Автореферат - Институт биологии гена РАН
advertisement
На правах рукописи Лопатина Анна Васильевна ОЦЕНКА РАЗНООБРАЗИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОВЕРХНОСТНОГО СНЕГА ПРИБРЕЖНЫХ ЗОН ВОСТОЧНОЙ АНТАРКТИДЫ Специальность 03.01.07 – молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2015 Работа выполнена в Лаборатории регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук. Научный руководитель: Северинов Константин Викторович, доктор биологических наук, профессор. Официальные оппоненты: Гельфанд Михаил Сергеевич, доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по научным вопросам Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем передачи информации им. А.А.Харкевича Российской академии наук. Алехина Ирина Александровна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Лаборатории изменений климата и окружающей среды Федерального государственного бюджетного учреждения Арктического и Антарктического научно-исследовательского института. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук. Защита диссертации состоится 17 ноября 2015 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д.34/5. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук по адресу: http://www.genebiology.ru/dissertation/Lopatina.shtml Автореферат разослан «_____»_____________ 2015 года. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук 1 Набирочкина Е.Н. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Полярные области – это важные климатообразующие регионы планеты и источники полезных ископаемых. Эти регионы очень чувствительны к изменению климата. По этим причинам интерес к полярным областям со стороны научного и экономического сообщества неуклонно растет. В 2010 году была принята государственная долгосрочная программа «Стратегия развития деятельности Российской Федерации в Антарктике на период до 2020 года и на более отдаленную перспективу». Развитие комплексных научных исследований в Антарктике и проведение мониторинга состояния компонентов природной среды является, таким образом, важной задачей, актуальной для нашей страны. Снежный покров – важнейшая климатическая и экологическая система нашей планеты. Снегами покрыто около 35% поверхности Земли. Снежная экосистема находится в тесном взаимодействии с атмосферой, почвами, морской и талой водой, и оказывает влияние на биосферу в целом. Большую роль при этом может играть микробная составляющая снежного покрова. Численность бактерий на поверхности снегов оценивается от 102 до 106 клеток на миллилитр (кл/мл) талой воды. Микробиологические исследования снегов Арктики, Антарктики и высокогорных ледников показали присутствие в них жизнеспособных микроорганизмов, многие из которых являются облигатными психрофилами. Эти данные описывают лишь минорную часть биологического разнообразия микроорганизмов поверхностных снегов, т.к. согласно современным данным, менее 1% всех бактерий, присутствующих в образце, поддается культивированию. Молекулярно-генетическими методами на поверхности снегов Арктики и высокогорных ледников были обнаружены представители разнообразных филогенетически групп микроорганизмов, например Betaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacilli и Actinobacteria. Исследования микроорганизмов поверхностных снегов Антарктиды с помощью молекулярно-генетических методов начались сравнительно недавно и пока весьма немногочисленны. Всего два исследования описывают разнообразие бактерий поверхностных снегов на куполе Антарктиды в районе двух исследовательских станций – Конкордия и Амундсен-Скотт. Данные о численности, составе и функциональных особенностях микроорганизмов на поверхности снега остальных частей Антарктиды, в том числе ее прибрежных районов, отсутствуют. Настоящая диссертационная работа посвящена изучению разнообразия микроорганизмов поверхностного снега прибрежных зон Восточной Антарктиды, а также попытке описания их функциональных особенностей. 1 Согласно плану, принятому в 2014 г. на «Совещании по определению главных научных проблем исследований Антарктики и Южного океана на период до 2035 г», изучение живых организмов на территории Антарктиды является одним из шести приоритетных направлений полярных исследований, поэтому результаты, полученные нами в ходе настоящей работы, могут стать основой для дальнейших исследований и мониторинга микроорганизмов поверхностных снегов Антарктиды. Цели и задачи Целью настоящей работы было охарактеризовать сообщества микроорганизмов поверхностного снега прибрежных зон Антарктиды для получения знаний о структуре, динамике и, возможно, функционировании этих сообществ. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1. Сбор образцов поверхностного снега в удалённых друг от друга областях Восточной Антарктиды, и выделение препаратов ДНК сообществ микроорганизмов снега. 2. Оценка распространения, численности и естественного видового разнообразия микроорганизмов в образцах поверхностного снега с применением молекулярно-генетических и микробиологических методов. 3. Идентификация функциональных категорий генов, характерных для сообществ микроорганизмов поверхностного снега Антарктиды. 4. Исследование штаммов Flavobacterium psychrophilum в образцах снега, собранных в удалённых друг от друга областях Антарктиды, с помощью генотипирования их CRISPR локусов. Научная новизна, теоретическая и практическая значимость Главная научная ценность работы заключается в том, что в ней впервые современными методами молекулярной биологии проведен комплексный анализ микробного сообщества поверхностного снега прибрежных районов Антарктиды. Показано, что таксономический состав бактерий в образцах антарктического снега из удаленных друг от друга областей Антарктиды, заметно отличается, а в одном и том же месте – существенно меняется в течение одного года. Впервые проведен функциональный анализ сообществ микроорганизмов антарктического снега, выявлена повышенная представленность функциональных групп генов, продукты которых вовлечены в адаптации к окислительному стрессу и устойчивости к тяжелым металлам. Наконец, впервые получены данные о разнообразии спейсеров CRISPR локусов психрофильных бактерий Flavobacterium psychrophilum, часто встречающихся на поверхности снегов Антарктиды. Впервые разработана и апробирована 2 новая методика оценки разнообразия штаммов микроорганизмов в природных образцах с помощью сравнения наборов амплифицированных спейсеров CRISPR-кассет бактерий. Уникальный опыт и практические навыки, полученные в ходе выполнения настоящей работы, могут быть использованы в планировании и осуществлении будущих микробиологических исследований в Антарктике и Арктике. Методология и методы работы Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов микробиологии, молекулярной биологии и биоинформатики. Основные положения, выносимые на защиту 1. Таксономический состав бактерий, находящихся на поверхности снега, заметно отличается в образцах из удаленных друг от друга областей Антарктиды, а в одной и той же области изменяется со временем. 