Лекции 7-12 - Кафедра оптики и биофотоники
advertisement
Доцент кафедры оптики и биофотоники СГУ, СГУ канд. физ.-мат. наук Генина Э.А. Физические методы исследования макромолекул и б биологических объектов б Лекции 7-12 Лекция №7 3.4. Лазерный мониторинг скорости кровотока и лимфотока 2 3.4.1. Движение крови и лимфы по сосудам Форменные элементы крови: • эритроциты (красные), • лейкоциты (белые) и • тромбоциты (розовые) http://papa-vlad.narod.ru/photo/chelovek Гематокрит – характеристика крови определяется отношением объема, занимаемого эритроцитами, к объему плазмы крови В норме этот параметр для крови человека равен ~0.4 3 ориентация р ц и деформация в капиллярах радиальная неоднородность http://www.liveinternet.ru/users/ludiko/post139552745/ агрегация р ц http://www.helppatient.ru/haematology/diagnosis/specific_an alyses/erythrocites/ http://900igr.net/kartinki/obg/Kurenie/031-Takvygljadit-TROMB-sgustok-iz-slipshikhsjaeritrotsitov.html 4 Профиль скорости кровотока Фиброзный слой Скользящий слой Ц Центральная р область,, обогащенная эритроцитами Реальный профиль Параболический профиль скорости, характерный для скорости скорости ньютоновской жидкости 5 Размер эритроцитов составляет 5-8 мкм С точки зрения гидродинамики крови, все сосуды можно разделить на четыре группы: 1 1. Микрососуды с диаметром 3-5 мкм 2 Микрососуды 2. Микросос ды с диаметром ди м тром 5-7 5 7 мкм 3 Сосуды 3. С с диаметром от 7 до 12 мкм 4. Сосуды с диаметром, превышающим размер эритроцита (12-150 мкм) 6 Лимфатические микрососуды по сравнению с кровеносными имеют больший диаметр Основным рассеивающим элементом являются лимфоциты Их размер составляет порядка 5 – 12 мкм Лимфатический микрососуд Равномерное распределение лимфоцитов в микрососуде Осевое расположение лимфоцитов в микрососуде 7 3.4.2. Динамическое рассеяние света Принципы доплеровской спектроскопии Рассеяние света от подвижных объектов называется динамическим рассеянием Эффект Доплера определяет сдвиг частоты рассеянного света в соответствие с соотношением: v Δν D = (ν s −ν 0 ) = ν 0 ( cos ϑi − cos ϑs ) c где νs – частота рассеянной волны, волны ν0 – частота падающей волны, волны v – скорость движения рассеивателя, с – скорость света, ϑi - угол между вектором падающего на объект излучения и направлением движения объекта, ϑs - угол между направлением движения объекта и наблюдения рассеянного излучения (3.13) 8 Схема высокоскоростной полнопольной лазерной доплеровской системы визуализации на основе КМОП КМОП-камеры Изображения параметров кровотока кожи пальцев человека 9 Метод лазерной спекл-визуализации полного поля Спеклы представляют собой результат трехмерной интерференции в каждой точки пространства, пространства где встречаются прошедшие или отраженные от оптических неоднородностей волны Динамические спекл-поля формируются в результате интерференции большого числа элементарных волн со случайными фазами, фазами возникающими при отражении когерентного света от движущейся шероховатой ро о атой поверхности о р ности биот биоткани ани и или и при ри его о прохождении через рассеивающую свет биоткань с движущимися рассеивателями 10 Наблюдение спеклов I Лазер x ϕ σh Lc v 11 I Модуляция ду ц интенсивности σI <I> х, t Контраст спеклов определяется как отношение среднеквадратичного значения флуктуации интенсивности к средней интенсивности, К = σI/<I> (3 14) (3.14) 12 Метод «анализа контраста лазерных спеклов» LASCA (Laser Speckle Contrast Analysis) ПЗС-камера Плата захвата изображения Лазер ПК И Исследуемый й объект б 13 3.5. Оптическая томография 14 Томография - послойное восстановление изображений б й путем решения обратной б й математической задачи I объект зондируется проникающим излучением с различных направлений, и прошедшее поле регистрируется, т. е. формируется набор проекций II вся совокупность полученной информации обрабатывается в каком-либо процессоре, т. е. изображение восстанавливается 15 Основные принципы построения томографической системы: • многоканальная система ввода зондирующего излучения в исследуемый объект • несколько источников зондирующего излучения с различными длинами волн • многоканальная система сбора и детектирования рассеянного излучения 16 Направления развития оптической томографии: • томографические системы и алгоритмы диффузионной томографии • методы, основанные на использовании когерентных и поляризационных свойств оптического излучения • проекционная томография • конфокальная и нелинейная й микроскопия 17 3.5.1. Диффузионная ффу оптическая томография Т Томография непрерывного излучения основана на измерениях интенсивности диффузно рассеянного излучения при различных положениях источника р р непрерывного излучения и детектора www.iapras.ru/publication/st/laz.html 18 Достоинство метода – простота р р реализации диагностических у устройств, р не требующих применения быстродействующих источников и приемников излучения, а также высокочастотных н х устройств й обработки б б сигналов н Недостаток метода – диффузионный характер распространения излучения затрудняет получение изображений неоднородностей с приемлемым для медицинской диагностики ди гностики пространственным разрешением и контрастом 19 Мониторинг активности коры головного мозга человека http://www.pulser.kz/?itpub=20061120 20 В импульсной томографии реализуется принцип зондирования рассеивающих сред короткими световыми импульсами у объект исследования диффузный компонент t зондирующий импульс t t баллистический и диффузный ффу компоненты tb ≈ L/c L Схема получения сигналов в импульсном диффузионном томографе 21 Достоинства метода – • при использовании ИК излучения высокая разрешающая способность, способность • возможность детектирования объемных объектов Недостатки метода – Н • необходимость учета различий в задержках при распространении зондирующего импульса по световодам от источника к объекту у и от объекта к фотодетекторам, • интерференция измеряемых сигналов, • отражение от торцов световодов, искажающее детектируемые импульсы • время получения изображения объекта 10 10-30 30 мин 22 Оптическая маммография 23 Модуляционная томография основана на использовании СВЧ-модулированного зондирующего излучения и анализе амплитудночастотных или амплитудно-фазовых амплитудно фазовых характеристик рассеянного излучения для различных положений источника и приемника относительно объекта 180 180° ко оммутатор 0° ко оммутатор фазор расщепите ель объект исследования диодные лазеры фотоумножители Функциональная схема модуляционного диффузионного томографа 24 Достоинства метода – • высокое пространственное разрешение достигается за счет интерференции волн фотонной плотности от различных источников, • возможность детектирования объемных объектов Недостаток метода – дрейф частоты 25 3.5.2. Оптическая когерентная р томография Оптическая когерентная р томография р ф ((ОКТ)) – новый высокоразрешающий метод получения изображения внутренней микроструктуры биотканей, основанный на интерферометрическом детектировании обратно б рассеянного света ближнего инфракрасного (ИК) диапазона 26 Ф Функциональная схема ОКТ устройства й 27 Время эхо-задержки волны: ΔT = z / v, где ΔT – эхо-задержка, эхо задержка z – расстояние, проходимое эхо-сигналом, v - скорость р р распространения р р световых волн Объединяя боковое сканирование и сканирование по глубине, ОКТ позволяет получить двумерное изображение б в поперечном сечении микроструктуры ткани 28 А - скан В - скан X-Y Z Z 29 3D - изображение 30 Длина когерентности источника излучения определяет аксиальное (продольное) разрешение ОКТ, или р разрешение р по глубине, у и характеризует р р у размер наименьших объектов, различимых на изображении. Продольное разрешение в стандартной н н й ОКТ обычно б н составляет 10 10-15 15 мкм Боковое (поперечное, (поперечное латеральное) разрешение определяется пространственной шириной или размером (фокусировкой) оптического пучка и может составлять от 1 до 20 мкм в перетяжке пучка Глубина зондирования - 1-2 1 2 мм Скорость сканирования - 400 А А–сканов сканов в секунду 31 Достоинства метода – • ОКТ О демонстрирует изобра изображение ение стру структуры туры ткани в той же ориентации, что и гистологический образец, разрезанный перпендикулярно поверхности ткани • двух- и трехмерное изображение может быть получено на живом объекте в реальном времени Недостатки метода – • наличие механического элемента системы – подвижного зеркала опорного плеча • исследование исследов ние поверхностных структур стр кт р 32 Оптический когерентный томограф на основе спектрального интерферометра волоконный р разветвитель СЛД 930 нм спектрометр опорное плечо светоделитель предметное плечо решетка Свирин А.