Sorour, A. Ghazal, I. Talaat // J Clin Lab Anal. – 2012. – V. 26. – P. 467-472. 414 250. Hayashi, T. Pattern recognition receptors/ T. Hayashi, T. Nakamura, A. Takaoka // Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi. – 2011. – V. 34. – № 12. – P. 329-345. 251. Hayes, J.D. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway/ J.D. Hayes, M. McMahon, S. Chowdhry, A.T. Dinkova-Kostova // Antioxid Redox Signal. – 2010. – V. 13. – № 11. – P. 1713-1748. 252. Hayes, J.D. The double-edged sword of Nrf2: subversion of redox homeostasis during the evolution of cancer/ J.D. Hayes, M. McMahon // Mol. Cell. – 2006. – V. 21. – P. 732. 253. He, G. NF-κB and STAT3 - key players in liver inflammation and cancer/ G. He, M. Karin // Cell. – 2011. – V. 21. – P. 159-168. 254. He, X.X. Expression of Toll-like receptors in human bone marrow mesenchymal stem cells/ X.X. He, H. Bai, G.R. Yang et al. // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2009. – V. 17. – № 3. – P. 695-699. 255. Hei, T.K. Mechanism of radiation-induced bystander effects: a unifying model/ T.K. Hei, H. Zhou, V.N. Ivanov, M. Hong, H.B. Lieberman, D.J. Brenner, S.A. Amundson, C.R. Geard // J. Pharm. Pharmacology. – 2008. – V. 60. – P. 943-950. 256. Heikenwalder, M. Lymphoid follicle destruction and immunosuppression after repeated CpG oligodeoxynucleotide administration/ M. Heikenwalder, M. Polymenidou, T. Junt et al. // Nat. Med. – 2004. – V. 10. – № 2. – P. 187–92. 257. Heiss, E. Nuclear factor kappa B is a molecular target for sulforaphane-mediated antiinflammatory mechanisms/ E. Heiss, C. Herhaus, K. Klimo, H. Bartsch, C. Gerhauser // J Biol Chem. – 2001. – V. 276. – P. 32008–32015. 258. Hemmi, H. A toll-like receptor recognizes bacterial DNA/ H. Hemmi, O. Takeuchi, T. Kawai et al. // Nature. – 2000 – V. 408 – P. 740-745. 259. Hidestrand, M. Influence of temperature during transportation on cell-free DNA analysis/ M. Hidestrand, R. Stokowski, K. Song, A. Oliphant, J. Deavers, M. Goetsch, P. Simpson, R. Kuhlman, M. Ames, M. Mitchell, A. Tomita-Mitchell // Fetal Diagn Ther. – 2012. – V. 31. – P. 122-128. 260. Hill, M. Uses of cell free fetal DNA in maternal circulation/ M. Hill, A.N. Barrett, H. White, L.S. Chitty // Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. – 2012. – V. 26. – P. 639-654. 261. Hirata, Y. HMGB1 plays a critical role in vascular inflammation and lesion formation via toll-like receptor 9/ Y. Hirata, H. Kurobe, M. Higashida, D. Fukuda, M. Shimabukuro, K. Tanaka, Y. Higashikuni, T. Kitagawa, M. Sata // Atherosclerosis. – 2013. – V. 231. – № 2. – P. 227-233. 262. Ho, P.P. An immunomodulatory GpG oligonucleotide for the treatment of autoimmunity via the innate and adaptive immune systems/ P.P. Ho, P. Fontoura, P. J. Ruiz, L. 415 Steinman, H. Garren // Journal of Immunology. – 2003. – V. 171. – № 9. – P. 4920– 4926. 263. Hofstetter, B. Impact of genomic methylation on radiation sensitivity of colorectal carcinoma/ B. Hofstetter, A. Niemierko, C. Forrer, J. Benhattar, V. Albertini, M. Pruschy, F.T. Bosman, C.V. Catapano, I.F. Ciernik // Int J Radiat Oncol Biol Phys. – 2010. – V. 76. – P. 1512-1519. 264. Holdenrieder, S. Clinical use of circulating nucleosomes/ S. Holdenrieder, P. Stieber // Crit Rev Clin Lab Sci. – 2009. – V. 46. – P. 1-24. 265. Holdenrieder, S. DNA integrity in plasma and serum of patients with malignant and benign diseases/ S. Holdenrieder, A. Burges, O. Reich, F.W. Spelsberg, P. Stieber // Ann N Y Acad Sci. – 2008. – V. 1137. – P. 162-170. 266. Holford, N.C. Normalization of circulating nucleic acid results/ N.C. Holford, A. Ramoutar, A.N. Butt, R. Swaminathan // Ann N Y Acad Sci. – 2008. – V. 1137. – P. 112118. 267. Holm, C.K. DNA recognition in immunity and disease/ C.K. Holm, S.R. Paludan, K.A. Fitzgerald // Curr Opin Immunol. – 2013. – V. 25. – № 1. – P. 13-18. 268. Honda, K. Spatiotemporal regulation of MyD88-IRF-7 signalling for robust type-I interferon induction/ K. Honda, Y. Ohba, H. Yanai et al. // Nature. – 2005. – V. 434. - № 7036. – P. 1035–1040. 269. Hong, B. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends/ B. Hong, Y. Zu // Theranostics. – 2013. – V. 3. – P. 377-394. 270. Hornung, V. AIM2 recognizes cytosolic dsDNA and forms a caspase-1-activating inflammasome with ASC/ V. Hornung, A. Ablasser, M. Charrel-Dennis, F. Bauernfeind, G. Horvath, D.R. Caffrey et al. // Nature. – 2009. – V. 458. – № 7237. – P. 514-518. 271. Hu, C.W. Correlation between concentrations of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in urine, plasma and saliva measured by on-line solid-phase extraction LC-MS/MS/ C.W. Hu, Y.J. Huang, Y.J. Li, M.R. Chao // Clin Chim Acta. – 2010. – V. 411. – P. 17-18. 272. Huang, L.Y. Th1-like cytokine induction by heat-killed Brucella abortus is dependent on triggering of TLR9/ L.Y. Huang, K.J. Ishii, S. Akira et al. // J.Immunol. – 2005. – V. 175. – P. 3964-3970. 273. Huang, R.B. Shear stress modulation of IL-1β-induced E-selectin expression in human endothelial cells / R.B.Huang, O. Eniola-Adefeso // PLoS ONE. – 2012. – V. 7. – № 2. – P. 31874. 274. Huang, X. Characterization of human plasma-derived exosomal RNAs by deep sequencing/ X. Huang, T. Yuan, M. Tschannen, Z. Sun, H. Jacob, M. Du, M. Liang, R.L. 416 Dittmar, Y. Liu, M. Liang, M. Kohli, S.N. Thibodeau, L. Boardman, L. Wang // BMC Genomics. – 2013. – V. 14. – P. 319. 275. Ikeda, R.K. Accumulation of peribronchial mast cells in a mouse model of ovalbumin allergen induced chronic airway inflammation: modulation by immunostimulatory DNA sequences/ R.K. Ikeda, M. Miller, J. Nayar et al. // J. Immunol. – 2003. – V. 171 – № 9. – P. 4860-4867. 276. Ishikawa, H. STING regulates intracellular DNA-mediated, type I interferon-dependent innate immunity/ H. Ishikawa, Z. Ma, G.N. Barber // Nature. – 2009. – V. 461. – P. 788– 792. 277. Itoh, K. Transcription factor Nrf2 regulates inflammation by mediating the effect of 15deoxy-Delta(12,14)-prostaglandin j(2)/ K. Itoh, M. Mochizuki, Y. Ishii, T. Ishii, T. Shibata, Y. Kawamoto, V. Kelly, K. Sekizawa, K. Uchida, M. Yamamoto // Mol Cell Biol. – 2004. – V. 24. – P. 36–45. 278. Ivanov, S. A novel role for HMGB1 in TLR9-mediated inflammatory responses to CpGDNA/ S. Ivanov et al. // Blood. – 2007. – V. 110. – P. 1970–1981. 279. Iyer, R. Low dose, low-LET ionizing radiation-induced radioadaptation and associated early responses in unirradiated cells/ R. Iyer, B.E. Lehnert // Mutat. Res. – 2003. – V. 503. – P. 1-9. 280. Jahn, P.S. BDCA-2 signaling inhibits TLR-9-agonist-induced plasmacytoid dendritic cell activation and antigen presentation/ P.S. Jahn, K.S. Zanker, J. Schmitz, A. Dzionek // Cell. Immunol. – 2010. – V. 265. – P. 15–22. 281. Jallepalli, P.V. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery/ P.V. Jallepalli, C. Lengauer // Nat Rev Cancer. – 2001. – V. 1. – P. 109–117. 282. Janeway, C.A. Innate immune recognition/ C.A. Janeway, R. Medzhitov // Annu Rev Immunol. – 2002. – V. 20. – P. 197–216. 283. Jang, Y.N. JAK-STAT pathway and myogenic differentiation/ Y.N. Jang, E.J. Baik // JAKSTAT. – 2013. – V. 2. – № 2. – P. 23282. 284. Jiang, N. Role of macrophages in the generation of circulating blood nucleosomes from dead and dying cells/ N. Jiang, C.F. Reich 3rd, D.S. Pisetsky // Blood. – 2003. – V. 102. – P. 2243–2250. 285. Jiang, N. The expression of plasma nucleosomes in mice undergoing in vivo apoptosis/ N. Jiang, C.F. Reich 3rd, M. Monestier, D.S. Pisetsky // Clin Immunol. – 2003. – V. 106. – P. 139–147. 417 286. Jiang, W.W. Increased plasma DNA integrity index in head and neck cancer patients/ W.W. Jiang, M. Zahurak, D. Goldenberg, Y. Milman, H.L. Park, W.H. Westra, W. Koch, D. Sidransky, J. Califano // Int J Cancer. – 2006. – V. 119. – P. 2673-2676. 287. Jing, N. G-quartet oligonucleotides: a new class of signal transducer and activator of transcription 3 inhibitors that suppresses growth of prostate and breast tumors through induction of apoptosis/ N. Jing, Y. Li, W. Xiong, W. Sha, L. Jing, D. J. Tweardy // Cancer Research. – 2004. – V. 64. – № 18. – P. 6603–6609. 288. Józefowski, S. Role of scavenger receptor MARCO in macrophage responses to CpG oligodeoxynucleotides/ S. Józefowski, T.H. Sulahian, M. Arredouani, L. Kobzik // J Leukoc Biol. – 2006. – V. 80. – № 4. – P. 870-879. 289. Jung, K. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker - a critical appraisal of the literature/ K. Jung, M. Fleischhacker, A. Rabien // Clin Chim Acta. – 2010. – V. 411. – P. 1611-1624. 290. Kaminski, J.J. Synthetic oligodeoxynucleotides containing suppressive TTAGGG motifs inhibit AIM2 inflammasome activation/ J.J. Kaminski, S.A. Schattgen, T.C. Tzeng, C. Bode, D.M. Klinman, K.A. Fitzgerald // J Immunol. – 2013. – V. 191. – № 7. – P. 38763883. 291. Kamran, M.Z. Role of STAT3 in cancer metastasis and translational advances/ M.Z. Kamran, P. Patil, R.P. Gude // Biomed Res Int. – 2013. – V. 2013. – P. 421821. 292. Kang, J.Y. Structural biology of the toll-like receptor family/ J.Y. Kang, J.O. Lee // Annu Rev Biochem. – 2011. – V. 80. – P. 917–941. 293. Kansanen, E. The Keap1-Nrf2 pathway: Mechanisms of activation and dysregulation in cancer/ E. Kansanen, S.M. Kuosmanen, H. Leinonen, A.L. Levonen // Redox Biol. – 2013. – V. 1. – № 1. – P. 45-49. 294. Karuri, A.R. 3H-1,2-dithiole-3-thione targets nuclear factor kappaB to block expression of inducible nitric-oxide synthase, prevents hypotension, and improves survival in endotoxemic rats/ A.R. Karuri, Y. Huang, S. Bodreddigari, C.H. Sutter, B.D. Roebuck, T.W. Kensler, T.R. Sutter // J Pharmacol Exp Ther. – 2006. – V. 317. – P.61–67. 295. Kato, H.,T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-selfRNA/ H. Kato, K. Takahasi, T. Fujita // Immunol.Rev. – 2011. – V. 243. – P. 91–98. 296. Katsuda, T. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells secrete functional neprilysin-bound exosomes/ R. Tsuchiya, N. Kosaka, Y. Yoshioka, K. Takagaki, K. Oki, F. Takeshita, Y. Sakai, M. Kuroda, T. Ochiya // Sci Rep. – 2013. – V. 3. – P. 1197. 418 297. Kawahara, T. Molecular evolution of the reactive oxygen-generating NADPH oxidase (Nox/Duox) family of enzymes/ T. Kawahara, M.T. Quinn, J.D. Lambeth // BMC Evol. Biol. – 2007. – V. 7. – P. 109. 298. Kawai, T. Toll-like receptor and RIG-I-like receptor signaling/ T. Kawai, S. Akira // Ann N Y Acad Sci. – 2008. – V. 1143. – P. 1-20. 299. Kawai, T. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity/ T. Kawai, S. Akira // Immunity. – 2011. – V. 34. – № 5. – P. 637-650. 300. Kawai, Y. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction/ Y. Kawai, M. Yoshida, K. Arakawa, T. Kumamoto, N. Morikawa, K. Masamura, H.Tada, S. Ito, H. Hoshizaki, S. Oshima, K. Taniguchi, H. Terasawa, I. Miyamori, K. Kishi, T. Yasuda // Circulation. – 2004. – V. 109. – № 20. – P. 2398-2400. 301. Kawasaki, T. Recognition of nucleic acids by pattern-recognition receptors and its relevance in autoimmunity/ T. Kawasaki, T. Kawai, S. Akira // Immunol Rev. – 2011. – V. 243. – № 1. – P. 61-73. 302. Keating, S.E. Cytosolic DNA sensors regulating type I interferon induction/ S.E. Keating, M. Baran, A.G. Bowie // TrendsImmunol. – 2011. – V. 32. – P. 574–581. 303. Kensler, T.W. Nrf2: friend or foe for chemoprevention?/ T.W. Kensler, N. Wakabayashi // Carcinogenesis. - 2010. – V. 31. – P. 90. 