Оценка конкуренции кислорода и медиатора электронного

Известия Тульского государственного университета
Естественные науки. 2013. Вып. 3. С. 235–243
Химия
УДК 543.553.8
Оценка конкуренции кислорода и медиатора
электронного транспорта в условиях работы
микробного топливного элемента на основе
бактерий Gluconobacter oxydans ∗
С. В. Алферов, П. Р. Минайчева, В. Т. Нгуен, В. А. Алферов
Аннотация.
Экспериментально
определены
скорости
восстановления
2,6-дихлорфенолиндофенола
(2,6-ДХФИФ)
бактериями Gluconobacter oxydans в окислительной среде и в
атмосфере азота в условиях работы микробного топливного элемента
(МТЭ), которые составили 0,34 и 0,40 мкМ/лс соответственно.
Показано, что зависимость изменения концентрации кислорода в
анодном отделении МТЭ от времени имеет линейный характер,
что говорит о нулевом порядке реакции. Определены скорости
восстановления кислорода и показано, что присутствие 2,6-ДХФИФ
в растворе практически не влияет на скорость восстановления
кислорода.
Ключевые слова: микробный топливный элемент, уксуснокислые
бактерии, восстановление кислорода.
Введение
В последнее десятилетие интенсивно исследуются биотехнологические
аспекты генерирования энергии, в том числе технологии создания
микробных топливных элементов (МТЭ) как способ генерации
электричества или водорода из возобновляемых источников без эмиссии
углекислого газа в экосистему. Микробные топливные элементы также
могут быть использованы для очистки сточных вод за счет способности
применяемых биокатализаторов окислять широкий спектр органических
веществ. В качестве биокатализаторов могут выступать ферменты или
микроорганизмы [1]. Использование последних более предпочтительно,
т.к. в этом случае не требуются сложные и дорогостоящие процессы
выделения, очистки и хранения ферментов. Одними из перспективных
микроорганизмов, на основе которых возможно создание МТЭ, являются
*
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 13-03-97514) и в
рамках Государственного задания 4412ГЗ.
236
С. В. Алферов, П. Р. Минайчева, В. Т. Нгуен, В. А. Алферов
уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans. Способность Gluconobacter
окислять широкий спектр органических соединений с низким выходом роста
и накоплением в среде продуктов окисления привела к их применению
в биотехнологии в производстве аскорбиновой и уксусной кислоты
[2,3], для асимметричного окисления различных субстратов [4], а также
создание на их основе биосенсоров [5] и топливных элементов [6]. Для
облегчения процесса передачи электронов от мембранно-локализованных
ферментов бактерий на анод топливного элемента применяются медиаторы
электронного транспорта – низкомолекулярные соединения, которые могут
проникать через внешнюю мембрану бактерий, получать электроны у
мембранно-локализованных ферментов и окисляться на аноде. В качестве
медиаторов электронного транспорта для Gluconobacter oxydans в МТЭ
использовались различные органические и неорганические соединения,
среди них 2,6-дихлорфенолиндофенол (2,6-ДХФИФ) оказался одним из
наиболее эффективных [7].
Анализ литературы показывает, что большинство исследований
по МТЭ до сих пор посвящено в основном прикладным аспектам
технологии, т.е. подбору оптимальных условий и разработке конструкций
для достижения максимальных энергетических характеристик. При
этом фундаментальные вопросы по особенностям механизмов работы
МТЭ, в том числе кинетические аспекты процессов переноса зарядов в
системе «субстрат – биокатализатор – медиатор – электрод» не были
систематически исследованы. Понимание таких механизмов позволит
создавать системы с высокими электрическими характеристиками. Таким
образом, исследование кинетических аспектов передачи электронов в
анодном отделении МТЭ представляется актуальной задачей в области
биотехнологии альтернативных источников энергии.
Известно, что для аэробных бактерий G. oxydans, кислород является
естественным конечным акцептором электронов, поэтому в присутствии
искусственного акцептора электронов в анодном пространстве может
наблюдаться конкуренция между ними [2].