2. Таксономический состав антарктических бактерий, определенный по представленности их 16S рРНК и соответствующих им генов, существенно разнится. 3. Среди функциональных категорий генов, статистически значимо перепредставленных в сообществах микроорганизмов поверхностного снега Антарктиды, выявлены гены, кодирующие белки клеточного ответа на окислительный стресс, и гены устойчивости к тяжелым металлам. 4. Наборы спейсеров (вариабельных участков CRISPR-кассет) в штаммах F. psychrophilum из географически удаленных областей Антарктиды существенно отличаются друг от друга и совершенно отличны от спейсеров F. psychrophilum из Северного полушария. Степень достоверности и апробация результатов работы Цели, поставленные в работе, достигнуты, результаты приведенных в работе экспериментов грамотно интерпретированы и сделанные в работе выводы обоснованы, их достоверность не вызывает сомнений. Результаты работы были опубликованы в рецензируемых научных журналах и представлены на российских и международных конференциях. Публикации Результаты работы были представлены на трех научных конференциях и опубликованы в двух статьях в рецензируемых научных журналах (см. перечень в разделе «Список работ, опубликованные по теме диссертации»). Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, а также выводов, благодарностей и списка литературы. Работа изложена на 126 3 страницах машинописного текста, включая 19 рисунков и 15 таблиц. Список цитируемых литературных источников включает 189 наименований. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Микробиологический анализ образцов талого снега. Изучение микробных сообществ в образцах поверхностного снега Антарктиды было начато с оценки количества микробных клеток, детектируемых с помощью микроскопии. Оценивали количество микробных клеток в образцах, собранных со станций Ленинградская и Дружная в ходе 54-й и 55-й сезонной Российской антарктической экспедиции (РАЭ). Так как эти станции находятся на удалении ~3000 км друг от друга (Рисунок 1), параллельный анализ должен был дать представление о вариации численности бактерий в заведомо независимых образцах поверхностного снега Восточной Антарктиды. Рисунок 1. Расположение четырех Российских антарктических станций, рядом с которыми отбирались образцы поверхностного снега. Расстояние до открытой воды в период отбора проб на станции Мирный и Прогресс составляло несколько километров, на станции Дружная – около 150 км, на станции Ленинградская – около 400 км. Карта Антарктиды взята из архива Института Арктики и Антарктики http://wdc.aari.ru/datasets/d0040/antarc/png/. 4 Методом прямого подсчета бактериальных клеток с помощью люминесцентной микроскопии было обнаружено 1,0-37,0×103 бактериальных клеток на мл (кл/мл) талого снега на станции Ленинградская и 5,6-46,0×103 кл/мл для станции Дружная. Полученные данные находятся в пределах ранее опубликованных измерений для образцов поверхностного снега полярных широт и высокогорных вечных снегов, где обнаруживали от 102 до 106 клеток на мл талой воды. Параллельно с микроскопическим анализом, изучалась способность бактерий из талой воды к росту в лабораторных условиях. Определяли способность к образованию колоний на чашках с твердыми питательными средами на трех температурах +4, +18 и +37 oC. Количество культивируемых бактерий в образцах было крайне низким и соответствовало 0-1,2 к.о.е./мл талой воды. Бактерии из колоний, образовавшихся на +4 оС или +18 оС, также образовывали колонии при пересеве на +37 оС. Таким образом, ни один из культивируемых антарктических микробов не был облигатным психрофилом. Как видно из Таблицы 1, наибольшее разнообразие культивируемых бактерий наблюдалось на станции Ленинградская. Интересно, что культивируемые бактерии в образцах, отобранных в одном и том же месте с разницей в один год, также как и образцы, отобранные на разных станциях в один и тот же год, были совершенно различными. Таблица 1. Таксономический анализ культивируемых бактерий из образцов поверхностного снега Антарктики. В таблице представлены бактерии, образовывавшие колонии при инкубации на указанных температурах. Место отбора образцов Дружная 54-я РАЭ Дружная 55-я РАЭ Инкубация +4 o C Bacillus sp. Инкубация +18 o C Bacillus sp. Инкубация +37 oC Bacillus sp. Stenotrophomonas sp. Bacillus sp., Pseudomonas Ленинградская fluorescens, 54-я РАЭ Rhodococcus erythropolis Bacillus sp., Microbacterium sp., Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus erythropolis Ochrobactrum Ленинградская sp., 55-я РАЭ Acinetobacter sp. Ochrobactrum sp., Acinetobacter calcoaceticus, Ochrobactrum Comamonas sp., sp., Acinetobacter Stenotrophomonas sp., sp. Methylobacterium sp., Sphingomonas sp. 5 Bacillus sp., Microbacterium sp., Phyllobacterium myrsinacearum, Roseococcus sp., Pseudomonas koreensis, Rhodococcus sp. 2. Анализ таксономического состава микробного сообщества методом молекулярного клонирования. Как известно из литературных источников, менее 1% бактерий, присутствующих в природных образцах, способны к росту в лабораторных условиях. Поэтому для оценки истинного разнообразия снежных бактерий Антарктиды были использованы молекулярно-генетические методы. Были приготовлены четыре библиотеки клонированных фрагментов генов 16S рРНК, амплифицированных с препаратов ДНК, выделенных из талого снега, собранного на станциях Ленинградская и Дружная в ходе 54-й и 55-й РАЭ. Всего было проанализировано около 450 последовательностей фрагментов генов 16S рРНК, которые принадлежали представителям восьми классов бактерий: Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Verrucomicrobiae и Bacilli. Betaproteobacteria были самым многочисленным классом и составляли от 39,3% до 82,5% от общего числа клонов на станции Ленинградская (54-й сезон) и Дружная (55-й сезон), соответственно. Более детальный таксономический анализ показал присутствие на поверхности