Университет Валенсии, кафедра по фундаментальным
advertisement
Слайд 1 Исследования по бесплодию 8. Соматические стволовые клетки из эндометрия, миометрия и яичек Irene Cervello, д.м.н. Университет Валенсии, кафедра по фундаментальным исследованиям в репродукции человека, Испания Предлагаем Вашему вниманию главу …. Эта глава называется «Соматические стволовые клетки из эндометрия, миометрия и яичек» Автор — д.м.н. Irene Cervello Слайд 2 Цели обучения • • • Приобрести новые представления о биологии и происхождении стволовых клеток и о таких понятиях, как пролиферация, самообновление и ниша стволовых клеток. Больше узнать о гипотезе существования соматических стволовых клеток (ССК) в матки и яичках человека. Подробно рассказать о последних научно-исследовательских работах по выявлению предполагаемых ССК в органах репродуктивной системы. Оценить, насколько ССК могут участвовать в регенерации клеток репродуктивных тканей и органов, возможность клинического применения этих свойств. Получить общие представления о месте ССК в области исследований по бесплодию. В этой главе поставлены следующие цели обучения: • Приобрести новые представления о биологии и происхождении стволовых клеток и о таких понятиях, как пролиферация, самообновление и ниша стволовых клеток. • Больше узнать о гипотезе существования соматических стволовых клеток (ССК) в матки и яичках человека. • Подробно рассказать о последних научно-исследовательских работах по выявлению предполагаемых ССК в органах репродуктивной системы •Оценить, насколько ССК могут участвовать в регенерации клеток репродуктивных тканей и органов, и возможность клинического применения этих свойств. • Получить общее представление о месте ССК в области исследований по бесплодию. Слайд 3 Введение endometrium Эндометрий myometrium Миометрий Endometrium suffers approx. 4000 cycle of Эндометрий проходит около 400 growth…. циклов роста в течение репродуктивной жизни женщины Myometrium exhibits a 20 fold Миометрий в течение беременности expansion…. может растягиваться в 20 раз Seminiferous tubules Семенные канальцы Cross section…. testis Поперечный канальцев Яичко срез семенных Organ capable of generating germ cells Орган, способный генерировать during the life половые клетки в течение жизни Соматические стволовые клетки (ССК) являются одной из самых увлекательных областей современной биологии и регенеративной медицины. Появляется все больше и больше доказательств наличия ССК в различных тканях и органах (в костном мозге, коже, печени). В настоящей главе мы попытаемся сделать краткий обзор исследований и новых достижений, касающихся ССК в репродукции человека. Матка, полый мышечный орган, главной функцией которого является имплантация бластоцисты и развитие плода до рождения. Она состоит из тканей с высокой пролиферативной способностью: • из эндометрия, который в течение репродуктивной жизни женщины проходит около 400 циклов роста, регенерации и отторжения, и • из миометрия, который в течение беременности может растягиваться в 20 раз. Следовательно, легко предположить или выдвинуть гипотезу, что повышение степени пролиферации или регенерации тканей может быть связано с наличием ССК. Кроме того, яички с точки зрения биологии развития организма и репродукции также характеризуются высокой способностью генерировать половые клетки в течение жизни. Тестикулярные ССК или герминальные/сперматогониальные стволовые клетки имеют крайне важное значение не только для получения новых герминальных стволовых клеток, но и для дальнейшей дифференцировки (в сперматогенные клетки и, в конечном итоге, в сперматозоиды). В данном контексте этот орган имеет все шансы содержать ССК. Слайд 4 Стволовые клетки Stem cells Стволовые клетки Somatic stem cells Non-specialized…. Соматические стволовые клетки неспециализированные клетки, способные к делению и дифференцировке в более зрелые клетки со специализированными функциями недифференцированные клетки, находящиеся в дифференцированных тканях взрослого организма, способные самообновляться и дифференцироваться во все специализированные типы клеток тканей, из которых они возникли Undifferentiated…. Познакомимся с понятием стволовых клеток: Стволовые клетки это неспециализированные клетки, способные к делению и дифференцировке в более зрелые клетки со специализированными функциями. В настоящее время существуют различные типы стволовых клеток: •эмбриональные стволовые