Посмотреть файл - ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России) На правах рукописи Семенова Наталья Юрьевна МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНТРАМЕДУЛЛЯРНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ СТРУКТУР ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ НИШИ И ЭЛЕМЕНТОВ ЛИМФОИДНОЙ СТРОМЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ 14.01.21 – гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор С.С. Бессмельцев доктор медицинских наук, профессор В.И. Ругаль САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................. 10 1.1. Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) ....................................................................................... 10 1.2. Биология ниши гемопоэтических стволовых клеток костного мозга: строение и функции ............................................................................................................................................ 13 1.3. Роль стромального микроокружения костного мозга в нормальном и малигнизированном гемолимфопоэзе, включая ХЛЛ ............................................................ 23 1.4. Участие стромы лимфоидной ткани в развитии лимфоидных предшественников в норме и ее состояние при малигнизации лимфопоэза............................................................. 28 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ....................................................... 38 2.1. Общая характеристика пациентов ...................................................................................... 38 2.2. Методы исследований............................................................................................................. 41 2.3. Методы статистической обработки ..................................................................................... 44 2.4. Объем проведенных исследований ...................................................................................... 44 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ........................................... 45 3.1. Нишеобразующие структуры стромального микроокружения костного мозга в норме ................................................................................................................................................. 45 3.2. Паренхима и формирующие нишу стволовых клеток стромальные образования костного мозга при ХЛЛ ............................................................................................................... 53 3.3. Гистоморфологическая характеристика стромального компонента в лимфатических узлах при немалигнизированных реактивных лимфаденопатиях ......... 68 3.4. Особенности структурной организации стромы лимфатических узлов при ХЛЛ .... 75 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................................. 83 ВЫВОДЫ ............................................................................................................................................. 99 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ....................................................................................... 100 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................................................ 101 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................................................. 102 3 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Механизмы, определяющие злокачественную трансформацию клеток-предшественниц лимфопоэза при лимфопролиферативных заболеваниях окончательно не расшифрованы, в связи с чем исследования с целью получения неизвестных ранее, новых данных, связанных с лейкозной трансформацией клеток и, в частности, основанных на анализе мало изученной на сегодня кроветворной и лимфоидной стромы, особенно нишеобразующих структур являются одной из актуальных проблем современной гематологии. В обширной группе лимфопролиферативных заболеваний хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) стоит на первом месте по частоте встречаемости [1]. В установлении причин появления и дальнейшей судьбы лейкозного клона при этом заболевании значимое место занимает изучение особенностей состояния ключевых нишеобразующих стромальных структур кроветворного и лимфоидного микроокружения, непосредственно регулирующих развитие гемопоэтических стволовых клеток и их коммитированных в лимфоидном направлении потомков [47, 55, 109, 137]. Состоянию костномозговой стромы, оценке ее роли в нормальном гемолимфопоэзе и значению ее дефектов в развитии гемобластозов, включая лимфопролиферативные заболевания, в последние годы уделяется большое внимание [9, 12, 36, 38, 59, 65]. При этом особенности структурной организации элементов стромального микроокружения, участвующие в формировании ниши клеток-предшественниц гемолимфопоэза в целом и при ХЛЛ в частности, практически не изучены. Согласно концепции остеобластно-васкулярной ниши кроветворное микроокружение содержит специализированные стромальные клеточные структуры - ниши, формируемые элементами стромы эндоста и микрососудами, которые определяют локализацию стволовых клеток и создают условия для их длительного самоподдержания, а также регулируют их дифференцировочный и пролиферативный потенциал. Вне ниши стволовые кроветворные клетки не способны выполнять свои функции [90, 134, 171, 174]. Также известно, что именно в костномозговых нишах гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) получают первоначальные сигналы гемопоэзиндуцирующего микроокружения, направляющие развитие гемопоэтических предшественников в лимфоидном направлении. Коммитированные лимфоидные предшественники мигрируют из костного мозга в лимфоидные органы, где при непосредственном влиянии стромального компонента лимфоидной ткани происходит их дальнейшее развитие. В связи с этим анализ структурных особенностей кроветворной ткани и состояния стромального микроокружения больных ХЛЛ является актуальным, так как на основании сведений о морфофункциональном статусе паренхимы и стромы костного мозга представляется 4 возможным получить факты, уточняющие патогенез появления и становления неопластического клона В-лимфоцитов при ХЛЛ. В тоже время, практически отсутствуют работы о состоянии не менее значимого регуляторного компонента, определяющего лимфопоэз – лимфоидного микроокружения, при нарушениях пролиферации и дифференцировки лимфоидных клеток при их малигнизации [5, 31, 45]. Коммитированные в лимфоидном направлении стволовые клетки мигрируют из стромальной ниши костного мозга в различные лимфоидные ткани и органы, в частности, лимфатические узлы. В них под воздействием, прежде всего фолликулярных дендритных клеток (ФДК) и эндотелия микрососудов, происходят завершающие этапы В-лимфопоэза и иммуногенеза. Учитывая этот факт, важную роль приобретает анализ состояния стромальных структур лимфатических узлов, напрямую ответственных за процессы пролиферации и дифференцировки мигрировавших из костного мозга лимфоидных предшественников. Таким образом, изучение морфофункциональных свойств ключевых нишеобразующих элементов кроветворного и лимфоидного микроокружения при малигнизированном лимфопоэзе является значимой научно-практической задачей. Сведения, полученные в ходе ее решения, важны для теоретической и практической гематологии, так как будут способствовать расшифровке патогенеза ХЛЛ, уточнению прогноза его течения и совершенствованию качества лечения заболевания. Степень разработанности темы Структурная организация стромы костного мозга при гемобластозах в целом изучена, однако морфофункциональный статус нишеобразующих элементов стромального микроокружения костного мозга, эндостальных образований и сосудов микроциркуляции при малигнизации лимфопоэза, в частности у больных ХЛЛ, охарактеризован мало. Недостаточно изучено состояние лимфоидного микроокружения при злокачественной трансформации лимфоидных предшественников и практически отсутствуют сведения о фолликулярных дендритных клетках, экстрацеллюлярном матриксе и характере микроциркуляции лимфатических узлов при ХЛЛ. До настоящего времени в условиях появления лейкозного клона у больных ХЛЛ отсутствует одновременный, сочетанный анализ ключевых стромальных структур костного мозга и лимфатических узлов, непосредственно участвующих в регуляции гемолимфопоэза и не сформулировано представление роли дефектов нишеобразующих образований кроветворной и лимфоидной стромы в патогенезе ХЛЛ. 5 Цель исследования. Определить морфофункциональные особенности стромальных элементов кроветворного и лимфоидного микроокружения, участвующих в формировании ниши гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и лимфоидных клеток-предшественниц, и оценить роль стромальных изменений в патогенезе хронического лимфолейкоза. Задачи исследования: 1. Изучить особенности инфильтрации опухолевыми лимфоцитами паренхимы костного мозга больных хроническим лимфолейкозом во взаимосвязи с состоянием стромы интрамедуллярных пространств губчатой кости. 2. Представить нишеобразующих морфологическую структур стромального и иммуногистохимическую микроокружения костного характеристику мозга – клеток эндостальных зон костных трабекул и сосудов микроциркуляторного русла кроветворной ткани при малигинизации гемолимфопоэза. 3. Охарактеризовать гистоморфологические изменения паренхимы и стромы лимфатических узлов больных ХЛЛ с поражением лимфоидной ткани. 4. Проанализировать структурную организацию ключевых стромальных регуляторных элементов лимфопоэза – фолликулярных дендритных клеток и сосудов микроциркуляторного русла при ХЛЛ. 5. Предложить концепцию роли дефектов нишеобразующих структур кроветворной и лимфоидной стромы в неопластической трансформации ГСК и клеток-предшественниц лимфопоэза. Научная новизна Впервые на клиническом материале представлены неизвестные ранее сведения о морфофункциональном состоянии нишеобразующих структур костного мозга и лимфатических узлов, непосредственно регулирующих развитие гемопоэтических стволовых клеток и клеток предшественниц в условиях малигнизации В-лимфопоэза при ХЛЛ. Данные получены на основании одновременного сочетанного структурного анализа кроветворного и лимфоидного микроокружения. Установлено, что независимо от характера опухолевой инфильтрации костного мозга – нодулярного, интерстициального или диффузного, наблюдаются морфофункциональные перестройки клеточных и внеклеточных элементов, участвующих в формировании гемопоэтической ниши: изменяется соотношение содержания интратрабекулярных коллагенов I и III типов, увеличивается количество эндостальных стромальных клеток костного мозга, изменяется их структурная организация, нарастает плотность микрососудов костномозговой 6 паренхимы, включая анатомические зоны локализации родоначальных кроветворных клеток в области эндоста. Выявлена взаимосвязь между плотностью микрососудов и интенсивностью опухолевого поражения костного мозга, а также показана корреляция между прогностическим фактором Zap70 (70-kd дзета-асоциированный белок) и плотностью микрососудов. Получены новые данные, свидетельствующие о вовлечении ключевых структур лимфоидного микроокружения в генез малигнизации лимфоидных клеток при ХЛЛ – обнаружены признаки дезинтеграции ФДК в паренхиме лимфатических узлов с одновременным усилением ангиогенеза, проявляющимся разрастанием сети мелких сосудов в лимфоидной ткани. Выдвинуто новое концептуальное положение о роли дефектов стромальных образований костного мозга, формирующих гемопоэтическую нишу, и стромальной ниши лимфатических узлов в генезе злокачественной трансформации лимфоидных предшественников. Теоретическая и практическая значимость работы Полученные в ходе проведенного исследования данные дополняют существующие знания о роли дефектов кроветворного и лимфоидного микроокружения в малигнизации лимфопоэза. Установленные качественные и количественные изменения нишеобразующих структур костномозговой и лимфоидной стромы позволяют сделать заключение об их вовлечении в процесс неопластической трансформации лимфоидных предшественников при ХЛЛ и могут указывать на перестройку функции ниши, направленную на поддержание лейкозного клона. Использованная методика одновременной оценки морфофункционального статуса структур кроветворной и лимфоидной ниш позволяет выявить у больных ХЛЛ стромальные дефекты, которые могут использоваться в клинике при оценке прогноза заболевания, контроля проводимого лечения и для его совершенствования. Методология и методы исследования В работе были использованы общенаучные (анализ данных, синтез) и частные научные методы (лабораторные, статистические). При изучении гистологических препаратов фрагментов подвздошной кости и биоптатов лимфатических импрегнация узлов серебром, применялись по Массону, окраски гематоксилин-эозином, проводившиеся по азур-II-эозином, стандартным методикам. Иммуногистохимические (ИГХ) исследования выполняли с использованием панели первичных антител (Dako, Abcam, Spring Bioscience) и полимерной системы визуализации Dako по рекомендованным производителями протоколам окрашивания. 7 Морфологическую оценку препаратов осуществляли на световом микроскопе Nikon Eclipse E200 со встроенной фотокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений «ВидеоТесТ-Морфология 5.2» с окуляром х10, при объективах х20, х40. Анализ гистологических препаратов выполнялся в 20 полях зрения для каждого образца. Статистическая обработка полученных данных проводилась методом вариационной статистики с определением средней величины М, ее средней ошибки m, стандартного отклонения SD. Достоверность различий оценивалась с помощью критерия Стьюдента (t), критерия Манна-Уитни. Различие между сравниваемыми показателями считалось статистически значимым при р ≤ 0,05. Для выяснения зависимости между показателями применялся корреляционный анализ. Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием программ Statistica v.6.0, MedCalc, Microsoft Excel для Windows ХР. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Стромальными структурами костного мозга человека, участвующими в формировании гемопоэтической ниши, являются эндостальные клетки, сосуды микроциркуляции, интрамедуллярный и интратрабекулярный экстрацеллюлярный матрикс. В лимфатических узлах структурами непосредственно регулирующими развитие мигрировавших из костного мозга лимфоидных предшественников являются фолликулярные дендритные клетки и микрососуды. 2. Перестройки морфофункционального статуса стромальных нишеобразующих структур при ХЛЛ развиваются независимо от типа опухолевой инфильтрации костного мозга. 3. Развитие хронического лимфолейкоза сопровождается качественными и количественными изменениями эндостальных стромальных клеток и плотности микрососудов. 4. Дезинтеграция и изменение фенотипа фолликулярных дендритных клеток и усиленный ангиогенез в тканях лимфатических узлов являются характерными особенностями состояния лимфоидной ткани при ХЛЛ. 5. Одним из патогенетических морфофункционального факторов статуса развития нишеобразующих лимфоидной стромы. Степень достоверности и апробация работы ХЛЛ является структур нарушение кроветворной и 8 Достоверность и обоснованность результатов работы обеспечена комплексным анализом нишеобразующих стромальных структур костного мозга и лимфатических узлов 112 пациентов с первично установленным диагнозом ХЛЛ с использованием современных методов гистологических и иммуногистохимических исследований и подтверждена адекватными поставленным задачам методами статистической обработки полученных данных. Результаты работы обсуждены и доложены на Всероссийских и Международных конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2012, 2014), Всероссийской научнопрактической конференции c международным участием «Инновационные технологии в нейроэндокринологии, нейронауках и гематологии» (Санкт-Петербург, 2013), 18 Конгрессе Европейской ассоциации гематологов (Стокгольм, 2013), Международной научно-практической конференции медицина: «Современная актуальные вопросы» (Новосибирск, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2014), II Конгрессе гематологов России (Москва, 2014), 19 Конгрессе Европейской ассоциации гематологов (Милан, 2014), Юбилейной конференции, посвященной 140-летию со дня рождения А.А. Максимова «От унитарной теории кроветворения до трансплантации костного мозга» (Санкт-Петербург, 2014). Внедрение результатов исследований в практику Основные положения исследовательскую работу в диссертации ФГБУ внедрены «Российский в практическую и научно- научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России». Материалы исследования используются в педагогическом процессе в ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» и при диагностике и лечении больных лимфопролиферативными заболеваниями в СПбГУЗ «Городская больница №15». Результаты диссертационной работы включены в Методические рекомендации «Современные методы диагностики и лечения неходжкинских лимфом» (СПб, 2015). Публикации По теме кандидатской диссертации опубликовано 19 научных работ, из них 5 в научнопрактических журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов диссертационных исследований. Также опубликована глава в коллективной монографии «Актуальные вопросы медицинских морфологических дисциплин» (Новосибирск, 2014, с. 62-80). 9 Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 175 источников: 23 отечественных и 152 иностранных. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 27 рисунками. Личный вклад автора Автором диссертационной лично проведены работы, анализ выполнены все литературных данных гистологические, и планирование иммуногистохимические исследования, морфометрия и фотографирование полученных микропрепаратов, осуществлены статистическая обработка, анализ полученных данных, обобщение результатов исследований и подготовка материалов к публикациям. 10 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) в 98% случаев представляет собой опухоль из мономорфных мелких В-лимфоцитов, накапливающихся в периферической крови, костном мозге, лимфатических узлах и других органах и обычно экспрессирующих CD5 (Т-клеточный антиген), CD23 и другие В-клеточные антигены (CD19, CD20) при невысоком уровне экспрессии поверхностных иммуноглобулинов. Т-клеточный вариант встречается крайне редко [168]. Удельный вес ХЛЛ среди лейкозов взрослых по-прежнему остается самым высоким, достигая 25—30% в Западной и Восточной Европе и Северной Америке (до 40 % у лиц старше 65 лет). Однако средний возраст заболевших ХЛЛ (65 лет) если и остается как будто постоянным, то главным образом за счет увеличения средней продолжительности жизни населения, что хорошо согласуется с прогнозами демографической ситуации в мире, несмотря на рост заболеваемости в более молодом возрасте (10—15% в возрасте до 55 лет; встречаются случаи до 40 лет). Следует иметь в виду, что нередко (40—60%) заболевание диагностируется в асимптомной фазе (лимфоцитоз при рутинном анализе крови) [1]. Более глубокое изучение биологии лимфоидных клеток при ХЛЛ, вариабельности клинического течения и ответа на новые варианты терапии заболевания привело к уточнению, а в ряде случаев и к пересмотру ранее казавшихся незыблемыми общебиологических и клинических представлений положений, о что механизмах существенным развития образом злокачественной отразилось на трансформации формировании лимфоидных предшественников при этой патологии. Однако существующие в настоящее время обширные сведения не позволяют установить истинную причину, лежащую в основе ХЛЛ. На сегодня известно, что патогенез ХЛЛ фактически не связан с реципрокными сбалансированными транслокациями хромосом, чем и отличается от других В-зрелоклеточных лимфопролиферативных заболеваний, при которых такие протоонкогены, как циклин d1, bcl2, bcl6, pax5, c-myc, вовлечены в хромосомные перестройки. Инактивация гена-супрессора опухолевого роста р53 на хромосоме 17р13 и делеции или мутации гена atm на хромосоме 11q22-23 наблюдаются на поздних стадиях заболевания, не являясь, вероятно, первичными опухолевыми событиями. Не смотря на то, что на ранних этапах развития ХЛЛ отмечаются делеции 13q14 (почти в половине случаев), структурные аберрации хромосомы 11 (≈20%) и 11 трисомия 12 хромосомы (15%), этот факт, однако, не может быть однозначным подтверждением основополагающей патогенетической причины становления ХЛЛ. В соответствии с мутационным статусом генов вариабельной области тяжелых цепей иммуноглобулинов среди больных ХЛЛ выделяют, по крайней мере, две большие подгруппы, мало отличающиеся друг от друга по экспрессии других генов, среди которых интерес представляет Zap70 (дзета-ассоциированный протеин), присутствующий на нормальных Тлимфоцитах и естественных клетках-киллерах, но не на нормальных В-клетках и большинстве клеток с мутантным IgVH. Этот белок имеет отношение к включению сигнальных путей при связывании иммуноглобулинов и может соотноситься с более агрессивным течением заболевания с немутантным IgVH, но его экспрессия не зависит от хромосомных аберраций [53]. Вместе с тем профиль экспрессии генов, кодирующих различные протеинкиназы, среди которых имелись и участвующие в передаче сигналов в клетке, не определялся мутантным статусом IgVH, а был специфичен для ХЛЛ [150]. Оценка количественной экспрессии генов, связанных с апоптозом и клеточным циклом, свидетельствует в пользу того, что из двух известных механизмов накопления опухолевых клеток при злокачественном заболевании — дефицит программированной клеточной гибели и активация клеточного цикла — для ХЛЛ все же более характерен первый [18, 89]. Даже если допустить принадлежность ХЛЛ к числу лимфопролиферативных заболеваний с низкой фракцией роста, при которых нарастание опухолевой массы в организме определяется в основном ингибицией апоптоза, не исключается накопление в последующем других изменений регуляции клеточного цикла, часто сопряженных с генами-супрессорами опухолевого роста, что способствует нарастанию пролиферативных процессов и агрессивности течения заболевания [39, 56, 132]. В противоположность тому, что наблюдается in vivo, быстрая гибель клеток ХЛЛ при культивировании связана с отсутствием ростовых или других факторов в среде, про которые известно, что они препятствуют апоптозу (гранулоцитарный колоние-стимулирующий фактор, основной фактор роста фибробластов, ИЛ-4, ИЛ-13, ИЛ-10, ИФН-α и γ, растворимый CD23). Несоответствие между интенсивностью апоптотических процессов при ХЛЛ in vivo и in vitro пытаются объяснить защитным действием на лейкозные клетки контакта со стромальными клетками костного мозга в организме [27]. C защитой злокачественных клеток при ХЛЛ от апоптоза связана и слабая экспрессия CD95 и CD95-R, через которые осуществляется запуск внешнего пути апоптоза. Стромальные клетки костного мозга поддерживают выживаемость лейкозных клеток. В свою очередь опухолевые В-клетки сами индуцируют у стромального микроокружения способность поддерживать выживаемость этих клеток (реципрокное взаимодействие) [28]. 12 Механизмы формирования ХЛЛ, как и любого другого заболевания, представляют интерес не только с точки зрения выяснения фундаментальных основ патологии, но прежде всего их понимание необходимо для установления терапевтических мишеней и способов воздействия на них, что является предметом многих исследований [118, 136, 162]. Микроокружение опухолевых клеток является ведущим в прогрессировании этого клинически гетерогенного заболевания и усилия последних лет сосредоточены на исследовании взаимодействия опухоль-микроокружение для раскрытия фундаментальных основ заболевания и поиска новых прогностических факторов, которые покажут клинически значимые корреляции. Заболевание остается неизлечимым и генез его требует дальнейших исследований. Учитывая роль стромы костного мозга и лимфоидной ткани, в частности лимфатических узлов, в развитии лимфоидных предшественников, очевидно, что анализ указанных образований актуален, а полученные данные о структуре кроветворной и лимфатической стромы при ХЛЛ имеют важное теоретическое и практическое значение для целей уточнения генеза неопластической трансформации лимфоидных предшественников, совершенствования лечения заболевания и прогноза его течения. 13 1.2. Биология ниши гемопоэтических стволовых клеток костного мозга: строение и функции В конце прошлого столетия была сформулирована новая концепция относительно поведения и роли стволовых клеток взрослого организма в поддержании функциональных свойств быстро обновляющихся тканей, таких как кроветворная, эпителий кишечника, эпидермис и иных с менее интенсивной способностью к самообновлению. Основным положением указанной концепции был тезис о том, что длительное самоподдержание стволовых клеток и реализация генетической программы дифференцировки возможны только при условии их пребывания в специфическом микроокружении, которое формирует для них особую нишу. Примечательно, что впервые идея ниши была обозначена относительно гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в 1978 г. R. Schofield [134]. Ниша является не просто локальным местопребыванием ГСК, а имеет структурно-анатомические и функциональные характеристики, вне ниши ГСК не способны выполнять свои ключевые функции. Так ГСК могут циркулировать в кровеносном русле и, находясь практически в любых тканях и органах, тем не менее, не функционируют в качестве стволовых клеток. Хоминг – способность мигрировать в свою нишу для получения соответствующих сигналов, является основным свойством ГСК [10]. В организме человека ежесуточно продуцируется и одновременно погибает 500 млрд. клеток крови. Это ставит систему гемопоэза на первое место среди всех тканей и органов по темпам клеточного самообновления. В таких условиях для поддержания клеточного баланса требуется, прежде всего, определенное количество стволовых клеток с закрепленной генетической программой их развития в кроветворном направлении, а также наличие эпигенетических механизмов, регулирующих реализацию пролиферативного и дифференцировочного потенциала ГСК. У взрослых гемопоэз в нормальных условиях ограничивается костной тканью. В ней локальные регуляторные механизмы развития ГСК определяются гемопоэзиндуцирующим микроокружением, в котором ключевая инструктивная роль принадлежит стромальным клеткам костного мозга (КМ). Ранее было показано, что помимо опорной функции, которую выполняет строма для костномозговой паренхимы, стромальные элементы ответственны за миграцию, сортировку, репликацию, пролиферацию и дифференцировку клеток КМ. Кроме того, стромальные клетки способны восстанавливать исходное микроокружение при повреждении органов, содержащих ретикулярную строму. Во всех случаях сначала восстанавливается строма, а затем она репопулирует кроветворными клетками. Строма выполняет опорную функцию для костномозговой паренхимы, а с помощью гуморальных факторов гемопоэза стромальные элементы осуществляют пролиферацию и 14 дифференцировку клеток КМ. Между паренхимой КМ и элементами стромы, создающей микроокружение, существует тесная взаимосвязь [10, 42, 100]. 