антарктического снега 41-го рода бактерий. Как видно из Рисунка 2, Janthinobacteria, Prosthecobacter, Sphingomonas и Caulobacter были самыми многочисленными родами в образцах со станции Дружная 54-го сезона и составляли, соответственно, 24,2%, 12,6%, 12,6% и 10,5% от общего числа клонов. Год спустя, в образце, собранном на том же месте, доля Janthinobacteria выросла до 36%, а три других наиболее многочисленных рода прошлого года не детектировались. В образцах со станции Ленинградская самыми многочисленными в 54-м сезоне были представители родов Novosphingobium (21,4%), Janthinobacteria (14,3%), Acidovorax (12,5%) и Pseudomonas (9,8%), однако в образце 55-го сезона эти роды практически не детектировались, уступив место представителям родов Comamonas (20,8%), Rhodoferax (18,5%) и Ralstonia (13,1%). Все присутствующие на поверхности снега доминантные роды бактерий ранее обнаруживались на поверхности снегов высокогорных ледников и полярных областей. Сравнительный анализ таксономического состава бактерий на уровне рода с помощью расчета коэффициента корреляции Пирсона в образцах двух сезонов выявил среднюю корреляцию на станции Дружная (r = 0,54, p-value < 0,05), и отсутствие корреляции на станции Ленинградская. Между образцами на станции Ленинградская и Дружная, собранными в ходе 54-й РАЭ, была получена средняя корреляция (r = 0,52, p-value < 0,05), однако для образцов 55-го сезона корреляции не было. Таким образом, микробные сообщества снега различаются 6 как между двумя станциями, так в пределах одной станции, по крайней мере при анализе образцов, собранных с интервалом в 12 месяцев. Рисунок 2. Анализ таксономической принадлежности ДНК последовательностей из четырёх библиотек клонов фрагментов генов 16S рРНК. Представлена частота встречаемости клонов, содержащих амплифицированные фрагменты генов 16S рРНК родов указанных бактерий, в образцах со станций Ленинградская (верхняя панель) и Дружная (нижняя панель). Высота столбца отражает процент последовательностей ДНК, соответствующих указанному роду бактерий. Звездочки над столбцами означают, что бактерии данного рода были также обнаружены культуральным методом. Содержание питательных веществ на поверхности снега крайне мало. Автотрофные прокариотические организмы, способные синтезировать органические молекулы, могли бы играть важную роль в снежной экосистеме, выступая в качестве первого звена питательной цепи. Однако последовательности 16S рРНК генов цианобактерий в полученных нами библиотеках клонов обнаружены не были. При направленной амплификации фрагментов генов 16S рРНК цианобактерий специфичными к 16S рРНК гену цианобактерий праймерами нам удалось получить незначительное количество ампликонов из образцов талой воды со станций Ленинградская и Дружная 54го сезона. Большая часть клонированных последовательностей была сходна с 7 последовательностями цианобактерий Phormidium, Anabaena и одноклеточной водоросли Chlorella. В целом, результаты указывают на то, что количество цианобактерий или фотосинтезирующих водорослей в проанализированных образцах крайне незначительно. Препараты ДНК, выделенные из образцов поверхностного антарктического снега, были также исследованы на наличие гена 16S рРНК архей. ПЦР с праймерами, специфичными к гену 16 рРНК архей, не привела к получению продукта амплификации ни для одного из изученных нами образцов, что может означать крайне незначительное количество или полное отсутствие архей в образцах. 3. Анализ таксономического состава методом молекулярного клонирования 16S рРНК. Препараты тотальной ДНК, приготовленные из образцов поверхностного антарктического снега, содержат генетический материал как живых, так и покоящихся форм, a также мертвых клеток бактерий. Одним из показателей жизнеспособности бактериальных клеток может служить высокое содержание РНК, в частности, рибосомальной РНК. Чтобы выявить такие бактерии, мы создали и проанализировали библиотеку клонов кДНК, полученную с 16S рРНК снежных бактерий, и сравнили ее с ранее полученными библиотеками 16S рДНК. Из Рисунка 3 следует, что таксономический состав находящихся на поверхности снега бактерий, определенный по представленности их 16S рРНК и соответствующим им генов, значительно разнится. Некоторые роды бактерий, например Acinetobacter, Caulobacter, Comamonas, Janthinobacterium, Pseudomonas, Sphingomonas и др., присутствовали в библиотеках, полученных на матрице как ДНК, так и кДНК, в то время как большая часть детектированных родов бактерий было выявлено при анализе лишь одного из типов библиотек. Сравнительный анализ с помощью коэффициента Пирсона также показал отсутствие корреляции таксономического состава бактерий, полученного при анализе двух типов библиотек, на обеих станциях. В отличие от молекул геномной ДНК, которые присутствуют в клетке в количестве нескольких копий, в живых клетках могут содержаться тысячи рибосом и, соответственно, молекул 16S рРНК. Можно предположить, что микроорганизмы, детектированные только в библиотеках клонов кДНК, были малочисленны на поверхности снега и поэтому не детектировались в ДНК библиотеках. Однако, такие микроорганизмы, возможно, и относятся к собственно снежной микрофлоре. Таким образом, совместный анализ библиотек клонов, полученных на матрицах ДНК и кДНК, позволяет получить более детальное представление о разнообразии бактерий на поверхности снега по сравнению с анализом библиотек одного типа. 8 Рисунок 3. Анализ таксономической принадлежности последовательностей фрагментов генов 16S рРНК, полученных после амплификации на матрицах ДНК или кДНК бактерий. На диаграмме представлена частота встречаемости клонов, содержащих амплифицированные фрагменты генов 16S рРНК родов указанных бактерий, в образцах со станций Ленинградская (верхняя панель) и Дружная (нижняя панель) 55-го сезона РАЭ. Высота столбца отражает процент последовательностей ДНК, соответствующих указанному роду бактерий. Звездочки над столбцами означают, что бактерии данного рода были также найдены культуральным методом. 4. Определение скорости включения радиоактивномеченных тимидина и лейцина. Для описанного в предыдущем разделе выделения РНК снег растапливали при температуре +4 оС в течение суток. Теоретически такая обработка могла приводить к активации бактерий, которые неактивны на снегу при отрицательных температурах, но способны возобновлять жизнедеятельность при температуре около 0 оС. Чтобы убедиться, что активные бактерии присутствуют в антарктическом снеге in situ, мы провели опыт по включению [метил-3H]тимидина и [3H]лейцина (Таблица 2) для образцов снега с четырех антарктических станций (тимидин включается в состав вновь синтезированных цепей ДНК, а лейцин - в состав белков). 