клетки, которые получают из внутренней клеточной массы бластоцисты, •эмбриональные стволовые клетки, которые получаются из половых гребней, и •соматические стволовые клетки. Стволовые клетки это недифференцированные клетки, находящиеся в дифференцированных тканях взрослого организма, способные самообновляться и дифференцироваться во все специализированные типы клеток тканей, из которых они возникли. Слайд 5 Соматические стволовые клетки (ССК) Biology of stem cells Биология стволовых клеток Stem cells Стволовые клетки Precursor cells Клетки-предшественники High proliferative potential Высокий пролиферативный потенциал Различный тип клеток Cпособность к самообновлению Дифференцировка Various cell types Ability to self-renewal Differentiation SSC….. ССК были выявлены в головном мозге, в костном мозге, периферической крови, кровеносных сосудах, скелетной мускулатуре, коже, зубах, сердце, кишечнике, печени, в эпителии яичников и яичек. Они занимают определенную территорию (так называемая «ниша» стволовых клеток) Биология стволовых клеток. Стволовые клетки имеют три основные характеристики. • Во-первых, это способность к самообновлению, стволовые клетки могут дать начало двум типам дочерних клеток, одни из которых имеют недифференцированный фенотип, а другие имеют предопределенный путь созревания. • Второй особенностью является возможность дифференцировки с ростом различных типов клеток. •Все это сопровождается высоким пролиферативным потенциалом, который представляет собой третью характеристику. Взрослые стволовые клетки были выявлены во многих органах и тканях, включая головной мозг, костный мозг, периферическую кровь, кровеносные сосуды, скелетную мускулатуру, кожу, зубы, сердце, кишечник, печень, эпителий яичников и яичек. Считается, что в каждой ткани они занимают определенную территорию, которая называется «ниша» стволовых клеток. . Слайд 6 Ниши соматических стволовых клеток (ССК) Biology of stem cells Биология стволовых клеток Differentiated cells Клетки-предшественники The only stage where slow division occurs Единственная стадия, во время которой происходит медленное деление клеток Стадия, во время которой до дифференцировки клетки могут делиться несколько раз Популяция транзитных амплифицирующихся клеток Они потеряли способность к делению и стали дифференцированными СК (стволовые клетки) Stage in which…. Transit amplifying cells population They have lost….. SС ТА DС Stem cells nichе… ТА (транзитные амплифицирующиеся клетки) ДК (дифференцированные клетки) Ниша стволовых клеток: «представляет собой основную единицу тканевой физиологии, которая интегрирует все сигналы и опосредует сбалансированный ответ стволовых клеток на нужды организма. Взаимодействие между стволовых клетками и их нишами создает динамическую систему, необходимую для поддержания тканей» Scadden Nature 441(7097), 1075-1079 (29 June 2006) ССК имеют иерархическое распределение в тканях и органах взрослого человека. В нише стволовых клеток - отдельной области, где располагаются стволовые клетки, происходит медленное деление клеток. После первого деления существует вторая стадия, во время которой вплоть до дифференцировки клетки могут делиться несколько раз, это транзитные амплифицирующиеся клетки. Они могут делиться лишь ограниченное число раз. Наконец, дифференцированные клетки теряют способность к делению. Функция ниши стволовых клеток играет важную роль в биологии и развитии ССК. Scadden описал это понятие следующим образом: «Ниша представляет собой основную единицу тканевой физиологии, которая интегрирует все сигналы и опосредует сбалансированный ответ стволовых клеток на нужды организма. Взаимодействие между стволовых клетками и их нишами создает динамическую систему, необходимую для поддержания тканей» Список литературы: The stem-cell niche as an entity of action. Scadden D,T. Nature 441(2006), pp.1075-1079. Слайд 7 Соматические стволовые клетки из эндометрия Uterus Endometrium Myometrium Perimetrium Round ligament Fallopian tube Ovary Cervix Vagina Proliferative Secretory Luminal epithelium Glandular epithelium Myometrium Functional layer Basal layer Could be part of…… Матка Эндометрий Миометрий Периметрий Круглая связка матки Маточная труба Яичник Шейка матки Влагалище Пролиферативный Секреторный Просветный эпителий Железистый эпителий Миометрий Функциональный слой Базальный слой Может ли ниша стволовых клеток эндометрия человека быть частью