304. Keren, A. The p38 MAPK signaling pathway: a major regulator of skeletal muscle development/ A. Keren, Y. Tamir, E. Bengal // Mol Cell Endocrinol. – 2006. – V. 252. – P. 224-230. 305. Kerrigan, A. M. Syk-coupled C-type lectin receptors that mediate cellular activation via single tyrosine based activation motifs/ A.M. Kerrigan, G.D. Brown // Immunol. Rev. – 2010. – V. 243. – № 1. – P. 335-352 306. Kessenbrock, K. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice byinactivating antiinflammatory progranulin/ K. Kessenbrock K et al. // J Clin Invest. 2008. – V. 118. – P. 2438–2447. 307. Khorasanizadeh, S. The nucleosome: from genomic organization to genomic regulation/ S. Khorasanizadeh // Cell. – 2004. – V. 116. – P. 259–272. 308. Kim, H.J. Contribution of impaired Nrf2-Keap1 pathway to oxidative stress and inflammation in chronic renal failure/ H.J. Kim, N.D. Vaziri // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2010. – V. 298. – P. 662-671. 419 309. Kim, J. A protective role of nuclear factor-erythroid 2-related factor-2 (Nrf2) in inflammatory disorders/ J. Kim, Y.N. Cha, Y.J. Surh // Mutat. Res. – 2010. – V. 690. – P. 12-23. 310. Kim, J.G. Epigenetics meets radiation biology as a new approach in cancer treatment/ J.G. Kim, M.T. Park, K. Heo, K.M. Yang, J.M. Yi // Int J Mol Sci. – 2013. – V. 14. – P. 15059-15073. 311. Kim, T. Aspartate–glutamate–alanine–histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells/ T. Kim, S. Pazhoor, M. Bao, Z. Zhang, S. Hanabuchi, V. Facchinetti, L. Bover, J. Plumas, L. Chaperot, J. Qin, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2010. – V. 107. – P. 15181– 15186. 312. Kim, Y.J. Pathogenesis and promising non-invasive markers for preeclampsia/ Y.J. Kim // Obstet Gynecol Sci. – 2013. – V. 56. – № 1. – P. 2-7. 313. Kim, Y.M. UNC93B1 delivers nucleotide-sensing toll-like receptors to endolysosomes/ Y.M. Kim, M.M. Brinkmann, M.E. Paquet, H.L. Ploegh // Nature. – 2008. – V. 452. – P. 234–238. 314. Kindrachuk, J. Activation and regulation of toll-like receptor 9: CpGs and beyond/ J. Kindrachuk, J. Potter, H.L. Wilson, P. Griebel, L.A. Babiuk, S. Napper // Mini Rev Med Chem. – 2008. – V. 8. – № 6. – P. 590-600. 315. Kinet, V. Cardiovascular extracellular microRNAs: emerging diagnostic markers and mechanisms of cell-to-cell RNA communication/ V. Kinet, J. Halkein, E. Dirkx, L.J. Windt // Front Genet.. – 2013. – V.12. – № 4. – P. 214. 316. Kiyokawa, T. A single base mutation in the PRAT4A gene reveals differential interaction of PRAT4A with Toll-like receptors/ T. Kiyokawa et al. // Int Immunol. – 2008. – V. 20. – P. 1407–1415. 317. Klammer, H. G. Bystander effects as manifestation of intercellular communication of DNA damage and of the cellular oxidative status/ H. Klammer, E. Mladenov, F. Li, G. Iliakis // Cancer Lett. – 2013. – V. 24. – P. 835-855 318. Klinman, D. Synthetic oligonucleotides as modulators of inflammation/ D. Klinman, H. Shirota, D. Tross, T. Sato, S. Klaschik // J Leukoc Biol. – 2008. – V. 84. – № 4. – P. 958964. 319. Klinman, D. Therapeutic applications and mechanisms underlying the activity of immunosuppressive oligonucleotides/ D. Klinman, H. Shirota, D. Tross, T. Sato, S. Klaschik // Annals of the New York Academy of Sciences. – 2009. – V. 1175. – P. 80– 88. 420 320. Klinman, D.M. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides/ D.M. Klimman // Nature Rev. Immunol. – 2004. – V. 4. – P. 1–10. 321. Kondo, T. Radiation-induced cell death/ T. Kondo // Nihon Rinsho. – 2012. – V. 70. - № 3. – P. 389-393. 322. Kondrikov, D. Growth and density-dependent regulation of NO synthase by the actin cytoskeleton in pulmonary artery endothelial cells. / Kondrikov D, Han HR, Block ER, Su Y // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. – 2006. – V.290. – № 1. – P. 41-50 323. Konorova, I.L. VE Influence of plasma DNA on acid-base balance, blood gas measurement, and oxygen transport in health and stroke/ I.L. Konorova, N.N. Veiko, V.E. Novikov // Ann N Y Acad Sci. – 2008. – V. 1137. – P. 278-282. 324. Kosaka, N. Trash or Treasure: extracellular microRNAs and cell-to-cell communication/ N. Kosaka, Y. Yoshioka, K. Hagiwara, N. Tominaga, T. Katsuda, T. Ochiya. // Front Genet. – 2013. – V. 5. – № 4. – P. 173. 325. Kostyuk, S. Extracellular GC-rich DNA activates TLR9- and NF-kB-dependent signaling pathways in human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs)/ S. Kostjuk, P. Loseva, O. Chvartatskaya, E. Ershova, T. Smirnova, E. Malinovskaya, O. Roginko, V. Kuzmin, V. Izhevskaia, A. Baranova, E. Ginter, N. Veiko // Expert Opin. Biol. Th. – 2012. – V.12. – № 1. – P. 99-111. 326. Kostyuk, S.V. An exposure to the oxidized DNA enhances both instability of genome and survival in cancer cells/ S.V. Kostyuk, M.S. Konkova, E.S. Ershova, A.J. Alekseeva, T.D. Smirnova, S.V. Stukalov, E.A. Kozhina, N.V. Shilova, T.V. Zolotukhina, Z.G. Markova, V.L. Izhevskaya, A. Baranova, N.N. Veiko // PLoS One. – 2013. – V. 8. – № 10. – P. e77469. 327. Kostyuk, S.V. Oxidized DNA induces an adaptive response in human fibroblasts/ S.V. Kostyuk, V.J. Tabakov, V.V. Chestkov, M.S. Konkova, K.V. Glebova, G,V. Baydakova, E.S. Ershova, V.L. Izhevskaya, A. Baranova, N.N. Veiko // Mutat Res. – 2013. – V.747. – P. 6–18. 328. Kostyuk, S.V. Role of extracellular DNA oxidative modification in radiation induced bystander effects in human endotheliocytes/ S.V. Kostyuk, A.V. Ermakov, A.Y. Alekseeva, T.D. Smirnova, K.V. Glebova, L.V. Efremova, A. Baranova, N.N. Veiko // Mutat. Res. - Fund. Mol. M. – 2012. – V. 729. - № (1-2). – P. 52-60. 329. Krieg, A. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation/ A. Krieg, A. Yi, S. Matson, T. Waldschmidt et al. // Nature. – 1995. – V. 374. – P. 546-549. 330. Krieg, A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects/ A.M. Krieg // Ann. Rev. Immunol. – 2002. – V. 20. – P. 709–60. 421 331. Krieg, A.M. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation/ A.M. Krieg, A.K. Yi, S. Matson, T.J. Waldschmidt et al. // J. Biol. Chem. – 2004. – V. 79, № 4. – P. 17217-17223. 332. Krieg, A.M. CpG still rocks! Update on an accidental drug/ A.M. Krieg // Nucleic Acid Ther. – 2012. – V. 22. – № 2. – P. 77-89. 333. Krieg, A.M. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation/ A.M. Krieg // Nat Rev Drug Discov. – 2006. – V. 5. – № 6. – P. 471-484. 334. Krishnamachari, Y. Innovative strategies for co-delivering antigens and CpG oligonucleotides/ Y. Krishnamachari, A.K. Salem // Adv Drug Deliv Rev. – 2009. – V. 61. – № 3. – P. 205-217. 335. Kuhmann, C. DNA methylation changes in cells regrowing after fractioned ionizing radiation/ C. Kuhmann, D. Weichenhan, M. Rehli, C. Plass, P. Schmezer, O. Popanda // Radiother Oncol. – 2011. – V. 101. – P. 116-121. 336. Kukita, Y. Quantitative Identification of Mutant Alleles Derived from Lung Cancer in Plasma Cell-Free DNA via Anomaly Detection Using Deep Sequencing Data/ Y. Kukita, J. Uchida, S. Oba, K. Nishino, T. Kumagai, K. Taniguchi, T. Okuyama, F. Imamura, K. Kato // PLoS One. – 2013. – V. 8. – № 11. – P. e81468. 337. Kumagai, Y. TLR9 as a key receptor for the recognition of DNA/ Y. Kumagai, O. Takeuchi, S. Akira // Adv Drug Deliv Rev. – 2008. – V. 60. – № 7. – P. 795-804. 338. Kurisetty, V.V. Pathogenic and therapeutic role of miRNAs in breast cancer/ V.V. Kurisetty, R. Lakshmanaswamy, C. Damodaran // Front Biosci. – 2014. – V. 19. – P. 111. 339. Vrtovec, B. CD34+ stem cell therapy in nonischemic dilated cardiomyopathy patients/ G. Poglajen, M. Sever, L. Lezaic, A. Socan, F. Haddad, J.C. Wu. // Clin Pharmacol Ther. – 2013. – V. 94. – № 4. – P. 452-481. 340. Lahoud, M.H. DEC-205 is a cell surface receptor for CpG oligonucleotides/ M.H. Lahoud, F. Ahmet, J.G. Zhang, S. Meuter, A.N. Policheni, S. Kitsoulis, C.N. Lee, M. O'Keeffe, L.C. Sullivan, A.G. Brooks, R. Berry, J. Rossjohn, J.D. Mintern, J. VegaRamos, J.A. Villadangos, N.A. Nicola, M.C. Nussenzweig, K.J. Stacey, K. Shortman, W.R. Heath, I. Caminschi. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2012. – V. 109. – № 40. – P. 16270-16275. 341. Laktionov, P.P. Cell surface oligonucleotide-binding proteins of human squamous carcinoma A431 cells/ P.P. Laktionov, B.P. Chelobanov, M.V. Kharkova, E.Y. Rykova, D.V. Pyshnyi, I.A. Pyshnaya, K. Marcus, H.E. Meyer, V.V. Vlassov // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. – 2003. – V. 22. – № 5-8. – P. 1715-1719. 422 342. Lambeth, J.D. Nox enzymes, ROS, and chronic disease: an example of antagonistic pleiotropy/ J.D. Lambeth // Free Radic Biol Med. – 2007. – V. 43. – № 3. – P. 332-347. 343. Lande, R. Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide/ R. Lande R, J. Gregorio, V. Facchinetti, B. Chatterjee, Y.H. Wang, B. Homey et al. // Nature. – 2007. – V. 449. – № 7162. – P. 564–569. 344. Landolt-Marticorena, C. Increased expression of B cell activation factor supports the abnormal expansion of transitional B cells in systemic lupus erythematosus/ C. LandoltMarticorena, R. Wither, H. Reich, A. Herzenberg, J. Scholey, D.D. Gladman, M.B. Urowitz, P.R. Fortin, J. Wither // J Rheumatol. – 2011. – V. 38. – № 4. – P. 642-651. 345. Latz, E. Activation and regulation of the inflammasomes/ E. Latz, T.S. Xiao, A. Stutz // Nat. Rev. Immunol. – 2013. – V. 13. – P. 397–411. 346. Lau, A. Dual roles of Nrf2 in cancer/ A. Lau, N.F. Villeneuve, Z. Sun, P.K. Wong, D.D. Zhang // Pharmacol Res. – 2008. – V. 58. – P. 262-270. 347. Lau, C.M. RNA-associated autoantigens activate B cells by combined B cell antigen receptor/Toll-like receptor 7 engagement/ C.M. Lau, C. Broughton, A.S. Tabor et al. // J. Exp. Med. – 2005. –V. 202. – P. 1171–1177. 348. Leach, J.K. Ionizing radiation-induced, mitochondria-dependent generation of reactive oxygen/nitrogen/ J.K. Leach. G. Van Tuyle, P.S. Lin, R. Schmidt-Ullrich, R.B. Mikkelsen // Cancer Res. – 2001. – V. 61. – № 10. – P. 3894-3901. 349. Leary. R.J. Detection of chromosomal alterations in the circulation of cancer patients with whole-genome sequencing/ R.J. Leary, M. Sausen, I. Kinde, N, Papadopoulos, J.D. Carpten, D. Craig, J. O'Shaughnessy, K.W. Kinzler, G. Parmigiani, B. Vogelstein, L.A. Diaz Jr, V.E. Velculescu // Sci Transl Med. – 2012. – V. 4. – № 162. – P. 162. 350. LeBel, C.P. Evaluation of the probe 2_,7_-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress/ C.P. LeBel, H. Ischiropoulos, S.C. Bondy // Chem. Res. Toxicol. – 1992. – V. 5. – P. 227–231. 351. Lebre, M.C. Human keratinocytes express functional Toll-like receptor 3, 4, 5, and 9/ M.C. Lebre, A.M. van der Aar, L. van Baarsen et al. // J. Inves. Dermatol. – 2007. – V. 127 – № 2. – P. 331-341. 352. Lecomte, T. Circulating free tumor DNA and colorectal cancer/ T. Lecomte, N. Ceze, E. Dorval, P. Laurent-Puig // Gastroenterol Clin Biol. – 2010. – V. 34. – № 12. – P. 662681. 353. Lee, C.C. Accessory molecules for Toll-like receptors and their function/ C.C. Lee, A.M. Avalos, H.L. Ploegh // Nat Rev Immunol. – 2012. – V. 3. – № 12. – P. 168-179. 423 354. Lee, C.F. Nox 4 is a novel inducible source of reactive oxygen species in monocytes and macrophages and mediates oxidized low density lipoprotein-induced macrophage death/ C.F. Lee, M. Qiao, K. Schroder, Q. Zhao, R. Asmis // Circ. Res. – 2010. – V. 106. – P. 1489–1497. 355. Lee, J. Withaferin A inhibits activation of signal transducer and activator of transcription 3 in human breast cancer cells/ J. Lee, E.R. Hahm, S.V. Singh // Carcinogenesis. – 2010. – V. 31. – P. 1991-1998. 