9 Таблица 2. Измерение включения радиоактивно меченных изотопов в образцах снега со станций Дружная, Ленинградская, Мирный и Прогресс, отобранных в 55-й сезон РАЭ. Включение радиоактивно меченых изотопов измерялась in situ, инкубация проводилась в течение 90 мин. Стандартную ошибку рассчитывали по трем повторностям. В таблице представлены значения измерений для контрольных и опытных образцов. Станция Включение тимидина, пмоль/ч×л Включение лейцина, пмоль/ч×л контроль опыт контроль опыт Дружная 0,55 ±0,003 4,4 ±0,03 1,25 ±0,06 33,1 ±1,27 Ленинградская 0,36±0,007 4,6 ±0,09 0,53 ±0,07 20,8 ±2,68 Мирный 3,16 ±0,84 158,1 ±30,25 3,45 ±0,48 365,9 ±51,23 Прогресс 0,45 ±0,09 7,6 ±1,58 1,83 ±0,18 64,9 ±6,99 Включение радиоактивных изотопов варьировало в пределах 4,4 – 158,1 пмоль/ч×л для тимидина, и в пределах 20,8 – 365,9 пмоль/ч×л для лейцина. Уровень включения радиоактивных изотопов на станции Мирный сопоставим с таковым для образцов снега на поверхности льда высокогорного озера в Пиренеях и Альпах (25 пмоль/л×час тимидина, 226 пмоль/л×час лейцина). На станциях Дружная, Ленинградская и Прогресс скорость включения радиоактивно меченых изотопов была в 20-30 раз ниже, чем на станции Мирный. Минимальный уровень активности наблюдался на станции Ленинградская, которая среди четырех рассматриваемых станций имеет самую низкую среднегодовую температуру и самую большую скорость ветров. Однако, даже на Ленинградской уровень включения существенно превышал значения, полученные с образцами снега, отобранного на куполе Антарктиды (0,13 пмоль/л×ч для тимидина и 0,31 пмоль/л×ч для лейцина). Таким образом, нам удалось показать присутствие метаболизирующих бактерий на поверхности антарктического снега in situ. 5. Анализ библиотек фрагментов генов 16S рРНК методом высокопроизводительного секвенирования. Исходное исследование таксономического состава бактерий поверхностного снега в районах двух российских антарктических станций проводилось анализом библиотек клонированных фрагментов генов 16S рРНК. Такой анализ позволяет выявить лишь доминантные группы бактерий. Для более подробного описания таксономического состава микробных сообществ снега библиотеки амплифицированных фрагментов генов 16S рРНК образцов 55-го сезона РАЭ были проанализированы методом высокопроизводительного 10 секвенирования, и список исследованных станций был расширен до четырех: Дружная, Ленинградская, Мирный и Прогресс. Было получено около 50000 последовательностей фрагментов генов 16S рРНК для каждой станции. Сравнивали результаты филогенетического анализа последовательностей генов 16S рРНК из образцов со станций Дружная и Ленинградская, полученных с помощью высокопроизводительного секвенирования, с полученными ранее данными анализа библиотек клонированных фрагментов этих генов. Оба метода давали сходные результаты на уровне классов: коэффициент корреляции представленности таксономических групп, полученных двумя методами для станции Дружная составил 0,99 (p-value < 0,05), для станции Ленинградская – 0,95 (p-value < 0,05). Однако, как видно из сравнения двух первых колонок рисунка 4А и 4Б, анализ методом высокопроизводительного секвенирования привел к увеличению доли малопредставленных классов, таких как Flavobacteriia, Alphaproteobacteria, Sphingobacteriia, Cytophaga, и Actinobacteria, за счет уменьшения доли доминирующих Betaproteobacteria. Далее сравнили таксономический состав бактерий в образцах со станций Дружная, Ленинградская, Мирный и Прогресс по результатам высокопроизводительного секвенирования (Рисунок 4Б). Были найдены последовательности, соответствующие 34-м классам бактерий. Самыми многочисленными классами во всех четырех образцах были: Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Sphingobacteriia, Flavobacteriia, Cytophagia, Actinobacteria, Cyanobacteria и Chloroplast (хлоропласты эукариотических организмов; происходят от цианобактерий и содержат гены 16S рРНК, которые амплифицируются универсальными бактериальными праймерами). В образцах со станций Ленинградская, Дружная и Мирный преобладали Betaproteobacteria (43, 68,5, и 43%, соответственно), а Flavobacteriia были самыми многочисленными (40%) в образце на станции Прогресс. Попарное сравнение таксономического состава бактерий в образце со станции Прогресс с остальными тремя образцами при помощи расчета коэффициента корреляции Пирсона показало значительное отличие микробного разнообразия этой станции от трех других станций (Рисунок 4В). 11 100%! A! В! 90%! 0.4 0.6 0.8 1 Корреляция Мирный 80%! 60%! Ленинградская Дружная 50%! Прогресс 20%! 10%! 0%! Б! Мирный 30%! Ленинградская 40%! Дружная Прогресс 70%! 100% Bacilli Actinobacteria Cyanobacteria Cytophagia Sphingobacteriia Chloroplast Alphaproteobacteria Flavobacteriia Gammaproteobacteria Betaproteobacteria 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Дружная Ленинградская Мирный Прогресс Рисунок 4. Анализ филогенетического разнообразия бактерий в образцах антарктического снега на уровне классов. А. На диаграмме представлена частота встречаемости клонов, содержащих амплифицированные фрагменты генов 16S рРНК классов указанных бактерий в образцах на станциях Дружная и Ленинградская. Б. На диаграмме представлена частота встречаемости последовательностей ДНК, содержащих амплифицированные фрагменты генов 16S рРНК классов указанных бактерий, в образцах на станциях Дружная, Ленинградская, Мирный и Прогресс по результатам высокопроизводительного секвенирования. В. Тепловая карта, демонстрирующая результаты попарного сравнения представленности классов бактерий в образцах из четырех станций, по данным высокопроизводительного секвенирования. Степень сходства оценивали при помощи расчета коэффициента корреляции Пирсона, значение которого показано цветом для каждой из пар сравниваемых образцов. В соответствии с приведенным градиентом цвета, наименьшему значению коэффициента корреляции Пирсона на тепловой карте присваивается желтый цвет, наибольшему – красный. Значение p-value для всех полученных значений коэффициента Пирсона составило менее 0,05. Результаты анализа таксономического состава бактерий на уровне рода представлены на Рисунке 5А. В образцах со станции Дружная самыми многочисленными были последовательности