базального слоя? Как мы уже отмечали, эндометрий является одной из наиболее регенерирующих тканей организма. Ткань эндометрия состоит из просветного эпителия и желез, выстланных эпителием, окруженных поддерживающей стромой, как это представлено на рисунке, где изображено гистологическое строение эндометрия. Кроме того, эндометрий можно разделить на функциональный (отторгающийся) слой и базальный (регенеративный) слой. В течение каждого менструального цикла ткань эндометрия отторгается и заменяется новым регенерированным слоем. Только функциональный слой отторгается во время менструации, а базальный слой остается интактным, что позволяет предположить, что новый функциональный слой образуется из базального. Может ли ниша стволовых клеток эндометрия человека быть частью базального слоя? Слайд 8 ДНК-меченные клетки в мышином эндометрии Внутрибрюшинное введение бромдезоксиуридина и вскрытие в различные сроки Бромдезоксиуридин является аналогом тимидина, который встраивается в геномную ДНК в фазу репликации митотического деления, маркируя таким образом новые клетки: ДНК-меченные клетки AGE Возраст Sacrifice Вскрытие ДНК-меченные клетки в мышином эндометрии: Для того, чтобы выявить наличие предполагаемых стволовых соматических клеток в матке мышей, эиспользовали метод окрашивания ДНК клеток. Ранее этот метод использовали для обнаружения ССК в коже млекопитающих. Мышам внутрибрюшинно вводили бромдезоксиуридин с концентрацией 50 мкг/ г веса и вскрывали на 7-й день (положительный контроль), на 14-й и 21-й день (прекращение грудного вскармливания), на 35-й день (половая зрелость), на 49-й день (взрослый возраст) и на 64-й, 77-й, 83-й, 90-й, 98-й, 106-й и 112-й день жизни. Бромдезоксиуридин является синтетическим аналогом тимидина, который встраивается в геномную ДНК в фазу репликации митотического деления, маркируя таким образом новые клетки. После маркировки с каждым делением бромдезоксиуридиновый сигнал постепенно ослабевает. Сохранение маркировки в подгруппах клеток означает отсутствие деления или очень низкий уровень деления, что является одной из основных характеристик соматических стволовых клеток. Список литературы: Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis. Taylor G, Lehrer MS, Jensen PJ, Sun TT, Lavker RM. Cell 18;102(4). (2000) ,pp 451-61. Слайд 9 ДНК-меченные клетки в мышином эндометрии Число ДНК-меченных клеток снижалось как в эпителии, так и в строме на протяжении всей жизни мышей Через 3-4 недели ДНК-меченные клетки исчезали из эпителия ДНК-меченные клетки содержали маркеры недифференцированных клеток Epithelial cells Эпителиальные клетки Stromal cells Стромальные клетки Blrdu labeled cell (%) Клетки, меченные бромдезоксиуридином (%) Chase period (weeks) Период наблюдения (недели) LE: Luminal epithelium ПЭ: Просветный эпителий GE:Glandular epithelium ЖЭ: Железистый эпителий Day 7 7-й день Day 21 21-й день В двух независимых исследованиях было описано присутствие ДНК-меченных клеток в мышином эндометрии. Такие клетки имели окрашенные в зеленый цвет ядра в эндометрии мыши через 7 дней, что подтверждало правильное введение бромдезоксиуридина (положительный контроль). Как вы можете видеть на верхнем графике и в нижней части слайда, число ДНК-меченных клеток (зеленые клетки на картинке) снижалось на протяжении всей жизни мышей как в эпителии, так и в строме, Примерно через 3-4 недели ДНК-меченные клетки исчезали из эпителия, а в строме во взрослом возрасте (старше 49 суток) присутствовало несколько меченныхх клеток. Они локализовались в нижней части стромы. Кроме того, как показали Cervelló и соавт. в 2007 году, ДНК-меченные клетки в мышином миометрии имеют черты ССК. Эти клетки располагались там же, где и характерные маркеры недифференцированных клеток, такие как с-Kit (гемопоэтический маркер стволовых клеток) и Oct-4 (маркер эмбриональных стволовых клеток). Так было продемонстрировано существование в эндометрии мышей ДНК-меченных клеток с характеристиками ССК. Это недифференцированная подгруппа клеток характеризуется накоплением бромдезоксиуридина и располагается там же, где и типичные маркеры стволовых клеток - с-Kit и Oct-4. Список литературы: Identification of label-retaining cells in mouse endometrium. Chan RW, Gargett CE. Stem Cells 24(6). (2006), pp 1529-38 Identification, characterization and co-localization of label-retaining cell population in mouse endometrium with typical undifferentiated markers. Cervelló I, Martínez-Conejero JA, Horcajadas JA, Pellicer A, Simón C. Hum Reprod. 