динамика структурных перестроек в липидных бислоях
advertisement
На правах рукописи Боздаганян Маринэ Евгеньевна МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА СТРУКТУРНЫХ ПЕРЕСТРОЕК В ЛИПИДНЫХ БИСЛОЯХ Специальность: 03.01.02 – Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2015 Работа выполнена на кафедре биоинженерии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (зав. кафедрой – доктор биологических наук, академик РАН, М.П. Кирпичников). Научный руководитель: Шайтан Константин Вольдемарович доктор физико-математических наук, профессор кафедры биоинженерии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» Научный консультант: Черепанов Дмитрий Александрович кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина Российской академии наук» Официальные оппоненты: Крупянский Юрий Федорович доктор физико-математических наук, профессор, зам. директора по научной работе Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт химической физики им. Н.Н.Семенова Российской академии наук» Волынский Павел Евгеньевич кандидат физико-математических наук, ст.н.с. Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук» Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт математических проблем биологии Российской академии наук», г. Пущино Защита диссертации состоится « 21 » мая 2015 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119234, Россия, Москва, Ленинские горы 1/24, МГУ, Биологический факультет, аудитория «Новая» С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и на сайте http://www.bio.msu.ru/dissertations/view.php?ID=674 Автореферат разослан « _____ » ____________ 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета , доктор биологических наук_________ М.Г. Страховская 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы Липидный бислой мембраны – основной барьер, ограничивающий диффузию веществ между клеткой и окружающей средой. Мембрана играет принципиальную роль в таких важных процессах клетки, как производство энергии, передача сигнала, поддержание гомеостаза клетки, выборочного транспорта молекул, а также обеспечивает защиту от токсических веществ. Липидные мембраны – динамические структуры, свойства которых обусловлены их составом и внешними условиями. Постоянные перестройки, происходящие в мембранах, влияют на жизнедеятельность клеток. Изменение липидного и белкового состава мембраны, модификация молекул липидов, встраивание новых молекул внутрь билипидного слоя, перенос различных веществ через мембрану может привести к изменению фазы мембраны и ее формы, в том числе привести к ее поро- или мицеллообразованию. Изучение свойств и функционирования биологических мембран – одна из самых актуальных задач биофизики. В первой части работы изучаются структурные перестройки, происходящие в бислоях различного состава, в том числе трёхкомпонентных системах при формирования рафтов – наноразмерных областей мембран эукариот, обогащенных сфингомиелином и холестерином. Недавно было показано, что некоторые белки функционально активны только в рафтах. Было доказано, что липидные рафты, содержащие целые кластеры белков, могут изменять свои размеры и состав в ответ на вне- или внутриклеточные сигналы, таким образом участвуя в важных клеточных процессах, как сортировка белков, их доставка в мембраны, межклеточная сигнализация и т.д. Однако молекулярные механизмы образования рафтов до сих пор мало изучены и нуждаются в уточнениях. Например, до сих пор остается под вопросом энергетика процессов образования рафтов в мембранах [1]. Другая проблема мембранологии – это проницаемость мембраны для различных веществ. Известно, что перекисное окисление липидов (ПОЛ) приводит к нарушению функционированию мембраны, следовательно, и клетки. За счёт образования гидропероксидов жирных кислот в цитоплазму могут проникать вода, ионы натрия, кальция, что приводит к разрушению клетки. Активация перекисного окисления характерна для многих заболеваний: дистрофии мышц (болезнь Дюшенна), болезни Паркинсона, при которых ПОЛ разрушает нервные клетки в стволовой части мозга, при атеросклерозе, развитии опухолей [2]. Исследование на молекулярном уровне механизмов действия антиоксидантов важно для поиска потенциальных лекарств. Во второй части работы изучаются свойства фуллерена и его производных (трималонат фуллеренов), для которых на модельных мембранах была показана высокая антиоксидантная активность – выше, чем у витамина Е [3]. С другой стороны, есть данные, свидетельствующие о том, что фуллерен провоцирует образование активных форм кислорода, вызывая гибель клеток [4]. Изучение взаимодействия фуллеренов с модельными бислоями может показать, какие структурные изменения в мембране происходят при сорбции на мембрану и проникновении изучаемых молекул внутрь гидрофобной области. В третьей части диссертации предлагается новая теория протонного переноса через липидную мембрану. Непроницаемость мембраны для ионов – базовое свойство всех мембран организмов. Несмотря на то, что протон является главным электрогенным ионом многих организмов Земли, проницаемость мембран для протонов довольно высокая. Например, коэффициент проницаемости для иона калия варьирует в пределах 10-9 – 10-13 см/с в зависимости от условий измерения и типов липидов. Для протона же измеренная проницаемость с использованием различных экспериментальных техник оказалась достаточно высокой 10-2 – 10-7 см/с [5]. Существенная разница в коэффициентах проницаемости для моновалентных катионов говорит о том, что процесс переноса протона протекает не путем диффузии, а по другому механизму. Согласно представленной модели, внутри бислойной липидной мембраны может 3 образовываться полярная область из атомов кислорода липидов, по которой выстраиваются цепочки воды, участвующие в переносе протонов. Цели и задачи исследования Цель настоящего исследования – изучить структурные перестройки в липидных бислоях методом молекулярной динамики при образовании рафтов в трехкомпонентых системах, взаимодействии с наночастицами, а также при переносе протона через мембрану. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи: • Создание модельных систем мембран различного липидного состава и их валидация • Исследование формирования рафта из трех липидов: пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (ПОФХ), холестерина (ХОЛ) и сфингомиелина (СМ). • Исследование энергий взаимодействия ХОЛ, СМ и ПОФХ между собой в модельных мембранах ПОФХ. • Исследование взаимодействия монослоев рафта в мембране ПОФХ. • Изучение взаимодействия фуллерена C60 и его производных, C3 и D3, с биологической мембраной, состоящей из липидов ДПХФ. • Исследование механизма переноса протонов через мембрану и количественная оценка энергии активации этого процесса. Научная новизна и практическая значимость работы Настоящая диссертация посвящена исследованию некоторых примеров структурных перестроек в липидных бислоях, таких как: разделение фаз и образование рафтов в многокомпонентных липидных системах, изменения формы и поверхностных свойств мембраны при взаимодействии с наночастицами, а также образованию специализированных структур внутри гидрофобного слоя мембраны при переносе протона. В рамках данной работы впервые методом молекулярной динамики было показано спонтанное образование рафта в трехкомпонентных модельных мембранах, состоящих из ПОФХ, СМ и ХОЛ в соотношении 2:1:1. Также была получена количественная оценка взаимодействия ПОФХ, СМ и ХОЛ между собой в модельной мембране, а также оценена