40 лет назад исследования, выполненные в лаборатории J.J. Trentin, показали, что стромальные клетки играют активную роль в регуляции дифференцировки ГСК во все типы линий клеток крови. J.J. Trentin предположил, что это индуктивное воздействие, включающее взаимодействие стромальных клеток и ГСК, и в связи с этим, гемопоэтическая строма была названа гемопоэзиндуцирующим микроокружением (ГИМ) [152]. Первое подтверждение, что существуют различные ГИМ в разных гемопоэтических органах было получено при исследовании, в котором имплантировали строму КМ (главное место гранулопоэза) в селезенку (поддержание эритропоэза) [152]. В этом эксперименте реципиентные мыши были облучены и им были введены клетки КМ, чтобы возобновить клетки-предшественники ГСК, мыши были декапитированы через 18– 24 часа и ткань КМ имплантировали напрямую в селезенку облученных вторичных реципиентов. Селезенки трансплантированных собрали селезенок через 7 дней визуализировали после под трансплантации световым и участки микроскопом. Имплантированная строма КМ легко отличима от стромы селезенки по различиям в соединительной ткани и по присутствию костных спикул в строме КМ [152]. Интересно, что типы колоний, выявленные в секциях селезенок, были зависимы от стромального микроокружения, в котором они развивались. Внутри стромы КМ колонии были главным образом гранулоцитарные по своей природе, в то время как в строме селезенки колонии, главным образом, были эритроидные, а в колониях, перекрывающих границы стром двух типов, линии были перемешаны. Этот эксперимент подтвердил тот факт, что строма различных органов индуцирует дифференцировку специфических линий клеток крови из предшественников и с этого времени она получила название – ГИМ, в дальнейших исследованиях были идентифицированы различные ГИМ [51, 151, 152]. В 1978 R. Schofield, основываясь на наблюдениях коллег, предсказал, что помимо микроокружения, которое индуцирует дифференцировку, также существует специфическая гемопоэтическая ниша стволовых клеток, которая фиксирует их на месте, предотвращает созревание, позволяя стволовым клеткам пролиферировать и поддерживать их свойства. Как только потомки ГСК покидают нишу, они переходят к дифференцировке [134]. Эти предположения были основаны на наблюдениях, что ГСК необходимо располагаться в КМ, чтобы сохранять «бесконечный» потенциал, в то время как ГСК, которые располагались в селезенке и формировали колонии были более ограничены в своей возможности поддерживать гемопоэз [134]. В течение последующих 25 лет исследования микроокружения КМ были, главным образом, основаны на микроскопических исследованиях или ex vivo культивируемых системах, особенно на 15 долгоживущих КМ культурах, которые способны поддерживать гемопоэз в течение длительного времени [62, 63]. В этих исследованиях, КМ стромальные клетки были охарактеризованы как фибробласты, ретикулярные клетки, эндотелиальные клетки, адипоциты и остеобласты. Изучение стромы в момент активного гемопоэза в длительной культуре КМ показало, что в строме существуют дискретные участки микроокружения, в которых клетки дифференцируются по определенным линиям [54]. Однако, точные отличительные черты клеточных типов, составляющих нишу ГСК, оставались неизвестными. В 2003 году в двух экспериментах, проведенных на мышиных моделях, было показано, что формирующий кость остеобласт способен влиять на размер пула ГСК in vivo, что означало, что остеобласт является важным компонентом ГСК ниши [48, 175]. В 2005 в других исследованиях была определена важная роль эндотелиальных клеток синусоидов КМ, что позволило предположить, что они также являются нишей для ГСК [85]. Строение ниши гемопоэтических стволовых клеток По мере накопления знаний об инструктивной роли микроокружения в обеспечении жизнедеятельности ГСК и понимании того факта, что его функциональный потенциал обеспечивается тесным взаимодействием многих элементов стромы КМ, становилось очевидным, что роль отдельных ее образований непосредственно влияющих на ГСК неравнозначны. В последнее десятилетие экспериментальные исследования структуры и функций микроокружения ГСК позволили выделить из широкого спектра формирующих его элементов конкретные костномозговые стромальные образования, которые непосредственно контролируют жизнедеятельность ГСК, определяют их локализацию и запускают генетически детерминированную программу пролиферации и дифференцировки родоначальных клеток гемолимфопоэза (рис. 1). Понимание гемопоэтической ниши значительно возросло за последние несколько лет, что, по крайней мере, частично связано с развитием новых методов клеточных исследований. В формировании ниши принимают участие многие типы клеток, включая остеобласты, клетки эндотелия, обильно экспрессирующие СХСL12 ретикулярные клетки (CAR-клетки), мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), симпатические нервные волокна. В нишах ГСК могут находиться в состоянии покоя, а могут активно пролиферировать. На сегодняшний день четко выделяют две ниши – эндостальную и васкулярную, не исключено, что в ближайшем будущем появятся новые «ниши» [32, 61, 112, 121]. 16 Рисунок 1. Стромальное микроокружение ГСК костного мозга. Схематическое изображение эндостальной и васкулярной ниши в костном мозге [рис. с изменениями по http://raysports.com.br/site/wp-admin/css/hematopoietic-stem-cells-niche]. Васкулярная ниша образована, главным образом, CAR-клетками, ММСК и эндотелиоцитами синусоидов. ГСК в составе этих ниш, как правило, активно пролиферируют. Компонентами эндостальных ниш являются выстилающие кость клетки (эндост) и ММСК. ГСК в эндостальных нишах, в основном находятся в состоянии покоя. Конкретные межклеточные взаимодействия и молекулярные механизмы, которые обуславливают статус клеточного цикла ГСК в разных костномозговых нишах до сих пор остаются до конца неуточненными [21-23, 112]. Основные клеточные нишеобразующие элементы Остеобласты У взрослых людей постоянный гемопоэз возникает в КМ, который расположен в полости кости. Вместо того чтобы быть инертной структурой, костная ткань постоянно претерпевает процесс ремоделирования через тесные связи между формированием кости из остеобластов и резорбцией кости остеокластами [103]. Остеобласты обычно располагаются вдоль эндоста между костью, КМ и периостом, который составляет внутренние и наружные поверхности кости соответственно. Главные функции остеобластов в ремоделировании кости - это секреция 17 неминерализованных белков матрикса кости (собирательно названных остеоид) и клеток остеобластной линии, регулирующих дифференцировку остеокластов [99, 103]. В двух одновременно опубликованных исследованиях установлено, что остеобласты играют активную роль как часть регулирующего микроокружения ГСК [48, 175]. В одном исследовании, проведенном на мышах, был удален рецептор костного морфогенетического белка кости 1A (BMPR1A). Результатом этого явилось эктопическое образование трабекулярной костеобразной области (TBLA), и значительное увеличение в количестве N-кадгерин+ остеобластов (SNOклетки) в TBLA. Увеличение TBLA коррелировало с увеличением количества ГСК (которые определялись по функциональным и фенотипическим свойствам), и было обнаружено, что ГСК прикреплялись к SNO-клеткам в ассоциации с N-кадгерином [175]. В другом исследовании изучались эффекты конститутивно активированного паратиреоидного гормона/паратиреоидсвязанного белкового рецептора (PPR) под контролем остеобласт-специфичного промотора коллагена 2.3kBα1(1) [48]. PPR-трансгенные мыши имели значительное увеличение ГСК клеток одновременно с увеличением площади, занимаемой трабекулярной костью и повышенным числом трабекулярных остеобластов, которые экспрессировали лиганд Notch Jagged1. ГСК клетки из PPR-трансгенных мышей имели более активированный Notch, чем ГСК дикого типа. Более того, контакт между ГСК и Jagged1-экспрессирующими остеобластами требовался для мобилизации ГСК, а добавление ингибитора секретазы, который подавляет активацию Notch, к культурам стромальных клеток предотвращало этот эффект [48]. Обработка стромальных культур дикого типа паратиреоидным гормоном повторяло фенотипы, которые наблюдались у PPR-трансгенных мышей. Было также показано, что паратиреоидный гормон имеет терапевтический потенциал для ГСК мобилизации и гемопоэтической реабилитации после трансплантации через регуляцию размера остеобластной ГСК ниши в моделях мыши [25, 48]. Следует отметить, что эти in vivo модели были созданы, главным образом, на основе данных, полученных в предыдущей работе in vitro, в которой было замечено, что остеобласты и остеобластные клеточные линии могут поддерживать гемопоэтические клетки в культуре. Было показано, что остеобласты человека поддерживают ГСК в ex vivo культивируемых системах [144,157]. В то время как увеличение количества остеобластов продемонстрировали прирост ГСК, уменьшение количества остеобластов не всегда равным образом коррелировало с сокращением ГСК. Удаление остеобластов ганцикловиром в трансгенных по тимидин-киназе мышах, экспрессирующейся остеобластами, вызывает сокращение костномозгового и усиление экстрамедуллярного гемопоэза. Это сопровождалось сокращением абсолютного числа примитивных гемопоэтических клеток в КМ, в селезенке и печени [155]. Тем не менее, дисфункция остеобластов у мышей, дефектных по бигликану не отразилась на изменении количества ГСК в КМ [84]. Следовательно, каждый из специфических типов остеобластов 18 вносит вклад в нишу или остеобласты не требуются для функции ниши и могут быть вытеснены другими типами клеток при условиях постепенного уменьшения числа остеобластов. Установлено, что продукты остеобластов являются позитивными регуляторами ГСК и включают в себя ангиопоэтин-1, тромбопоэтин и Jagged-1, в то время как остеобластассоциированные негативные регуляторы ГСК ниши включают остеопонтин и dikkopf1 [30, 48, 85,165]. Остеобласты обильно экспрессируют хемокин CXCL12, который играет роль в хемотаксисе, хоуминге и выживании ГСК, а также в удержании ГСК в КМ [44]. Хотя следует отметить, что другие не остеобластные ретикулярные клетки КМ также экспрессируют высокие уровни CXCL12 и могут играть роль в нише [119,143]. Несмотря на то, что остеобласты являются помощниками в регуляции ГСК в КМ, остается неизвестным требуется ли их контакт напрямую с ГСК. Эндотелиальные клетки Эндотелиальные клетки выстилают все сосуды в организме. В КМ они формируют барьер между развивающимися гемопоэтическими клетками и кровью, регулируют циркуляцию клеток крови [15, 42, 139]. Факты, подтверждающие возможность того, что периваскулярная зона служит регуляторной нишей для стволовых клеток, были получены в двух исследованиях. Исследование гемопоэтических клеток животных in vivo показало, что они располагаются рядом с особыми субсекциями микроциркуляторного русла КМ, где клетки сохраняются или увеличиваются в количестве за 70-дневный интервал [139]. Эти данные позволяют предположить, что периваскулярная зона является потенциальной нишей, но изученные гемопоэтические популяции не были хорошо обогащены ГСК. Именно открытие SLAMантигенов, помечающих ГСК, сделало возможным гистологическую оценку того, где ГСК располагаются в микроокружении КМ [85]. Исследования показали, что большинство ГСК находились в периваскулярной зоне и только меньшинство из них (меньше 16%) в периэндостальной области. Эти данные согласуются с гипотезой о том, что периваскулярные участки также являются нишей, но есть несколько спорных моментов. Самое важное это то, что ГСК двигаются внутрь и из кровяного русла, таким образом, остается формально возможным то, что клетки собираются вокруг сосудов, потому, что это важная точка в их движении. Если это так, то это не соответствует критериям ниши. Также в трабекулярном регионе, где располагается большинство ГСК, тяжело распознать все анатомические связи, основываясь на двумерных изображениях. Представляет ли периваскулярная зона истинную нишу в КМ до сих пор требует экспериментального подтверждения. Хотя, возрастные изменения в гемопоэзе предположительно указывают на то, что периваскулярные участки, скорее всего, служат нишами, и существуют исследования in 19 vitro, которые показывают, что эндотелиальные клетки, полученные из различных тканей, могут поддерживать ГСК системы в культуре [15, 42, 98]. В эмбриональном развитии ГСК возникают в желточном мешке, плацента может также служить местом продукции ГСК. Печень плода становится областью, где располагаются ГСК в течение следующего триместра беременности, гемопоэз устанавливается в КМ несколько позже, во втором триместре эмбрионального развития [59, 116, 117]. За исключением КМ все места, где самообновление может быть изолировано в течение эмбрионального развития, лишены остеобластов, но содержат эндотелиальные клетки, которые тесным образом ассоциированы с поколением ГСК [116, 117]. Одним из важных компонентов стромы костного мозга являются потомки МСК ретикулярные клетки. Основным местом их локализации являются интрамедуллярные пространства губчатой кости, включая эндостальные зоны. Кроме того, часто ретикулярные клетки располагаются по периферии сосудов МЦР. Одна из их функций - регуляция миграции зрелых клеток крови из костного мозга в циркуляцию [164]. Микроскопическими исследованиями показано, что эти клетки имеют темное ядро и средних размеров цитоплазму. Часть из них содержит крупные жировые капли. Интрамедуллярные ретикулярные клетки своими длинными цитоплазматическими отростками пронизывают костномозговые полости и формируют механический каркас, внутри которого располагаются гемопоэтические клетки. Таким образом, они выполняют роль своеобразного "якоря", который задерживает клетки крови и способствует их передвижению в циркуляцию. Контактируя между собой, а также с костью и сосудами они не позволяют спадаться стенкам синусоидов, состоящих из одного слоя эндотелиальных клеток [42, 160, 164]. Кроме того, в их цитоплазме обнаружены микрофиламенты. Известно, что ретикулярные клетки лимфатических узлов способствуют транспортировке лимфоцитов, по всей вероятности в костном мозге ретикулярные клетки способствуют миграции клеток крови в интрамедуллярных пространствах костномозговых лакун. Ретикулярные клетки выполняют и более специфические функции. Имея в цитоплазме хорошо развитый белоксинтезирующий аппарат, ретикулярные клетки являются основным источником образования экстрацеллюлярного матрикса, формирующего микросреду интрамедуллярных пространств костного мозга. Синтезируя коллаген, глюкозаминогликаны и другие физиологически активные субстанции, ретикулярные клетки способны непосредственно влиять на процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников. Особенно следует отметить роль коллагена, который выполняет не только опорную функцию, но и необходим в процессах эмбрио- и морфогенеза, оказывает влияние на рост и 20 дифференцировку клеток. В интрамедуллярных пространствах костного мозга присутствует в основном коллаген I и III типа. Адипоциты занимают значительное место в костномозговых полостях. Их роль в гемопоэзе пока еще окончательно не ясна, хотя некоторые авторы полагают, что эти клетки также обладают способностью продуцировать гемопоэтические ростовые факторы [152]. В условиях нормального кроветворения жировые клетки заполняют у взрослых все пространство костномозговой полости, не занятое миелоидной тканью. В промежутках между жировыми клетками диффузно расположены гранулоциты. Иногда адипоциты тесно прилежат к поверхности костных балок. При электронно-микроскопическом исследовании можно отметить тесные взаимоотношения преадипоцитов с молодыми гранулоцитарными элементами, в местах межклеточных контактов обнаружены перестройки плазмолемм преадипоцитов. По всей видимости, незрелые жировые клетки оказывают влияние на гранулоцитопоэз. Что касается зрелых жировых клеток, то они являются энергетическими депо костного мозга и лабильным матриксом, легко теряющим липиды для обеспечения развития гемопоэтических клеток в условиях повышенного запроса при различных экстремальных ситуациях. Способность адипоцитов адсорбировать на своей поверхности широкий спектр физиологически активных субстанций позволяет жировым клеткам непосредственно участвовать в гуморальной регуляции процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических предшественников. Костномозговые стромальные клетки продуцируют макромолекулы, которые формируют высокоорганизованную структуру, известную как экстрацеллюлярный матрикс. Главные компоненты экстрацеллюлярного матрикса - коллагены (фибриллярные протеины, продуцируемые ретикулярными и эндотелиальными клетками), фибронектин (гликопротеин, секретируемый ретикулярными клетками и макрофагами), ламинин (гликопротеин, продуцируемый эндотелиальными клетками) и протеогликаны. Экстрацеллюлярный матрикс является не только механической поддержкой для гемопоэтических элементов, но также играет динамическую роль в регуляции гемопоэза [79, 81, 151]. Идентификация двух различных типов клеток, как важных компонентов ГСК ниши, привело ко многим вопросам, на которые до сих пор нет ответов. Остеобласты и эндотелиальные клетки представляют собой отдельные ниши или представляют одну ГСК нишу? Ниши для покоящихся и активированных ГСК одинаковые или они различаются? Исследования локализации ГСК в их нише in vivo преимущественно основывались на визуализации клеток в гистологических препаратах КМ [50, 85, 112, 175]. Эти двухмерные изображения не отражают действительную трехмерную структуру микроокружения КМ. Поэтому, такие исследования могут быть лишены правильной анатомической структуры ГСК ниши, которая скорее состоит из многообразия различных клеточных типов, чем привязана к 21 одному типу клеток. Очень вероятно, например, что остеобласт-содержащая ниша ГСК находится в тесной связи с эндотелиальными клетками. Доказательством в пользу этого служат данные о том, что КМ, включая эндостальную поверхность, сильно васкуляризирован [60, 113]. На самом деле, васкуляризация хрящевой пластинки важный процесс в течение формирования эмбриональной кости посредством эндохондрального окостенения, и сокращение кровоснабжения значительно сокращает формирование кости [43, 101, 102]. Более того, кровоснабжение играет ключевую роль в продолжающемся процессе ремоделирования кости [43]. Следовательно, остеобласт-содержащая ГСК ниша, возможно, находится по близости к эндотелиальным клеткам, и эти два типа клеток могут совместно формировать трабекулярную ГСК нишу. Хотя, существуют отдельные участки КМ, в которых эндотелиальные клетки не расположены рядом с остеобластами, в частности, в областях, лишенных трабекулярной кости в центральном участке диафиза [60]. Еще предстоит изучить, локализуются ли эти эндотелиальные клетки также рядом с ГСК или они отличаются от тех, которые были идентифицированы как периваскулярная ГСК ниша. Тем не менее, некоторые недавние исследования предположили существование двух различных ГСК ниш, которые поддерживают неактивные или активированные ГСК. Некоторые исследователи отмечают, что остеобласт-содержащая ниша представляет собой нишу, в которой ГСК остаются не активированными. На сегодняшний день было показано что, по крайней мере, три молекулы, найденные на поверхности остеобластов (Nкадгерин, ангиопоэтин-1 и тромбопоэтин) регулируют активацию ГСК через взаимодействие с их рецепторами (N-кадгерин, Tie-2 и Mpl соответственно) [30, 67, 73, 166, 172, 175]. Более того, результатом остеобласт-специфической экспрессии канонического ингибитора Wnt-пути dikkopf1 стал выход ГСК из состояния покоя в добавок к уменьшению потенциала трансплантанта ГСК [67]. Эти данные позволяют предположить, что Wnt-сигналинг в нише важен для поддержания покоя и самообновления ГСК. В периваскулярной нише наоборот ГСК находятся в более активированном состоянии. Таким образом, активированные ГСК включают в себя ГСК, находящиеся в цикле и те ГСК, которые были подвергнуты стрессу, такому как добавление химиотерапевтических медикаментов (например, 5-фторурацил или циклофосфоамид) или цитокинов [110, 124, 166, 174]. До сих пор не ясно, может ли такая ниша являться временной для ГСК, представляет ли она собой стабильную нишу для отдельной популяции ГСК или ГСК в периваскулярной нише были транзитом, когда их визуализировали. Также неизвестно имеют ли все остеобласты и эндотелиальные клетки одинаковый потенциал поддержки ГСК или специализированные остеобласты/эндотелиальные клетки, специфические размещения остеобластов/эндотелиальных клеток имеют разные роли в регуляции ГСК. Например, трабекулярные остеобласты изначально были идентифицированы 22 как часть ГСК ниши, хотя, обычно мы ссылаемся на ГСК нишу как на эндостальную поверхность, которая относится как к кортикальной, так и к трабекулярной кости [48, 175]. Известно, что кортикальная и трабекулярная кости различаются по своему анатомическому положению, структуре и функциям. Кортикальная кость расположена в диафизальном участке трубчатой кости, она тонкая и плотная (80–90% кости кальцифицировано) и считается, что она выполняет, главным образом, механические и защитные функции. И, наоборот, трабекулярную кость можно найти в метафизарном участке кости, она менее плотная (15–25% кальцифицированно) и выполняет, в большинстве своем, метаболическую функцию [34]. Еще предстоит определить, имеют или нет остеобласты при различных анатомических локализациях разные роли в отношении регулирования ГСК. В этом направлении особое значение приобретает анализ и выявление в гетерогенной группе клеточных элементов эндоста популяции CD146+ клеток. Указанные клетки, обладая остеогенным потенциалом, необходимы для поддержания кроветворения. В эксперименте гемопоэз прекращался при их отсутствии. Подобным образом, эндотелиальные клетки - это специализированные клетки, которые имеют различные функции в различных тканях и органах, также существуют различия в свойствах и функциях эндотелиальных клеток, полученных из разного размера кровеносных сосудов, артерий и капилляров [35]. Более того, было показано, что ГСК привязаны к специфическим микродоменам, экспрессирующим CXCL12 в кровеносных сосудах КМ, что позволяет предположить, что специфические участки эндотелиальных клеток могут функционировать как периваскулярная ГСК ниша [139]. Таким образом, обладающие различной функциональной способностью эндостальные клетки губчатой кости, сосуды МЦР и эстрацеллюлярный матрикс являются основными образованиями стромального микроокружения кроветворной ниши, играющими ключевую роль в самоподдержании, пролиферации и дифференцировке ГСК. 23 1.3. Роль стромального микроокружения костного мозга в нормальном и малигнизированном гемолимфопоэзе, включая ХЛЛ Совершенно очевидно, что функциональные и структурные изменения элементов микроокружения могут быть причиной нарушений кроветворной функции костного мозга. В настоящее время установлено значение дефектов стромы костного мозга в развитии апластической анемии, миелодиспластических синдромов, острых и хронических формах лейкозов, иммунодефицитных состояний [3, 13, 14, 37, 65, 91, 111, 131, 159]. В связи с этим учет изменений стромального микроокружения необходим как для назначения оптимального лечения, так и для прогнозирования заболеваний. При этом в последние годы основной интерес сосредоточен на изучении механизмов, посредством которых дефекты микроокружения КМ приводят к гемопоэтическим нарушениям. В исследованиях in vitro было показано, что кондиционные среды культур стромальных клеток костного мозга больных неходжкинскими лимфомами (НХЛ) без признаков поражения костного мозга обладают способностью значительно ингибировать рост лейкозных клеток и умеренно – рост нормальных кроветворных клеток. Элементы кроветворного микроокружения больных НХЛ со значительным поражением костного мозга проявляют меньшую способность ингибировать пролиферацию опухолевых клеток и более выраженную способность подавлять рост нормальных кроветворных предшественников [40, 42, 147]. Дефицит ядерных миелопролиферативному γ-рецепторов синдрому ретиноевой (МПС) с кислоты приводит увеличением к числа гранулоцитарных/макрофагальных предшественников и с увеличением числа гранулоцитов в периферической крови, КМ и селезенке, которое полностью зависит от костномозгового микроокружения. Этот эффект связан с повышением уровня фактора некроза опухоли альфа (TNFα) в измененном микроокружении КМ [156]. Удаление белка ретинобластомы в кроветворной системе привело к МПС и потере ГСК из костномозговой ниши вследствие мобилизации. Однако эти нарушения не являются внутренними свойствами гемопоэтических клеток, а зависят от роли этого белка во взаимодействии между миелоидными клетками и микроокружением КМ [157]. Инактивация Mib1 (Notch сигнальный путь), также приводила к МПС у мышей и смерти в связи с инфильтрацией органов миелоидными клетками. МПС является зависимым от микроокружения, так как трансплантация кроветворных клеток дикого типа в Mib1-дефицитное микроокружение приводила к миелопролиферации [86]. Кроме того, повторное введение нерегулируемого активного внутриклеточного домена Notch1 у Mib1нулевых мышей привело к сокращению заболеваний. Также МДС с редкими случаями острого миелоидного лейкоза наблюдался у мышей с клетками-остеопредшественниками со 24 специфическими нарушениями синтеза Dicer1, белка необходимого для интерференции РНК [122]. При in vivo конфокальной микроскопии микрососудов в черепе живых мышей были обнаружены прерывистые участки эндотелия с высокой экспрессией E-селектина или SDF-1α, который определенно влияет на хоминг вводимых опухолевых клеточных линий. Нарушение взаимодействия с SDF-1, например, ингибирует хоминг и, в конечном итоге, приживление клеток острого лимфобластного лейкоза линии NALM-6 в этих сосудах. Это позволяет предположить, что молекулярные различия в сосудах могут быть ответственны за дифференциальное приживление опухолевых клеток в микроокружение КМ [139]. В последующих исследованиях было показано, что рост лейкозных клеток в микроокружении КМ повреждает нормальные ГСК в своей нише и уменьшает количество предшественников ГСК и мобилизацию через секрецию фактора стволовых клеток лейкозными клетками, что приводит к "захвату" ниши [57]. Многие публикации последних нескольких лет сосредоточены на защитных эффектах компонентов микроокружения КМ в поддержании жизнедеятельности лейкозных клеток. Микроокружение КМ, как полагают, обеспечивает убежище лейкозным клеткам во время химиотерапии, терапии ингибиторами тирозинкиназы или во время эффекта «трансплантатпротив-лейкемии» после аллогенной трансплантации ГСК. Считается, что микроокружение КМ содержит минимальную остаточную болезнь и обеспечивает сигналы выживания для лейкозных клеток. Это подтверждает тот факт, что уровни транскриптов гена WT1, хорошо известного маркера минимальной остаточной болезни при лейкозе, выше в КM, чем в периферической крови у пациентов с ОМЛ и острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) [69, 169]. С помощью ксенотрансплантационных анализов ОМЛ клеток человека у NOD/SCID мышей авторы показали, что ОМЛ клетки возвращаются в богатые остеобластами области КМ, где они становятся неактивными и защищенными от апоптоза, индуцированного химиотерапией [75]. В последующих исследованиях, авторы описывают, что выход из состояния покоя ОМЛ ЛСК путем введения G-CSF делает их более чувствительными к апоптозу, индуцированному цитостатиками и приводит к устранению лейкозных стволовых клеток и увеличению выживаемости у вторичных реципиентов [129]. Точно так же, показатели полной ремиссии выше (11%) у пациентов с ОМЛ, получающих химиотерапию и G-CSF в комбинированной схеме лечения, по сравнению с пациентами, получавшими только химиотерапию. Это может быть связано с дифференциацией некоторых ОМЛ клеток или расширением функций нейтрофилов, или с отменой защитных воздействий стромы [87]. Регуляция гемопоэза - сложный многоступенчатый процесс, обеспечивающийся стромальными факторами, которые продуцируются непосредственно клеточным 25 микроокружением, а также гормонами, витаминами и гемопоэтическими факторами, вырабатывающимися в других органах (тимус, печень, почки). Регуляторный эффект стромального микроокружения КМ осуществляется путем прямых контактов стромальных клеток с кроветворными предшественниками, а также посредством нарабатываемых стромой гуморальных факторов стимуляции и ингибирования процессов пролиферации и дифференцировки ГСК. Сложная сеть сигнальных путей регуляции ГСК в настоящее время является предметом интенсивных исследований [64, 78, 93-96, 104, 105, 108, 114, 115, 135, 141, 148, 154, 163]. Первые исследования, описывающие ГСК нишу остеобластов, идентифицировали два регулятора их размера: PPR и BMPR1A [48, 175]. Вероятно, что существует намного больше регуляторов ГСК ниш, которые следует открыть в будущих исследованиях. Также возможно, что остеобластные и эндотелиальные ГСК ниши непосредственно влияют друг на друга. В различных исследованиях было показано, что симпатическая нервная система также играет важную роль в регуляции ГСК ниши [26, 82, 83, 92, 107]. Анатомические исследования выявили, что КМ высоко иннервирован как миелинизированными, так и немиелинезированными нервными волокнами, большинство из которых расположены рядом с артериолами в КМ [49, 50, 170]. Результатом хирургического разрыва бедренного нерва являлось сокращение клеточности КМ, сопровождающееся значительной мобилизацией клетокпредшественников [26]. Кроме того, результатом введения мышам нейротоксина 6гидроксидопамина (который блокирует синтез нейротрансмиттера в адреноэргических и допаминэргических нервных волокнах) стало сокращение клеточности КМ [26]. Недавно было показано, что нейротрансмиттер норэпинефрин контролирует как супрессию остеобластов, так и даунрегуляцию экспрессии CXCL12 в клетках кости, которая возникает в ответ на введение G-CSF [83]. Дополнительные исследования на мышиных моделях показали, что циклическое высвобождение ГСК и экспрессия CXCL12 в микроокружении КМ регулировалась циркадной секрецией норэпинефрина посредством симпатической нервной системы [107]. Недавно установлено, что нейротрансмиттеры играют роль в мобилизации, пролиферации и дифференцировке человеческих ГСК [140]. Другие типы клеток, которые имеют возможные роли в регуляции ниши ГСК, включают хондроциты, адипоциты и CXCL12-богатые ретикулярные клетки [52, 77, 143, 156, 157]. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы объяснить, как каждая из этих типов клеток вносит вклад в ГСК нишу. Гемопоэтические клетки также играют роль в регуляции ГСК ниш. Например, было выявлено, что моноциты экспрессируют остеопонтин, который значительно сокращает Notch1 сигналинг в ГСК, совместно культивируемых с поддерживающей линией стромальных клеток КМ, экспрессирующих Jagged1 [76, 97]. Кроме того, полученные из моноцитов остеокласты играют 26 важную роль не только в регуляции активности остеобластов и, следовательно, в потенциальном размере остеобластной ГСК ниши, но повышающаяся концентрация Ca2+, высвобождаемых в течение остеобласт-опосредованной резорбции кости может быть важной для остеобласт-содержащей ГСК ниши [25, 103]. Предполагают, что остеокласты индуцируют ГСК мобилизацию из микроокружения КМ [88]. На сегодняшний день до конца не изучен вопрос о том, существует ли перекрестное взаимодействие между остеобластами и эндотелиальными клетками в ГСК нишах, хотя существует свидетельство того, что эндотелиальные клетки и остеобласты могут регулировать друг друга [66, 144-147]. Ангиопоэтин-1, который экспрессируется линией остеобластов, взаимодействует с Tie-2, экспрессируемым эндотелиальными клетками, чтобы увеличить ангиогенез и сократить проницаемость сосудов [68, 157, 128]. Подобным образом, остеобласты секретируют сосудистый эндотелиальный фактор роста, который также модулирует васкуляризацию и проницаемость эндотелиальных клеток и имеет значение в морфогенезе кости [77, 173]. Также были серии сообщений, описывающих, что периваскулярная ниша является нишей для мезенхимальных стволовых клеток (МСК), предшественников остеобластов [127, 138]. До сих пор неизвестно, имеет ли МСК периваскулярная ниша ту же анатомическую локализацию и функцию, как и ГСК периваскулярная ниша. Определение того, участвуют ли МСК или МСК ниша в изменении ГСК ниши является областью огромного интереса, которая, как ожидается, получит значительное внимание в будущем. Существуют, хотя и мало изучены, доказательства того, что взаимодействие между нишей и гемопоэтическими клетками взаимное. Было выявлено in vitro и in vivo, что в течение 48 часов после стресса, вызванного острым кровотечением, ГСК секретируют костные морфогенетические белки (BMP-2, ВМР-6), направляющие развитие МСК по остеобластной линии [88]. Однако этот ответ проявлялся в меньшей степени у возрастных и страдающих остеопорозом животных. Кроме того, было показано, что мегакариоциты, локализованные вблизи эндоста, стимулируют остеобласты через увеличение содержания BMP-2, BMP-4 и BMP-6. Это доказывает, что гемопоэтические элементы вовлечены в формирование кости и проявляют активность в пределах ниши. Касательно нарушений регуляции гемопоэза при ХЛЛ стоит отметить тот факт, что на сегодняшний день известны лишь единичные работы, в которых изучается эта проблема. Если для апластической анемии, МДС, ОЛЛ, ОМЛ, иммунодефицитных состояний установлено значение дефектов стромы костного мозга в развитии этих заболеваний, то для ХЛЛ не были определены решающие события в изменениях стромального микроокружения, которые могут быть прогностическими факторами для развития заболевания. В литературных источниках встречаются единичные работы посвященные исследованиям костных морфогенетических 27 белков, роли CXCL12-клеток, сигнальных путей в развитии ХЛЛ [5, 20, 29, 70, 80, 148, 161]. При этом особенности структурной организации стромы практически не рассматриваются. Уделяется пристальное внимание плотности сосудов микроциркуляции при инфильтрации костного мозга, и в ряде работ показана значимость этого показателя для развития ХЛЛ [35, 47, 109, 167]. Увеличение плотности сосудов считается неблагоприятным прогностическим фактором. Остается много открытых вопросов о роли микроокружения КМ, как у здоровых лиц, так и при злокачественных состояниях. В исследованиях нормальной ниши ГСК, усилия специалистов в настоящее время сосредоточены на секретируемых или мембраносвязанных цитокинах, рецепторах адгезии, широком спектре факторов связывания внеклеточного матрикса, которые играют роль в гомеостазе ГСК. Динамические отношения между эндостальной и сосудистой нишами и факторы, регулирующие возможность перемещения ГСК и их предшественников между этими нишами должны быть выяснены, как и вопросы о том, какие типы клеток, на самом деле напрямую связываются с ГСК и есть ли другие, возможно, неизвестные типы клеток, которые могут играть важную роль в нише ГСК. Применение этих знаний к нише ЛСК может сообщить о различиях, которые указывают на уязвимость ЛСК. Эти исследования помогут разработать новые способы терапии, которые дополнят наш текущий арсенал по борьбе с заболеваниями системы крови. 28 1.4. Участие стромы лимфоидной ткани в развитии лимфоидных предшественников в норме и ее состояние при малигнизации лимфопоэза В функциональном отношении клетки лимфоидной системы могут быть разделены на три типа: стволовые кроветворные клетки, клетки-предшественники первичных лимфоидных органов, клетки вторичных лимфоидных органов. По темпу клеточного обновления лимфоидная ткань занимает одно из первых мест в организме. Развитие лимфоидных клеток не прекращается всю жизнь - это необходимо для “подстройки” иммунитета к постоянно изменяющейся иммунологической ситуации. Особенность всей лимфоидной системы состоит в том, что в течение всей жизни ее органы объединяют интенсивные клеточные миграции, в ходе которых осуществляется пролиферация и дифференцировка иммунокомпетентных клеток. Эти процессы происходят при условии упорядоченной миграции клеток-предшественников из одних органов кроветворной системы в другие, включая костный мозг, тимус и периферические лимфоидные органы. Стоит отметить, что дифференцировка общих предшественников в разных направлениях (например, в Т- и В-клетки) требует различных несовпадающих местных условий [48]. Основная функция лимфоузлов состоит в обеспечении взаимодействия антигена, который поступает туда по афферентным лимфатическим сосудам, с иммунокомпетентными клетками. В ходе иммунного ответа в структуре лимфоузла происходит ряд изменений, благодаря которым обеспечивается возможность для наибольшего количества лимфоцитов проконтактировать с антигеном и между собой. Структуры лимфатического узла создают условия для направленного, а не случайного взаимодействия разных субпопуляций лимфоцитов и для развития стимулированных антигеном клонов иммунокомпетентных клеток. Группой экспертов ВОЗ предложено выделять в лимфоузле следующие функциональные зоны и структуры: 1. Кортикальный слой с залегающими в нем фолликулами. 2. Паракортикальную зону. 3. Мозговое вещество с мозговыми тяжами. Фолликулы и мозговые тяжи являются тимуснезависимыми областями (В-зона), паракортикальная зона - тимусзависимой областью (Т-зона). Структура и клеточный состав лимфоузлов человека исследовались многими авторами [2, 5, 173]. Непаренхиматозный компонент лимфатических узлов представлен стромальными элементами, характеризующимися структурными и функциональными особенностями. Это, прежде всего, собственно стромальные образования, выполняющие, в основном, опорную и трофическую функцию. В лимфатических уздах они представлены фибробластами, фиброцитами, миоцитами, эндотелиоцитами сосудов, нейрогенными элементами [2]. Наряду с 29 указанными образованиями непаренхиматозные структуры лимфоидной ткани включают в себя группу ретикулярных клеток, которые совместно с выше указанными элементами стромы, а также в сочетании с экстрацеллюлярным матриксом формируют лимфоидное микроокружение, обеспечивающее развитие лимфоидных клеток [153]. При этом необходимо заметить, что ключевая роль развития лимфоидных предшественников принадлежит ретикулярным клеткам и экстрацеллюлярному матриксу. Остальные элементы стромы играют вспомогательную роль. Термин ретикулярные клетки носит собирательный характер и включает 4 основных морфофункциональных типа: гистиоцитарные, дендритные, интердигитирующие и фибробластические ретикулярные клетки. На светооптическом уровне с использованием рутинных окрасок дифференцировать указанные типы практически невозможно, поскольку их морфологические характеристики не четки. Определение принадлежности к определенному варианту требует гистохимических и иммуногистохимических методов анализа [7]. Во всех ретикулярных клетках имеется слабо выраженный гранулярный эндоплазматический ретикулум и мелкие митохондрии. Хроматин в ядрах мелко диспергирован (исключение – фибробластические ретикулярные клетки), это придает ядрам светлый вид. Как правило, в ядрах контурированы крупные ядрышки. Гистохимическое исследование показывает следующее распределение ферментов в ретикулярных клетках: АТФ-аза и неспецифическая эстераза (интердигитирующие); кислая фосфатаза и неспецифическая эстераза (дендритные); кислая фосфатаза и неспецифическая эстераза в большей степени, чем в дендритных клетках (гистиоцитарные); щелочная фосфатаза (фибробластические) [2, 5, 7]. Фибробластные клетки представляют собой главную популяцию стромальных клеток лимфоузла и формируют скелетную конструкцию органа. Они локализованы как в кортикальной зоне, так и в мозговом веществе лимфоузла [2, 5]. В корковом слое эти клетки проходят в непосредственной близости с дном субкапсулярного синуса, а в мозговом формируют трехмерную сеть и находятся в контакте с капиллярами и высокими эндотелиальными венулами, образуя “футляр” вокруг сосудистой стенки. Предполагается, что фибробластные клетки могут быть вовлечены в транспорт молекул из отделов синуса в высокие эндотелиальные венулы или в другие клеточные популяции лимфоидной паренхимы. Отмечено также, что фибробласты активно вырабатывают цитокины, являющиеся посредниками межклеточных взаимодействий и участвующие во многих физиологических и патологических процессах. Гистиоцитарные ретикулярные клетки имеют вид фиксированных макрофагов, почти неотличимых от гистиоцитов и макрофагов костномозгового происхождения, особенно находящихся в лимфатических фолликулах. 30 Фолликулярные дендритные клетки (ФДК) преобладают в корковом веществе лимфоузлов, главным образом, в центрах первичных и вторичных лимфатических фолликулов, являясь клетками специфического микроокружения В-клеточных областей и антигенпредставляющей субпопуляцией клеточных элементов лимфатического узла [5, 8, 11]. Показано, что структура ФДК может изменяться в зависимости от их функциональной активности. Эти клетки способны длительное время удерживать антиген на своей поверхности, регулируя образование В-клеток памяти и предшественников антителоформирующих плазмоцитов. Фолликулярные дендритные клетки имеют характерные морфологические особенности, которые и обусловили их название. Для ФДК характерно овальное ядро средних размеров, сферические митохондрии, незначительное количество пиноцитозных пузырьков и лизосом. Они обладают длинными цитоплазматическими отростками, которые охватывают прилежащие к ФДК лимфоциты, что связывают с участием ФДК в развитии В-лимфоцитов. Рутинными методами окраски дендритные отростки не идентифицируются, но часто они хорошо визуализируются на срезах, окрашенных на IgM, маркирующий иммунные комплексы на поверхности отростков. Их отростки также выявляются окрашиванием на CD21 и CD23 [2, 11, 20]. Дендритные клетки помимо длинных отростков, которыми они соединяются между собой, имеют отчетливо различимые замыкательные комплексы – десмосомы, отличающие эти клетки от интердигитирующих ретикулярных клеток. ФДК представляют собой акцессорные антигенпредставляющие клетки, которые активно участвуют в иммунных реакциях [8, 20, 74]. ФДК играют особую роль в локализации антигена в кортикальных фолликулах лимфоузлов и реакциях зародышевых центров, связанных с сохранением антигена. Антиген, как правило, локализуется на поверхностной мембране длинных отростков цитоплазмы ФДК, вокруг которых образуются скопления лимфоцитов. Встреча любого покоящегося В-лимфоцита с антигеном может произойти в любом участке иммунной системы, но чаще всего это происходит в лимфоидных органах, где антиген фиксируется и длительно удерживается системой ретикулярных клеток. Представление лимфоцитам экзогенных эпитопов осуществляется специализированными антигенпредставляющими клетками, к которым относятся и дендритные клетки лимфатических узлов. Этот механизм осуществляется путем постоянного контактирования лимфоцитов с антигенпредставляющими клетками. Антигенпредставляющие клетки (моноциты/макрофаги, дендритные клетки, В-лимфоциты) захватывают антиген, своей ферментной системой расщепляют его на пептидные фрагменты и в комплексе с молекулами антигенов гистосовместимости II класса (МНС II) представляют его на своей поверхности. Т-хелпер с помощью своего антигенраспознающего рецептора распознает микробные пептиды, 31 располагающиеся в желобке молекулы МНС II класса антигенпредставляющей клетки. СD4рецептор Т-хелпера, расположенный рядом с антигенраспознающим рецептором, также участвует в распознавании комплекса "молекулы МНС II класса/антигенный пептид", расположенный на антигенпредставляющей клетке. Это так называемое двойное распознавание, принцип которого заключается в обеспечении специфического взаимодействия в иммунном ответе только аутологичных клеток. Следствием такого распознавания является образование комплекса из Т-хелпера и антигенпредставляющей клетки, который стабилизируется еще рядом связей между костимулирующими или кофакторными молекулами, взаимодействующими по принципу рецептор-лиганд. К наиболее существенным относятся связи между СD40 и СD80/86 на антигенпредставляющих клетках и СD154 и СD28 на Тхелперах. Следствием этого взаимодействия являются активация Т-хелперов и их пролиферация [120]. Если ФДК считаются компонентом В-зон периферических лимфоидных органов, то интердигитальные тимусзависимых промоноциты и дендритные областях. моноциты, клетки Показано, а сами описываются, как часть микроокружения что предшественниками этих интердигитальные клетки клеток в являются рассматриваются как разновидность макрофагов, потерявших способность к фагоцитозу. Однако в отличие от типичных макрофагов в цитоплазме этих клеток редко встречаются фагосомы и практически не выявляется активность кислой фосфатазы. Интердигитальные ретикулярные клетки имеют бледно окрашивающиеся ядра овальной или удлиненной формы, иногда с инвагинациями довольно сложной конфигурации, и широкую цитоплазму. Эти клетки имеют большое сходство с клетками Лангерганса, но не содержат гранул Бирбека. При иммуноцитохимическом исследовании в них определяется белок S-100 и антиген HLA-DR. Интердигитирующие ретикулярные клетки, в отличие от дендритных, соединяются между собой и другими клеточными элементами при помощи пальцевидных отростков цитоплазмы, входящих между такими же структурами других клеток. Интердигитальные клетки вырабатывают гликопротеиды, которые играют роль гуморальных факторов, способных запускать пролиферацию и бласттрансформацию Тлимфоцитов. По данным Д.Э. Цыплакова иммуногистохимический анализ с использованием меченых моноклональных антител показал, что дендритные ретикулярные клетки экспрессируют протеин S100 и CD35, интердигитальные - протеин S100- и CD1-антигены, фибробластические ретикулярные клетки и макрофаги экспрессируют лизоцим, α1-антихимотрипсин, S100протеин, десмин, пан-цитокератины, виментин, ламинин и коллаген IV типа [2]. 32 Как и в костном мозге, система кровеносных сосудов является важным компонентом лимфатического узла, поскольку из крови в его ткань и обратно осуществляется интенсивная миграция лимфоцитов [2, 5, 11, 17]. Проникшие в узел через его ворота кровеносные сосуды ветвятся в мозговом и корковом слоях. В корковом слое располагаются мелкие венулы, в которые переходят капилляры. Эндотелий посткапиллярных венул построен из высоких клеток, в их цитоплазме часто обнаруживаются лимфоциты. В ходе миграции лимфоциты проходят как между эндотелиальными клетками, так и через их цитоплазму, затем через базальную мембрану и попадают в ткань глубокого кортекса. Эмиграция лимфоцитов из лимфоузлов осуществляется через эфферентные лимфатические сосуды, по которым лимфоциты возвращаются в кровоток. В этих взаимодействиях участвуют селектины, CD44 и интегрины, экспрессированные на лимфоцитах. Селектины (CD62L) связываются с сиалированными углеводами эндотелиоцитов, CD44 – с гиалуронатом, интегрины LFA-1 и VLA-4 с ICAM-1 и VCAM-1 соответственно. Давно установленный факт, что стромальные клетки лимфоидных органов играют инструктивную роль в поддержании нормального лимфопоэза и иммуногенеза, а оценка состояния стромального микроокружения лимфоидной ткани при злокачественной трансформации лимфоидных предшественников имеет принципиальное значение в раскрытии механизмов развития лимфопролиферативных заболеваний, включая ХЛЛ. Как отмечалось выше морфологические и функциональные свойства стромы костного мозга в норме и при различных гемобластозах широко изучены, но имеются лишь единичные работы, посвященные описанию свойств стромальных элементов лимфатических узлов при лимфопролиферативных заболеваниях [1, 5, 8, 19, 20]. Имеется небольшое количество работ по морфологии некоторых клеточных элементов лимфоидного микроокружения при лимфопролиферативных исследовании морфологических особенностей дендритных заболеваниях. ретикулярных Так, при клеток при неходжкинских лимфомах отмечено изменение ультраструктуры ретикулярных клеток. При этом, происходило уменьшение количества лимфоцитов, контактирующих с дендритными ретикулярными клетками, увеличение межклеточных расстояний, перестройки плазматических мембран, изменения ультрацитохимических свойств клеток, в частности, снижение или полное отсутствие реакции на кислую фосфатазу. Отмечено уменьшение количества дендритных ретикулярных клеток в зависимости от гистологического варианта лимфом. Так, лимфомы фолликулярного типа сопровождаются увеличением количества ретикулярных клеток, в то время как при диффузных лимфомах отмечено уменьшение их числа и значительные деструктивные изменения. Данные о вовлечении в патологический процесс дендритных ретикулярных клеток при неходжкинских лимфомах были иммуногистохимических и экспериментальных исследованиях [8, 161]. подтверждены при 33 Важную роль в иммунном ответе играет микроархитектоника лимфатического узла, которая в основном поддерживается ретикулярными клетками и внеклеточным матриксом. Хемокины, продуцируемые ретикулярными клетками, индуцируют хемотаксис и адгезию Тклеток и дендритных клеток на поверхности ретикулярных клеток. В свою очередь, сигналы от лимфоцитов индуцируют ретикулярные клетки к образованию внеклеточного матрикса, который обеспечивает движение и взаимодействие иммунных клеток в лимфатическом узле. Одним из положений теории рака является представление о перестройке стромальных компонентов, создающей более благоприятные условия для злокачественного роста. Известно, что строма реализует свое воздействие на гемопоэтические клетки, как путем непосредственных межклеточных контактов, так и опосредованно, с помощью гуморальных механизмов. При лимфоидных неоплазиях происходят значительные нарушения в системе межклеточных взаимодействий. Клетки микроокружения являются главным источником цитокинов – пептидов, обеспечивающих регуляцию пролиферации, дифференцировки и апоптоза гемопоэтических лимфопролиферативных клеток. заболеваний Отмечено, весьма что роль значительна. цитокинов К примеру, в патогенезе известно, что пролиферативная активность стромы лимфоузлов у больных неходжкинскими лимфомами не зависит от морфологического варианта заболевания, а связана с продукцией цитокинов, в частности ФНО-α стромальными элементами лимфатических узлов. У пациентов с ХЛЛ повышена секреция стромой лимфатических узлов ИЛ-6 и ИЛ-4 in vitro [5], что отражает участие данных веществ в патогенезе данных заболеваний. Применение химиотерапии снижает продукцию ИЛ-4 in vivo, что может быть благоприятным фактором, учитывая особенность ИЛ4 ингибировать апоптоз опухолевых клеток. Также были показаны различия в экспрессии внутриклеточного ИЛ-8 клетками опухолевого клона и нормальными В-лимфоцитами, что имеет клиническое значение [23]. Методом проточной цитофлуориметрии выявлено, что у больных с доброкачественным течением заболевания уровень ИЛ-8 на клетках опухолевого клона составил 0,67 ± 0,20%. У больных с прогрессирующей формой заболевания экспрессия ИЛ-8 была выше и равнялась 16,72 ± 5,08% (р<0,05). У доноров крови экспрессия ИЛ-8 Влимфоцитами составила 0,46 ± 0,20 %. Скорее всего, высокие уровни экспрессии ИЛ-8 опухолевыми клетками у больных с прогрессирующей формой заболевания подтверждают способность этого цитокина влиять на процесс аккумуляции лейкозных клеток, способствуют опухолевому росту и прогрессии заболевания [23]. При лимфоидных неоплазиях, как и при других онкологических заболеваниях, малигнизированные клетки секретируют разнообразные факторы роста и онкобелки, способные стимулировать пролиферацию фибробластов, гладкомышечных клеток и эндотелиальных клеток из их предшественников, а также усиливать синтез и секрецию зрелыми клетками 34 компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Стромообразование в опухоли является результатом взаимодействия между опухолевыми клетками и клетками соединительной ткани гистиогенного и гематогенного происхождения. Показано, что при лимфоидных малигнизациях снижается количество ретикулярных клеток и клеток эндотелия сосудов. Вероятно лимфоидные малигнизации оказывают деструктивный эффект на некоторые стромальные элементы. Таким образом, гиперпластический рост стромы не всегда ассоциирован с более тяжелым клиническим течением заболевания, что может быть обусловлено как разнообразием непосредственного взаимного влияния опухолевых гемопоэтических и стромальных клеток, так, в некоторых случаях, и изменением выработки цитокинов, обеспечивающих ускоренную пролиферацию стромы. Существует множество установленных и предполагаемых взаимодействий между клетками стромы и паренхимы гемопоэтической и лимфатической систем [73, 161]. Хорошо известно, что клетки стромы костного мозга играют ключевую роль в хоуминге, пролиферации и дифференцировке клеток-предшественниц гемолимфопоэза. Таким же образом, эпителиальные клетки тимуса модулируют пролиферацию и дифференцировку Т-лимфоцитов. Что касается лимфатических узлов, значительные исследования были посвящены дендритным клеткам, которые презентируют антиген и участвуют в инициации Т - зависимых клеточных ответов. Работы, посвященные изучению дендритных клеток (ДК) при некоторых формах опухолей, показали, что количество и иммунофенотип ДК, их распределение в опухолевой и непораженной ткани отражаются на прогнозе этих новообразований. ДК являются гетерогенной группой, в зависимости от происхождения их делят на миелоидные ДК (мДК) и плазмоцитоидные ДК, инициирующие разные типы клеточного ответа – Тх1 или Тх2 [8, 120]. В зависимости от функционального состояния ДК могут быть подразделены на незрелые и зрелые. Основной функцией незрелых ДК является захват антигенов, в том числе опухолевых, путем эндоцитоза и фагоцитоза, а также выработка цитокинов, привлекающих и активирующих клетки врожденного иммунитета, что позволяет отграничить распространение повреждающего фактора. Созревание ДК, в процессе которого они становятся наиболее активными антигенпрезентирующими клетками иммунной системы, сопровождается потерей эндоцитарных и фагоцитарных рецепторов, изменением морфологии, секрецией молекулкостимуляторов (CD40, CD80, CD86) и разнообразных хемокинов и цитокинов, варьирующих в зависимости от типа чужеродного антигена и вида клеток, которые вовлекаются в иммунный ответ. ДК играют в норме важную роль в формировании микроокружения кроветворных клеток костного мозга и лимфоидной ткани. Иммунофенотип незрелых мДК: CD1+, низкая экспрессия 35 CD83, CD208(DC-LAMP)-, CD209(DS-SIGN)+, цитоплазматический MHC II. Иммунофенотип зрелых мДК: CD1+-, высокая экспрессия CD83, CD208(DC-LAMP)+, CD209(DS-SIGN)-, мембранная экспрессия MHC II [2]. ДК считаются наиболее важным фактором, определяющим состав лимфоидной популяции и влияющим на регулирование функциональной активности лимфоидных клеток. Они могут создавать не только противоопухолевые, но и проопухолевые стимулы. Так, ДК совместно с TGFβ способствуют дифференцировке предшественников FoxP3-клеток в зрелые CD4+ FoxP3-клетки. С другой стороны, ДК не только презентируют опухолевые антигены натуральным киллерам и цитотоксическим клеткам, которые обеспечивают противоопухолевый иммунитет, но и принимают непосредственное участие в элиминации опухолевых клеток [8]. Стоит отметить, что ХЛЛ характеризуется большим количеством CD5+ долгоживущих клеток в костном мозге, крови и вторичных лимфоидных органах [1, 125, 126]. На сегодняшний день, принято считать, что устойчивость к апоптозу и избирательное выживание опухолевых клеток не только автономная характеристика, но зависит от внешних антиапоптозных стимулов. Это подтверждается тем фактом, что, несмотря на их долгую жизнь in vivo, ХЛЛ клетки часто уходят в апоптоз в условиях in vitro. Это также позволяет предположить, что в условиях in vitro клетки не получают сигналов выживания, которые присутствуют в микроокружении in vivo. Некоторые сигналы, исходящие от стромальных и Т клеток костного мозга, как оказалось, усиливают рост и продлевают жизнь ХЛЛ клеток [31, 45, 47]. Не так давно было отмечено, что внеклеточный тиоредоксин защищает ХЛЛ клетки от апоптоза in vitro [33, 126]. Тиоредоксин является мультифункциональным белком, который повсеместно экспрессируется в небольшом количестве во всех клетках тела. Внутриклеточный тиоредоксин имеет как антиапоптотический эффект так и ростовой эффект. Некоторые клетки способны высвобождать тиоредоксин. Эта внеклеточная форма тиоредоксина имеет цитокиновую и хемокиновую активности [33, 71, 130]. Было показано, что Т-клетки в микроокружении ХЛЛ подавляют апоптоз опухолевых клеток. Также было показано, что хотя Т-клетки продуцировали интерферон гамма и ИЛ-4, экспрессия тиоредоксина в этих клетках не была повышена. Стромальные клетки лимфоидной ткани также присутствовали в центрах пролиферации ХЛЛ. Интересно, что экспрессия тиоредоксина коррелировала с присутствием как стромальных клеток, так и с пролиферирующими Ki-67-клетками опухоли, причем размер и число пролиферативных центров варьировало от пациента к пациенту. У пациентов с большим соотношением пролиферирующих клеток Ki-67+, тиоредоксинэкспрессирующие клетки были главным образом локализованы рядом с Ki-67+ и окружены ими, указывая на то, что тиоредоксин является потенциальным фактором выживания опухоли [23, 58]. Было показано, что 36 стромальные клетки опухоли не только экспрессировали тиоредоксин, но некоторые из них секретировали его ex vivo. Интересно, что стромальные клетки костного мозга и клетки-няньки были также способны секретировать тиоредоксин, таким образом, секреция тиоредоксина стромальными клетками лимфатического узла не является тканеспецифичной. Детальный механизм тиоредоксин-опосредованного увеличения выживаемости неопластических клеток при ХЛЛ еще предстоит изучить, хотя известно, что это белок влияет на некоторые окислительно-регуляторные функции и ассоциирован с большим количеством белков-мишеней, модулируя их трехмерную структуру и функции и катализируя тиолдисульфидные обменные реакции. Тиоредоксин является ключевым белком в индуцировании синтеза нескольких цитокинов, включая ИЛ-4, интерферон γ и TNFα, которые, как известно, влияют на выживаемость неопластических клеток при ХЛЛ [30, 46]. Исторически, ХЛЛ был описан как аккумуляторное заболевание клеток с дефектом апоптоза. Согласно данной точке зрения, большинство ХЛЛ клеток периферической крови имеют остановку клеточного цикла в G0/G1 фазе [41, 125]. Однако недавние исследования с использованием маркера клеточного цикла Ki67 показали, что ХЛЛ пролиферация возникает в костном мозге и вторичных лимфоидных органах. Сигналы, которые контролируют клеточную пролиферацию, остаются неизвестными, так как большинство in vitro систем не способны поддержать ХЛЛ пролиферацию клеток. При культивировании in vitro, ХЛЛ клетки быстро вступают в апоптоз, если они не контактируют со стромальными клетками, или, если не добавить растворимых факторов. In vitro огромное количество различных молекул могут увеличить выживаемость ХЛЛ клеток, но на ограниченное время, что указывает на отсутствие важных факторов, которые присутствуют in vivo [47, 74]. Согласно данным Д.