22(1). (2007),pp 45-5. Слайд 10 Возможные маркеры стволовых клеток в эндометрии человека Маркеры стволовых клеток Локализация в эндометрии Ссылка Эмбриональные стволовые клетки Культвированные мезенхимальные стволовые клетки Endothelial cell: perivascular cell and Эндотелиальные клетки: mesenchymal stem cell периваскулярные клетки и мезенхимальные стволовые клетки Haematopoetic stem cell Гемопоэтические стволовые клетки In humans, it colocalise….. У человека, локализуется рядом с виментином и цитокератином. У мышей локализуется рядом с клетками, меченными бромдезоксиуридином In humans, it differentiates… У человека, по-разному экспрессируется в базальной и функциональной строме In humans, it co-expresses… У человека, экспрессируется вместе с PDGF-Rβ In humans, mainly in stroma. In murine… У человека, главным образом, в Stem cell markers Endometrial localization Reference Embryonic stem cell Cultured mesenchymal stem cell In humans, mainly in stroma. Co-localization... строме. У мышей локализуется рядом с клетками, меченными бромдезоксиуридином У человека, главным образом, в строме Локализация рядом с клетками, меченными бромдезоксиуридином в эндометрии беременных мышей До сих не описаны конкретные маркеры стволовых клеток в человеческом эндометрии. Чтобы решить эту проблему, в различных исследованиях использовали сочетание разных маркеров, как представлено в таблице. Чтобы охарактеризовать ССК в эндометрии человека, были исследованы многие из классических маркеров стволовых клеток. Важно определить маркеры как эпителиальных, так и стромальных эндометриальных стволовых клеток. Список литературы: Cervelló I, Gil-Sanchis C, Mas A and Simón C. Current understanding of endometrial stem cells. Expert Review of Obstetric and Gynecology. Vol.4 (2009) , pp. 273-282. Слайд 11 Возможные маркеры стволовых клеток в эндометрии человека Изоляция в мезенхимальноподобных клеток из стромы эндометрия человека с использованием периваскулярных клеточных маркеров CD146 и PDGF-Rβ Высокая эффективность клонирования изолированных клеток по сравнению с общей популяцией стромальных клеток Способность этих клеток дифференцироваться к мезенхимальную ткань в условиях in vitro (адипогенную, остеогенную, миогенную и хондрогенную) Мезенхимальный клеточный фенотип отвечает за его циклический рост и может в перспективе использоваться для тканевой инжинерии Schwab и Gargett, 2007 Stromal endometrial tissue Differentiation Cloning Culture Phenotype Стромальная эндометриальная ткань Дифференцировка Клонирование Культивирование Фенотип В 2007 году Schwab и Gargett предложили два периваскулярных маркера в качестве возможных маркеров стромальных стволовых клеток эндометрия. Они изолировали из стромы эндометрия клетки, содержащие CD146 и PDGF-Rβ, и показали высокую эффективность их клонирования по сравнению с общей популяцией стромальных клеток, что указывает на высокий пролиферативный потенциал выбранных клеток. Кроме того, эти изолированные клетки культивировали для подтверждения их способности к дифференцировке в мезенхимальные клетки в условиях in vitro. Изолированные клетки с периваскулярными маркерами были способны дифференцироваться по адипогенной, остеогенной, миогенной и хондрогенной линии. Основным результатом данного исследования было выявление двух периваскулярных маркеров, CD146 и PDGF-Rβ, что позволило проспективно выделить из ткани эндометрия человека клетки, подобные мезенхимальным стволовым клеткам. Список литературы: Co-expression of two perivascular cell markers isolates mesenchymal stem-like cells from human endometrium. Schwab KE, Gargett CE. Hum Reprod. 22(11). (2007), pp 2903-11. Слайд 12 «Сторонняя» популяция и эндометриальные соматические стволовые клетки «Сторонняя» популяция: метод Хёхста и сортировки клеток (FACS: флуоресцентный активатор сортировки клеток) + Hoechst Краситель Хёхст + Hoechst Verapamil Краситель Хёхст и верапамил Undifferentiated cells enriched in ABC Недифференцированные клетки, transporters can exclude Hoechst dye обогащенные транспортными белками семейства ABC, могут выделять краситель Хёхст All the cells…. Все клетки окрашены В связи с отсутствием специфических маркеров (см. предыдущие слайды) другие исследователи попытались использовать универсальный инструмент для определения ССК в ткани эндометрия. Goodell и колл. в 