356. Lee, T.H. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma/ T.H. Lee, L. Montalvo, V. Chrebtow, M.P. Busch // Transfusion. – 2001. – V. 41. – P. 276-282. 357. Lehmann, B.D. Senescence-associated exosome release from human prostate cancer cells/ B.D.Lehmann, M.S. Paine, A.M. Brooks et al. // Cancer Res. – 2008. – V. 68. – P. 7864–7871. 358. Lener, B. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells/ B. Lener, R. Koziel, H. Pircher, E. Hutter, R. Greussing, D. HerndlerBrandstetter, M. Hermann, H. Unterluggauer, P. Jansen-Durr // Biochem. J. – 2009. – V. 423. – P. 363–374. 359. Lenert, P.S. Classification, mechanisms of action, and therapeutic applications of inhibitory oligonucleotides for Toll-like receptors (TLR) 7 and 9/ P.S. Lenert // Mediators Inflamm. – 2010. – V. 2010. – P. 986596. 360. Lenert, P.S. CpG stimulation of primary mouse B cells is blocked by inhibitory oligodeoxyribonucleotides at a site proximal to NF-κB activation/ P.S. Lenert, L. Stunz, A.-K. Yi, A. M. Krieg, R. F. Ashman // Antisense and Nucleic Acid Drug Development. – 2001. – V. 11. – № 4. – P. 247–256. 361. Lenert, P.S. DNA-like class R inhibitory oligonucleotides (INH-ODNs) preferentially block autoantigen-induced B-cell and dendritic cell activation in vitro and autoantibody production in lupus-prone MRL-Faslpr/lpr mice in vivo/ P.S. Lenert, K. Yasuda, L. Busconi et al. // Arthritis Research and Therapy. – 2009. – V. 11. – № 3. – P. 79. 362. Lenert, P.S. Inhibitory oligodeoxynucleotides—therapeutic promise for systemic autoimmune diseases?/ P.S. Lenert // Clinical and Experimental Immunology. – 2005. – V. 140. – № 1. – P. 1–10. 363. Lenert, P.S. Structural characterization of the inhibitory DNA motif for the type A[D]CpG-induced cytokine secretion and NK-cell lytic activity in mouse spleen cells/ P.S. Lenert, W. Rasmussen, R. F. Ashman, Z. K. Ballas // DNA and Cell Biology. – 2003. – V. 22. – № 10. – P. 621–631. 424 364. Lenert, P.S. Targeting Toll-like receptor signaling in plasmacytoid dendritic cells and autoreactive B cells as a therapy for lupus/ P.S. Lenert // Arthritis Research and Therapy. – 2006. – V. 8. – № 1. – P. 203. 365. Levenson V.V. DNA methylation as a universal biomarker/ V.V. Levenson // Expert Rev Mol Diagn. – 2010. – V. 10. – P. 481-488. 366. Levy, D.E. Cytoplasmic transcription factors: mediators of cytokine signaling/ D.E. Levy, R. Raz, J.E. Durbin, H. Bluyssen, R. Muzaffar, S. Pisharody // Agents Actions Suppl. – 1995. – V. 47. – P. 79-85. 367. Li, D. Oxidative DNA damage and 8-hydroxy-2-deoxyguanosine DNA glycosylase/apurinic lyase in human breast cancer/ D. Li, W. Zhang, J. Zhu, P. Chang, A. Sahin, E. Singletary, M. Bondy, T. Hazra, S. Mitra, S.S. Lau, J. Shen, J. DiGiovanni // Mol Carcinog. – 2001. – V. 31. – P. 214-223. 368. Li, H. Structural mechanism of DNA recognition by the p202 HINa domain: insights into the inhibition of Aim2-mediated inflammatory signaling/ H.Li, J. Wang, J. Wang, L.S. Cao, Z.X. Wang, J.W. Wu // Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Commun. – 2014. – V. 70. – № 1. – P. 21-29. 369. Li, J.Z. Plasma DNA in systemic lupus erythematosus. Characterization of cloned base sequences/ J.Z. Li, C.R. Steinman // Arthritis Rheum. – 1989. – V. 32. – № 6. – P. 726733. 370. Li, Z. Alternative cyclin D1 splice forms differentially regulate the DNA damage response/ Z. Li, X. Jiao, C. Wang et al. // Cancer Res. – 2010. – V. 70. – № 21. – P. 8802–8811. 371. Licht, R. Plasma levels of nucleosomes and nucleosome-autoantibody complexes in murine lupus: effects of disease progression and lipopolyssacharide administration/ R. Licht, M.C. vanBruggen, B. Oppers-Walgreen, T.P. Rijke, J.H. Berden // Arthritis Rheum. – 2001. – V. 44. – P. 1320–1330. 372. Lim, M.H. Preparation of a copper-based fluorescent probe for nitric oxide and its use in mammalian cultured cells/ M.H. Lim // Nat Protoc. – 2007. – V. 2. – № 2. – P. 408-415. 373. Limmon, G. V. Scavenger receptor class-A is a novel cell surface receptor for doublestranded RNA/ G.V. Limmon, M. Arredouani, K.L. Mccann, R.A. Corn Minor, L. Kobzik, F. Imani // FASEB. – 2008. – V. 22. – № 1. – P. 159-167 374. Liu, B. Folding of Toll-like receptors by the HSP90 paralogue gp96 requires a substratespecific cochaperone/ B. Liu et al. // Nat Commun. – 2010. – V. 1. – P. 79. 425 375. Liu, G.H. NF-kappaB=p65 antagonizes Nrf2-ARE pathway by depriving CBP from Nrf2 and facilitating recruitment of HDAC3 to MafK/ G.H. Liu, J. Qu, X. Shen // Biochim Biophys Acta. – 2008. – V. 1783. – P. 713–727. 376. Lo, Y.M. Genomic analysis of fetal nucleic acids in maternal blood/ Y.M. Lo, R.W. Chiu // Annu Rev Genomics Hum Genet. – 2012. – V. 13. – P. 285-306. 377. Lo, Y.M. Non-invasive prenatal testing using massively parallel sequencing of maternal plasma DNA: from molecular karyotyping to fetal whole-genome sequencing/ Y.M. Lo // Reprod Biomed Online. – 2013. – V. 27. – № 6. – P. 593-5988. 378. Lo, Y.M. Plasma DNA as a prognostic marker in trauma patients/ Y.M. Lo, T.H. Rainer, L.Y. Chan, N.M. Hjelm, R.A. Cocks // Clin Chem. – 2000. – V. 46. – P. 319–323. 379. Lo, Y.M. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma/ Y.M. Lo, J. Zhang, T.N. Leung, T.K. Lau, A.M. Chang, N.M. Hjelm // Am J Hum Genet. – 1999. – V. 64. – № 1. – P. 218-224. 380. Lobrich, M. H2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair. Strengths, limitations and oprtimization/ M. Lobrich, A. Shibata, A. Beucher, A. Fisher, M. Ensminger, A.A. Goodarzi, O. Barton, P.A. Jeggo // Cell Cycle. – 2010. – V. 9. – P. 662-669. 381. Loo, D.T. In situ detection of apoptosis by the TUNEL assay: an overview of techniques.Methods/ D.T. Loo // Mol Biol. – 2011. – V. 682. – P. 3-13. 382. Loree, J. Radiation-induced molecular changes in rat mammary tissue: possible implications for radiation-induced carcinogenesis/ J. Loree, I. Koturbash, K. Kutanzi, M. Baker, I. Pogribny, O. Kovalchuk // Int J Radiat Biol. – 2006. – V. 82. – P. 805-815. 383. Lorenzo, Y. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead/ Y. Lorenzo, S. Costa, A.R. Collins, A. Azqueta // Mutagenesis. – 2013. – V. 28. – № 4. – P. 427-432. 384. Loseva, P. Extracellular DNA oxidation stimulates activation of NRF2 and reduces the production of ROS in human mesenchymal stem cells/ P. Loseva, S. Kostyuk, E. Malinovskaya, N. Clement, C. Dechesne, C. Dani, T. Smirnova, K. Glebova, G. Baidakova, A. Baranova, V. Izhevskaia, E. Ginter, N. Veiko // Expert Opin. Biol. Th. – 2012. – V.12. – № 1. – P. 85-97. 385. Lotze, M.T. High-mobility group box 1 protein (HMGB1): nuclear weapon in the immune arsenal/ M.T. Lotze, K.J. Tracey // Nat Rev Immunol. – 2005. – V. 5. – P. 331342. 386. Lu ,Y. Apelin-APJ induces ICAM-1, VCAM-1 and MCP-1 expression via NF-κB/JNK signal pathway in human umbilical vein endothelial cells/ Y. Lu, X. Zhu, G.X. Liang, 426 R.R. Cui, Y. Liu, S.S. Wu, Q.H. Liang, G.Y. Liu, Y. Jiang, X.B. Liao, H. Xie, H.D. Zhou, X.P. Wu, L.O. Yuan, E.Y. Liao // Amino Acids. – 2012. – V. 43. – № 5. – P. 2125-2136. 387. Lui, Y.Y. Predominant hematopoietic origin of cell-free DNA in plasma and serum after sex-mismatched bone marrow transplantation/ Y.Y. Lui, K.W. Chik, R.W. Chiu, C.Y. Ho, C.W. Lam, Y.M. Lo // Clin Chem. – 2002. – V. 48. – P. 421-427. 388. Lv, F. Inhibitory effects of mild hyperthermia plus docetaxel therapy on ER(+/-) breast cancer cells and action mechanisms/ F. Lv, Y. Yu, B. Zhang, D. Liang, Z.M. Li, W. You // J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. – 2013. – V. 33. – № 6. – P. 870-876. 389. Lyle, A.N.,P. Poldip 2 ,a novel regulator of Nox4 and cytoskeletal integrity in vascular smooth muscle cells/ A.N. Lyle, N.N. Deshpande, Y. Taniyama, B. Seidel-R ogol, L. Pounkova, P. Du et al. // Circ. Res. – 2009. – V. 105. - P. 249–259. 390. Ma, J. Coculture of osteoblasts and endothelial cells: optimization of culture medium and cell ratio/ J. Ma, J.J. van den Beucken, F. Yang, S.K. Both, F.Z. Cui, J. Pan, J.A. Jansen // Tissue Eng Part C Methods. – 2011. – V. 17. – № 3. – P. 349-357. 391. Magnusson, M. Cutting edge: natural DNA repetitive extragenic sequences from gramnegative pathogens strongly stimulate TLR9/ M. Magnusson, R. Tobes, J. Sancho, E. Pareja // J Immunol. – 2007. – V. 179. – № 1. – P. 31-35. 392. Malik, A.N. Is mitochondrial DNA content a potential biomarker of mitochondrial dysfunction?/ A.N. Malik, A. Czajka // Mitochondrion. – 2013. – V. 13. – № 5. – P. 481492. 393. Malinovskaya, E.M. Fragments of Cell-free DNA (cfDNA) Enhance Transcription Activity in Human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) and Inhibit Their in vitro Differentiation/ E.M. Malinovskaya, S.V. Kostyuk, A. V. Ermakov, M.S. Kon'kova, T.D. Smirnova, L.V. Kameneva, L.V. Efremova, A.Y. Alekseeva, L.N. Lyubchenko, N.N. Veiko // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. . – 2011. – V. 31. – P.199-205. 394. Mandel, P. Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l’homme/ P. Mandel, P. Metais // CR Acad. Sci. Paris. – 1948. – V. 142. – P. 241-243. 395. Mangal, D. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress/ D. Mangal, D. Vudathala, J.H. Park, S.H. Lee, T.M. Penning, I.A. Blair // Chem Res Toxicol. – 2009. – V. 22. – P. 788-797. 396. Mantovani A. Molecular pathways linking inflammation and cancer/ A. Mantovani // Curr Mol Med. – 2010. – V. 10. – № 4. – P. 369-373. 397. Marshall, J.D. Identification of a novel CpG DNA class and motif that optimally stimulate B cell and plasmacytoid dendritic cell functions/ J.D. Marshall, K. Fearon, C. 427 Abbate, S. Subramanian, P. Yee, J. Gregorio, R.L. Coffman, G. Van Nest // J Leukoc Biol. – 2003. – V. 73. – № 6. – P. 781-792. 398. Martin, L.M. Exposure to low dose ionising radiation: molecular and clinical consequences/ L.M. Martin, B. Marples, T.H. Lynch, D. Hollywood, L. Marignol // Cancer Lett. – 2013. – V. 338. – № 2. – P. 209-218. 399. Martin-Armas, M. Toll-like receptor 9 (TLR9) is present in murine liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) and mediates the effect of CpG-oligonucleotides/ M. MartinArmas, J. Simon-Santamaria, I. Pettersen, B. Sveinbjornsson // J. Hepatol. – 2006. – V. 44. – № 5. – P. 939-946. 400. Martínez Valle, F. DNase 1 and systemic lupus erythematosus/ F. Martínez Valle, E. Balada, J. Ordi-Ros, M. Vilardell-Tarres // Autoimmun Rev. – 2008. – V. 7. – № 5. – P. 359-363. 401. Martinez, P. Computational optimisation of targeted DNA sequencing for cancer detection/ P. Martinez, N. McGranahan, N.J. Birkbak, M. Gerlinger, C. Swanton // Sci Rep. – 2013. – V. 3. – № 3. – P. 3309. 402. Marzese, D.M. Diagnostic and prognostic value of circulating tumor-related DNA in cancer patients/ D.M. Marzese, H. Hirose, D.S. Hoon // Expert Rev Mol Diagn. – 2013. – V. 13. – № 8. – P. 827-844. 403. Massy, Z.A. The role of oxidative stress in chronic kidney disease/ Z.A. Massy, P. Stenvinkel, T.B. Drueke // Semin Dial. – 2009. – V. 22. – № 4. – P. 405-408. 404. Matsumoto, F. Cathepsins are required for Toll-like receptor 9 responses/ F. Matsumoto et al. // Biochem Biophys Res Commun. – 2008. – V. 367. – P. 693–699. 405. Matsumoto, H. Vanguards of paradigm shift in radiation biology: radiation-induced adaptive and bystander responses/ H. Matsumoto, N. Hamada, A. Takahashi, Y. Kobayashi, T. Ohnishi // J Radiat Res. – 2007. – V. 48. – № 2. – P. 97-106. 