Структурно-химическая характеристика физиологически
advertisement
На правах рукописи Головченко Виктория Владимировна Структурно-химическая характеристика физиологически активных пектиновых полисахаридов 02.00.10 – Биоорганическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Сыктывкар - 2013 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Научный консультант: академик РАН, доктор химических наук Оводов Ю. С. Официальные оппоненты: Миронов В.Ф. член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор ФГБУН Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова РАН, заведующий лабораторией Усов А.И. доктор химических наук, профессор ФГБУН Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, заведующий лабораторией Звягинцева Т.Н. доктор химических наук, профессор ФГБУН Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, заведующая лабораторией Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии Уфимского научного центра РАН Защита состоится 15 мая 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru Автореферат разослан «__» __________2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Черников О.В. 3 Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Целлюлоза, гемицеллюлозы, пектиновые полисахариды являются главными компонентами растительной клеточной стенки. Пектиновые полисахариды совместно с гемицеллюлозами образуют матрицу, в которую встроены микрофибриллы целлюлозы. Взаимодействие между полисахаридами обеспечивает не только устойчивые, но и динамичные, гибкие свойства клеточной стенки (Carpita & Gibeaut, 1993; Горшкова, 2007). Среди полисахаридов клеточных стенок высших растений пектиновые вещества (пектиновые полисахариды, пектины) являются на сегодняшний день наиболее сложными и интересными с точки зрения структурной организации и функциональной активности. Пектиновые полисахариды выполняют разнообразные биологические функции в растениях (Горшкова, 2007) и обладают разноплановой физиологической активностью (Попов, 2010). Сложная структура пектиновых полисахаридов и наличие большого числа генов в растениях, регулирующих их синтез, свидетельствуют о способности пектинов выполнять разнообразные функции в различные периоды роста и развития растений (Caffall & Mohnen, 2009). Пектиновые полисахариды участвуют в процессе прорастания семян и росте проростков, поддерживают тургор растений, обеспечивают в них водно-солевой обмен, определяют устойчивость растений к засухе и низким температурам, обусловливают резистентность растительной клетки к действию фитопатогенов (Гапоненков и Проценко, 1962; Оводов, 1998; Горшкова, 2007). В составе пектинов обнаружены такие структурные элементы, как линейный галактуронан (HG), разветвленные ксилогалактуронан, апиогалактуронан, рамногалактуронан-I (RG-I) и рамногалактуронан-II (RG-II) (Ridley еt al., 2001; Yapo, 2011). Несмотря на значительные успехи в области структурных исследований полисахаридов, сложность построения и нерегулярный характер углеводных цепей пектиновых макромолекул не позволяют считать их структуру установленной. На сегодняшний день не выяснено, являются ли галактаны, арабинаны и арабино-галактаны отдельными молекулами, сопутствующими пектиновым веществам, или они ковалентно связаны с пектинами. Кроме того, представления о блочном характере углеводных цепей пектинов и наличии ковалентной связи между структурными элементами в их макромолекулах основаны лишь на косвенных доказательствах и требуют подтверждения. Поэтому в настоящее время нет общепринятой модели строения пектиновых макромолекул (Vincken еt al., 2003). Более того, есть все основания полагать, что не все структурные элементы пектинов установлены и, несомненно, поиск пектинов со строением углеводных цепей, отличных от уже известных, представляет значительный интерес. Недостаточно охарактеризовано влияние климатических и экологических условий произрастания растений на биосинтез пектинов в клетке. Выявление факторов, влияющих на биосинтез пектинов и на их 4 модификацию, необходимо для определения роли пектинов в онтогенезе растений и, поскольку пектины являются физиологически активными биополимерами, взаимосвязи их структуры и физиологической активности. Являясь одним из главных компонентов клеточных стенок растений, пектиновые полисахариды входят в состав пищевых волокон (ПВ), составляющих значительную часть растительного пищевого рациона человека. Пектины поступают в организм человека как в составе овощей и фруктов, так и в виде функциональных пищевых ингредиентов и биологически активных пищевых добавок (БАД). Суточная норма потребления пектинов составляет 5 грамм (Pilnik, 1990). Пектины характеризуются многоплановой физиологической активностью и способствуют выведению из организма животных и человека токсинов, солей тяжелых металлов, радионуклидов, обладают иммуномодулирующим и противовоспалительным действием (Попов, 2010). В основе биологической и физиологической активности пектиновых полисахаридов лежит структурная организация их макромолекул. На сегодняшний день установлена структура пектинов ряда овощей и фруктов. Однако спектр употребляемых в пищу растений гораздо шире, а условия экстракции пектиновых полисахаридов, применяемые для их выделения, значительно отличаются от условий переваривания в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) человека. Более того, структура пектиновых полисахаридов может модифицироваться под действием ряда веществ, секретируемых в ЖКТ. Существенное влияние на структуру пектинов могут оказывать различные факторы: рН, ионная сила, активность ферментов. Сведения об экстракции пектинов из ПВ в условиях гастральной среды и их модификации в процессе пищеварения крайне важны при выявлении структурных элементов, определяющих физиологическую активность пектиновых полисахаридов. Таким образом, исследование структуры пектинов и ее модификации становится актуальной междисциплинарной задачей, лежащей на стыке биоорганической химии, биохимии и физиологии. Много вопросов, связанных со структурой пектиновых полисахаридов, определяющей функции этих биополимеров в растениях и их физиологическое действие на организм, остаются нерешенными и обусловливают то повышенное внимание, которое уделяется учеными разных специальностей и направлений всестороннему изучению пектиновых полисахаридов. Цель исследования – структурно-химическое исследование физиологически активных пектиновых полисахаридов и выявление факторов, влияющих на их структуру. Задачи исследования: 1. Провести скрининг растений европейского Севера России и Монголии на содержание в них пектиновых полисахаридов с целью выявления новых структурных элементов макромолекул пектинов. 5 2. Провести структурно-химические исследования пектиновых полисахаридов, отличающихся наличием в углеводных цепях значительных участков RG-I, высоким содержанием остатков нейтральных моносахаридов, высокой вязкостью водных растворов и выраженной физиологической активностью. 3. Сравнить пектиновые полисахариды растений, принадлежащих к одному виду, но произрастающих в различных природно-климатических условиях: засушливых резко континентальных и влажных умеренно континентальных, с целью определения влияния систематического недостатка влаги на структуру синтезируемых ими пектиновых полисахаридов. 4. Оценить воздействие техногенных загрязнений на структуру пектиновых полисахаридов клеточных стенок ряски. 5. Провести структурно-химические исследования пектиновых полисахаридов, экстрагируемых из овощей и фруктов в гастральной среде. 6. Установить влияние гастральной среды на структуру пектиновых полисахаридов. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Галактуронан комарумана, пектина сабельника болотного Comarum palustre L., содержит линейные и разветвленные участки с 2,4-, 3,4- и 2,3,4-замещенными остатками галактуроновой кислоты в качестве точек разветвлений. 2. В растениях одного вида, а также в растениях разных видов одного рода, независимо от климатических условий их произрастания, синтезируются близкие по моносахаридному составу полисахариды. 3. Систематический недостаток влаги вызывает снижение биосинтеза пектиновых полисахаридов в клеточных стенках растений, не оказывая влияния на их моносахаридный состав. 4. В клеточных стенках ряски малой Lemna minor L. и ряски горбатой L. gibba L. под влиянием техногенных загрязнений изменяется синтез пектинов, в результате чего снижается содержание апиогалактуронана и увеличивается содержание ксилогалактуронана. 5. В условиях гастральной среды из клеточных стенок растений экстрагируются растворимые пектины и частично пектины протопектинового комплекса. Углеводные цепи пектиновых полисахаридов при этом подвергаются деструкции, степень которой определяется структурными особенностями их макромолекул и повышается с увеличением длительности воздействия гастральной среды. 6. В условиях гастральной среды из клеточных стенок растений совместно с пектиновыми полисахаридами экстрагируется белок, частично связанный с пектиновыми макромолекулами. Научная новизна. В составе углеводных цепей пектиновых макромолекул обнаружены фрагменты разветвленного галактуронана, в котором главная и боковые углеводные цепи имеют аналогичное строение 6 и представлены остатками 1,4-связанной -D-галактопиранозилуроновой кислоты; боковые цепи присоединены к остаткам галактуроновой кислоты главной углеводной цепи галактуронана в С2- или С3-положение, при этом небольшое число боковых цепей присоединяется одновременно в С2- и С3-положения. Впервые охарактеризованы пектиновые полисахариды растений, произрастающих в условиях влажного умеренно континентального климата европейского Севера России и сухого резко континентального климата Монголии. Установлено, что в них синтезируются пектиновые полисахариды, имеющие традиционную для пектинов структуру с преимущественным содержанием 1,4--D-галактуронана, часть остатков галактуроновой кислоты в котором метилэтерифицирована, и с разветвленной областью, представленной RG-I с боковыми цепями, образованными остатками галактозы и арабинозы. Продемонстрировано сходство моносахаридного состава пектиновых полисахаридов растений, принадлежащих к одному роду и произрастающих в различных природно-климатических условиях, и показано, что систематический недостаток влаги вызывает снижение содержания пектиновых полисахаридов в клеточных стенках растений, не оказывая влияния на их структуру. В условиях гастральной среды из овощей и фруктов экстрагируются растворимые пектиновые полисахариды и пектины протопектинового комплекса совместно с белком, часть которого связана с пектиновыми макромолекулами. Выявлено, что в условиях гастральной среды пектиновые полисахариды подвергаются деструкции, степень которой зависит от строения их углеводных цепей и времени обработки. Наименьшей деструкции подвергаются пектины, включающие значительные участки галактуронана. Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования дополняют и расширяют знания о структуре и биосинтезе пектиновых полисахаридов. Показано, что углеводная цепь галактуронана может иметь как линейный, так и разветвленный характер. Способность ряски малой L. minor L. и ряски горбатой L. gibba L. реагировать на техногенные загрязнения окружающей среды изменением моносахаридного состава пектиновых полисахаридов позволяет рекомендовать ряску как индикатор чистоты водоемов и прилежащих к ним территорий. Расширены представления о модификации структуры пектиновых полисахаридов в процессе пищеварения. Полученные данные, свидетельствующие о деструкции углеводных цепей пектинов в условиях гастральной среды, должны учитываться при выявлении структурных элементов пектиновых макромолекул, определяющих их физиологическую активность. 7 Проведенный обширный скрининг пектинов в растениях существенно дополняет сведения о растительных ресурсах Республики Коми и Монголии, что повышает потенциал их рационального использования в интересах человека. Разработаны технологии получения из растительного сырья иммуностимулирующих и противовоспалительных полисахаридных препаратов. Полученные данные о пектиновых полисахаридах дают возможность использования их в пищевой промышленности и для создания на их основе новых лечебных и профилактических препаратов для медицины и ветеринарии. Апробация работы. Результаты исследований были представлены автором лично в виде устных и стендовых сообщений на Всероссийском совещании «Лесохимия и органический синтез» (г. Сыктывкар, 1996; 1998); 11-м Европейском симпозиуме по углеводам (г. Лиссабон, Португалия, 2001); 7-й Европейской международной школе по углеводам (г. Вагенинген, Нидерланды, 2002); III съезде Всероссийского биохимического общества (г. Санкт-Петербург, 2002); Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Казань, 2002; г. Саратов, 2004; г. Сыктывкар 2006; г. Уфа, 2008); II Российской научнопрактической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (г. Москва, 2003); Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (г. Алма-Ата, Казахстан, 2003, 2007); III Всероссийской школе-конференции «Химия биохимия углеводов» (г. Саратов, 2004); Семинаре по углеводам (г. Борстель, Германия, 2004); III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (г. Воронеж, 2005); 7-ом Международном симпозиуме по химии природных соединений (г. Ташкент, Узбекистан, 2007), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск, 2008), 3-й Международной конференции по химическому исследованию и использованию природных ресурсов (г. Улан-Батор, Монголия, 2008); Научно-практической конференции «Физико-химическая биология» (г. Сыктывкар, 2009); конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» (г. Ташкент, Узбекистан, 2010); Всероссийской научной конференции «Химия и медицина» (г. Уфа, 2010); XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (г. Владивосток, 2010); 16-м Европейском симпозиуме по углеводам (г. Неаполь-Сорренто, Италия, 2011), I Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (г. Казань, 2012). Публикации. По теме диссертации опубликовано 65 научных работ, в том числе одна монография, четыре патента Российской Федерации, 22 статьи, в том числе 21 статья в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, из них 11 в зарубежных и 10 статей в российских журналах. 8 Личный вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в разработке подходов к исследованию, постановке и решении основных задач, активном участии на всех этапах теоретических и экспериментальных исследований, интерпретации, анализе, систематизации полученных результатов и в их оформлении для публикации. Структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав: обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, а также выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 380 источников, в том числе 340 на английском языке. Работа изложена на 243 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков и 33 таблицы. Работа выполнена в Отделе молекулярной иммунологии и биотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук в рамках плановых тем НИР «Физиологическая активность полисахаридов в зависимости от структуры (ГР № 01.200 107401) и «Физиологическая активность пектиновых полисахаридов, модифицированных в условиях искусственной гастроэнтеральной среды» (ГР № 0120.0 602858). Частично работа получила финансовую поддержку Министерства науки и образования в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 - 2012 годы» (госконтракты №№ 02.512.11.2190 и 02.512.12.0014), Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 01-04-96437, 03-04-48136, 05-04-08030, 06-04-48079, 07-04-9012, 08-04-12235, 09-04-00017, 12-04-00150), Программ фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки медицине», Программы интеграционных проектов фундаментальных научных исследований, выполняемых в УрО РАН совместно с СО РАН и ДВО РАН, Программы поддержки ведущих научных школ РФ № НШ-1260.2003.4 (Научная школа академика Ю.С. Оводова). Сокращения и условные обозначения: GalpA - галактопиранозилуроновая кислота, Galp – галактопираноза, Araf - арабинофураноза, Rhap – рамнопираноза, Xylp – ксилопираноза, Manp - маннопираноза, Glcp – глюкопираноза, HG – галактуронан; RG - рамногалактуронан; СМ – степень метилэтерификации остатков галактуроновой кислоты, ДЭАЭ-целлюлоза – диэтиламиноэтилцеллюлоза, ТФУ - трифторуксусная кислота, АСМ – атомно-силовая микроскопия, ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография, ГЖХ-МС – хромато-масс-спектромерия, CDTA – циклогександиаминтетрауксусная кислота, ПДК – предельно допустимая концентрация, ЯТЦ – ядерный тепловой цикл; БАД – биологически активные пищевые добавки; Mw – средневесовая молекулярная масса; Mn – среднечисловая молекулярная масса; Mw / Mn – степень полидисперсности; ЖКТ – желудочно-кишечный тракт; ПС – полисахарид. 9 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Скрининг растений на содержание пектиновых полисахаридов В результате скрининговых исследований выделены и изучены образцы пектиновых полисахаридов наземной части более 50 различных видов растений европейского Севера России и Монголии. Выделение полисахаридов из растительного сырья проведено методом исчерпывающей экстракции, включающей предварительную обработку растительного материала хлороформом и последовательную экстракцию водой (25 °С и 80 °С, 6 ч), подкисленной водой (рН 4, 50 °С, 3 ч), 0.7 % водным раствором оксалата аммония (70 °С, 6 ч). В результате выявлено, что содержание пектиновых полисахаридов в исследованных растениях варьирует в достаточно широких пределах: от незначительных 0.2 – 0.5 % в ятрышнике пятнистом Orchis maculata и багульнике болотном Ledum palustre L. до высоких 10 – 16 % в борщевике Сосновского Heracleum sosnowskyi L., бадане толстолистном Bergenia сrassifolia L. и пижме обыкновенной Tanacetum vulgare L. При этом в подавляющем большинстве растений содержание нерастворимых пектиновых полисахаридов, входящих в состав протопектинового комплекса и экстрагирующихся водным раствором оксалата аммония, значительно выше, чем растворимых пектинов, несвязанных с компонентами клеточной стенки и экстрагирующихся водой. Установлено, что главными моносахаридными остатками, входящими в состав углеводных цепей большинства исследованных пектинов, являются остатки GalpA, Araf и Galp, что является типичным для пектиновых полисахаридов. Суммарное содержание остатков нейтральных моносахаридов в пектинах древесной зелени хвойных пород деревьев достигает 30 %. Остатки Apif, редко встречающегося разветвленного моносахарида, обнаружены только в лемнане, пектине ряски малой, и в небольших количествах в пектинах пихты Abies sibirica L., сосны сибирской Pinus sibirica Du Tour и лиственницы сибирской Larix sibirica L. В исследованных пектинах соотношение остатков Rha : GalA варьирует от 1 : 20 до 1 : 90 и указывает на преимущественное содержание в них галактуронана. Исключение представляются пектины сабельника болотного Comarum palustre L., крапивы двудомной Urtica dioica L. и березы обыкновенной Betula alba L., в которых высокое содержание остатков нейтральных моносахаридов и соотношение остатков Rha : GalA составляющее 1 : 5, 1 : 3 и 1 : 2, соответственно, свидетельствует о преимущественном содержании в их углеводных цепях разветвленных участков, образованных RG-I. Большинство фракций, экстрагированных водой, включает значительное количество белковых компонентов, содержание которых достигает 20 %. При этом большая часть белка отделяется в процессе ионообменной хроматографии и, следовательно, не имеет ковалентных связей с углеводной составляющей. 