В. и др. РМЖ, http://www.rmj.ru/ зеркало образец Скорость 25 тыс. линейных сканов в секунду, аксиальная разрешающая способность б находится в пределах 3–8 3 8 мкм, поперечная – 10–15 мкм 33 Поляризационно-чувствительная р у ОКТ Поляризационная селекция детектируемого излучения в низкокогерентном поляризационно поляризационночувствительном ОКТ (ПЧОКТ) заключается в формировании ф р р интерференционного рф р сигнала с использованием ко-поляризованной либо кроссполяризованной составляющей Применяется для: • разделении рассеивающих частиц по размерам при построении изображения объекта • измерения оптической анизотропии биоткани в зависимости от глубины сканирования 34 ОКТ (а) и ПЧОКТ (b) изображения артериальной стенки свиньи На ОСТ-скане видны средняя (M) и адвентициальная (A) оболочки кровеносного сосуда и сосуд (V) Запаздывание по фазе π http://www.thorlabs.de/OCT На ПЧОКТ ПЧОКТ-скане скане выделяется адвентициальный слой, состоящий из коллагеновых волокон, двулучепреломление которых вызвано запаздыванием по фазе поляризованных компонент 35 0 Доплеровская ОКТ Объединение принципов ОКТ и лазерной доплеровской диагностики позволяет создать многофункциональные доплеровские ОКТ-системы для анализа и визуализации как морфологических особенностей биотканей, так и гемодинамики в биотканях на различных глубинах Для реализации доплеровской ОКТ необходимы: • • • мощный щ оптический источник для достаточного освещения щ образца за короткое время, быстродействующая сканирующая линия задержки в опорном плече интерферометра, интерферометра чтобы быстро генерировать данные для изображения, соответствующие алгоритмы и математическое обеспечение 36 Серия из последовательных изображений поперечного среза сердца Африканского головастика с наложенными нало енными данными доплеровс доплеровского ого с сканирования анирования http://www.thorlabs.de/OCT синим и красным цветом окрашены потоки, направленные соответственно навстречу и в направлении падающего света 37 3.5.3. Оптическая проекционная томография Оптическая проекционная р томография р ф (ОПТ) основана на регистрации света, прошедшего через образец ПЗС-камера Поворотное устройство Иммерсионая среда Линзы оптической системы www annualreviews org/doi/abs/10 3 140210 www.annualreviews.org/doi/abs/10...3.140210 38 ОПТ может работать в режиме поглощения и эмиссии и позволяет получать у изображения р ф флуоресцирующих у р ру щ и нефлуоресцирующих ф у р ру щ биологических объектов размером от нескольких микрон до сантиметра и толщиной до 15 мм, что невозможно при использовании других оптических методов томографии Эмбрион мыши Darrell А. et al. SPIE Newsroom, 2008, http://spie.org/x31120.xml?ArticleID=x31120 Формирование органов у эмбриона мыши (12-дней) www life pravda com ua www.life.pravda.com.ua 39 Лекция №8 3 6 М 3.6. Микроскопия 40 3.6.1. Оптическая микроскопия www.handsel.ru/business_souvenir/ page18/ Стеклянные линзы (Голландия, XVI-XVII вв). http://newzz.in.ua/ob/1148846038-desyatizobretenij-kotorye-izmenili-mir.html Микроскоп Р. Гука (R. Hooke, 1635-1703) www.eurolab.ru/mikroskop_vidy_mikroskopov Сложный микроскоп (1876) microscope.bioscorp.ru/print/UID_243356.html Современный исследовательский микроскоп 41 Принцип действия микроскопа Принципиальная оптическая схема микроскопа: 12 - осветительная система по Келлеру (1-6), - предметный столик с препаратом (7), - приемная система (8-12), - источник оптического излучения (1) - собирающая б линза (2) - полевая осветительная диафрагма (3), - зеркало (4) - ирисовая р со диафрагма д фр гм (5), (5) - собирающая линза - конденсор (6) - микрообъектив (8) - апертурная диафрагма (9), (9) - полевая диафрагма окуляра (10), - окуляр (11) - глаз (12) 1 2 11 7’ D=2 250 мм Fок 10 Fоб 9 8 Fоб 7 6 5 7’’ 4 3 42 Основные характеристики микроскопа: Видимое увеличение микроскопа равно произведению увеличения микрообъектива у р Гоб и окуляра у р Гок Увеличение микрообъектива: р Δ Г об = f об ((3.14)) Увеличение окуляра: у р 250 Г ок = f ок (3.15) где fоб, fок - их фокусные расстояния, Δ- расстояние между задним фокусом микрообъектива и передним фокусом окуляра 43 Линейное поле зрения зависит от углового поля окуляра 2ω': y' = fок tgω' и увеличения микроскопа Г 500 ⋅ tgω ′ 2y = Г (3.16) Числовая апертура NА=n · sinθ (3.17) где n - показатель преломления среды, в которой находится объект, θ - угол между оптической осью и крайним лучом, попадающим в объектив из фокуса микрообъектива 44 Метод светлого поля Используется для исследования поглощающих объектов: в тех местах, местах где поглощение отсутствует отсутствует, свет проходит без изменения и образует в плоскости изображения светлый фон, а поглощающие участки выглядят темными Контраст в изображении тем лучше, чем больше поглощение Для исследования биологических микрообъектов необходимо использовать предварительное окрашивание специальными красителями р Генина Э.А. и др. Квант. электр., 2011, 41. Кожа свиньи окраска гематоксилином и эозином 45 Метод д темного поля Используется при исследовании сильнорассеивающих микрообъектов малого размера, размера например например, бактерий С Специальная схема освещения объекта: б 1 – конденсор 2- препарат 3- объектив 3 2 1 http://foto.mail.ru/mail/sud-med/44/54.html Костная ткань 46 Метод фазового контраста Используется при исследовании живых микрообъектов: Излучение, прошедшее через клетку разбивается на две сост вляющи : дифр составляющие: дифракционную кционн ю и прямолин прямолинейную йн ю (или нулевую) При регистрации изображения П б происходит интерференция этих двух составляющих поля Если изменить фазу нулевой составляющей на λ/4, то в результате интерференции возникнет контрастная модуляция интенсивности в плос плоскости ости изобра изображения ения 47 Принципиальная р ц схема фазово-контрастного ф р микроскопа в проходящем свете 1 2 3 4 1 – апертурная диафрагма 2 –конденсор 3- препарат 4 – объектив 5 – фазовая пластинка р 6 – изображение 5 6 http://traditio-ru.org/wiki/ Бактерии в обычном и фазово-контрастном фазово контрастном микроскопе 48 Разновидности метода фазового контраста: • Темный (негативный) фазовый контраст • Светлый (позитивный) фазовый контраст • Амплитудный фазовый контраст • Аноптральный контраст http://traditio-ru.org/wiki/ Фазовый конденсор 49 Метод интерференционного контраста И Используется для измерения плотности вещества внутри живой клетки Основан на измерении распределения фазы поля прошедшего через микрообъект В отличие от фазового контраста, в котором оба итерферирующих пучка света проходят через объект, в интерференционном контрасте каждый пучок формируется отдельным оптическим каналом 50 Метод интерференционного контраста 1 4 Сигнальный поток 2 5 3 1 2 1 –конденсор р 2 – среда 3 – объект 4 – объектив 5 – регистратор Опорный поток Оптическое излучение Е, вышедшее из конденсора, делится в точке 1 на два световых потока: E1 = A1 exp ⎡⎣ −ikϕ1 ( x, y ) ⎤⎦ E2 = A2 exp ⎡⎣ +ikϕ2 ( x, y ) ⎦⎤ (3 18) (3.18) где А1 и А2 – амплитуда поля, k = 2π/λ - волновое число φ1 (x, y) = φ2 (x, y) = const 51 Затем оба потока объединяются в точке 2 и направляются по одному пути на регистратор. регистратор Таким образом, образом на регистратор попадает два поля: E1′ = A1 exp ⎡⎣ −ikϕ1′ ( x, y ) ⎦⎤ E2′ = A2 exp p ⎡⎣ +ikϕ2′ ( x, y ) ⎤⎦ где (3.19) ϕ1′ = const, ϕ2′ = var Переменное распределение фазы во втором потоке несет информацию о показателе