406. Mayer, A.K. Differential recognition of TLR-dependent microbial ligands in human bronchial epithelial cells/ A.K. Mayer, M. Muehmer, J. Mages et al. // J. Immunol. – 2007. – V. 178. – № 5. – P. 3134-3142. 407. McGettrick, A.F. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation/ A.F. McGettrick, L.A. O'Neill // Curr Opin Immunol. – 2010. – V. 22. – № 1. – P. 20-27. 408. McManus, K.J. ATM-dependent DNA damage-independent mitotic phosphorylation of H2AX in normally growing mammalian cells/ K.J. McManus, M.J. Hendzel // Mol Biol Cell. – 2005. – V. 16. – № 10. – P. 5013-5025. 428 409. McMillan, T.J. Cellular effects of long wavelength UV light (UVA) in mammalian cells/ T.J. McMillan, E. Leatherman, A. Ridley, J. Shorrocks, S.E. Tobi, J.R. Whiteside // J. Pharm. Pharmacol. – 2008. – V. 60. – P. 969-976. 410. Medzhitov, R. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity/ R. Medzhitov, P. Preston-Hurlburt, C.A. Janeway // Jr. Nature. 1997. – V. 388. – P. 394-397. 411. Melnikov, A. Differential methylation profile of ovarian cancer in tissues and plasma/ A. Melnikov, D. Scholtens, A. Godwin, V. Levenson // J Mol Diagn. – 2009. – V. 11. – № 1. – P. 60-65. 412. Mermershtain, I. Structural mechanisms underlying signaling in the cellular response to DNA double strand breaks / I. Mermershtain, J.N. Glover // Mutat Res. – 2013. – V. 750. – № 1-2. – P. 15-22. 413. Meyer-Wentrup, F. DCIR is endocytosed into human dendritic cells and inhibits TLR8mediated cytokine production/ F. Meyer-Wentrup, A. Cambi, B. Joosten, M.W. Looman, I.J. De Vries, C.G. Figdor et al. // J. Leukoc. Biol. – 2009. – V. 85. – P. 518–525. 414. Miao, E.A. A Caspase-1-induced pyroptotic cell death/ E.A. Miao, J.V. Rajan, A. Aderem // Immunol Rev. – 2011. – V. 243. – № 1. – P. 206-214. 415. Mijatovic, T. Nucleolus and c-Myc: potential targets of cardenolidemediated antitumor activity / T. Mijatovic, N. De Neve, P. Gailly, V. Mathieu, B. Haibe-Kains, G. Bontempi, J. Lapeira, C. Decaestecker, V. Facchini, R. Kiss // Mol. Cancer Ther. – 2008. – V. 7. № 5. – P. 1285-1296. 416. Milani, P. Posttranscriptional regulation of SOD1 gene expression under oxidative stress: Potential role of ELAV proteins in sporadic ALS/ P. Milani, M. Amadio, U. Laforenza, M. Dell'Orco, L. Diamanti, V. Sardone, S. Gagliardi, S. Govoni, M. Ceroni, A. Pascale, C. Cereda // Neurobiol Dis. – 2013. – V. 60. – P. 51-60. 417. Miller, F.J. NADPH oxidase 4: walking the walk with Poldip2/ F.J. Muller // Circ. Res. – 2009. – V. 105. – P. 209-210. 418. Mitchell, S.A. Bystander effect and adaptive response in C3H 10T(1/2) cells/ S.A. Mitchell, S.A. Marino, D.J. Brenner, E.J. Hall // Int. J. Radiat. Biol. – 2004. – V. 80. – P. 465-472. 419. Moe, K.T. Nox 2 and Nox 4 mediate umour necrosis factor- alpha-induced ventricular remodelling in mice/ K.T. Moe, N.O. Yin, T.M. Naylynn, K. Khairunnisa, M.A. Wutyi, Y. Gu et al. // J. Cell.Mol.Med. – 2011. – V. 15. – P. 2601-2613. 429 420. Moldovan, L. Analyzing the circulating microRNAs in exosomes/extracellular vesicles from serum or plasma by qRT-PCR/ L. Moldovan, K. Batte, Y. Wang, J. Wisler, M. Piper // Methods Mol Biol. – 2013. – V. 1024. – P. 129-145. 421. Moore, J.O. Effects of ultraviolet B exposure on the expression of proliferating cell nuclear antigen in murine skin/ J.O. Moore, S.R. Palep, R.N. Saladi, D. Gao, Y. Wang, R.G. Phelps, M.G. Lebwohl, H. Wei // Photochem. Photobiol. – 2004. – V. 80. – P. 587595. 422. Morozkin, E.S. A comparative study of cell-free apoptotic and genomic DNA using FISH and massive parallel sequencing/ E.S. Morozkin, E.M. Loseva, I.V. Morozov, A.M. Kurilshikov, A.A. Bondar, E.Y. Rykova, N.B. Rubtsov, V.V. Vlassov, P.P. Laktionov // Expert Opin Biol Ther. – 2012. – V. 12. – № 1. – P. 11-17. 423. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays/ T. Mosmann // J Immunol Methods. – 1983. – V. 65. – № 1-2. – P. 55-63. 424. Mothersill, C. Radiation-induced bystander effects and adaptive responses--the Yin and Yang of low dose radiobiology?/ C. Mothersill, C. Seymour // Mutat Res. – 2004. – V. 568. – № 1. – P. 121-128. 425. Mouliere, F. High fragmentation characterizes tumour-derived circulating DNA/ F. Mouliere, B. Robert, E. Arnau Peyrotte, M. Del Rio, M. Ychou, F. Molina, C. Gongora, A.R. Thierry // PLoS One. – 2011. – V. 6. – P. e23418. 426. Mouliere, F. The importance of examining the proportion of circulating DNA originating from tumor, microenvironment and normal cells in colorectal cancer patients/ F. Mouliere, A.R. Thierry // Expert Opin Biol Ther. – 2012. – V. 12. – № 1. – P. 209-215. 427. Muñoz-Pinedo, C. Signaling pathways that regulate life and cell death: evolution of apoptosis in the context of self-defense/ C. Muñoz-Pinedo // Adv Exp Med Biol. – 2012. – V. 738. – P. 124-143. 428. Nagano, T. Molecular design of fluorescent probes and development of novel fluorescent mother compounds/ T. Nagano // Yakugaku Zasshi. – 2014. – V. 134. – № 1. – P. 89103. 429. Nagaria, P. DNA double-strand break response in stem cells: mechanisms to maintain genomic integrity/ P. Nagaria, C. Robert, F.V. Rassool // Biochim Biophys Acta. – 2013. – V. 1830. – № 2. – P. 2345-2353. 430. Nagasawa H. Bystander effect for chromosomal aberrations induced in wild-type and repair deficient CHO cells by low fluences of alpha particles/ H. Nagasawa, J.B. Little // Mutat. Res. – 2002. – Vol. 508. – № 1-2. – P. 121-129. 430 431. Nagasawa, H. Induction of sister chromatid exchanges by extremely low doses of alphaparticles/ H. Nagasawa, J.B. Little // Cancer Res. – 1992. – V. 52. – P. 6394-6396. 432. Nair, S. Regulatory potential for concerted modulation of Nrf2- and Nfkb1- mediated gene expression in inflammation and carcinogenesis/ S. Nair, S.T. Doh, J.Y. Chan, A.N. Kong, L. Cai // Br J Cancer. – 2008. – V. 99. – P. 2070–2082. 433. Nanou, A. Viral delivery of antioxidant genes as a therapeutic strategy in experimental models of amyotrophic lateral sclerosis/ A. Nanou, A. Higginbottom, C.F. Valori, M. Wyles, K. Ning, P. Shaw, M. Azzouz // Mol Ther. – 2013. – V. 21. – № 8. – P. 14861296. 434. Naryzhny, S.N. Proliferating cell nuclear antigen: a proteomics view/ S.N. Naryzhny // Cell Mol Life Sci. – 2008. – V. 65. – P. 3789–3808. 435. Nasmyth, K. Viewpoint: putting the cell cycle in order/ K. Nasmyth // Science. – 1996. – V. 274. – P. 1643-1645. 436. Valentino, T. PATZ1 interacts with p53 and regulates expression of p53-target genes enhancing apoptosis or cell survival based on the cellular context/ T. Valentino, D. Palmieri, M. Vitiello, G.M. Pierantoni, A. Fusco, M. Fedele // Cell Death Dis. – 2013. – V. 12. – № 4. – P. 963. 437. Ng, S.K. Proteins that contain a functional Z-DNA-binding domain localize to cytoplasmic stress granules/ S.K. Ng, R. Weissbach, G.E. Ronson, A.D. Scadden // Nucleic Acids Res. – 2013. – V. 41. – № 21. – P. 9786-9799. 438. Nguyen, T. Transcriptional regulation of the antioxidant response element: activation by Nrf2 and repression by MafK/ T. Nguyen, H.C. Huang, C.B. Pickett // J Biol Chem. – 2000. – V. 275. – P. 15466–15473. 439. Nielsen, C.T. Circulating microparticles in systemic Lupus Erythematosus/ C.T. Nielsen // Dan Med J. – 2012. – V. 59. – № 11. – P. 4548. 440. Nieto-Sampedro, M. Inhibitors of Glioma Growth that Reveal the Tumour to the Immune System/ M. Nieto-Sampedro, B. Valle-Argos, D. Gómez-Nicola, A. FernándezMayoralas, M. Nieto-Díaz // Clin Med Insights Oncol. – 2011. – V. 5. – P. 265–314. 441. Nikjoo, H. Biophysical model of the radiation-induced bystander effect/ H. Nikjoo, I.K. Khvostunov // Int. J. Radiat. Res. – 2003. – Vol. 79. – № 1. – P. 43-52. 442. Nisimoto, Y. Constitutive NADPH-Dependent Electron Transferase Activity of the Nox4 Dehydrogenase Domain/ Y. Nisimoto, H.M. Jackson, H. Ogawa, T. Awahara, J.D. Lambeth // Biochemistry. – 2010. – V. 49. – № 11. – P. 2433–2442. 443. O’Neill, P. Radiation chemistry comes before radiation biology/ P. O’Neill, P. Wardman // Int. J.Radiat. Biol. – 2009. – V. 85. – P. 9–25. 431 444. Ochs R.L., Smetana K. Fibrillar center distribution in nucleoli of PHA-stimulated human lymphocytes. // Exp.Cell Res. – 1989. – V. 184. – P. 552-557 445. Ojima, M. Radiation-induced bystander effects induce radioadaptive response by lowdose radiation/ R.L. Ochs, K. Smetana // Radiat. Prot. Dosim. – 2011. – V. 146. – P. 276-279. 446. Olson, E.N. bHLH factors in muscle development: dead lines and commitments, what to leave in and what to leave out/ E.N. Olson, W.H. Klein // Genes Dev. – 1994. – V. 8. – № 1. – P. 1-8. 447. O'Neill, L.A. Primer: Toll-like receptor signaling pathways--what do rheumatologists need to know?/ L.A. O'Neill // Nat Clin Pract Rheumatol. – 2008. – V. 4. – № 6. – P. 319-327. 448. Pacher, P. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease/ P. Pacher, J.S. Beckman, L. Liaudet // Physiol. Rev. – 2007. – V. 87. – P. 315–424 449. Palaniyar, N. Nucleic acid is a novel ligand for innate, immune pattern recognition collectins surfactant proteins A and D and mannose-binding lectin/ N. Palaniyar, J. Nadesalingam, H. Clark, M.J. Shih, A.W. Dodds, K.B. Reid // J. Biol. Chem. – 2004. – V. 279. – P. 32728–32736. 450. Palucka A.K. Cross-regulation of TNF and IFN-alpha in autoimmune diseases / A.K Palucka., J.P. Blanck, L. Bennett, V. Pascual, J. Banchereau // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 2005. – V. 102. – № 9. – P. 3372–3377 451. Pan, M.H. Comparative studies on the suppression of nitric oxide synthase by curcumin and its hydrogenated metabolites through down-regulation of IkappaB kinase and NFkappaB activation in macrophages/ M.H. Pan, S.Y Lin-Shiau, J.K. Lin // Biochem Pharmacol. - 2000. – V. 60. – P. 1665–1676. 452. Papayannopoulos, V. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps/ V. Papayannopoulos, K.D. Metzler, A. Hakkim, A. Zychlinsky // J Cell Biol. – 2010. – V. 191. – P. 677-691. 453. Park, B. Granulin is a soluble cofactor for toll-like receptor 9 signaling/ B. Park et al. // Immunity. – 2011. – V. 34. – P. 505–513. 454. Park, B. Proteolytic cleavage in an endolysosomal compartment is required for activation of Toll-like receptor 9/ B. Park, M.M. Brinkmann, E. Spooner, C.C. Lee, Y.M. Kim, H.L. Ploegh // Nat. Immunol. – 2008. – V. 9. – P. 1407–1414. 455. Park, H.S. Cutting edge: direct interaction of TLR4 with NAD(P)H oxidase 4 is ozyme is essential for lipopolysaccharide-induced production of reactive oxygen species and 432 activation of NF-kappaB/ H.S. Park, H.Y. Jung, E.Y. Park, J. Kim, W.J. Lee, Y.S. Bae // J. Immunol. – 2004. – V. 173. – P. 3589–3593. 456. Park, S.H. Endoplasmic reticulum stress-activated C/EBP homologous protein enhances nuclear factor-kappaB signals via repression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma/ S.H. Park, H.J. Choi, H, Yang et al. // J Biol Chem. – 2010. – V. 285. – № 46. – P. 35330-35339. 457. Patel, S.J. The inflammatory response to double stranded DNA in endothelial cells is mediated by NF_B and TNF/ S.J. Patel, R. Jindal, K.P. King, A.W. Tilles, M.L. Yarmush // PLoS ONE. - 2011. – V. 6. – P. 19910. 458. Pedruzzi, L.M. Nrf2-keap1 system versus NF-κB: the good and the evil in chronic kidney disease?/ L.M. Pedruzzi, M.B. Stockler-Pinto, M. Jr. Leite, D. Mafra // Biochimie. – 2012. – V. 94. – № 12. – P. 2461-2466. 