представителей родов Janthinobacterium (27%), Ralstonia (15%) и Pseudomonas (11%), в образцах со 12 станции Ленинградская – Caulobacter (12%), Acinetobacter (10%) и Comamonas (9%). На уровне родов бактерий результаты анализа фрагментов генов 16S рРНК, полученных в ходе высокопродуктивного секвенирования, хорошо коррелировали с результатами, полученными при анализе библиотек клонированных последовательностей. Коэффициент корреляции Пирсона для образцов со станций Дружная и Ленинградская составил 0,8 и 0,9, соответственно (p-values < 0,05). В образце со станции Мирный самыми многочисленными родами бактерий были Ralstonia (31%), Bacilariophyta (24%) и Rudaea (8%), на Прогрессе – Flavobacterium (39%), Hydrogenophaga (14%) и Ralstonia (7%). Все высокопредставленные на поверхности антарктического снега роды микроорганизмов были ранее детектированы в холодных местах обитания. Несмотря на то, что состав бактерий на уровне классов был сходен для образцов со станций Дружная, Ленинградская и Мирный, корреляции на уровне родов между проанализированными образцами не наблюдалось: коэффициент корреляции Пирсона варьировал от 0,1 для Прогресса и Ленинградской до 0,4 для Мирного и Дружной (Рисунок 5Б). A 45 Б 0.2 0.6 1 Корреляция 40 35 Мирный 20 Ленинградская 15 Прогресс 10 5 Ralstonia Flavobacterium Bacillariophyta Janthinobacterium Pseudomonas Acinetobacter Caulobacter Comamonas Sphingomonas Hydrogenophaga Stenotrophomonas Rudaea Arcicella Burkholderia Polaromonas Chryseobacterium Ferruginibacter Methylobacterium GpVI Novosphingobium 0 Дружная Ленинградская Мирный Дружная 25 Ленинградская Мирный Дружная Прогресс 30 Прогресс Рисунок 5. Разнообразие бактерий в образцах антарктического снега на уровне родов. A. На диаграмме представлена частота встречаемости последовательностей фрагментов 16S рРНК, полученных в ходе высокопроизводительного секвенирования (указаны 20 самых многочисленных родов бактерий). Б. Тепловая карта, демонстрирующая попарное сравнение представленности родов бактерий в образцах из четырех станций, согласно данным высокопроизводительного секвенирования. Степень сходства оценивали при помощи расчета коэффициента корреляции Пирсона, значение которого показано цветом для каждой из пар сравниваемых образцов. Значение pvalue для всех полученных значений коэффициента Пирсона составило менее 0,05. 13 Как было описано в первой части данной работы, цианобактерии отсутствовали в библиотеках клонов 16S рРНК в образцах со станций Ленинградская и Дружная, и с трудом детектировались только при амплификации специфическими праймерами. Анализ ДНК образцов методом высокопроизводительного секвенирования также показал почти полное отсутствие таких последовательностей в образцах со станций Ленинградская (0,04%) и Дружная (0,6%). Однако, 24% последовательностей со станции Мирный и 7% со станции Прогресс относились к филуму Cyanobacteria/Chloroplast. Станции Мирный и Прогресс, в которых наблюдается большая доля цианобактериальных и хлоропластных последовательностей, находятся всего в нескольких километрах от открытой поверхности морской воды, в то время как Дружная и Ленинградская, где такие последовательности практически отсутствуют – на расстоянии ~150 км и ~400 км, соответственно. Логично предположить, что источником цианобактериальных и хлоропластных последовательностей на поверхности снега близких к воде станций являются воды Южного океана, где цианобактерии и диатомовые водоросли, содержащие хлоропласты, присутствуют в значительном количестве. 6. Метагеномный анализ таксономического состава сообществ микроорганизмов антарктического снега. Анализ библиотек фрагментов генов 16S рРНК позволяет описать таксономический состав бактерий, но не позволяет получить информацию о других микроорганизмах, находящихся на поверхности снега (эукариотах, вирусах). Для более полного описания таксономического состава антарктических снежных сообществ мы провели метагеномное секвенирование случайных фрагментов ДНК, присутствующих в образцах талого снега, и получили около 500000 последовательностей для каждой из четырех станций. Как видно из Таблицы 3, большинство метагеномных последовательностей принадлежали представителям домена Bacteria, и лишь небольшая доля последовательностей относилась к другим доменам жизни. Это означает, что полученные нами данные по секвенированию амплифицированных библиотек фрагментов генов 16S РНК достаточно полно описывают разнообразие сообществ снежных микроорганизмов. 14 Таблица 3. Результаты таксономического анализа последовательностей случайных фрагментов ДНК, полученных в ходе метагеномного секвенирования. В таблице представлены доли (%) каждой филогенетической группы в четырех образцах поверхностного снега. Станция Bacteria, % Eukaryota, % Viruses, % Archaea, % Дружная 98,29 1,41 0,06 0,10 Ленинградская 99,04 0,77 0,06 0,06 Мирный 84,65 14,97 0,14 0,17 Прогресс 98,38 1,22 0,04 0,31 Коэффициент корреляции Пирсона между соотношениями таксономических групп бактерий, выявленными при анализе метагеномных библиотек и библиотек фрагментов генов 16S РНК для каждой станции составил 0,97-0,99 (p-value<0,05) на уровне классов (мажорные классы представлены на Рисунке 6) и 0,68-0,86 (p-value<0,05) на уровне родов. 100% 90% 80% 70% Actinobacteria 60% Cytophagia 50% Sphingobacteriia Alphaproteobacteria 40% Flavobacteriia 30% Gammaproteobacteria Betaproteobacteria 20% 10% 0% Дружная (16S рРНК) Дружная Ленинградская Ленинградская (метагеном) (16S рРНК) (метагеном) Рисунок 6. Анализ наборов таксономических групп бактерий, полученных при анализе метагеномных библиотек и библиотек фрагментов генов 16S РНК для станций Дружная и Ленинградская. На диаграмме представлена частота встречаемости последовательностей ДНК указанных классов бактерий. Последовательности ДНК эукариот были лучше всего представлены в образце со станции Мирный, где их доля составила 15% (Таблица 9). Большинство из них относилось к диатомовым водорослям Bacilariophyta, что, скорее всего, было связано с выбором места отбора образцов снега – снег на 15 этой станции отбирали непосредственно над морским льдом. Образцы из остальных трех станций содержали около 1% эукариотических последовательностей (Таблица 9). Самыми распространёнными из них были последовательности Streptophita (Растения), Chordata (Хордовые), Arthropoda (Членистоногие), Ascomycota (Аскомицеты) и Аpicomplexa (эндопаразитические простейшие животных), представители которых не являются эндогенными обитателями поверхностного снега Антарктиды. Учитывая гораздо большие (по сравнению с бактериальными) размеры геномов этих эукариот, можно заключить, что примеси чужеродного для антарктических снежных сообществ генетического материала в образцах были минимальны. Помимо прокариотических и эукариотических последовательностей, мы обнаружили около 400 последовательностей ДНК из вирусных геномов. Интересно, что 70% вирусных последовательностей на станции Прогресс и до 50% на станции Дружная принадлежали гигантским эукариотическим вирусам Pandoravirus sp. Остальные вирусные последовательности соответствовали фрагментам геномов хвостатых бактериофагов семейства Caudovirales, которые доминируют в природных экосистемах с преобладанием бактерий. Содержание ДНК последовательностей архей было крайне низким во всех четырех метагеномных библиотеках (менее 0,2%), что согласуется с отсутствием продуктов амплификации фрагментов генов 16S рРНК архей. 