энергия взаимодействия двух монослоев рафта при их различных сдвигах друг относительно друга. Согласно полученным данным, основные рафтообразующие липиды, СМ и ХОЛ, имеют энергию взаимодействия друг с другом ниже, чем остальные пары липидов. Показано, что сорбция молекул С60, C3 и D3 в область гидрофильных головок мембраны не приводит к каким-либо структурным перестройкам на ее поверхности. Кластер из фуллеренов проникает внутрь мембраны и, искривляя, деформирует ее. Изомеры фуллерена С60 (C3 и D3) не проникают внутрь бислоя, а остаются на его поверхности, но на разной глубине: С3 оказывается на 0,5 нм глубже погруженным в мембрану в силу своей стехиометрии. В работе впервые предложен новый механизм переноса протона, а также оценена энергия активации этого процесса. Согласно предложенной модели, протон присоединяется к фосфату липида, и в результате процесса «неполного флип-флопа» переносится на другую сторону мембраны уже фосфатом другого липида. В этом процессе участвуют также молекулы воды, которые выстраиваются по «кислородной лестнице», образованной кислородами липидов. Положения, выносимые на защиту 1. Холестерин и сфингомиелин, являясь основными рафтообразующими липидами, имеют сродство друг к другу выше на 10 кДж/моль, чем другие пары липидов в модельной мембране ПОФХ. 2. Монослои рафта в мембранной модели ПОФХ изгибают бислой и сдвинуты друг относительно друга на 3,1 нм. 4 3. Кластер из молекул фуллеренов изгибает мембрану ДПФХ, что ведет к образованию гидрофобных областей на поверхности бислоя мембраны и делает липиды уязвимыми для АФК. 4. Расположение малонатных группировок на молекулах фуллеренах C3 и D3 влияет на их взаимодействие с биомембранами. 5. Протон может переноситься через мембрану фосфатами механизмом неполного флип-флопа. Лимитирующая стадия этого процесса – образование кислородной лестницы, по которой выстраиваются молекулы воды. Апробация работы Основные результаты работы были представлены и обсуждены на следующих конференциях и симпозиумах: 1й и 2й Международных школах Нано-2009 и Нано-2011 «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Ступинский район – 2009, 2011); в летней школе «Simulation Approaches to Problems in Molecular and Cellular Biology» (Сан-Себастьян – 2009); международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва – 2010); международной конференции «Суперкомпьютеры и математические модели» (Якутск – 2011); конференции Европейского Биофизического сообщества (Лиссабон – 2013); международном симпозиуме «Frontiers In Electronic Structure Theory And Multi Scale Modeling» (Москва – 2013); 18й международной школе молодых ученых «Биология – наука 21 века» (Пущино – 2014); международной научно-практическая конференция “Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины” (Ростов-на-Дону – 2013); 12й международной школе по Биофизике имени Греты Пифак-Мрзлжак (Примоштен – 2014). Публикации По материалам работы опубликовано 4 статьи в рецензируемых российских и международных научных журналах, входящих в перечень ВАК, 10 тезисов докладов на всероссийских и международных симпозиумах и конференциях, 1 статья находится в печати. Личный вклад автора Личный вклад диссертанта заключается в сборе и анализе литературных данных, постановке задач, разработке путей решения поставленных задач, проведении вычислений методом классической молекулярной динамики, разработке методик расчета потенциала средней силы, интерпретации результатов, подготовке публикаций и докладов по теме диссертационной работы. Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 171 наименование. Работа изложена на 94 страницах машинописного текста и включает 44 рисунка и 16 таблиц. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении сформулированы основные цели и задачи работы, обоснована её актуальность и практическая значимость. Глава 1. Материалы и методы В главе рассмотрены основы метода молекулярной динамики: основные алгоритмы и приложения. Описаны особенности параметризации биологических мембран, а также фуллеренов. Приведены теоретические основы методики расчетов свободной энергии систем: метод зонтичной выборки и метадинамики. 5 Глава 2. Динамика многокомпонентных билипидных слоев и формирование рафтов Глава 2 целиком посвящена изучению структурных перестроек в мембранах в связи с формированием рафтов в них и разбита на шесть частей. 2.1. Литературный обзор В обзоре собраны сведения о мембранах и их свойствах. Приведены данные о различных липидных составах клеточных мембран. Подробно обсуждается вопрос фазовых переходах в модельных мембранах. Представлены фазовые диаграммы липидных бислоев, состоящих из трех типов липидов. Описаны имеющиеся данные о причинах формирования рафтов, существующих гипотезах бислойности рафта. 2.2. Формирование бислоя из смеси липидов Липиды случайно распределялись в кубической ячейке объемом 1870 нм3 с водой (Рис. 1а). Степень гидратации составляла 89 молекул воды на липид. Далее система эволюционировала в соответствии с алгоритмами равновесной молекулярной динамики. В результате наблюдалось формирование бислоя из смеси липидов. Спустя 194 нс появляется мембраноподобная структура (Рис. 1в), которая сохраняет свою конфигурацию до конца расчета (371 нс), имеется некоторая асимметричность мембраны. Профили плотности системы характеризуют распределение атомов или молекул в расчетной ячейке вдоль определенной координаты, т.е. нулевая плотность в данной точке означает, что искомых атомов или молекул нет. Рис. 1. Эволюция свойств системы со случайно Толщина бислоя рассчитывалась из расположенными липидами в боксе (система Б). а – плотностей атомов фосфора ПОФХ и СМ Начальная конфигурация системы – перемешанные и составляла 4,6 нм (Рис. 1г). Видно, что в липиды в кубическом ящике (вода не показана). б – верхнем монослое молекул ПОФХ Профиль плотности липидов, воды и системы до и больше (Рис. 1г), в то время как СМ и после образования мембраноподобной структуры. ХОЛ распределены более равномерно. Обозначения: до релаксации – (1) Система, (2) Профили плотности системы (отдельных ПОФХ, (3) СМ, (4) ХОЛ, (5) Вода; после релаксации молекул липидов и воды) в начале и в – (6) Система, (7) ПОФХ, (8) СМ, (9) ХОЛ, (10) конце расчета приведены на Рис. 1б. В Вода. в – Фрагмент бислоя, сформированного в начале расчета имелась гомогенная смесь процессе симуляции – все липиды находятся в фазе липидов и воды. В конце наблюдали Lo. г – Плотность атомов фосфора ПОФХ (2), СМ (3) характерное распределение липидов по и кислорода ХОЛ (1) в мембране. Все атомы в обе стороны бислоя и профиль липидах изображены в виде ван-дер-ваальсовых мембранной структуры (Рис. 1б,г). сфер. ПОФХ изображен белым цветом, СМ – черным Мембрана занимает не всю площадь цветом, ХОЛ – серым цветом. ячейки (Рис. 1в). Часть воды находится в центре расчетной ячейки, что отражено на графике (Рис. 1б). Динамические свойства липидных бислоев исследовали путем расчета среднеквадратичного отклонения (СКО) r 2 (t ) (t – время) атомов фосфора молекул ПОФХ и СМ и атомов кислорода у 6 ХОЛ. Расчеты производили в течение первых 25 нс симуляции и в последние 25 нс после образования бислойной структуры. В начале симуляции рассчитанные коэффициенты диффузии D для липидов больше и соответствует по порядку величины коэффициенту диффузии липидов в жидкой мембране. Однако после формирования бислоя коэффициент диффузии снижается на порядок, что соответствует жидкоупорядоченной (Lо) структуре мембраны. Расчет параметра порядка ацильных