459. Pei, X.H. Biochemical and cellular mechanisms of mammalian CDK inhibitors: a few unresolved issues/ X.H. Pei, Y. Xiong // Oncogene. – 2005. – V. 24. – № 17. – P. 2787– 2795. 460. Peter, M. Characterization of suppressive oligodeoxynucleotides that inhibit Toll-like receptor-9-mediated activation of innate immunity/ M. Peter, K. Bode, G.B. Lipford, F. Eberle, K. Heeg, A.H. Dalpke // Immunology. – 2008. – V. 123. – № 1. – P. 118–128. 461. Peters, D.L. Continuous adaptation through genetic communication - a putative role for cell-free DNA/ D.L. Peters, P.J. Pretorius // Expert Opin Biol Ther. – 2012. – V. 12. – № l. – P. 127-132. 462. Peters, D.L. Origin, translocation and destination of extracellular occurring DNA - a new paradigm in genetic behaviour/ D.L. Peters, P.J. Pretorius // Clin Chim Acta. – 2011. – V. 412. – P. 806-811. 463. Pevsner-Fischer, M. Toll-like receptors and their ligands control mesenchymal stem cell functions/ M. Pevsner-Fischer, V. Morad, M. Cohen-Sfady, L. Rousso-Noori, A. ZaninZhorov, S. Cohen, I.R. Cohen, D. Zipori // Blood. – 2007. – V. 109. – № 4. – P. 14221432. 464. Pickering, A.M. Nrf2-dependent induction of proteasome and Pa28alphabeta regulator are required for adaptation to oxidative stress/ A.M. Pickering, R.A. Linder, H. Zhang, H.J. Forman, K.J. Davies // J. Biol. Chem. – 2012. – V. 287. – P. 10021–10031. 465. Pinzani, P. Circulating cell-free DNA in plasma of melanoma patients: qualitative and quantitative considerations/ P. Pinzani, F. Salvianti, S. Zaccara, D. Massi, V. De Giorgi, M. Pazzagli, C. Orlando // Clin Chim Acta. – 2011. – V. 412. – P. 2141-2145. 433 466. Pinzani, P. Circulating nucleic acids in cancer and pregnancy/ P. Pinzani, F. Salvianti, M. Pazzagli, C. Orlando // Methods. – 2010. – V. 50. – P. 302-307. 467. Pisetsky D.S. The origin and properties of extracellular DNA: from PAMP to DAMP/ D.S. Pisetsky // Clin Immunol. – 2012. – V. 144. – P. 32-40. 468. Pisetsky, D.S. Antinuclear antibodies in rheumatic disease: a proposal for a functionbased classification/ D.S. Pisetsky // Scand J Immunol. – 2012. – V. 76. – № 3. – P. 223228. 469. Pisetsky, D.S. The blood nucleome in the pathogenesis of SLE/ D.S. Pisetsky, A.J. Ullal // Autoimmun Rev. – 2010. – V. 10. – P. 35-37. 470. Pisetsky, D.S. The generation of extracellular DNA in SLE: the role of death and sex/ D.S. Pisetsky, N. Jiang // Scand J Immunol. – 2006. – V. 64. – P. 200-204. 471. Pogribny, I. Dose-dependence, sex- and tissue-specificity, and persistence of radiationinduced genomic DNA methylation changes/ I. Pogribny, J. Raiche, M. Slovack, O. Kovalchuk // Biochem Biophys Res Commun. – 2004. – V. 320. – P. 1253-1261. 472. Poltorak, A. Genetic and physicalmapping of the Lps locus: identification of the toll-4 receptor as a candidate gene in the critical region/ A. Poltorak, I. Smirnova, X. He et al. // Blood CellsMol Dis. – 1998. – V. 24. – P. 340–355. 473. Ponomaryova, A.A. Concentration and distribution of single-copy beta-actin gene and LINE-1 repetitive elements in blood of lung cancer patients/ A.A. Ponomaryova, E.Y. Rykova, N.V. Cherdyntseva // Circ Nucleic Acids Plasma Serum. – 2011. – V. 2. – P. 4145. 474. Puszyk, W.M. Unequal representation of different unique genomic DNA sequences in the cell-free plasma DNA of individual donors/ W.M. Puszyk, F. Crea, R. W. Old // Clin Biochem. – 2009. – V. 42. – № 7-8. – P. 736-738. 475. Qi, R. Proteolytic processing regulates Toll-like receptor 3 stability and endosomal localization/ R. Qi, D. Singh, C.C. Kao // J Biol Chem. – 2012. – V. 287. – № 39. – P. 32617-32629. 476. Qiu, J. Toll-like receptor 9 agonist inhibits ERalpha-mediated transactivation by activating NF-kappaB in breast cancer cell lines/ J. Qiu, X. Wang, X. Guo, C. Zhao, X. Wu, Y. Zhang // Oncol Rep. – 2009. – V. 22. – № 4. – P. 935-941. 477. Radic, M. Neutrophil extracellular chromatin traps connect innate immune response to autoimmunity/ M. Radic, T.N. Marion // Semin Immunopathol. – 2013. – V. 35. – P. 465-480. 478. Raiche, J. Sex- and tissue-specific expression of maintenance and de novo DNA methyltransferases upon low dose X-irradiation in mice/ J. Raiche, R. Rodriguez-Juarez, 434 I. Pogribny, O. Kovalchuk // Biochem Biophys Res Commun. – 2004. – V. 325. – P. 3947. 479. Rainer, T.H. Effects of filtration on glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNA in the plasma of trauma patients and healthy individuals/ T.H. Rainer, N.Y. Lam, N.B. Tsui, E.K. Ng, R.W. Chiu, G.M. Joynt, Y.M. Lo // Clin Chem. – 2004. – V. 50. – P. 206208. 480. Rainer, T.H. Prognostic use of circulating plasma nucleic acid concentrations in patients with acute stroke/ T.H. Rainer, L.K. Wong, W. Lam, E. Yuen, N.Y. Lam, C. Metreweli, Y.M. Lo // Clin Chem. – 2003. – V. 49. – P. 562–569. 481. Rak, J. Extracellular vesicles - biomarkers and effectors of the cellular interactome in cancer/ J. Rak // Front Pharmacol. – 2013. – V. 6. – P. 4-21. 482. Raleigh, D.R. Molecular targets and mechanisms of radiosensitization using DNA damage response pathways/ D.R. Raleigh, D.A. Haas-Kogan // Future Oncol. – 2013. – V. 9. – № 2. – P. 219-233. 483. Ramachandran, K. Free circulating DNA as a biomarker of prostate cancer: comparison of quantitation methods/ K. Ramachandran, C.G. Speer, S. Fiddy, I.M. Reis, R. Singal // Anticancer Res. – 2013. – V. 33. – № 10. – P. 4521-4529. 484. Ramaiah, S.K. Toll-like receptor and accessory molecule mRNA expression in humans and mice as well as in murine autoimmunity, transient inflammation, and progressive fibrosis/ S.K. Ramaiah, R. Günthner, M. Lech, H.J. Anders // Int J Mol Sci. – 2013. – V. 14. – № 7. – P. 13213-13230. 485. Ramirez, J.L. Serum DNA as a tool for cancer patient management/ J.L. Ramirez, C. Taron M, Balaña, C. Sarries, P. Mendez, I. de Aguirre, L. Nuñez, B. Roig, C. Queralt, M. Botia, R. Rosell // Rocz Akad Med Bialymst. – 2003. – V. 48. – P. 34-41. 486. Rani, S. Global analysis of serum microRNAs as potential biomarkers for lung adenocarcinoma/ S. Rani, K. Gately, J. Crown, K. O'Byrne, L. O'Driscoll // Cancer Biol Ther. – 2013. – V. 4. – № 14. – P. 12 487. Raptis, L. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus/ L. Raptis, H.A. Menard // J Clin Invest. – 1980. – V. 66. – P. 1391-1399. 488. Ravid, T. Ceramide accumulation precedes caspase-3 activation during apoptosis of A549 human lung adenocarcinoma cells/ T. Ravid, A. Tsaba, P. Gee, R. Rasooly, E.A. Medina, T. Goldkorn // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. – 2003. – V. 284. – № 6. – P. 1082-1092. 435 489. Reed SI. Ratchets and clocks: the cell cycle, ubiquitylation and protein turnover/ S.I. Reed // Nat Rev Mol Cell Biol. – 2003. – V. 4. – P. 855-864. 490. Ren, B. Is plasma cell-free DNA really a useful marker for diagnosis and treatment of trauma patients?/ B. Ren, F. Liu, F. Xu, J. He, H. Zhu, G. Zou // Clin Chim Acta. – 2013. – V. 424. – P. 109-113. 491. Reuter S, Gupta SC, Chaturvedi MM, Aggarwal BB. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked? Free Radic Biol Med. – 2010. – V. 49. – № 11. – P. 16031616. 492. Rhodes, A. Plasma DNA concentration as a predictor of mortality and sepsis in critically ill patients/ A. Rhodes, S.J. Wort, H. Thomas, P. Collinson, E.D. Bennett // Crit Care. 2006. – V. 10. – № 2. – P. 60. 493. Richard, G.F. Comparative genomics and molecular dynamics of DNA repeats in eukaryotes/ G.F. Richard, A. Kerrest, B. Dujon // Microbiol Mol Biol Rev. – 2008. – V. 72. – № 4. – P. 686-727. 494. Roberts, T.L. HIN-200 proteins regulate caspase activation in response to foreign cytoplasmic DNA/ T.L. Roberts, A. Idris, J.A. Dunn, G.M. Kelly, C.M. Burnton, S. Hodgson L.L. Hardy, V. Garceau, M.J. Sweet, I.L. Ross, D.A. Hume, K.J. Stacey // Science. – 2009. – V. 20. –№ 323(5917). – P. 1057-1060 495. Rock, F.L. A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll/ F.L. Rock, G. Hardiman, J.C. Timans, R.A. Kastelein, J.F. Bazan // Proc. // Nat. Acad. Sci. – 1998. – V. 95. – P. 588-593. 496. Rodriguez, G.P. In vivo bypass of 8-oxodG/ G.P. Rodriguez, J.B. Song, G.F. Crouse // PLoS Genet. – 2013. – V. 20. –№ 9 (8). – P. e1003682. 497. Rogakou, E.P. DNA doublestranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139/ E.P. Rogakou, D.R. Pilch, A.H. Orr, V.S. Ivanova, W.M. Bonner // J. Biol. Chem. – 1998. – V. 273. – P. 5858–5868. 498. Rose, W.A. 2nd TLR9 is important for protection against intestinal damage and for intestinal repair/ W.A. Rose 2nd, K. Sakamoto, C.A. Leifer // Sci Rep. – 2012. – V. 2. –P. 574 499. Roszkowski, K. Oxidative DNA Damage - the possible use of biomarkers as additional prognostic factors in oncology/ K. Roszkowski //. Front Biosci. – 2014. – V. 19. – P. 808-817. 500. Roth, C. Apoptosis-related deregulation of proteolytic activities and high serum levels of circulating nucleosomes and DNA in blood correlate with breast cancer progression/ C. 436 Roth, K. Pantel, V. Muller, B. Rack, S. Kasimir-Bauer, W. Janni, H. Schwarzenbach // BMC Cancer. – 2011. – V. 11. – P. 4. 501. Royall J.A., H. Ischiropoulos, Evaluation of 2_,7_-dichlorofluorescin and dihydrorhodamine 123 as fluorescent probes for intracellular H2O2 in cultured endothelial cells/ J.A. Royall // Arch. Biochem. Biophys. 1993. – V. 302. – P. 348–355. 502. Ruff M.R. Rabbit tumor necrosis factor: mechanism of action / M.R Ruff, G.E. Gifford // Infect Immun. – 1981. – V.31. – № 1. – Р. 235-241 503. Russo, M.T. The oxidized deoxynucleoside triphosphate pool is a significant contributor to genetic instability in mismatch repair-deficient cells/ M.T. Russo, M.F. Blasi, F. Chiera, P. Fortini, P. Degan, P. Macpherson, M. Furuichi, Y. Nakabeppu, P. Karran, G. Aquilina, M. Bignami // Mol Cell Biol. – 2004. – V. 24. – № 1/ - P. 465-474. 504. Rykova, E.Y. Cell-free and cell-bound circulating nucleic acid complexes: mechanisms of generation, concentration and content/ E.Y. Rykova, E.S. Morozkin, A.A. Ponomaryova, E.M. Loseva, I.A. Zaporozhchenko, N.V. Cherdyntseva, V.V. Vlassov, P.P. Laktionov // Expert Opin Biol Ther. – 2012. – V. 12. – № 1. – P. 141-153. 505. Salminen, A. Activation of innate immunity system during aging: NF-kB signaling is the molecular culprit of inflamm-aging/ A. Salminen, J. Huuskonen, J. Ojala, A. Kauppinen, K. Kaarniranta, T. Suuronen // Ageing Res. Rev. – 2008. – V. 7. – № 2. – P. 83-105. 506. Samejima, K. Trashing the genome: the role of nucleases during apoptosis/ K. Samejima, W.C. Earnshaw // Nat Rev Mol Cell Biol. – 2005. – V. 6. – P. 677–688. 507. Sandgren, S. The human antimicrobial peptide LL-37 transfers extracellular DNA plasmid to the nuclear compartment of mammalian cells via lipid rafts and proteoglycandependent endocytosis/ S. Sandgren, A. Wittrup, F. Cheng, M. Jonsson, E. Eklund, S. Busch et al. // J Biol Chem. – 2004. – V. 279. – № 17. – P. 17951–17956. 508. Sandholm, J. Selander KS.Estrogen receptor-α and sex steroid hormones regulate Tolllike receptor-9 expression and invasive function in human breast cancer cells/ J. Sandholm, J.H. Kauppila, C. Pressey, J. Tuomela, A. Jukkola-Vuorinen, M. Vaarala, M.R. Johnson, K.W. Harris, K.S. Selander // Breast Cancer Res Treat. – 2012. – V. 132. – № 2. – P. 411-419. 509. Sano, H. Dna isolated from DNA/anti-DNA antibody immune complexes in systemic lupus erythematosus is rich in guanine-cytosine content/ H. Sano, C. Morimoto // J. Immunol. – 1982. – V.128. – № 3. – P. 1341-1345. 