УДК 66.011 Доцент Д.С. Дворецкий, доцент Е.В. Пешкова, аспирант М.С. Темнов

Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности
А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014
УДК 66.011
Доцент Д.С. Дворецкий, доцент Е.В. Пешкова,
аспирант М.С. Темнов
(Тамбовский гос. техн. ун-т) кафедра технологии и оборудования
пищевых и химических производств, тел. (4752) 63-94-42
Экспериментальное определение
технологических режимов роста
биомассы микроводоросли хлорелла
с повышенным содержанием
липидов
Обосновано применение микроводоросли Chlorella vulgaris штамм
ИФР № С-111 в качестве источника сырьевых компонентов для произ­
водства биодизельного топлива третьего поколения. Проведены экспе­
риментальные исследования, на основании которых разработаны тех­
нологические основы и модифицированные питательные среды для
культивирования биомассы Chlorella vulgaris ИФР № С-111 с повышен­
ным содержанием липидов.
The implementation of Chrorella vulgaris microalgae (strain IFR
No. C- 111) as a source of raw materials for third-generation biodiesel fuel
production is justified. Experimental research has been conducted which
allowed to develop techniques and modified broth for the cultivation of
Chrorella vulgaris (strain IFR No. C- 111) biomass rich in lipids.
Ключевые слова: микроводоросль Chlorella vulgaris, штамм ИФР
№ С-111, липиды, компоненты смесевого биодизельного топлива, техно­
логические режимы культивирования, модифицированная питательная
среда Тамийя, источники азотного питания.
В настоящее
время
перспективным является
применение
биомассы
в производстве энергоносителей. Основным сырьем для получения биодизельного
топлива являются растительные технические липиды, которые извлекают из возоб­
новляемой биомассы (рапса, сои, рыжика, кукурузы) [1]. Использование биомассы
микроводорослей в качестве источника сырья представляется наиболее оправдан­
ным в производстве биотоплива третьего поколения [1]. Для производства биотоп­
лива
используются
нейтральные
липиды
триацилглицериды.
Синтез
и накопление большого количества триацилглицеридов в биомассе микроводорос­
лей происходит в условиях стрессового культивирования, осуществляемого подбо­
ром специальной питательной среды, температуры, освещения [4].
В исследовании Н.И. Черновой и др. [2] проведен сравнительный анализ ур о­
жайности масличных растений и микроводорослей при промышленном производ­
стве технических липидов и показано, что из-за высокой продуктивности микрово­
дорослей замена масличных культур на микроводорослевые позволит сократить
площади
выращивания
в
5СН100 раз,
используя
земли,
не
пригодные
для растениеводства.
В исследовании Б.К. Заядана и др. [3] выделены альгологически чистые куль­
туры микроводорослей из различных водных экосистем, проведен скрининг по
продуктивности выделенных культур и коллекционных штаммов микроводорослей.
СДворецкий Д.С., Пешкова Е.В., Темнов М.С., 2014
32
Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности
А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014
Методом индуцированного мутагенеза (УФ-облучение, 254 нм, 40 эрг/мм2)
и селекции получен мутантный штамм Chlorella pyrenoidosa C-2m2, характеризую­
щийся высокой активностью биосинтеза и накопления липидов, и проведена опти­
мизация условий его культивирования. Установлено, что оптимальными условиями
для интенсивного накопления липидов клетками Chlorella pyrenoidosa C-2m2 явля­
ется уменьшение концентрации азота в питательной среде в 10 раз (до 0,004 г/л)
и освещенность на уровне 4 кАк.
Paul Held [4] изучал штаммы Chlorella vulgaris (2714) и два различных выде­
ленных штамма Microcystis aeruginosa (LB 2238 и LB 2061). Клетки штаммов выра­
щивались на средах BG11, ТАР и ТР. В результате было определено, что при вы ра­
щивании штаммов на среде BG11 наибольшую продуктивность имеет Chlorella
vulgaris 2714 - на 15-й день культивирования 38 миллионов клеток в 1 мл суспен­
зии, Microcystis aeruginosa LB2238 и LB2061 - 8 миллионов клеток в 1 мл суспензии
и 30 миллионов клеток в 1 мл суспензии. При выращивании штамма Chlorella
vulgaris (2714) на средах BG11, ТАР и ТР наибольший прирост биомассы составил
на среде ТАР.
В исследовании Eline Ryckebosch и др.