1996 году для выявления гемопоэтических стволовых клеток описали метод Хёхста (по названию красителя) с выделением «сторонней» популяции. Сторонняя популяция клеток эндометрия может быть выделена с использованием флуоресцентного активатора сортировки клеток (FACS), проточной цитометрии и сортировки клеток. Метод основан на способности предполагаемых ССК к ускоренному выбросу красителя Хёхст. Как вы можете видеть на верхней части слайда, клетки инкубировали с красителем Хёхст в течение 90 минут, а затем были проанализированы методом FACS. Предполагаемые недифференцированные клетки, обогащенные транспортными белками семейства ABC, могут выделять краситель. В этом случае посредством соответствующего программного обеспечения мы можем различить клетки, способные к выбросу красителя («сторонняя» популяция) и клетки, сохраняющие краситель («несторонняя» популяция). При блокаде АBC-транспортеров (нижний рисунок) все клетки сохранили краситель, в этом случае мы не наблюдаем «стороннюю» популяцию. Список литературы: Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Goodell MA, Brose K, Paradis G, Conner AS, Mulligan RC. J Exp Med. 1;183(4). (1996), pp 1797-806. Слайд 13 Сторонняя популяция и эндометриальные соматические стволовые клетки Epithelial cells Stromal cells SP NSP FACS and SP Cell culture Hoechst Hoechst +VP Эпителиальные клетки Стромальные клетки Сторонняя популяция Несторонняя популяция FACS и сторонняя популяция Культивирование клеток Краситель Хёхст Краситель Хёхст + верапамил Первое исследование, описывающее присутствие клеток «сторонней» популяции в эндометрии человека после культивирования in vitro Клетки «сторонней» популяции, изолированные из железистой фракции, могут дать рост желез и стромы через 5 месяцев культивирования Полученные результаты показали, что клетки «сторонней» популяции, выделенные из эндометрия человека, обладают способностью к самообновлению и дифференцировке в один тип клеток (железистые/стромальные клетки). Като и соавт., 2007 Като и соавт. в 2007 году опубликовали первое исследование, описывающее присутствие клеток «сторонней» популяции в эндометрии человека после культивирования in vitro. Клетки «сторонней» популяции, изолированные по методу, описанному в предыдущем слайде, были получены как из железистой/эпителиальной фракции, так и из стромальной фракции. Через 5 месяцев культивирования эти клетки «сторонней» популяции смогли дать рост желез и стромы, соответственно. Полученные результаты показали, что клетки «сторонней» популяции, выделенные из эндометрия человека, обладают способностью к самообновлению и дифференцировке в один тип клеток. Список литературы: Characterization of side-population cells in human normal endometrium. Kato K, Yoshimoto M, Kato K, Adachi S, Yamayoshi A, Arima T, Asanoma K, Kyo S, Nakahata T, Wake N. Hum Reprod. 22(5). (2007), pp 1214-23. Слайд 14 Соматические стволовые клетки из миометрия Hoechst Pyronin Y myoSP myoMP reserpine Хёхст Пиронин Y миометральные популяции Миометральные популяции резерпин клетки клетки «сторонней» основной Кандидаты на соматические стволовые клетки миометрия были выявлены на основе фенотипа «сторонней» популяции, которая способна выделять краситель Хёхст через АТФ-связывающий кассетный транспортер G2 (ABCG2). Изоляция и описание характера миоматральных клеток «сторонней» популяции: предполагаемые миометральные стволовые клетки Экспрессия ABCG2 в клетках «сторонней» популяции 98% миометральных клеток «сторонней» популяции и лишь 20% миометральных клеток основной популяции находились в фазе G0, что может быть следствием статической природы тканевых стволовых клеток Соматические стволовые клетки из миометрия: Миометрий обладает способностью растягиваться во время беременности в 20 раз. Гладко-мышечная мускулатура матки ремодулируется, а происхождение новых гладкомышечных клеток остается неясным. Настоящее исследование описывает подгруппу клеток миометрия, изолированных с помощью метода Хёхст из миометрия небеременных женщин, которые представляю собой популяцию стволовых клеток. В этом исследовании кандидаты на соматические стволовые клетки миометрия были выявлены на основе фенотипа «сторонней» популяции, которая способна к выбросу красителя Хёхст через АТФ-связывающий кассетный транспортер G2. Изолированные клетки «сторонней популяции» экспрессировали белок ABCG2 (верхний рисунок). Проточная цитометрия с последующим окрашиванием