510. Saraiva, M. The regulation of IL-10 production by immune cells/ M. Saraiva, A. O'Garra // Nat Rev Immunol. – 2010. – V. 10. – № 3. – P. 170-181. 437 511. Sasai, M. Bifurcation of Toll-like receptor 9 signaling by adaptor protein 3/ M. Sasai, M.M. Linehan, A. Iwasaki // Science. – 2010. – V. 329. – P. 1530–1534. 512. Sasai, M. Pathogen Recognition Receptors: Ligands and Signaling Pathways by TollLike Receptors/ M. Sasai, M. Yamamoto // International Reviews of Immunology. – 2013. – V. 32. – P. 116–133. 513. Sathe, A. TLR9 and RIG-I Signaling in Human Endocervical Epithelial Cells Modulates Inflammatory Responses of Macrophages and Dendritic Cells In Vitro/ A. Sathe, K.V. Reddy // PLoS One. – 2014. – V. 9. – № 1. – P. e83882. 514. Sato, N. Correlation between centrosome abnormalities and chromosomal instability in human pancreatic cancer cells/ N. Sato, K. Mizumoto, M. Nakamura et al. // Cancer Genet Cytogenet. – 2001. – V. 126. – P. 13–19. 515. Savva, A. Targeting Toll-Like Receptors: Promising Therapeutic Strategies for the Management of Sepsis-Associated Pathology and Infectious Diseases/ A. Savva, T. Roger // Front Immunol. – 2013. – V. 18. – № 4. – P. 387. 516. Sayres, L.C. Cell-free fetal nucleic acid testing: a review of the technology and its applications/ L.C. Sayres, M.K. Cho // Obstet Gynecol Surv. – 2011. – V. 66. – P. 431442. 517. Schindler, R. Correlations and interactions in the production of interleukin-6 (IL-6), IL-1, and tumor necrosis factor (TNF) in human blood mononuclear cells: IL-6 suppresses IL-1 and TNF?/ R. Schindler, J. Mancilla, S. Endres et al. // Blood. – 1990. – V. 75. – P. 4047. 518. Schmidt, B. Integrity of cell-free plasma DNA in patients with lung cancer and nonmalignant lung disease/ B. Schmidt, S. Weickmann, C. Witt, M. Fleischhacker // Ann N Y Acad Sci. – 2008. – V. 1137. – P. 207-213. 519. Schmidt, M.V. The nuclear hormone receptor PPARgamma as a therapeutic target in major diseases/ M.V. Schmidt, B. Brune, A. von Knethen // Sci World J. – 2010. – V. 10. – P. 2181-2197. 520. Schnerch, D. Cell cycle control in acute myeloid leukemia/ D. Schnerch, J. Yalcintepe, A. Schmidts, H. Becker, M. Follo, M. Engelhardt, R. Wäsch // Am J Cancer Res. – 2012. – V. 2. – № 5. – P. 508-528. 521. Schorey JS, Bhatnagar S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. – 2008. – V. 9. – P. 871–881. 522. Schroder, K. Nox 4 is a protective reactive oxygen species generating vascular NADPH oxidase/ K. Schroder, M. Zhang, S. Benkhoff, A. Mieth, R. Pliquett, J. Kosowski et al. // Circ. Res. – 2012. – V. 110. – P. 1217–1225. 438 523. Schwarzenbach, H. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients/ H. Schwarzenbach, D.S. Hoon, K. Pantel // Nat Rev Cancer. – 2011. – V. 11. – P. 426-437. 524. Schwarzenbach, H. Circulating nucleic acids as biomarkers in breast cancer/ H. Schwarzenbach // Breast Cancer Res. – 2013. – V.15. – № 5. – P. 211. 525. Schwarzenbach, H. Loss of heterozygosity at tumor suppressor genes detectable on fractionated circulating cell-free tumor DNA as indicator of breast cancer progression/ H. Schwarzenbach, C. Eichelser, J. Kropidlowski, W. Janni, B. Rack, K. Pantel // Clin Cancer Res. – 2012. – V. 18. – № 20. – P. 5719-5730. 526. Scott, B.R. A biological-base model that links genomic instability, bystander effects and adaptive response/ B.R. Scott // Mutat. Res. – 2004. – V. 568. – P. 129-143. 527. Scully, R. Double strand break repair functions of histone H2AX/ R. Scully, A. Xie // Mutat Res. – 2013. – V. 750. – № 1-2. – P. 5-14. 528. Sedelnikova, O.A. Role of oxidatively induced DNA lesions in human pathogenesis/ O.A. Sedelnikova, C.E. Redon, J.S. Dickey, A.J. Nakamura, A.G. Georgakilas, W.M. Bonner // Mutat.Res. – 2010. – V. 704. – P. 152–159. 529. Segurado, M. The S-phase checkpoint: targeting the replication fork/ M. Segurado, J.A. Tercero // Biol Cell. – 2009. – V. 101. – P. 617-627. 530. Seitz, N. A novel statistical approach for the evaluation of comet assay data/ N. Seitz, M. Böttcher, S. Keiter, T. Kosmehl, W. Manz, H. Hollert, T. Braunbeck // Mutat Res. – 2008. – V. 652. – № 1. – P. 38-45. 531. Sekizawa, A. Cell-free fetal DNA in the plasma of pregnant women with severe fetal growth restriction/ A. Sekizawa, M. Jimbo, H. Saito, M. Iwasaki, R. Matsuoka, T. Okai, A. Farina // Am J Obstet Gynecol. – 2003. – V. 188. – № 2. – P. 480-484. 532. Seldon, M.P. Heme oxygenase-1 inhibits the expression of adhesion molecules associated with endothelial cell activation via inhibition of NF-kappaB RelA phosphorylation at serine 276/ M.P. Seldon, G. Silva, N. Pejanovic, R. Larsen, I.P. Gregoire, J. Filipe, J. Anrather, M.P. Soares // J Immunol. – 2007. – V. 179. – P. 7840– 7851. 533. Sellier, H. How should we define STAT3 as an oncogene and as a potential target for therapy?/ H. Sellier, A. Rébillard, C. Guette, B. Barré, O. Coqueret // JAKSTAT. – 2013. – V. 2. – № 3. – P. e24716. 534. Selvarajoo, K. Macroscopic law of conservation revealed in the population dynamics of Toll-like receptor signaling/ K. Selvarajoo // Cell Commun Signal. – 2011. – V. 20. – № 9. – P. 9. 439 535. Shackelford, R.E. Oxidative stress and cell cycle checkpoint function. Free Radic/ R.E. Shackelford, W.K. Kaufmann, R.S. Paules // Biol. Med. – 2000. – V. 28. – № 9. – P. 1387–1404. 536. Shao, W. The caspase-1 digestome identifies the glycolysis pathway as a target during infection and septic shock/ W. Shao, G. Yeretssian, K. Doiron, S.N. Hussain, M. Saleh // J Biol Chem. – 2007. – V. 282. – № 50. – P. 36321–36329. 537. Sharma, V.K. Mass spectrometric based analysis, characterization and applications of circulating cell free DNA isolated from human body fluids/ V.K. Sharma, P. Vouros, J. Glick // Int J Mass Spectrom. – 2011. – V. 304. – № 2-3. – P. 172-183. 538. Shatz, M. The human TLR innate immune gene family is differentially influenced by DNA stress and p53 status in cancer cells/ M. Shatz, D. Menendez, M.A. Resnick // Cancer Res. – 2012. – V. 72. – № 16. – P. 3948-3957. 539. Shaw, N. Role of the HIN Domain in Regulation of Innate Immune Responses/ N. Shaw, Z.J. Liu // Mol Cell Biol. – 2014. – V. 34. – № 1. – P. 2-15. 540. Sherr, C.J. Living with or without cyclins and cyclin-dependent kinases/ C.J. Sherr, J.M. Roberts // Genes Dev. – 2004. – V. 18. – P. 2699–2711. 541. Shimony, A. Cell free DNA detected by a novel method in acute ST-elevation myocardial infarction patients/ A. Shimony, D. Zahger, H. Gilutz, H. Goldstein, G. Orlov, M. Merkin, A. Shalev, R. Ilia, A. Douvdevani // Acute Card Care. – 2010. – V. 12. – P. 109111. 542. Shintani, Y. TLR9 mediates cellular protection by modulating energy metabolism in cardiomyocytes and neurons/ Y. Shintani, A. Kapoor, M. Kaneko, R.T. Smolenski, F. D'Acquisto, S.R. Coppen, N. Harada-Shoji, H.J. Lee, C. Thiemermann, S. Takashima, K. Yashiro, K. Suzuki // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2013. – V. 110. – № 13. – P. 51095114. 543. Shirota, H. Suppressive oligodeoxynucleotides protect mice from lethal endotoxic shock/ H. Shirota, I. Gursel, M. Gursel, and D. M. Klinman, // Journal of Immunology. – 2005. – V. 174. – № 8. – P. 4579–4583. 544. Shivji, K.K. Proliferating cell nuclear antigen is required for DNA excision repair/ K.K. Shivji, M.K. Kenny, R.D. Wood // Cel. – 1992. – V. 69. – P. 367–374. 545. Shrivastav, M. Nucleic Acid Sensors and Type I Interferon Production in Systemic Lupus Erythematosus/ K.K. Shivji, M.K. Kenny, R.D. Wood // Front Immunol. – 2013. – V. 4. – P. 319. 546. Silke, J. Inhibitor of apoptosis (IAP) proteins-modulators of cell death and inflammation/ J. Silke, P. Meier // Cold Spring Harb Perspect Biol. – 2013. – V. 5. – № 2. – P. a008730. 440 547. Singh, S.S. Nrf2/ARE stress response mechanism: a control point in oxidative stressmediated dysfunctions and chronic inflammatory diseases/ S.S. Singh, S. Vrishni, B.K. Singh, I. Rahman, P. Kakkar // Free Radic. Res. – 2010. – V. 44. – P. 1267-1288. 548. Sinha, K. Oxidative stress: the mitochondria-dependent and mitochondria-independent pathways of apoptosis/ K. Sinha, J. Das, P.B. Pal, P.C. Sil // Arch Toxicol. – 2013. – V. 87. – № 7. – P. 1157-1180. 549. Skibsted, S. Bench-to-bedside review: Future novel diagnostics for sepsis - a systems biology approach/ S. Skibsted, M.K. Bhasin, W.C. Aird, N.I. Shapiro // Crit Care. – 2013. – V. 17. – № 5. – P. 231. 550. Sohni, A. Mesenchymal Stem Cells Migration Homing and Tracking/ A. Sohni, C.M. Verfaillie // Stem Cells Int. – 2013. – V. 2013. – P. 130763. 551. Speina, E. Contribution of hMTH1 to the maintenance of 8-oxoguanine levels in lung DNA of non-small-cell lung cancer patients/ E. Speina, K.D. Arczewska, D. Gackowski, M. Zielińska, A. Siomek, J. Kowalewski, R. Oliński, B. Tudek, J.T. Kuśmierek // J Natl Cancer Inst. – 2005. – V. 97. - № 5/ - P. 384-395. 552. Stacey, K. The molecular basis for the lack of immunostimulatory activity of vertebrate DNA/ K. Stacey, G. Young, F. Clark et al. // J. Immunol. – 2003. – V. 170. – P. 36143620. 553. Staron, M. Heat-shock protein gp96/grp94 is an essential chaperone for the platelet glycoprotein Ib-IX-V complex/ M. Staron et al. // Blood. – 2011. – V. 117. – P. 7136– 7144. 554. Stevens, J.B. Heterogeneity of cell death/ J.B. Stevens, B.Y. Abdallah, G. Liu, S.D. Horne, S.W. Bremer, K.J. Ye, J.Y. Huang, M. Kurkinen, C.J. Ye, H.H. Heng // Cytogenet Genome Res. – 2013. – V. 139. – № 3. – P. 164-173. 555. Stroun, M. Alu repeat sequences are present in increased proportions compared to a unique gene in plasma/serum DNA: evidence for a preferential release from viable cells/ M. Stroun, J. Lyautey, C. Lederrey, H.E. Mulcahy, P. Anker // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2001. – V.945. – № 9. – P. 258-264. 556. Struthers, L. Direct detection of 8-oxodeoxyguanosine and 8-oxoguanine by avidin and its analogues/ L. Struthers, R. Patel, J. Clark, S. Thomas // Anal Biochem. – 1998. – V. 255. – № 1. – P. 20-31. 557. Stunz, L.L. Inhibitory oligonucleotides specifically block effects of stimulatory CpG oligonucleotides in B cells/ L.L. Stunz, P. Lenert, D. Peckham et al. // European Journal of Immunology. – 2002 . – V. 32. –- № 5. – P. 1212–1222. 441 558. Su, T.T. Cellular responses to DNA damage: one signal, multiple choices/ T.T. Su // Annu Rev Genet. – 2006. – V. 40. – P. 187-208. 559. Sun, L. Cyclic GMP-AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway/ L. Sun, J. Wu, F. Du, X. Chen, Z.J. Chen // Science. – 2013. – V. 339. – P. 786–791. 560. Sun, L. JAK1-STAT1-STAT3, a key pathway promoting proliferation and preventing premature differentiation of myoblasts/ L. Sun, K. Ma, H. Wang, F. Xiao, Y. Gao, W. Zhang et al. // J Cell Biol. – 2007. – V. 179. – P. 129-138. 561. Sun, W. ERIS, an endoplasmic reticulum IFN stimulator, activates innate immune signaling through dimerization/ W. Sun, Y. Li, L. Chen, H. Chen, F. You, X. Zhou, Y. Zhou, Z. Zhai, D. Chen, Z. Jiang // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2009. – V. 106. – P. 8653–8658. 562. Surh, Y.J. Nrf2 as a master redox switch in turning on the cellular signaling involved in the induction of cytoprotective genes by some chemopreventive phytochemicals/ Y.J. Surh, J.K. Kundu, H.K. Na // Planta Med. – 2008. – V. 74. – P. 1526–1539. 563. Suzuki, M. Structure of Bax: oregulation of dimer formation and intracellular localization/ M. Suzuki, R.J. Youle, N. Tjandra // Cell. – 2000. – V. 103. – P. 645–654. 564. Suzuki, N. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma/ N. Suzuki, A. Kamataki, J. Yamaki, Y. Homma // Clin Chim Acta. – 2008. – V. 387. – P. 55-58. 565. Swarup, V. Circulating (cell-free) nucleic acids - a promising, non-invasive tool for early detection of several human diseases/ V. Swarup, M.R. Rajeswari // FEBS Lett. – 2007. – V. 581. – P. 795-799. 566. Swathi, A. Homology modeling and structural comparison of leucine rich repeats of Toll like receptors 1-10 of ruminants/ A. Swathi, G. Dhinakar Raj, A. Raja, K.G. Tirumurugaan // J Mol Model. – 2013. – V. 19. – № 9. – P. 3863-3874. 567. Swystun, L.L. Breast cancer chemotherapy induces the release of cell-free DNA, a novel procoagulant stimulus/ L.L. Swystun, S. Mukherjee, P.C. Liaw // J Thromb Haemost. – 2011. – V, 9. – P. 2313-2321. 568. Symons, A. MAP kinase kinase kinases and innate immunity/ Symons, A., Beinke, S., Ley, S.C., // Trends Immunol. – 2006. – V. 2. – P. 40–48. 569. Szabo, A. Collaboration of Toll-like and RIG-I-like receptors in human dendritic cells: tRIGgering antiviral innate immune responses/ A. Szabo, E. Rajnavolgyi // Am J Clin Exp Immunol. – 2013. – V. 2. – № 3. – P. 195-207. 570. Szpechcinski, A. Evaluation of fluorescence-based methods for total vs. amplifiable DNA quantification in plasma of lung cancer patients/ A. Szpechcinski, R. Struniawska, J. 442 Zaleska, M. Chabowski, T. Orlowski, K. Roszkowski, J. Chorostowska-Wynimko // J Physiol Pharmacol. – 2008. – V. 59. - № l. – P.675-681. 571. Tabeta, K. The Unc93b1 mutation 3d disrupts exogenous antigen presentation and signaling via Toll-like receptors 3, 7 and 9/ K. Tabeta et al. // Nat Immunol. – 2006. – V. 7. – P. 156–164. 572. Taguchi, T. Chromosomal localization of TIL, a gene encoding a protein related to the Drosophila transmembrane receptor Toll, to human chromosome 4p14/ T. Taguchi, J.L. Mitcham, S.K. Dower, J.E. Sims, J.R. Testa // Genomics. – 1996. – V. 32. – P. 486-488. 573. Takac, I. The E-loop is involved in hydrogen peroxide formation by the NADPH oxidase Nox4/ I Takac, K. Schroder, L. Zhang, B. Lardy, N. Anilkumar, J. D. Lambeth, A.M. Shah, F. Morel, R.P. Brandes // J Biol Chem. – 2011. – V. 286. - № l5. – P. 1330413313. 574. Takagi, M. Toll-like Receptor/ M. Takagi // J Clin Exp Hematop. – 2011. – V.51 – № 2. – P. 77-92. 575. Takahashi, K. A protein associated with Toll-like receptor (TLR) 4 (PRAT4A) is required for TLR-dependent immune responses/ K. Takahashi et al. // J Exp Med. – 2007. – V. 204. – P. 2963–2976. 576. Takeuchi, O. TLR6: a novel member of an expanding Toll-like receptor family/ O. Takeuchi, T. Kawai, H. Sanjo et al. // Gene. – 1999. – V. 231. – P. 59-65. 577. Tanaka K. Multiple functions of the S-phase checkpoint mediator/ K. Tanaka // Biosci Biotechnol Biochem. – 2010. – V. 74. – P. 2367-2373. 578. Tanaka, Y. STING specifies IRF3 phosphorylation by TBK1 in the cytosolic DNA signaling pathway/ Y. Tanaka, Z.J. Chen // Sci Signal. – 2012. – V. 5. – P. 20. 579. Tang, D. PAMPs and DAMPs: signal 0s that spur autophagy and immunity/ D. Tang, R. Kang, C.B. Coyne, H.J. Zeh, M.T. Lotze // Immunol Rev. – 2012. – V. 249. – № 1. – P. 158-175. 580. Theofilopoulos, A.N. Intracellular nucleic acid sensors and autoimmunity/ A.N. Theofilopoulos, D.H. Kono, B. Beutler, R. Baccala // J. Interferon CytokineRes. – 2011. – V. 31. – P. 867–886. 581. Thierry, A.R. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts/ A.R. Thierry, F. Mouliere, C. Gongora, J. Ollier, B. Robert, M. Ychou, M. Del Rio, F. Molina // Nucleic Acids Res. – 2010. – V. 38. – P. 6159-6175. 582. Thomas, S.R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities/ S.R. Thomas, P.K. Witting, G.R. Drummond // Antioxid Redox Signal. – 2008. – V. 10. – № 10. – P. 1713-1765. 443 583. Tian, J. Toll-like receptor 9-dependent activation by DNA-containing immune complexes is mediated by HMGB1 and RAGE/ J. Tian et al. // Nat Immunol. – 2007. – V. 8. – P. 487–496. 584. Tong, Y.K. Diagnostic developments involving cell-free (circulating) nucleic acids/ Y.K. Tong, Y.M. Lo // Clin Chim Acta. – 2006. – V. 363. – P. 187-196. 585. Tran, T.T. The release of DNA into the plasma of mice following hepatic cell death by apoptosis and necrosis/ T.T. Tran, P. Groben, D.S. Pisetsky // Biomarkers. – 2008. – V. 13. – P. 184-200. 586. Trenerry, M.K. Cameron-Smith D. JAK/STAT signaling and human in vitro myogenesis/ M.K. Trenerry, P.A. Della Gatta // BMC Physiol 2011. – 2006. – V. 11. – P. 6/ 587. Triantafilou, K. Herpes simplex virus 2-induced activation in vaginal cells involves Tolllike receptors 2 and 9 and DNA sensors DAI and IFI16/ K. Triantafilou, D. Eryilmazlar, M. Triantafilou // Am J Obstet Gynecol. – 2014. – V. 210. – № 2. – P. 122. 588. Trieu, A. DNA motifs suppressing TLR9 responses/ A. Trieu, T.L. Roberts, J.A. Dunn, M.J. Sweet, K.J. Stacey // Crit Rev Immunol. – 2006. – V. 26. – № 6. - P. 527-544. 589. Tsai, N.W. The value of serial plasma nuclear and mitochondrial DNA levels in patients with acute ischemic stroke/ N.W. Tsai, T.K. Lin, S.D. Chen, W.N. Chang, H.C. Wang, T.M. Yang, Y.J. Lin, C.R. Jan, C.R. Huang, C.W. Liou, C.H. Lu // Clin Chim Acta. – 2011. – V. 412. – № 5-6. – P. 476-479. 590. Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: appraisal of the Griess reaction in the L-arginine/nitric oxide area of research/ D. Tsikas // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. – 2007. – V. 851. – № 1-2. – P. 51-70. 591. Tsui, N.B. Recent advances in the analysis of fetal nucleic acids in maternal plasma/ N.B. Tsui, Y.M. Lo // Curr Opin Hematol. – 2012. – V. 19. – P. 462-468. 592. Turchinovich, A. Characterization of extracellular circulating microRNA/ A. Turchinovich, L. Weiz, A. Langheinz, B. Burwinkel // Nucleic Acids Res. – 2011. – V. 39. – P. 7223-7233. 593. Turpaev, KT. Keap1-Nrf2 signaling pathway: mechanisms of regulation and role in protection of cells against toxicity caused by xenobiotics and electrophiles/ K.T. Turpaev // Biochemistry. – 2. – V. 78. – № 2. – P. 111-126. 594. Ulivi, P. Role of quantitative and qualitative characteristics of free circulating DNA in the management of patients with non-small cell lung cancer/ P. Ulivi, R. Silvestrini // Cell Oncol. – 2013. – V. 36. –- № 6. – P. 439-448. 444 595. Umetani, N. Higher amount of free circulating DNA in serum than in plasma is not mainly caused by contaminated extraneous DNA during separation/ N. Umetani, S. Hiramatsu, D.S. Hoon // Ann N Y Acad Sci. – 2006. – V. 1075. – P. 299-307. 596. Umetani, N. Increased integrity of free circulating DNA in sera of patients with colorectal or periampullary cancer: direct quantitative PCR for ALU repeats/ N. Umetani, J. Kim, S. Hiramatsu, H.A. Reber, O.J. Hines, A.J. Bilchik, D.S. Hoon // Clin Chem. – 2006. – V. 52. – P. 1062-1069. 597. Umetani, N. Prediction of breast tumor progression by integrity of free circulating DNA in serum/ N. Umetani, A.E. Giuliano, S.H. Hiramatsu, F. Amersi, T. Nakagawa, S. Martino, D.S. Hoon // J Clin Oncol. – 2006. – V. 24. – P. 4270-4276. 598. Unterholzner, L. The interferon response to intracellular DNA: why so many receptors?/ L. Unterholzner // Immunobiology. – 2013. – V. 218. – № 11. – P. 1312-1321. 599. Urbanova, M. Circulating nucleic acids as a new diagnostic tool/ M. Urbanova, J. Plzak, H. Strnad, J. Betka // Cell Mol Biol Lett. – 2010. – V. 15. – P. 242-259. 600. Vabret, N. Sensing Microbial RNA in the Cytosol/ Vabret N, Blander JM. // Front Immunol. – 2013. – V. 25. – № 4. – P. 468. 601. Vacchelli, E. Trial Watch: Toll-like receptor agonists for cancer therapy/ E. Vacchelli, A. Eggermont, C. Sautès-Fridman, J. Galon, L. Zitvogel, G. Kroemer, L. Galluzzi // Oncoimmunology. – 2013. – V. 2. – № 8. – P. e25238. 602. Valadi, H. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells/ H. Valadi, K. Ekstrom, A. Bossios, M. Sjostrand, J.J. Lee, J.O. Lotvall // Nat Cell Biol. – 2007. – V. 9. – P. 654–659. 603. Valavanidis, A. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis/ A. Valavanidis, T. Vlachogianni, C. Fiotakis // J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev. – 2009. – V. 27. – P. 120-139. 604. van den Heuvel, S. Cell-cycle regulation/ S. van der Heuvel // WormBook. – 2005. – V. 21. – P. 1-16. 605. van der Vaart, M. Characterisation of circulating DNA by parallel tagged sequencing on the 454 platform/ M. van der Vaart, D.V. Semenov, E.V. Kuligina, V.A. Richter, P.J. Pretorius // Clin Chim Acta. – 2009. – V. 409. – P. 21-27. 606. van der Vaart, M. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma/ M. van der Vaart, P.J. Pretorius // Clin Chim Acta. – 2008. – V. 395. – P. 186. 607. van der Vaart, M. Circulating DNA. Its origin and fluctuation/ M. van der Vaart, P.J. Pretorius // Ann N Y Acad Sci. – 2008. – V. 1137. – P. 18-26. 445 608. van der Vaart, M. The origin of circulating free DNA/ M. van der Vaart, P.J. Pretorius // Clin Chem. – 2007. – V. 53. – № 12. – P. 2215. 609. Van Helden, P.D. Potential Z-DNA-forming elements in serum DNA from human systemic lupus erythematosus/ P.D. Van Helden // J Immunol. – 1985. – V. 134. - № 1. – P. 177-9. 610. Vasilyeva I.N. Low-molecular-weight DNA in blood plasma as an index of the influence of ionizing radiation/ I.N. Vasilyeva // Ann N Y Acad Sci. – 2001. – V. 945. – P. 221228. 611. Vasquez MZ. Recommendations for safety testing with the in vivo comet assay/ M.Z. Vasquez // Mutat Res. – 2012. – V. 747. – № 1. – P. 142-156. 612. Veiko, N.N. Elements of structural organization of the transcribed area of the ribosomal repeat (rDNA) in human peripheral blood lymphocytes/ N.N. Veiko, N.A. Liapunova, N.V. Kosiakova, D.M. Spitkovskii // Mol Biol. – 2001. – V. 35. – № 1. – P. 52-64. 613. Vernon, S.D. Analysis of 16S rRNA gene sequences and circulating cell-free DNA from plasma of chronic fatigue syndrome and non-fatigued subjects/ S.D. Vernon, S.K. Shukla, J. Conradt, E.R. Unger, W.C. Reeves // BMC Microbiol. – 2002. – V. 2. – P. 39. 614. Verthelyi, D. Immunoregulatory activity of CpG oligonucleotides in humans and nonhuman primates/ D. Verthelyi, D.M. Klinman // Clin. Immunol. – 2003. – V. 109. – P. 64-71. 615. Vilaysane, A. The innate immune response to DNA/ A. Vilaysane, D.A. Muruve // Semin Immunol. – 2009. – V. 21. – № 4. – P. 208-214. 616. Vladimer, G.I. Inflammasomes and host defenses against bacterial infections/ G.I. Vladimer, R. Marty-Roix, S. Ghosh, D. Weng, E. Lien // Curr Opin Microbiol. – 2013. – V. 16. – № 1. – P. 23-31. 617. Vladimirov, V.G. Extracellular DNA level in the blood of irradiated rats/ V.G. Vladimirov, A.S. Belokhvostov, S.S. Sherlina, I.N. Vasilyeva, A.M. Voskresensky // Int J Radiat Biol. – 1992. – V. 62. – № 6. – P.667-671. 618. Vollmer, J. TLR9 in Health and Disease/ J. Vollmer // Int. Rev. of Immunology. – 2006. – V. 25. – P. 155-181. 619. von Löhneysen, K. Structural insights into Nox4 and Nox2: motifs involved in function and cellular localization/ K. von Löhneysen, D. Noack, M.R. Wood, J.S. Friedman, U.G. Knaus // Mol Cell Biol. – 2010. – V. 30. – № 4. – P. 961-975. 620. Wakabayashi, N. When NRF2 talks, who's listening?/ N. Wakabayashi, S.L. Slocum, J.J. Skoko, S. Shin, T.W. Kensler // Antioxid Redox Signal. – 2010. – V. 13. – № 11. – P. 1649-1663. 446 621. Wallace D.C. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging/ D.C. Wallace // Environ Mol Mutagen. – 2010. – V. 51. – P. 440-450. 