[6] использовались штамм
Phaeodactylumtri cornutum P tl 8.6, который выращивали на питательной среде
WC с добавлением 30 г/л искусственной морской соли. Также изучались штамы
Nannochloropsis salina SAG 40.85, Chlorella vulgaris SAG 2 1 1 - llb и Arthrospira
platensis SAG 85.79. Nannochloropsis salina и Chlorella vulgaris культивировали при
температуре 21,9 ± 0,5 °C и при использовании среды WC. Для морской микроводо­
росли Nannochloropsis salina добавлялось 30 г/л искусственной морской соли. A r­
throspira platensis культивировали при температуре 21,9 ± 0,5 °С, для культивиро­
вания использовалась среда Spirulina (SAG, Германия). Клеточные стенки всех
штаммов подвергались разрушению (обработкой в шариковой мельнице или уль­
тразвуком), при этом максимальное количество липидов было экстрагировано из
биомассы Nannochloropsis salina (35,1 ± 0,8 %), далее шли остальные штаммы:
Phaeodactylumtri cornutum (28,7 ± 0,4), Chlorella vulgaris (21,7 ± 2,0), Arthrospira
platensis (11,6 ± 0,8).
В исследовании Pandian Prabakaran et al. [7], были выбраны микроводоросли
Chorella sp., Scenedesmus sp. и Neochloris sp. Микроводоросли инкубировали, и с­
пользуя среду BG11 [7] при воздухообмене 0,3 об/м3 и освещенности на уровне
2.5 кАк. Сухой вес биомассы всех трех штаммов составил 0,5 г/л, наибольшая про­
дуктивность была у штамма Chorella sp. и составила 52,7 мг/л-сут. Максимальная
производительность липидов была у штамма Scenedesmus sp. и составила 9,5
мг/(л-сут). По результатам данного исследования, учитывая величины производи­
тельности биомассы и липидов, можно рекомендовать использовать штаммы
Chorella sp. и Scenedesmus sp.
В исследовании Jae-Yon Lee et al. [8] были использованы микроводоросли Botryococcus sp., Chlorella vulgaris и Scenedesmus sp. на среде B G 11 при воздухообмене
0,3 об/м3. Дни инкубации штаммов Chlorella vulgaris, Scenedesmus sp. составили 7
дней, для штамма Botryococcus sp. в два раза больше - 14. Сухой вес биомассы всех
трех штаммов составил 0,5 г/л, наибольшая продуктивность была у штамма
Chorella vulgaris и составила 74,2 мг/л-сут. Максимальная производительность ли ­
пидов
была
у
штамма
Botryococcus
sp.
и
составила
11.5 мг/(л-сут), а у Chlorella vulgaris - 11,1 мг/(л-сут). Однако, учитывая тот факт,
что дни инкубации штамма Chlorella vulgaris по сравнению со штаммом Botryococ­
cus sp. в два раза меньше, а содержание липидов в них практически
одинаковое, микроводоросли Chlorella vulgaris можно рекомендовать использовать
в качестве сырья для производства биотоплива.
Таким образом, для производства биомассы в промышленном масштабе из
всего
многообразия
микроводорослей
пригодны
штаммы
рода
Chlorella,
33
Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности
А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014
что обусловлено высокой скоростью роста, высоким содержанием триацилглицеридов по отношению к сухой массе и устойчивостью к чужеродным биологическим
агентам (грибы, бактерии, другие виды микроводорослей).
В качестве объекта исследования в данной работе использовался штамм мик­
роводоросли Chlorella vulgaris ИФР № С -111 как наиболее приспособленный для
культивирования в условиях средней полосы России [9].
Экспериментальная установка (рис. 1) представляет собой реактор цилиндри­
ческой формы объемом 0,002 м3 из прозрачного материала, снабжённый барботером, с помощью которого осуществлялось обогащение суспензии газо-воздушной
смесью. Освещенность реактора была на уровне 10,6 кАк, что соответствует преде­
лу насыщения по Винбергу.