7. Анализ функциональных категорий генов в метагеномах поверхностного снега Антарктиды. Для выявления функциональных категорий генов была проведена автоматическая аннотация метагеномных последовательностей с помощью сервиса MG-RAST. Большинство метагеномных последовательностей в образцах включали части открытых рамок считывания (ОРС), кодирующие белки следующих функциональных категорий: «clustering-based subsystems» (14-16%), «carbohydrate metabolism» (9%), «amino acids and derivatives» (8%), «miscellaneous» (8%) и «protein metabolism» (6.5–8.5%). Все перечисленные выше функциональные категории генов доминируют во многих ранее изученных микробных сообществах, включая почвенные, пресные и морские экосистемы. Было проведено сравнение представленности функциональных категорий генов в метагеномах сообществ микроорганизмов антарктического снега с таковыми для метагеномов почв умеренных широт, открытых и прибрежных вод Тихого океана и сообществ микробного мата в Антарктиде. В метагеномах сообществ микроорганизмов антарктического снега оказались статистически значимо перепредставлены 40 функциональных категорий генов. Среди них «probably organic hydroperoxide resistance related hypothetical protein» и «bacterial 16 hemoglobin». Белки устойчивости к органическим пероксидам и белки бактериального гемоглобина участвуют в клеточном ответе на кислородное голодание и окислительный стресс. Перепредставленность указанных генов может отражать адаптацию микроорганизмов полярных снегов к постоянному окислительному стрессу, вызванному жестким ультрафиолетовым излучением. Среди самых многочисленных функциональных категорий генов, перепредставленных в метагеномах микроорганизмов снега, но не кодирующих белки стресс-ответа, оказались гены функциональных категорий «iron acquisition and metabolism», «resistance to antibiotics and toxic compounds», «programmed cell death and toxin-antitoxin systems» и «protein secretion systems». Однако, согласно результатам недавнего комплексного исследования сообществ микроорганизмов нескольких экосистем с помощью метагеномного, метатранскриптомного и метапротеомного подходов, собственно метагеномный анализ обладает наименьшей разрешающей способностью и часто не позволяет делать надежные выводы о наборе характерных функциональных категорий генов в сообществах. Таким образом, для подтверждения результатов анализа функциональных категорий генов, проведенных в нашей работе, потребуются дополнительные исследования. 8. Анализ типов CRISPR-Cas последовательностей в метагеномax антарктических микробных сообществ. CRISPR-Cas – это системы адаптивного иммунитета прокариот, основанные на специфическом узнавании и деградации чужеродного генетического материала короткими РНК. В ходе вирусной инфекции в клетках бактерий происходит отбор коротких чужеродных фрагментов ДНК (протоспейсеров) и встраивание их в повторяющиеся локусы (CRISPRкассеты). Продукты транскрипции спейсеров в комплексе с Cas белками комплементарно связываются с чужеродной ДНК или РНК, что приводит к ее деградации. Кроме комплементарного взаимодействия транскрипта спейсера и протоспейсера мишени для успешного узнавания чужеродной ДНК к протоспейсеру должен примыкать так называемый PAM (protospacer adjacent motif) мотив, последовательность которого различается для CRISPR-Cas систем из различных микроорганизмов. Около 40% геномов бактерий и около 90% геномов архей содержат CRISPR кассеты. Повторы, соответствующие CRISPR-Cas системе одного типа, как правило являются специфичными для одного вида бактерий, тогда как наборы спейсеров часто уникальны для отдельных штаммов одного вида. Таким образом, анализ набора спейсеров в CRISPR кассетах является чувствительным инструментом для выявления отличий между штаммами внутри одного рода или вида для широкого спектра микроорганизмов. 17 Нам удалось найти фрагменты CRISPR-кассет в метагеномах всех четырех станций. Лишь малая часть из найденных нами последовательностей повторов соответствовала повторам в уже известных CRISPR-кассетах, доступных в базе данных GеnBank. Среди CRISPR-кассет с наибольшим числом спейсеров оказались кассеты Flavobacterium psychrophilum с 46-нуклеотидным повтором (CRISPR-Cas система подтипа II-C). Фрагменты кассет, содержавших этот повтор, были найдены в образцах снега, собранного на станциях Прогресс, Дружная и Ленинградская. Кроме того, три спейсера, принадлежащих CRISPRкассетам этого типа, были обнаружены в метагеномных последовательностях сразу двух станций (Дружная и Прогресс), в то время как остальные спейсеры были уникальны для каждой станции. Как указано в предыдущем разделе, Flavobacterium был самым многочисленным родом в образцах со станции Прогресс (40% от всех найденных последовательностей ДНК) и также присутствовали на станциях Дружная (4%), Ленинградская (0,1%) и Мирный (0,1%). 9. Анализ разнообразия спейсеров F. psychrophilum, в трех различных областях Антарктики. Чтобы провести более полное сравнение спейсеров из CRISPR-кассет F. psychrophilum мы разработали новый подход, который позволяет проанализировать разнообразие спейсеров из кассет с одинаковой последовательностью повтора. Была подобрана пара праймеров, частично комплементарных последовательности повтора CRISPR-кассеты F. psychrophilum. Праймеры использовали для амплификации находящихся между повторами спейсеров, с использованием в качестве матрицы ДНК из образцов снега, как показано на Рисунке 7. Рисунок 7. Схема эксперимента по амплификации спeйсеров из CRISPR-кассеты. На рисунке схематически показана CRISPR-кассета, зелеными прямоугольниками изображены повторы, белыми прямоугольниками – спейсеры. Синие стрелки под и над CRISPR-кассетой обозначают места гибридизации праймеров для ПЦР. Черные линии с указанием длины (в нуклеотидах) схематически изображают фрагменты ДНК, которые ожидаются при проведении амплификации с использованием праймеров, специфичных к повторам F. psychrophilum. 