622. Wang, B.G. Increased plasma DNA integrity in cancer patients/ B.G. Wang, H.Y. Huang, Y.C. Chen, R.E. Bristow, K. Kassauei, C.C. Cheng, R. Roden, L.J. Sokoll, D.W. Chan, M. Shih Ie // Cancer Res. – 2003. – V. 63. – P. 3966-3968. 623. Wang, C.J. Rapid and simple one-step membrane extraction for the determination of 8hydroxy-2'-deoxyguanosine in human plasma by a combination of on-line solid phase extraction and LC-MS/MS/ C.J. Wang, N.H. Yang, C.C. Chang, S.H. Liou, H.L. Lee // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. – 2011. – V. 879. – № 30. – P. 35383543. 624. Wang, D. Activation of nuclear factor-kappaB-dependent transcription by tumor necrosis factor-alpha is mediated through phosphorylation of RelA/p65 on serine 529 / D. Wang, A.S. Baldwin Jr. // J. Biol. Chem. – 1998. – V.273. – №.45. – P. 29411-29416. 625. Wang, H. Molecular modelling methods for prediction of sequence-selectivity in DNA recognition/ H.Wang, C.A. Laughton // Methods. – 2007. – V. 42. – № 2. – P. 196-203. 626. Wang, J. The functional effects of physical interactions among Toll-like receptors 7, 8, and 9/ J. Wang, Y. Shao, T.A. Bennett, R.A. Shankar, P.D. Wightman, L.G. Reddy // J Biol Chem. – 2006. – V. 281. – № 49. – P. 37427-37434. 627. Wang, X.J. Identification of retinoic acid as an inhibitor of transcription factor Nrf2 through activation of retinoic acid receptor alpha/ X.J. Wang, J.D. Hayes, C.J. Henderson, C.R. Wolf // Proc Natl Acad Sci USA. – 2007. – V. 104. – P. 19589–19594. 628. Wang, Z.J. Lipopolysaccharides can protect mesenchymal stem cells from oxidative stress-induced apoptosis and enhance proliferation of MSCs via Toll-like receptor(TLR)4 and PI3K/Akt/ Z.J. Wang, F.M. Zhang, L.S. Wang, Y.W. Yao, Q. Zhao, X. Gao // Cell Biol Int. – 2009. – V. 33. – № 6. – P. 665-674. 629. Weber, C. A. Toll-like receptor (TLR) 3 immune modulation by unformulated small interfering RNA or DNA and the role of CD14 (in TLR-mediated effects)/ C. Weber, C. Müller, A. Podszuweit, C. Montino, J. Vollmer, A. Forsbach // Immunology. – 2012. – V. 136. – № 1. – P. 64-77. 630. Weiss, L. Circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer/ L. Weiss, C. Hufnagl, R. Greil // N Engl J Med. – 2013. – V. 369. – P. 93. 631. Wells, A. The dormancy dilemma: quiescence versus balanced proliferation/ A. Wells, L. Griffith, J.Z. Wells, D.P. Taylor // Cancer Res. – 2013. – V. 73. – № 13. – P. 3811-3816. 447 632. Weyemi, U. The emerging role of ROS-generating NADPH oxidase NOX4 in DNAdamage responses/ U. Weyemi, C. Dupuy // Mutat Res. – 2012. – V. 751. – № 2. – P. 7781. 633. Widel, M. Bystander effect induced by UV radiation; why should we be interested?/ M. Widel // Postepy Hig Med Dosw. – 2012. – V. 14. – № 66. – P. 828-837. 634. Wieland, T. Analogs of phalloidin. D-Abu2-Lys7-phalloin, an F-actin binding analog, its rhodamine conjugate (RLP) a novel fluorescent F-actin-probe, and D-Ala2-Leu7phalloin, an inert peptide.Int/ T. Wieland, T. Miura, A. Seeliger // J Pept Protein Res. – 1983. – V. 21. – № 1. – P. 3-10. 635. Wlodkowic, D. Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances/ D. Wlodkowic, J. Skommer, Z. Darzynkiewicz // Exp Oncol. – 2012. – V. 34. – № 3. – P. 255-262. 636. Yan, L. An intronic miRNA regulates expression of the human endothelial nitric oxide synthase gene and proliferation of endothelial cells by a mechanism related to the transcription factor SP-1/ L. Yan, M. Kang, Z. Qin, W. Zhang, Y. Li, H. Ou // PLoS One. – 2013. – V. 8. – № 8. – P. 70658. 637. Wu, J. Cyclic GMP-AMP is an endogenous second messenger in innate immune signaling by cytosolic DNA/ J. Wu, L. Sun, X. Chen, F. Du, H. Shi, C. Chen et al. // Science. – 2013. – V. 339. – P. 826–830. 638. Wu, J. The role of BRCA1 in DNA damage response/ J. Wu, L.Y. Lu, X. Yu // Protein Cell. – 2010. – V. 1. – № 2. – P. 117-123. 639. Wu,J. New sensing mechanisms for design of fluorescent chemosensors emerging in recent years/ J. Wu, W. Liu, J. Ge, H. Zhang, P. Wang // Chem Soc Rev. – 2011. – V. 40. – № 7. P. 3483-3495. 640. Xiang, D. Lung cancer screening: from imaging to biomarker/ D. Xiang, B. Zhang, D. Doll, K. Shen, G. Kloecker, C. Freter // Biomark Res. – 2013. – V. 1. – № 1. – P. 4. 641. Xu, J. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis/ J. Xu, X. Zhang, R. Pelayo, M. Monestier, C.T. Ammollo, F. Semararo, F.B. Taylor, N.L. Esmon, F. Lupu, C.T. Esmon // Nature Med. – 2009. – V. 15. – P. 1318–1322. 642. Xue,X. Optimizing the yield and utility of circulating cell-free DNA from plasma and serum/ X. Xue, M.D. Teare, I. Holen, Y.M. Zhu, P.J. Woll // Clin Chim Acta. – 2009. – V. 404. – № 2. – P. 100-104. 643. Yamamoto, M. Current views of toll-like receptor signaling pathways/ M. Yamamoto, K. Takeda // Gastroenterol Res Pract. – 2010. – V. 2010. – P. 240365. 448 644. Yanai, H. HMGB proteins function as universal sentinels for nucleic-acid-mediated innate immune responses/ H. Yanai et al. // Nature. – 2009. – V. 462. – P. 99–103. 645. Yang, H. The many faces of HMGB1: molecular structure-functional activity in inflammation, apoptosis, and chemotaxis/ H. Yang, D.J. AntoineDJ, U. Andersson, K.J. Tracey // J. Leukoc Biol. – 2013. – V. 93. – № 6. – P. 865-873. 646. Yang, Y. Heat shock protein gp96 is a master chaperone for toll-like receptors and is important in the innate function of macrophages/ Y, Yang et al. // Immunity. – 2007. – V. 26. – P. 215–226. 647. Yang, Y. Roles of heat shock protein gp96 in the ER quality control: redundant or unique function?/ Y. Yang, Z. Li // Mol Cells. – 2005. – V. 20. – P. 173–182. 648. Yasuda, K. CpG-motif independent activation of TLR9 upon endosomal translocation of "natural" phosphodiester DNA/ K. Yasuda, M. Rutz, B. Schlatter et al. // Eur. J. Immunol. – 2006. – V. 36 – P. 431-436. 649. Yasuda, T. Clinical applications of DNase I, a genetic marker already used for forensic identification/ T. Yasuda, Y. Kawai, M. Ueki, K. Kishi // Leg Med. – 2005. – V. 7. – № 4. – P. 274-277. 650. Yasuda, K. Macrophage activation by a DNA/cationic liposome complex requires endosomal acidification and TLR9-dependent and -independent pathways/ K. Yasuda, Y. Ogawa, I. Yamane, M. Nishikawa, Y. Takakura // J Leukoc Biol. – 2005. – V. 77. – № 1. – P. 71-79. 651. Yasutomo, K. et al. Mutation of DNASE 1 in people with systemic lupus erythematosus/ K. Yasutomo, T. Horiuchi, S. Kagami, H. Tsukamoto, C. Hashimura, M. Urushihara et al. // Nat.Genet. – 2001. – V. 28. – P. 313-314. 652. Yen, M.Y. Increased 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in leukocyte DNA in Leber's hereditary optic neuropathy/ M.Y. Yen, S.H. Kao, A.G. Wang, Y. H. Wei // Invest Ophthalmol Vis Sci. – 2004. – V. 45. – № 6. – P. 1688-1691. 653. Yi, J.M. Novel methylation biomarker panel for the early detection of pancreatic cancer/ J.M. Yi, A.A. Guzzetta, V.J. Bailey, S.R. Downing, L. Van Neste, K.B. Chiappinelli, B.P. Keeley, A. Stark, A. Herrera, C. Wolfgang, E.P. Pappou, C.A. Iacobuzio-Donahue, M.G. Goggins, J.G. Herman, T,H. Wang, S.B. Baylin, N. Ahuja // Clin Cancer Res. – 2013. – V. 19. – № 23. – P. 6544-6555. 654. Yipp, B.G. NETosis: how vital is it?/ B.G. Yipp, P. Kubes // Blood. – 2013. – V. 122. – № 16. – P. 2784-2794. 449 655. Yu M. Circulating cell-free mitochondrial DNA as a novel cancer biomarker: opportunities and challenges/ M. Yu // Mitochondrial DNA. – 2012. – V. 23. – P. 329332. 656. Yu, S.C. Noninvasive prenatal molecular karyotyping from maternal plasma/ S.C. Yu, P. Jiang, K.W. Choy, K.C. Chan, H.S. Won, W.C. Leung, E.T. Lau, M.H. Tang, T.Y. Leung, Y.M. Lo, R.W. Chiu // PLoS One. – 2013. – V. 8. – № 4. – P. 60968. 657. Yu, X. The role of necroptosis, an alternative form of cell death, in cancer therapy/ X. Yu, Q. Deng, AS.M. Bode, Z. Dong, Y. Cao // Expert Rev Anticancer Ther. – 2013. – V. 13. - № 7. – P. 883-893. 658. Yuan, A. Transfer of microRNAs by embryonic stem cell microvesicles/ A. Yuan, E.L. Farber, A.L. Rapoport, D. Tejada, R. Deniskin, N.B. Akhmedov, D.B. Farber // PLoS One. – 2009. – V. 4. – P. 4722. 659. Yuan, H. A modified extraction method of circulating free DNA for epidermal growth factor receptor mutation analysis/ H. Yuan, Z.Z. Zhu, Y. Lu, F. Liu, W. Zhang, G. Huang, G. Zhu, B. Jiang // Yonsei Med J. – 2012. – V. 53. – № 1. – P. 132-137. 660. Yurdakul, S. Oxidative DNA damage is significantly correlated with flow-mediated dilation in patients with coronary artery disease/ S. Yurdakul, B. Ozben, A.K. Bilge, U.M. Turkoglu, S. Arkaya, Y. Nisanci // J Investig Med. – 2008. – V. 56. – № 7. – P. 925-930. 661. Zahner, N.L. Stimulatory type A CpG-DNA induces a Th2-like response in human endothelial cells/ N.L. Zahner, C. Habich, V./ Kolb-Bachofen // Int Immunopharmacol. – 2011. – V. 11. – № 11. – P. 1789-1795. 662. Zane, M. Circulating cell-free DNA, SLC5A8 and SLC26A4 hypermethylation, BRAF(V600E): A non-invasive tool panel for early detection of thyroid cancer/ M. Zane, M. Agostini, M.V. Enzo, E. Casal Ide, P. Del Bianco, F. Torresan, I. Merante Boschin, G. Pennelli, A. Saccani, D. Rubello, D. Nitti, M.R. Pelizzo. // Biomed Pharmacother. – 2013. – V. 67. – № 8. – P. 723-730. 663. Zeuner, R.A. Influence of stimulatory and suppressive DNAmotifs on host susceptibility to inflammatory arthritis/ R.A. Zeuner, D. Verthelyi, M. Gursel, K.J. Ishii, D.M. Klinman // Arthritis and Rheumatism. – 2003. – V. 48. – № 6. – P. 1701–1707. 664. Zhang, L. A new biodosimetric method: branched DNA-based quantitative detection of B1 DNA in mouse plasma/ L. Zhang, M. Zhang, S. Yang, Y. Cao, S. Bingrong Zhang, L. Yin, Y. Tian, Y. Ma, A. Zhang, P. Okunieff // Br J Radiol. – 2010. – V. 83. – P. 694-701. 450 665. Zhang, X. Activation of the Nrf2=antioxidant response pathway increases IL-8 expression/ X. Zhang, X. Chen, H. Song, H.Z. Chen, B.H. Rovin // Eur J Immunol. – 2005. – V. 35. – P. 3258–3267. 666. Zhang, Z. The helicase DDX41 senses intracellular DNA mediated by the adaptor STING in dendritic cells/ Z. Zhang, B. Yuan, M. Bao, N. Lu, T. Kim, Y.J. Liu // Nat. Immunol. – 2011. – V. 12. – P. 959–965. 667. Zheng, H. Therapeutic potential of Nrf2 activators in streptozotocin-induced diabetic nephropathy/ H. Zheng et al. //. Diabetes. – 2011.L – V. 60. – P. 3055. 668. Zhong, X.Y. Elevated level of cell-free plasma DNA is associated with breast cancer/ X.Y. Zhong, A. Ladewig, S, Schmid, E. Wight, S. Hahn S et al. // Arch Gynecol Obstet. – 2007. – V. 276. – P. 327-331. 669. Zhong, Z. Cyclin D1/cyclin-dependent kinase 4 interacts with filamin A and affects the migration and invasion potential of breast cancer cells/ Z. Zhong, W.S. Yeow, C. Zou et al. // Cancer Res. – 2010. – V. 70. – № 5. – P. 2105–2114. 670. Zhou, W. ERRbeta: a potent inhibitor of Nrf2 transcriptional activity/ W. Zhou, S.C. Lo, J.H. Liu, M. Hannink, D.B. Lubahn // Mol Cell Endocrinol. – 2007. – V. 278. – P. 52–62. 671. Zhu, H. Oxidation pathways for the intracellular probe 2_,7_-dichlorofluorescein/ H. Zhu, G.L. Bannenberg, P. Moldeus, H.G. Shertzer // Arch. Toxicol. – 1994. – V. 68. – P. 582-587. 672. Zmetakova, I. Evaluation of protein expression and DNA methylation profiles detected by pyrosequencing in invasive breast cancer/ I. Zmetakova, L. Danihel, B. Smolkova, M. Mego, V. Kajabov, T. Krivulcik, I. Rusnak, B. Rychly, D. Danis, V. Repiska, P. Blasko, M. Karaba, J. Benca, J. Pechan, I. Fridrichova // Neoplasma. – 2013. – V. 60. - № 6. – P. 635-646.