цепей липидов показал, что СМ и ПОФХ имеют высокую степень упорядоченности. Таким образом, расчеты толщины мембраны, коэффициентов диффузии и параметра порядка свидетельствуют о том, что липиды находятся в упорядоченном состоянии или фазе Lo. 2.3. Формирование рафта в липидном бислое В стартовой конфигурации в готовых бислоях в одном случае, рафт был сформирован заранее, в другом случае три вида липидов были расположены случайным образом (Рис. 2а,в). Профили плотности систем приведены на Рис. 2б,г вдоль координаты Z. Профили плотности вычисляли в первые 20 нс симуляции и в последние 20 нс симуляции. Толщину мембраны измеряли по максимуму плотности фосфатных группировок липидов. В результате за 100 нс в системе с приготовленной заранее областью, обогащенной СМ и ХОЛ (Рис. 2а), изменилась толщина бислоя. Рис. 2. Эволюция свойств бислойных систем (Системы До релаксации этот бислой имел А, В). а – (1) Начальная структура мембраны с одинаковую толщину 3.5 нм. В сформированным рафтом. (2) Спустя 100 нс рафт результате МД эксперимента изменил толщину и длину. б – Профиль плотности сформировался рафт толщиной 4 нм, в системы до и после релаксации. в – (1) Начальная то время как толщина остальной структура мембраны с хаотично расположенными мембраны, состоящей из ПОФХ липидами. (2) Мембрана с сформированным рафтом липидов, уменьшилась до 3 нм. Это спустя 330 нс симуляции. г – Профиль плотности хорошо согласуется с системы до и после образования рафта. Обозначения: экспериментальными данными [6]. Во до релаксации – (1) Система, (2) СМ, (3) ХОЛ, (4) второй системе (Рис. 2в) длина ПОФХ, (5) Вода; после релаксации – (6) Система, (7) расчетной траектории составляла 337 СМ, (8) ХОЛ, (9) ПОФХ, (10) Вода. нс. В начале расчета толщина бислоя составляла 3.4 нм, в конце – в области рафта – 3.8 нм, в остальной части мембраны – 2.7 нм (Рис. 2в,г). На Рис. 2в видно, что липиды, находящиеся вне рафтовой области, включая СМ и ХОЛ, формируют бислой меньшей толщины, чем липиды рафта. Для мембраны с обогащенной СМ и ХОЛ областью, хорошо видна разница в степени упорядоченности липидов: СМ находится в Lo-фазе, в то время как липиды ПОФХ упорядочены явно в меньшей степени и находятся в Ld-фазе. Несколько иная картина дл мембраны с хаотичным распределением липидов: все липиды, находящиеся в мембране, имеют достаточно высокий параметр порядка и находятся в Lo-фазе. Результаты относительно типа фаз также подтверждаются рассчитанными коэффициентами диффузии. 7 На графике видно, что в процессе симуляции профиль плотности системы изменяется в связи с уширением мембраны в области рафта (Рис. 2б, г). Отметим, что в нашей работе образование рафта было спонтанным процессом. Анализ траекторий показывает, что фактором, определяющим образование рафта, оказывается повышенная концентрация молекул ХОЛ и СМ в 3 и 2.4 раза соответственно (Табл. 1). Таким образом, установленный состав рафта ПОФХ:СМ:ХОЛ 1:1,8:1,4. Табл. 1. Количество молекул ПОФХ, СМ, ХОЛ в мембране Липид ПОФХ СМ ХОЛ Количество молекул на 1 нм2 Рафтовая область мембраны Нерафтовая область мембраны 1.06 0.78 0.69 0.62 0.26 0.29 Соотношение количества молекул на 1 нм2 в рафтовой и нерафтовой областях мембраны 1.7 3 2.4 2.4. Исследование силы взаимодействия различных липидов друг с другом В начале исследования был повторен эксперимент со спонтанным формированием рафта в мембране ПОФХ (Рис. 3а). Длина сформированного рафта составила 9 нм, а толщина 5,1 нм. Две других изучаемых мембраны были двухкомпонентные и состояли из ПОФХ и СМ, ПОФХ и ХОЛ в соотношении 2:1 в обоих случаях. Образования рафта в них не наблюдалось. Мембрана, содержащая СМ и ПОФХ оказалась толще, чем мембрана ПОФХ и ХОЛ. А параметр порядка для ПОФХ и СМ в системе №2 – ниже, чем параметр порядка ПОФХ в системе №3, т.е. молекулы ХОЛ структурировали липиды ПОФХ. Для трех мембран были изучены коэффициенты диффузии липидов и параметры порядка. Из вычисленных параметров следует, что липиды во второй системы – СМ и ПОФХ находятся в фазе Ld, в то время как в присутствии ХОЛ наблюдается упорядочивание молекул, что не противоречит литературным данным. Радиальная функция распределения (РРФ) характеризует закономерности в расположении соседних атомов или молекул. Функция радиального распределения характеризуется большим первым пиком, соответствующим первым ближайшим соседям, и постепенно расширяющимися пиками меньшей интенсивности, Рис. 3. Конечная структура трех которые соответствуют вторым, третьим и т.д. исследуемых мембран. а – соседним частицам вокруг выбранного атома. РРФ Трехкомпонентная мембрана с рафтом. б – строилась для атомов фосфора в молекулах ПОФХ Мембрана из ПОФХ и СМ. в – Мембрана и СМ и атомов кислорода для ХОЛ. Для анализа из ПОФХ и ХОЛ. Серым цветом показаны графиков РРФ важны расстояния между пиками, их липиды ПОФХ, синим – СМ, желтым – высота и ширина. То есть сильно уширенный ХОЛ. Атомы фосфора – оранжевые сферы, низкий пик означает отсутствие какой-либо упорядоченной структуры (Рис. 4а, в, е). То есть атомы кислорода ХОЛ – красные. липиды ПОФХ, СМ и ХОЛ при заданной температуре не структурируют мембрану. 8 Высокий и узкий пик на Рис. 4г для фосфора ПОФХ и кислорода ХОЛ свидетельствует о специфическом взаимодействии на расстоянии около 3,5 Å, т.е. порядка водородной связи, эти данные подтверждаются [7]. В то же время на Рис. 4д второй пик, соответствующий расстоянию 7 Å между ХОЛ и СМ, по высоте практически совпадает с первым. Это говорит о формировании стабильных структурированных кластеров из ХОЛ и СМ в рафте. На Рис. 5 представлены профили свободной энергии. Особое внимание стоит обратить на Рис. 5в, ж. Профили свободной энергии для этих двух систем имеют явные минимумы: для пары ПОФХ-ХОЛ 10 кДж/моль на расстоянии 8 Å, для пары СМ-ХОЛ 20 кДж/моль на расстоянии между липидами 7 Å (показаны стрелками). Из полученных значений свободных энергий можно заключить, что взаимодействие СМХОЛ сильнее, чем ПОФХ-ХОЛ. Конформация для комплекса СМ-ХОЛ соответствует описанной ранее зонтичной модели [8], когда фосфолипид буквально «накрывает» молекулу ХОЛ. Рис. 4. Радиальные функции распределения для системы №1. а – РРФ для фосфоров липидов ПОФХ. б – РРФ для фосфоров липидов ПОФХ и СМ. в – РРФ для фосфоров липидов СМ. г – РРФ для фосфоров липидов ПОФХ и кислородов ХОЛ. д – РРФ для фосфоров липидов СМ и кислородов ХОЛ. е – РРФ для кислородов ХОЛ. Рис. 5. ПСС для липидов, взаимодействующих в мембране ПОФХ. а – ПСС для двух молекул ПОФХ. б – ПСС для двух молекул ХОЛ. в – ПСС для ПОФХ и ХОЛ. г – Структура комплекса ПОФХ-ХОЛ в минимуме свободной энергии. д – ПСС для ПОФХ и СМ. е – ПСС для двух молекул СМ. ж – ПСС для СМ и ХОЛ. з – Структура комплекса СМ-ХОЛ в минимуме свободной энергии. 2.5. Исследование взаимодействия двух монослоев рафта в мембране Изучение взаимодействия монослоев в рафте – трудоемкая задача, т.