Э. Цыплакова и соавт., исследовавших влияние кровеносного микроциркуляторного русла на клеточный иммунный ответ в лимфатических узлах, регионарных к злокачественным опухолям, сосудистое русло лимфатических узлов играет двоякую роль. С одной стороны, на ранних этапах развития опухоли происходит активация Тклеточных иммунных реакций с усилением рециркуляции лимфоцитов через посткапиллярные венулы и превращением их путем бласттрансформации в цитотоксические Т-киллеры, что, вероятно, сдерживает процесс метастазирования. С другой стороны, на более поздних стадиях опухолевого роста изменения сосудистой стенки и циркуляторные расстройства сопровождаются отложением внутри- и внесосудистого фибрина, затрудняя тем самым рециркуляцию лимфоцитов и, следовательно, приводят к уменьшению числа трансформированных Т-киллеров, способных уничтожать попадающие в лимфатический узел опухолевые клетки, что, по мнению авторов, предопределяет процесс метастазирования. При появлении в лимфатических узлах метастазов фибрин уже способствует их закреплению в 37 лимфоидной ткани, а также изолирует от цитотоксического действия оставшихся в небольшом количестве Т-эффекторов [2]. На данный момент мы владеем разрозненными данными, говорящими нам о существенной роли стромального микроокружения в лимфатических узлах в норме и при становлении ХЛЛ. При этом отсутствует целостное представление о структурных особенностях лимфоидной стромы при нарушениях пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов. Дальнейшее особенностей, изучение лимфоидного адгезивных микроокружения, взаимодействий с его использованием морфофункциональных современных методов структурного анализа, во-первых, позволит идентифицировать функциональные субпопуляции стромальных клеток, во-вторых, может способствовать поискам новых методов лечения гемобластозов и лимфопролиферативных заболеваний. По литературным данным известны некоторые гистологические изменения костного мозга при ХЛЛ, однако, описанные изменения не отражают в полном объеме характер вовлечения нишеобразующих структур в патологический процесс. Во многих исследованиях стромы костного мозга и лимфоидных органов при патологических состояниях кроветворения акцент делается на отдельные структурные элементы микроокружения, большинство исследований проводится in vitro. Данные, касающиеся морфофункциональных изменений гемопоэтической ниши в костном мозге и нишеобразующих структур в лимфатических узлах, представлены в разобщенных исследованиях на разных группах пациентов. Нами была поставлена задача на основе комплексного исследования охарактеризовать морфофункциональные особенности стромальных элементов кроветворного и лимфоидного микроокружения, участвующих в формировании ниши ГСК и лимфоидных клетокпредшественниц, и оценить роль стромальных изменений в патогенезе ХЛЛ. Подобный анализ до настоящего времени не проводился. 38 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Общая характеристика пациентов В настоящей работе проанализированы 112 пациентов с ХЛЛ, которые находились на лечении в отделении гематологии ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России с января 2000 г. по сентябрь 2014 г. Диагноз ХЛЛ устанавливали на основании общепринятых критериев. Диагностические критерии ХЛЛ включают инфильтрацию костного мозга популяцией CD5+ В-лимфоцитов и наличие в периферической крови лимфоцитоза (не менее 5*109/л моноклональных В-клеток) на протяжении ≥ 3 мес. В аспирате костного мозга инфильтрация лимфоцитами не менее 30%. Пациентам были определены стадии заболевания по классификации Rai (таблица 1). Таблица 1. Система стадирования ХЛЛ по Rai (1975) Стадия заболевания Клинико-лабораторные показатели 0 Только лимфоцитоз в периферической крови и костном мозге 1 Лимфоцитоз и лимфаденопатия 2 Лимфоцитоз и гепатомегалия, спленомегалия или наличие гепато- и спленомегалии одновременно; +/- лимфаденопатия Лимфоцитоз и анемия (гемоглобин <110 г/л); +/- лимфаденопатия; 3 спленомегалия, гепатомегалия Лимфоцитоз и тромбоцитопения (тромбоцитов <100*109/л); +/- анемия 4 (гемоглобин <110 г/л); органомегалия Всем больным было проведено общеклиническое обследование, включающее современные общепринятые методы диагностики онкогематологических заболеваний: - гемограмма с определением содержания гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов с подсчетом лейкоформулы и тромбоцитов (окраска по стандартной методике по РомановскомуЛейшману); - биохимический анализ крови; - цитогенетические исследования костного мозга и периферической крови; - FISH-исследование костного мозга и периферической крови TP53, LSI ATM (11q22), LSI (13q14), CEP12; - иммуноглобулины сыворотки, β2-микроглобулин; - миелограмма, выполненная по общепринятой методике; 39 - иммунофенотипирование лимфоцитов (периферическая кровь и костный мозг) на проточном цитофлуориметре с использованием моноклональных антител CD5, CD19, CD20, CD23, CD43, CD81, HLA-DR, IGD, CD11c; - рентгенография органов грудной полости; - УЗИ и компьютерная томография органов грудной полости, брюшной полости и забрюшинного пространства, малого таза. Морфологическая диагностика ХЛЛ проиводилась в отделении патологической анатомии ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России по результатам гистологического и иммуногистохимического исследований опухолевой ткани в соответствии с критериями классификации опухолей кроветворной и лимфоидной тканей Всемирной Организации Здравоохранения 2008 года. Характеристика пациентов представлена в таблице 2. Таблица 2. Характеристика пациентов с хроническим лимфолейкозом Параметры Пациенты n=112 Возраст, годы (минмакс) Медиана 49-73 60 Пол Мужской 64 Женский 48 Стадия по Rai, колво: 0-1 21 2 35 3-4 56 Материалом исследований послужили полученные до начала терапии трепанобиоптаты подвздошной кости 96 больных ХЛЛ (56 мужчин и 40 женщин) в возрасте от 49 до 73 лет (средний возраст группы 59,9±7,2 лет, медиана 60) и биопсии лимфатических узлов 61 больного (33 мужчины и 28 женщин) той же возрастной группы (средний возраст группы 60,8±6,8 лет, медиана 61). Группу сочетанного анализа составили трепанобиоптаты и биопсии лимфатических узлов от 45 пациентов (28 мужчин и 17 женщин, средний возраст группы 40 59,9±7,7 лет, медиана 60). Контрольную группу при изучении костного мозга составили фрагменты подвздошной кости 30 здоровых лиц 50-70 лет (средний возраст группы 58,2±5,6 лет, медиана 58). Группой сравнения при анализе стромы лимфатических узлов служили биоптаты лимфатических узлов 20 лиц в возрасте 48-70 лет (средний возраст группы 62,7±6,2 лет, медиана 63) с неопухолевой реактивной неспецифической лимфаденопатией. Контрольная группа пациентов сопоставима по полу, возрасту и национальности с основной группой. Материал от пациентов, сформировавшие контрольную группу для анализа лимфатических узлов, был предоставлен из ФГБУ «СПб НИИФ» МЗ РФ, «НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина» СЗГМУ им. И.И.Мечникова, ФГБУЗ «СПб клиническая больница РАН». При проведении диагностических исследований, во всех случаях было установлено, что лимфатические узлы являются реактивными, без признаков опухолевого роста, метастазов, вирусного поражения. Пациенты контрольной группы для анализа костного мозга составили доноры костного мозга ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России 2000-2014 гг. 41 2.2. Методы исследований При проведении трепанобиопсии забор губчатого вещества костной ткани осуществлялся иглой Jamshidi или Islam из задней ости подвздошной кости. Для исследования получали столбик костной ткани не менее 2 см длиной, поскольку субкортикальные лакуны не отражают состояние кроветворения. Фиксация и декальцинация трепанобиоптатов осуществлялась с использованием набора Mielodec (BioOptics, Италия). В состав набора входил фиксатор (формалин с хлоридом ртути) и декальцинатор на основе ЭДТА в кислотном буфере. Трепанобиоптат помещали в фиксатор на 90 минут, затем промывали 70º этанолом 30 минут с последующим помещением в декальцинирующую жидкость на 90-120 минут. Биоптаты лимфатических узлов фиксировались в 10% нейтральном забуференном формалине. Объем фиксирующей жидкости в 20 раз превышал объем фиксируемого объекта. Общее время фиксации при комнатной температуре (около 20ºС) было не менее 24 часов. Трепанобиоптаты и лимфатические узлы обезвоживались и пропитывались парафином по общепринятой стандартной методике. Гистологическая проводка осуществлялась с помощью автоматического вакуумного процессора Tissue-Tek Vip 5Jr (Sakura, Япония). Обезвоживание осуществлялось с помощью готового раствора IsoPREP (БиоВитрум, Россия) абсолютизированный изопропанол 99,7%-ной концентрации с добавкой оксилфеноксиполиэтоксиэтанола (Тритон Х15) в соотношении 1:10000. Для пропитывания обезвоженной ткани и приготовления блоков применяли среду НISTOMIX. Использовали следующий протокол гистологической проводки: - 4 смены раствора IsoPREP, время экспозиции в каждой смене 1 час; - 2 смены раствора IsoPREP, время экспозиции в каждой смене 1 час 30 мин; - 2 смены HISTOMIX, время экспозиции в каждой смене 1 час; - 2 смены HISTOMIX, время экспозиции в каждой смене 2 часа. Длительность обработки на каждом этапе, указанные выше, одинаковы как для проводки лимфатических узлов, так и для трепанобиоптатов костного мозга. С использованием ротационного микротома Accu-cut SRM (Sakura, Япония) изготовляли срезы толщиной не более 4 мкм, которые в дальнейшем депарафинировали, гидратировали, окрашивали гистологическими, гистохимическими и иммуногистохимическими методами по общепринятым стандартным методикам. При анализе трепанобиоптатов применялись окраски гематоксилин-эозин, азур-II-эозин, импрегнация серебром, по Массону. 42 При анализе лимфатических узлов применялись следующие окраски - гематоксилинэозин, азур-II-эозин, импрегнация серебром. Иммунногистохимические реакции проводили по стандартной методике, основываясь на рекомендациях фирмы-производителя первичных антител. В ходе работы был подобран оптимальный протокол. Срезы помещали на стекло с полилизиновым покрытием, высушивали в термостате в течение 18 часов при 37°С, депарафинировали, гидратировали и производили демаскировку антигена в цитратном буфере рН 6,0 на водяной бане при 97°С 30 минут, для некоторых антител демаскировка в буфере рН 9,0 97°С 20 минут. Эндогенную пероксидазную активность ликвидировали инкубацией в течение 6 минут в растворе, блокирующем пероксидазу (EnVision, Dako, Дания). Панель первичных антител, используемая в исследованиях, представлена в таблице 3. Для визуализации использовали полимерную систему EnVision (Dako, Дания) с диаминобензидином (DAB), инкубация с системой 30 минут при комнатной температуре, с DAB 5 минут при комнатной температуре. Препараты докрашивали гематоксилином, дегидратировали в спиртах, просветляли в ксилоле и заключали в БиоМаунт (Bio-Optica, Италия). Проводили общепринятые отрицательные и положительные контрольные процедуры при обработке параллельных срезов. Отрицательный контроль проводился с заменой первичных антител на ТBS-буфер. Все полученные препараты оценивались визуально с помощью микроскопа Nikon Eclipse E200 со встроенной фотокамерой с окуляром х10, при объективах х20, х40. Морфометрические исследования паренхиматозных и стромальных элементов кроветворной и лимфоидной ткани трепанобиопсий костного мозга и биоптатов лимфатических узлов осуществлялись с использованием пакета программ «ВидеоТесТ-Морфология 5.2» (Россия). Анализ гистологических препаратов проводился в 20 полях зрения при увеличении 20х для каждого образца. Уровень экспрессии Ki-67 определяли, как процент клеток имеющих специфическое окрашивание. Для оценки экспрессии Zap70 применяли балльную систему. Визуально оценивали интенсивность окраски клеток в баллах от 0 до 2 (отрицательная, слабая, сильная). Количество эндостальных клеток определяли, как количество клеток на единицу длины костной трабекулы. Удельная плотность микрососудов определяли путем вычисления процента площади занимаемой сосудами (имеющей специфическое окрашивание) к общей площади ткани в поле зрения. 43 Таблица 3. Маркеры, использованные в иммуноморфологическом исследовании Маркер Выявляемые структуры Клон Фирма производитель CD 23 Дендритные клетки, Вклетки SP23 Dako CD 21 Дендритные клетки, Вклетки 1F8 Dako CD 35 Дендритные клетки, Вклетки, гранулоциты, часть NK-клеток Ber-Mac-DRC Dako FDC Дендритные клетки CNА.42 Dako Фасцин Дендритные клетки 55-K2 Dako Ламинин Ламинин 4C7 Dako Десмин Десмин D33 Dako Коллаген I типа Коллаген I типа COL-I Abcam Коллаген III типа Коллаген III типа Polyclonal Abcam Коллаген IV типа Коллаген IV типа CIV 22 Dako CD34 Class II Эндотелий, ранние миелоидные клетки QBEnd 10 Dako CD31 Эндотелий, гранулоциты, часть Т-клеток JC70A Dako vWF Эндотелий Polyclonal Dako Ki-67 Маркер пролиферации MIB-1 Dako Zap70 Т-клетки, опухолевые клетки при ХЛЛ 2F3.2 Dako CD146 Эндостальные, периваскулярные клетки Polyclonal Spring Bioscience 44 2.3. Методы статистической обработки Статистическая обработка полученных данных проводилась методом вариационной статистики с определением средней величины М, ее средней ошибки m, стандартного отклонения SD. Достоверность различий оценивалась с помощью критерия Стьюдента (t), критерия Манна-Уитни. Различие между сравниваемыми показателями считалось статистически значимым при р ≤ 0,05. Для выяснения зависимости между показателями применялся корреляционный анализ. Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием программ Statistica v.6.0, MedCalc, Microsoft Excel для Windows ХР. 2.4. Объем проведенных исследований В ходе исследования произведена оценка 3658 гистологических препаратов. Таблица 4. Количество проведенных исследований Методы исследования Костный мозг Лимфатические узлы Гематоксилин-эозин 145 87 Азур-II-эозин 95 71 Импрегнация серебром 122 77 Массон 95 71 1617 1278 Иммуногистохимия 45 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Нишеобразующие структуры стромального микроокружения костного мозга в норме Структурная организация паренхимы костного мозга и образований участвующих в формировании гемопоэтической ниши контрольной группы была изучена в цельных фрагментах подвздошной кости 30 здоровых лиц (средний возраст группы 58,2±5,6 лет, медиана 58). При микроскопическом исследовании гистологических препаратов материал был представлен периостом, кортикальной пластинкой и губчатой костной тканью. Несмотря на возраст, кортикальная кость содержала хрящевую ткань. Как известно, вариант развития кости на месте хряща является обязательным условием, при котором костная ткань способна поддерживать кроветворение. Костномозговые пространства губчатого вещества были заполнены жировой и кроветворной тканью в равных соотношениях у всех лиц до 60 лет (n=22), незначительное увеличение в пределах лакун объема жировой ткани наблюдалось у лиц возрастной группы 60-70 лет (n=8) (рис. 2). Среди адипоцитов располагались клетки трех линий миелопоэза на всех стадиях развития. Отмечался нормобластический тип эритропоэза. Клетки на стадии эритронормобластов располагались в центральных отделах костных лакун с наличием макрофагов среди скоплений указанных клеток, имелась тенденция расположения вызревающих форм вблизи сосудов. Зрелые гранулоциты были диффузно рассеяны среди адипозной ткани костномозговых лакун. Отчетливо прослеживалась топографическая взаимосвязь расположения миелобластов и промиелоцитов в субэндостальных зонах костномозговых пространств, зачастую незрелые клетки располагались на поверхности костных балок. В центральных отделах бластные формы гранулоцитопоэза обнаруживались редко. Мегакариоцитарный росток был представлен генерацией мегакариоцитов крупных и средних размеров с гиперглобулярными ядрами. Небольшое количество лимфоцитов располагалось диффузно в паренхиме костного мозга. Следует отметить, что в костномозговых пространствах подвздошной кости здоровых лиц обнаруживались скопления лимфоцитов, формирующих образования типа лимфоидных фолликулов, преимущественно отмеченные реактивные лимфоидные структуры были выявлены у лиц в возрасте 65-70 лет. Реактивные нодулярные инфильтраты костного мозга здоровых лиц, в отличие от неопластического нодулярно-очагового поражения костного мозга при ХЛЛ, имели гистологические признаки, отличающие их от опухолевых инфильтратов. 46 Реактивные нодулярные скопления в костном мозге имели четкие границы; разнообразный клеточный состав, включавший малые и крупные лимфоциты, иммунобласты, гистиоциты. А Б Рисунок 2. А) Костный мозг здорового человека, три ростка гемопоэза, 100х. Б) Участок кортикальной кости, 200х. Рисунок 3. Импрегнация серебром, ретикулиновый каркас костного мозга здорового человека, 100х. 47 Указанные структуры содержали сосуды, иногда обнаруживались центры размножения. Отсутствовали признаки ретикулинового фиброза. Ретикулиновый каркас костного мозга здоровых лиц при импрегнации препаратов серебром был представлен отдельными тонкими небольшими нитями ретикулиновых волокон, ориентированных в разных направлениях и не имевших пересечений. Помимо сетчатого каркаса, ретикулиновые нити образовывали утолщенные тяжи возле сосудов (рис. 3). Наряду с клеточными элементами гемопоэтической ниши нами были проведены ИГХ исследования коллагенов I, III и IV типа, так как они являются основными структурными белками экстрацеллюлярного матрикса, принимающими участие в морфогенезе. Во всех случаях костные трабекулы экспрессировали коллаген I типа, в 16 случаях наблюдалась выраженная экспрессия коллагена III типа, в основном в субэндостальных участках и рядом с крупными сосудами, коллаген IV типа экспрессировали сосуды с хорошо выраженной базальной мембраной. Один из элементов стромального микроокружения, образующих нишу стволовых клеток – микроциркуляторное русло (МЦР) – в костном мозге был представлен синусоидальными сосудами различного калибра и формы, а также сетью микрососудов интрамедуллярных и эндостальных зон костномозговых пространств подвздошной кости. Синусы - тонкостенные сосуды, которые на разрезе имели вытянутую, овальную или круглую форму (рис. 4). По калибру синусоидальные сосуды можно разделить на три вида: мелкие, средние, крупные. Мелкие и средние синусоиды были преимущественно удлиненной и вытянутой формы. Более редко встречающиеся крупные синусоидальные сосуды имели округлые очертания. Их площадь в срезах подвздошной кости не превышала 5%. Как правило, просветы синусоидов заполнены преимущественно эритроцитами. Ядросодержащие клетки, в основном, зрелые гранулоциты, практически не обнаруживались или выявлялись в небольшом количестве. При гистологическом исследовании стенка синусоида состояла из одного слоя вытянутых эндотелиальных клеток двух морфологических типов: уплощенные клетки с узкой полоской цитоплазмы и плоскими ядрами, и эндотелиоциты с крупными ядрами, выбухающие в просвет синуса. Структурные различия эндотелиальных клеток, по-видимому, определяют функциональное состояние синусов в целом. При ИГХ окраске на ламинин и коллаген IV типа выявлялась тонкая прерывистая базальная мембрана. В сравнении с другими сосудами базальная мембрана синусоидов выражена значительно слабее, а в некоторых участках синусоидальной стенки она не просматривалась. Помимо синусов, которые играют огромное значение для регуляции гемопоэза, образуют гистогематический барьер, пропускают и секретируют функционально активные вещества, 48 Рисунок 4. Крупный синусоидальный сосуд в костном мозге здорового человека, 200х. была изучена плотность сосудов МЦР, так как этот существенный маркер ангиогенеза необходим для оценки состояния кроветворной ниши при малигнизации гемолимфопоэза. При ИГХ исследованиях сосудов интрамедуллярной паренхимы использовалась панель антител (CD34 class II, CD31, vWF). В контрольной группе удельная площадь микрососудов при применении указанной панели антител была следующей: CD34 class II - 9,1±1,2 %, CD31 10,4±1,4 %, vWF - 6,5±0,5 % (рис. 5). Для дальнейших исследований нами были выбраны данные, полученные с использованием антитела CD34 class II. Методами статистического анализа было определено, что эти данные ближе всего к средним величинам площади МЦР у всех исследованных пациентов. Таким образом, система микроциркуляции костного мозга существенно отличается от кровоснабжения других органов и тканей. Это, прежде всего, связано с наличием в МЦР костномозговой паренхимы синусоидальных сосудов. Указанная структурная организация определяет функцию костного мозга как кроветворного органа, регулируя трансвазальное прохождение биологически активных веществ и зрелых клеток крови, а также, что особенно важно, обеспечивает миграцию ГСК из экстравазальных пространств в циркуляцию и обратно. 49 Рисунок 5. Сосуды микроциркуляторного русла в паренхиме костного мозга здорового человека. ИГХ CD34 cl.II, 100х. Активный костный мозг подвздошной кости человека расположен в интрамедуллярных пространствах губчатого морфологическом вещества, исследовании сформированного трепанобиоптатов костными контрольной трабекулами. группы При выявлялись анастомозирующие между собой костные балки правильной формы с ровными гладкими краями. ИГХ анализ костного матрикса с использованием антител к коллагену I типа выявил равномерное распределение белка по всей поверхности срезов костных трабекул подвздошной кости. Площадь трабекул губчатого вещества подвздошной кости здоровых лиц составляла 21,0±2,4%. Поверхность костных балок была покрыта сплошным слоем эндостальных клеточных элементов, среди которых представлялось возможным выделить клетки двух типов. Первые характеризуются резко уплощенной и вытянутой формой, с удлиненными темными ядрами и тонкой полоской базофильной цитоплазмы. Значительно реже наблюдаются клетки второго типа – полигональной формы, с более заметной базофильной цитоплазмой и с круглыми, чаще всего эксцентрично расположенными ядрами. При морфометрическом исследовании количество эндостальных клеток составило 1,4±0,2 клеток на единицу длины костных трабекул (рис. 6). 50 Рисунок 6. Клетки эндостальной зоны костного мозга здорового человека, 200х. Как известно CD146+ стромальные клетки участвуют в остеогенезе, их присутствие необходимо для становления гемопоэза. В исследованной контрольной группе CD146+ клетки определялись непосредственно на эндостальной поверхности или субэндостально (слабая экспрессия) и периваскулярно (сильная экспрессия) рядом с сосудами МЦР. В процентном соотношении к площади гемопоэтической ткани количество CD146+ не превышало 2,5±0,3%, при этом важно отметить тот факт, что в большинстве наблюдений вблизи CD146+ клеток располагались CD34+ клетки и сосуды МЦР (рис.7). У здоровых лиц чаще всего молодые кроветворные клетки преимущественно гранулоцитарного ряда (миелобласты, промиелоциты) определялись вблизи трабекулярной поверхности в тех местах, где на эндосте располагались клетки второго типа. Более зрелые клетки располагались в отдалении от эндоста и, по мере созревания, происходило смещение зрелых гранулоцитов в центральные отделы костномозговых пространств. Также было установлено, что состояние эндостальных клеток в различных участках поверхности костных балок варьировало. Прежде всего, было выявлено, что состояние клеток эндоста зависело от присутствия в эндостальной зоне молодых гемопоэтических клеток гранулоцитарного ростка. В тех зонах, где отмечались признаки повышенной гемопоэтической 51 активности, эндостальная зона отличалась увеличенным количеством стромальных клеток. Преимущественно в таких зонах выявлялись CD34+ клетки. Рисунок 7. Экспрессия CD146 клетками субэндостальной зоны костного мозга здорового человека, 200х. Стрелками указаны Cd146+ клетки на эндостальной поверхности костной балки. Считается, что эндостальные клетки играют роль селективно проницаемой мембраны, регулирующей ионный обмен между костным матриксом и интрамедуллярной средой. Известно, что кость является хранилищем минеральных солей, часть из которых крайне необходима для процессов кроветворения. В частности важное значение имеет обмен кальция, ионы которого играют существенную роль в регуляции гемопоэза. Кроме этого, костные трабекулы являются хранилищем коллагена I типа, ключевого белка, определяющего клеточный морфогенез не только в эмбриональном периоде, но и у взрослых. Наконец, учитывая способность стромальных эндостальных клеток формировать экстрацеллюлярный матрикс и выделять гуморальные факторы регуляции гемопоэза, а также, то обстоятельство, что эндостальная зона хорошо васкуляризирована, становится очевидным важное значение указанных образований в поддержании жизнедеятельности и дальнейшего развития стволовых кроветворных клеток. 