Рис. 1. Лабораторный фотобиореактор для культивирования фотоавт отроф ных м икроор­
ганизмов: 1 - реакт ор в форме цилиндра (h=400 мм, D=8 мм); 2 - барбот ажное устройство;
3 - панель с энергосберегающими лампами (освещенность слоя суспензии порядка 10 клк); 4
- компрессор; 5 - емкость для подачи питательной среды
Цель исследования - определение технологических режимов роста биомассы
микроводоросли Chlorella vulgaris штамма ИФР № С -111, обеспечивающих накопле­
ние нейтральных липидов для последующего их использования в качестве сырья
для смесевого биодизельного топлива, а именно: выбор питательной среды, обеспе­
чивающей наибольшую продуктивность микроводоросли, подбор компонентов п и ­
тательной среды - источников азотсодержащих соединений и интервала оптималь­
ных температур для роста биомассы микроводорослей хлорелла, а также условий
стресса, стимулирующих накопление липидов в клетках рассматриваемого штамма.
Для проведения первого эксперимента штамм Chlorella vulgaris ИФР № С -111
культивировался на питательных средах Тамийя [1] и ТАР [2] при температуре
29 °С, уровне pH 6,2-8,0, при круглосуточном освещении энергосберегающими лам ­
пами с освещенностью на уровне 10,6 кАк, аэрация осуществлялась воздушной
смесью с содержанием углекислого газа 0,04 %. Посевной материал составлял 20 %
от общего объема суспензии (с концентрацией: 1■10б кл/мл). Динамика прироста
34
Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности
А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014
Ж*
штамма Chlorella vulgaris ИФР № С-111 на средах Тамийя и ТАР представлена
на рис. 2.
•—среда Тамийя
►*- среда ТАР
t, сутки
t, с у т
Рис. 3. Динам ика прироста
биомассы на модернизированных
средах Тамийя с разным и
источниками азота
Рис. 2. Н акопление биомассы
штамма Chlorella vulgaris И Ф Р
NqC -111
на
средах
Тамийя
и ТАР
Экспоненциальная фаза роста составила 8 сут и максимальный прирост био­
массы - 55-106 кл/мл для среды Тамийя (8-е сут), максимальный прирост биомассы
на среде ТАР был 15-106 кл/мл.
Согласно литературе различные соединения - источники азота обладают
разной доступностью для клеток микроводоросли хлорелла, поэтому во втором
эксперименте производилась оптимизация питательной среды по применению
азотсодержащих
соединений.
Для
этого
применялись
модифицированные
питательные среды Тамийя, в которых в качестве источника азота использовались:
нитрат калия в первом эксперименте, хлорид аммония - во втором и мочевина в третьем (рис. 3). Условия культивирования: температура 29 °С, круглосуточная
освещённость лампами на уровне 10,6 кАк, концентрация посевного материала 2-106 кл/мл.
Результаты эксперимента показывают, что в качестве источника азотсодер­
жащих соединений для накопления биомассы штамма
Chlorella vulgaris
ИФР № С-111 оптимально подходит нитрат калия, обеспечивающий двукратный
прирост биомассы на 7-й день культивирования по сравнению со средой с мочеви­
ной и более чем пятидесятикратный - при использовании питательной среды с хло­
ридом аммония. Объяснить низкий прирост на среде с источником азота - хлорид
аммония можно тем, что хлорид аммония N H 4 CI - соль слабого основания гидрата
аммиака NH./HvO и сильной соляной кислоты НС1, в воде гидролизуется и дает кис­
лую реакцию:
N H 4 CI + НОН <-► N H 4 OH + НС1
NH4+ + НОН <-►n h 4o h + Н+,
поэтому уровень pH в процессе культивирования на этой среде падал с 7,05 до 3,5.
Замедление прироста биомассы на среде с использованием мочевины можно
объяснить тем, что Chlorella vulgaris содержит мочевинную амидазу, которая ката­
лизирует расщепление мочевины [2]:
С ( Ш 2 )2+АТФ+Н 2 0=С02+2КНз+АДФ+Р1.
Установлено, что при культивировании штамма и использовании в качестве
источника азота - мочевины, на 4-5-й день культивирования аммонийная форма
азота может достигать в среде 40-60 % от общего содержания азота, что подкисляет
среду и вызывает угнетение роста клеток.
35
Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности
А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014
Для определения интервала температуры культивирования, обеспечивающего
высокую продуктивность по биомассе, штамм Chlorella vulgaris ИФР № С-111 куль­
тивировался на среде Тамийя, уровне pH 6,2-8,0, при круглосуточном освещении
энергосберегающими лампами с освещенностью на уровне 10,6 кАк, аэрация осу­
ществлялась воздушной смесью с содержанием углекислого газа 0,04 %, при тем пе­
ратурах культивированиях 27,5, 29,5 и 35 °С. Посевной материал составлял 20 % от
общего объема суспензии (с концентрацией 2-106 кл/мл). Динамика прироста био­
массы клеток микроводорослей представлена на рис. 4.