преломления внутри объекта 52 Интерферограмма эритроцита при настройке интерферометра на полосы равного наклона 53 Поляризационная микроскопия П Применяется для исследования анизотропных сред в поляризованном свете Некоторые биологические объекты обладают свойством двулучепреломления, измерение которого позволяет определять р особенности строения р живых клеток 54 Принципиальная схема поляризационного микроскопа 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 ортоскопическое наблюдение 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 коноскопическое наблюдение 1 поляризатор; 2, 6 – диафрагмы; 3 - конденсор; 4 – препарат; 15 – объектив; 7 – компенсатор; 8 – анализатор; 9 – линза Бертрана; 55 10 - фокальная плоскость окуляра; 11 - окуляр http://sudmedhistology.narod.ru/photoalbum.html Кристаллы оксалатов в биоткани при отравлении этиленгликолем www.nikon-microscope.ru/urine_micro.htm Кристаллы осадка мочи после применения противоракового препарата 56 Флуоресцентная у р (люминесцентная) микроскопия Использует для формирования изображения И б оптическое излучение, возникшее внутри микрообъекта в результате явления фотолюминисценции Механизмы возникновения фотолюминесценции: • Собственное свечение веществ, входящих в состав клетки, которое возникает после возбуждения ее внешним излучением определенной длины волны. волны Это явление называется автофлуоресценцией • Свечение веществ, веществ специально введенных в клетку, клетку под действием внешнего оптического излучения определенной длины волны. Это явление называется вторичной люминесценцией й 57 Гистологический срез (а) и автофлуоресцентное изображение (б) кожи свиньи а б Флуоресцентное изображение меланоцитов человека, окрашенных флуоресцентным красителем Shimizu Т. Journal of Dermatological Science, 2005, 37, 65-73. 58 Флуоресцентный у р ц микроскоп р д должен отвечать следующим требованиям: - освещение препарата должно осуществляться на строго определенной длине волны близкой максимальной длине волны поглощения света флуорофором - микроскоп должен собирать как можно больше света при флуоресценции, ф у р ц ц , при р этом исключая постороннее р излучение у 59 Оптическая схема флуоресцентного микроскопа отличается от обычного наличием двух у светофильтров: ф р - первый находится в осветительной системе и выделяет из всего спектра р источника освещения щ объекта возбуждающее у д щ излучение у требуемой длины волны - второй второй, расположенный после микрообъектива, микрообъектива пропускает только свет флуоресценции, поглощая возбуждающее излучение 60 Изображения, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии Колонии эмбриональных стволовых клеток человека Изображение сотен стволовых клеток человека на разных стадиях дифференцировки в нейроны (клетки(клетки предшественницы - зеленые; дифференцированные нейроны Нейрон с аксоном и тремя р ) красные) дендритными д др отростками; р ; окружающие ру щ клетки - нейральные клетки61 предшественницы http://old.celltranspl.ru/forum/index.php?PHPSESSID=97d7ab1051921735f8130af7ab885287&topic=113.0 Лекция №9 62 3 6 2 Микротомографы 3.6.2. Основная задача – получение информации о пространственном распределении некоторого параметра исследуемого объекта: показателя преломления коэффициента поглощения коэффициента рассеяния распределения флуоресцентных меток и пр. 63 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия Главное достоинство – отсутствие расфокусированной размытой й части изображения, б т.к. единовременно освещается единственная точка в фокальной плоскости, сканирование которой и позволяет сформировать изображение объекта 64 Поперечное разрешение: 0.46λ Δx = NA (3 20) (3.20) Продольное разрешение: Δz = 1.4nλ ( NA ) 2 (3 21) (3.21) где д n – показатель преломления р иммерсионной р жидкости д объектива При NA = 1.2 1 2 линзы объектива с водной иммерсией на длине волны λ = 1064 нм и n = 1.35 Δх = 0.4 0 4 мкм, м м Δz = 1.4 14м мкм м 65 В случае, когда биологические объекты помечены красителями с разными длинами волн поглощения, требуется несколько возбуждающих длин волн. волн В этом случае используется многоканальная система регистрации для одновременной регистрации сигналов флуоресценции в пределах одного образца б Для создания трехмерного массива данных освещающий луч должен двигаться во всех трех пространственных измерениях. Для этого используются сканеры луча, предмета и объектива Математическое обеспечение для обработки изображений позволяет создавать трехмерные изображения, которые можно вращать и оценивать с точки зрения размера и объема внутренних структур в образце 66 Изображения, полученные с помощью конфокальной микроскопии Два изображения эмбриона человека флюоресценция на разных длинах волн (зеленый - хорионический гонадотропин, красный й - молекула адгезии)) Нейросфера, формирующаяся в процессе р ц дифференцировки д фф р ц р стволовых клеток в нейроны Три р нейрона, р полученные у из эмбриональных стволовых клеток 67 http://old.celltranspl.ru/forum/index.php?PHPSESSID=97d7ab1051921735f8130af7ab885287&topic=113.0 Ультрамикроскопия Применяется при исследовании различных дисперсных и коллоидных систем, а также в новых методах оптической томографии биологических тканей Направление освещающего излучения выбирается р д у р направлению р наблюдения д перпендикулярно В основе метода лежит дифракция света на объектах, размер которых меньше половины длины волны 68 Схема лазерного ультрамикроскопа цифровая фотокамера окуляр объектив объектив лазер столик микроскопа регулируемая щелевая цилиндрическая диафрагма фр линза камера с образцом лазер Федосов И.В. и др. Оптика и спектроскопия, 2009, 107, 893-900. http://ourworld.ucoz.ru/news/2007-04-04-885 69 Изображения, полученные с помощью ультрамикроскопии Федосов И.В. и др. Квантовая электроника, 2008, 38, 530-535. Частицы коллоидного золота диаметром 40 нм в пучке лазерного ультрамикроскопического осветителя www.bioimaging.ru/bioimaging_products7_ru.htm b /b d h Плод мыши, выявленный с помощью автофлуоресценции 70 Пространственная разрешающая способность ультрамикроскопа определяется размерами изображений объектов, которые можно считать точечными источниками Изображение точечного источника, источника полученного с помощью дифракционно-ограниченного объектива микроскопа с круглой апертурной диафрагмой, будет иметь вид кружка Эйр с диаметром Эйри ро первого р о о дифракционного фр ц онно о максимума d = 2.44λ ( Г об + 1) f ( (3.22) ) f – относительное отверстие объектива микроскопа Для объектива, дающего изображение предмета на бесконечности, относительное отверстие определяется соотношением ⎤ 1 ⎡⎛ n ⎞ f = ⎢⎜ ⎟ − 1⎥ 2 ⎢⎣⎝ NA ⎠ ⎥⎦ 2 1/ 2 n – показатель преломления среды в пространстве предметов (3.23) 71 Микроскопия селективного планарного освещения Разработана для создания многомерных изображений образцов размером до нескольких миллиметров Основана на освещении объекта интенсивным пучком света, направленным перпендикулярно оси микроскопа В системе комбинируется двухмерное освещение с ортогональными детектирующими камерами 72 Схема микроскопа селективного планарного освещения цифровая видеокамера окуляр объектив лазер цилиндрическая линза телескопическая система объектив камера с образцом Федосов И.В. и др. Оптика и спектроскопия, 2009, 107, 893-900. Huisken J. and Stainier D.Y. R. Development, 2009, 136, 1963-1975. 