10 Скрининг физиологической активности, проведенный в лаборатории молекулярной физиологии и иммунологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН, выявил пектины, обладающие иммуномодулирующей, противовоспалительной и гастропротективной активностью. Детально изучено строение физиологически активных пектинов, отличающихся наличием в углеводных цепях значительных участков RG-I, высоким содержанием остатков нейтральных моносахаридов и характеризующихся высокой вязкостью водных растворов. Особенности строения физиологически активных пектинов В ходе структурных исследований установлено строение пектиновых полисахаридов десяти различных видов растений и показано, что большинство из них характеризуется традиционной для пектинов структурой с преимущественным содержанием линейного 1,4--D-галактуронана, часть остатков GalpA в котором метилэтерифицирована, и с разветвленной областью, представленной RG-I с боковыми цепями, образованными остатками арабинозы и галактозы. Несмотря на то, что наличие ковалентной связи между остатками рамнозы главной углеводной цепи и боковыми цепями, образованными остатками арабинозы и галактозы, установлено лишь для отдельных исследованных пектинов, присутствие 2,4-замещенных остатков рамнозы в углеводных цепях пектинов определено для большинства из них (Оводов и др., 2009). Однако в составе углеводных цепей комарумана, пектина сабельника болотного Comarum palustre L., наряду с традиционными для пектинов структурными элементами, было выявлено наличие разветвлений в углеводных цепях галактуронана, что кардинальным образом меняет представление о структуре пектиновых полисахаридов, которое ранее было основано на абсолютной линейности галактуронанового кора. Структурно-химическая характеристика комарумана. Методом спектроскопии ЯМР были исследованы продукты кислотного гидролиза комарумана: СРН-1 – фрагмент RG-I; СРН и СРН-2 – фрагменты HG, []D20 = + 246 (1 мг/мл; вода), СМ 5.0 %, и СРМ – метилэтерифицированное производное комарумана, СМ 81.5 % (Табл. 1). Таблица 1. Моносахаридный состав комарумана, его фрагментов и производных Содержание, %4 Фрагменты Выход, % GalpA Gal Ara Rha Xyl 1 СР 4.0 64.0 11.3 6.0 12.0 0.1 2 СРН-1 30.0 39.8 20.1 2.4 27.1 0.1 2 СРН-2 20.0 98.0 1.8 0.1 0.5 0.1 3 СРН 92.0 99.0 0.0 0.0 0.3 0.0 2 СРМ 78.0 65.0 13.2 2.8 11.5 0.0 1 3 – от воздушно-сухого сырья; 2 – от комарумана СР; – от массы СРН-2; 4 – весовые проценты. Glc 2.1 4.6 0.1 0.0 3.1 11 Положение сигналов атомов углерода остатков GalpA в С ЯМР-спектре фрагмента СРН-2, практически не содержащего боковых цепей (Табл. 1), определяется при 101.2 м.д. (С1), 70.1 м.д. (С2), 70.5 м.д. (С3), 79.9 м.д. (С4), 72.9 м.д. (С5), 176.3 м.д. (С6) (Рис. 1) и свидетельствует о наличии в углеводной цепи комарумана 1,4--D-галактопиранозилуронана. 13 Рис. 1. 13С ЯМР-спектр фрагмента СРН-2. В спектрах метилэтерифицированного производного комарумана СРМ помимо сигналов остатков GalpA со свободной карбоксильной группой, положение которых идентично положению сигналов в спектрах галактуронана СРН-2, присутствуют сигналы метилэтерифицированных остатков GalpA (Рис. 2 а, б). Рис. 2. 1Н/13С HSQC-спектр метилэтерифицированного производного СРМ. 12 В аномерной области 1Н/13С HSQC-спектра (Рис. 2 а) наблюдается интенсивный сигнал ( С1/Н1 при 100.9 / 5.16 м.д.) аномерных атомов остатков Rhap, и в области сильного поля идентифицируются сигналы С6/Н6 при 18.1 / 1.28, 18.3 / 1.33 м.д., принадлежащие атомам углерода и протонам метильной группы остатков Rhap (Рис. 2 в). 1Н/13С HSQC-спектр (Рис. 2 б) указывает на -конфигурацию остатков рамнопиранозы ( С5/Н5 при 70.9 / 3.48 м.д.) и их замещение по второму положению ( С2/Н2 при 78.2 / 4.10 м.д.). Положение сигналов в гетероядерном спектре 1Н/13С HSQC (Рис. 2 а, б) остатков D-галактопиранозы указывает на наличие терминальных и 1,4-связанных остатков -D-Galp. В ЯМР-спектре наблюдается смещение в слабое поле сигнала С4 остатка -D-Galp, замещенного по четвертому положению ( 79.1 м.д.) по сравнению с положением сигнала С4 в незамещенном остатке -D-Galp ( 70.0 м.д.). В спектре NOESY (Рис. 3 а) наблюдается транс-гликозильный корреляционный пик аномерного протона остатка L-Rhap и H4 остатка D-GalpA, замещенного по четвертому положению ( Н1/Н4 при 5.16 / 4.46 м.д.). Этот тип замещения подтверждается относительно слабыми корреляционными пиками H5 (Рис. 3 а), H6 (Рис. 3 б) остатка -L-Rhap и H4 остатка -D-GalpA ( Н5 / Н4 при 3.48 / 4.46 м.д., Н6 / Н4 при 1.28 / 4.46 м.д. соответственно). Рис. 3. Спектр NOESY метилэтерифицированного производного СРМ. Гомоядерные спектры TOCSY и COSY производного СРМ указывают на присутствие в комарумане 1,2-связанных остатков -L-Rhap, замещенных по C4-положению. В 1Н ЯМР-спектрах наблюдается смещение в слабое поле сигналов H4, H5 и H6 остатка 2,4-ди-О-замещенной -L-Rhap по сравнению с их положением в остатке 1,2-связанной -L-Rhap (Табл. 2). 13 Таблица 2. Химические сдвиги сигналов атомов углерода в 13С и протонов в 1 Н ЯМР-спектрах метилэтерифицированного производного комарумана СРM Остаток C-1 Н-1 101.8 4)--GalpA(OMe)-(1 4.96 99.4 4)--GalpA-(1 5.08 100.9 2)--Rhap-(1 5.16 100.9 2,4)--Rhap-(1 5.16 106.1 -Galp-(1 4.70 105.8 4)--Galp-(1 4.64 н.о. – не определено. Химические сдвиги, м.д. (C ацетон 31.45 м.д.; H ацетон 2.23 м.д.) C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 Н-2 Н-3 Н-4 H-5 H-6; H-6’ 69.2 69.3 80.4 72.0 172.1 3.71 3.99 4.46 4.96 69.2 70.6 79.9 71.7 172.3 3.87 4.10 4.46 5.08 78.2 70.5 72.9 70.9 18.1 4.10 3.82 3.42 3.48 1.28 78.2 70.5 н.о. н.о. 18.3 4.07 3.90 3.68 3.58 1.33 72.8 73.3 70.0 76.8 62.2 3.65 3.70 4.01 3.77 3.78; 3.72 73.3 74.7 79.1 76.0 62.2 3.67 3.75 4.18 3.72 3.78; 3.72 OMe 54.3 3.82 В спектре NOESY фрагмента СРМ (Рис. 3 б) присутствует интенсивный транс-гликозильный корреляционный пик H6 остатка 2,4-ди-О-замещенной -L-Rhap и аномерного протона 1,4-связанных остатков -D-Galp ( Н6/Н1 при 1.33 / 4.64 м.д.), который свидетельствует о замещении остатков Rhap по С4-положению остатками -D-Galp. Наличие этого пика особенно важно в связи с тем, что корреляционный пик аномерного протона 1,4-связанных остатков -D-Galp с H4 2,4-замещенных остатков -L-Rhap ( Н1/Н4 при 4.64 /3.68 м.д.) совпадает с пиками аномерного протона с Н3 и Н5 1,4-связанных остатков -D-Galp ( Н1/Н3 и Н1/Н5 4.64 / 3.75 и 4.64 / 3.72 м.д. соответственно) (Рис. 3 а). Все это указывает на наличие замещения остатков -L-Rhap главной углеводной цепи пектина остатками 1,4--D-Galp.Присутствие в спектре NOESY транс-гликозильных корреляционных пиков аномерного протона с H3, H4 и H5 остатков -D-Galp (Рис. 3а), замещенных по C4, указывает на наличие олигосахаридного фрагмента: …4)--Galp-(14)--Galp-(1… в углеводных цепях производного СРМ и, следовательно, комарумана. ЯМР-спектры фрагмента СРН-1 (Табл. 3) подтверждают и дополняют данные о структуре комарумана, полученные при анализе ЯМР-спектров метилэтерифицированного производного СРМ. В 13С ЯМР-спектре фрагмента СРН-1 обнаружен сигнал при 171.9 м.д., принадлежащий атому углерода метилэтерифицированной карбоксильной группы (COOCH3). Присутствие метилэтерифицированных карбоксильных групп в остатках GalpA подтверждено сигналами С/Н-атомов CH3O-группы при 54.1 / 3.80 м.д. в спектре 1Н/13С HSQC фрагмента СРН-1 (Рис. 4). 14 Таблица 3.Химические сдвиги сигналов атомов углерода в 1 Н ЯМР-спектрах фрагмента комарумана СРН-1 Остаток 4)--GalpA(OMe)-(1 -GalpA-(1 4)--GalpA-(1 4)--GalpA-(1 2)--Rhap-(1 2,4)--Rhap-(1 -Galp-(1 4)--Galp-(1 6)--Galp-(1 C-1 Н-1 101.8 4.97 н.о. 4.95 99.1 5.04 101.0 4.95 100.2 5.22 100.2 5.22 105.8 4.71 104.8 4.65 104.5 4.50 13 С и протонов в Химические сдвиги, м.д. (C ацетон 31.45 м.д.; H ацетон 2.23 м.д.) C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 Н-2 Н-3 Н-4 H-5 H-6; H-6’ 69.3 69.4 79.7 71.7 171.9 3.73 4.02 4.47 5.12; 5.09 69.7 69.7 71.2 72.6 173.6 3.92 3.98 4.33 4.75 69.1 70.9 78.7 71.5 174.4 3.90 4.14 4.46 4.98 69.1 70.9 78.7 71.5 174.4 3.86 4.12 4.46 4.98 77.9 70.6 72.9 70.8 17.7 4.12 3.85 3.44 3.66 1.25 77.8 70.5 н.о. 69.4 18.0 4.09 3.90 3.78 3.70 1.33 72.8 74.6 69.9 76.4 62.1 3.66 3.65 4.02 3.77 3.84; 3.78 72.6 73.5 79.3 75.8 62.0 3.65 3.77 4.18 3.75 3.77 72.9 73.8 н.о. 75.0 70.7 3.51 3.67 4.17 3.95 4.12; 3.92 Рис. 4. Спектр 1Н/13С HSQC фрагмента СРН-1. OMe 54.1 3.80 15 ЯМР-спектры фрагмента СРН-1 подтверждают наличие 1,4-связанных остатков -D-Galp. Кроме транс-гликозильного корреляционного пика аномерного протона с H4 остатков -D-Galp, замещенных по C4 ( Н1/Н4 при 4.65 / 4.18 м.д.), в спектре ROESY (Рис. 5) наблюдается транс-гликозильный корреляционный пик аномерного протона терминальных остатков -D-Galp с H4 остатков -D-Galp, замещенных по C4 ( Н1 / Н4 при 4.71 / 4.18 м.д.). Кроме того, в спектре ROESY (Рис. 5) присутствует транс-гликозильный корреляционный пик аномерного протона с H6 и H6’ остатков -D-Galp, замещенных по C6 ( Н1/Н6, H6’ при 4.50 / 3.92, 4.12 м.д.). Наличие данной гликозидной связи подтверждается присутствием в гетероядерном спектре 1Н/13С HSQC (Рис. 4) сигнала аномерного атома углерода при 104.5 м.д. и смещением в область слабого поля сигнала С6 ( 70.7 м.д.) 1,6-связанных остатков -D-Galp по сравнению с его положением в незамещенном остатке D-Galp ( 62.1 м.д.). Рис. 5. Спектр ROESY фрагмента СРН-1. При перметилировании по методу Хакомори с последующим восстановлением LiAlD4 в тетрагидрофуране и идентификацией метилированных моносахаридов после полного кислотного гидролиза в виде соответствующих ацетатов полиолов с помощью ГЖХ-МС установлено наличие среди главных компонентов углеводной цепи комарумана, его фрагмента СРН-1 и метилированного производного СРМ практически равных количеств остатков 1,2-связанной и 2,4-замещенной Rhap. Это свидетельствует о наличии в составе комарумана близких по длине участков линейного RG и разветвленного RG-I. Результаты ГЖХ-МС указывают на то, что в состав разветвленной области комарумана, наряду с 1,4-связанными и терминальными остатками Galp, входят остатки 1,3- и 1,6-связанной Galp и 1,5-связанной Araf (Табл. 4). Точками разветвления боковых цепей являются 3,4-, 4,6-замещенные остатки Galp. В гидролизате перметилированного 16 производного комарумана СРМ в небольшом количестве идентифицированы остатки 1,4-, 1,6-связанной и 3,6-замещенной Glcp (Табл. 4). Кроме того, результаты метилирования указывают на присутствие в макромолекуле комарумана терминальных, 1,4-, 1,3-связанных и 3,4-замещенных остатков GalpA, которые идентифицированы как дейтерированные производные. Наличие 3,4-замещенных остатков GalpA указывает на присутствие разветвлений в углеводных цепях галактуронана комарумана. Чтобы подтвердить данные о разветвленном характере углеводной цепи галактуронана, было проведено исследование фрагмента галактуронана СРН, в составе которого из остатков нейтральных моносахаридов идентифицированы лишь остатки Rhap (Табл. 1). Таблица 4. Результаты анализа комарумана и его производных методом метилирования Метилированные Фрагменты СР СРН-1 СРМ сахара* 2,3,4-O-Me3-Rhap – – + Rhap-(1 3,4-O-Me2-Rhap ++ ++ ++ 2)-Rhap-(1 3-O-Me-Rhap ++ ++ ++ 2,4)-Rhap-(1 2,3-Ме2-Araf ++ – – 5)-Araf-(1 ++ ++ ++ 2,3,4,6-Me4-Galp