Целью данной работы являлось выявление особенностей конкуренции
между кислородом и медиатором электронного транспорта 2,6дихлорфенолиндофенолом в условиях работы микробного топливного
элемента.
Материалы и методы
Все используемые в работе реактивы имели степень чистоты х.ч. или
ч.д.а. (Sigma (США), Merck (Германия), Диа-М (Россия)).
Культивирование бактериальных клеток G. oxydans. В работе
использовали бактерии G. oxydans subsp. industrius (ВКМ B-1280)
из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии
и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино.
Оценка конкуренции кислорода и медиатора электронного транспорта
237
Культивирование бактерий проводили на питательной среде следующего
состава: D-сорбит — 200 г/л; дрожжевой экстракт — 20 г/л; объем среды
100 мл, pH среды 5,2–5,5, при температуре 28◦ С в течение 18 ч. Клетки
собирали центрифугированием на центрифуге Avanti J-30I («Beckman
Coulter, Inc», США) при 12000 об/мин 10 мин. и отмывали двукратно 20
мМ натрий-фосфатным буферным раствором с рН 6,0. Осевшие клетки
ресуспендировали в новой порции буферного раствора и центрифугировали
на центрифуге Eppendorf 5417 C/R («Eppendorf», Германия) 10 мин при
12000 об/мин. Полученные осадки в микропробирках подсушивали на
воздухе, для каждой серии опытов в качестве биокатилизатора использовали
новую порцию клеток разбавленных 30 мМ натрий-фосфатного буфера (рН
6,0) в соотношении 1:3 (мг сырого веса/мкл).
Спектрофотометрическое определение скорости восстановления
2,6-дихлорфенолиндофенола. Скорости восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола целыми клетками бактерий определяли спектрофотометрически по модифицированному методу [8]. Концентрация медиатора в
кювете составляла 30 мкМ. Длина волны 600 нм. В измерительную
кювету и кювету сравнения с буферным раствором (рН = 6, 0) добавляли
раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола и биомассу бактерий G. oxydans
(150 мг/мл), тщательно перемешивали. В кювету сравнения вносили
раствор дитионита натрия (концентрация в кювете 1%) для полного
восстановления медиатора. В измерительную кювету вносили раствор
окисляемого субстрата до конечной концентрации 50мМ, снова тщательно
перемешивали и регистрировали изменение оптической плотности раствора
в кинетическом режиме спектрофотометра при заданной длине волны.
Для создания бескислородных условий перед началом реакции растворы
продували азотом в течение 20 мин, реакцию запускали субстратом.
Угол наклона линейного участка кинетических кривых использовали как
критерий скорости протекания процесса.
Подготовка
ячейки
микробного
топливного
элемента.
Основой модели микробного топливного является двухкамерная ячейка.
Объём анодного отделения был равен объему катодного и составлял
5 мл. Электродами служили графитовые стержни диаметром 8 мм.
Глубина погружения электродов в раствор — 10 мм. Связь кювет
осуществлялась через отверстие в стенке диаметром 6 мм. Камеры
разделяли протонно-обменной мембраной МФ-4СК («Пластполимер»,
Санкт-Петербург, Россия), являющейся аналогом мембраны «Nafion-117» в
протонированной форме.
Определение концентрации кислорода в анолите МТЭ. В
анолит МТЭ добавляли 30 мкл суспензии клеток Goxydans (0,33 мг сырого
веса/мкл), 30 мкл этанола (концентрация 1 М). Концентрацию кислорода
в растворе измеряли кислородомером «Эксперт 001» (Эконикс-Эксперт,
238
С. В. Алферов, П. Р. Минайчева, В. Т. Нгуен, В. А. Алферов
Россия) в кинетическом режиме при постоянном перемешивании раствора
магнитной мешалкой (400 об/мин).
Для оценки возможного влияния 2,6-ДХФИФ на скорость потребления
кислорода в анолит кроме вышеупомянутых компонентов добавляли 30
мкл раствора 2,6-ДХФИФ (концентрация 1мг/мл) и аналогично проводили
измерение концентрации кислорода в растворе.