73 Изображения, полученные с помощью микроскопии селективного планарного освещения Эмбрион рыбки оризии МСПО изображение эмбриона рыбки оризии 74 http://www.bio-pro.de/magazin/thema/00180/index.html?lang=en&artikelid=/artikel/03227/index.html 3.6.3. Нелинейная микроскопия р Появление нелинейной оптики связано с разработкой лазеров, которые могут генерировать свет с большой напряженностью электрического поля, соизмеримой с напряженностью микроскопического поля в атомах Нелинейно оптическая микроскопия находит широкое Нелинейно-оптическая применение при изучении различных биологических явлений и объектов, как правило, в конфокальной геометрии Данный метод диагностики включает в себя такие методики, как многофотонная люминесценция и генерация второй оптической гармоники 75 Многофотонная микроскопия Многофотонное возбуждение молекул – это нелинейный процесс, включающий поглощение молекулами моле улами двух или более фотонов, чья ч я совместная энергия достаточна для переходов молекул в возбужденное состояние Двухфотонный метод использует для визуализации объектов фотоны на длине волны второй гармоники падающего излучения ((например, р р, 350 нм), ), появляющиеся щ точно в фокальной области возбуждающего пучка (700 нм) 76 Схема работы двухфотонного микроскопа ИК лазер Сканирующее зеркало Дихроичный светоделитель д Дихроичный светоделитель ФЭУ Красный фильтр Зеленый фильтр ФЭУ Объектив Флуорофоры Фокальная плоскость http://ru.wikipedia.org 77 http://molbiol.ru/bio/001/002.html Трёхмерные изображения поверхности гранул пыльцы а) мультифотонная сканирующая микроскопия; b) обычная конфокальная сканирующая микроскопия. Преимущества многофотонного микроскопа по сравнению с однофотонным: большая проникающая способность, низкая степень фототоксичности 78 Микроскопия р на основе генерации р второй р гармоники Генерация второй гармоники – нелинейный оптический процесс р Интенсивное поле лазера индуцирует нелинейную поляриз цию второго порядка поляризацию порядк в ансамбле нс мбле высокоупорядоченных не центральносимметричных молекул, молекул в результате чего получается когерентная волна точно на удвоенной частоте (или с половинной длиной волны) падающего света 79 Изображение И обр н коллагеных о н х волокон о о он в коже крысы Преимущества р у ГВГ-микроскопии р перед р методами линейной визуализации: высокое пространственное р р р разрешение р приемлемая во многих случаях глубина зондирования развязка сигнала возбуждения и детектирования отсутствие повреждения живой ткани возможность получения изображений высокоупорядоченных структурных белков без экзогенных меток возможность визуализировать как поверхность, поверхность так и глубокие слои объекта 80 3.7. 3 7 Управление оптическими свойствами биотканей 81 http://liveinternet.ru www.happydoctor.ru загар www.webmd.com/skin-problems-andtreatments/picture-of-sunburn-secondp degree эритема http://uvbnb.ru/publ/vitiligo_lechenie_ufb_311nm_fizik a_processov/11-1-0-121 отек 82 клетка фиброзная ткань http://dic.academic.ru http://muza.inspaceblog.net/?p=124 коллагеновые внутритканевая Показатель преломления фибриллы жидкость (ncol = 1.47 ) (nint = 1.35 ) цитоплазма ncol (n0 = 1.37 ) ns, nnc n0 nint, ядро (nnc = 1.39) органеллы (ns = 1.38–1.41) Закон Гладстона – Дэйла: N n = ∑ ni f i , i =1 ∑f i i =1 (3.24) где ni и fi – соответственно показатель преломления и объемная доля компонентов среды, N – число компонентов 83 Методы у управления р оптическими свойствами биотканей: • Компрессия р ир растяжение • Дегидратация и коагуляция • Оптическая иммерсия • Окрашивание 84 Компрессия р и р растяжение Увеличение прозрачности ткани происходит У за счет увеличения: • оптической однородности, которая достигается удалением крови и внутритканевой жидкости (воды) из области компрессии (или растяжения) • упорядоченности структурных компонентов Поглощение щ биоткани у уменьшается за счет удаления крови 85 Дегидратация Коэффициенты рассеяния и поглощения б биотканей й увеличиваются Полное оптическое пропускание образца ткани увеличивается за счет • уменьшения его толщины • внутреннего выравнивания показателей преломления • увеличения плотности упаковки и упорядоченности волокон 86 Коагуляция Коэффициенты рассеяния и поглощения биотканей увеличиваются Полное пропускание уменьшается, а диффузное отражение увеличивается 87 Оптическая иммерсия Коэффициент рассеяния биотканей уменьшается Полное оптическое пропускание р у образца р ткани увеличивается за счет • дегидратации р тканевых компонентов • частичного замещения внутритканевой жидкости иммерсионным веществом • структурной модификации или диссоциации коллагена 88 • дегидратация тканевых компонентов • частичное замещение внутритканевой жидкости иммерсионным р веществом • структурная модификация или диссоциация коллагена 89 Степень дегидратации С Кинетика дегидратации кожи при испарении и применении гиперосмотических агентов – глицерина и пропиленгликоля Степень дегидратации ткани: M (t = 0) − M 0 H D (t ) = (1 − exp ( −t τ D ) ) M (t = 0) (3.25) глицерин воздух пропиленгликоль t,, часы где М – масса образца ткани (г), M0 – постоянная масса образца (т.е. масса сухого у образца) р ) ((г), ), τD- постоянная времени, характеризующая скорость дегидратации (с) и t – время дегидратации (с). (с) ( Разность между начальной и постоянной массой образца M ( t = 0 ) − M 0 показывает количество воды, воды покинувшей ткань в процессе дегидратации 90 ) • дегидратация тканевых компонентов • частичное замещение внутритканевой й жидкости иммерсионным веществом • структурная ру ур модификация ф или диссоциация коллагена 91 Для двухкомпонентной у модели средний р показатель преломления р ткани n определяется показателями преломления материала их рассеивающих центров ns и базового вещества n0, n = fsns + (1 – fs)n0, (3.26) где fs – зависящая от времени объемная доля рассеивателей в ткани Отношение ns/n0 ≡ m определяет коэффициент рассеяния Выражение для коэффициента рассеяния, полученное для системы невзаимодействующих тонких цилиндров с числом фибрилл на единицу площади ρs записывается в форме: ⎛ π 5a 4 n03 ⎞ 2 ⎤ 2 2⎡ ⎟ − + μ s ≅ ρ s ⎜⎜ ( m 1 ) 1 3 ⎢ ( m 2 + 1) 2 ⎥ ⎟ ⎣ ⎦ ⎝ λ0 ⎠ (3 27) (3.27) где ρs =ffcyl/πa2, fcyl – поверхностная доля цилиндров, цилиндров a – радиус цилиндра, цилиндра λ0 – длина волны в вакууме 92 В качестве первого приближения предполагаем: 1) радиусы рассеивателей (фибрилл) и их плотность не могут значительно измениться под действием химических агентов (т.е. не наблюдается ни набухания, ни сжатия биоткани) 2) абсолютное изменение n0 не очень значительно 3) вариации значения μs вызываются только изменением показателя преломления внутритканевого ( (межфибриллярного) ф бр рно о) пространства ро р н по оо отношению нош н ю к показателю преломления рассеивателей Принимая во внимание, что большинство биотканей имеют m ≈ 1, отношение коэффициентов рассеяния на одной длине волны может быть записана как функция от отношения показателей преломления m: ⎛ m2 − 1 ⎞ ⎟⎟ ⎝ m1 − 1 ⎠ 2 μ s 2 ≅ μ s1 ⎜⎜ При n0 = 1.35 → 1.42 и ns = 1.47 При m = 1 (3.28) μs уменьшится в 7 раз μs → 0 93 Кинетика спектров р отражения р склеры р глаза кролика р и кожи человека in vivo, измеренные на длине волны 700 нм в различные моменты времени после введения 40%-водного 40% водного раствора р створ глюкозы 94 До оптического просветления склеры 700 нм, нм 5 Дж/см2 1.7 Дж/см2 доля поглощенных фотонов = 0.34 После оптического просветления склеры 700 нм, 5 Дж/см2 22Д 2.2 Дж/см /с 2 доля поглощенных фотонов = 0.44 95 • дегидратация тканевых компонентов • частичное замещение внутритканевой у р жидкости иммерсионным веществом • структурная модификация или диссоциация коллагена 96 Изображение биотканей с помощью микроскопии второй гармоники Ин Интактный н й хр хрящ щ Интактная кожа Yeh A.T. et al. J. Invest. Dermatol., 2003, 121, 1332-1335. Хрящ после воздействия глицерина Кожа после воздействия глицерина Wen X. et al. J. Biophoton., 2010, 3, 44-52. 97 Методы изменения поглощающих свойств биоткани • флуоресцентные красители для визуализации http://last24.info/read/2007/10/29/5 • красители с узкой полосой поглощения для фототермолиза • фотоактиваторы для фотодинамической терапии Genina E.A. et al. J. Biomed. Opt., 2002, 7, 471-477. 