52 Таким образом, исследование подвздошной кости с применением современных гистологических методов, в том числе ИГХ, дает возможность проанализировать не только гистоархитектонику функциональной паренхимы костного мозга, но и детально оценить стромальные нишеобразующие элементы гемопоэтической ниши – систему микроциркуляциии, а также клеточные и внеклеточные образования эндостальной зоны губчатой кости. Совершенно очевидно, что структурная организация МЦР и эндостальных зон костной ткани в сочетании с их функциональным потенциалом способны определять ключевую роль указанных элементов стромы костного мозга в поддержании жизнедеятельности ГСК. 53 3.2. Паренхима и формирующие нишу стволовых клеток стромальные образования костного мозга при ХЛЛ Анализ гистологических препаратов подвздошной кости 96 больных ХЛЛ (56 мужчин и 40 женщин) в возрасте от 49 до 73 лет (средний возраст группы 59,9±7,2 лет, медиана 60) свидетельствовал об изменении клеточного состава интрамедуллярной кроветворной паренхимы и указывал на структурные перестройки стромального микроокружения, включая образования, формирующие нишу для стволовых кроветворных клеток – сосуды МЦР и клеточные элементы, располагающиеся на поверхности костных трабекул, а также интрамедуллярный экстрацеллюлярный матрикс эндостальных зон. При изучении паренхимы костного мозга была отмечена неоднородность специфической опухолевой инфильтрации интрамедуллярных пространств. На основании гистологических исследований губчатой кости больных ХЛЛ в паренхиме костного мозга было выделено три типа лимфоидной инфильтрации: нодулярный, интерстициальный, диффузный (рис. 8). Нодулярная инфильтрация отмечалась у 18 пациентов (18,8%), интерстициальная у 26 пациентов (27%), диффузная у 52 пациентов (54,2%). Нодулярный тип опухолевой инфильтрации характеризовался появлением в кроветворной паренхиме одного или нескольких нечетко отграниченных от миелоидной ткани скоплений лимфоидных клеток. Как правило, нодулярный инфильтрат располагался в субэндостальных зонах костномозговых лакун. Нечеткие границы нодулярных инфильтратов были обусловлены тем обстоятельством, что происходило распространение лимфоидных клеток в прилежащую миелоидную ткань, светлые центры размножения при указанной инфильтрации не обнаруживались, обнаруживалось незначительное повышение количества микрососудов нодулярных лимфоидных скоплений. Размер очагов поражения варьировал, при увеличении размеров опухолевых нодулей могли выявляться зоны соприкосновения с поверхностью костных трабекул (n=5). Клеточный состав нодулярных инфильтратов был мономорфен и представлен малыми лимфоцитами, имеющими округлые ядра с глыбчатым, комковатым хроматином, практически не контурированными ядрышками, клетки имели малозаметную узкую цитоплазму. В небольшом количестве также были представлены лимфоциты средних размеров с дисперсным хроматином, наличием мелких ядрышек. При импрегнации препаратов серебром отмечалось появление отдельных грубых нитей отложений ретикулина. Представленные особенности структуры нодулярных лимфоидных скоплений в костномозговых пространствах при ХЛЛ позволяет отчетливо дифференцировать их от 54 А Б В Рисунок 8. Типы опухолевой инфильтрации в костном мозге при ХЛЛ: А) нодулярная, Б) интерстициальная, В) диффузная, 100х. 55 неопухолевых реактивных лимфоидных фолликулов костного мозга здоровых лиц, охарактеризованных в предыдущей главе. Интерстициальный тип поражения костного мозга устанавливался в наблюдениях, когда клетки лимфоидных инфильтратов располагались в миелоидной ткани между сохранившимся объемом адипоцитов. При этом клеточный состав миелокариоцитов изменялся в зависимости от степени их замещения опухолевыми лимфоцитами. Характер клеточного состава лейкозных инфильтратов был подобен типу клеток образующих нодулярные скопления. Выявлялись преимущественно лимфоциты мелких размеров, среди которых присутствовали в небольшом количестве клетки средних размеров. При диффузной опухолевой инфильтрации костного мозга лимфоидные клетки занимали практически все пространство костномозговых полостей. Происходило практически полное замещение опухолью жировой ткани в лакунах губчатой кости (более 70% поражения). Обнаруживалось небольшое количество клеток деятельного костного мозга диффузно располагающихся между лимфоцитами мелких и средних размеров. Иммунофенотип опухолевых клеток был установлен при ИГХ исследовании. Лимфоидные инфильтраты содержали клеточную лимфоидную популяцию экспрессирующую пан-В-клеточные маркеры CD19, CD20, CD79α, а также CD5 и CD23. Отсутствовала экспрессия Cyclin D1, CD10. Распределение типов инфильтрации костного мозга по стадиями Rai показано на рисунке 9. Так, 3-4 стадии характеризовались преобладанием случаев с диффузной инфильтрацией костного мозга, в то время как 0-1 стадии с преобладанием нодулярной инфильтрации. Интерстициальная инфильтрация отмечалась на всех стадиях Rai – в 3 случаях 0 стадии, в 7 случаях 1 стадии, 16 случаях 2 стадии, 10 случаях 3 стадии и 5 случаях 4 стадии. Нами была определена пролиферативная активность, как количество экспрессирующих Ki-67 лимфоцитов в инфильтрации: низкая - менее 5%, умеренная 5-10%, повышенная более 10%. Пролиферативная активность была преимущественно низкая (54 случая, 56%), повышенная экспрессия Ki-67 отмечалась в 42 случаях (44%), 37 из которых имели диффузную и 5 интерстициальную инфильтрацию костного мозга (таблица 5). 56 нодулярная интерстициальна я диффузная 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% ста дия 0 ста дия 1 ста дия 2 ста дия 3 стадия 4 Рисунок 9. Распределение (в % соотношении) типов инфильтрации костного мозга больных ХЛЛ по стадиям Rai. Морфологические признаки реакции стромы костного мозга имелись при всех трех видах опухолевой инфильтрации костномозговой паренхимы. Однако были выражены неравнозначно в целом и относительно нишеобразующих элементов стромального микроокружения (таблица 5). При выявлении в костномозговых пространствах губчатого вещества подвздошной кости нодулярных лимфоидных инфильтратов структурных перестроек элементов стромального микроокружения в кроветворной паренхиме вне зон инфильтрации обнаружено не было. Морфология МЦР русла, а также клеточных элементов эндоста и костных балок на светооптическом уровне в гистологических препаратах, окрашенных рутинными методами, не изменялась, наблюдалось незначительное увеличение числа сосудов в пределах опухолевых инфильтратов (рис. 10). Что касается зон поражения, при импрегнации серебром можно было отметить наличие стромальной реакции на патологический процесс в форме увеличения количества ретикулиновых нитей в месте расположения нодулярных инфильтратов. При этом в некоторых случаях отмечался очаговый ретикулиновый склероз (рис. 11). 57 А Б В Г Рисунок 10. Иммуногистохимическое выявление сосудов в костном мозге CD34 cl.II: А) группа сравнения, Б) нодулярная, В) интерстициальная, Г) диффузная инфильтрация при ХЛЛ, 200х. А Б В Рисунок 11. Ретикулиновый каркас костного мозга, импрегнация серебром: А) нодулярная, Б) интерстициальная, В) диффузная инфильтрация при ХЛЛ, 200х. 58 Таблица 5. Морфометрические показатели структур костного мозга подвздошной кости в зависимости от типа лимфоидной инфильтрации (М±м) Больные ХЛЛ Паренхима и строма костного мозга Здоровые лица n=30 Гемопоэтическая ткань (в том лимфоидные пролифераты) (площадь, %) 51,2±3,3 Нодулярная инфильтрация Интерстициальная инфильтрация n=18 n=26 Диффузная инфильтрация n=52 52,3±5,1 57,2±4,1 70,7±3,9* (15,7±7,5) (25,0±6,2) (51,15±6,92) числе Жировая ткань (площадь, %) 28,1±1,0 27,5±0,7 23,8±3,8 13,0±4,2* Костная ткань (площадь, %) 21,0±2,4 19,6±4,4 18,3±1,0 17,1±1,3 МЦР 9,1±1,2 12,3±2,5 13,1±1,2* 17,9±3,7* Эндостальные клетки (кол-во на ед. пл.) 1,4±0,2 1,3±0,5 1,8±0,4 2,3±0,4* Пролиферативная активность ki-67 (% в инфильтрате) Не измерялась 2,3±0,4 5,2±0,7+ 9,5±1,6+ Сосуды (площадь, %) Примечание: * - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем; + - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с нодулярной инфильтрацией. 59 Гистологические исследования стромальных структур микроокружения костного мозга при интерстициальном варианте опухолевой инфильтрации не выявили статистически значимых количественных перестроек нишеобразующих структур. Однако были заметны морфологические изменения организации элементов микроокружения. Стромальная реакция заключалась в изменении ретикулинового каркаса паренхимы кроветворной ткани, в лакунах отчетливо определялось увеличение количества отдельно располагающихся фрагментов ретикулина (рис. 11). При этом в большинстве случаев (n=14) нити располагались изолировано и не образовали свидетельствовать пересечений об изменении или сетчатого функциональной рисунка. Отмеченный активности факт ретикулярных может клеток. Увеличивается количество волокон коллагена III типа в субэндостальных пространствах. Статистически достоверных количественных изменений клеток эндоста при данном поражении костного мозга, не выявлено, однако соотношение клеток с уплощенными и крупными ядрами изменяется в сторону увеличения количества последних. Достоверно увеличена плотность сосудов по сравнению с нормальным костным мозгом (рис. 10). Отчетливо проявлялись изменения стромального микроокружения костного мозга, включая структуры, образующие васкулярную и остеобластную ниши стволовых клеток при исследовании трепанобиоптатов с диффузным поражением костного мозга при ХЛЛ. Наряду с изменением количества и структуры нишеобразующих элементов, происходили качественные перестройки стромального микроокружения в целом. Диффузная инфильтрация костного мозга сопровождалась редукцией адипоцитов, оставшиеся жировые клетки характеризовались снижением объема жировой вакуоли. В костномозговых пространствах происходило усиление ретикулинового рисунка вплоть до появления грубых ретикулиновых волокон, образующих пересечения с формированием ретикулинового склероза (рис. 11). Удельная площадь сосудов МЦР определялась нами с помощью ИГХ реакций с панелью антител - маркеров клеток эндотелия - CD34 cl. II, CD31, фактор Фон Виллебранда (vWF). Данные представлены в таблице 6. 60 Таблица 6. Результаты определения удельной площади сосудов по иммуногистохимическим исследованиям с маркерами эндoтелия (М±м) Нодулярная Интерстициальная Диффузная Контроль инфильтрация инфильтрация инфильтрация (площадь, %) (площадь, %) (площадь, %) (площадь, %) n=18 n=26 n=52 n=30 CD34 cl. II 12,3±2,5 13,1±1,2* 17,9±3,7* 9,1±1,2 CD31 11,1±2,7 12,1±3,4 20,1±4,2* 10,4±1,4 vWF 6,1±0,3 8,1±0,5 11,2±0,4* 6,1±0,5 Маркер эндотелия Примечание: * - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем. Полученные данные со всеми антителами показали увеличение площади сосудов при диффузной инфильтрации по сравнению с контрольной группой, при сравнении удельной площади сосудов у пациентов с нодулярной и интерстициальной типами инфильтрации значения достоверно не отличались от контрольных, но тенденция увеличения удельной площади сосудов прослеживалась при окраске со всеми антителами. Нарастало количество микрососудов во всех отделах костномозговых пространств и, что особенно важно, в субэндостальных пространствах, также следует заметить, что в большинстве сосудов наблюдалось появление эндотелиоцитов с крупными, активными ядрами (рис.11). По результатам ИГХ исследований для дальнейших сравнений нами были выбраны значения удельной плотности сосудов, полученные с антителами CD34 cl. II, так как этот маркер позволяет объективизировать оценку сосудов МЦР различной степени зрелости, включая популяцию незрелых эндотелиальных клеток, а также по данным статистического анализа они являются более достоверными (р < 0,03). Так было показано, что площадь сосудов при диффузной инфильтрации (17,9±3,7 %) возрастает почти в 2 раза по сравнению с контролем (9,1±1,2%), при интерстициальной инфильтрации увеличивается почти в 1,5 раза (13,1±1,2%), при нодулярной инфильтрации статистически значимых изменений не обнаружено (12,3±2,5%) (рис. 12). 61 Рисунок 12. Изменение удельной площади сосудов МЦР (% от площади гемопоэтической ткани) в группах пациентов по типам инфильтрации костного мозга (CD34 cl.II) по сравнению с контролем. Нами также определялась экспрессия 70-kd дзета-ассоциированного белка (Zap70) и оценивалась зависимость экспрессии этого белка от изменяющейся удельной площади сосудов МЦР костного мозга больных ХЛЛ. Экспрессия Zap70 оценивалась в опухолевых клетках и характеризовалась как отрицательная (менее 20% экспрессирующих клеток), умеренная (2050%) и сильная (более 50%), внутренним положительным контролем служили Т-клетки (рис. 13). На рисунке 14 представлен график динамики показателей плотности микрососудов и уровня экспрессии Zap70 больных ХЛЛ, была выявлена статистически значимая корреляция между этими показателями (R=0,7, p < 0,05, N=96). 62 А Б Рисунок 13. Экспрессия Zap70 в опухолевых клетках, инфильтрирущих паренхиму костного мозга при ХЛЛ: А) умеренная экспрессия, Б) выраженная экспрессия, 200х. 63 Рисунок 14. Зависимость уровня экспрессии Zap70 и площади сосудов МЦР у больных ХЛЛ. Примечание: наклонная линия тренда показывает зависимость исследуемых значений, R=0,7, p < 0,05, N=96. Полученные данные свидетельствуют о том, что экспрессия Zap70 коррелирует с типом инфильтрации костного мозга: во всех случаях диффузной инфильтрации костного мозга (n=52) большинство лейкозных клеток были положительны (более 65%), в то время как при нодулярной инфильтрации (n=18) экспрессии в подавляющем большинстве случаев обнаружено не было, интерстициальная инфильтрация костного мозга (n=26) отличалась переменной экспрессией Zap70. Отмечались 6 случаев интерстициальной инфильтрации с отсутствием экспрессии Zap70 (менее 15%), 4 случая с повышенной экспрессией (50-65%), 16 случаев с умеренной экспрессией (30-45%) (рис. 15). В нашем исследовании также были проанализированы данные миелограммы и периферической крови пациентов с одновременным анализом характера поражения костного мозга на материале трепанобиоптатов. Соотношения между типами лимфоидной инфильтрации в костном мозге и параметрами периферической крови и миелограммы представлены в таблице 7. Изменения показателей выявлялись при всех типах поражения, однако в наибольшей степени были выявлены при диффузном типе, при котором в периферической крови отмечалось более высокое содержание лейкоцитов (114,9±28,2*109/л) и лимфоцитов (101,8±13,2*109/л), снижение 64 уровня гемоглобина (87±5,7 г/л), а в миелограмме увеличено количество лимфоцитов (82,1±3,3%) и миелокариоцитов (460,3±131,2*109/л). Таблица 7. Соотношения между типами лимфоидной инфильтрации костного мозга и лабораторными данными (М±м) Тип Периферическая кровь пролифера- Гемоглобин, Лейкоциты, 9 Лимфоциты, Миелограмма Лимфоциты, 9 Лимфоциты, Миелокарио- ции г/л 10 /л % 10 /л % циты, 109/л Диффузный 87±5,7* 114,9± 88,6±2,6* 101,8± 82,1±3,3* 460,3± 28,2* Интерстици- 112±11,2 13,2* 31,7±6,8* 85,2±2,5* 27,1±8,3* 131,2* 62,9±5,4* альный 278,8± 100,8* Нодулярный 120±8,7 9,1±4,9 60,5±12,5 5,5±1,6 36,2±13,2 143,2± 18,2 Примечание: * - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с нодулярной инфильтрацией. Таким образом, учитывая, что анемия и лимфоцитоз являются неблагоприятными прогностическими факторами заболевания можно заключить, что нодулярная и интерстициальная инфильтрация свидетельствуют о более благоприятном течении ХЛЛ в сравнении с диффузным типом поражения костного мозга. 12 10 8 6 4 2 0 нодулярная интерстициальная zap-70 отриц zap-70 слабая диффузная zap-70 сильная Рисунок 15. Распределение уровней экспрессии Zap70 по типам инфильтрации костного мозга у больных ХЛЛ. 65 Исследование эндостальных зон показало статистически значимое увеличение количества клеток на эндосте при диффузной инфильтрации костного мозга - 2,3±0,4 ед/пл по сравнению с контролем 1,4±0,2 ед/пл (таблица 5). Одновременно с увеличением числа эндостальных клеток стромы, изменялась структурная организация ядер. В выстилающих поверхность костных балок клетках доля клеточных элементов с вытянутыми уплощенными формами ядер уменьшалась, наблюдалось нарастание в эндостальных и субэндостальных зонах стромальных клеток с крупными просветвленными ядрами (рис. 16). Экспрессия молекулы CD146, которая маркирует стромальные клетки эндостальных и периваскулярных зон при диффузной инфильтрации также увеличена и присутствовала практически повсеместно в субэндостальных зонах (10,2±1,3% от гемопоэтической ткани) (рис. 17). Иммуногистохимическое определение коллагеновых волокон не показало достоверных отличий между типами инфильтрации костного мозга. Тем не менее, тенденция к изменению распределения экспрессии коллагена разных типов присутствует и можно говорить о том, что эта проблема требует более подробного рассмотрения. Так нарастает количество коллагеновых волокон III типа в экстрацеллюлярном матриксе у пациентов с ХЛЛ по сравнению с контролем, что отмечено в 28 случаях из 52 при диффузной инфильтрации, и в 9 случаях из 26 при интерстициальной инфильтрации костного мозга (рис. 18). Нами были показаны значимые изменения структур стромы костного мозга, которые указывают на важную роль опухолевого микроокружения в прогрессии заболевания. Наиболее выраженные изменения стромы костного мозга происходят при диффузном варианте инфильтрации. При этом особенно важно отметить, что перестройки регистрируются в микроциркуляции и в стромальных элементах эндостальных зон костномозговых пространств – ключевых образований, формирующих нишу клеток предшественников гемолимфопоэза. С усилением опухолевой инфильтрации в костном мозге нами показано увеличение количества клеток на эндосте, усиление экспрессии CD146 в субэндостальной зоне, количества сосудов МЦР, увеличение количества коллагеновых и ретикулиновых волокон. Один из факторов прогноза, экспрессия молекулы Zap70, коррелирует с этими изменениями, что может свидетельствовать о доброкачественном течении ХЛЛ при нодулярном и интерстициальном типах инфильтрации, и прогрессирующем при диффузном типе поражения костного мозга. 66 А Б В Рисунок 16. Эндостальные клетки в костном мозге: А) здоровые лица, Б) интерстициальная инфильтрация при ХЛЛ, В) диффузная инфильтрация при ХЛЛ, ув. 400х. Рисунок 17. Выраженная экспрессия CD146 клетками субэндостальных зон костного мозга у пациентов с ХЛЛ, 400х. 67 А Б В Рисунок 18. Экспрессия коллагенов А) коллаген III типа, Б) коллаген I типа, В) коллаген IV типа в костном мозге пациентов с ХЛЛ, 200х. Таким образом, у больных ХЛЛ в костном мозге наблюдаются различные варианты опухолевой инфильтрации – нодулярный, интерстициальный, диффузный. Наряду с изменениями интрамедуллярной паренхимы развитие ХЛЛ сопровождается структурными перестройками стромальных образований формирующих гемопоэтическую нишу. Нарушения МЦР проявляются ростом числа микрососудов, приводящим к увеличению их плотности в миелоидной ткани. При этом рост числа сосудов также затрагивает эндостальные зоны губчатого вещества подвздошной кости. Одновременно с перестройкой МЦР происходит увеличение количества эндостальных стромальных клеток, включая CD146+, и наблюдается тенденция к изменению экстрацеллюлярного матрикса эндостальных и периваскулярных зон, что подтверждается ИГХ исследованиями коллагена III и IV типов. Очевидно, что дефекты структур формирующих гемопоэтическую нишу могут быть значимым патогенетическим фактором неопластической трансформации В-лимфоцитов и в таких условиях функция ниши может быть направлена на поддержание лейкозного клона. 68 3.3. Гистоморфологическая характеристика стромального компонента в лимфатических узлах при немалигнизированных реактивных лимфаденопатиях Подобно структурной организации костного мозга, строение лимфатических узлов также включает в себя паренхиматозный и стромальный компонент. Ранее, в обзоре литературы отмечалось, что строма лимфатических узлов формируется гетерогенной по структуре и функциям популяцией ретикулярных клеток и разветвленной системой сосудов. По аналогии с костным мозгом, в группе стромальных элементов лимфатического узла выделяются нишеобразующие элементы стромы лимфоидной ткани, которые играют ключевую роль в реализации программы пролиферации и дифференцировки лимфоидных предшественников, окончательной стадией которой являются В-лимфоциты и плазмоциты. Указанную группу элементов лимфоидной стромы представляют фолликулярные дендритные клетки и микрососуды лимфатических узлов. В качестве группы сравнения были взяты биоптаты лимфатических узлов 20 лиц в возрасте 48-70 лет (средний возраст группы 62,7±6,2 лет, медиана 63) с неопухолевой реактивной неспецифической лимфаденопатией. Поскольку разные структуры лимфатического узла отвечают на антигенные воздействия неодинаково, границы отдельных зон были стерты или смещены вследствие гиперплазии или наоборот гипоплазии той или иной субпопуляции лимфоцитов. При гистологическом исследовании использованного материала во всех наблюдениях сохранялась структура строения лимфатических узлов. В гистологических препаратах различалась капсула, кортикальная зона, лимфоидные фолликулы в большинстве случаев с наличием светлых реактивных центров, паракортикальная зона, мозговые тяжи, лимфатические синусы, сосудистая сеть (рис. 19). В лимфатических узлах можно выделить строму с фиксированными клетками и паренхиму с клеточной популяцией, которая претерпевает изменения. Фибробластические ретикулярные клетки составляют основную стромальную популяцию клеток и формируют ретикулярную сеть. Ретикулярная сеть выполняет несколько функций: формирование структуры лимфатического узла и обеспечение условий для пролиферации, дифференцировки и миграции клеток, а также передаче сигналов между клетками. Коллагены I и III типов отвечают за прочность ретикулярной сети, коллаген IV типа и ламинин маркируют сосудистую систему лимфатического узла. Общая структура и клеточный состав паренхимы лимфоузлов не отличался качественным содержанием, имелись в различной степени изменения количественных соотношений. Капсула исследованных лимфатических узлов была представлена 69 А Б Рисунок 19. Лимфатический узел с неспецифической хронической лимфаденопатией: А) общий вид, 40х, Б) фолликул лимфатического узла с ярко выраженным светлым центром и зоной мантии, 100х. 70 плотными коллагеновыми волокнами с наличием небольшого числа фиброцитов, гладкомышечных волокон. При ИГХ исследовании в капсуле выявлялся коллаген III, IV типов, десмин, местами определялось позитивное окрашивание на ламинин. Инфильтративные процессы отсутствовали. Внутрь паренхимы от капсулы распространялись соединительнотканные трабекулы, содержащие сосуды. При ИГХ исследованиях в трабекулах также наблюдалась экспрессия десмина, коллагена III, IV типов. Кортикальная зона в изученных препаратах была расширена, содержала различной величины лимфоидные фолликулы, чаще с центрами размножения. Фолликулы содержали центробласты, центроциты, макрофаги, выявленные при ИГХ исследованиях ФДК (рис. 20). Имелись митозы, четкая зона мантии. Паракортикальная зона содержала лимфоциты малых и крупных размеров, гистиоциты. Синусы лимфатических узлов имели обычную структуру, признаков синусового гистиоцитоза обнаружено не было. Учитывая цель работы, объектами анализа были нишеобразующие элементы стромы – ФДК и сосуды МЦР – их характеристике было уделено основное внимание. ФДК - крупные клетки с длинными тонкими отростками, которые охватывают прилежащие лимфоциты, и овальными ядрами с выраженными ядрышками, большинство ФДК двуядерные, но также бывают и трехъядерные клетки. ИГХ исследования с панелью антител CD21, CD23, Anti-FDC CNA.42, Anti-fascin, СD35 показали наличие ФДК в специфичных для них местах – первичных и вторичных фолликулах лимфатических узлов (рис. 20). При окраске с антителами Anti-fascin помимо ФДК в фолликулах, были выявлены интердигитальные ретикулярные клетки в Т-зависимой зоне. Морфология дендритных клеток не была изменена. По данным морфометрии ФДК занимают около 23 % от площади лимфатических узлов. 71 А Б В Г Рисунок 20. Лимфатические узлы контрольной группы (левый столбец) и пациентов с ХЛЛ (правый столбец). Выявление фолликулярных дендритных клеток ИГХ методом с антителами к CD35 (А), Anti-FDC CNА.42 (Б), CD23 (В), Anti-fascin (Г), 200х. 72 При гистоморфологическом исследовании кровеносные сосуды были представлены сосудами МЦР, крупными сосудами, венулами с высоким эндотелием. Фолликулы были менее васкуляризированы, чем перифолликулярная область и мозговое вещество. ИГХ выявление сосудов и синусов лимфатических узлов проводилось с использованием моноклональных антител CD34 class II, CD31, vWF. Наибольшее количество сосудов определялось в паракортикальной зоне, единичные в фолликулах (рис.21, таблица 8). ИГХ исследования с антителами к коллагену IV типа и ламинину выявляли каркас синусов лимфоузлов и крупные сосуды с базальной мембраной. Таблица 8. Результаты определения плотности сосудов в лимфатических узлах (М±м) Маркер Больные ХЛЛ Контроль эндотелия (площадь, %) (площадь, %) n=61 n=20 CD34 cl. II 12,8±0,3* 6,5±0,5 CD31 18,3±0,7* 10±0,8 vWF 15±0,3* 8±0,2 Примечание: * - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем. 73 А Б Рисунок 21. Лимфатический узел контрольной группы. Выявление сосудов ИГХ методом с антителами CD34 cl. II, А) корковое вещество с фолликулом, 100х, Б) паракортикальная зона, 200х. 74 Рисунок 22. Лимфатический узел контрольной группы. Выявление ретикулиновых волокон, импрегнация серебром, 100х При импрегнации препаратов лимфатических узлов серебром ретикулиновый каркас был представлен отдельными нитями ретикулиновых волокон, ориентированных в разных направлениях и не имевших пересечений. Распределение ретикулиновых волокон было разным в разных частях лимфатических узлов, в фолликулах их было меньше, чем в других частях лимфатических узлов и они были более разобщенные. Наибольшее количество волокон отмечалось в мозговом веществе и вокруг кровеносных и лимфатических сосудов. Наряду с сетчатым каркасом, ретикулиновые нити образовывали утолщенные тяжи возле сосудов (рис. 22). Таким образом, структурная организация лимфатических узлов при реактивных лимфаденопатиях соответствует нормальной гистоархитектонике паренхиматозного и стромального компонентов и отличается незначительными изменениями – прежде всего увеличением объема кортикальной зоны и ростом числа лимфоидных фолликулов разного размера. 75 3.4. Особенности структурной организации стромы лимфатических узлов при ХЛЛ В исследовании были проанализированы биопсии лимфатических узлов 61 больных ХЛЛ (33 мужчины и 28 женщин) в возрасте 49-73 лет (средний возраст группы 60,8±6,8 лет, медиана 61). При морфологическом исследовании биоптатов лимфоузлов больных ХЛЛ во всех случаях отмечались нарушение гистоархитектоники компонентов лимфоидной ткани. Диффузная инфильтрация лимфоцитами наблюдалась во всех случаях, в 18 случаях в лимфоидной ткани определялись так называемый псевдофолликулярный тип роста – участки, которые представляли собой обычные зоны опухолевых разрастаний, окрашивающиеся в более светлые тона на более интенсивно окрашенном фоне (рис. 23). В подавляющем большинстве случаев в ткани лимфатических узлов выявлялся диффузный рост лимфоцитов малых размеров с узким ободком цитоплазмы, наличием ядер округлой формы, глыбчатой структурой хроматина. Ядрышки либо не выявлялись, либо слабо контурировали. Наряду с малыми лимфоцитами встречались клетки средних размеров – пролимфоциты с более обильной цитоплазмой, просветленными ядрами, в которых определялись ядрышки. Наконец, в опухолевых инфильтратах обнаруживались крупные клетки с большими везикулярными ядрами, в которых центрально располагались круглые ядрышки – параиммунобласты. однородным, но В большинстве случаев ХЛЛ в части наблюдений выделялись опухолевый инфильтрат пролиферативные зоны выглядел роста - псевдофолликулы. Клетки псевдофолликулов наряду с малыми лимфоцитами включали в себя параиммунобласты и пролимфоциты, также эти зоны богаты клетками, экспрессирующими маркер пролиферации Кi-67. Импрегнация серебром гистологических препаратов лимфатических узлов показала деструктивные изменения ретикулиновой сети лимфоидной ткани, причем в двух противоположных направлениях – дезорганизация ретикулиновых волокон с уменьшением их количества относительно площади лимфоидной ткани наблюдалась в 47 случаях (77%), второй тип – образование более грубой сети с очагами ретикулинового склероза в 14 случаях (23%) (рис. 24). 