Масштабирование производства биофармацевтических

GENETIKA
FROM FUNDAMENTAL RESEARCH
TO UNDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY
Р.А. Хамитов
ГНЦ РФ ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных
микроорганизмов
МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВА
БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ
СУБСТАНЦИЙ
ВИП: Важнейший инновационный проект
2007 – 2010
Тема: «Производство рекомбинантных белков для медицинского
применения на основе культур клеток животных и микроорганизмов с
использованием высокоэффективных технологических платформ».
Цель:
ликвидация технологического отставания отечественной фарминдустрии
и снижение зависимости от импорта лекарственных субстанций за счет
реализации цикла работ по созданию производства рекомбинантных
белков для медицинского применения на базе высокоэффективных
технологических платформ на основе культур клеток животных и
микроорганизмов, включая работы от создания перспективного
инновационного продукта, имеющего значительный потенциал для
коммерциализации, до освоения на его основе промышленного
производства новой и усовершенствованной высокотехнологичной
продукции и ее успешной реализации на рынке, обеспечивающей в
течение выполнения проекта 5-кратное превышение объемов продаж
созданной продукции относительно затраченных по проекту бюджетных
средств.
Инновационный внедренческий центр
на базе ГосНИИгенетики
В центре имеются следующие технологические участки:
•
блок для проведения генно-инженерных работ и конструирования
продуцентов;
•
лаборатория культивирования микроорганизмов;
•
лаборатория культивирования эукариотов;
•
участок биохимии для проведения очистки белковых препаратов, полученных
микробиологическим способом;
•
участок биохимии для проведения очистки белковых препаратов, полученных
с помощью эукариотов;
•
лаборатория переноса технологии;
•
помещение карантинного хранения;
•
испытательная аналитическая лаборатория;
•
собственная система водоподготовки
•
собственная замкнутая система вентиляции и кондиционирования воздуха.
•
специальные помещения для подготовки посуды и приготовления растворов,
питательных сред и т.д. (отдельно для микробиологического производства и для
производства с использование клеток млекопитающих);
Лаборатория культивирования микроорганизмов
Лаборатория культивирования эукариотов
Лаборатория переноса технологии
Испытательная аналитическая лаборатория
Центр прошел лицензирование и аккредитацию в системе качества.
Получена лицензия на осуществление деятельности, связанной с
использованием возбудителей инфекционных заболеваний.
Основные биофармацевтические продукты,
закупаемые по импорту, и потери бюджета от
отсутствия отечественных аналогов
ПРОДУКТЫ и
НОЗООЛОГИИ
(ОСНОВНЫЕ)
ДОЛЯ
ИМПОРТА
ПОТЕРИ ОТ
ОТСУТСТВИЯ
ОТЕЧЕСТВ. СРЕДСТВ
Эритропоэтин, ЭПО
(анемия)
>95%
1.0 МЛРД.РУБ / ГОД
Интерферон-альфа, ИНФальфа (гепатиты В и С,
онкология)
80
1.0 МЛРД.РУБ / ГОД
Стоимость годового курса ЭПО при лечении почечной недостаточности составляет
более 150 тыс рублей на одного пациента
Стоимость курса интерферона альфа при лечении вирусных гепатитов – более 250
тыс рублей на пациента, а при лечении онкологических заболеваний может
достигать 2 млн. руб.
Этапы создания лекарственных средств на основе
рекомбинантных белков
генно-инженерные работы создания генетических
конструкций;