98 http://www.bio.unn.ru/rus/kbf/Science.htm Лекция №10 4. Ультразвуковые методы исследованиия 99 4 1 Понятие ультразвука 4.1. Ультразвук – это упругие колебания в газах, газах жидкостях и твердых телах, частоты которых превышают 20 0 кГц ц Ультразвуковые волны характеризуются характеризуются: • периодом колебания - временем, за которое молекула у (частица) ( ц ) совершает р одно д полное колебание; • частотой - числом колебаний в единицу времени; • длиной - расстоянием между точками одной фазы; • скоростью р распространения р р р 100 Ультразвуковые колебания при распространении подчиняются д законам геометрической р оптики: • в однородной среде они распространяются прямолинейно р и с постоянной скоростью р • на границе различных сред с неодинаковой акустической плотностью часть лучей отражается, а часть преломляется Импеданс - акустическое сопротивление среды, величина которого зависит от ее плотности и скорости распространения звуковых волн 101 4.2. Ультразвуковое р у исследование (УЗИ) Применение ультразвука с диагностической целью обусловлено его свойством отражаться от границ различных тканей, что позволяет обнаруживать и визуализировать неоднородности исследуемых сред, определять их местонахождение, линейные размеры акустические параметры размеры, и другие физические характеристики www.hottay.ru/e-store/catalog/ 102 Физическая основа УЗИ - пьезоэлектрический эффект При деформации монокристаллов некоторых химических соединений (кварц, титанат бария) под р этих воздействием УЗ волн, на поверхности кристаллов возникают противоположные по знаку электрические заряды - прямой пьезоэлектрический эффект И наоборот, б при подаче на них переменного электрического заряда в кристаллах возникают заряда, механические колебания с излучением у УЗ волн h http://ru.wikipedia.org/wiki/ // k d / k/ Создание электрического напряжения 103 пьезоэлектриком Типичная конструкция стандартного одноэлементного УЗ УЗ-преобразователя преобразователя 1 2 3 4 5 6 7 1 – электрический соединитель 2 – экранированный пластмассовый корпус 3 – элемент настройки 4 – соединение с источником питания 5 – заземляющее соединение 6 – демпфер 7 – пьезоэлектрический элемент заданной формы 8 – согласующий слой 8 104 Принципы формирования эхоизображений внутренней структуры объектов в системах импульсной УЗ локации радиолокация гидролокация http://mixfight.com.ua/ http://solo-project.com/view_electro.php?id=1696 УЗ-локация http://pankotskiy.ru/view_termin.php?id=473 Эхоскопия глаза глаза: 1 – эхосигнал от передней поверхности р р роговицы ц 2, 3, - эхосигналы от передней и задней поверхностей р хрусталика ру 4 – эхосигнал от сетчатки и структур заднего полюса глазного яблока http://glazamed.ru/glaz_bol/6.13.php 106 При р одномерной р эхоскопии (эхографии) р ф определяются р амплитуды и время приема эхосигналов, полученных зондированием исследуемой среды по направлению УЗ луча При этом формируется одномерная эхограмма А-типа Изображение А-типа http://acsys.ru/production/?type_id=16&subtype_id=7&product_id=106 107 При двухмерной эхоскопии (сонографии) УЗ луч сканирует в продольной р или поперечной р к лучу у у плоскостях В первом случает изображение называется поперечным или Втипа, во втором – фронтальным или С С-типа типа Изображение В типа В-типа http://www.sheritel.ru/index.php?page=28 3D изображение 108 Д Доплеровский р метод д УЗИ дает д возможность измерения скорости кровотока Ультразвук посылается через кожу на поток крови и, отражаясь от движущихся эритроцитов, эритроцитов сдвигается по частоте на величину Δν, пропорциональную скорости их движения: v Δν = 2ν 0 cos α c (4.1) где ν0 – частота излучаемого сигнала, v – скорость кровотока, с – скорость ультразвука в мягких тканях, α - угол между направлением излучения ультразвука и вектором скорости кровотока Таким образом, отраженный УЗ луч несет информацию о линейной й й скорости потока крови 109 Дуплексная сонография http://ru.wikipedia.org/wiki/ 110 4D УЗИ – сочетание 3D изображения с регистрацией движения объекта б http://ru.wikipedia.org/wiki/ 111 Преимущества УЗИ УЗИ: • б большая информативность получаемого эхоизображения, связанная с относительно высокой пространственной разрешающей способностью (чем меньше длина волн, тем выше разрешающая способность у ультразвукового р у аппарата. р В системах медицинской ультразвуковой диагностики обычно используют частоты от 2 до 10 МГц. Разрешающая способность б современных ультразвуковых аппаратов достигает 0.5 – 2.5 мм) 112 • высокая чувствительность к изменению физических и ф ф физиологических характеристик р р биологических тканей • способность выделять подвижные структуры в организме и оценивать скоростные характеристики кровотока в сердце и сосудах • безвредность и безболезненность диагностических обследований 113 Недостатки и ограничения УЗИ: • трудность или даже невозможность получения эхоизображений внутренних органов при наличии в них или перед ними газосодер газосодержащих ащих структур стру тур (легкие, кишечник) и структур со значительным затуханием и рассеянием УЗ колебаний (костные ткани)) • недостаточная чувствительность при исследовании некоторых структур, отличающихся малой й акустической контрастностью • сложность реализации высокой разрешающей способности на большой глубине нахождения исследуемых тканей вследствие частотно частотнозависимого характера затухания УЗ колебаний 114 4 3 Оптоакустическая томография 4.3. Л Лазерная оптоакустика – это возбуждение б акустических колебаний под воздействием лазерного излучения Оптоакустические у сигналы возбуждаются у в результате температурного расширения нагретого объема при поглощении импульсного лазерного излучения Условие мгновенного нагрева: длительность лазерных импульсов много меньше, чем время распространения р р р акустической у волны по облучаемому объему 115 Схема генерации и детектирования ОА сигнала Рассеивающая среда Лазерный р пучок у УЗ-детекторы УЗ волна Поглощающий объект 116 Лазерное излучение ближней инфракрасной области б может распространяться глубоко б в биологические ткани и обычно индуцирует акустические волны на ультразвуковых частотах в несколько МГц или ниже Эти ультразвуковые частоты способны распространяться на сантиметровые расстояния с минимальным затуханием и потерями Комбинация импульсного у ближнего инфракрасного фр р излучения с низкими ультразвуковыми частотами позволяет детектировать изображения на глубине ~ 5 см в тканях 117 Видимые лазерные импульсы могут проникать в биологические ткани на глубину 1-2 мм и индуцировать акустические волны на частотах 10 100 МГц Эти высокочастотные акустические волны позволяют точно воспроизводить структуру оптических слоев ткани Высокочастотное ультразвуковое детектирование может быть использовано для построения изображений слоистых структур тканей с высоким разрешением 118 Схема устройства импульсного оптоакустического томографа 119 www ipfran ru www.ipfran.ru ОА-томограмма ОА томограмма фантома с двумя сферическими поглощающими неоднородностями 120 Достоинства методов оптоакустики: • В сравнении р с диагностикой методами стандартной р спектрофотометрии и когерентной оптической томографии, чувствительность фотоакустической (о то к ст ч ской) спектроскопии (оптоакустической) с ктроско ок зы оказывается тс выше • При реализации оптоакустической томографии, достигается более высокая разрешающая способность по сравнению с чисто оптическими методами • Более перспективны р в сравнении р с методами чисто УЗИ 121 Лекция №11 5 Методы исследования 5. макромолекул 122 , 5.1. 1 Диффузия Д Поступательная диффузия – это самопроизвольный процесс. Экспериментально установлено, процесс установлено что, что как только в среде возникает неоднородность по концентрации, р начинается спонтанная диффузия, ффу стремящаяся устранить эту неоднородность Д Диффузия протекает в соответствии с законом Фика Ф 123 S А В x d dx dm Поток растворенного вещества dt , т. е. количество вещества, перемещающегося за время dt перпендикулярно сечению площади S, прямо пропорционален градиенту концентрации: dm dc = − DS dt dx Величина D называется коэффициентом диффузии (5.1) 124 Результирующая у ру сила, действующая у на молекулы, у которые р находятся на границе раздела областей А и В, равна ΔF = PS – (P + ΔP)S = - SΔP (5.2) Р – осмотическое давление Сила, приходящаяся на одну молекулу, есть ΔF S ΔP F= =− cS Δx cS Δx NkT = kTc , откуда ΔP = kTΔc Осмотическое давление P = V kT Δc F =− c Δx N – число Авогадро, k – постоянная Больцмана, T – абсолютная температура, V - объем раствора (5.3) (5.4) 125 Согласно закону Стокса, частицы сферической формы испытывают со стороны р жидкости действие силы трения р В равновесии F' = 6πηav. η F = F', т. е. kT Δc 6πη av = − c Δx (5.5) η - коэффициент вязкости, а – радиус частицы, v – скорость движения частицы и поскольку в соответствии с равенством (5.5) (5 5) vc = Δx Δm Δm 1 kT Δc = ⋅ =− ⋅ Δt ΔV Δt S 6πη a Δx (5.6) то, исходя из закона Фика получим или где f – коэффициент трения Δm Δc = − DS Δt Δx D= kT 6πη a kT D= f (5.7) (5 8) (5.8) 126 • D возрастает с ростом Т, поскольку возрастает числитель • выражения (5.7) (5 7) и уменьшается знаменатель, знаменатель т.