76 Рисунок 23. Лимфатический узел при ХЛЛ. Рисунок лимфатического узла стерт, 100х. Рисунок 24. Лимфатический узел при ХЛЛ. Выявление ретикулиновых волокон, импрегнация серебром, 100х. 77 При анализе гистологических препаратов, окрашенных рутинными методами гематоксилинэозином и азур-II-эозином, небольшое количество ФДК определялось в единичных случаях (n=3) в псевдофолликулах. ИГХ определение ФДК с панелью антител выявило интересные факты. Стоит отметить, что маркеры CD21 и CD23 при данном варианте лимфопролиферативного заболевания присутствуют на опухолевых клетках и являются диагностически значимыми при постановке диагноза ХЛЛ. Так при ХЛЛ CD23 экспрессируется во всех случаях более чем на 50% клеток (рис. 21, таблица 9). СD21 во многих случаях экспрессировался умеренно – в 32 случаях (53%) позитивны менее 25 % клеток, в оставшихся наблюдениях (n=29) экспрессия наблюдалась в 30-35% опухолевых клеток. Умеренная экспрессия СD35 обнаружена в 23 случаях (38%). Маркеры CNА.42 и фасцин показали незначительное количество разрозненно лежащих клеток, без образования сетчатой структуры, при этом следует отметить, что фасцин маркирует и интердигитальные ДК. В 3 случаях ХЛЛ при ИГХ исследовании были выявлены ФДК, образующие сеть, в псевдофолликулах. Представленные результаты свидетельствуют о дезорганизации сети ФДК при ХЛЛ (таблица 9). Вероятно, происходит также и изменение их фенотипа под влиянием опухолевой прогрессии, так как маркеры ФДК, которые не экспрессируются одновременно опухолевыми клетками, практически отсутствуют. Рисунок 25. Выраженная экспрессия Zap70 в лимфатическом узле больного ХЛЛ, 100х. 78 Таблица 9. Экспрессия маркеров нишеобразующих структур лимфатических узлов (М±м) Нишеобразующие структуры лимфатического узла, % площадь Группа сравнения (лимфадениты) Больные ХЛЛ n=61 n=20 Сосуды CD34 cl. II 6,5±0,5 12,8±0,3* CD23 23±3,1 79,8±4,2* CD21 19,3±1,2 24,7±2,2 (n=42) СNA.42 17,5±1,6 7,3±1,8* Фасцин 35,7±2,4 19,3±1,6* CD35 28,3±2,3 11,1±3,6* 18,2±2,1 72,4±8,2 (35 случаев) * (Т-клетки) 24,3±2,7 (26 случаев) Коллаген IV 5,1±0,3 9,5±2,1* Коллаген III 3,1±0,5 2,7±0,8 Ламинин 3,2±0,4 1,5±0,3* Десмин 1,2±0,2 0,8±0,2 Zap70 Примечание: * - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем. 79 Экспрессия прогностического маркера Zap70 (более 50%) определялась в 35 случаях (57%), в 10 случаях экспрессия отсутствовала (16%), в остальных наблюдениях отмечалась умеренная экспрессия (n=16, 26%) (рис. 26). При рутинных окрасках было отмечено увеличение количества сосудов, при этом венулы с высоким эндотелием определялись значительно реже, чем в контрольной группе. ИГХ определение сосудов проводилось с использованием моноклональных антител Dako CD34 cl. II, CD 31, vWF, anti-laminin, anti-collagen IV типа. Исследования показали, что на фоне инфильтрации лимфоузлов зрелыми лимфоцитами обнаруживалось увеличение количества мелких сосудов, а также сосудов с выбухающими в просвет эндотелиоцитами с крупными ядрами, хорошо очерченными ядрышками и фибробластоподобными клетками по периферии сосудов (рис. 26). Структура эндотелиоцитов указанных сосудов была характерна для клеток с высокой функциональной активностью. Морфометрические измерения с помощью программы ВидеоТест показали, что площадь сосудов МЦР составила 12,8±0,3 % при ХЛЛ по сравнению с 6,5±0,5% в контрольной группе (таблица 8). ИГХ с антителами к ламинину и коллагену IV типа выявила прерывистую или отсутствующую базальную мембрану у большинства сосудов (таблица 9). Экстрацеллюлярный матрикс лимфатических узлов также претерпевает изменения, но не все они являются статистически достоверными. Так отмечается незначительное сокращение десмина, коллагена III типа в трабекулах и в паренхиме лимфатического узла. Достоверно показано сокращение количества коллагена IV типа и ламинина (таблица 9). Представленные нами данные свидетельствуют о значительных перестройках в структурной организации лимфатических узлов при ХЛЛ, которые затрагивают как паренхиматозный, так и стромальный компонент. Во всех случаях гистоархитектоника первичных и вторичных лимфоидных органов у больных ХЛЛ изменяется в связи с появлением клона лейкозных клеток, особенно это относится к нишеобразующим стромальным структурам – ФДК, сосудам МЦР и экстрацеллюлярному матриксу. 80 А Б Рисунок 26. Лимфатические узлы при ХЛЛ. Выявление сосудов ИГХ методом с антителами CD34 cl. II: А) паракортикальная зона, единичные крупные сосуды, 200х, Б) корковое вещество, сосуды микроциркуляторного русла, 100х. 81 В группу сочетанного анализа вошли 45 пациентов (28 мужчин и 17 женщин, средний возраст группы 59,9±7,7 лет, медиана 60), от которых были получены фрагменты подвздошной кости и биоптаты лимфатических узлов. Особенности гистоморфологических характеристик нишеобразующих структур показаны в таблице 10. Нодулярный тип инфильтрации костного мозга представлен в 8 случаях (17,8%), интерстициальный тип в 18 (40%) и диффузный в 19 (42,2%) случаях поражения костного мозга. Общая тенденция такова, что при диффузной инфильтрации костного мозга и существенных изменениях нишеобразующих структур (площадь сосудов МЦР, количество клеток на эндосте, ретикулиновые отложения, изменения экспрессии коллагенов и CD146 в клетках субэндостальной зоны) в лимфатических узлах определяется увеличение экспрессии Zap70, усиление сосудистого компонента в лимфоидной паренхиме и сокращение сети ФДК (результаты по ИГХ реакциям с антителом к фасцину). Эти изменения отмечаются в подавляющем большинстве случаев (n=33). Однако были наблюдения, которые выходили за рамки этой тенденции, так в 3 случаях нодулярной инфильтрации костного мозга была показана усиленная экспрессия Zap70 (более 60 %) в лимфатических узлах, при этом таковой не наблюдалось в нодулярных скоплениях в костном мозге, также экспрессия маркера пролиферативной активности Кi-67 была невысокой (8%). В 6 случаях интерстициальной и диффузной инфильтрации костного мозга в лимфатических узлах не было отмечено значительного увеличения площади сосудов МЦР, при этом количество ФДК было снижено. Нарушения состояния нишеобразующих элементов стромы могут приводить к изменению сигнальных путей регуляции пролиферации и дифференцировки нормальных лимфоидных предшественников. В связи с этим снижается противоопухолевый потенциал лимфоидной ткани и создаются условия для неопластической прогрессии. 82 Таблица 10. Особенности нишеобразующих структур костного мозга и лимфатических узлов у пациентов из группы сочетанного анализа (М±м) Вариант инфильтрации костного мозга Нодулярный Костный мозг Интерстициальный Лимфатический узел Костный мозг Диффузный Лимфатический узел Костный мозг Лимфатический узел Нишеобразующие структуры МЦР Клетки эндоста МЦР ФДК (Фасцин) МЦР Клетки эндоста МЦР ФДК (Фасцин) МЦР Клетки эндоста МЦР ФДК (Фасцин) 14,7± 10,2±1,3 1,5±0,3 8,7 ±2,3 32,7±3,6 13,5±1,1 2,1±0,5 11,2±1,3 25,6±2,3 18,2±3,5* 21,3±1,6* 2,8±0,5* 1,6* Примечание: * - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с нодулярной инфильтрацией. 83 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Отличительной чертой ХЛЛ – одного из наиболее часто встречаемых вариантов гемобластозов, является сочетанное опухолевое поражение миелоидной и лимфоидной ткани, особенно ярко манифестируемое в стадии заболевания с появлением лимфаденопатии. На базе этого положения естественно полагать, что установление патогенетических механизмов лимфоидной малигнизации в такой ситуации требует анализа как кроветворной, так и лимфоидной ткани, которые тесно взаимосвязаны и по существу представляют собой единый миелолимфоидный комплекс. Дополнительно к этому, анализ указанных тканей является неполноценным без знания состояния их стромального микроокружения и, особенно, тех структур, которые формируют нишу ГСК и стволовых клеток лимфоидной направленности. На базе этих положений при изучении структуры костного мозга подвздошной кости и строения лимфатических узлов больных ХЛЛ была поставлена задача установить морфофункциональные особенности стромальных элементов кроветворного и лимфоидного микроокружения, участвующих в формировании ниши ГСК и лимфоидных клеток-предшественниц, и оценить роль изменений состояния нишеобразующих структур в патогенезе заболевания. Полученные в ходе выполнения диссертационной работы данные отчетливо свидетельствуют о нарушении морфофункциональных свойств структур гемопоэтической ниши в костном мозге и элементов лимфоидной ниши в лимфатических узлах у больных ХЛЛ. В связи с этим представляется возможным расширить существующие представления о патогенезе ХЛЛ концептуальным положением об участии в этом процессе структурных и функциональных лимфатических перестроек узлов, нишеобразующих непосредственно элементов влияющих на костного развитие ГСК мозга и и их коммитированных в лимфоидном направлении потомков. Одновременно полученные сведения о морфофункциональных особенностях гемопоэтической и лимфоидной ниш создают предпосылки для более точного прогнозирования течения заболевания, совершенствования лечения и оценки его эффективности. Система гемолимфопоэза стоит на первом месте среди всех тканей и органов по темпам клеточного самообновления. В таких условиях для поддержания клеточного баланса требуется прежде всего определенное количество стволовых клеток с закрепленной генетической программой их развития в кроветворном и лимфоидном направлении, а также наличие дополнительных механизмов, регулирующих реализацию пролиферативного и дифференцировочного потенциала стволовых клеток, среди которых 84 ключевая роль принадлежит регуляторным факторам кроветворной стромы. У взрослых гемопоэз ограничивается костной тканью. В ней локальные регуляторные механизмы развития клеток-предшественниц гемолимфопоэза определяются гемопоэзиндуцирующим микроокружением, в котором ключевая инструктивная роль принадлежит стромальным клеткам. Из широкого спектра клеточных элементов микроокружения для анализа нами были выделены ключевые образования, играющие инструктивную роль в жизнедеятельности стволовых кроветворных клеток. Мы исходили из положения, что длительное самоподдержание стволовых клеток и реализация генетической программы развития возможны только при условии их пребывания в специфическом микроокружении, которое формирует для них особую нишу. Ниша является не просто локальным местопребыванием стволовых клеток, а имеет структурно-анатомические и функциональные характеристики. Вне ниши стволовые кроветворные клетки не способны выполнять свои функции. Клеточные и внеклеточные образования губчатой кости эндостальных зон, система микрососудов и экстрацеллюлярный матрикс являются структурами, формирующими нишу клеток-предшественниц гемолимфопоэза. Коммитированные лимфоидные предшественники мигрируют из костного мозга в лимфоидные органы, где при непосредственном влиянии стромального компонента лимфоидной ткани происходит их дальнейшее развитие. Не смотря на то, что для большинства исследователей ХЛЛ является неопластическим процессом, вопрос о том, что представляет собой ХЛЛ - злокачественное заболевание крови или болезнь, обусловленную нарушением нормальной регуляции гемолимфопоэза, до сих пор остается нерешенным окончательно [55, 125]. В связи с этим любые новые сведении относительно расшифровки причины развития ХЛЛ весьма актуальны как для понимания природы заболевания, так и для целей терапии и прогноза. Важная роль в получении фактов, способствующих раскрытию патогенеза ХЛЛ, принадлежит изучению стромального микроокружения костного мозга. Согласно одной из гипотез развития ХЛЛ в основе заболевания лежит неопластическая трансформация Влимфопоэза, а ключевая роль в развитии В-лимфоцитов принадлежит интрамедуллярным стромальным клеткам, которые коммитируют направление их развития, регулируют пролиферацию и дифференцировку [31, 109]. Естественно полагать, что нарушение структуры и функции костномозговых стромальных регуляторов В-лимфопоэза могут вести к нарушению развития лимфоидных клеток-предшественниц, не исключая их малигнизацию. Выживаемость больных ХЛЛ различна и колеблется в широких пределах (от 2-3 лет до средней продолжительности жизни), что может свидетельствовать о 85 гетерогенности патогенеза ХЛЛ [1, 72]. Возможно, речь идет не только о различных формах одного заболевания, но и о существовании нескольких заболеваний в рамках ХЛЛ, которые формируются по разным патогенетическим механизмам, приводящим к одним последствиям – накоплению долгоживующих лимфоцитов с определенным фенотипом. Что лежит в основе патогенеза еще предстоит выяснить, но на основании известных фактов, можно уверенно утверждать, что нишеобразующие элементы костного мозга и лимфоидных органов играют существенную роль в этом процессе. Материалом исследования послужили гистологические препараты костного мозга и лимфатических узлов 112 пациентов с ХЛЛ, из них 45 пациентов из группы сочетанного анализа, 96 пациентов с трепанобиоптатами костного мозга и 61 с биопсиями лимфатических узлов. Медиана возраста составила 60 лет. Распределение по полу составило 61/51 (м/ж) соответственно. Всем пациентам был проведен полный набор диагностических исследований и были определены стадии заболевания по Rai. Контрольная группа пациентов сопоставима по полу, возрасту и национальности с основной группой. Контрольную группу составили 50 человек: трепанобиоптаты подвздошной кости были взяты у 30 здоровых лиц, биоптаты лимфатических узлов 20 человек с реактивными лимфаденопатиями послужили группой сравнения при изучении лимфоидной ткани. Для гистологических исследований использовались парафиновые блоки. При изучении гистологических структур применялись стандартные окраски - гематоксилинэозин, азур-II-эозин, импрегнация серебром, по Массону. ИГХ анализ проводили с использованием панели первичных антител и полимерной системы визуализации Dako по протоколам окрашивания, рекомендованными производителем. Морфометрическую оценку результатов выполняли на световом микроскопе Nikon Eclipse E200 со встроенной фотокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений «ВидеоТесТ-Морфология 5.2» с окуляром х10, при объективах х20, х40. Анализ гистологических препаратов проводился в 20 полях зрения для каждого образца. Статистическая обработка полученных данных проводилась методом вариационной статистики с определением средней величины М, ее средней ошибки m, стандартного отклонения SD. Достоверность различий оценивалась с помощью критерия Стьюдента (t), критерия Манна-Уитни. Различие между сравниваемыми показателями считалось статистически значимым при р ≤ 0,05. Для выяснения зависимости между показателями применялся корреляционный анализ. Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием программ Statistica v.6.0, MedCalc, Microsoft Excel для Windows ХР. 86 В деятельном костном мозге строма является структурной основой гемопоэзиндуцирующего микроокружения, она обеспечивает механическую опору клеткам, регулирует развитие ГСК, интрамедуллярную и трансэндотелиальную миграцию стволовых и зрелых клеток крови. Представленный в работе морфофункциональный анализ паренхиматозно-стромальных взаимосвязей свидетельствует о том, что структурная организация стромальных элементов костного мозга направлена на поддержание динамического равновесия гемолимфопоэза и претерпевает значительные перестройки при ХЛЛ, свидетельствующие об их важной роли в патогенезе заболевания. Известно, что распространенность опухолевого поражения костного мозга и характер инфильтрации кроветворной ткани опухолевыми клетками является значимым, так как эти факторы во многом определяют дальнейшее течение заболевания и его лечение. Полученные нами данные о типах инфильтрации костного мозга при ХЛЛ не противоречат этому утверждению. При анализе 96 трепанобиоптатов костного мозга нами выделено три типа инфильтрации костного мозга – нодулярный (n=18, 18,8%), интерстициальный (n=26, 27%) и диффузный (n=52, 54,2%). На основе гистоморфологических и клинико-лабораторных данных пока нами было показано, что тип инфильтрации является одним из факторов для оценки прогноза течения заболевания. При анализе стадий заболевания по Rai была показана тенденция усиления инфильтрации костного мозга при увеличении стадии, так практически у всех пациентов с 4 стадией заболевания (12 из 18) определена диффузная инфильтрация костного мозга, у 6 пациентов установлена интерстициальная инфильтрация, в то время как нодулярная не была отмечена ни у одного пациента. Напротив, при 1 стадии заболевания, у 15 пациентов отмечена нодулярная инфильтрация, у 7 интерстициальная, диффузная инфильтрация выявлена у 1 пациента. Нами был проведен гистоморфометрический анализ нишеобразующих структур микроокружения костного мозга: сосудов МЦР, эндостальных клеток, белков экстрацеллюлярного и интратрабекулярного матрикса. Сосуды МЦР определялись нами с использованием панели антител - специфичных маркеров клеток эндотелия - CD34 cl.II, CD31, фактор фон Виллебранда (vWF), характеризующих различную степень зрелости сосудов микроциркуляторного русла. ИГХ исследования показали тенденцию к увеличению количества сосудов при диффузной инфильтрации по сравнению с контрольной группой. Для дальнейших сравнений нами были выбраны средние значения удельной площади сосудов, полученные с антителами CD34. Этот маркер позволяет объективизировать оценку микрососудистого русла различной степени зрелости, включая популяцию незрелых эндотелиальных клеток. 87 При сравнении удельной площади сосудов (CD34 cl.II) между нодулярной и интерстициальной типами инфильтрации значения достоверно не отличались 12,3±2,5% и 13,1±1,2% соответственно (р > 0,05), выделить пороговое значение для этих типов инфильтрации не удалось, но тенденция увеличения удельной площади сосудов прослеживалась при окраске со всеми антителами. При морфометрическом анализе были показаны достоверные отличия между группой сравнения и пациентами с ХЛЛ – в контрольной группе площадь сосудов составила 9,1±1,2%, при нодулярной инфильтрации 12,3±2,5%, при интерстициальной 13,1±1,2%, при диффузной 17,9±3,7% (р ≤ 0,05). При этом во всех группах плотность сосудов была сильнее увеличена в субэндостальных зонах и зонах лимфоидной инфильтрации костного мозга. Наличие или отсутствие соматических мутаций в экспрессии генов вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов (IgVH) является серьезным прогностическим показателем при ХЛЛ. Отсутствие мутации связывают с быстрым прогрессированием заболевания, в то время как гипермутации являются благоприятными для прогноза заболевания. Исследования профиля экспрессии генов при ХЛЛ показали, что существует корреляция между экспрессией 70-kd дзета-ассоциированного белка (Zap70) и статусом гипермутаций, до 97% Zap70+ больных имеют немутантную конфигурацию гена IgVH, а 94% Zap70- больных имеют соматическую гипермутацию. Такая сильная корреляция экспрессии с мутационным статусом IgVH наблюдается только при ХЛЛ. Таким образом, Zap70 может служить суррогатным маркером прогноза для ХЛЛ [29, 161]. Наши данные показали зависимость экспрессии белка Zap70 и типа инфильтрации костного мозга. Во всех случаях диффузной инфильтрации костного мозга (52 случая) большинство лейкозных клеток были положительны (до 90%), в то время как при нодулярной инфильтрации экспрессии в подавляющем большинстве случаев (15 из 18) обнаружено не было, в 4 случаях экспрессия была выявлена в 40% клеток. Интерстициальная инфильтрация (26 случаев) костного мозга отличалась переменной экспрессией Zap70 – в 9 случаях экспрессия до 40% клеток, в 12 случаях экспрессия до 60% клеток, в 5 случаях отсутствие экспрессии Zap70. Мы проанализировали зависимость между площадью сосудов и экспрессией Zap70 и выявили уверенную корреляцию между этими показателями (R=0,7, р < 0,05, N=96). В немногочисленных исследованиях по изучению площади сосудов в костном мозге при ХЛЛ получены противоречивые данные. Некоторые исследования продемонстрировали, что повышенное обилие сосудов является фактором плохого прогноза, ассоциировано с дальнейшей прогрессией и с химиоустойчивостью опухоли. Однако, не все исследователи определяют роль этого фактора в развитии заболевания, так есть работы, в которых не 88 показано статистически значимое изменение площади сосудов, что может быть связано с недостаточной выборкой пациентов [167]. Следует подчеркнуть, что нами были определены площади сосудов с применением панели антител, а также с одновременным анализом экспрессии маркера прогноза Zap70 и были получены убедительные данные, говорящие о том, что площадь сосудов МЦР изменяется в зависимости от стадии инфильтрации костного мозга и может служить маркером прогноза в развитии ХЛЛ. Эндостальная выстилка образована остеобластами, остеогенными клеткамипредшественниками (часто обозначаемыми как «клетки костной выстилки» — bone-lining cells) и остеокластами; при этом остеобласты рассматриваются как главный клеточный компонент эндоста, отвечающий за регуляцию ГСК [22, 106]. Анализ количества эндостальных клеток показал статистически значимые отличия между группой с диффузной инфильтрацией костного мозга и контролем - 2,3±0,4 клеток на единицу измерения и 1,4±0,2 клеток на единицу измерения соответственно (р ≤ 0,05). Достоверных отличий между контрольной группой (1,4±0,2) и группами с нодулярной (1,3±0,5) и интерстициальной (1,8±0,4) инфильтрацией получено не было (р ≥ 0,05). Маркер CD146 (MCAM) первоначально был идентифицирован как онкомаркер меланомы, но последние работы показывают, что CD146 участвует в различных физиологических процессах, таких как сигнальная трансдукция, миграция клеток, дифференцировка мезенхимальных клеток и ангиогенез. В основном CD146+ клетки в костном мозге - это субэндотелиальные клетки, которые принимают участие в регуляции ангиогенеза. В исследованиях было показано, что во многих органах определяется экспрессия CD146 на периваскулярных клетках, в основном на перицитах. CD146/MCAMпозитивные клетки являются важной составляющей ниши ГСК. Роль CD146+ стромальных элементов в том, что они экспрессируют CXCL12 и другие продукты экспрессии генов, причастных к регулированию ГСК. Показано, что CD146+ клетки поддерживают долгосрочное нахождение ГСК в нише через клеточные контакты, и, по крайней мере, частично посредством активации Notch-сигналинга [70]. В наших исследованиях количество клеток, в которых была обнаружена экспрессия CD146, было увеличено при диффузном типе поражения костного мозга по сравнению с контрольной группой (р < 0,05). Экспрессия CD146 наблюдалась не только на клетках эндоста, но и в субэндостальных зонах. Характерной чертой ХЛЛ является накопление в организме иммунологически дефектных долгоживущих лимфоцитов [1, 55]. В исследованиях in vitro было показано, что длительность жизни лейкозных клеток определяется адгезивными взаимодействиями с кроветворным микроокружением, в результате которых блокируется клеточный апоптоз. 89 Адгезия осуществляется посредством адгезивно-рецепторных молекул клеточных мембран и компонентов экстрацеллюлярного матрикса, участвующих в проведении внутриклеточных регуляторных сигналов, экспрессия которых регулируется цитокинами. Изменение продукции цитокинов стромальными клетками через воздействие на рецепторный аппарат клеточных мембран, может приводить к нарушению механизма регуляции клеточного цикла, удлинению срока жизни лимфоцитов и их дифференцировки. При импрегнации серебром у больных ХЛЛ наблюдалось увеличение числа ретикулярных клеток в интрамедуллярных пространствах и развитие очагов фиброза, что также определяется в основном при диффузном типе поражения костного мозга. При гистологических и иммуногистохимических исследованиях отмечалась тенденция перераспределения коллагенов I, III, IV типов. Эти изменения могут быть причиной нарушения секреции и соотношения гуморальных факторов регуляции гемолимфопоэза и, как следствие, приводить к нарушению пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Коллагены – важные структурные белки экстрацеллюлярного матрикса. Содержание коллагена в костном мозге определяется его контролируемой продукцией и деградацией популяциями коллаген-продуцирующих клеток, таких как фибробласты и эндотелиальные клетки. Фибробласты продуцируют коллаген I и III типов, в то время как эндотелиальные клетки продуцируют коллаген IV типа. Между этими клетками есть различие и в топографической ориентации, так фибробласты окружают костномозговые синусы и чередуются с гемопоэтическими клетками в костномозговой паренхиме, эндотелиальные клетки образуют стенки сосудов МЦР. Накопление коллагена в костном мозге может быть обусловлено усилением синтеза, нарушением деградации коллагена или обоими механизмами вместе. В то же время усиление синтеза коллагена может быть связано не только с повышенным уровнем его продукции клетками, но и с увеличением количества этих клеток [106, 121, 147]. Нами были отмечены изменения в распределении коллагенов разных типов по мере нарастания фиброзных изменений, так была показана тенденция увеличения количества коллагена I и III типов, в то время как коллаген IV типа и ламинин практически не определялись, сосуды имели прерывистую базальную мембрану. Коллаген I типа в костном мозге во всех случаях отмечается в трабекулах и стромальных клетках рядом с ними. Коллаген III типа определяется в зонах эндоста, рядом с мегакариоцитами. Представленные результаты изучения состояния стромы костного мозга больных ХЛЛ свидетельствуют о реакции стромального микроокружения на появление опухолевых клеток в интрамедуллярных пространствах губчатого вещества кости. Как мы 90 отмечали ранее, именно в костной ткани присутствует специализированная популяция стромальных остеогенных клеток, формирующих нишу для предшественниц гемолимфопоэза. Указанная категория клеток определяет, в частности, развитие стволовых клеток в направлении В-лимфопоэза. Ключевыми структурными компонентами, формирующими нишу, являются эндостальные стромальные клетки губчатого вещества кости, которые совместно с нарабатываемыми ими гуморальными регуляторными факторами и экстрацеллюлярным матриксом при участии микрососудов обеспечивают реализацию генетической программы пролиферации и дифференцировки стволовых клеток, включая лимфоидные предшественники, из которых может возникнуть пул неопластических клеток при ХЛЛ [133, 137, 174]. Как следует из наших исследований, отчетливые изменения регистрировались именно в эндостальных зонах, где происходит перестройка соотношения эндостальных клеток и системы микроциркуляции. Это обстоятельство может служить весомым аргументом, указывающим на возможность перестройки функционального потенциала гемопоэтической ниши. На сегодняшний день твердо установлено значение дефектов ниши в расстройствах гемолимфопоэза, вплоть до непосредственного участия стромальных элементов формирующих нишу в появлении лейкозного клона [3, 13, 65, 159]. На наш взгляд вероятность важной, если не ключевой, роли в патогенезе ХЛЛ дефектов стромального микроокружения очень высока. Прежде всего, это может быть связано с тем, что дефекты ниши могут приводить к нарушению сигнальных путей запуска генетически детерминированной программы пролиферации и дифференцировки нормальных гемопоэтических предшественников, включая клеткипредшественницы В-лимфопоэза. В условиях дисбаланса сигнальных путей вероятность появления неопластического клона крайне высока, а функция ниши может перейти на поддержание трансформированных клеток. Таким образом, отмеченные морфологические особенности стромы костного мозга больных ХЛЛ могут быть обусловлены как первичным поражением кроветворного микроокружения, так и цитокиновым дисбалансом в результате воздействия на строму лейкозного клона. Полученные нами результаты относительно дефектов стромы при разных типах инфильтрации могут свидетельствовать как о биологической гетерогенности заболевания, так и о постепенном развитии опухолевого процесса. Взаимоотношения строма – паренхима в системе гемолимфопоэза является базисным для развития и созревания миелоидных и лимфоидных клеток в норме и на основании полученных нами данных можно говорить о роли дефектов стромальных нишеобразующих структур в прогрессии ХЛЛ. 91 Другая часть наших исследований была посвящена оценке стромально- паренхиматозных особенностей лимфатических узлов при ХЛЛ. По данным литературы такой анализ не проводился. Настоящее исследование было направлено на анализ нишеобразующих элементов стромы – дендритных клеток и сосудов МЦР. В функциональном отношении клетки лимфоидной системы могут быть разделены на три типа: стволовые кроветворные клетки, клетки-предшественники