к. требует больших вычислительных мощностей, а также подбора оптимального алгоритма расчета. Во время релаксации рафт и прилегающие к ним липиды ПОФХ, входящие в верхние и нижние группы, изогунули мембрану (Рис. 6). Изгиб мембраны связан со сдвигом монослоев рафта. После релаксации полученных структур методом зонтичной выборки была рассчитана кривая взаимодействия монослоев друг сдругом в зависимости от сдвига монослоев друг относительно друга. Из начальных точек (0-6 нм) верхний монослой со скоростью 10-5 нм/пс сдвигался на 1 нм. Из траектории движения выбирались положения, в которых будет рассчитана свободная энергия: 9 0,15, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,4 – всего 12 точек. Траектории зонтичной выборки обрабатывались по алгоритму WHAM. Результат расчетов свободной энергии сдвига монослоев представлен на Рис. 7. Из кривой видно, что основной минимум (100 кДж/моль) приходится на сдвиг, равный 3,1 нм. Кривая, рассчитаная методом молекулярной динамики, не совпала с предложенной в [9]. Скорее всего, это связано с тем, что теоретическая модель не учитывает изгиб мембраны, возникающий при сдвиге монослоев рафта. Несмотря на то что минимум сдвига монослоев рафта был предсказан, в двух предыдущих расчетах (в системах А, В), не произошло сдвига монослоев друг относительно друга, а также не было изгибов мембраны. Это может быть связано с меньшими размерами систем А и В по сравнению с исследуемой в этом разделе, а также с недостаточным временем релаксации: вероятно, сдвиг образуется не сразу после формирования рафта. Поскольку результаты, в некотором смысле, противоречат друг другу, возможно, имеет смысл рассмотреть гипотезу о взаимном притяжении молекул СМ в двух монослоях и рассчитать их профиль свободной энергии взаимодействия. Рис. 6. Вид мембраны со встроенным рафтом: расстояние между центрами масс двух монослоев – 5,4 нм. Обозначения как на Рис. 3. Рис. 7. Профиль свободной энергии двух монослоев рафта при различных сдвигах. Прерывистые линии – вспомогательные, указывают на минимумы. 2.6. Заключение. В многокомпонентной мембране происходят существенные перестройки и изменения свойств: формирование рафтов, изменение коэффициентов диффузии, параметров порядка, толщины, радиуса изгиба. Рафт является устойчивой и стабильной структурой мембраны с временем жизни не менее трех сотен наносекунд. В течение всего времени численных экспериментов рафт не распадается, а также не наблюдаются процессы порообразования либо мицеллообразования. Исходя из полученных данных о параметрах порядка, коэффициентах диффузии и толщине мембраны, липиды в рафте всегда находятся в Lo-фазе. Случайное распределение в стартовой конфигурации молекул сфингомиелина и холестерина внутри сформированных мембран и в ячейке с водой приводит к тому, что исследуемые области оказываются в фазе Lo при Т=323 К. МД двухкомпонентных мембран показывает, что холестерин является ключевым компонентом, повышающим параметр порядка ацильных цепей липидов, и таким образом структурирует мембрану. В то же время присутствие сфингомиелина является необходимым условием формирования рафта. Главную роль в процессе формирования рафта играют молекулы холестерина и сфингомиелина, концентрация которых была заметно выше в области рафта, чем в остальной мембране. Также установлен состав рафта: липиды ПОФХ, СМ, ХОЛ находятся в рафте в соотношении 1:1,8:1,4. Были рассчитаны свободные энергии взаимодействия пар липидов между собой, обнаружены специфические взаимодействия для пар СМ-ХОЛ и ПОФХ-ХОЛ, соответствующие минимумам ПСС. 10 В процессе проверки теории о сдвиге монослоев рафта друг относительно друга выяснилось, что хорошо отрелаксированная мембрана изгибается. Минимумы, предсказанные теоретической моделью (4 нм), не совпадают с рассчитанными и находятся на расстоянии 3,1 нм. Предложенную в [9] модель следует уточнить и ввести параметр, описывающий изгиб мембраны. Глава 3. Динамика транспорта углеродных нанообъектов через липидные бислои В третьей главе диссертации были определены способности к сорбции и проникновению С60фуллерена и его амфифильных производных – C3-трималонат-C60-фуллерена (C3) и D3трималонат-C60-фуллерена (D3) в модельную мембрану ДПФХ. Изучены структурные перестройки, возникающие при взаимодействии фуллеренов с мембраной. Глава поделена на пять частей. 3.1. Литературный обзор В обзоре обсуждаются свойства фуллеренов и их потенциальные приложения в области медицины и биологии. Заострено внимание на разницах в антиоксидантных свойствах различных гидрофильных производных фуллерена. Сравниваются ранее полученные данные численных экспериментов по взаимодействию фуллеренов с мембранами. 3.2. Проникновение фуллерена C60 внутрь мембраны Равновесная МД одной молекулы фуллерена с мембраной показала, что в течение первой наносекунды С60 сорбируется в область головок (Рис. 8а). А уже на третьей наносекунде спонтанно проникает в область гидрофобных хвостов (Рис. 8a,в), что согласуется с ранее проведенными экспериментами. На протяжении следующих 100 нс симуляции фуллерен остается внутри мембраны. После равновесной МД проводился расчет профиля энергии взаимодействия С60 с мембраной ДПФХ (Рис. 8б). Форма потенциала средней силы (ПСС) фуллерен-мембрана схожа с исследованиями, Рис. 8. Характеристика взаимодействия проведенными ранее. Главный минимум энергии молекулы фуллерена с мембраной. а – находится чуть поодаль от центра мембраны, а при Расстояние между ц.м. С60 и ц.м. прохождении области головок – есть небольшой мембраны. Погружение внутрь мембраны барьер. Следует отметить, что некоторые детали (прерывистая линия – граница мембраны) разнятся среди ранее проведенных экспериментов: отмечено стрелкой – на 3 наносекунде иногда не наблюдается барьер при переходе симуляции. б – Профиль свободной фуллерена из водной среды в область хвостов. энергии процесса проникновения Крупнозернистое моделирование дает завышенные фуллерена C60 в модельную значения свободных энергий. Суммируя, можно эукариотическую мембрану. в – Вид утверждать, что в силу маленьких времен расчета системы мембраны с фуллереном внутри. возникает проблема недостижимости термодинамического равновесия в исследуемых гетерогенных средах. Также разница в параметризации моделей, в свою очередь, ведет к различающимся результатам в схожих исследованиях. 11 Расчет профилей свободной энергии для системы фуллерен-мембрана производился с применением метода метадинамики, который раньше не использовался исследователями. Таким образом, рассчитав ПСС и сравнив его с предыдущими результатами, мы валидировали метод и убедились в правильности подобранных параметров. На Рис. 8б видно, что фуллерен преодолевает энергетический барьер в примерно 15 кДж/моль при переходе из водной среды в область гидрофобных хвостов. Глобальный минимум энергии находится на расстоянии 0,7 нм от центра мембраны: при приближении к центру мембраны свободная энергия фуллерена возрастает на 30 кДж/моль. Для изучения Рис. 9. Характеристика и вид МД систем фуллеренов положения молекулы фуллерена внутри была проведена с мембраной. а, б – Параметры порядка для мембраны дополнительная равновесная МД: С60 был липидных хвостов, рассчитанные для ДПФХ мембраны, ДПФХ мембраны с одним фуллереном и помещен в центр бислоя между концами. ДПФХ мембраны с десятью фуллеренами C60: а – sn- После 50 нс симуляции был построен распределения вероятностей 1-цепь, б – sn-2-цепь. в – Вид конечной график расположения фуллерена в мембране: на конфигурации системы (девять из десяти фуллеренов внутри мембраны). г – Молекулярный гидрофобный расстоянии 0,8 нм от центра мембраны потенциал (МГП), рассчитанный для верхней части большую часть времени. Адсорбция мембраны. Фуллерены показаны как ВдВ сферы фуллерена на поверхность мембраны и его прыжок внутрь бислоя никаким красным цветом. образом не влияет на свойства липидов (Табл. 2). Все перечисленные выше результаты не противоречат ранее полученным данным, что свидетельствует о правильно параметризованной модели. 