к. т к в первом приближении η = Aer/T (коэффициент вязкости уменьшается с увеличением Т) D обратно пропорционален а и, следовательно, М1/3, поскольку 4 3 N π a = MV 3 где М – молекулярная масса; V - молярный парциальный удельный объем Теоретически коэффициент диффузии равен D0 = kT 1/ 3 ⎛ 3MV ⎞ 6πη ⎜ ⎟ ⎝ 4π ⎠ (5.9) а теоретический коэффициент трения 1/ 3 ⎛ 33MV MV ⎞ f 0 = 6πη ⎜ ⎟ ⎝ 4π ⎠ (5.10) 127 В зависимости от реальной формы молекулы значения D и D0, как и f и f0 могут различаться. Для молекул рибонуклеазы, обладающих почти сферической формой, величина D/D0 = f/f0 составляет 1.04, а для вируса табачной мозаики, имеющего вытянутую форму, она равна 3.12 128 П Первый й закон Ф Фика выражает тот факт, что число молекул, диффундирующих за время dt через поверхность площади S в направлении, р перпендикулярном р у р этой поверхности р (поток), ( ) прямо пропорционально S и градиенту концентрации или ∂n ∂c S = − DS ∂t ∂x (5.11) ∂n ∂c = −D ∂t ∂x (5 12) (5.12) 129 S Ф(x) А - Ф(x+dx) В x d dx Изменение потока, проходящего через площадь от точки x к точке x + dx, равно S при переходе ∂Ф ( x ) ∂Ф ( x) ⎡ ⎤ − Ф ( x + dx ) + Ф ( x ) S = − Ф ( x ) − dx + Ф ( x ) S = − Sdx (5.13) [ ] ⎢ ⎥ ∂x ∂x ⎣ ⎦ 130 Но из первого закона Фика следует, что ∂ ⎡ ∂c ⎤ ∂ 2c − ⎢ − D ⎥ Sdx = D 2 Sdx ∂x ⎣ ∂x ⎦ ∂x (5.14) и, таким образом, локальное изменение концентрации в точке равно dc ∂ 2c =D 2 ∂x dt (5.15) Обобщение этого результата на трехмерный случай приводит к следующему уравнению: ∂c = DΔc - второй закон Фика ∂t (5.16) 131 Экспериментальные р методы д исследования д свободной диффузии Метод, основанный на измерении преломления • Показатель преломления разбавленных растворов меняется линейно с концентрацией • Поскольку и с, и dc/dx входят в уравнение диффузии как относительные величины, измерение показателя преломления n или его градиента эквивалентно измерению с или dc/dx соответственно 132 Пучок света, попадая в ту область образца, где имеется градиент показателя преломления, преломления отклоняется на угол, угол пропорциональный величине градиента: dn( x) dα = K dx растворитель f0 f1 f2 f3 f4 падающая плоская волна α выходящая искаженная волна раствор f0,…, f4 – положение фронта распространения пучка α – угол отклонения пучка 133 Схема интерференционной установки Рэлея щелевой источник кювета кювета сравнения с исследуемым раствором F коллиматорная линза C1 C0 P сферическая ф р цилиндрическая ц др линза линза экран р астигматическая система Полученные на экране интерференционные полосы вертикальны в случае, когда обе кюветы С0 и С1 заполнены одной и той же жидкостью В кюветы С0 и С1 наливают соответственно растворитель и раствор. В этом случае совокупность интерференционных полос 134 смещается относительно первоначального положения Флуоресцентный метод Определение коэффициента диффузии флуоресцентных молекул (или молекул, помеченных флуоресцентными маркерами) основано на обесцвечивании флуоресцентных молекул двигающихся в фокальной плоскости светового молекул, пучка Сразу после обесцвечивания измеряется восстановление флуоресценции в обесцвеченной области за счет диффузии туда флуоресцентных молекул из окружающих областей, б й не подвергавшихся фотообесцвечиванию б 135 Интенс сивность флуорессценции Динамика интенсивности флуоресценции при фотообесцвечивании и восстановлении Finitial F(t = ∝) F(t=0) 0 τD Время р Finitial.- начальная флуоресценция τD - характеристическое время диффузии - показывает время, за которое восстанавливается половина первоначальной интенсивности флуоресценции 136 Кривая восстановления флуоресценции на круглом участке с гауссовым профилем интенсивности флуоресценции может быть описана формулой (если начальная интенсивность флуоресценции считается 1): −k n f (t ) = ∑ n =0 n ! n =∞ 1 ⎡ ⎛ 2t ⎞ ⎤ 1 + n ⎢1 + ⎜ ⎟ ⎥ ⎣ ⎝ τ D ⎠⎦ где k – константа обесцвечивания, которая определяется количеством флуоресцентных у р молекул; у τD – характеристическое р р время р обесцвеченных ф диффузии, которое связано с коэффициентом диффузии соотношением τD = ω2 4D где ω определяется как половина ширины гауссова профиля интенсивности лазерного пятна на высоте в e-2 раз меньшей высоты профиля; D – коэффициент диффузии 137 Спектроскопические методы Метод оценки коэффициентов диффузии химического вещества в б биоткани основан на измерении временной й зависимости поглощения биоткани в спектральном диапазоне, соответствующем полосам поглощения данного вещества Транспорт р р низкомолекулярных у р соединений д в биоткани описывается в рамках модели свободной диффузии с помощью второго закона Фика (5.16) 138 Для определения концентрации вещества в биоткани может быть использован метод отражательной спектроскопии с пространственным разрешением Он основывается на модифицированном законе БугераЛамберта-Беера, и в этом случае оптическая плотность ткани А определяется формулой: й A = μ aσρ + G где μ a - коэффициент поглощения; ρ - расстояние между источником и детектором; σ - дифференциальный коэффициент длины пробега фотона, который учитывает удлинение траектории фотона за счет многократного рассеяния; G – константа, определяемая геометрией эксперимента 139 О Оптическа ая плотнос сть (А) 2,5 2,0 , 1,5 1,0 400 без красителя 180 мин взаим одействия с красителем 500 600 700 800 900 1000 λ , нм Проникновение вещества в биоткань увеличивает ее оптическую плотность в том спектральном диапазоне, диапазоне где находятся полосы поглощения вещества 140 Оптическая плотность ткани, измеренная в различные временные интервалы определяется соотношением: интервалы, A ( t , λ ) = A ( t = 0, λ ) + Δμ a ( t , λ ) L где t – временной интервал; λ - длина волны; A ( t = 0, λ ) - оптическая плотность ткани, измеренная в начальный момент времени; Δμ a ( t , λ ) = ε ( λ ) C ( t ) - коэффициент поглощения вещества в ткани; ε ( λ ) - молярный коэффициент поглощения вещества; C(t) – концентрация вещества в ткани; L = ρσ - параметр, определяющий поглощающие и рассеивающие свойства ткани Таким образом, уравнение ΔA ( t , λ ) = A ( t , λ ) − A ( t = 0, λ ) = Δμa ( t , λ ) L = ε ( λ ) C ( t ) L может быть использовано для расчета коэффициента диффузии вещества 141 Метод радиоактивных меток Метод основан на использовании изотопов М Основное преимущество заключается в том, что возможно измерять очень малые концентрации проникающих веществ, а основной й недостаток состоит в том, что необходимо использовать радиоактивные изотопы, изотопы которые могут быть опасны, особенно в случае in vivo исследований 142 Схема метода радиоактивных меток образец ткани донорная ячейка вещество, меченое радиоактивными изотопами акцепторная ячейка буферный раствор с стинцилляционный ц ц о счетчик двухкамерная диффузионная фф кювета 143 Анализ диффузии ффу проникающих р веществ через р мембрану р у может быть выполнен с помощью первого закона Фика (5.12): Φ = − DΔC l = PΔC где Ф – стационарный поток проникающего вещества в единичной длине пробега молекулы; D – коэффициент диффузии (см2/с); ΔC = Cd − Ca - градиент концентрации, Cd - концентрация меченого вещества в донорной камере, Ca – концентрация меченого вещества в акцепторной камере (г/см3); l – толщина мембраны (см); Р – коэффициент проницаемости (см/с) Коэффициент проницаемости может быть определен как P = J ( Cd − Ca ) = KD l где K = k12 k21 - коэффициент