первичных лимфоидных органов, клетки вторичных лимфоидных органов. По типу клеточного обновления лимфоидная ткань занимает одно из первых мест. Развитие лимфоидных клеток не прекращается всю жизнь - это необходимо для “подстройки” иммунитета к постоянно изменяющейся иммунологической ситуации. Основная функция лимфоузлов состоит в обеспечении взаимодействия антигена, который поступает туда по афферентным лимфатическим сосудам, с Т- и В-лимфоцитами, мигрирующими из крови [2, 5]. Ультраструктурные исследования стромы лимфоузлов показали, что число микрососудов в лимфоузлах пациентов с лимфаденопатиями было обычно низким и значительно возрастало при В-клеточных НХЛ. При опухолях промежуточной степени злокачественности зарегистрировано значительное повышение количества микрососудов, а самое высокое количество наблюдалось при лимфомах высокой степени злокачественности [53]. Эти данные подтверждают мнение, что ангиогенез повышается с ростом злокачественности, и подчеркивают его роль как эпигеномного фактора при Вклеточном прогрессировании. Формирование сосудов в опухолях происходит на фоне изменений экстрацеллюлярного матрикса. Это приводит к развитию неполноценных сосудов преимущественно капиллярного типа, имеющих нередко прерывистую базальную мембрану и нарушенную эндотелиальную выстилку. Эндотелий может замещаться опухолевыми клетками, а иногда и вовсе отсутствовать. В лимфатических узлах при ХЛЛ нами показано увеличение количества мелких сосудов на фоне сниженной экспрессии белков внеклеточного матрикса – коллагена IV типа, ламинина и десмина. Для многих опухолей показана связь плотности микрососудов с прогрессией заболевания. Недавно была установлена зависимость показателей выживаемости при ХЛЛ от сывороточного уровня факторов ангиогенеза – фактора роста эндотелия сосудов VEGF и роста фибробластов bFGF [1]. Одной из причин повышенного интереса к механизмам ангиогенеза явилось наличие некоторых нарушений данного процесса в отличие от нормального физиологического ангиогенеза. Особенности строения кровеносных сосудов на разных стадиях их формирования определяются уровнем экспрессии и характером 92 взаимодействия различных ангиогенных факторов. В результате реализации аутокринных и паракринных механизмов регуляции уровня ангиогенных факторов, секретируемых эндотелиальными клетками и клетками экстрацеллюлярного матрикса, происходит формирование «локальных очагов васкуляризации», в которых происходит активное прорастание ткани кровеносными капиллярами, как в норме, так и при патологии. В качестве регуляторов ангиогенеза могут выступать белковые соединения, продуцируемые различными клетками — лимфоцитами, макрофагами, тучными, эндотелиальными клетками, опухолевыми и др. Известно, что ангиогенез в опухоли происходит в условиях нарушенных межклеточных и паренхиматозно-стромальных взаимоотношений. Наряду с факторами роста в процессе ангиогенеза имеет большое значение состав экстрацеллюлярного матрикса стромы опухоли [6]. Белки экстрацеллюлярного матрикса, такие как коллагены I, III, IV типа, ламинин, десмин практически не определяются при ХЛЛ, в то время как экспрессия их в контрольной группе выявляется рядом с сосудистым компонентом, в воротах лимфатических узлов, под капсулой и в Т-зависимой зоне. Морфометрический анализ сосудов показал статистически достоверное увеличение площади сосудов при ХЛЛ 12,8±0,3% по сравнению с контролем 6,5±0,5% (р ≤ 0,05). Ключевая роль развития лимфоидных предшественников в лимфатических узлах принадлежит дендритным ретикулярным клеткам. Исследования последних лет показали изменения количества дендритных ретикулярных клеток в зависимости от гистологического варианта лимфом. Так, лимфомы фолликулярного типа сопровождаются увеличением количества ретикулярных клеток, в то время как при диффузных лимфомах отмечено уменьшение их числа и значительные деструктивные изменения. Данные о вовлечении в патологический процесс дендритных ретикулярных клеток при НХЛ были подтверждены при иммуногистохимических и экспериментальных исследованиях [2, 7]. Работы, посвященные изучению дендритных клеток при некоторых формах опухолей, показали, что количество и иммунофенотип ДК, их распределение в опухолевой и непораженной ткани отражаются на прогнозе этих новообразований [8, 120]. Нами показана дезинтеграция сети ФДК лимфоузлов. ИГХ исследования с панелью антител показали интересные данные, так не была отмечена выраженная экспрессия маркера дендритных клеток FDС CNA.42, антигены CD23 и CD21 выявлялись на опухолевых клетках, маркер CD35 также определялся в небольшом количестве наблюдений и в небольшом процентном соотношении, фасцин, маркирующий интердигитальные и фолликулярные дендритные клетки, присутствовал в уменьшенном объеме по сравнению с контролем. Эти данные свидетельствуют о дезинтеграции сети 93 ФДК в лимфатических узлах, косвенно говорят о сокращении их количества под действием опухолевого клона и, вероятно, судя по отсутствию экспрессии ряда маркеров, о смене их фенотипа. Исследования ФДК показали гетерогенность их клеточной популяции, так ФДК из светлой зоны герминативного центра и темной зоны имеют разные поверхностные маркеры, так экспрессия DRC-1 и CD23 характерна для клеток из светлой зоны вторичного фолликула. ФДК считаются наиболее важным фактором, определяющим состав лимфоидной популяции и влияющим на регулирование функциональной активности лимфоидных клеток. Они могут создавать не только противоопухолевые, но и проопухолевые стимулы. Дендритные клетки совместно с TGF β способствуют дифференцировке предшественников FoxP3-клеток в зрелые CD4+ FoxP3клетки. С другой стороны, они не только презентируют опухолевые антигены натуральным киллерам и цитотоксическим клеткам, которые обеспечивают противоопухолевый иммунитет, но и принимают непосредственное участие в элиминации опухолевых клеток [74, 120]. Напомним, что ХЛЛ характеризуется накоплением CD5+ долгоживущих клеток, устойчивых к апоптозу [58, 109]. Несмотря на их долгую жизнь in vivo, ХЛЛ клетки часто уходят в апоптоз в условиях in vitro - клетки не получают сигналов выживания, которые присутствуют в микроокружении in vivo. Сокращение числа ФДК в лимфатических узлах больных ХЛЛ и изменения в их фенотипе, что показано в наших исследованиях, может являться благоприятным фактором для выживания и прогрессии лейкозного клона. Возможно, опухолевые клетки создают условия для подавления системы фолликулярных дендритных клеток на цитокиновом уровне. С другой стороны при некоторых вариантах лимфом показано увеличение количества дендритных клетки, как в опухолевых инфильтратах, так и в непораженных участках лимфатических узлов. Исследователи предполагают, что дендритные клетки совместно с другими компонентами стромы лимфатических узлов могут изменять свою морфологию и выполняемые функции и обеспечивать поддержание лейкозного клона, создавать условия для пролиферации и быстрого роста опухолевой массы [109]. Вполне допустима мысль, что сокращения количества ФДК на самом деле не происходит, однако поверхностный аппарат клеток изменяется и они приобретают мутантный фенотип. Биологическое значение этого факта еще предстоит выяснить, но уже сейчас очевидна вовлеченность дендритных клеток в генез неопластической трансформации лимфоидных предшественников и их роль в поддержание лейкозного клона. Обсуждая результаты сочетанного анализа, стоит отметить, что сохраняется общая тенденция, которая была обнаружена при изучении отдельных вариантов поражения 94 костного мозга. При усилении опухолевой инфильтрации в паренхиме подвздошной кости больных ХЛЛ также происходят изменения нишеобразующих структур – увеличение количества сосудов МЦР, количества клеток на эндосте, одновременно замечены более сильные поражения лимфатических узлов, в которых также отмечается усиление сосудистого рисунка и сокращение сети ФДК. Нами были обнаружены единичные случаи, которые не вписываются в эту концепцию – так при интерстициальном и диффузном поражении костного мозга изменения в лимфатических узлах были не так ярко выражены в 6 случаях. Мы предполагаем, что это может быть связано с тем, что пациенту был диагностирован ХЛЛ в самом начале патологического процесса, и повреждения нишеобразующих структур еще не успели генерализоваться. В большинстве случаев по степени поражения костного мозга можно предполагать более сильные повреждения в лимфатических узлах, и наоборот. Таким образом, выяснение характера воздействия стромы на гемопоэз остается актуальной задачей для гематологии. Для решения проблемы регуляторных воздействий целесообразно использование морфологических методов, включая ИГХ, так как факты, полученные с применением морфологических методов при изучении костного мозга и лимфоидной ткани в норме и при нарушениях кроветворения, способствуют дальнейшей конкретизации роли отдельных компонентов кроветворной и лимфоидной стромы в нормальном и малигнизированном гемолимфопоэзе. Злокачественная трансформация ГСК достигается при наличии нескольких условий, так на сегодняшний день основными принято считать следующие – генетические изменения в клетке, невозможность уйти в апоптоз, а также благоприятное микроокружение для развития и прогрессии опухолевого клона. Имеется большое количество фактов о различных нарушениях при малигнизации ГСК и их коммитированных в различных направлениях потомков. Они включают в себя молекулярно-генетические и клеточные механизмы. Давно изучается роль экспрессии онкогенов, гуморальных ингибиторов и стимуляторов пролиферации, цитокинов, факторов апоптоза и ангиогенеза, дисфункции иммунной системы и другие процессы, но только в последние годы стали проводиться исследования о роли гемопоэтической ниши в злокачественной трансформации ГСК [106, 133, 149, 158, 163]. Полученные нами результаты подтверждают существующее положение о роли дефектов ниши в злокачественной трансформации ГСК и освещают некоторые особенности патогенеза ХЛЛ, в частности дают представление о морфофункциональных перестройках стромальных нишеобразующих элементов костного мозга и лимфатических узлов, имеющих существенное значение в процессе малигнизации лимфоидных клетокпредшественниц при этом заболевании. 95 Как известно, в постнатальном периоде формирующая гемопоэтическую нишу эндостальная зона является основным местом локализации стволовых кроветворных клеток. Здесь же определяется их дифференцировка в лимфоидном направлении, продвижение от эндоста в экстравазальных пространствах к синусоидам и далее в лимфоидную ткань [106, 144, 175]. Регуляторный эффект стромальной ниши осуществляется путем прямых контактов стромальных клеток с кроветворными предшественниками, а также посредством нарабатываемых стромой гуморальных факторов стимуляции и ингибирования процессов пролиферации и дифференцировки ГСК. Контроль над формированием рецепторного аппарата лимфоцитов и их спецификации в основном лежит на клетках стромального микроокружения костного мозга и тех лимфоидных органов и тканей, куда попадают лимфоциты. Любые нарушения клеток микроокружения могут приводить к аберрациям функционального статуса лимфоидных клеток, в частности их рецепторного аппарата. In vitro было показано, что развитие В-лимфоцитов в условиях нормального лимфопоэза определяется их адгезивным взаимодействием со стромой [151]. У больных ХЛЛ эти взаимодействия нарушены из-за неполноценности адгезивных молекул и нарушения продукции стромой гуморальных факторов, определяющих продолжительность жизни лимфоцитов при ХЛЛ. Изменения структурной организации и функции клеток кроветворного микроокружения могут стать одной из причин нарушения механизмов регуляции нормального В-лимфопоэза, приводящих к развитию заболевания. В-лимфопоэз не ограничивается только костным мозгом, в нем происходит «вертикальная» образование дифференцировка «наивного» В-лимфоцита, В-лимфоцита. результатом Дальнейшее которой созревание является В-лимфоцитов происходит в лимфатических узлах, во вторичном зародышевом фолликуле под воздействием антигена, который является для В-лимфоцитов основным фактором роста и дифференцировки. Здесь огромное значение играет состояние микроокружения, основными составляющими являются дендритные клетки, ретикулярные клетки, экстрацеллюлярный матрикс и нарабатываемые стромой цитокины. Если «наивный» лимфоцит попадает в измененное микроокружение, то вероятность развития опухоли и дисбаланса пролиферации/апоптоза увеличивается многократно. В настоящее время общепризнанной является точка зрения, что в основе развития злокачественной ткани лежит дефект стволовой клетки [4]. Так, относительно лейкозного процесса принято считать, что лейкемизация возникает из одной клетки, весь процесс поддерживается небольшим числом лейкозных стволовых клеток. При этом обсуждаются два основных пути становления лейкозного процесса. Первый – стохастический – 96 характеризуется наличием опухолевой массы, состоящей из гетерогенной популяции незрелых опухолевых клеток, небольшая часть которых способна к самоподдержанию и дифференцировке, при этом выбор происходит случайно. Иерархическая гипотеза подразумевает существование опухолевой популяции, в которой незначительная часть клеток поддерживает заболевание. Предполагается, что стволовые клетки, детерминированные к миелоидной дифференцировке, могут изменяться таким образом, что начинают использовать гены, уже не экспрессирующиеся на этой стадии дифференцировки, то есть гены стволовых клеток. Кроме указанных существует гипотеза, согласно которой опухоль может появиться первоначально не из стволовой кроветворной клетки, а из коммитированных клеток, претерпевших генетические трансформации, в результате чего приобрели свойства стволовых и способны к самоподдержанию. Наконец высказывается предположение, что трансформация стволовой клетки происходит в эмбриональном периоде, она сохраняется после рождения и по мере истощения пула стволовых клеток и наступления времени выхода ее в пролиферацию и дифференцировку происходит появление лейкозного клона. Обобщая современные сведения и учитывая собственные данные о состоянии стромы костного мозга при малигнизированном гемопоэзе, считаем возможным дополнить существующие гипотезы лейкозогенеза собственным представлением об этом процессе, а именно, роли в его становлении дефектов стромальной ниши стволовых клеток (рис. 27). Наши данные о состоянии эндоста при малигнизированном кроветворении свидетельствуют о резко выраженных изменениях структур, формирующих нишу стволовой клетки. Вне зависимости от характера их генеза – вторичного или первичного, они в любом случае приводят к нарушениям развития стволовой клетки. Так в первом случае возникший и развивающийся лейкозный клон кроветворных клеток способен привести первоначально к функциональным, а затем структурным изменениям стромального микроокружения, формирующего гемопоэтическую нишу. Основным итогом этого является нарушение регуляции нормального гемопоэза, что создает благоприятные условия для прогрессии лейкоза. Наряду с этим, возможен второй путь, при котором происходит первичное поражение стромальных элементов кроветворной ниши. Это приводит к извращению генетической программы нормальной пролиферации и дифференцировки стволовых клеток гемолимфопоэза, результатом чего является становление дисмиелопоэза с последующим появлением лейкозного клона. Например, одним из пусковых механизмов подобного процесса может быть вирусное поражение стромальных элементов, что подтверждается проведенными ранее исследованиями, в 97 которых нами были выявлены в клетках стромы внутриядерные включения вирусной природы и доказанной способности вирусов персистировать в стромальных клетках костного мозга. Считаем, что наша гипотеза может быть проверена в будущем и принципиально не должна отвергаться. Деструкция стромальной архитектоники нишеформирующих структур костного мозга и лимфатических узлов может являться ключевым фактором становления и развития ХЛЛ. В условиях малигнизации миелоидных и лимфоидных предшественников характер перестроек нишеобразующих структур костного мозга и лимфоидной ткани имеет важное значение для установления причин развития системных заболеваний крови, определении тактики лечения, оценке его эффективности и прогнозировании возможных путей развития системных заболеваний кроветворной и лимфоидной ткани. В заключение необходимо отметить, что изучение роли ниши в нормальном и малигнизированном гемолимфопоэзе только начинает разрабатываться. Эта проблема волнует умы многих ученых и объем накопленных разрозненных данных о роли микроокружения достиг того предела, когда приходит осознание, что в кроветворной ткани взаимодействие строма-паренхима имеет основополагающее значение для развития ГСК. В решении этой проблемы сочетанный морфологический, иммуноморфологический, молекулярно-генетический микроокружения необходим анализ для нишеобразующих обнаружения структур стромального причинно-следственных связей, определяющих развитие и прогрессию многих заболеваний системы крови, а также для поиска новых мишеней терапии этих заболеваний. Рисунок 27. Концепция роли дефектов нишеобразующих элементов кроветворной и лимфоидной стромы в малигнизированном миелолимфопоэзе. 99 ВЫВОДЫ 1. У больных хроническим лимфолейкозом, независимо от характера инфильтрации лимфоцитами паренхимы костного мозга – нодулярного, интерстициального или диффузного, наблюдаются морфофункциональные изменения структур стромального микроокружения, формирующих нишу гемопоэтических стволовых клеток. 2. Характерной особенностью развития ХЛЛ является достоверное увеличение количества эндостальных стромальных клеток интрамедуллярных пространств, включая CD146+ клетки, (р < 0,05) и перестройки структурной организации клеточных и внеклеточных элементов стромы поверхности костных трабекул, являющихся анатомическими зонами локализации и длительного самоподдержания стволовых клеток. 3. При опухолевой лимфоидной инфильтрации в костном мозге больных ХЛЛ выявлено достоверное усиление плотности микрососудов костных лакун подвздошной кости, включая эндостальные участки, при этом наиболее выраженные изменения отмечались при диффузном поражении кроветворной ткани (в 2 раза). 4. Установлена корреляция между прогностическим фактором - экспрессией молекулы Zap70 на опухолевых клетках и плотностью микрососудов на материале трепанобиоптатов больных ХЛЛ (R=0,7, р < 0,05), что свидетельствует о неблагоприятном типе течения заболевания при увеличении плотности сосудов в паренхиме костного мозга. 5. В лимфатических узлах больных ХЛЛ обнаруживаются нарушения структурной организации паренхиматозной и стромальной ткани, наблюдаются качественные и количественные изменения ключевых элементов лимфоидной стромы, участвующих в поддержании лимфопоэза, а также перестройка экстрацеллюлярного матрикса. 6. Характерными особенностями опухолевой инфильтрации лимфатических узлов при ХЛЛ является дезинтеграция сети фолликулярных дендритных клеток, изменение их фенотипа и снижение количества в 3 раза (р < 0,05), увеличение плотности микрососудов в 2 раза (р < 0,05) и изменение экстрацеллюлярного матрикса лимфоидной ткани (распределение коллагенов III, IV типов, десмина, ламинина). 7. Установленные качественные и количественные изменения стромальных нишеобразующих структур костного мозга и лимфатических узлов указывают на вовлечение кроветворной и лимфоидной ниш в генез неопластической трансформации лимфоидных предшественников у больных ХЛЛ и свидетельствуют о перестройке функций микроокружения, направленных на поддержание лейкозного клона при этом заболевании. 100 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При установлении диагноза ХЛЛ рекомендован анализ состояния кроветворной ткани больных ХЛЛ на материале трепанобиопсий подвздошной кости. Необходимо оценивать характер лимфоидной инфильтрации (нодулярный, интерстициальный, диффузный) и пролиферативный потенциал опухолевых клеток. 2. Наряду с выделением типов опухолевой инфильтрации необходимо изучение гистоморфологических особенностей нишеобразующих структур костного мозга, таких как плотность сосудов микроциркуляторного русла, количество клеток на эндосте и их фенотип, распределение коллагенов I, III, IV типа. Помимо стандартных гистологических окрасок для более точного анализа этих структур целесообразно проводить иммуногистохимическое исследование с антителами CD34 cl.II, CD146, collagen I, collagen III, collagen IV. 3. При изучении биоптатов лимфатических узлов у больных ХЛЛ для дифференциальной диагностики следует проводить иммуногистохимические исследования как для установления фенотипа опухолевых клеток (CD3, CD5, CD10, CD20, CD23, CD79α, Cyclin D1, Bcl2, Bcl6, ki67), так и для характеристики состояния фолликулярных дендритных клеток (CD35, Anti-fascin, Anti-FDC CNA.42), ангиогенеза (CD31, CD34 cl.II) и измерения уровня экспрессии белка Zap70. 4. Сочетанный гистоморфологический анализ стромальных структур кроветворной и лимфоидной ниш может быть использован в практической работе в целях уточнения прогноза течения заболевания и для оценки эффективности проводимой терапии при повторных исследованиях костного мозга и лимфатических узлов в динамике заболевания. 101 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ CAR-клетки – CXCL12+ ретикулярные клетки костного мозга BMP 2, 4, 6 – костные морфогенетические белки 2, 4, 6 MHC I (II) – молекула гистосовместимости I (II) класса SNO-клетки – N-кадгерин+ остеобласты TBLA – трабекулярная костная область ГИМ – гемопоэзиндуцирующее микроокружение ГСК – гемопоэтическая стволовая клетки ДК – дендритная клетка ИГХ – иммуногистохимия ИЛ 4, 6, 8 – интерлейкины 4, 6, 8 КМ – костный мозг ЛСК – лейкозная стволовая клетка мДК – миелоидная дендритная клетка МДС – миелодиспластический синдром ММСК – мультипотентная мезенхимальная стволовая клетка МПС – миелопролиферативный синдром МСК – мезенхмимальная стромальная клетка МЦР – микроциркуляторное русло НХЛ – неходжкинская лимфома ОМЛ – острый миелоидный лейкоз ФДК – фолликулярная дендритная клетка ХЛЛ – хронический лимфолейкоз ХМЛ – хронический миелоидный лейкоз 102 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Бакиров, Б.А. Клинико-патогенетическая характеристика и факторы прогноза в развитии и течении хронического лимфолейкоза: автореферат дис. … д-ра.мед.наук: 14.01.21 / Бакиров Булат Ахатович. – СПб., 2013. – 46 с. 2. Белянин, В.Л., Цыплаков Д.Э. Диагностика реактивных гиперплазий лимфатических узлов / В.Л. Белянин, Д.Э. Цыплаков. – СПб-Казань, 1999. – 328 с. 3. Бессмельцев, С.С. Множественная миелома (патогенез, клиника, диагностика, дифференциальный диагноз). Часть 1 / С.С. Бессмельцев // Клин. Онкогематол. – 2013. — Т.6, N3. — С. 237-58. 4. Дризе, Н.И. Различия между лейкозными и нормальными кроветворными стволовыми клетками / Н.И. Дризе // Онкогематология. – 2006. – Т. 1, №2. – С. 5-9. 5. Киселева, М.В. Морфо-функциональное состояние стромы лимфатических узлов при некоторых лимфопролиферативных заболеваниях: дис. … канд. мед. наук: 14.00.29 / Киселева Мария Витальевна. – СПб., 2001. – 128 с. 6. Коган, Е.А. Автономный рост и прогрессия опухолей / Е.А. Коган // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2002. – Т.12, №4. – С. 45-49. 7. Криволапов, Ю.А. Морфологическая диагностика лимфом / Ю.А. Криволапов, Е.Е. Леенман. – СПб.: Коста., 2006. – С. 45-48. 8. Леенман, Е.Е. Место дендритных клеток в микроокружении при лимфоме Ходжкина /М.С. Мухина, К.М. Пожарисский, Е.Е. Леенман и др. // Архив патологии. – 2010. – №2. – С. 3-7. 9. Лелявский, А.А. Ниша гемопоэтических стволовых клеток invivo: «увидеть своими глазами» / А.А. Лелявский // КТТИ. – 2009. – №1. – С. 32-38. 10. Пальцев, М.А. Что есть стволовая клетка / В кн.: Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Том 1. Под ред. М.А. Пальцева. — М.: ОАО «Изд. «Медицина», изд. «Шико». – 2009. – С. 13-31. 11. Райт, Д. Морфологическая диагностика патологии лимфатических узлов / Д. Райт, Б. Эддис, Э. Леонг. – М.: Мед.лит., 2008. – С. 42-86. 12. Ругаль, В.И. Морфофункциональная характеристика стромы костного мозга в норме и при остром миелобластном лейкозе: дис. … д-ра. мед. наук: 14.01.21 / Ругаль Виктор Иванович. – Ленинград, 1989. – 297 с. 13. Ругаль, В.И. Структурные особенности паренхимы и стромы костного мозга больных множественной миеломой / В.И. Ругаль, С.С. Бессмельцев, Н.Ю. Семенова и др. // Биомед. журн. Medline.Ru. – 2012. - Т.13. – С. 515-23. 103 14. Ругаль, В.И. Особенности нишеобразующих структур и стромы костного мозга больных хроническим лимфоцитарным лейкозом / В.И. Ругаль, С.С. Бессмельцев, Н.Ю. Семенова и др. // Биомедицинский журнал Medline.Ru. – 2013. – Т.14. – С. 347-361. 15. Ругаль, В.И. Морфология синусоидальных сосудов гемопоэтической ниши костного мозга / В кн.: Актуальные вопросы медицинских морфологических дисциплин. Коллективная монография под ред. В.П. Волкова. - Новосибирск: Изд. «СибАК». – 2014. – С. 62-80. 16. Ругаль, В.И. Состояние интрамедулярной стромы больных неходжкинскими лимфомами с поражением костного мозга / В.И. Ругаль, Н.Ю. Семенова, С.С. Бессмельцев // Вестник гематологии. – 2011. - Т. VII, №2. – С. 36-37. 17. Ругаль, В.И. Нишеобразующие структуры стромы костного мозга и лимфатических узлов при хроническом лимфолейкозе / В.И. Ругаль, Н.Ю. Семенова, С.В. Волошин, С.С. Бессмельцев // Гены и клетки. – 2014. - Т. IХ, №2. – С. 30-134 18. Свирновский, А. И. Хронический лимфоцитарный лейкоз: парадигмы и парадоксы / А.И. Свирновский // Медицинские новости. – 2008. – №13. – С. 7-19. 19. Семенова, Н.Ю. Нишеобразующие элементы стромы костного мозга и лимфатических узлов при ХЛЛ / Н.Ю. Семенова, С.С. Бессмельцев, В.И. Ругаль // Гематология и трансфузиология. – 2014. – Т. 59, №1(1). – С. 62-63. 20. Стругов, В.В. Моделирование микроокружения клеток хронического лимфолейкоза в лимфатических узлах / В.В. Стругов, С.В. Жук, Р.Ш. Бадаев, П.А. Бутылин, А.Н. Зарицкий // Трансляционная медицина. – 2013. – Т. 23, №6. – С. 88-102. 21. Фриденштейн, А.Я. Клеточные основы кроветворного микроокружения / А.Я. Фриденштейн, Е.А. Лурия. – М.: Медицина, 1980. – 215 с. 22. Чертков, И.Л. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение / И.Л. Чертков, О.А. Гуревич. - М., 1984. – 238 с. 23. Шерстнева, Е.С. Клиническое значение внутриклеточного ИЛ-8 у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом / Е.С. Шерстнева, Н.В. Исаева, Т.П. Загоскина и др. // Вестник гематологии. – 2007. – Т. 3, №2. - С. 49-50. 24. Adams, G.B. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor / G.B. Adams, K.T. Chabner, I.R. Alley et al. // Nature 2006. – N. 439. – Р. 599–603. 25. Adams ,G.B. Therapeutic targeting of a stem cell niche / G.B. Adams, R.P. Martin, I.R. Alley et al. // Nat. Biotechnol. – 2007. – N. 25. – Р. 238–43. 26. Afan, A.M. Bone marrow innervation regulates cellular retention in the murine haemopoietic system / A.M. Afan, C.S. Broome, S.E. Nicholls et al. // Br. J. Haematol. – 1997. – N. 98. – Р. 569– 77. 104 27. Albesiano, E. Activation-induced cytidine deaminase in chronic lymphocytic leukemia B cells: expression as multiple forms in a dynamic, variably sized fraction of the clone / E. Albesiano, B.T. Messmer, R.N. Damle et al. // Blood. – 2003. – Vol. 102(9). – P. 3333 – 3339. 28. Ame-Thomas, P. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis / P. AmeThomas, H. Maby-El Hajjami, C. Movoisin et al. // Blood.–2007.–Vol. 109(2).–P. 693–702. 29. Amin, S. Zap 70 in chronic lymphocytic leukemia / S. Amin, A. Parker, J. Manu // Int J Biochem Cell Biol. – 2008. – Vol. 40(9). – P. 1654–1658. 30. Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche / F. Arai, A. Hirao, M. Ohmura et al. // Cell. – 2004. – N. 118. – Р. 149–61. 31. Asplund, S.L. Immunophenotype does not correlate with lymph node gistology in chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma / S.L. Asplund, R.W. McKenna, M. Howard, S.H. Croft // Am J of Surg Pathol. – 2002. – Vol. 26. – Р. 624–629. 