получение клеток-продуцентов;
оптимизация условий культивирования, способствующих
максимальному выходу продукта без потери его качественных
характеристик;
подбор условий выделения и очистки целевого белка и их
оптимизация для снижения себестоимости продукта;
разработка методов контроля качества;
разработка и испытание готовой лекарственной формы;
.
масштабирование
производства.
Производство рекомбинантного
эритропоэтина человека
Эритропоэтин (ЭПО) – основной регулятор эритропоэза.
Первичная структура зрелого эритропоэтина
человека, имеющего три N-связанных углеводных
остатка (аминокислоты Asn-24, Asn-38 и Asn-83) и
одну О-связанную углеводную цепь (Ser-126).
Эпоэтин-бета отличается от эпоэтина-альфа:
1) более широким спектром и большей пропорцией менее кислых
изоформ;
2) большей пропорцией связывания с лектинами Erythrina cristagalli,
Lycopersicon esculentum, Phaseolis vulgaris и Agaricus bisporus;
3) большим содержанием изоформ с высоким соотношением
биоактивностей in vivo/in vitro.
Схемы производства эритропоэтина
Адгезионная культура клеток СНО
Приготовление
банков клеток
Культивирование
на флаконах
Роллерное
культивирование
Выделение
и очистка
Стерилизующая
фильтрация
И фасовка
Суспензионная и псевдосуспензионная культура клеток СНО
Приготовление
банков клеток
Культивирование
в колбах
Реакторное
культивирование
Выделение
и очистка
Стерилизующая
фильтрация
И фасовка
МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВА
РЕКОМБИНАНТНОГО ЭРИТРОПОЭТИНА
Адгезионная (прикрепленная) культура клеток СНО
Клетки прикрепляются к поверхности сосуда.
Культивируются в роллерных установках с
вращающимися бутылями.
P ~ Vbio ~ S ~ L2, Vmed ~ Vfl ~ L3
р = P/V ~ Vmed-1/3
P – продуктивность клеток
р – удельная продуктивность на единицу объема
Vfl – объем сосуда
Vbio - объем биомассы
Vmed - объем среды
S – площадь поверхности сосуда
L- линейные размеры сосуда
Увеличение объема сосуда приводит к
уменьшению удельной продуктивности на единицу
Возможности масштабирования адгезионной
культуры клеток CHO
1. Увеличение числа роллерных бутылей
Преимущества:
- низкая стоимость материалов
- неизменность производственного
регламента
Недостатки:
- высокая трудоемкость
- необходимость увеличения
производственной базы
2. Использование сосудов с увеличенной площадью поверхности
Роллерные бутыли с
гофрированной поверхностью (в 2 раза)
Многоэтажные флаконы
(до 50 “этажей”)
Преимущества:
- меньшие затраты на оборудование
Недостатки:
- необходимость изменения
производственного регламента
Замечание:
- высокая стоимость материалов,
которая часто окупается за счет
большей продуктивности
Перевод клеток в суспензионную форму
позволяет культивировать клетки не на поверхности, а в объеме среды
1. “Псевдосуспензия” с использованием микроносителей (клетки растут на
поверхности или в порах микрочастиц)
Преимущества:
- использование обычных адгезионных
клеточных линий
Недостатки:
- сравнительно низкая плотность
- высокая себестоимость частиц
2. “Истинная” суспензионная культура
Преимущества:
- сверхвысокая клеточная плотность
(более 107 клеток/мл)
- использование бессывороточных сред
Недостатки:
- необходимость создания и
характеризации специальных клеточных
линий
Культивирование суспензионных клеток СНО
Многоразовые биореакторы
Одноразовые системы культивирования
К преимуществам одноразовых ферментеров относятся:

сокращение времени подготовку ферментера к работе за счет исключения
процессов мойки и стерилизации и связанным с ними контрольных операций;

технологичность процессов масштабирования и переноса технологий;

упрощение процессов ферментации и снижение практически до нуля рисков
контаминации;

удешевление процессов внедрения технологий;

повышение коэффициента загрузки оборудования за счет сокращения времени на
его подготовку;

упрощение системы валидации оборудования и технологии;

снижение требований к квалификации персонала.
ПРОДУКЦИЯ КЛЕТКАМИ ЭПО ПРИ РАЗНЫХ
УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Клетки СНО, продуцирующие эритропоэтин,
культивировали в следующих условиях:
1 роллерные бутыли, адгезионная культура
2 суспензионная культура, сывороточная среда
3 суспензионная культура, бессывороточная среда
4 После чего собирали культуральную жидкость (КЖ)
с помощью центрифугирования и/или фильтрации.
Изоэлектрическое
фокусирование
образцов КЖ
В качестве образца сравнения использовали:
4 стандарт BRP Европейской фармакопеи
Концентрация ЭПО в
образцах КЖ по данным ИФА
Вестерн-блот образцов КЖ
Образцы
3
2
1
4
Концентрация
ЭПО, мг/л
1
13-27
2
35-46
3
22-34
Исх. линия
10-15
1
2
3
4
Производство рекомбинантного безметионинового
интерферона альфа – 2b человека
Интерферон альфа-2b - рекомбинантный белок с молекулярной массой 19 300
дальтон. Получен из клона E.coli путем гибридизации плазмиды бактерий с
геном человеческих лейкоцитов, кодирующим синтез интерферона. В отличие
от интерферона альфа-2a имеет аргинин в положении 23.
Схема производства
Приготовление
банков клеток
Культивирование
в колбах
Культивирование
в биореакторе
дезинтеграция и
Первичная очистка
Выделение
и очистка
Стерилизующая
фильтрация
И фасовка
Разработка продуцента безметионинового интерферона
альфа-2b
Система SUMO (Small Ubiquitin-related protein Modifier) состоит из гибридного
белка, включающего в свой состав одноименный белок-помощник, а также
SUMO-специфичной протеиназы Ulp1, используемой для процессинга
гибридного белка и выщепления из его состава целевой части.
Достоинства:
1) Ulp1 способна эффективно гидролизовать
пептидную
связь,
соединяющую
консервативный С-концевой дипептид ГлиГли зрелого SUMO с любым последующим
аминокислотным остатком (кроме пролина);
2) способна
эффективно
гидролизовать
изопептидную
связь
соединяющую
консервативный С-концевой дипептид ГлиГли зрелого SUMO с -аминогруппой остатка
лизина в целевом белке;
3) Ulp1
является
одной
из
самых
«технологичных» протеиназ.
Стадии дезинтеграции и первичной очистки
 Дезинтеграцию проводят в проточном дезинтеграторе при
высоком давлении.
 Удаление растворимых клеточных компонентов производят
промыванием
нерастворимой
формы
интерферона
буферными растворами, содержащими денатурирующие
агенты и детергенты (Тритон Х100, мочевина и т.д.).
 Полученный осадок, содержащий интерферон, растворяют в
буферном растворе,
гидрохлорид.
содержащим
6
М
гуанидин
Схема процесса 4-х стадийной
хроматографической очистки
Обращеннофазная
хроматография
(RPC)
Катионообменная
хроматография
(КМ1)
Катионообменная
хроматография
(КМ2)
Гель-фильтрация
(SE)
KM1
RPC
KM2
SE
Цель
Захват белка,
концентрирование
Основная очистка
Концентрирование
Очистка от
димеров ИФН,
перевод в буфер
ГЛФ
Оборудование
Радиальные колонки
Proxys с сорбентом
CM-Sepharose FF
Аксиальные
колонки высокого
давления Vydac
C18
Радиальные колонки
Proxys с сорбентом
CM-Sepharose FF
Аксиальные
колонки с
сорбентом
Superdex 75
Масштабирование стадии
хроматографической очистки
Рисунок 2. Слева - схема потока и эффект
концентрирования в радиальной хроматографии;
Справа - пристеночные эффекты и схема потока в
аксиальной хроматографии.
Преимущества:
Рисунок 1. Схема
радиальной колонки.
А - упаковочные входы.
воспроизводимость;
экономичность;
высокая производительность;
дополнительное концентрирование элюата;
высокая масштабируемость
Характеристики этапов очистки
безметионинового интерферона альфа-2b
Стадии
Выход со стадии
Чистота интерферона
Подготовительные этапы
Отмывка 1
20±2%
Отмывка 2
90±2%
Отмывка 3
85±5%
Растворение
98±1%
Ренатурация и
ферментолиз
6,5±0,5%
50±5%
Очистка
Ионообменная
хроматография КМ1
85±5%
> 70%
Обращенно-фазная
хроматография
75±5%
> 95%
Ионообменная
хроматография КМ2
Гель-фильтрация
97±2%
> 95%
97±2%
> 95%
ВЫВОДЫ:
1. Производство субстанции эритропоэтина
было увеличено в 5 раз;
2. Производство субстанции интерферона
альфа-2b было увеличено в 2,5 раза.
Меняйте мир вместе с нами
www.genetika.ru