распределения, k12 – константа связывания, k21 – константа диссоциации 144 Коэффициент распределения можно оценить из K= ( радиоактивность в ткани ) ( вес ткани ) ( радиоактивность в растворе ) ( вес раствора ) К Коэффициент проницаемости связан со структурными свойствами биоткани (мембраны) с помощью соотношения: ε D0 P= τl где ε, τ и l – пористость, пористость извилистость диффузионных путей и толщина мембраны, соответственно; D0 – коэффициент диффузии проникающего вещества в тканевой жидкости, определяемый уравнением Стокса-Эйнштейна: Стокса Эйнштейна: D0 = kT ( 6πη rs ) , где k – коэффициент Больцмана, T – абсолютная температура, η - коэффициент вязкости, rs – гидродинамический радиус диффундирующих молекул 145 Коэффициент проницаемости может быть рассчитан с помощью уравнения: V ⋅ dC P= S ⋅ C0 ⋅ dt где dC/dt – изменение концентрации в объеме образца за единицу времени, V – объем акцепторной камеры, S – площадь поверхности мембраны, C0 – начальная концентрация диффундирующего вещества Параметр (dC/dt ) можно измерить как наклон линейного участка графика зависимости количества проникающего вещества в акцепторной камере от времени 146 Лекция №12 5.2. Седиментация и ультрацентрифугирование 147 Седиментация – оседание или всплывание частиц в вязкой жидкости под действием гравитационной силы или центробежных сил Если плотность частиц больше, чем плотность жидкости то: жидкости, - частицы движутся у совершенно р беспорядочно р (броуновское движение), в результате среда становится гомогенной - частицы перемещаются преимущественно в направлении гравитационного поля: происходит седиментация, которая стремится сделать среду гетерогенной 148 Выведем уравнение движения частицы под действием й центробежной б й силы Пусть частица массы m находится на расстоянии r от оси вращения некоторого сосуда, вращающегося с угловой скоростью ω На нее действует центробежная сила F = mω2r Если плотность частицы равна ρ, объем - V, а плотность среды - ρ0, то кажущаяся масса частицы будет равна V(ρ – ρ0) и эффективная центробежная б сила, действующая й ю на частицу, составит 2 F = V(ρ – ρ0) ω r (5.17) Если ρ > ρ0, частица будет двигаться в направлении от оси вращения наблюдается эффективная седиментация Если ρ < ρ0, частица будет перемещаться в обратном направлении – наблюдается флотация 149 Когда частица достигает своей предельной скорости, центробежная сила равна силе сопротивления, т. е. V ( ρ − ρ0 ) ω 2 r = f где f = dr dt (5.18) kT , D – коэффициент фф диффузии ффу D Следовательно,, kT dr V ( ρ − ρ0 ) ω r = D dt 2 (5.19) 150 Умножив обе части этого равенства на число Авогадро N и заметив, что NVρ = M - молекулярной массе частицы, и Nk = R – ууниверсальной р газовой постоянной, а также введя удельный парциальный объем частицы V = 1/ ρ , получим RT dr M (1 − V ρ 0 ) ω r = D dt 2 (5.20) откуда молекулярная масса частицы равна dr RT RTs dt M= = 2 D (1 − V ρ0 ) ω r D (1 − V ρ0 ) 1 − V ρ0 d / ddt dr s= 2 ω r (5.21) - флотационный член - коэффициент седиментации 151 Рассмотрим равновесие между седиментацией Р йи диффузией через некоторое сечение площади А Пусть с – концентрация раствора на уровне рассматриваемого сечения; тогда можно написать ⎛ dm ⎞ 2 = cAs ω r ⎟ для седиментации: ⎜ ⎝ dt ⎠ B для д д диффузии ффу ((закон Фика): ) dc ⎛ dm ⎞ ⎜ ⎟ = DA dr ⎝ dt ⎠ D 152 В равновесии р dc cAsω r = DA dr (5.22) csω 2 r D= dc dr (5.23) 2 откуда Подставляя соотношение (5.23) в (5.21), получаем RT dc d dr 2 RT d ln c M= = 2 (1 − V ρ0 ) ω cr (1 − V ρ0 ) ω 2 d ( r 2 ) (5.24) 153 Если с1 и с2 – концентрации в двух точках, находящихся на оси вращения соответственно на расстоянии r1 и r2, то c2 2 RT ln c1 M= 2 2 2 1 − V ρ ω r − r ( (2 1) 0) (5.25) 154 Ультрацентрифугирование представляет собой способ б разделения смесей й на компоненты с идентичными химическими свойствами Поскольку величина s по всей ячейке постоянна, можно записать для двух слоев толщиной dr1 и dr2, отстоящих от оси вращения на расстояния r1 и r2 соответственно dr1 dr2 s = dt2 = dt ω r1 ω 2 r2 (5.26) dr2 r2 откуда dr1 r1 = dr2 r2 (5.27) c2 c1 θ r1 dr1 155 Считая, что размер ячейки в направлении, перпендикулярном плоскости рисунка, равен l, получаем концентрации в заштрихованных областях: n n , c2 = c1 = r1θ dr d 1l r2θ dr d 2l откуда c1 r2 dr2 ⎛ r2 ⎞ = =⎜ ⎟ c2 r1dr1 ⎝ r1 ⎠ 2 (5.33) 156 Время осаждения – это время, которое должна затратить частица, чтобы пройти расстояние от мениска до дна ячейки при центрифугировании Интегрирование р р выражения р dr / dt s= 2 ω r в пределах р от r0 до R, равных соответственно расстоянию до мениска и до дна, приводит к следующему равенству равенству: 1 R T = 2 ln l ω s r0 (5 34) (5.34) 157 Центрифугирование применяется: • для определения молекулярной массы макромолекул • для определения конформационных изменений молекул • для контроля за чистотой препарата • в молекулярной генетике при исследовании репликации ДНК и других 158 5.3. Хроматография 159 • • • • • • 1900 г. впервые р применён р ру русским учёным-ботаником М.С. Цветом 1906 г. появился термин хроматография 1931 г. г Р. Р Кун Кун, А А. Винтерштейн и Е Е. Ледерер при помощи хроматографии выделили из сырого каротина α и β фракции в кристаллическом виде 1941 г. А.Дж.П. Мартин и Р.Л.М. Синг разработали «распределительную хроматографию» 1947 г. Т.Б. Гапон, Е.Н. Гапон и Ф.М. Шемякин разработали метод «ионообменной хроматографии» 1952 г. Дж. Мартину и Р. Сингу была присуждена Нобелевская премия в области химии за создание метода распределительной хроматографии http:// waprik.ru 160 Хроматография – это метод, позволяющий разделять, выделять, а иногда и идентифицировать компоненты выделять смеси Основные компоненты О • неподвижная фаза – пористое или сильно измельченное вещество а в некоторых случаях жидкость вещество, • подвижная фаза – газ или жидкость В зависимости от природы неподвижной фазы р различают • • • хроматографию хроматографию хроматографию хроматографию в газовой фазе на колонке на бумаге (тонкослойную хроматографию, на пластинке) 161 В зависимости от принципа различают • • • • • • используемого у физического ф адсорбционную хроматографию распределительную хроматографию аффинную хроматографию гель-фильтрацию ионообменную хроматографию противоточную хроматографию Для разделения продуктов (элюирования) используют элюирующую среду (элюент), которая может быть • жидкостью в случае хроматографии на бумаге или на колонке (жидкостная хроматография) • газом (чаще всего это инертный газ или азот) в случае газовой хроматографии 162 Хроматограмма – кривая, изображающая кривая зависимость концентрации соединений, соединений выходящих из колонки с потоком подвижной фазы, от времени с момента начала разделения Базовая линия соответствует тому промежутку времени, в течение которого детектор регистрирует сигнал только от подвижной фазы Пик описывает постепенное нарастание концентрации на выходе из колонки и последующем ее уменьшении Время появления максимума пика на хроматограмме называется временем р уд удерживания р tR t0 - время удерживания несорбируемого вещества 163 Удерживаемый объем данного вещества рассчитывается по формуле: Vn = tn v v ((5.35)) - скорость подачи через колонку подвижной фазы Параметр коэффициент емкости данного соединения в данной хроматографической р р ф системе р рассчитывается по ф формуле: р у K = (tR - t0)/t0 (5.36) Коэффициентом распределения называется равновесное отношение концентрации данного компонента в неподвижной фазе к его концентрации в подвижной фазе 164 Газовая хроматография Газовая хроматография – метод разделения летучих у компонентов, при р котором р подвижной фазой служит газ-носитель, протекающий через неподвижную фазу с большой поверхностью Газ-носитель не реагирует с неподвижной фазой и разделяемыми веществами Различают газо-твёрдофазную и газо-жидкостную хроматографию 165 Схема газового хроматографа: С 1 - источник газа газа-носителя носителя (подвижной фазы) 2 - регулятор расхода газа носителя 3 - устройство ввода пробы 4 - хроматографическая колонка в термостате 5 – детектор 