Galp-(1 2,4,6-Me3-Galp – – + 3)-Galp-(1 ++ ++ ++ 2,3,6-Me3-Galp 4)-Galp-(1 – + + 2,3,4-Me3-Galp 6)-Galp-(1 + – – 2,6-Me2-Galp 3,4)-Galp-(1 – – + 2,3-Me2-Galp 4,6)-Galp-(1 – – + 2,3,6-Me3-Glсp 4)-Glсp-(1 – – + 2,3,4-Me3-Glсp 6)-Glсp-(1 – – + 2,4-Me2-Glсp 3,6)-Glсp-(1 Дейтерированные: ++ – – 2,3,4-Me3-Gal GalA-(1 + – – 2,4-Me2-Gal 3)-GalA-(1 ++ – – 2,3-Me2-Gal 4)-GalA-(1 2-O-Me-Gal + – – 3,4)-GalA-(1 * - идентифицированы в виде соответствующих ацетатов полиолов; +/– - относительное содержание в гидролизате. Поскольку метилирование остатков уроновых кислот протекает с большим трудом, и добиться исчерпывающего метилирования практически невозможно, остатки GalpA галактуронана СРН предварительно восстанавливали до галактозы. Полноту восстановления исходного галактуронана до галактана оценивали по отсутствию в ИК-спектре полос поглощения, характерных для карбоксильных групп. В результате в гидролизате перметированного галактана, метилирование которого 17 проводили до полного отсутствия в ИК-спектре полос поглощения, характерных для гидроксильных групп, было установлено присутствие 2,3,6-три-О-метил-D-Galp в качестве главного компонента и приблизительно в равных количествах 2,3,4,6-тетра-, 2,6- и 3,6-ди-О-метил-D-Galp в качестве минорных компонентов. Наличие в гидролизате этих метилированных остатков галактозы указывает на присутствие во фрагменте СРН и в комарумане 1,4-связанных, терминальных, 3,4- и 2,4-замещенных остатков GalpA соответственно. Кроме того, в гидролизате в следовых количествах обнаружена 6-моно-О-метил-D-Galp, присутствие которой свидетельствует о наличии в углеводных цепях комарумана и его фрагмента остатков 2,3,4-замещенной GalpA. Изучение архитектоники галактуронана СРН методом атомно-силовой микроскопии подтвердило результаты, полученные методом метилирования (Оводова и др., 2006). АСМ-изображение макромолекулы галактуронана СРН свидетельствует о присутствии в его составе отдельных молекул и агрегатов (Рис. 6 I). I) II) Рис.6. I) АСМ-изображение галактуронана, главного структурного компонента макромолекулы комарумана: (а) полученное на приборе АСМ-изображение; (б) увеличенный участок (171 – 270 нм) АСМ-изображения: 1 – неразветвленная линейная молекула; 2 – молекулы, имеющие по одному разветвлению; 3 – молекулы, имеющие несколько боковых цепей; II) Гистограмма распределения контурных длин макромолекул галактуронана СРН, измеренных с помощью АСМ (Оводова и др., 2006). Контурные размеры макромолекул, приведенные на гистограмме галактуронана СРН (Рис. 6 II), свидетельствуют о высокой его полидисперсности, которая подтверждается данными ВЭЖХ (Mw/Mn составляет 3.9). Длина линейных молекул и линейных участков боковых цепей разветвленных макромолекул в соответствии с АСМ-измерениями варьирует от 10 до 100 нм и равняется в среднем 30 15 нм. Разветвленные молекулы (Рис.6 Iа) составляют не менее 50 % общего числа макромолекул. На АСМ-изображении галактуронана СРН отчетливо видно, что многие макромолекулы, наряду с главной углеводной 18 цепью, имеют боковые цепи различной длины. Молекулы галактуронана содержат по одной и по несколько боковых цепей, присоединенных как к разным, так и к одному участку главной углеводной цепи (Рис. 6 Iб) Таким образом, на основании полученных данных можно предположить присутствие в составе комарумана следующих структурных элементов: в линейной области ... 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 4-GalpA-1 4-D-GalpA-1 ... n ... 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 2-L-Rhap-1 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 ... n в разветвленной области: 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 n 2,3 4-D-GalpA-1 разветвленный галактуронан 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 k m 2 3 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 RG-I ... 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 2-L-Rhap-1 4-D-GalpA-1 n 4 боковые цепи: 5-L-Araf-1 5-L-Araf-1 n ... 4-D-Galp-1 4-D-Galp-1 n .... 6-D-Galp-1 6-D-Galp-1 n .... D-Galp-1 3-D-Galp-1 3-D-Galp-1 n .... D-Glcp-1 6-D-Glcp-1 D-Glcp-1 4-D-Glcp-1 D-Galp-1 2-L-Rhap-1 4-D-GalpA-1 n 4 ... точки разветвления: D-Galp-1 4-D-GalpA-1 боковые цепи боковые цепи L-Araf-1 6-D-Glcp-1 .... 4-D-Glcp-1 .... 3,4-ди-О-замещенная D-Galp; 4,6-ди-О-замещенная D-Galp; 3,6-ди-О-замещенная D-Glcp n n Влияние условий произрастания растений синтезируемых ими пектиновых полисахаридов на структуру Ранее предполагалось, что исследование пектиновых полисахаридов растений, произрастающих в экстремальных условиях, может выявить новые элементы структуры пектинов и расширит представление о биосинтезе и функциях этих биополимеров (Ridley et al., 2001). Существует явный недостаток данных о влиянии условий произрастания растений, в том числе загрязнения окружающей среды и климатических условий, на структуру синтезируемых ими пектиновых полисахаридов. Для определения влияния климатических условий и систематического недостатка влаги, испытываемого растением в период роста и развития, на 19 биосинтез пектиновых полисахаридов было проведено сравнительное исследование пектиновых полисахаридов, выделенных из растений, принадлежащих к одному виду, но произрастающих в различных природноклиматических условиях: влажном умеренно континентальном климате европейского Севера России (Республика Коми, РК) и сухом резко континентальном климате Монголии. Растительный материал был собран в период цветения на территории РК и Монголии. Ввиду того, что климатические условия РК и Монголии сильно различаются, поиск растений одного вида, произрастающих в обеих климатических зонах, резко осложнился, в связи с чем, несмотря на скрининг большого числа растений, список растений, произрастающих в обеих климатических зонах, ограничен (Табл. 5, 6). Таблица 5. Характеристика водорастворимых фракций, выделенных из растений РК и Монголии Место произрастания РК РК Монголия РК Монголия Название Выход, Содержание, %3 1 % GalA Gal Ara Rha Xyl Man Glc растения Бадан толстолистный Bergenia сrassifolia L. B. сrassifolia 0.12 8.8 7.0 5.3 2.9 1.5 3.9 2.7 Кипрей узколистный Epilobium angustifolium L. E.angustifolium 0.3 24.4 4.5 2.3 1.1 0.6 4.4 9.5 E.angustifolium 0.1 30.0 5.5 3.3 1.0 0.8 2.0 6.8 Радиола розовая Rhodiola rosea L. белок 49.3 45.8 40.6 R. rosea R. rosea 1.2 57.6 6.6 7.9 1.8 1.4 1.5 4.5 11.5 0.1 56.6 5.9 5.2 2.1 0.5 0.9 4.4 14.4 Дудник лесной Angelica archangelica РК A.archangelica 0.2 30.2 5.3 8.1 1.4 2.3 4.5 0.6 28.3 Монголия A.archangelica 0.1 40.5 5.0 4.4 1.1 3.4 4.1 1.0 20.5 Ревень Rheum sp. РК R.rhabarbarum 5.9 63.3 2.3 3.9 4.8 0.3 0.1 0.9 7.1 Монголия R. nanum 2.6 62.1 1.9 4.5 4.1 0.0 0.1 0.4 1.6 Борщевик Heracleum sp. РК H. sosnowsyi 0.4 23.4 19.6 2.6 2.7 0.3 1.5 1.6 40.2 Монголия H. sibiricum 0.1 31.7 12.7 3.1 2.0 1.2 1.0 3.1 32.4 Ятрышник Orchis sp. РК O. maculata 9.6 5.4 1.4 0.7 0.3 0.1 58.7 17.9 0.2 Монголия O. militaris 7.1 3.5 0.7 0.6 0.2 0.1 60.7 19.9 0.1 1 – выход рассчитан от массы сухого растительного материла; 2 – выход фракции водорастворимых пектиновых полисахаридов из бадана толстолистного Bergenia сrassifolia L., произрастающего на территории Монголии, составляет 0.002 %; 3 – весовые проценты. Показано, что содержание растворимых пектиновых полисахаридов и пектинов протопектинового комплекса в растениях, произрастающих в условиях засушливого климата Монголии, значительно ниже, чем в растениях, произрастающих во влажном климате европейского Севера России (Табл. 5, 6). 20 Показано, что главным компонентом всех полисахаридных фракций, за исключением фракций, выделенных из ятрышника, являются остатки D-GalpA (40 – 90 %), суммарное содержание остатков нейтральных моносахаридов, большая часть которых представлена остатками Galp и Araf, составляет 10 – 20 %, что типично для пектиновых полисахаридов. Водные фракции, полученные из ятрышника, кипрея и родиолы, произрастающих в обеих климатических зонах, отличаются повышенным содержанием остатков Glcp (Табл. 5). Положительная йодкрахмальная реакция и обработка амилазой, приводящая к снижению содержания глюкозы в полисахаридных фракциях кипрея и родиолы до 0.5 – 1.0 %, свидетельствуют о том, что большая часть остатков Glcp входит в состав присутствующего во фракциях крахмала. Таблица 6. Характеристика пектиновых полисахаридов протопектинового комплекса, выделенных из растений РК и Монголии Место Название Выход, Содержание, %2 1 произрастания растения % GalA Gal Ara Rha Xyl Man Бадан толстолистный Bergenia сrassifolia L. РК B. сrassifolia 14.0 85.0 1.9 3.4 1.8 0.3 0.3 Монголия B. сrassifolia 13.0 83.3 1.2 3.1 1.6 2.3 0.2 Кипрей узколистный Epilobium angustifolium L. РК E.angustifolium 5.2 74.0 2.4 2.2 1.2 2.1 1.4 Монголия E.angustifolium 2.8 76.0 1.7 2.2 0.8 1.8 1.6 Радиола розовая Rhodiola rosea L. РК Монголия Glc белок 0.9 1.6 2.0 0.9 1.1 1.7 17.8 18.8 R. rosea R. rosea 5.3 80.1 6.6 5.1 2.0 1.0 1.1 5.3 5.8 3.0 71.2 4.7 6.9 2.4 2.7 0.2 0.7 1.9 Дудник лесной Angelica archangelica РК A.archangelica 1.3 90.2 3.5 1.7 1.4 2.1 0.2 1.2 0.0 Монголия A.archangelica 1.0 87.4 2.5 2.8 1.2 2.1 0.1 0.9 0.0 Ревень Rheum sp. РК R.rhabarbarum 4.8 69.2 6.1 8.5 5.1 0.9 0.3 0.0 2.9 Монголия R. nanum 0.6 60.8 5.2 9.2 5.6 0.0 0.1 0.4 2.4 Борщевик Heracleum sp. РК H. sosnowsyi 9.0 85.2 4.2 4.0 2.4 0.5 0.1 0.5 2.4 Монголия H. sibiricum 5.8 82.3 3.7 3.2 2.0 0.8 0.2 1.3 2.4 1 – выход рассчитан от массы сухого растительного материла; 2 – весовые проценты. Моносахаридный состав полисахаридных фракций, выделенных из наземной части ятрышника, принципиально отличается от всех остальных. Главными компонентами их углеводных цепей являются остатки Manp и Glcp (Табл. 5). Отрицательная йодкрахмальная реакция доказывает отсутствие в их составе крахмала. Ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе (Cl--форма) показано, что полученные из ятрышника полисахаридные фракции представляют собой смесь двух полисахаридов: глюкоманнана и пектинового полисахарида, содержание которого в полисахаридной фракции из ятрышника шлемоносного составляет 5.1 % (содержание в воздушно-сухом растительном материале 0.4 %), в 21 полисахаридной фракции из ятрышника пятнистого – 5.0 % (содержание в воздушно-сухом растительном материале 0.5 %). Главными компонентами углеводных цепей пектинов ятрышника являются остатки GalpA (до 74 %), Galp ( 7 %), Araf ( 4 %) и Rhap ( 4 %). Все водные фракции, за исключением фракций, выделенных из ятрышника и ревеня, содержат значительное количество белка, большая часть которого отделяется в процессе ионообменной хроматографии. Ввиду того, что исследованные виды борщевика, ятрышника и ревеня различны, можно утверждать, что независимо от климатических условий, в растениях не только одного вида, но и разных видов одного рода, синтезируются близкие по моносахаридному составу и, возможно, по структуре, полисахариды. Систематический недостаток влаги, испытываемый растением в период роста, вызывает снижение синтеза пектиновых полисахаридов в клеточных стенках растений, не влияя на моносахаридный состав синтезируемых полисахаридов. Влияние техногенных загрязнений на структуру пектиновых полисахаридов ряски Ранее установлена способность пресноводного цветкового растения ряски малой Lemna minor L. сорбировать Pb2+, Hg2+, Cr3+, Cr4+ и Cu2+ из водных растворов (Dirilgen, 2011). При этом показано, что Ni2+, содержащиеся в водоемах даже в микромолярных концентрациях (1 – 100 М), вызывают морфологические изменения в листьях ряски (Appenroth et al., 2010), которые могут быть обусловлены модификацией пектиновых полисахаридов, являющихся главными структурными компонентами клеточных стенок ряски. Для определения влияния техногенных загрязнений на синтез пектиновых полисахаридов в ряске, была проведена сравнительная химическая характеристика образцов пектиновых полисахаридов, выделенных из ряски двух видов (L. minor и L. gibba L.), произрастающих в экологически чистых районах и в районах, подвергшихся техногенному загрязнению, связанному с деятельностью целлюлознобумажного комбината (ЦБК), предприятий пищевой промышленности (птицефабрика) и ядерного теплового цикла (ЯТЦ) (Табл. 7). Радиоактивное загрязнение территории, в том числе р. Теча, обусловлено производственной деятельностью ПО «Маяк» (предприятия по производству компонентов ядерного оружия, изотопов, хранению и регенерации отработавшего ядерного топлива) и радиационными инцидентами, в частности, регламентированными технологическими сбросами в 1949 – 1952 гг. больших объемов жидких радиоактивных отходов в верховье р. Теча, аварийным выбросом радиоактивных веществ в 1957 г. (Трапезников и др., 2007). Кроме того, высокий уровень антропогенного воздействия в данном регионе обуславливает превышающее ПДК в десятки и сотни раз содержание тяжелых металлов в природных экосистемах (Позолотина и др., 2008). 22 Таблица 7. Характеристика местности отбора образцов ряски ПС Координаты 5634’18” LMC-1 6054’32” 5641’22” LMC-2 6115’27” 61°67’94” 50°79’50” 5536’53” LМD-1 6137’10” LMC-3 р. Сысерть Свердловской области р. Брусянка Свердловской области Oзеро, Дырнос РК р. Теча Челябинской области 5536’12” LМD-2 6140’55” р. Теча Челябинской области 5536’15” LМD-3 6141’02” р. Теча Челябинской области 5535’04” LМD-4 6147’29” р. Теча Челябинской области 5534’27” LМD-5 6202’33” р. Теча Челябинской области 61°84’81” LМD-6 50°73’12” Озеро, Эжвинский район РК Озеро, Выльгортский район РК 61°60’86” LМD-7 50°70’68” Вид ряски - Мощность -фона в воздухе* 0.08 мк Зв/ч - 0.1 мк Зв/ч L .gibba - 0.03 мк Зв/ч L .minor радионуклиды, тяжелые металлы (ЯТЦ) радионуклиды, тяжелые металлы (ЯТЦ) радионуклиды, тяжелые металлы (ЯТЦ) радионуклиды, тяжелые металлы (ЯТЦ) радионуклиды, тяжелые металлы (ЯТЦ) отходы ЦБК 0.67 мк Зв/ч L. gibba 0.57 мк Зв/ч L .gibba 0.44 мк Зв/ч L gibba 0.50 мк Зв/ч L. gibba 0.62 мк Зв/ч L. minor 0.03 мк Зв/ч L.minor органические отходы птицефабрики 0.03 мк Зв/ч L. minor Место сбора Загрязнение L. minor * - данные предоставлены сотрудниками Института биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук, г. Сыктывкар. Чтобы выявить влияние загрязнений на синтез лемнана, пектинового полисахарида ряски, для полученных образцов лемнана были установлены моносахаридный состав, содержание белка и молекулярная масса (Табл. 8 и 9). Найдено, что образцы лемнана LMC-1, LMC-2 и LMC-3, выделенные из ряски разных видов (ряски малой L. minor и ряски горбатой L. gibba), имеют близкий моносахаридный состав и отличаются высоким содержанием остатков GalpA и Apif. Независимо от видовой принадлежности 23 растений в образцах лемнана, выделенных из ряски, произрастающей в загрязненных районах, отмечается снижение содержания остатков Apif и повышение содержания остатков Xylp. Отличительной особенностью образца лемнана LMD-2 является высокое содержание и остатков Apif, и остатков Xylp (Табл. 8). Таблица 8. Моносахаридный состав образцов лемнана, полученных из ряски Образец* LMС-1 LMС-2 LMС-3 LMD-1 LMD-2 LMD-3 LMD-4 LMD-5 LMD-6 LMD-7 GalA 50.6±0.2 50.9±1.0 60.4±0.2 48.3±0.7 46.5±1.7 47.8±0.3 49.6±0.6 42.0±0.7 50.6±0.2 50.1±1.2 Gal 3.5±0.1 5.0±0.2 4.3±0.5 3.2±0.1 2.9±0.4 2.4±0.2 2.5±0.3 2.7±0.1 1.3±0.8 1.1±0.1 Ara 1.9±0.2 2.5±0.2 3.5±0.7 1.6±0.1 1.8±0.2 1.7±0.3 1.5±0.1 1.6±0.1 2.3±0.6 1.9±0.2 Содержание, % Rha Api 2.1±0.2 22.3±2.3 2.3±0.1 22.4±1.6 2.5±0.7 20.2±1.5 1.9±0.3 16.7±2.5 2.2±0.5 21.4±2.0 1.8±0.1 14.9±2.4 2.1±0.4 14.9±2.2 1.9±0.1 16.8±3.4 2.3±0.6 12.3±2.4 1.5±0.1 9.6±1.8 Xyl 3.8±0.4 3.4±0.2 3.7±0.3 7.5±0.6 7.0±1.1 5.9±0.5 6.4±0.3 7.9±0.6 5.2±0.9 6.5±0.7 Man 0.6±0.1 0.6±0.1 0.1±0.1 0.5±0.1 0.4±0.1 0.3±0.1 0.3±0.1 0.4±0.1 0.5±0.2 0.4±0.1 Glc 1.8±0.1 2.7±0.2 1.0±0.7 1.9±0.3 1.5±0.9 3.0±0.2 1.4±0.3 3.0±0.2 3.5±0.5 1.3±0.1 В таблице представлены средние арифметические значения и средние квадратичные отклонения (n=10). * - районы сбора ряски, из которой были выделены образцы, указаны в Табл. 7. Проведенное ранее исследование структуры лемнана из ряски малой L. minor (Golovchenko et al., 2002) выявило наличие в составе его углеводной цепи в качестве главного компонента г а ла кт у р о н а н а в ли н е й н о й о бла ст и : ...4)--D-GalpA-(14)--D-GalpA-(14)--D-GalpA-(1... n и а п и о г а ла кт у р о н а н а в р а з ве т влен н о й о бла с т и : …4)--D-GalрA-(14)--D-GalрA-(14)--D-GalрA-(1… 3 3 …3’)--D-Apif-(13’)--D-Apif-1 -D-Apif-1 а в качестве минорного компонента гетерогликаногалактуронана, имеющего боковые цепи: точки разветвления: … 3,4-ди-О-замещенная D-Galp; -L-Araf-(15)--L-Araf-(1 2,4-ди-О-замещенная D-Xylp; 2-O-Me--D-Xylp-(14)--D-Xylp-(1… 4 2,5-ди-О-замещенная L-Araf -D-Xylp-1 d -D-Xylp-(14)--D-Xylp-(1… β-D-Galp-(13)-β-D-Galp-(1… β-D-Galp-(14)-β-D-Galp-(1… Увеличение в образцах лемнана содержания остатков Xylp и снижение количества остатков Apif, скорее всего, связано с протекающими в растении защитными процессами, приводящими к уменьшению синтеза 24 апигалактуронана и увеличению синтеза ксилогалактуронана. Ранее было показано, что остатки Xylp невозможно полностью удалить из состава углеводных цепей пектина ряски (Mascaro & Kindel, 1977), возможно, они входят в состав ксилогалактуронана, как это было установлено для зостерана, пектина морских трав сем. Zosteraceae (Ovodov et al., 1971). Наличие ксилогалактурона может влиять на физические свойства пектиновой матрицы и клеточной стенки в целом. По-видимому, пектиновые полисахариды выполняют важную регуляторную функцию и являются лабильным звеном растительной клетки. Они участвуют в адаптативной перестройке растительной клетки и при воздействии техногенных загрязнений повышают ее резистентность, увеличивая синтез фрагмента ксилогалактуронана в образцах лемнана. О модификации пектиновых полисахаридов под влиянием техногенных загрязнений также свидетельствует изменение их молекулярной массы (Mw и Mn). Mw и Mn образцов лемнана из ряски, произрастающей в загрязненных районах, независимо от типа загрязнения, ниже по сравнению с образцами лемнана, полученными из ряски, произрастающей в чистых районах (Табл. 9). Молекулярно-массовые характеристики образцов лемнана определены методом высоко-эффективной жидкостной хроматографии на колонке Shodex OHpak SB-804 HQ, при использовании пуллуланов с молекулярными массами: 1.3, 6, 12, 22, 50, 110, 200, 400, 800 кДа, для калибровки. Таблица 9. Характеристика образцов лемнана, выделенных из ряски Образец1 Выход2, % Белок, %3 Mw, кДа Mn, кДа Mw/Mn LMС-1 4.8 11.7 427.2 46.4 9.2 LMС-2 5.9 10.8 380.8 63.4 6.0 LMС-3 8.5 0.3 626.3 210.0 2.8 LMD-1 3.3 12.3 161.0 25.1 6.4 LMD-2 2.8 13.6 358.9 32.5 11.0 LMD-3 3.1 17.2 181.9 34.6 5.3 LMD-4 2.9 11.3 178.8 24.3 7.4 LMD-5 3.5 9.3 187.0 20.8 9.0 LMD-6 2.5 6.0 290.5 38.5 7.6 LMD-7 3.8 5.3 288.0 36.0 8.0 1 – районы сбора ряски, из которой были выделены образцы, указаны в Табл. 7; – выход от массы воздушно-сухого растительного материала; 3 – весовые проценты. 2 Все пектиновые полисахариды, за исключением LMС-3, содержат значительное количество белка, который в ходе ионообменной хроматографии отделяется от углеводной составляющей практически полностью. Взаимосвязи между количеством белка во фракциях и загрязнениями выявлено не было (Табл. 9). Таким образом, полученные результаты указывают на то, что техногенные загрязнения приводят к изменению синтеза лемнана в 25 клеточных стенках ряски, в частности, к снижению апиогалактуронана и увеличению синтеза ксилогалактуронана. Структурно-химическая полисахаридов овощей и фруктов характеристика синтеза пектиновых Пектиновые полисахариды, являясь одним из главных компонентов клеточных стенок всех высших растений, наряду с целлюлозой и гемицеллюлозами, входят в состав пищевых волокон. Пектины составляют большую часть нормального пищевого рациона человека и поступают в организм человека как в составе овощей и фруктов, так в качестве функционального пищевого ингредиента (код ЕС, E440) и БАД. Известно, что пектины обладают широким спектром физиологической активности. Поскольку между структурой и физиологической активностью наблюдается тесная взаимосвязь (Попов, 2010), было исследовано влияние гастральной среды на экстракцию пектиновых полисахаридов и их структуру с использованием модели пищеварения in vitro. В качестве желудочного сока использовали раствор, состав которого описан ранее (Corcoran et al., 2007) и включает следующие компоненты: HCl (1.27 г/л) как главный компонент желудочного сока; NaCl (2.05 г/л), KH2PO4 (0.60 г/л), CaCl2 (0.11 г/л), KCl (0.37 г/л) как составные компоненты желудочного сока, которые могут оказывать влияние на процессы экстракции пектинов из