18 Продукты амплификации были получены для трех образцов ДНК, со станций Прогресс, Дружная и Ленинградская. Амплифицированные последовательности были секвенированы на платформе Illumina и для каждой станции было получено около 250000-300000 последовательностей спейсеров длиной 30+/-4 п.о. (Таблица 4). Схожие спейсеры (до пяти замен) были объедены в кластеры. В результате кластеризации было получено 8196 уникальных кластеров в трех образцах. Количество кластеров варьировало от 2584 (Дружная) до 3822 (Прогресс, где представленность Flavobacterium в библиотеках фрагментов генов 16S рРНК была самой высокой). Оценки истинного разнообразия кластеров спейсеров (Schao1 и Sace в Таблице 4) в 1,5-2,5 превышали полученные нами количества кластеров для каждой станции, таким образом, разнообразие CRISPR спейсеров F. psychrophilum в образцах было неожиданно высоким. В одной CRISPR-кассете в геноме бактерий в среднем содержится 10-30 спейсеров. Следовательно, в образцах трех станций могут содержатся десятки или даже сотни различных штаммов F. psychrophilum. Таблица 4. Статистические данные по спейсерам F. psychrophilum в образцах из трех антарктических станций. В таблице представлены количества последовательностей спейсеров, кластеров спейсеров, оценки истинного разнообразия кластеров спейсеров и оценки покрытия библиотек кластеров спейсеров, рассчитанные по формуле Гуда. Кластеры спейсеров Станция Число спейсеров % Число уникальных кластеров кластеров Покрытие Cchao1, % Schao1 Sace Дружная 273255 2584 65,6 48 6382 5359 Ленинградская 313241 2759 92,2 43 5824 6477 Прогресс 255447 3822 79,6 60 6271 6332 Результаты сравнения кластеров спейсеров между станциями представлены в виде диаграммы Венна на Рисунке 8. Лишь 58 кластеров были найдены во всех трех библиотеках спейсеров. Доля кластеров, уникальных для каждой станции, варьировала от 66% для станции Дружная, до 92% для станции Ленинградская. Таким образом, набор спейсеров (а следовательно и штаммов) F. psychrophilum в каждой из трех исследованных областей Антарктиды в значительной степени уникален. Попарные пересечения кластеров спейсеров составили от 29% для образцов со станции Дружная и Прогресса, 7% для Дружной и Ленинградской и 3% для Прогресса и Ленинградской. Т.е., станции, расположенные ближе друг к другу (Прогресс и Дружная, расстояние 150 км), обладают более схожим составом популяции 19 внутри вида F. psychrophilum. На уровне родов бактерий мы наблюдали противоположную картину при анализе фрагментов 16S рРНК генов – станция Прогресс была наиболее отличной от других станцией, а сообщества Ленинградской и Дружной были наиболее похожи друг на друга. Рисунок 8. Сравнение набора кластеров спейсеров в образцах со станций Дружная, Прогресс и Ленинградская. Синим, розовым и желтым кругом показаны кластеры спейсеры из станций Прогресс, Ленинградская и Дружная соответственно. Цифры, расположенные ближе к внешним сторонам кругов, показывают количества уникальных кластеров спейсеров для каждой станции; цифры в местах пересечения кругов – количества совпадающих между двумя или тремя выборками кластеров. Скобки показывают удаленность станций друг от друга. Около 1% кластеров, содержали спейсеры, последовательности которых были комплементарны спейсерам из кластеров с большим весом (большим количеством содержащихся в них спейсеров) из того же образца. Наличие комплементарных пар спейсеров в CRISPR кассетах было ранее продемонстрировано в экспериментах по адаптации (встраивании новых спейсеров) в CRISPR-кассету Escherichia coli. Присутствие самокомплементарных спейсеров в наших данных указывает на то, что встраивания новых спейсеров в системах I-E E. coli и II-C F. psychrophilum может протекать по сходному механизму. 10. Сравнительный анализ кластеров спейсеров антарктических F. psychrophilum с последовательностями в общедоступных базах данных. Коллекцию из 8196 уникальных кластеров спейсеров F. psychrophilum, полученных в настоящей работе, сравнили со 117-ю уникальными спейсерами в геномах флавобактерий из базы данных GenBank, изолированных в разное время на территории Европы, однако ни одного соответствия получено не 20 было. Коллекцию кластеров спейсеров F. psychrophilum затем сравнили с опубликованными нуклеотидными последовательностями хромосом, плазмид и вирусов бактерий рода Flavobacterium. Было получено три соответствия в геномах флавофагов, и два соответствия участкам хромосом Flavobacterium. Интересно, что один из кластеров спейсеров соответствовал множественным последовательностям в хромосомах различных флавобактерий: F. indicum, F. psychrophilum, F. columnare и F. branchiophilum. Дополнительный анализ геномного контекста этих необычных протоспейсеров выявил, что они являются частью несовершенных палиндромных некодирующих повторов длиной 125 п.о. Функция этих повторов неизвестна. Они имеют тенденцию располагаться в межгенных областях, и генетическое окружение таких областей часто состоит из генов транспозаз, систем рестрикции-модификации, и систем абортивной инфекции (Рисунок 9А). 125-ти нуклеотидный повтор, найденный в ходе нашего анализа, может участвовать в обеспечении пластичности геномов флавобактерий, а соответствие этого повтора спейсеру CRISPR-Cas системы возможно означает участие CRISPR-Cas в контроле распространения подобных элементов по геномам флавобактерий. Последовательности 117-ти уникальных спейсеров F. psychrophilum из базы данных GenBank сравнили с последовательностями геномов флавофагов и получили 24 соответствия – в несколько раз выше, чем число соответствий известным флавофагам тысяч антарктических спейсеров (см. выше). Этот неожиданный результат можно объяснить тем, что изоляты F. psychrophilum, также как и фаги флавобактерий, последовательности которых находятся в базе данных, были выделены на территории Северного полушария. Выравнивание 24-х протоспейсеров и фланкирующих их восьминуклеотидных последовательностей позволило выявить консервативную последовательность NNATAT на 3’-конце протоспейсера, которая, возможно, является PAM мотивом II-C CRISPR-Cas системы F. psychrophilum (Рисунок 9Б). Консервативного мотива на 5'-конце протоспейсера, так же как и в последовательности самого протоспейсера, выявлено не было. Это согласуется с литературными данными о том, что PAM мотив для CRISPR-Cas систем II типа находится в 3'-фланкирующей области протоспейсера. Протоспейсеры в геномах флавобактерий или флавофагов, соответствующих антарктическим спейсерам (см. выше), такого консервативного мотива не имели. 