пиронином Y и красителем Хёхст 33342 показали, что ≈ 98% миометральных клеток «сторонней» популяции и лишь 20% миометральных клеток основной популяции находились в фазе G0 (нижний рисунок), что может быть следствием статической природы тканевых стволовых клеток. Список литературы: Side population in human uterine myometrium displays phenotypic and functional characteristics of myometrial stem cells. Ono M, Maruyama T, Masuda H, Kajitani T, Nagashima T, Arase T, Ito M, Ohta K, Uchida H, Asada H, Yoshimura Y, Okano H, Matsuzaki Y. Proc Natl Acad Sci 104 (2007), pp. 18700-18705. Слайд 15 Соматические стволовые клетки из миометрия myoSP myoMP Day 0 Day 21 миометральные клетки «сторонней» популяции Миометральные клетки основной популяции Начало культивирования На 21-й день культивирования Влияние концентрации кислорода на пролиферацию основной и «сторонней» популяции клеток миометрия Через 21 день культивирования в условиях гипоксии была индуцирована экспрессия αSMA (гладко-мышечного маркера), предполагая наличие у «сторонней» популяции миометральных клеток потенциала к спонтанной дифференцировке в зрелые клетки миометрия. Ono и соавт., 2007 Для дальнейшей характеристики клеток «сторонней» популяции миометрия авторы культивировали и размножили их в пробирке, используя различные условия культивирования, одним из которых является низкая концентрация кислорода (гипоксия). Гипоксия, как известно, оказывают стимулирующий эффект на некоторые виды стволовых клеток. Кроме того, авторы исследовали влияние концентрации кислорода на пролиферацию основной и «сторонней» популяции клеток миометрия. Эффективной пролиферации «сторонней» популяции в нормоксических условиях (20% O2) не наблюдалось (верхний рисунок), зато при 2% напряжении кислорода клетки хорошо размножались in vitro. Хотя сразу после изоляции «сторонняя» популяция миометральных клеток не экспрессировала гладко-мышечные маркеры, такие как αSMA, экспрессия этих маркеров начиналась через 21 день культивирования в условиях гипоксии (нижний рисунок), предполагая наличие у «сторонней» популяции миометральных клеток потенциала к спонтанной дифференцировке в зрелые клетки миометрия. Список литературы: Side population in human uterine myometrium displays phenotypic and functional characteristics of myometrial stem cells. Ono M, Maruyama T, Masuda H, Kajitani T, Nagashima T, Arase T, Ito M, Ohta K, Uchida H, Asada H, Yoshimura Y, Okano H, Matsuzaki Y. Proc Natl Acad Sci 104 (2007), pp. 18700-18705. Слайд 16 Соматические стволовые клетки из миометрия Ovariectomized E2 pellet sc 100 000 cells myoSP 100 000 cells myoMP myoSP myoMP Удаление яичников Гранулы с эстрадиолом подкожно 100 000 клеток «сторонней» популяции 100 000 клеток основной популяции миометральные клетки «сторонней» популяции Миометральные клетки основной популяции Дифференцировка in vitro и in vivo Воссоздание миометрия in vivo ↓ Миометральные клетки «сторонней» популяции дали рост человеческим клеткам у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (13 из 16), но они не были выявлены при введении миометральных клеток основной популяции (3 из 16) Дифференцировка по множественным линиям ↓ Результаты показали, что судя по морфологии и окраске типичными маркерами, у клеток «сторонней» популяции наблюдается дифференцировка в адипоциты и остеоциты, а у клеток основной популяции – нет. Ono и соавт., 2007 Мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом и удаленными яичниками подкожно имплантировали гранулы с эстрадиолом (верхний рисунок). Затем в маточные рога ввели миометральные клетки «сторонней» популяции (1 × 105 клеток на рог). Матку удалили через 10 недель после ксенотрансплантации и подвергли иммунофлуоресцентному окрашиванию и конфокальной микроскопии. У мышей, которым трансплантировали клетки «сторонней» популяции, были обнаружены клетки человеческого происхождения, а у мышей, которым трансплантировали клетки основной популяции, они обнаружены не были. Также был изучен потенциал «сторонней» популяции миометральных клеток к дифференцировке по множественным линиям в условиях in vitro. Результаты показали, что судя по морфологии и окраске типичными маркерами, у клеток «сторонней» популяции наблюдается дифференцировка в адипоциты и остеоциты, а у клеток основной популяции – нет. Список литературы: Side population in human uterine myometrium displays phenotypic and functional characteristics of myometrial