3.3. Проникновение кластера из фуллеренов внутрь мембраны В водной среде гидрофобные фуллерены могут существовать лишь в агрегированном состоянии. В следующем эксперименте мы провели МД с десятью фуллеренами и ДПФХ мембраной. Для того, чтобы изучить проницаемость кластера из фуллеренов, мы разместили десять молекул С60 в воде над мембраной таким образом, чтобы они не контактировали ни с мембраной, ни друг с другом. Спустя несколько наносекунд после начала симуляции фуллерены агрегировали и адсорбировались на поверхность мембраны в области гидрофильных головок. Первый фуллерен из агрегата попал внутрь мембраны через 3 нс. Остальные фуллерены проникли в мембрану спустя несколько наносекунд. На сотой наносекунде девять из десяти фуллеренов были погружены в область гидрофобных хвостов (Рис. 9в). Все фуллерены оставались внутри мембраны на протяжении последующих 400 нс расчетов. Мы не наблюдали дезагрегации фуллеренов внутри мембраны, возможно из-за того, что не хватило расчетного времени (дезагрегация происходит на временах порядка микросекунд). Наиболее вероятная локализация кластера из фуллеренов – 0,5-1 нм от центра мембраны. Вразрез с предыдущими исследованиями с использованием крупнозернистой модели, мембрана деформируется при добавлении большого количества фуллеренов: она изгибается, 12 площадь, приходящаяся на липидную головку уменьшается с 69 до 56 Å2, а толщина мембраны увеличивается с 38,7 Å до 42 Å к концу расчета (Табл. 2). Молекулярный гидрофобный потенциал (МГП) был рассчитан для двух сторон мембраны: в начальный и конечный период времени. В начальный момент времени поверхность мембраны выглядит классически: небольшие гидрофобные области (хвосты) перемежаются с к крупными гидрофильными (головки). Фуллерены расположены и над гидрофобными, и над гидрофильными участками мембраны. После проникновения кластера из фуллеренов внутрь мембраны, было показано, что образовалась крупная гидрофобная область, рядом с местом проникновения С60 (Рис. 9г). Это означает, что фуллерены, проникшие в мембрану, вызвали ее возмущение, приведшее к экспонироваю части гидрофобных хвостов в водную среду, а по сути, образованию небольшой поры в мембране. В такой конформации липиды особенно уязвимы перед АФК. Коэффициенты диффузии для ДПФХ молекул не менялись с добавлением фуллеренов внутрь мембраны, значения хорошо согласуются с экспериментальными данными. Также не было обнаружено поро- или мицеллообразования, возможно, из-за ограничения времени симуляции. Из Рис. 9а, б видно, что параметры порядка мембраны не изменились значиельно ни с одним фуллероном в мембране, ни с девятью. Значения SCH соответсвуют Ld фазе мембраны. Табл. 2. Свойства ДПФХ мембраны в МД с разным количеством фуллеренов. ДПФХ с 10 фуллеренами Изучаемое свойство ДПФХ ДПФХ с одним фуллереном Толщина, Å Площадь, приходящаяся на липидную головку, Å2 Коэффициент латеральной диффузии, 10-7см2/с 33,7 32,0 38,7 42,2 69 71 56 56,6 0,98 1,3 0,99 0,61 Радиус изгиба мембраны, Å - - 32 30,2 70-100 нс расчета 470-500 нс расчета Таким образом, исследования показали, что добавление нескольких фуллеренов к мембране ДПФХ не привело к изменению фазы мембраны или ее разрушению. Однако сильный изгиб, возникающий после проникновения фуллеренов внутрь мембраны, привел к образованию крупной гидрофобной поры. Все это может привести в результате к атаке липидных хвостов активными формами кислорода, находящимися в водной среде. Наши данные позволяют на молекулярном уровне объяснить высокий цитотоксический эффект, вызываемый большими концентрациями С60. 3.4. Исследование взаимодействия C3 и D3 фуллеренов с биологической мембраной В этой части работы была также проведена равновесная МД C3 и D3 фуллеренов с ДПФХ мембраной, методом метадинамики расчитывался профиль энергии взаимодействия карбоксифуллеренов с мембраной (Рис. 10, Рис. 11). Для молекул карбоксифуллеренов были выбраны полностью депротонированные формы, т.к. pKa1 = 2.3 и pKa2 = 5.7 для малоновой кислоты в воде. Однако в гидрофобной мембране, когда значения pKa становятся выше, скорее всего, фулерены будут протонированы. Увеличенные значения pKa и протонирование фуллеренов приведет к уменьшению барьера переноса C3/D3 из воды в область гидрофобных хвостов. С другой стороны, в области гидрофильных цвиттерионных головок pKa малоновой кислоты будет зависеть от локальных взаимодейсвтий с фосфатом и холиновой группировкой. Тем не менее, мы предполагаем, что эти взаимодействия играют минорную роль в процессе сорбции фуллеренов на поверхность мембраны, и для простоты используем заряд -6 C3/D3.. 13 В равновесной МД молекула C3 сорбировалась на поверхность мембраны в две стадии. В начале симуляции C3 находился на расстоянии 2 нм от ц.м. мембраны, окруженный слоем растворителя (гидратная оболочка С3 – 40 молекул воды), как видно из Рис. 12. Позже молекула продвинулась больше вглубь мембраны примерно на 0,5 нм и установила контакт гидрофобной полусферой с липидными хвостами, а малоновые остатки остались в области головок (Рис. 10в). Рис. 10. Взаимодействие фуллерена C3 с мембраной. а – Профиль ПСС процесса проникновения C3 в модельную эукариотическую мембрану. б – Промежуточная ориентация молекулы C3, сорбированной на мембрану (показана с окружающим слоем воды). в – Стабильная конформация (в соответствие с глобальным энергетическим минимумом) C3, сорбированнного на мембрану и погруженного своей гидрофобной полусферой в область хвостов. Рис. 11. Взаимодействие фуллерена D3 с мембраной. а – Профиль ПСС процесса проникновения D3 в модельную эукариотическую мембрану. б – Стабильная конформация (в соответствие с глобальным энергетическим минимумом) D3 , сорбированнного в область гидрофильных головок. Такое поведение производного фуллерена C3 напрямую связано со стереохимией молекулы – две полусферы молекулы – гидрофобная и гидрофильная с малонатами – определяют амфифильную природу этого соединения. Ориентация молекулы (угол поворота) C3 к нормали мембраны была рассчитана из равновесной МД. В начале расчета, в первые 25 нс – ориентация фуллерена меняется значительно, однако после Рис. 12. Молекула завершения процесса сорбции молекулы на мембрану, угол между фуллерена С3 с малонатными группировками и нормалью к мембране падает, и ассоциированными с карбоксифуллерен “садится” на гидрофобные хвосты. Такая конформация и соответсвует глобальному минимуму, приведенному на Рис. 10а. ней молекула воды Для изучения взаимодействия молекулы D3 с бислоем ДПФХ также были проведены равновесная МД и метадинамика. Расчеты показали, что D3 только сорбировался в области гидрофильных головок, оставаясь на расстоянии чуть более 2 нм от центра мембраны (Рис. 11). Оба карбоксифуллерена с гидрофильными отрицательно заряженными группировками не склонны проникать внутрь мембраны из-за высокого энергетического барьера (Рис. 10, Рис. 11). Для обоих производных фуллерена были рассчитаны поверхности, доступные растворителю (ПДР). Во время адсорбции C3 на мембрану, ПДР падал довольно быстро (Рис. 13). С другой стороны, ПДР для молекулы D3 оставался примерно одинаковым во время симуляции, т.к. в отличие от C3 не происходило специфического гидрофобного контакта с мембраной. 14 Наблюдаемая разница в сорбции молекул C3 и D3 возможно играет важную роль в антиоксидантных активностях этих двух молекул: они располагаются не внутри мембраны, как многие антиоксиданты, а на ее поверхности, предотвращая перекисное окисление липидов. Однако известно, что цитопротективные своейства C3 выше, чем у D3 [10], малонаты которого расположены симметрично на всей поверхности мембраны, не давая “зафиксироваться” на постоянном месте в определенной области мембраны. Рис. 13. Поверхности, доступные для растворителя, рассчитаные из равновесных МД для C3 и D3. 