растительных клеток; пепсин (0.50 г/л), протеолитический фермент, секретируемый в желудке, который может влиять на количество соэкстрагирующегося белка. Уровень рН использованного раствора, имитирующего желудочный сок, составляет 1.5, что соответствует значению рН желудочного сока человека, которое зависит от индивидуальных особенностей организма и варьирует от 1.5 до 2.0 (Dressman, 1998). Изучение экстракции пектиновых полисахаридов в гастральной среде проводили на широко употребляемых в пищу в необработанном виде овощах и фруктах таких, как лук репчатый, перец болгарский, капуста белокочанная, томаты, сельдерей черешковый, сельдерей корневой, морковь, редька зеленая, чеснок, яблоки, виноград зеленый (сорт Тайфи), виноград синий (сорт Виктория), слива домашняя. Было проведено детальное исследование структуры пектинов лука, перца, сельдерея и сливы, обладающих иммуномодулирующей и противовоспалительной активностью (Ovodova et al., 2009; Popov et al., 2011; Golovchenko et al., 2012). Структурно-химическая характеристика пектиновых полисахаридов лука репчатого Allium cepa. Из луковиц лука репчатого в условиях гастральной среды in vitro была получена фракция АС, ингибирующая всасываемость в ЖКТ пищевого аллергена (Golovchenko et al., 2012). Методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе установлено, что фракция АС состоит из трех пектиновых полисахаридов: АС-1, элюирующегося 0.01 M раствором NaCl; АС-2, элюирующегося 0.1 M раствором NaCl; и АС-3, элюирующегося 0.2 M раствором NaCl (Табл. 10). 26 Для контрольного выделения и определения общего содержания пектиновых полисахаридов в клеточных стенках лука была использована последовательная экстракция водой и 0.7 % водным раствором оксалата аммония, в результате которой были получены фракции: AC-W и AC-O соответственно. Фракции AC-W и AC-1, AC-O и AC-3 характеризуются близким содержанием остатков галактуроновой кислоты, однако различаются содержанием остатков нейтральных моносахаридов (Табл. 10). Структура полисахаридов AC, AC-1, AC-3 исследована методом спектроскопии ЯМР. 1Н и 13С ЯМР-спектры были расшифрованы с использованием двумерных 1H/1H COSY, TOCSY, ROESY и 1H/13C HSQC, HMBC спектров. Таблица 10. Химическая характеристика пектиновых фракций лука Выход, Mw, Mn, GalA3 Gal3 Ara 3 Rha3 Xyl3 Glc3 Белок3 Mw/Mn % кДа кДа AC 0.31 42.0 28.3 2.8 2.1 0.6 0.7 23.0 559 41 13.6 2 AC-1 28.2 29.0 53.3 2.9 3.5 1.1 0.6 6.6 718 60 12.0 2 AC-2 13.0 40.0 41.0 5.3 4.0 0.6 5.6 5.6 317 59 5.4 2 AC-3 36.0 71.0 17.2 1.8 1.7 0.8 0.4 6.6 113 26 4.3 1 AC-W 0.1 27.2 33.8 8.6 0.7 1.5 2.4 25.0 777 544 1.4 1 AC-O 2.3 68.4 18.2 1.8 0.6 0.3 1.0 9.1 495 142 3.5 1 – выход от массы воздушно-сухого растительного материала; – выход от массы полисахаридной фракции AC; 3 – весовые проценты %. 2 В 1Н/13С HSQC-спектрах фракций AC, AC-1, AC-3 наиболее интенсивные транс-гликозильные корреляционные пики принадлежат атомам углерода и протонам 1,4-связанных остатков -D-Galp (G), 1,5-связанных остатков -L-Araf (Ara) и терминальных остатков -D-Galp (Gt). В спектрах фракций AC и AC-1 присутствуют транс-гликозильные корреляционные пики различной интенсивности атомов углерода и протонов остатков -D-Galp (G’) и -D-Galp, замещенных по С4-положению, расположенные на восстанавливающих концах углеводных цепей, которые свидетельствуют о присутствии во фракциях AC и AC-1 галактана. (Рис. 7). В спектрах фракций AC и AC-3 присутствуют интенсивные транс-гликозильные корреляционные пики атомов углерода и протонов 1,4-связанных остатков -D-GapA (GA) и 1,3-связанных остатков -D-Galp (G”), которые не были идентифицированы во фракциях AC и AC-1. На наличие остатков 1,3--D-Galp указывает положение сигнала С3 ( 81.5 м.д.) в слабом поле, отличное от его положения в терминальных и 1,4-связанных остатках -D-Gal. Положение сигналов других атомов углерода и протонов 1,3-связанных остатков -D-галактопиранозы были определены из гетероядерных 1H/13C HSQC (Рис. 8, б и в) и гомоядерных TOCSY, COSY спектров и представлены в табл. 11. 27 Рис. 7. 1Н/13С HSQC спектр пектиновой фракции AC-1. Рис. 8. 13C ЯМР-спектр пектиновой фракции AC-3. 28 Таблица 11. Химические сдвиги сигналов в 1H и 13С ЯМР-спектрах пектиновой фракции AC-3 Остаток →4)-α-D-GalpA-(1→ (GA) →2)-α-L-Rhap-(1→ (Rha) β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp (Gt) β-D-Galp-(1→6)-β-D-Galp (Gt’) →4)-β-D-Galp-(1→4 (G) →3)-β-D-Galp-(1→ (G”) α-L-Araf-(1→ (Arat) →5)-α-L-Araf-(1→ (Ara) Химические сдвиги, м.д. (C ацетон 31.45 м.д.; H ацетон 2.23 м.д.) C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 H-1 H-2 H-3 H-4 H-5; H5’ H-6; H6’ 100.5 69.7 70.3 79.5 72.6 176.1 5.09; 5.05 3.75 3.98 4.42 4.78 100.0 77.8 70.0 73.4 71.2 18.0 5.25 4.11 3.85 3.40 3.76 1.24 105.8 73.4 74.2 70.3 76.6 62.2 4.63 3.62 3.66 3.89 3.68 3.81; 370 105.0 72.2 74.2 70.3 76.6 62.2 4.44 3.54 3.66 3.89 3.68 3.81; 3.79 105.6 73.3 74.6 78.9 75.7 62.0 4.63 3.68 3.77 4.17 3.72 3.81; 3.79 104.3 72.6 81.5 69.8 76.6 62.0 4.51 3.77 3.73 4.14 3.68 3.85; 3.80 110.7 82.8 78.1 85.4 62.8 5.24 4.21 3.96 4.13 3.82, 3.71 108.7 82.1 78.0 83.6 68.2 5.09 4.13 4.00 4.21 3.88; 3.80 В результате показано, что, как в большинстве пектинов, главными структурными элементами пектина лука, экстрагирующегося в гастральной среде in vitro, являются следующие структурные элементы: линейный галактуронан ... 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 4-GalpA-1 4-D-GalpA-1 ... n рамногалактуронан-I ... 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 2-L-Rhap-1 4-D-GalpA-1 4-D-GalpA-1 n 4 содержащий боковые цепи: 5-L-Araf-1 5-L-Araf-1 n 2-L-Rhap-1 4-D-GalpA-1 n 4 ... боковые цепи боковые цепи L-Araf-1 4-D-Galp-1 4-D-Galp-1 n .... 3-D-Galp-1 3-D-Galp-1 n .... D-Galp-1 ... D-Galp-1 и короткоцепочечный галактан: D-Galp-1 4-D-Galp-1 4-D-Galp-1 n 4-D-GalpOH Пониженное содержание остатков Araf и наличие галактана с короткими углеводными цепями во фракциях АС и AC-1, пониженные 29 значения молекулярных масс и повышенные значения полидисперсности фракций AC-1 и AC-3 в сравнении с фракциями AC-W и AC-O, свидетельствуют о деструкции углеводных цепей пектиновых полисахаридов в процессе экстракции в гастральной среде in vitro. В пектине плодов сливы также имеет место гидролиз боковых цепей, состоящих из 1,4-связанных остатков галактозы, и образование короткоцепочечного галактана в гастральной среде in vitro. В растворимых пектиновых полисахаридах сельдерея черешкового и корневого в процессе экстракции в гастральной среде in vitro наблюдается деструкция углеводных цепей, которая сопровождается снижением содержания остатков Araf и Galp. Однако было установлено, что пектиновые полисахариды перца в процессе экстракции в гастральной среде in vitro не подвергаются деструкции. Это, вероятно, связано с тем, что углеводные цепи пектиновых полисахаридов, экстрагирующихся в гастральной среде in vitro из клеточных стенок перца, практически не содержат RG-I и представлены главным образом 1,4--D-галактуронаном с частично метилэтерифицированными и в меньшей степени ацетилированными по С3-положению остатками GalpA (Рис. 9). Рис. 9. 13С ЯМР-спектр пектинового полисахарида перца. Полученные результаты свидетельствуют о том, что углеводные цепи пектиновых полисахаридов при экстракции в гастральной среде in vitro подвергаются деструкции, степень которой определяется строением их углеводных цепей. 30 Влияние пепсина, протеолитического фермента желудочного сока, на количество белка, соэкстрагирующегося с пектинами из овощей и фруктов в условиях гастральной среды В ходе структурно-химических исследований пектиновых полисахаридов, экстрагируемых в гастральной среде in vitro, установлено, что совместно с пектинами из клеточных стенок всех исследованных овощей и фруктов экстрагируется белок, содержание которого во фракциях составляет от 1.4 % (фракция МD из яблок) до 68.4 % (фракция AS из чеснока). Cоэкстрагирующийся с пектинами белок вносит определенный вклад в физиологическую активность (Борисенков и др., 2011; Челпанова и др., 2012). Поэтому для определения влияния пепсина, протеолитического фермента, секретируемого в желудке, на количество соэкстрагирующегося белка использовали экстрагирующие растворы, имитирующие желудочный сок и включающие одинаковое количество солей и соляной кислоты, но различающиеся концентрацией пепсина от 0 до 0.5 г/л. В результате показано, что добавление пепсина в экстрагирующий раствор в концентрации 0.25 г/л приводит к снижению количества соэкстрагирующегося белка во всех фракциях. Увеличение концентрации пепсина до 0.5 г/л существенно снижает концентрацию белка только во фракции ВО, экстрагируемой из капусты (Рис. 10). 68.4 содержание белка, % 70 60 0 г/л 0.25 г/л 50 0.50 г/л 35.4 40 33.5 30 24.5 28.5 26.8 27.2 24.3 23.3 21.4 20.9 20.1 21.2 20 14.6 14.9 15.4 10.8 10 3.8 14.6 12.1 13.6 13.2 15.5 7.6 7.5 3.4 5.9 4.6 6.4 3.6 14.8 7.7 5.9 6.4 4.7 2.5 1.4 1.7 1.3 0 AC ВО СА DS AS RSZ AG AGS LE MD VVv VVt PD Рис. 10. Влияние концентрации пепсина в растворе, имитирующем желудочный сок, на количество соэкстрагирующегося с пектинами белка. На рисунке представлены полисахаридные фракции: AC из лука, BO из капусты, CA из перца, DS из моркови, AS из чеснока, RSZ из редьки, AG из сельдерея корневого, AGS из сельдерея черешкового, LE из томатов, MD из яблок, VVv из винограда (сорт Виктория), VVt из винограда (сорт Тайфи), PD из сливы. 