stem cells. Ono M, Maruyama T, Masuda H, Kajitani T, Nagashima T, Arase T, Ito M, Ohta K, Uchida H, Asada H, Yoshimura Y, Okano H, Matsuzaki Y. Proc Natl Acad Sci 104 (2007), pp. 18700-18705. Слайд 17 Соматические стволовые клетки из яичек Герминальные стволовые клетки из яичек мышей плюрипотентны и у них есть такой же потенциал к дифференцировке, как и у эмбриональных стволовых клеток. Предполагаемые сперматогониальные стволовые клетки были выделены (с экспрессией специфического сперматогониального маркера stra8) и культивированы в условиях in vitro При культивировании формировали эпибластоподобные колонии ССК экспрессировали типичные факторы транскрипции, характерные для недифференцированных стволовых клеток, такие как Oct3 / 4, Nanog, utf1 и rex Guan и соавт., 2006 Соматические стволовые клетки из яичек: Яички характеризуются высокой способностью генерировать половые клетки в течение жизни. ССК яичка или герминальные/сперматогониальные стволовые клетки имеют важное значение не только для создания новых зародышей стволовых клеток, но и для дифференцировки (в клетки сперматогенеза и, в конечном итоге, в сперматозоиды). Guan и соавт. описали, что герминальные стволовые клетки из яичек мышей плюрипотентны и у них есть такой же потенциал к дифференцировке, как и у эмбриональных стволовых клеток. Предполагаемые сперматогониальные стволовые клетки были выделены (с экспрессией специфического сперматогониального маркера stra -8) и культивированы in vitro в разнообразных условиях. После этого авторы обнаружили, что предполагаемые ССК образовывали эпибластоподобные колонии, похожие на эмбриональные стволовые клетки. Кроме того, ССК экспрессировали типичные факторы транскрипции, характерные для недифференцированных стволовых клеток, такие как Oct3 / 4, Nanog, utf1 и rex. Список литературы: Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis. Guan K, Nayernia K, Maier LS, Wagner S, Dressel R, Lee JH, Nolte J, Wolf F, Li M, Engel W, Hasenfuss G. Nature 440, (2006). pp. 1199-1203 Слайд 18 Соматические стволовые клетки из яичек Получение клеток сердечной мышцы и следы вентрикулярной активности в кардиомиоците, выделенном из ССК Нейрональная дифференцировка ССК и наличие дофаминергических нейронов Образование тератом из ССК. Опухоли содержат зачатки всех трех зародышевых листков (кишечная дифференцировка, рис.А, поперечнополосатые мышцы и хрящи, рис. B, нервная ткань, рис. С). В условиях In vitro изолированные ССК способны дифференцироваться в клетки мезодермальной линии. ССК смогли дать рост клеткам сердца и, кроме того, один кардиомиоцит с помощью электрофизиологических методов продемонстрировал спонтанный потенциал действия (верхний рисунок). С помощью экспрессии типичных нейроэпителиальных маркеров была подтверждена способность к дифференцировке в нейроэктодерму. ССК могут дифференцироваться в дофаминергические нейроны, как вы можете видеть на центральном рисунке. В условиях in vivo изолированные ССК показали возможность развиваться в тератомы после введения мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом. Опухоли содержат зачатки всех трех зародышевых листков: •энтодермы (кишечная дифференцировка, рис.А) •мезодермы (поперечно-полосатые мышцы и хрящи, рис. B) •эктодермы (нервная ткань, рис. С) Исследования In vitro и in vivo подтвердили плюрипотентность изолированных ССК, схожую с эмбриональными стволовыми клетками. Список литературы: Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis. Guan K, Nayernia K, Maier LS, Wagner S, Dressel R, Lee JH, Nolte J, Wolf F, Li M, Engel W, Hasenfuss G. Nature 440, (2006). pp. 1199-1203. Слайд 19 Соматические стволовые клетки из яичек Testis Яичко Testicular tubules Тестикулярные канальцы Enzymatical digestion, single cells Ферментное расщепление, отдельные selection клетки 4 days 4 дня Matrix selection Выбор матрицы Collagen Коллаген Laminin Ламинин After matrix selection Somatic cells После выбор матрицы Соматические клетки Unselected cells Неселективная популяция клеток Spermatogonial cells Coll cells Lam cells haGSC Сперматогониальные клетки Клетки, связавшиеся с коллагеном Клетки, связавшиеся с ламинином Взрослые герминальные стволовые клетки человека Отсутствие взрослых герминальных стволовых клеток человека No haGSC Teratoma formation…. No teratoma formation…. Образование тератомы и дифференцировка в клетки всех трех зародышевых листков Отсутствие образования