Результаты и обсуждение
Для аэробных бактерий, таких как G.oxydans, кислород является
естественным конечным акцептором электронов и может конкурировать с
медиатором при получении электронов от бактерий.
Для выявления конкуренции между естественным акцептором
электронов — кислородом и искусственными акцепторами электронов
проводили исследование зависимости скорости восстановления ДХФИФ
бактериями G. oxydans спектрофотометрическим методом в атмосфере азота
и в атмосфере воздуха. По истечении первой минуты инкубации бактерий
в присутствии субстрата скорость восстановления ДХФИФ в атмосфере
воздуха становится равной скорости его восстановления в атмосфере азота
(рис. 1).
Рис. 1. Кинетические зависимости восстановления ДХФИФ бактериями
G. oxydans в атмосфере азота (¥) и в атомосфере воздуха (◮) (ДХФИФ —
30 мкМ)
По-видимому, интенсивное дыхание уксуснокислых бактерий в
присутствии избытка субстрата биоокисления приводит к уменьшению
содержания кислорода в кювете в течение короткого времени. Несмотря
на то, что искусственный акцептор электронов способен конкурировать
с кислородом за электроны дыхательной цепи бактерий, скорость
Оценка конкуренции кислорода и медиатора электронного транспорта
239
восстановления медиатора после первой минуты инкубации в обеих системах
становится одинаковой, что может свидетельствовать об отсутствии
заметной конкуренции между двумя акцепторами электронов.
По полученным экспериментальным кинетическим кривым были
определены скорости реакции восстановления ДХФИФ в атмосфере азота и
в атмосфере воздуха.
Скорости восстановления медиатора рассчитывали по формуле:
v=
∆c
∆D
tg α
=
=
,
∆τ
∆τ · ε · L
ε·l
(1)
где v — скорость реакции восстановления красителя (моль/лс), C —
концентрация красителя(моль/л), D — оптическая плотность, τ — время
(с), ε — молярный коэффициент экстинкции (М·см)−1 , l — толщина кюветы
(см).
Рассчитанные значения скоростей восстановления медиатора ДХФИФ
в атмосфере азота и в атмосфере воздуха оказались равны 0,4 и
0,34 мкмоль/лс соответственно.
Для определения скорости восстановления кислорода бактериями G. oxydans с помощью термооксиметра «Эксперт-001» измеряли концентрацию
кислорода в системе, содержащей этанол, суспензию бактерий G. оxydans
в случаях отсутствия и присутствия ДХФИФ, результаты представлены на
рис. 2.
Рис. 2. Кинетика расходования кислорода в случаях присутствия
и отсутствия медиатора при разомкнутой внешней цепи биотопливного
элемента
Можно заметить, что после 10 минут инкубирования содержание
кислорода в растворе практически падает до нуля, т.е. диффузия
кислорода из воздуха в раствор происходит недостаточно быстро, чтобы
компенсировать расходование растворенного кислорода в результате
окислительной активности бактерий по отношению к этанолу.
240
С. В. Алферов, П. Р. Минайчева, В. Т. Нгуен, В. А. Алферов
Линейная зависимость измененния концентрации кислорода от времени
свидетельствует о том, что порядок реакции нулевой. Аппроксимация
экспериментальных зависимостей в данном интервале уравнением линейной
зависимости (приведено на рис. 3) позволяет определить константу скорости,
которая в этом случае равна скорости восстановления кислорода.
Рис. 3. Кинетика потребления кислорода в анодном отделении БТЭ
в режиме разомкнутой цепи, А — без ДХФИФ, В — в присутствии ДХФИФ
По тангенсу угла наклона прямых были определены скорости
восстановления кислорода в случаях отсутствия и присутствия ДХФИФ:
0, 59 · 1000 мкмоль
мкмоль
мг
=
= 0, 31
,
vO (безДХФИФ) = 0, 5928
л · мин
32 · 60 л · с
л ·с
мг
0, 62 · 1000 мкмоль
мкмоль
=
= 0, 32
.
vO (сДХФИФ) = 0, 62
л · мин
32 · 60 л · с
л ·с
Далее были определены относительные значения скорости восстановления
кислорода, нормированные на единицу биомассы бактериальных клеток, в
объеме 2 мл растворе, как и в расчете скорости восстановления ДХФИФ:
v (безДХФИФ) · М
мкмоль
= 0, 38
,
mклеток
с·г
мкмоль
v (сДХФИФ) · М
= 0, 40
.
vO2 (сДХФИФ) =
mклеток
с·г
vO2 (безДХФИФ) =
Можно видеть, что присутствие ДХФИФ в растворе практически не
влияет на скорость восстановления кислорода.