21 Киназа Эндонуклеаза 305к Метил-трансфераза 310к 315к Транспозаза Киназа 1105к 1110к 1115к Транспозаза Структурный белок профага 1090к 3′ AT G G A G A T T T AC T A C G A G T C C T C A C A T weblogo.berkeley.edu 5’ фланкирующая последовательность C N T T 3′ C 3′ weblogo.berkeley.edu weblogo.berkeley.edu 3’ фланкирующая последовательность Последовательность протоспейсера 2 AA G A TTT C A G G 8 C GA A TT TT C T C C A G C C G 7 6 G 2 0 5′ 1 7 6 5 4 3 2 1 5’ фланкирующая последовательность A T AG 3′ weblogo.berkeley.edu 4 A G 3 A T 8 1 5 1 bits bits GACA G 0 5′ 2 0 5′ TAT A A T A C GT 7 0 5′ 6 8 7 6 5 4 T 5 G 1 4 A TC CT 3 TA 3 A 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 A AA TG T G 1 AT 2 bits bits 1 0 5′ В 1332к 2 2 bits 2 1120к Транспозаза 1085к 1195к Б 320к 2 Транспозаза Эндонуклеаза 8 Транспозаза 1 А 3′ weblogo.berkeley.edu Последовательность протоспейсера 3’ фланкирующая последовательность Рисунок 9. Анализ последовательностей, имеющих соответствие кластерам спейсеров из CRISPR кассет антарктических F. psychrophilum. A. Схема генетического окружения палиндромных некодирующих 125-ти нуклеотидных повторов в геноме F. indicum. Повторы показаны мелкими фиолетовыми стрелками. Гены показаны крупными стрелками. Серым показаны уникальные гены, цветным показаны гены, кодирующие гомологичные белки. Гены, кодирующие белки с биоинформатически предсказанными функциями, обозначены крупной стрелкой с подписью сверху. Б. Предполагаемая последовательность PAM мотива CRISPR-Cas системы F. psychrophilum из базы данных GenBank. Лого получено с помощью выравнивания 24-х обнаруженных в геномах флавофагов протоспейсеров и прилегающих к ним с 5'- и 3'-концов восьминуклеотидных последовательностей. В. Предполагаемая последовательность PAM мотива CRISPR-Cas системы антарктических F. psychrophilum. Лого получено с помощью выравнивания 435-ти обнаруженных в антарктических метагеномах протоспейсеров и прилегающих к ним с 5'- и 3'-концов восьминуклеотидных последовательностей. Мы также сравнили набор кластеров спейсеров с метагеномными последовательностями, полученными в настоящем исследовании (всего ~800000 последовательностей), и метагеномными последовательностями из образцов умеренных экосистем, которые собраны в «env_nt» базе данных GenBank (порядка 20 млн. последовательностей). В ходе анализа было получено 435 соответствий с антарктическими метагеномными последовательностями, и всего 247 соответствий с последовательностями из 22 базы данных «env_nt». По-видимому, полученный результат означает, что CRISPR-Cas система антарктических флавобактерий обеспечивает защиту бактериальных клеток от эндемичных антарктических вирусов или плазмид, последовательности геномов которых пока еще не определены. Выравнивание протоспейсеров и фланкирующих их восьминуклетодиных последовательностей позволило выявить консервативную последовательность NNAAAG на 3’-конце протоспейсера (Рисунок 9В). Консервативного мотива на 5'-конце протоспейсера и в последовательности самого протоспейсера выявлено не было. Интересно, что позиции консервативных нуклеотидов соответствовали таковым для протоспейсеров, выявленных в ходе сравнения спейсеров F. psychrophilum Северного полушария с последовательностями флавофагов (см. выше), однако сама последовательность консервативных нуклеотидов отличалась. Протоспейсеры, находящиеся на последовательностях из базы данных «env_nt», консервативного мотива на фланкирующих участках не имели. ВЫВОДЫ 1. Анализом последовательностей фрагментов генов 16S рРНК определён состав микробных сообществ в образцах поверхностного снега в районе четырех антарктических станций. Установлено, что наиболее многочисленными являются представители классов Betaproteobacteria, Alphaproteobacteria и Gammaproteobacteria. Показано, что таксономический состав бактерий, находящихся на поверхности снега, заметно отличается в образцах из удаленных друг от друга областей Антарктиды, и изменяется со временем. 2. Впервые показано, что таксономический состав антарктических бактерий поверхностного снега, определенный по представленности их 16S рРНК и соответствующих им генов, существенно разнится. 3. Впервые для микроорганизмов антарктического снега проведено масштабное метагеномное секвенирование. Выявлены функциональные категории генов, статистически значимо перепредставленные в сообществах микроорганизмов поверхностного снега Антарктиды, среди них – гены, кодирующие белки клеточного ответа на окислительный стресс, и гены устойчивости к тяжелым металлам. 4. Продемонстрировано значительное разнообразие спейсеров CRISPR кассет антарктических бактерий на примере Flavobacterium psychrophilum. Показано, что наборы спейсеров (вариабельных участков кассет) в штаммах F. psychrophilum из географически удаленных областей Антарктиды существенно отличаются друг от друга. 23 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в научных журналах: 1. Lopatina A, Krylenkov V, Severinov K. Activity and bacterial diversity of snow around Russian Antarctic stations. // Research in Microbiology. – 2013. – T. 164. – № 9. – C. 949-958. 2. Пугач КС, Лопатина АВ, Северинов КВ. CRISPR системы адаптивного иммунитета прокариот. // Молекулярная Биология. – 2012. – T. 46. – № 2. – C. 175–182. Материалы конференций: 1. Lopatina AV, Popova AV, Krylenkov VA, Severinov KV. Changes in bacterial community composition of surface snow around three sampling sites in East Antarctica. // CAREX conference on life in extreme environments. Dublin, Ireland, 2011, P. 84. 2. Лопатина АВ, Крыленков ВА, Северинов КВ. Разнообразие бактерий поверхностного снега Восточной Антарктиды. // Конференция по созданию российской программы Международного полярного десятилетия. Сочи, Россия, 2010, С. 93. 3. Lopatina AV, Krylenkov VA, Severinov KV. Bacterial diversity of surface snow around three different points in East Antarctica. // SCAR 4th Open Science Conference. Buenos-Aires, Argentina, 2010, P. 45. 24