тератомы и дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков Получение культуральным методом герминальных стволовых клеток из сперматогониальных клеток яичка взрослого человека из биоптата яичка Герминальные стволовые клетки с характеристиками, схожими с человеческими эмбриональными стволовыми клетками Получение сперматогониальных стволовых клеток человека из биоптата яичка можно будет использовать для проведения клеточной терапии В 2008 году было опубликовано исследование, в котором описано получение герминальных стволовых клеток из сперматогониальных клеток яичка взрослого человека. Клеточные и молекулярные параметры продемонстрировали сходство с человеческими эмбриональными стволовыми клетками, включая возможность формирования в тератомы (опухоли, содержащих различные виды клеток и тканей из всех трех зародышевых листков). Образцы тканей яичка человека были механически и ферментативно диссоциированы для получения отдельных клеток. После этого клетки культивировали в течение 4 дней вместе с GDNF или LIF (факторами роста, используемыми для поддержания недифференцированного состояния эмбриональных стволовых клеток). Затем клетки отбирали с помощью CD49f (α6интегрина) и культивировали в присутствии коллагена или ламинина. Ламинин связывался со сперматогониальными клетками, содержащими VASA (маркер герминальных клеток), и эти клетки могли превращаться в тератомы в условиях in vivo и дифференцироваться в производные всех трех зародышевых листков. Клетки, культивированные в присутствии коллагена, были VASAотрицательными и не образовывали тератомы. Авторы разработали метод культивирования для получения взрослых герминальных стволовых клеток человека из биоптата яичка. Они выделили герминальные стволовые клетки с такими же характеристиками, как и у эмбриональных стволовых клеток человека. Результаты показали, что стволовые клетки из биоптата яичка можно будет использовать для проведения клеточной терапии. Список литературы: Generation of pluripotent stem cells from adult human testis. Conrad S, Renninger M, Hennenlotter J, Wiesner T, Just L, Bonin M, Aicher W, Bühring HJ, Mattheus U, Mack A, Wagner HJ, Minger S, Matzkies M, Reppel M, Hescheler J, Sievert KD, Stenzl A, Skutella T. Nature. 20;456(7220). (2008), pp 344-9. Слайд 20 Выводы • • • • Наличие ССК в эндометрии мышей было продемонстрировано с помощью ДНКмеченных клеток и выявлением соседней локализации рядом с маркерами недифференцированных клеток. Однако присутствие ССК в человеческом эндометрии было доказано другими способами: с помощью маркеров предполагаемых эндометриальных стволовых клеток и «сторонней» популяции. Оба метода позволили предположить существование эндометриальных ССК и возможность их использования при гинекологических заболеваниях. Наличие ССК в миометрии было продемонстрировано за счет их способности дифференцироваться в различные типы клеток в условиях in vitro и в миометрий в условиях in vivo. Это исследование позволило лучше понять патогенез такого заболевания миометрия, как лейомиома. В различных работах была продемонстрировано, что сперматогониальные стволовые клетки обладают такой же плюрипотентностью, как и эмбриональные стволовые клетки. Получение человеческих сперматогониальных половых клеток из биоптата яичка может позволить проводить индивидуальную клеточную терапию. В конце главы можно сделать следующие выводы: • Наличие ССК в эндометрии мышей было продемонстрировано с помощью ДНКмеченных клеток и выявлением соседней локализации рядом с маркерами недифференцированных клеток. • Однако присутствие ССК в человеческом эндометрии было доказано другими способами: с помощью маркеров предполагаемых эндометриальных стволовых клеток и «сторонней» популяции. Оба метода позволили предположить существование эндометриальных ССК и возможность их использования при гинекологической патологии. • Наличие ССК в миометрии было продемонстрировано за счет их способности дифференцироваться в различные типы клеток в условиях in vitro и в миометрий в условиях in vivo. Это исследование позволило лучше понять патогенез такого заболевания миометрия, как лейомиома. • В различных работах была продемонстрировано, что сперматогониальные стволовые клетки обладают такой же плюрипотентностью, как и эмбриональные стволовые клетки. Получение человеческих сперматогониальных половых клеток из биоптата яичка может позволить проводить индивидуальную клеточную терапию.