Если учесть, что при своем восстановлении молекула кислорода
принимает 4 электрона, а молекула ДХФИФ –– 2, то скорость восстановления
кислорода и ДХФИФ составляет 2 и 1,6 мкмоль электронов · с −1 · г −1
соответственно. Таким образом, полученные скорости восстановления
медиатора и расходования кислорода в анодном отделении БТЭ получились
практически одинаковыми, что доказывает отсутствие необходимости
искусственно создавать анаэробные условия, как это принято в других
моделях биотопливных элементов [8,9].
В литературе известны подобные случаи для других видов бактерий
и медиаторов, как видно из табл. 1. В таблице представлены скорости
восстановления кислорода, тионина, метиленового синего различными
Оценка конкуренции кислорода и медиатора электронного транспорта
241
микроорганизмами с учетом количества перенесенных электронов для одной
молекулы окислителя. Субстратом являлась глюкоза или мальтоза [10].
Таблица 1
Скорости восстановления (v) кислорода и медиаторов (мкмоль · c−1 · г −1 ) с
учетом числа перенесенных электронов для каждого вида окислителя [11]
Микроорганизм
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa
vO2
7,04
2,20
2,96
4,12
vтионин
7,30
18,0
14,2
3,08
vметилен.синий
8,32
3,82
3,40
—
Можно отметить, что природа медиатора весьма существенно влияет на
скорость его восстановления различными микроорганизмами.
Ранее было установлено, что гомогенизат клеток G. oxydans, полученный
после ультразвуковой обработки бактериальных клеток, обладает
удельной активностью по этанолу 2,78 Е/мг, что соответствует скорости
восстановления этанола 46,3 мкмоль · г −1 · c−1 [10]. Даже если предположить,
что целые клетки обладают удельной активностью в 10 раз меньшей, чем
гомогенизат клеток, т.е. 4,6 мкмоль · г −1 · c−1 , то такая величина значительно
выше, чем суммарная скорость восстановления ДХФИФ и кислорода. Таким
образом, отсутствие видимой конкуренции между ДХФИФ и кислородом
можно объяснить присутствием избытка биокатализатора в условиях
эксперимента и тем фактом, что весь присутствующий в системе кислород
полностью расходуется за 10 мин. (см. рис. 2).
Заключение
Таким образом, в ходе работы определены скорости восстановления
медиатора бактериями G. oxydans и скорости расходования кислорода
в системе биотопливного элемента в случаях отсутствия и присутствия
медиатора электронного транспорта 2,6-дихлорфенолиндофенола. Показано
отсутствие заметной конкуренции между 2,6-ДХФИФ и кислородом, что
можно объяснить присутствием избытка биокатализатора в условиях
эксперимента в результате чего весь присутствующий в системе
кислород полностью расходуется за первые 10 мин. Полученные данные,
свидетельствуют о том, что при использовании уксуснокислых бактерий
G. oxydans в качестве биокатализаторов в анодном отделении микробного
топливного элемента нет необходимости искусственно создавать анаэробные
условия, как это принято в других моделях МТЭ, что позволяет существенно
снизить затраты при конструировании микробных топливных элементов.
Данный аспект имеет большое практическое значение при разработке
энергоэффективных систем очистки сточных вод биотехнологических
предприятий.
242
С. В. Алферов, П. Р. Минайчева, В. Т. Нгуен, В. А. Алферов
Список литературы
1. Lapinsonniere L., Picot M., Barriere F. Enzymatic versus microbial bio-catalyzed
electrodes in bio-electrochemical systems // Chem.Sus.Chem. 2012. № 5.