32. Avecilla, S.T. Chemokine-mediated interaction of hematopoietic progenitors with the bone marrow vascular niche is required for thrombopoiesis / S.T. Avecilla, K. Hattori, B. Heissig et al. // Nat. Med. – 2004. – N. 10. – Р. 64–71. 33. Bäckman, E. Thioredoxin, produced by stromal cells retrieved from the lymph node microenvironment, rescues chronic lymphocytic leukemia cells from apoptosis in vitro / E. Bäckman, A.C. Bergh, I. Lagerdahl et al. // Haematologica. – 2007. – Vol. 92(11). – Р. 1495–1504. 34. Baron, R. General Principles of Bone Biology. In: Favus M.J., editor. Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism / R. Baron // Washington, DC: Amer. Society for Bone and Mineral Research. – 2003. – Р. 1–8. 35. Belloni, P.N. Microvascular endothelial cell heterogeneity: interactions with leukocytes and tumor cells / P.N Belloni, R.J. Tressler // Cancer Metastasis Rev. – 1990. – N. 8. – Р. 353–89. 36. Bessmeltsev, S. Stromal microenvironment and stem cells niche in multiple myeloma / S. Bessmeltsev, V. Rugal // Haematologica. – 2010. – Vol. 95(25). – Р. 569–570. 37. Bewry, N.N. Stat3 contributes to resistance toward BCR-ABL inhibitors in a bone marrow microenvironment model of drug resistance / N.N. Bewry, R.R. Nair, M.F. Emmons et al. // Mol. Cancer Ther. – 2008. – N. 7. – Р. 3169–75. 38. Bhatia, R. Abnormal function of the bone marrow microenvironment in chronic myelogenous leukemia: role of malignant stromal macrophages / R. Bhatia, P.B. McGlave, G.W. Dewald et al. // Blood. – 1995. – N. 85. – Р. 3636–45. 39. Binsky I., Haran N., Starlets D. et al. // Blood. – 2006. – Vol. 108(11). – P. 796. 105 40. Blau, O. Chromosomal aberrations in bone marrow mesenchymal stroma cells from patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloblastic leukemia / O. Blau, W.K. Hofmann, C.D. Baldus et al. // Exp. Hematol. – 2007. – N. 35. – Р. 221–9. 41. Bonato, M. Lymph node histology in typical and atypical chronic lymphocytic leukemia / M. Bonato, S. Pittaluga, A. Tierens et al. // Am J Surg Pathol. – 1998. - Vol. 22(1). – Р. 49-56. 42. Bradford, G.B. Quiescence, cycling, and turnover in the primitive hematopoietic stem cell compartment / G.B. Bradford, B. Williams, R. Rossi, I. Bertoncello // Exp. Hematol. – 1997. – N. 25. – Р. 445–53. 43. Brandi, M.L. Vascular biology and the skeleton / M.L. Brandi, P. Collin-Osdoby // J. Bone Miner Res. – 2006. – N. 21. – Р. 183–92. 44. Broxmeyer, H.E. Rapid mobilization of murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with AMD3100, a CXCR4 antagonist / H.E. Broxmeyer, C.M. Orschell, D.W. Clapp et al. // J. Exp. Med. – 2005. – N. 20. – Р. 1307–18. 45. Bueso-Ramos, C.E. Aberrant morphology, proliferation, and apoptosis of B-cell chronic lymphocytic leukemia cells / C.E. Bueso-Ramos, A. Ferrajoli, L.J. Medeiros et al. // Hematology. – 2004. – Vol. 9. – Р. 279–286. 46. Burke-Gaffney, A. Thioredoxin: friend or foe in human disease / A. Burke-Gaffney, M.E. Callister, H. Nakamura // Trends Pharmacol Sci. – 2005. – Vol. 26. – Р. 398–404. 47. Caligaris-Cappio, F. Role of the microenvironment in chronic lymphocytic leukaemia / F. Caligaris-Cappio // Br J Haematol. – 2003. – Vol. 123. – Р. 380-388. 48. Calvi, L.M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche / L.M. Calvi, G.B. Adams, K.W. Weibrecht et al. // Nature. – 2003. – N. 425. – Р. 841–46. 49. Calvo, W. Schwann cells of the bone marrow / W. Calvo, J. Forteza-Vila // Blood. – 1970. – N. 36. – Р. 180–8. 50. Calvo, W. On the development of bone marrow innervation in new-born rats as studied with silver impregnation and electron microscopy / W. Calvo, J. Forteza-Vila //Am. J. Anat. – 1969. – N. 126. – Р. 355–71. 51. Celso, C. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem cells in their niche / C. Celso, H.E. Fleming, J.W. Wu, C.X. Zhao // Nature. – 2009. – Vol. 457. – P. 92–96. 52. Chan, C.K. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation/ C.K. Chan, C.C. Chen, C.A. Luppen // Nature. – 2009. – Vol. 457. – P.490–494. 53. Chen, L. ZAP-70 directly enhances IgM signaling in chronic lymphocytic leukemia / L. Chen, J. Apgar, L. Huynh et al. // Blood. –2005. – Vol. 105(5). – P. 2036—2041. 106 54. Cheshier, S.H. In vivo proliferation and cell cycle kinetics of long-term self-renewing hematopoietic stem cells / S.H. Cheshier, S.J. Morrison, X. Liao, I.L. Weissman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – N. 96. – Р. 3120–5. 55. Chiorazzi, N. Chronic lymphocytic leukemia / N. Chiorazzi, K.R. Rai, Ferrarini M. // N Engl J Med. – 2005. – Vol. 352. – Р. 804–815. 56. Chirazzi, N. Evolving view of the in-vivo kinetics of chronic lymphocytic leukemia B cells / N. Chirazzi, M. Ferrarini // Hematology 2006. - ASH Education Program Book. - 2006. – P. 273—278. 57. Colmone, A. Leukemic cells create bone marrow niches that disrupt the behavior of normal hematopoietic progenitor cells / A. Colmone, M. Amorim, A.L. Pontier et al. // Science 2008. – N. 322. – Р. 1861–5. 58. Cordone, I. Monoclonal antibody Ki-67 identifies B and T cells in cycle in chronic lymphocytic leukemia: correlation with disease activity / I. Cordone, E. Matutes, D. Catovsky // Leukemia. –1992. – Vol. 6(9). – Р. 902–906. 59. Cumano, A. Ontogeny of the hematopoietic system / A. Cumano, I. Godin // Annu. Rev. Immunol. – 2007. – N. 25. – Р. 745–85. 60. De Saint-Georges, L. The microcirculation of bone and marrow in the diaphysis of the rat hemopoietic long bones / L. De Saint-Georges, S.C. Miller // Anat. Rec. – 1992. – N. 233. – Р. 169– 77. 61. Dexter, T.M. Stromal cells associated haemopoiesis / T.M. Dexter // J. Cell Physiol. – 1992. – N. 23. – P. 87-94. 62. Dexter, T.M. Stimulation of differentiation and proliferation of haemopoietic cells in vitro / T.M. Dexter, T.D. Allen, Lajtha et al. // J. Cell Physiol. – 1973. – N. 82. – Р. 461–73. 63. Dexter, T.M. Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro / T.M. Dexter, T.D. Allen, L.G. Lajtha // J. Cell Physiol. – 1977. – N. 91. – Р. 335–44. 64. Dimitroff, C.J. CD44 is a major E-selectin ligand on human hematopoietic progenitor cells / C.J. Dimitroff, J.Y. Lee, S. Rafii et al. // J. Cell Biol. 2001. – N. 153. – Р. 1277–86. 65. Duhrsen, U. Stromal abnormalities in neoplastic bone marrow diseases / U. Duhrsen, D.K. Hossfeld // Ann. Hematol. – 1996. – N. 73. – Р. 53–70. 66. Ferrara, N. The biology of vascular endothelial growth factor / Ferrara N., Davis-Smyth T. // Endocr. Rev. – 1997. – N. 18. – Р. 4–25. 67. Fleming, H.E. Wnt-signaling in the niche enforces hematopoietic stem cell quiescence and is necessary to preserve self-renewal in vivo / H.E. Fleming, V. Janzen, C. Lo Celso C et al. // Cell Stem Cell. – 2008. – N. 2. – Р. 274–83. 107 68. Fukuhara, S. Differential function of Tie2 at cell-cell contacts and cell-substratum contacts regulated by angiopoietin-1 / S. Fukuhara, K. Sako, T. Minami et al. // Nat. Cell Biol. – 2008. – N. 10. – Р. 513–26. 69. Garg, M. Prognostic significance of quantitative analysis of WT1 gene transcripts by competitive reverse transcription polymerase chain reaction in acute leukaemia / M. Garg, H. Moore, K. Tobal, J.A. Liu Yin // Br. J. Haematol. – 2003. – N. 123. – Р. 49–59. 70. Gothard, D. Prospective isolation of human bone marrow stromal cell subsets: A comparative study between Stro-1-, CD146- and CD105-enriched populations. / D. Gothard, J. Greenhough, E. Ralph // J. Tissue Eng. – 2014. – N. 5. – doi: 10.1177/2041731414551763. 71. Gromer, S. The thioredoxin system: from science to clinic / S. Gromer, S. Urig, K. Becker // Med Res Rev. – 2004. – Vol. 24. – Р. 40–89. 72. Hallek, M. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute Working Group 1996 guidelines / M. Hallek, B.D. Cheson, D. Cotovsky et al. // Blood. – 2008. – Vol. 111. – Р. 544–546. 73. Haug, J.S. N-cadherin expression level distinguishes reserved versus primed states of hematopoietic stem cells / J.S. Haug , X.C. He, J.C. Grindley et al. // Cell Stem Cell 2008. – N. 2. – Р. 367–79. 74. Herishanu, Y. The lymph node microenvironment promotes B-cell receptor signaling, NF-kappaB activation, and tumor proliferation in chronic lymphocytic leukemia / Y. Herishanu, P. Perez-Galan, D. Liu et al. // Blood. – 2011. – Vol. 117, – N. 2. – Р. 563–574. 75. Ishikawa, F. Chemotherapyresistant human AML stem cells home to and engraft within the bonemarrow endosteal region / F. Ishikawa, S. Yoshida, Y. Saito et al. // Nat. Biotechnol. – 2007. – N. 25. – Р. 1315–21. 76. Iwata, M. Human marrow stromal cells activate monocytes to secrete osteopontin, which downregulates Notch1 gene expression in CD34+cells / M. Iwata, N. Awaya, L. Graf et al. // Blood. – 2004. – N. 103. – Р. 4496–502. 77. Jacenko, O. Linking hematopoiesis to endochondral skeletogenesis through analysis of mice transgenic for collagen X / O. Jacenko, D.W. Roberts, M.R. Campbell et al. // Am. J. Pathol. – 2002. – N. 160. – Р. 2019–34. 78. Jin, L. Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells / L. Jin, K.J. Hope, Q. Zhai et al. // Nat. Med. – 2006. – N. 12. – Р. 1167. 79. Jin, L. Monoclonal antibody-mediated targeting of CD123, IL-3 receptor alpha chain, eliminates human acute myeloid leukemic stem cells / L. Jin, E.M. Lee, H.S. Ramshaw et al. // Cell Stem Cell. – 2009. – N. 5. – Р. 31–42. 108 80. Jonathan, W. Friedberg. CLL microenvironment: macro important / Jonathan W. Friedberg // Blood. – 2011. – Vol. 117(2). – Р. 377–378. 81. Jordan, C.T. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells / C.T. Jordan, D. Upchurch, S.J. Szilvassy et al. // Leukemia. – 2000. – N. 14. – Р. 1777–84. 82. Katayama, Y. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow / Y. Katayama, M. Battista, W.M. Kao et al. // Cell. – 2006. – N. 124. – Р. 407–21. 83. Katayama, Y. CD44 is a physiological E-selectin ligand on neutrophils / Y. Katayama, A. Hidalgo, J. Chang et al. // J. Exp. Med. – 2005. – N. 201. – Р. 1183–9. 84. Kiel, M.J. Lack of evidence that hematopoietic stem cells depend on N-cadherin-mediated adhesion to osteoblasts for their maintenance / M.J. Kiel, G.L. Radice, S.J. Morrison // Stem Cell. – 2007. – N. 1. – Р. 204–17. 85. Kiel, M.J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells / M.J. Kiel, O.H. Yilmaz, T. Iwashita et al. // Cell. – 2005. – N. 121. – Р. 1109–21. 86. Kim, Y.W. Defective Notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease / Y.W. Kim, B.K. Koo, H.W. Jeong et al. // Blood. – 2008. – N. 112. – Р. 4628–38. 87. Klyuchnikov, E. Sensitising leukemic cells by targeting microenvironment / E. Klyuchnikov, N. Kroger // Leuk. Lymphoma. – 2009. – N. 50. – Р. 319–20. 88. Kollet, O. Osteoclasts degrade endosteal components and promote mobilization of hematopoietic progenitor cells / O. Kollet, A. Dar, S. Shivtiel et al. // Nat. Med. – 2006. – N. 12. – Р. 657–64. 89. Korz, Ch. Evidence for distinct pathomechanisms in B-cell chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma by quantitative expression analysis of cell cycle and apoptosis-associated genes / Ch. Korz, A. Pscherer, A. Benner et al. // Blood. – 2002. — Vol. 99. – P. 4554—4561. 90. Krause, D. The Hematopoietic Stem Cell Niche—Home for Friend and Foe / D. Krause, D. Scadden, L. Preffer // Clinical Cytometry. – 2012. – Vol. 58. – P. 7–20. 91. Krause, D.S. Parathyroid hormone-induced modulation of the bone marrow microenvironment reduces leukemic stem cells in murine chronic myelogenous-leukemia-like disease via a TGFbetadependent pathway / D.S. Krause, K. Fulzele, A. Catic et al. // Blood. – 2011. – N. 118. – Р. 1670. 92. Krause, D.S. Requirement for CD44 in homing and engraftment of BCR-ABL-expressing leukemic stem cells / D.S. Krause, K. Lazarides, U.H. von Andrian, R.A. van Etten // Nat. Med. – 2006. – N. 12. – Р. 1175–80. 109 93. Krause, D.S. Selectins and their ligands are required for for homing and engraftment of BCR-ABL leukemia-initiating cells / D.S. Krause, U.H. von Andrian, R.A. van Etten // Blood. – 2005. – N. 106. – Р. 106a. 94. Kricun, M.E. Red-yellow marrow conversion: its effect on the location of some solitary bone lesions / M.E. Kricun // Skeletal Radiol. – 1985. - N. 14. – Р. 10–19. 95. Kugler, M. A recombinant trispecific single-chain Fv derivative directed against CD123 and CD33 mediates effective elimination of acute myeloid leukaemia cells by dual targeting / M. Kugler, C. Stein, C. Kellner et al. // Br. J. Haematol. – 2010. – N. 150. – Р. 574–86. 96. Lane, S.W. Differential niche and Wnt requirements during acute myeloid leukemia progression / S.W. Lane, Y.J. Wang, C. Lo Celso et al. // Blood. – 2011. – N. 118. – Р. 2849–56. 97. Li, L. The human homolog of rat Jagged1 expressed by marrow stroma inhibits differentiation of 32D cells through interaction with Notch1 / L. Li, L.A. Milner, Y. Deng et al. // Immunity. – 1998. – N. 8. – Р. 43–55. 98. Li, W. Hematopoietic stem cell repopulating ability can be maintained in vitro by some primary endothelial cells / W. Li, S.A. Johnson, W.C. Shelley, M.C. Yoder // Exp. Hematol. – 2004. – N. 32. – Р. 1226–37. 99. Lian, J.B. Bone formation: maturation and functional activities of osteoblast lineage cells. In: Favus M.J., editor. Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism / J.B. Lian, G.S. Stein, J.E. Aubin // Washington, DC: American Society for Bone and Mineral Research. – 2003. – Р. 13–28. 100. Lichtman, M.A. The ultrastructure of the hemopoietic environment of the marrow: a review / M.A. Lichtman // Exp. Hematol. – 1981. – N. 9. – Р. 391–410. 101. Maes, C. Impaired angiogenesis and endochondral bone formation in mice lacking the vascular endothelial growth factor isoforms VEGF164 and VEGF188 / C. Maes, P. Carmeliet, K. Moermans et al. // Mech. Dev. – 2002. – N. 111. – Р. 61–73. 102. Maes, C. A novel transgenic mouse model to study the osteoblast lineage in vivo / C. Maes, T. Kobayashi, H.M. Kronenberg // Ann.N.Y. Acad. Sci. – 2007. – N. 116. – Р. 149–64. 103. Martin, T.J. Osteoclast-derived activity in the coupling of bone formation to resorption / T.J. Martin, N.A. Sims // Trends Mol. Med. – 2005. – N. 11. – Р. 76–81. 104. Mateo, V. Mechanisms of CD47-induced caspase-independent cell death in normal and leukemic cells: link between phosphatidylserine exposure and cytoskeleton organization / V. Mateo, E.J. Brown, G. Biron et al. // Blood. – 2002. – Vol. 100(8). – P. 2882—2890. 105. Matsunaga, T. Interaction between leukemic-cell VLA-4 and stromal fibronectin is a decisive factor for minimal residual disease of acute myelogenous leukemia / T. Matsunaga, N. Takemoto, T. Sato et al. // Nat. Med. – 2003 . – N. 9. – Р. 1158–65. 110 106. Mayani, H. Biology of the hemopoietic microenvironment / H. Mayani, L.J. Guilbert, A. Janowaska-Wieczorek // Eur. J. Haematol. – 1992. – Vol. 49. – P. 225–233. 107. Mendez-Ferrer, S. Haematopoietic stem cell release is regulated by circadian oscillations / S. Mendez-Ferrer, D. Lucas, M. Battista, P.S. Frenette // Nature. – 2008. – Vol. 452. – P. 442–7. 108. Miyake, K. Hyaluronate can function as a cell adhesion molecule and CD44 participates in hyaluronate recognition / K. Miyake, C.B. Underhill, J. Lesley, P.W. Kincade // J. Exp. Med. – 1990. – Vol. 172. – P. 69–75. 109. Montillo, M. Chronic lymphocytic leukemia: novel prognostic factors and their relevance for risk-adapted therapeutic strategies / M. Montillo, T. Hamblin, M. Hallek et al. // Haematologica. – 2005. – Vol. 90, N. 3. – Р. 391–399. 110. Morrison, S.J. Cyclophosphamide/granulocyte colony-stimulating factor induces hematopoietic stem cells to proliferate prior to mobilization / S.J. Morrison, D.E. Wright, I.L. Weissman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1997. – Vol. 94. – P. 1908–13. 111. Mraz, M. Bone marrow stromal cells potect lymphoma B-cells from rituximabinduced apoptosis and targeting integrin alpha-4-beta-1 (VLA-4) with natalizumab can overcome this resistance / M. Mraz, C.S. Zent, A.K. Church et al. // Br. J. Haematol. – 2011. – Vol. 155. – P. 53–64. 112. Nagasawa, T. Control of hematopoietic stem cells by the bone marrow stromal niche: the role of reticular cells / T. Nagasawa, Y. Omatsu, T. Sugiyama // Trends Immunol. – 2011. – N. 32(7). – Р. 315–20. 113. Narayan, K. Effects of 5-fluorouracil or total-body irradiation on murine bone marrow microvasculature / K. Narayan, S. Juneja, C. Garcia // Exp. Hematol. – 1994. – N. 22. – Р. 142–8. 114. Nilsson, S.K. Osteopontin, a key component of the hematopoietic stem cell niche and regulator of primitive hematopoietic progenitor cells / S.K. Nilsson, H.M. Johnston, G.A. Whitty et al. // Blood. – 2005. – N. 106. – Р. 1232–9. 115. O’Malley, D.P. Morphologic and immunohistochemical evaluation of splenic hematopoietic proliferations in neoplastic and benign disorders / D.P. O’Malley, Y.S. Kim, S.L. Perkins et al. // Mod. Pathol. – 2005. – N. 18. – Р. 1550–61. 116. Orkin, S.H. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology/ S.H. Orkin, L.I. Zon // Cell. – 2008. – N.132. – Р. 631–44. 117. Orkin, S.H. SnapShot: hematopoiesis / S.H. Orkin, L.I. Zon // Cell. – 2008. – N. 132. – Р. 712. 118. Pallasch, Ch.P. Overexpression of TOSO in CLL is triggered by B-cell receptor signaling and associated with progressive disease / Ch.P. Pallasch, J. Schwamb, A. Schulz et al. // Blood. – 2006. – Vol. 108(11). – Pt. 1. – P. 793a. 111 119. Papayannopoulou, T. Stem-cell ecology and stem cells in motion / T. Papayannopoulou, D.T. Scadden // Blood. – 2008. – N. 111. – Р. 3923–30. 120. Park, C.S. How do follicular dendritic cells interact intimately with B cells in the germinal centre / C.S. Park, Y.S. Choi // Immunology. – 2005. – Vol. 114. – Р. 2–10. 121. Purton, L.E. The hematopoietic stem cell niche / L.E. Purton, D.T. Scadden // StemBook, ed. The Stem Cell Research Community. – 2008. – Vol. 15. – P. 1–14. 122. Raajimakers, M.H. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia / M.H. Raajimakers, S. Mukherjee, S. Guo et al. // Nature. – 2010. – N. 464. – Р. 852–7. 123. Rafii, S. Human bone marrow microvascular endothelial cells support long-term proliferation and differentiation of myeloid and megakaryocytic progenitors / S. Rafii, F. Shapiro, R. Pettengell et al. // Blood. – 1995. – N. 86. – Р. 3353–63. 124. Randall, T.D. Phenotypic and functional changes induced at the clonal level in hematopoietic stem cells after 5-fluorouracil treatment / T.D. Randall, I.L. Weissman // Blood. – 1997. – N. 89. – Р. 3596–606. 125. Rawstron, A.C. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia / A.C. Rawstron, F.L. Bennett, S.J. O`Connor et al. // N Engl J Med. – 2008. – Vol. 359(6). – Р. 575–583. 126. Rosati S. Chronic lymphocytic leukaemia: a review of the immunoarchitecture / S. Rosati, P.M. Kluin // Curr Top Microbiol Immunol. – 2005. – Vol. 294. – Р. 91–107. 127. Sacchetti, B. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment / B. Sacchetti, A. Funari, S. Michienzi et al. // Cell. – 2007. – N. 131. – Р. 324–36. 128. Saharinen, P. Angiopoietins assemble distinct Tie2 signalling complexes in endothelial cell-cell and cell-matrix contacts / P. Saharinen, L. Eklund, J. Miettinen et al. // Nat. Cell Biol. – 2008. – N. 10. – Р. 527–37. 129. Saito, Y. Induction of cell cycle entry eliminates human leukemia stem cells in s a mouse model of AML / Y. Saito, N. Uchida, S. Tanaka et al. // Nat. Biotechnol. – 2010. – N. 28. – Р. 275– 280. 130. Saitoh, M. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase [ASK-1] / M. Saitoh, H. Nishitoh, M. Fujii et al. // Embo J. – 1998. – Vol. 17. – Р. 2596–2606. 131. Sala-Torra, O. Evidence of donor-derived hematologic malignancies after hematopoietic stem cell transplantation / O. Sala-Torra, C. Hanna, M.R. Loken et al. // Biol. Blood Marrow Transpl. – 2006. – N. 12. – Р. 511–7. 132. Sanches-Beato, M. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas / M. Sanches-Beato, A. Sanches-Aquilera, M.A. Piris // Blood. – 2003. – Vol. 101(4). – P. 1220—1235. 112 133. Scadden, D.T. The stem cell niche in health and leukemic disease / D.T. Scadden // Best Pract Res Clin Haematol. – 2007. – Vol. 20(1). – P. 19–27. 134. Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell / R. Schofield // Blood Cells. – 1978. – N. 4. – Р. 7–25. 135. Scupoli, M.T. Interleukin 7 requirement for survival of T-cell acute lymphoblastic leukemia and human thymocytes on bone marrow stroma / M.T. Scupoli, O. Perbellini, M. Krampera et al. // Haematologica. – 2007. – N. 92. – Р. 264–6. 136. Seitz G., Yildirim S., Boehmler A. et al. // Blood. – 2006. – Vol. 108(11). – Pt. 1. – P. 793a. 137. Semenova, N. Nicheforming stromal elements of bone marrow and lymph nodes in CLL / N. Semenova, S. Bessmeltsev, V. Rugal // Haematologica. – 2014. – N. 99 (s1). – Р. 743. 138. Shi, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp / S. Shi, S. Gronthos // J. Bone Miner Res. – 2003. – N. 18. – Р. 696–704. 139. Sipkins, D.A. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment / D.A. Sipkins, X. Wei, J.W. Wu et al. // Nature. - 2005. – N. 435. – Р. 969–73. 140. Spiegel, A. Catecholaminergic neurotransmitters regulate migration and repopulation of immature human CD34+cells through Wnt signaling / A. Spiegel, S. Shivtiel, A. Kalinkovich et al. // Nat. Immunol. – 2007 . – N. 8. – Р. 1123–31. 141. Spitzer, T.R. The expanding frontier of hematopoietic cell transplantation / T.R. Spitzer, B.R. Dey, Y.B. Chen et al. // Cytometr. B. Clin. Cytom. – 2012. – N. 82 (B). – Р. 271–9. 142. Stier, S. Osteopontin is a hematopoietic stem cell niche component that negatively regulates stem cell pool size / S. Stier, Y. Ko, R. Forkert et al. // J. Exp. Med. – 2005. – N. 201. – Р. 1781–91. 143. Sugiyama, T. Maintenance of the hematopoietic stem cell pool by CXCL12-CXCR4 chemokine signaling in bone marrow stromal cell niches / T. Sugiyama, H. Kohara, M. Noda, T. Nagasawa // Immunity. – 2006. – N. 25. – Р. 977–88. 144. Taichman, R.S. Human osteoblasts support hematopoiesis through the production of granulocyte colony-stimulating factor / R.S. Taichman, S.G. Emerson // J. Exp. Med. – 1994. – N. 179. – Р. 1677–82. 145. Taichman, R.S. The role of osteoblasts in the hematopoietic microenvironment / R.S. Taichman, S.G. Emerson // Stem Cells. – 1998. – N. 16. – Р. 7–15. 146. Taichman, R.S. Human osteoblasts support human hematopoietic progenitor cells in vitro bone marrow cultures / R.S. Taichman, M.J. Reilly, S.G. Emerson // Blood. – 1996. – N. 87. – Р. 518–24. 147. Taichman, R.S. The hematopoietic microenvironment: osteoblasts and the hematopoietic microenvironment / R.S. Taichman, M.J. Reilly, S.G. Emerson // Hematology. – 2000. – N. 4. – Р. 421–6. 113 148. Tangye, S.G. Human cytokines suppress apoptosis of leukaemic CD5+ B cells and preserve expression of bcl-2 / S.G. Tangye, R.L. Raison // Immunol Cell Biol. – 1997. – Vol. 75. – Р. 127–135. 149. Tavassoli, M. Hemopoietic stromal microenvironment / M. Tavassoli, A. Fridenstein // Amer. J. Hematol. – 1983. – Vol. 15(2). – P. 195–203. 150. Tavolaro S., Chiaretti S., Messina M. et al. // Blood. – 2006. – Vol. 108(11). – Pt. 1. – P. 791a. 151. Tokoyoda, K. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development / K. Tokoyoda, T. Egawa, T. Sugiyama et al. // Immunity. – 2004. – N. 20. – Р. 707–18. 152. Trentin, J.J. Determination of bone marrow stem cell differentiation by stromal hemopoietic inductive microenvironments (HIM)/ J.J. Trentin // Am. J. Pathol. – 1971. – N. 65. – Р. 621–8. 153. Tsuda, H. The roles of lymph node stromal cells in proliferation of lymphoid leukemia cells/ H. Tsuda, H. Nishimura, T. Sawada, K. Takatsuki // Br.J.Cancer. – 1990. – Vol. 61. – Р. 362–364. 154. Vianello, F. Bone marrow mesenchymal stromal cells non-selectively protect chronic myeloid leukemia cells from imatinib-induced apoptosis via the CXCR4/CXCL12 axis / F. Vianello , F. Villanova, V. Tisato et al. // Haematologica. - 2010. – N. 95. – Р. 1081–9. 155. Visnjic, D. Hematopoiesis is severely altered in mice with an induced osteoblast deficiency / D. Visnjic, Z. Kalajzic, D.W. Rowe et al. // Blood. - 2004. – N. 103. – Р. 3258–64. 156. Walkley, C.R. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency / C.R. Walkley, G.H. Olsen, S. Dworkin et al. // Cell. – 2007. – N. 129. – Р. 1097–110. 157. Walkley, C.R. Rb regulates interactions between hematopoietic stem cells and their bone marrow microenvironment / C.R. Walkley, J.M. Shea, N.A. Sims et al. // Cell. – 2007. – N. 129. – Р. 1081–95. 158. Wei, J. Microenvironment determines lineage fate in a human model of MLL-AF9 leukemia / J. Wei, M. Wunderlich, C. Fox et al. // Cancer Cell. – 2008. – N. 13. – Р. 483–95. 159. Weisberg, E. Inhibition of CXCR4 in CML cells disrupts their interaction with the bone marrow microenvironment and sensitizes them to nilotinib / E. Weisberg, A.K. Azab, P.W. Manley et al. // Leukemia. – 2012. – N. 26. – Р. 985–90. 160. Weiss, L. A. Scanning electron microscopic study of the spleen / L. A. Weiss // Blood. – 1974. – N. 43. – Р. 665–691. 161. Weistner, A. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile / A. Weistner, A. Rosenwald, T.S. Barry et al. // Blood. – 2003. – Vol. 101. – Р. 4944–4951. 162. West, D. / D.A . West, D.M. Lucas, M.E. Davis et al. // Blood. – 2006. – Vol. 108(11). – Pt. 1. – P. 794a. 114 163. Westen, H. Association of alkaline-phosphatase-positive reticulum cells in bone marrow granulocytic precursors / H. Westen, D.F. Beinton // Exp. Med. – 1979. – Vol. 150(4). – P. 919–937. 164. Williams, W. Examination of the marrow. In: Beulter E., Lichtman M.A., Coller B.S., and Kipps T.J. editors / W. Williams, D.A. Nelson // Hematology Williams. New York: McGraw-Hill. – 1995. – Р. 15–22. 165. Wilson, A. C-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation / A. Wilson, M.J. Murphy, T. Oskarsson et al. // Genes Dev. – 2004. – N. 18. – Р. 2747–63. 166. Wilson, A. Dormant and self-renewing hematopoietic stem cells and their niches / A. Wilson, G.M. Oser, M. Jaworski et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2007. – N. 1106. – Р. 64–75. 167. Wolowiec, D. Bone marrow angiogenesis and proliferation in B-cell chronic lymphocytic leukemia / D. Wolowiec, Z. Wozniak, S. Potoczek // Anal. Quant. Cytol. Histol. – 2004. – N. 26(5). – Р. 263–70. 168. World Health Organization Classification of Tumors. Pathology and Genetics of Tumors of Hematopoietic and Lymphoid Tissues /ed. E.S. Jaffe et al. // Lyon: IARC Press. – 2008. – P. 121— 132. 169. Yamamoto-Sugitani, M. Galectin-3 (Gal-3) induced by leukemia microenvironment promotes drug resistance and bone marrow lodgement in chronic myelogenous leukemia / M. YamamotoSugitani, J. Kuroda, E. Ashihara et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2011. – N. 108. – Р. 17468–73. 170. Yamazaki, K. Ultrastructural morphometric study of efferent nerve terminals on murine bone marrow stromal cells, and the recognition of a novel anatomical unit: the “neuro-reticular complex” / K. Yamazaki, T.D. Allen // Am. J. Anat. – 1990. – N. 187. – Р. 261–76. 171. Yin, T. The stem cell niches in bone / T. Yin, L. Li. // J. Clin. Invest. – 2006. – N. 116. – Р. 1195–201. 172. Yoshihara, H. Thrombopoietin/MPL signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence and interaction with the osteoblastic niche / H. Yoshihara, F. Arai, K. Hosokawa et al. // Cell Stem Cell. – 2007. – N. 1. – Р. 685–97. 173. Zelzer, E. Multiple roles of vascular endothelial growth factor (VEGF) in skeletal development, growth, and repair / E. Zelzer, B.R. Olsen. // Curr. Top. Dev. Biol. – 2005. – N. 65. – Р. 169–87. 174. Zhang, J. Stem cell niche: microenvironment and beyond / J. Zhang, L. Li. // J. Biol. Chem. – 2008. – N. 283. – Р. 9499–503. 175. Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size / J. Zhang, C. Niu, L. Ye et al. // Nature. – 2003. – N. 25. – Р. 836–41.