-1РСДЛ
Тамий?
&-J9.ST
*-J5T
-обеднение*
среда
а зо то м
Там ий*
Рис.
5.
Накопление
биожассы
штамма Chlorella vulgaris ИФР
Nq
С-111
на
стандартной
и обедненной азотож средах Тажийя
Рис.
4.
Динам ика
прироста
биожассы
штажма
Chlorella
vulgaris
ИФР
Nq
С -1 11
в зависимости от температуры
Анализ графиков показывает, что максимальный прирост биомассы штамма
был при температуре суспензии 29,5 °С, и составил 53-10б кл/мл на 8-й день
культивирования. Повышение температуры приводит к значительному снижению
роста
клеток.
Такое
поведение
объясняется
повышением
растворимости
и концентрации углекислого газа в культуральной жидкости, приводящим
к ингибированию роста клеток микроводоросли.
Деф ицит доступных азотсодержащих соединений в питательной среде созда­
ет стресс для клеток микроводорослей, которые стимулируют накопление липидов в
клетках биомассы. При этом наблюдается снижение интенсивности биосинтеза
белка, образование клеток, которые теряют способность к делению, но увеличива­
ются в диаметре и образуют глобулы, содержащие нейтральные липиды. Данные
изменения в клетках наблюдаются при концентрации азота в питательной среде
менее 80 мг/л. В зависимости от физиологических свойств штамма при азотном
голодании накапливается до 50-80 % липидов от сухой массы клетки.
Для определения режимов, соответствующих стрессовым условиям, обеспе­
чивающим максимальное накопление липидов внутри клетки, штамм Chlorella vul­
garis ИФР № С-111 выращивался на стандартной и обедненной азотом средах Т а ­
мийя. Содержание азота в стандартной среде Тамийя было 231 мг/л, а на обеднен­
ной азотом среде Тамийя содержание азота было 50 мг/л. Посевной материал со­
ставлял
20
%
от
общего
объема
суспензии
с
концентрацией
1•10б кл/мл; температура культивирования - 29 °С, при круглосуточном освещении
энергосберегающими лампами с освещенностью на уровне 10,6 кАк, аэрация осу­
ществлялась воздушной смесью с содержанием углекислого газа 0,04 %.
Динамика прироста биомассы штамма Chlorella vulgaris ИФР № С -111 на
стандартной и обедненной азотом среде Тамийя представлена на рис. 5.
36
Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности
А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014
Снижение роста клеток почти в 5,5 раз на среде, обедненной азотом, объясня­
ется тем, что клетки Chlorella vulgaris не способны полностью поглощать азот из пи­
тательной среды. Таким образом, азот становится практически не доступен для
клеток при остаточной концентрации 10 мг/л. Данный эксперимент позволил вы ­
явить нецелесообразность накопления биомассы Chlorella vulgaris ИФР № С -111 с
применением среды с пониженным содержанием азота, поскольку такой режим
способствует раннему наступлению стационарной фазы при концентрации клеток
9-10б кл./мл, однако такой режим можно рекомендовать на второй стадии культи­
вирования для накопления липидов.
По результатам работы можно сделать следующие выводы:
- микроводоросль хлорелла является перспективным продуцентом при производ­
стве компонентов смесевого биодизельного топлива - нейтральных липидов. На ос­
новании обзора информационных источников был обоснован выбор штамма мик­
роводоросли Chlorella vulgaris ИФР № С -111;
- экспериментальные исследования позволили установить, что для накопительно­
го культивирования биомассы Chlorella vulgaris ИФР № С-111 с повышенным со­
держанием липидов наилучшая продуктивность микроводоросли хлорелла достига­
ется при использовании модифицированной среды Тамийя, содержащей в своем
составе нитрат калия в качестве источников азота;
- наилучшая скорость роста биомассы наблюдается при температуре 29,5 °С;
- по достижении биомассой микроводоросли хлорелла стационарной стадии ро­
ста, следует создавать клеткам стрессовые условия путём снижения содержания
доступных азотсодержащих соединений в питательной среде для стимулирования
накопления внутриклеточных липидов. Установление оптимальных режимов накоп­
ления внутриклеточных липидов и режимов их выделения является предметом
дальнейшего исследования.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ
в базовой части задания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дворецкий, Д.С. Технология получения биодизельного топлива с использо­
ванием гетерофазных катализаторов и СВЧ-нагрева [Текст] / Д.С. Дворецкий, С.А.