31 Исследование аминокислотного состава выявило, что белки всех фракций характеризуются близким аминокислотным составом с преобладанием остатков аспарагиновой и глютаминовой кислот. Следовательно, различия в гидролизе пептидных связей не могут быть связаны со специфичностью пепсина, и, по-видимому, обусловлены наличием пространственных затруднений для расщепления ферментом пептидных связей, как это было показано ранее методом атомно-силовой микроскопии при исследовании свекловичного пектина (Kirby et al., 2008). Авторами показано, что часть экстрагируемых пектиновых полисахаридов связана с белковой составляющей и представляет собой пектин-белковые комплексы с различными надмолекулярными структурами, в которых белок имеет форму клубка, а молекула пектина одним концом прикреплена к нему или закручена (плотно или свободно) вокруг белка. Таким образом, опираясь на эти данные, можно предположить, что во фракциях, в которых увеличение концентрации пепсина не приводит к снижению количества соэкстрагирующегося белка, пектиновая макромолекула связана с белком и создает пространственные затруднения для расщепления пепсином пептидных связей. Таким образом, было установлено, что в условиях гастральной среды in vitro из овощей и фруктов совместно с пектиновыми полисахаридами экстрагируются кислые белки с остатками аспарагиновой и глютаминовой кислот в качестве главных компонентов, при этом часть соэкстрагирующегося белка связана с пектиновыми макромолекулами. Структурная модификация в гастральной среде in vitro пектиновых полисахаридов Для изучения деструкции пектинов в условиях гастральной среды, физиологически активные пектиновые полисахариды с различным строением углеводных цепей: бергенан ВС, пектин бадана толстолистного, содержащий линейный метилэтерифицированный галактуронан в качестве главного и RG-I в качестве минорного компонента; гераклеуман HS, пектин борщевика Сосновского, углеводная цепь которого представлена низкометилэтерифицированным галактуронаном; комаруман СР, линейная область которого представлена галактуронаном, а разветвленная – RG-I и галактуронаном; лемнан LM, с галактуронаном в линейной и апиогалактуронаном в разветвленной области, – обрабатывали раствором, имитирующим желудочный сок, при 37 °С. В процессе обработки пектинов варьировали время (0.5, 2, и 4 ч) как один из важных параметров пищеварения. В результате установлено, что в условиях гастральной среды in vitro происходит деструкция углеводных цепей пектинов, которая определяется структурой пектиновых полисахаридов: наименьшему гидролитическому разрушению подвергаются углеводные цепи пектинов с незначительными разветвленными областями (НS и BC), наибольшему – пектины, содержащие разветвленные области (CP и LM). При этом для всех 32 пектинов степень деструкции увеличивается с увеличением времени обработки (Табл. 12). Методом ВЭЖХ показано, что при обработке пектинов в гастральной среде in vitro снижается величина их средневесовой и среднечисловой молекулярной массы. Молекулярная масса всех пектинов, за исключением лемнана LM, значительно уменьшается в первые полчаса обработки. Молекулярная масса лемнана LM снижается равномерно в течение всего времени обработки, что, вероятно, обусловлено наличием в составе его макромолекулы апиогалактуронана, который существенно отличает его от других исследованных пектинов. В углеводных цепях всех исследованных пектинов с увеличением времени обработки снижается содержание остатков нейтральных моносахаридов (Табл. 12). Таблица 12. Характеристика пектинов, обработанных в условиях искусственной гастральной среды Время Содержание, %2 Выход, пс обработки, %1 GalA Gal Ara Rha Api Xyl ч 0 85.0 1.9 3.4 1.8 0.3 0.5 93 89.5 2.1 2.0 1.3 0.0 ВС 2 90 90.2 1.9 2.0 1.1 0.0 4 88 91.5 1.6 3.4 0.9 0.0 0 85.2 4.2 4.0 2.4 0.5 0.5 96 86.0 3.4 3.4 1.6 0.1 HS 2 93 89.0 2.9 2.0 1.4 0.0 4 90 90.2 2.7 2.1 1.1 0.0 0 64.0 11.3 6.0 11.8 0.0 0.5 89 77.0 8.4 5.0 6.1 0.0 СР 2 87 85.0 3.6 2.3 3.4 0.0 4 84 89.0 3.2 2.7 2.0 0.0 0 62.0 3.6 3.5 2.5 20.2 3.7 0.5 87 72.0 4.1 3.0 3.0 12.6 3.2 LM 2 80 77.0 3.1 2.0 3.1 10.7 2.7 4 78 80.0 2.0 1.9 3.3 8.0 2.0 1 Mw, Mn, Glc белок кДа кДа 1.3 1.0 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.2 2.1 0.4 0.7 0.6 1.0 0.0 0.0 0.0 2.1 0.9 0.5 0.8 2.4 1.6 1.4 1.1 4.5 2.0 3.9 1.4 1.5 1.4 0.6 0.4 680 477 397 380 431 266 230 233 542 287 273 254 281 235 208 157 86 73 66 59 38 35 26 31 87 56 29 25 34 36 35 27 – выход от массы навески полисахарида; 2– весовые проценты. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что углеводные цепи пектиновых полисахаридов в условиях гастральной среды подвергаются деструкции, степень которой определяется структурными особенностями строения их макромолекул, а именно: большей деструкции подвергаются молекулы пектинов, в состав углеводных цепей которых входят разветвленные участки с боковыми цепями, образованными остатками нейтральных моносахаридов. Способность пектиновых макромолекул расщепляться в условиях гастральной среды следует учитывать при исследовании физиологической активности, особенно при выявлении структурных элементов пектиновых макромолекул, определяющих их активность. 33 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В рамках проведенного исследования установлено, что пектиновые полисахариды отличаются разнообразием входящих в их состав структурных элементов. Однако подавляющее большинство синтезируемых в клеточных стенках растений пектиновых полисахаридов содержит в качестве главного структурного компонента 1,4--D-галактуронан в линейной области и в разветвленной RG-I с боковыми цепями, образованными остатками арабинозы и галактозы. Для отдельных исследованных пектинов показано наличие ковалентной связи между остатками арабинозы, галактозы боковых цепей и остатками рамнозы главной углеводной цепи в RG-I. В тоже время присутствие 2,4-замещенных остатков рамнозы в углеводных цепях всех исследованных пектинов и невозможность разделения кислых и нейтральных полисахаридов ионообменной хроматографией указывают на то, что арабинананы, галактаны и арабиногалактаны являются боковыми цепями пектиновых макромолекул. Кроме того, полученные данные не подтверждают существующее в настоящее время предположения об абсолютной линейности галактуронана, образующего кор пектинов. Установлено, что углеводные цепи галактуронана наряду с линейными участками имеют разветвления. Наличие разветвлений в галактуронановом коре пектиновых полисахаридов свидетельствует о необходимости дальнейшего выявления новых элементов структуры их макромолекул. По-видимому, закономерности построения углеводных цепей пектинов рано считать до конца установленными. Сложность исследования структуры пектинов обусловлена не только нерегулярностью построения их макромолекул, но и трудностями выделения пектинов из растительного материала в нативном виде, а также влиянием факторов окружающей среды на структуру синтезируемых пектинов. Это затрудняет выяснение взаимосвязи между структурой пектинов и их биологическими функциями и физиологическим действием. Выявлено, что климатические факторы окружающей среды, в частности систематический недостаток влаги, не оказывают влияния на моносахаридный состав полисахаридов. Пектиновые полисахариды растений одного рода, произрастающих в различных климатических условиях, характеризуются близким моносахаридным составом. В то же время показано изменение моносахаридного состава пектиновых полисахаридов под влиянием техногенных загрязнений, что может быть обусловлено активизацией защитных процессов в клеточных стенках растений, направленных на изменение структуры пектиновых макромолекул. Это свидетельствует о выполнении пектинами важной регуляторной функции в растительной клетке, в которой пектиновые полисахариды являются лабильным звеном клеточной стенки и участвуют в ее адаптативной перестройке. Модификация структуры пектинов направлена на повышение резистентности клетки к стрессорному воздействию. 34 Выяснение структуры пектиновых полисахаридов является актуальной задачей не только для определения их биологических функций в растениях, но и для выявления взаимосвязи структуры и физиологической активности пектинов. Пектиновые полисахариды, являясь компонентами растительной клеточной стенки, поступают в организм человека перорально в составе пищевых волокон и прежде, чем реализовать свое физиологическое действие, подвергаются воздействию секретов желудочно-кишечного тракта. Показано, что пектиновые полисахариды экстрагируются из пищевых волокон в условиях гастральной среды и могут оказывать физиологическое действие не только как компоненты пищевых волокон, но и как изолированные макромолекулы. При этом экстрагируются как пектины, не связанные с клеточной стенкой, так и пектиновые полисахариды протопектинового комплекса. В условиях гастральной среды совместно с пектиновыми полисахаридами экстрагируются кислые белки, содержащие остатки аспарагиновой и глютаминовой кислот в качестве главных компонентов. Часть соэкстрагирующегося белка связана с пектиновыми макромолекулами, которые, вероятно, препятствуют протеолитическому расщеплению пептидных связей. Вопреки общепринятым представлениям показано, что пектины в условиях гастральной среды подвергаются деструкции, степень которой определяется строением их углеводных цепей. Пектиновые макромолекулы, включающие в свой состав значительные участки галактуронана, подвергаются деструкции в меньшей степени. Увеличение времени обработки приводит к повышению деструкции углеводных цепей пектинов. Структурные изменения пектиновых полисахаридов в условиях гастральной среды и при стрессорном воздействии на растительную клетку, следует учитывать при определении молекулярного механизма их физиологического и биологического действия, особенно при выявлении взаимосвязи структуры и физиологической активности. ВЫВОДЫ 1. Показано, что в состав клеточных стенок большинства растений европейского Севера России и Монголии входят пектиновые полисахариды, характеризующиеся преимущественным содержанием линейного 1,4--D-галактуронана с частично метилэтерифицированными остатками галактуроновой кислоты и рамногалактуронана-I с боковыми цепями, образованными остатками арабинозы и галактозы. 2. Выявлено, что углеводная цепь комарумана, пектина сабельника болотного Comarum palustre L., в разветвленной области наряду с рамногалактуронаном-I содержит участки разветвленного галактуронана, в котором главная и боковые углеводные цепи образованы 1,4-связанными остатками -D-галактопиранозилуроновой кислоты. Боковые цепи в разветвленных участках галактуронана присоединены к остаткам 35 галактуроновой кислоты его главной углеводной цепи в С2- или С3-положения и одновременно в С2- и С3-положения. 3. Найдено, что в растениях одного вида, а также в растениях разных видов одного рода, независимо от климатических условий их произрастания, синтезируются близкие по моносахаридному составу пектиновые полисахариды. 4. Выявлено, что систематический недостаток влаги в период роста растений вызывает снижение содержания пектиновых полисахаридов в клеточных стенках, не оказывая влияния на их моносахаридный состав. 