6 - электронный усилитель 7-р регистрирующий р ру щ прибор р р ((компьютер) р) 8 – расходомер http://ru.wikipedia.org 166 Дифференциальный Д фф р ц детектор д р R1 и R3 - измерительные р н ячейки R2 и R4 – сравнительные ячейки Мост Уитстона преобразует различия в температурах двух газов обусловленные газов, различиями в теплопроводности, в разность потенциалов http://ru.wikipedia.org Схема моста Уитстона для газовой хроматографии 167 Пламенно-ионизационный ц детектор д р (A)- колонка хроматографа (B) - емкость, емкость где поддерживается высокая температура, для того чтобы смесь оставалась в газообразном состоянии (C) - подача водорода (D)- подача кислорода ((E)) - ф форсунка р у горелки р (F) - пламя (G, H)- электроды (J)- отверстие http://ru.wikipedia.org 168 http://www.chromatogramma.ru/book/export/html/3 Пример разделения смеси газов с использованием ГХ 169 Хроматография на колонке Типичный прибор для колоночной хроматографии: 1 – элюент ((подвижная д ф фаза)) 2 – хроматографическая колонка 3 – сорбент (неподвижная фаза) 4 – приемник р фракций фр А, Б, В – окрашенные зоны 170 http://orgchemlab.com/index.php/chromatography/column-chromatography.html Схема прохождения компонентов подвижной фазы через колонку Для извлечения образующихся в результате разделения зон пропускают через колонку чистый й растворитель до тех пор, пока не соберут все фракции по мере их х выхода t0 – момент начала выхода подвижной фазы tr – время удерживания компонента в колонке www.rusnauka.com/9_DN_2010/Biologia/61946.doc.htm 171 Хроматография р р ф на бумаге у бумага а капля смеси растворитель б через несколько часов повернуть бумагу на 90° против часовой стрелки и использовать другой растворитель в Схема работы хроматографии на бумаге: а – начальная фаза б – результат одномерной хроматографии в – результат двумерной хроматографии через несколько часов 172 Тонкослойная хроматография http://festival.1september.ru/articles/566825/ до погружения в растворитель после погружения в растворитель http://donapunya.wordpress.com/ Анализируемый ру р раствор р и образцы р ц наносят на р расстоянии ~1.5 см от нижнего края пластинки и друг от друга Для проявления р пластинки помещают вертикально р в камеру ру с растворителем Состав смеси определяют, сравнивая получаемую картину разделения анализируемой смеси с хроматограммой известной смеси 173 http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/104 Хроматограмма 10 эфирных масел, проявлена ванилином 174 Гель-фильтрация загрузка образца с помощью шприца буфер буфер буфер ..... ... ........ Малые молекулы в образце могут проникать внутрь гранул, вследствие этого они протекают через колонку медленнее Крупные молекулы протекают между гранулами р у и проходят р д сквозь колонку у быстрее Правильный размер пор и свойства растворителя р р являются решающими р для хорошего разделения . . . .. а б в г ....... 175 Аффинная хроматография Позволяет очищать биомолекулы у и другие ру полимеры р на основе их индивидуальной структуры или функции, используя высокоспецифичное сродство макромолекулы к другой молекуле, дру у , которая р присоединена р д к неподвижной д фазе Для осуществления фракционирования по биологическому сродству один из «партнеров» такой пары химически закрепляют на матрице «биоаффинного» сорбента, а сорбцией и элюированием второго «партнера» управляют путем изменения условий биологического взаимодействия в результате введения в элюент солей, мочевины, детергентов, конкурирующих молекул или изменения его рН 176 Принцип работы: А - образец б впрыскивают в колонку В - через колонку пропускают буферный раствор, в результате чего молекулы, у которых нет сродства к неподвижной фазе, вымываются ю из колонки, а молекулы с высоким сродством к неподвижной фазе удерживаются в колонке С - удерживаемые молекулы элюируются из колонки растворителем другого состава А В С Определяемое вещество Аналитическое разделение Примеси Антитело http://www.chromatogramma.ru/book/export/html/3 Детекция Количественный анализ 177 Ионообменная хроматография Задержание молекул происходит в результате электростатического взаимодействия разноименно заряженных р ионов Ионообменники состоят из остова (или матрицы) и функциональных групп: - остов состоит из смолы с ковалентно связанными анионами или катионами - функциональные группы содержат ионы, ионы жестко связанные с остовом, и подвижные ионы, способные обмениваться 178 1. Основы метода 2. Графики диссоциации 1а. Низкие значения рН 1б. Высокие значения рН 3.Элюирование в ступенчатом градиенте рН Разделение имеющих разный заряд аминокислот 179 Противоточная р хроматография р р ф и ультрафильтрация Противоточная хроматография используется для крупномасштабной б й очистки некоторых веществ в тех случаях, когда другие методы оказываются излишне дорогими Подвижная и неподвижная фазы являются жидкостями, и разделение р д основано на р распределении р д образца р ц между ду этими двумя жидкостями 180 Схема функционирования: а) определенное биохимическое вещество имеет более высокую растворимость в фазе А, чем примеси, но в фазе В его растворимость ниже, чем примесей б) фаза В с высокой концентрацией примесей переносится в следующий аппарат, и свежая порция фазы В переносится из предыдущего аппарата в указанный аппарат в) фазы А и В смешиваются и снова разделяются, и процесс повторяется 181 182 Ультрафильтрация не является хроматографическим методом, У но является исключительно эффективным способом подготовки образцов для последующей хроматографии, а иногда может даже заменить хроматографию Применяется р для очистки белков, смены буферных уф р растворов р р и концентрирования белковых растворов Очистка белка с определенной молекулярной массой Мр осуществляется в два этапа: а) в аппарате ультрафильтрации используют мембрану с порогом пропускания выше, чем Мр, и собирают фильтрат б) используют мембрану с порогом пропускания ниже, ниже чем Мр, и собирают раствор, оставшийся в камере 183 http://ecologcrimea.com.ua/catalog/equipment/cleaning/84/?lng=ru 184 5 4 Электрофорез 5.4. Электрофорезом называют перемещение заряженных частиц в электрическом поле (если имеют дело с набольшими ионами, говорят об ионофорезе) Скорость заряженной частицы достигает предельного значения, когда движущая сила, действующая со стороны электрического поля, становится равной й по величине силе сопротивления, обусловленной вязким трением, т. е. qE = 6πηrv (5.37) где q – заряд частицы, Е – напряженность электрического поля, η – коэффициент вязкости жидкости, в которой происходит перемещения частицы, r – радиус частицы, v – скорость 185 движения частицы Применяются следующие методики: • • Свободный электрофорез, или электрофорез по методу движущейся границы – это простейший способ выделения из смеси лишь двух компонентов: самого быстрого и самого медленного Электрофорез на носителе, или зональный электрофорез – раствор движется по капиллярам пористой подложки (бумага, окись алюминия, алюминия агарозный гель и т. т д д.)) 186 Различают • электрофорез при низких напряжениях (от 4 до 5 В·см-1, время разделения – около двадцати часов); широко используется для разделения сывороточных белков • высоковольтный электрофорез – разделение сопровождается р выделением большого количества тепла, что может привести к испарению буфера. Обладает значительно более высоким разрешением. р зрешением 187 Схема работы устройства для электрофореза микропипетка с образцом катод пластиковый корпус буфер гель анод буфер уф р стандарты При наличии элетрофореграмм эталонных белков с известной молекулярной массой можно определять молекулярные массы белков Неизвестный Н й белок 188 Разработаны некоторые специальные методики: • двумерный электрофорез, при котором электрическое р поле перпендикулярно р у р направлению движения ионов под действием силы тяжести • электрофорез, позволяющий концентрировать тот или иной компонент смеси в определенном месте подложки • иммуноэлектрофорез, применяющийся при исследованиях взаимодействий антиген – антитело 189