3.5. Заключение Процессы проникновения и накопления фуллерена C60, кластера из десяти фуллеренов, а также двух производных – С3 и D3 – были изучены методами равновесной молекулярной динамики и метадинамики. Сорбция всех фуллеренов на поверхность мембраны происходит в течение первых наносекунд симуляции. Немодифицированный фуллерен (одиночная молекула и кластер из С60) спонтанно проникают в мембрану и остаются внутри нее на протяжении всего времени расчетов. После проникновения в эукариотическую мембрану C60 остается на расстоянии 0,7-0,8 нм от центра бислоя. Кластер из фуллеренов деформирует мембану, вызывая ее изгиб, а также формирования гидрофобных участков на поверхности, которые делают мембрану более уязвимой к АФК. Изученные производные фуллерена – два изомера трималонат фуллерена – не проникают внутрь мембраны, а лишь сорбируются на ее поверхность, не меняя структуру бислоя. Отрицательно заряженные карбоксифуллерены взаимодействуют с положительно заряженными холинами, а также окружены гидратной оболочкой из 40 молекул воды. Было показано, что фуллерен C3 способен на 0,5 нм глубже погружаться в мембрану, чем D3. Глава 4. Механизм транспорта протона через билипидные слои Глава 4 настоящей диссертации посвящена изучению процесса переноса протона через модельный билипидный слой ПОФХ и связанные с ним перестройки в мембране, разделена на 4 части. 4.1. Литературный обзор В обзоре описываются экспериментальные данные по проницаемости протонов в мембраны. Обсуждаются возможные механизмы переноса протона: диффузионно или с участием переносчиков. Анализируются результаты численных экспериментов других авторов. 4.2. Описание модели переноса протона и расчет свободной энергии переноса Наиболее вероятным механизмом переноса протона является использование переносчиков – протонофоров. Первые кандидаты на эту роль – жирные кислоты мембран. Протонирование жирных кислот ведет к их нейтрализации, а следовательно они могут переносить протоны при помощи флип-флоп переходов. Однако в синтетических липидах, когда в системе отсутствуют жирные кислоты, перенос протона все равно происходит, поэтому жирные кислоты не являются искомыми протонофорами. Значение pKa для жирных кислот сопоставимо со значением pKa для фосфатных групп (pKa ~ 3.0), поэтому фосфатная группировка липида может быть переносчиком протона, особенно учитывая ее высокую буферную емкость [11]. Но здесь опять требуется флип-флоп механизм для перетаскивания липида через всю мембрану, однако он происходит довольно медленно (порядка нескольких часов), а энергия активации флип-флопа более 100 кДж/моль. 15 Поэтому в нашей молекулярнодинамической модели предложена гипотеза неполного флип-флопа (Рис. 14): два липида, находящиеся с двух сторон мембраны, один из которых протонированный, двигаются внутрь мембраны до такого расстояния, когда перенос протона становится возможным. Далее протон переходит с одного фосфата на другой, а вместе с ним оказывается на другой стороне мембраны. В первой серии МД две молекулы ПОФХ сближались друг навстречу другу внутрь мембраны как показано Рис. 14. Механизм неполного флип-флопа. а – Протон находится на воде в области фосфатных групп. б – Протон присоединяется к фосфату липида. в – Протонированный и непротонированный липиды погружаются внутрь мембраны, происходит перенос протона с одного фосфата на другой. г – Липиды возвращаются к границам мембраны, а протон отсоединяется от фосфата. Рис. 15. Формирование кислородной лестницы и водного мостика в процессе моделирования механизма неполного флип-флопа. а – Начальный вид системы: ПОФХ-Н сверху, ПОФХ – снизу, показаны как ВдВ сферы, фосфаты находятся на расстоянии 3,4 нм. б – Формирование кислородной лестницы между двумя монослоями мембраны на расстоянии 1,5 нм. в –Формирование водного мостика между двумя фосфорами на расстоянии 1,2 нм. Фосфоры показаны как оранжевые сферы, азоты – синие, кислороды липидов – малиновые. Рис. 16. График потенциала средней силы. Потенциал средней силы для двух липидов: справа – ПОФХ-Н, слева – ПОФХ. Гармонический потенциал был приложен к обоим фосфорам выбранных липидов вдоль оси Z. на Рис. 15. На верхний липид протонированный – ПОФХ-Н, имеет нейтральную фосфатную группу, фосфат нижнего липида, ПОФХ, заряжен отрицательно. Когда фосфатные группы проникают внутрь мембраны, они увлекают за собой молекулы воды (Рис. 15б, в). После того, как расстояние между двумя фосфатами (RPP) становится меньше 1,3 нм, образуется мостик из 7 молекул воды между атомами фосфора (Рис. 15в). Расчеты свободной энергии были повторены несколько раз. Каждый раз водный мостик появлялся при RPP < 1,3 нм. В каждой симуляции был рассчитан потенциал средней силы (Рис. 16). ПСС возрастает по мере проникновения липидной головки внутрь мембраны. Видно, что наклон кривой ПСС молекулы ПОФХ круче, чем молекулы ПОФХ-Н. Как видно из графика (Рис. 16), значения ПСС 16 повышались с понижением скорости, это связано, скорее всего с уменьшением возмущений в системе. Свободная энергия (ΔG) складывалась из двух значений энергий для каждого липида. Таким образом, чтобы перенести фосфаты внутрь мембраны до расстояния 1,3 нм, необходимо затратить 70-90 кДж/моль (Рис. 16). Параллельно вычислительным экспериментам, А. Лохматиковым была экспериментально определена энергия активации процесса переноса протона на липосомах, состоящих только из синтетических липидов ПОФХ. Измеренная Ea равнялась 60 кДж/моль, что на 20 кДж/моль меньше аналогичных измерений на природных липидах [12], а также на 10-20 кДж/моль меньше значений, полученных при перемещении двух фосфатов внутрь мембраны на расстояние 1,2 нм. 4.3. Изучение свойств «кислородной лестницы» Во время проведений расчетов было замечено, что появление цепочки воды внутри мембраны всегда сопряжено с характерными структурными перестройками сложноэфирных атомов кислорода липидных молекул. Каждый ПОФХ имеет четыре кислорода, при приближении моделируемых липидов внутри мембраны, восемь кислородов перестраивались в специализированную структуру, которая была названа “кислородная лестница” (Рис. 17в). Молекулы воды располагались мостиком вдоль отрицательно заряженной кислородной лестницы в гидрофобной части мембраны (Рис. 15г). Важно отметить, что лестница формировалась до того, как образуются водные цепочки, на расстояниях RPP < 1,5 нм (Рис. 17). Чтобы проверить причастность кислородных лестниц к формированию водных цепочек, была проведена вторая серия МД расчетов. Атомы фосфоров липидов ПОФХ-Н и ПОФХ были зафиксированы на определенных RPP расстояниях, это позволило достигнуть в конкретных точках состояния равновесия и отсутствия сильных возмущений в системах. На Рис. 17 показаны стадии формирования кислородной лестницы и выстраивания по ней водной цепочки. Вода выстраивалась вдоль кислородов уже на расстоянии порядка RPP=1,55 нм. Однако как только лестница разрушалась, цепочки также прекращали свое существование. Водные цепочки стали появляться чаще и сохранились дольше на более близких расстояниях RPP, особенно при RPP < 1,1 нм (Рис. 17, Рис. 18). МД расчеты показали, что формирование водных цепочек лимитировано образованием кислородных лестниц, т.к. формирование этих двух структур происходит не параллельно, а последовательно. По-видимому, временная задержка, которая требуется для того, чтобы сформировалась цепочка воды, в первой серии МД не была соблюдена из-за постоянного движения фосфоров. Соответственно это привело к тому, что молекулы воды выстроились позже, т.