P. 995–1005.
2. Gluconobacter oxydans : its biotechnological applications / A. Gupta [et al.] // J.
of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2001. № 3. P. 445–456.
3. Macauley S., McNeil B., Harvey L.M. The genus Gluconobacter and its applications
in biotechnology. Critical Reviews // Biotechnology. 2001. № 21. P. 1–25.
4. Gao L., Wei D.Z. Asymmetric oxidation by Gluconobacter oxydans // Applied
Microbiology and Biotechnology. 2006. V. 70. P. 135–139.
5. Tkac J., Stefuca V., Gemeiner P. Biosensors with immobilised microbial cells
using amperometric and thermal detection principles // Focus on Biotechnology,
applications of cell immobilisation biotechnology. 2005. V. 8. P. 549–566.
6. Иммобилизация бактерий Gluconobacter oxydans на аноде биотопливного
элемента / П.Р. Минайчева [и др.] // Вода: химия и экология. 2013. № 2.
C. 44–51.
7. Bioelectrocatalytic oxidation of glucose by immobilized bacteria Gluconobacter oxydans . Evaluation of water-insoluble mediator efficiency / E Babkina [et al.] //
Electroanalysis. 2006. № 18. P. 2023–2029.
8. Bradley R., Ray R.R., Little B. A miniature microbial fuel cell operating with an
aerobic anode chamber // J. of power sources. 2007. № 165. Р. 591–597.
9. Use of a coculture to enable current production by Geobacter sulfurreducens /Qu.
Youpeng [et al.] // Applied and environmental microbiology. 2012. V. 78. № 9.
P. 3484–3487.
10. Electron-transfer coupling in microbial fuel cells: 1. Comparison of redox-mediator
reduction rates and respiratory rates of bacteria / S.D. Roller [et al.] // Journal of
Chemical Technology and Biotechnology. 1984. V. 1, № 34. P. 3–12.
11. Purification and characterization of alcohol dehydrogenase from Gluconobacter
suboxydans / M. Islami [et al.] // International J. of Biological Sciences. 2008.
P. 208–213.
Алферов Сергей Валерьевич (s.v.alferov@gmail.com), к.х.н., доцент,
кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.
Минайчева Полина Романовна (polina.minaycheva@gmail.com), аспирант,
кафедра химии, Тульский государственный университет.
Нгуен Винь Тиен (tiencoc@yahoo.com), аспирант, кафедра химии,
Тульский государственный университет.
Алферов Валерий Анатольевич (chem@tsu.tula.ru), к.х.н., зав.
кафедрой, кафедра химии, декан, естественнонаучный факультет, Тульский
государственный университет.
Оценка конкуренции кислорода и медиатора электронного транспорта
243
Competition assessment of oxygen and mediator of electron
transport in the working conditions microbial fuel cell based
on the bacteria Gluconobacter oxydans
S. V. Alferov, P. R. Minaycheva, V. T. Nguen, V. A. Alferov
Abstract. Oxygen reduction rate were determined experimentally in a system
comprising a bacterial suspension Gluconobacter oxydans, ethanol, in the cases
of absence and presence of the electron transport mediator of 2,6-dichlorophenol
(2,6-DCPIP) in working conditions of the microbial fuel cell (MFC). It is shown
that the dependence of the oxygen concentration versus time in the anode
compartment MFC is linear, indicating that the zero order reaction. The rates of
oxygen reduction and show that the presence of 2,6-DCPIP in solution does not
affect the rate of recovery of oxygen.
Keywords: microbial fuel cell, acetobacter, oxygen reduction.
Alferov Sergey (s.v.alferov@gmail.com), candidate of chemical sciences, associate professor, department of biotechnology, Tula State University.
Minaycheva Polina (polina.minaycheva@gmail.com), postgraduate student,
department of chemistry, Tula State University.
Nguen Vin Tien (tiencoc@yahoo.com), postgraduate student, department of
chemistry, Tula State University.
Alferov Valeriy (chem@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, head of
the department, department of chemistry, dean, faculty of natural sciences, Tula
State University.
Поступила 12.09.2013