5. В клеточных стенках ряски при произрастании в зоне техногенных загрязнений снижается содержание лемнана, сопровождающееся увеличением в его углеводных цепях количества остатков ксилозы и снижением содержания остатков апиозы. 6. Показано, что в искусственной гастральной среде из овощей и фруктов экстрагируются главным образом растворимые пектины, не связанные с компонентами клеточной стенки, и частично пектиновые полисахариды протопектинового комплекса. 7. Установлено, что в искусственной гастральной среде углеводные цепи пектиновых полисахаридов подвергаются деструкции, степень которой определяется их строением: меньшему расщеплению подвержены пектины, содержащие значительные участки галактуронана. Деструкция углеводных цепей пектинов повышается с увеличением времени их инкубирования в гастральной среде. 8. Совместно с пектинами из овощей и фруктов экстрагируются кислые белки, часть которых связана с пектиновыми макромолекулами. Остатки аспарагиновой и глютаминовой кислот являются главными компонентами соэкстрагирующегося белка. 9. Предложена концепция формирования разнообразия структур пектиновых макромолекул, согласно которой пектиновые полисахариды участвуют в адаптативной перестройке растительной клетки, повышая ее резистентность к воздействию техногенных факторов окружающей среды. 36 ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Монография Оводов Ю.С., Головченко В.В., Гюнтер Е.А., Попов С.В. Пектиновые вещества растений европейского Севера России. – Екатеринбург: УрО РАН, 2009 – 105 с. Статьи в рецензируемых журналах 1. Оводова Р.Г., Головченко В.В., Попов С.В. Выделение и химическая характеристика полисахаридов (вибурнанов) из шрота ягод калины обыкновенной Viburnum opulus // Химия раст. сырья. 1999. № 1. С. 53-57. 2. Оводова Р.Г, Головченко В.В., Попов С.В., Шашков А.С., Оводов Ю.С. Выделение и предварительное исследование строения и физиологической активности водорастворимых полисахаридов из шрота ягод калины обыкновенной Viburnum opulus // Биоорган. химия. 2000. Т. 26, № 1. С. 61-67. 3. Оводова Р.Г., Головченко В.В., Шашков А.С., Попов С.В., Оводов Ю.С. Структурное исследование и физиологическая активность лемнана, пектина из Lemna minor // Биоорган. химия. 2000. Т. 26, № 10. С. 743-751. 4. Golovchenko V.V., Ovodova R.G., Shashkov A.S., Ovodov Yu.S. Structural studies of the pectic polysaccharide from duckweed Lemna minor L. // Phytochemistry. 2002. Vol. 60. P. 89-97. 5. Хасина Э.И., Сгребнева М.Н., Головченко В.В., Оводова Р.Г. Гастропротективное действие лемнана – пектинового полисахарида, выделенного из ряски малой Lemna minor L. // Докл. АН. 2003. Т. 390, № 3. С. 413-415. 6. Popov S.V., Popova G.Yu., Nikolaeva S.Yu., Golovchenko V.V., Ovodova R.G. Immunostimulating activity of pectic polysaccharide from Bergenia crassifolia (L.) Fritsch. // Phytotherapy Res. 2005. Vol. 19, N 12. P. 1052-1056. 7. Оводова Р.Г., Попов С.В., Бушнева О.А., Головченко В.В., Чижов А.О., Клинов Д.В., Оводов Ю.С. Разветвление галактуронанового кора макромолекулы комарумана, пектина сабельника болотного Comarum palustre L. // Биохимия. 2006. Т. 71, № 5. С. 666-671. 8. Popov S.V., Golovchenko V.V., Ovodova R.G., Smirnov V.V., Popova G.Yu., Ovodov Yu.S. Characterisation of the oral adjuvant effect of lemnan, a pectic polysaccharide of Lemna minor L. // Vaccine. 2006. Vol. 24, N 26. P. 5413-5419. 9. Головченко В.В., Оводова Р.Г., Бушнева О.А., Шашков А.С., Чижов А.О., Оводов Ю.С. Структурное исследование бергенана, пектина из бадана толстолистного Bergenia crassifolia // Биоорган. химия. 2007. Т. 33, № 1. С. 53-54. 10. Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., Оводова Р.Г., Головченко В.В., Зайцева О.О., Соломина О.Н., Степанова Е.С., Оводов Ю.С. Криозащитное действие лемнана, пектина ряски малой // Физиология. 2008. Т. 421, № 4. С. 559-561. 37 11. Khasina E.I., Sgrebneva M.N., Ovodova R.G., Golovchenko V.V., Ovodov Yu.S. Gastroprotective еffect of lemnan, a pectic polysaccharide from Lemna minor L. // Phytopharmacology and Therapeutic Values II In Recent Progress in Medicinal Plants. 2008. Vol. 20. P. 181-188. 12. Ovodova R.G., Golovchenko V.V., Popov S.V., Popova G.Yu., Paderin N.M., Shashkov A.S., Ovodov Yu.S. Chemical composition and anti-inflammatory activity of pectic polysaccharide isolated from celery stalks // Food Chem. 2009. Vol. 114. P. 610-615. 13. Khramova D.S., Popov S.V., Golovchenko V.V., Vityazev F.V., Paderin N.M., Ovodov Yu.S. Abrogation of the oral tolerance to ovalbumin in mice by citrus pectin // Nutrition. 2009. Vol. 25. P. 226-232. 14. Оводова Р.Г., Головченко В.В., Попов С.В., Оводова Ю.С., Новейшие сведения о пектиновых полисахаридах // Изв. Коми НЦ УрО РАН. 2010. № 3. С. 25-30. 15. Belska N.V., Guriev A.M., Danilets M.G., Trophimova E.S., Uchasova E.G., Ligatcheva A.A., Belousov M.V., Agaphonov V.I., Golovchenko V.V., Yusubov M.S., Belsky Y.P. Water-soluble polysaccharide obtained from Acorus calamus L. classically activates macrophages and stimulates Th1 response // Intern. Immunopharmacol. 2010. Vol. 10. P. 933-942. 16. Соломина О.Н., Сведенцов Е.П., Зайцева О.О., Полежаева Т.В., Оводова Р.Г., Головченко В.В., Лаптев Д.С., Худяков А.Н., Степанова Е.С., Оводов Ю.С. Крипротекторные свойства ряда пектинов // Докл. АН. 2010. Т. 430, № 4. C. 559-561. 17. Khramova D.S., Golovchenko V.V., Shashkov A.S., Otgonbayar D., Chimidsogzol A., Ovodov Yu.S. Chemical composition and immunomodulatory activity of a pectic polysaccharide from the ground thistle Cirsium esculentum Siev. // Food Chem. 2011. Vol. 126. P. 870-877. 18. Popov S.V., Ovodova R.G., Golovchenko V.V., Popova G.Yu., Viatyasev F.V., Shashkov A.S., Ovodov Y.S. Chemical composition and anti-inflammatory activity of a pectic polysaccharide isolated from sweet pepper using a simulated gastric medium // Food Chem. 2011. Vol. 124. P. 309-315. 19. Borisenkov M.F., Bakutova L.A., Latkin D.S., Golovchenko V.V., Viatyasev F.V. Interaction of microbial -glucoronidase with vegetable pectins // J. Agric. Food Chem. 2011. Vol. 59. P. 9922-9926. 20. Борисенков М.Ф., Головченко В.В., Витязев Ф.В. Адсорбция эстрогенов in vitro на фракциях пектиновых веществ перца сладкого и капусты белокочанной // Химия раст. сырья. 2011. № 3. С. 53-58. 21. Golovchenko V.V., Khramova D. S., Ovodova R. G., Shashkov A. S., Ovodov Yu. S. Structure of pectic polysaccharides isolated from onion Allium cepa L. using a simulated gastric medium and their effect on intestinal absorption // Food Chem. 2012. Vol. 134. Р. 1813-1822. 22. Golovchenko V.V., Khramova D. S., Shashkov A. S., Dorjgoo Otgonbayar, Aria Chimidsogzol, Ovodov Yu. S. Structural characterisation of the polysaccharides from endemic Mongolian desert plants and their effect on the intestinal absorption of ovalbumin // Carbohydr. Res. 2012. Vol. 356. P. 265-272. 38 Патенты 1. Пат. 2149642 Российская Федерация. Способ получения из растительного сырья полисахаридов, обладающих иммуностимулирующим действием / Оводова Р.Г., Бушнева О.А., Головченко В.В., Попов С.В., Оводов Ю.С.; заявитель и патентообладатель Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН – № 99117565; заявл. 09.08.1999; опубл. 27.05.2000; Бюл. № 15. 2. Пат. 2190666 Российская Федерация. Способ получения D-апиозы из полисахарида ряски малой Lemna minor L. // Головченко В.В., Оводова Р.Г., Оводов Ю.С., заявитель и патентообладатель Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН – № 2000118498; заявл. 11.07.2000; опубл. 10.10.2002; Бюл. № 28. 3. Пат. 2301524 Российская Федерация. Криоконсервант для лейкоцитов // Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., Оводова Р.Г., Оводов Ю.С., Головченко В.В., Солонина О.Н., Щеглова О.О., Утемов С.В., Костяев А.А., заявитель и патентообладатель Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН – № 20066101031; заявл. 10.01.2006; опубл. 27.06.2007; Бюл. № 18. 4. Пат. 2344829 Российская Федерация. Способ получения из растительного сырья галактуронанов, обладающих противовоспалительным действием / Головченко В.В., Витязев Ф.В., Оводов Ю.С., Оводова Р.Г., Попов С.В., Попова Г.Ю., заявитель и патентообладатель Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН – № 2007147162/15; заявл. 18.12.2007; опубл. 27.01.2009; Бюл. № 3. 39 Благодарности Выполнение данной работы стало возможным благодаря многим людям. В первую очередь, хочу выразить благодарность научному консультанту академику Юрию Семеновичу Оводову за нужный импульс в трудный момент работы, за позитивную критику, справедливые замечания и в то же время его желание дать свободу в воплощении идей. Особо благодарна д.б.н., доценту Сергею Владимировичу Попову за научные консультации и идеи, положенные в основу отдельных этапов работы, рекомендации, высказанные в ходе выполнения и обсуждения работы. Приятно осознаю свой долг перед к.х.н., ст.н.с. Раисе Григорьевне Оводовой, которая помогала мне познать все тонкости исследовательской работы в течение всех лет проведения работы и внесшей неоценимый вклад в мое развитие как личности, так и исследователя. Искренне благодарна к.х.н., доценту Ольге Андреевне Патовой за обсуждение работы и ценные советы. Хочется выразить благодарность всем сотрудникам лаборатории гликологии и отдельную благодарность Федору Васильевичу Витязеву за всестороннюю поддержку и помощь на всех этапах выполнения работы. Высоко ценю комментарии к работе, оказанную неоценимую помощь и моральную поддержку к.б.н. Дарьи Сергеевны Храмовой. Огромная благодарность д.х.н. Александру Степановичу Шашкову за исследование образцов полисахаридов методом спектроскопии ЯМР, помощь в их интерпретации и ценные советы, к.х.н. Марии Ивановне Билан за подготовку образцов для исследования их спектроскопией ЯМР, к.х.н. Александру Олеговичу Чижову за помощь в исследовании метилированных сахаров методом ГЖХ-МС, к.б.н. Елене Сергеевне Белых за любезно предоставленные образцы ряски, к.б.н. Николаю Юрьевичу Селиванову за анализ аминокислотного состава входящих в состав полисахаридных фракций белков. Выражаю благодарность всему коллективу Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии, который создавал замечательную научную атмосферу, в которой было легко и приятно работать.