е. энергия активации оказалась завышенной. Приближение двух фосфатов липидов друг к другу внутри мембраны увеличивает вероятность образования водной цепочки, однако требует больше энергии. Из второй серии МД были рассчитаны вероятности образования водной цепочки внутри мембраны, способной переносить протон. Показано, что процесс наиболее вероятен при 1,1 нм < RPP < 1,4 нм (Рис. 18). В таком случае для атомов фосфора на расстоянии 1,4 нм энергия активация получается порядка 5060 кДж/моль (Рис. 16), и это хорошо согласуется с рассчитанной экспериментально энергией активации переноса протона через билипидный слой. Формирование кислородного мостика внутри мембраны никак не сопряжено с процессами протонирования/депротонирования. Поэтому для транспорта протона лимитирующей стадией является как раз формирование кислородного мостика. Видимо этим объясняется отсутствие H2O/D2O эффекта. Кинетическая модель также предсказывает отсутствие эффекта, связанного с изменением проницаемости в зависимости от ΔpH. Ранее было показано, что скорость транспорта протонов через Fo домен АТФазы также не зависит от величин мембранного потенциала в пределах 6,0 < pH < 10,0, а также была установлена независимость переноса протона от типа воды H2O/D2O в пределах 8,0 < pH < 10,0. Эти 17 наблюдения были объяснены лимитирующей стадией белкового конформационного перехода с энергией активации Ea порядка 60-70 кДж/моль. Рис. 17. Процесс формирования кислородной лестницы между двумя молекулами фосфора, расположенными на расстоянии 1,5 нм. а – Начальная конфигурация системы. б – Начало формирования кислородной лестницы. в – Появление кислородной лестницы между двумя фосфорами внутри мембраны. г – Построение водного мостика вдоль кислородной лестницы. Рис. 18. Вероятность образования водной Рис. 19. График зависимости количества цепочки внутри мембраны, рассчитанная молекул, пересекавших мембрану, от для разных расстояний фиксированных расстояния между фосфорами двух липидов. фосфоров. По аналогии, в нашем случае кислородная лестница как раз и есть тот конформационный переход, лимитирующая стадия, ограничивающая транспорт протона. Реализация таких "благоприятных" конформаций будет зависеть от гибкости молекул, участвующих в процессе, и это объясняет сильную зависимость протонного переноса от текучести, фазы мембраны. Филогенетический анализ показал, что протон-зависимой энергетике предшествовала натрий-зависимая энергетика, возможно из-за высокой проницаемости древних мембран для протона [13]. В разных группах организмов возникали разнообразные приспособления для уменьшения проницаемости Н+. Бактерии используют различные средства для увеличения плотности упаковки неполярных атомов в средней плоскости бислоя, археи – монослои липидов. Эти средства по идее должны препятствовать образованию «лестничных мостов» внутри мембраны. В случае архейных мембран кислородные лестницы должны быть короче, т.к. в каждом липиде содержится только четыре атома кислорода. Это объясняет, почему архейные мембраны 18 практически непроницаемы для протонов, даже несмотря на то, что мембранный дипольный потенциал архей на 120 мВ ниже, чем у организмов, содержащих сложноэфирные липиды. Поскольку протонов на поверхности мембраны довольно много, «крайние» молекулы воды образовавшейся цепочки могут обмениваться Н+ не только с фосфатами, но и с другими молекулами. Это означает, что в случае, если у молекулы липида нет фосфатной группировки, например у гликолипидов, обмен протонов может происходить по описанному выше механизму, только без стадии присоединения протона к фосфату. Полярные кислородные лестницы могут способствовать переносу не только протонов, но и молекул воды. Механизм водного транспорта через липидные бислои такдже до конца не ясен. Коэффициенты проницаемости воды - 10-2-10-4 см/с, а энергия активации Ea ~ 40-80 кДж/моль. Было предложено, что молекулы воды пересекают мембрану при образовании в ней дефектов. Однако до сих пор не было установлено, какие именно дефекты в мембране образуются. Полярные мостики кислородов вполне подходят на роль таких дефектов. В симуляции было показано, что вода пересекает мембрану при образовании водных мостиков (Рис. 19). Таким образом, кислородная лестница, которая была показана методом МД, может играть важную роль не только в транспорте протонов через биологические мембраны, но и молекул воды. 4.4. Заключение В четвертой главе диссертации были изучены процессы протонного переноса через мембрану мембрану и связанные с ними перестройки в мембране. Сначала был предложен механизм переноса протона с участием фосфатной группировки липида. Была проведена МД, в которой две молекулы ПОФХ (одна протонированная на фосфате, а другая - нет) двигались в центр мембраны с постоянной скоростью, имитируя процесс неполного флип-флопа. На расстоянии порядка 1,5 нм между фосфорами стали появляться короткие водные мостики, которые могут быть ответственны за перенос протона. Кроме того, было показано, что водные мостики выстраиваются вдоль «кислородной лестницы», сформированной восемью атомами кислорода эфирных групп липидов ПОФХ. Средняя свободная энергия на расстоянии 1,5 нм равняется примерно 60 кДж/моль, что согласуется с ранее опубликованными данными для липосом, состоящим из ПОФХ. Расчеты показывают, что трансмембранный перенос протона лимитирован образованием кислородной лестницы. Это объясняет, например, независимость коэффициента проницаемости протона от pH, а также отсутствие эффекта дейтериевой воды на проводимость протонов. Кислородные лестницы, возможно, являются теми полярными каналами мембраны, которые облегчают транспорт протонов и воды через мембраны. ВЫВОДЫ 1. Равновесная молекулярная динамика смеси трех липидов (ПОФХ, сфингомиелина и холестерина) в соотношении 2:1:1 в сформированной мембране приводит при Т=323 К за время порядка 0,3 мкс к образованию рафтовой области, с повышенным содержанием сфингомиелина и холестерина по сравнению с мембранной частью. Установлен состав липидного рафта – ПОФХ:СМ:ХОЛ находятся в соотношении 1:1,8:1,4. 2. Путем количественной оценки взаимодействия всех пар липидов (ПОФХ, сфингомиелина и холестерина) между собой в модельных мембранах ПОФХ показано, что сродство ХОЛ и СМ в липидном бислое сильнее (минимум энергии -20 кДж/моль), чем сродство остальных пар липидов. Именно эта разница в энергиях взаимодействия приводит к образованию рафтов с повышенной концентрацией СМ и ХОЛ. 3. Показано, что молекулы холестерина являются ключевым компонентом, повышающим параметр порядка ацильных цепей липидов в 1,5 раза, и таким образом структурируют мембрану. 19 4. Исследовано влияние сдвигов монослоев рафта друг относительно друга. Показано, что сдвиги приводят к изгибам в мембранах. Рассчитано, что минимум свободной энергии структуры бислойного рафта (-100 кДж/моль) приходится на расстояние 3,1 нм между центрами масс монослоев. 5. Изучен механизм взаимодействия фуллерена C60 и его производных, C3 и D3, с биологической мембраной, состоящей из липидов ДПХФ. Показано, что фуллерены склонны накапливаться внутри бислоя и вызывать перестройки структуры мембраны: изгибать, вызывать образование гидрофобных пор. Молекулы C3 и D3 не проникают внутрь мембраны, а сорбируются в область головок, причем C3 погружается глубже в мембрану на 0,5 нм, чем D3, в силу своей стехиометрии. 