Нагорнов, А.А. Ермаков, С.В. Неизвестная // Вопросы современной науки и прак­
тики. Университет имени В.И. Вернадского. - 2012. - Специальный выпуск (39). С. 136-143.
2. Чернова, Н.И. Микроводоросли в качестве сырья для получения биотоплива
[Текст] / Н.И. Чернова, С.В. Киселева, Т.П. Коробкова, С.И.Зайцев / / Альтернатив­
ная энергетика и экология. - 2008. - № 9. - С. 68-74.
3. Заядан, Б.К. Выделение, мутагенез и оптимизация условий культивирова­
ния
штамовмикроводорослей
для
производства
биодизеля
[Текст]
/ Б.К. Заядан, С. Пуртон, А.К. Садвакасова, А.А. Усербаева, К. Болатхан // Физио­
логия растений. - 2014. - № 1. - С. 135.
4. Held, Paul. Determination o f Algal Cell Lipids Using Nile Red - Using Microplates
to Monitor Neutral Lipids in Chlorella Vulgaris / Paul Held, Keri Raymond. (http: / /www.biotek.com/resources/articles/nile-red-dve-algal.html).
5. Gouveia, Luisa / Microalgae as a Feedstock for Biofuels. Book / Luisa Gouveia.
- Springer, 2011.
37
Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности
А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014
6. Ryckebosch, Е. Optimization o f an Analytical Procedure for Extraction of Lipids
from Microalgae / / Journal o f the American Oil Chemists' Society. 2012. vol 89. P. 189­
198.
7. Pandian, P. A study on effective lipid extraction methods from certain fresh w a ­
ter microalgae // Elixir Bio Technology. 2011. vol 39. P. 4589-4591.
8. Jae-Yon Lee Comparison o f several methods for effective lipid extraction from
microalgae // Bioresource Technology. 2010. Vol 101. P. 575-577.
9. Богданов, Н.И. Суспензия хлореллы в рационе сельскохозяйственных ж и­
вотных [Текст] / Н.И. Богданов. - Волгоград : «Здоровье и экология», 2007. - 48 с.
R E FE R E N C E
1. Dvoretsky, D.S. Technology o f Producing Biodiesel Using Heterophase Catalysts
and Microwave Heating[Text]/ D.S. Dvoretsky, S.A. Nagornov, A.A. Ermakov, S.V. Neisvestnaya // Questions o f modern science and practice. Vernadsky University 2012. vol 39. - P. 136-143.
2. Chernova, N.I. Microalgae as Source for Biofuels [Text] / N.I Chernova,
S.V. Kiseleva, T.P. Korobkova, S.I. Zaitsev // Alternative Energy and Economy. 2008.
vol 9. P. 68-74.
3. Zayadan, B.K. Isolation, mutagenesis and optimization o f strain cultivation
o f microalgae for biodiesel production [Text] / / Vegetable physiology. 2014. vol 1.
P. 135.
4. Held, Paul. Determination o f Algal Cell Lipids Using Nile Red - Using M icro­
plates to Monitor Neutral Lipids in Chlorella Vulgaris/ Paul Held, Keri Raymond. (http: / /www.biotek.com/resources/articles/nile-red-dye-algal.html).
5. Gouveia, Luisa/ Microalgae as a Feedstock for Biofuels. Book / Luisa Gouveia. Springer, 2011.
6. Ryckebosch, E. Optimization o f an Analytical Procedure for Extraction
o f Lipids from Microalgae // Journal o f the American Oil Chemists' Society. 2012.
vol 89. P. 189-198.
7. Pandian, P.A. study on effective lipid extraction methods from certain fresh w a ­
ter microalgae // Elixir Bio Technology. 2011. vol 39. P. 4589-4591.
8. Lee, Jae-Yon et al. Comparison o f several methods for effective lipid extraction
from microalgae // Bioresource Technology. 2010. Vol 101. P. 575-577.
9. Bogdanov, N.I. Suspension of Chlorella in the diet o f farm animals [Text] /
N.I.Bogdanov. - Volgograd: « Health and ecology», 2007. - P.48.
38