6. Предложен новый механизм транспорта протона через биологическую мембрану с участием фосфатов липидов. Показано, что при погружении головок липидов в мембрану на расстоянии 1,5 нм внутри мембраны возникает кислородная лестница, по которой выстраиваются молекулы воды, образуя цепочку. Оценена вероятность переноса протона по такой структуре, а также показана возможность переноса молекул воды с участием этой же кислородной лестницы. Рассчитанная энергия активации этого процесса составляет порядка 60 кДж/моль и хорошо согласуется с экспериментальными данными. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Bozdaganyan, M. E., Shaitan, K. V. Raft Formation in Biological Membranes: A Molecular Dynamics Simulation Study //BIOLOGICHESKIE MEMBRANY. – 2014. – Т. 31. – №. 4. – С. 244251. 2. Bozdaganyan, M. E., Orekhov, P. S., Shaytan, A. K., Shaitan, K. V. Comparative Computational Study of Interaction of C60-Fullerene and Tris-Malonyl-C60-Fullerene Isomers with Lipid Bilayer: Relation to Their Antioxidant Effect //PloS one. – 2014. – Т. 9. – №. 7. – С. e102487. 3. Bozdaganyan, M., Bragazzi, N. L., Pechkova, E., Shaitan, K. V., & Nicolini, C. Identification of Best Protein Crystallization Methods by Molecular Dynamics (MD) //Critical Reviews™ in Eukaryotic Gene Expression. – 2014. – Т. 24. – №. 4. – C. 311-324. 4. Pechkova E., Bragazzi N. L., Bozdaganyan M., Belmonte L., Nicolini C. A Review of the Strategies for Obtaining High-Quality Crystals Utilizing Nanotechnologies and Microgravity //. ‒ 2014. ‒ T. 24, № 4. ‒ C. 325-339. 5. Bozdaganyan, M., Bragazzi, N., Pechkova, E., Orekhov, P., Shaitan, K., & Nicolini, C. Molecular Dynamics for Nanobiotechnology // Nanobiotechnology in Energy, Environment and Electronics Pan Stanford, 2015. ‒ C. 105-136. 6. Galimzyanov, T. R., Molotkovsky, R. J., Bozdaganyan, M. E., Cohen, F. S., Pohl, P., Akimov, S. A. Elastic membrane deformations govern interleaflet coupling of lipid ordered domains// Physical review letters. – в печати 7. Bozdaganyan, M.Ye., Shaitan, A.K., Shaitan, K.V. “Studing of the interaction of fullerenes with biological membranes by molecular dynamics”, “1st International Scientific School - Nano 2009. Nanomaterials and Nanotechnologies in Living Systems”, 2009, Сборник тезисов, C. 174, Московская область, Ступинский район, Россия 8. Bozdaganyan, M.Ye. “Molecular dynamics simulation of fullerene C60 interaction with biological membrane”, Summer School on Simulation Approaches to Problems in Molecular and Cellular Biology, 31.08-5.09.2009, Сборник тезисов, C. 27, San Sebastian, Spain 9. Bozdaganyan, M.Ye. “Investigation of the interaction of C60 with prokaryotic and eukaryotic membranes by molecular dynamics” XVII International Conference of Students and Young Scientists “Lomonosov-2010”, 2010, Сборник тезисов, C. 16, Москва, Россия 10. Antonov, M.Yu., Shaitan, A.K., Orekhov, F.S., Bozdaganyan, M.Ye. “The application of parallel 20 11. 12. 13. 14. 15. 16. calculations and hybrid architectures for the study of the dynamics of biomacromolecules using molecular modeling” Proceedings of the international conference "Supercomputer mathematical models", 2011, сек. 43-46, Якутск, Россия Боздаганян, М.Е., Шайтан, А.К., Шайтан, К.В. “Исследование взаимодействия фуллерена и его производного с биомембранами методом молекулярной динамики” 2-ая Международная научная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина», 19.09-24.09.2011, Сборник тезисов, C. 16, Московская область, Ступинский район, Россия Bozdaganyan, M., Shaytan, K. “Structural properties of lipid rafts in biomembranes: a molecular dynamics simulation study” Eur Biophys J, 2013, 42 (Suppl 1):S1–S236 Bozdaganyan, M.Ye., Mulkidjanian, A.Y., Cherepanov, D.A., Shaitan, K.V. “Proton transfer through biological membrane: a molecular dynamics simulation study” International Symposium “Frontiers In Electronic Structure Theory And Multi Scale Modeling”, 21.10-22.10.2013, Сборник тезисов, C. 15, Москва, Россия Bozdaganyan, M., Shaitan, K. “Structural properties of lipid rafts in biomembranes: a molecular dynamics simulation study” The 18th international Pushchino school conference of young scientists “Biology – the science of the XXI century”, 21.04-25.04.2014, Сборник тезисов, C. 77, Московская область, Пущино, Россия Боздаганян, М.Е., Шайтан, К.В. “Изучение динамики липидных рафтов методом молекулярной динамики” V Международная научно-практическая конференция “Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины”, 3.10-5.10.2013, Сборник тезисов, C. 263, Ростов-на-Дону, Россия Bozdaganyan, M., Shaytan, K. “Computational study of interaction of C60-fullerene and tris-malonylC60-fullerene isomers with biomembranes” 12th Greta Pifat-Mrzljak International School of Biophysics, 27.09-06.10.2014, Сборник тезисов, C. 68, Primošten, Croatia СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Baumgart T., Hess S. T., Webb W. W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension // Nature. ‒ 2003. ‒ T. 425, № 6960. ‒ C. 821-824. 2. Halliwell B., Chirico S. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance // The American journal of clinical nutrition. ‒ 1993. ‒ T. 57, № 5. ‒ C. 715S-724S. 3. Wang I. C., Tai L. A., Lee D. D., Kanakamma P. P., Shen C. K., Luh T. Y., Cheng C. H., Hwang K. C. C(60) and water-soluble fullerene derivatives as antioxidants against radical-initiated lipid peroxidation // J Med Chem. ‒ 1999. ‒ T. 42, № 22. ‒ C. 4614-20. 4. Sayes C. M., Gobin A. M., Ausman K. D., Mendez J., West J. L., Colvin V. L. Nano-C60 cytotoxicity is due to lipid peroxidation // Biomaterials. ‒ 2005. ‒ T. 26, № 36. ‒ C. 7587-7595. 5. Perkins W. R., Cafiso D. S. An electrical and structural characterization of H+/OH- currents in phospholipid vesicles // Biochemistry. ‒ 1986. ‒ T. 25, № 8. ‒ C. 2270-6. 6. Rinia H. A., Snel M. M., van der Eerden J. P., de Kruijff B. Visualizing detergent resistant domains in model membranes with atomic force microscopy // FEBS Lett. ‒ 2001. ‒ T. 501, № 1. ‒ C. 92-6. 7. Chiu S. W., Jakobsson E., Mashl R. J., Scott H. L. Cholesterol-Induced Modifications in Lipid Bilayers: A Simulation Study // Biophysical Journal. ‒ 2002. ‒ T. 83, № 4. ‒ C. 1842-1853. 8. Ali M. R., Cheng K. H., Huang J. Assess the nature of cholesterol–lipid interactions through the chemical potential of cholesterol in phosphatidylcholine bilayers // Proceedings of the National Academy of Sciences. ‒ 2007. ‒ T. 104, № 13. ‒ C. 5372-5377. 9. Галимзянов Т., Молотковский Р., Акимов С. ЛИНЕЙНОЕ НАТЯЖЕНИЕ И СТРУКТУРА ГРАНИЦЫ РАФТА, РАССЧИТАННЫЕ С УЧЕТОМ ДЕФОРМАЦИЙ ИЗГИБА, НАКЛОНА И РАСТЯЖЕНИЯ/СЖАТИЯ // Биологические мембраны. ‒ 2011. ‒ T. 28, № 5. 21 10. Dugan L. L., Lovett E. G., Quick K. L., Lotharius J., Lin T. T., O'Malley K. L. Fullerene-based antioxidants and neurodegenerative disorders // Parkinsonism Relat Disord. ‒ 2001. ‒ T. 7, № 3. ‒ C. 243-246. 11. Dencher N. A., Burghaus P. A., Grzesiek S. Determination of the net proton-hydroxide ion permeability across vesicular lipid bilayers and membrane proteins by optical probes // Methods Enzymol. ‒ 1986. ‒ T. 127. ‒ C. 746-60. 12. Rossignol M., Thomas P., Grignon C. Proton permeability of liposomes from natural phospholipid mixtures // Biochim Biophys Acta. ‒ 1982. ‒ T. 684, № 2. ‒ C. 195-9. 13. Mulkidjanian A. Y., Galperin M. Y., Koonin E. V. Co-evolution of primordial membranes and membrane proteins // Trends in biochemical sciences. ‒ 2009. ‒ T. 34, № 4. ‒ C. 206-215. 22
