Сенчакова Татьяна Юрьевна

На правах рукописи
Сенчакова Татьяна Юрьевна
БИОТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ МИКРОМИЦЕТОВ
ЧЕРНОЗЕМА ВЫЩЕЛОЧЕННОГО
В АГРОЭКОСИСТЕМАХ ЛЕСОСТЕПИ
03.00.16 - экология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Воронеж – 2009
Работа выполнена в ГОУ ВПО
«Воронежский государственный педагогический университет»
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Свистова Ирина Дмитриевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Грабович Маргарита Юрьевна,
кандидат биологических наук, доцент
Перов Сергей Николаевич
Ведущая организация:
Воронежский государственный
аграрный университет им. К.Д. Глинки
Защита состоится 18 ноября 2009 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.038.05
в Воронежском государственном универси-
тете по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета.
Автореферат разослан «16» октября 2009 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета
кандидат биологических наук
Барабаш Г.И.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. С позиции системного подхода почвенные
микромицеты являются неотъемлемой частью наземных биогеоценозов, они
определяют скорость биогеохимической трансформации веществ. В последние годы расширяются исследования видового состава и структуры комплексов почвенных микромицетов разных природных зон. Микромицеты почвы
предлагаются в качестве информативного параметра микробиомониторинга
для оценки уровня загрязнения экосистем. Выявлены виды грибов, индикаторные на определенную антропогенную нагрузку (Мирчинк, 1988; Марфенина, 1999; Свистова, 2005). Однако причина доминирования этих видов и
возрастающее сходство комплексов микромицетов разных почв в условиях
антропогенной нагрузки остаются неясными.
Культуры микромицетов используются в биотехнологии в качестве
препаратов для биоконтроля фитопатогенов, что актуально для снижения
пестицидной нагрузки и «биологизации» земледелия. Важным, но практически не исследованным вопросом является выживание и динамика вносимых в
почву микромицетов, а также их влияние на структуру всего микробного сообщества (Звягинцев, 1998).
Сукцессии почвенных микромицетов являются одной из основных
причин развития микробного фитотоксикоза и почвоутомления в агроэкосистемах (Берестецкий, 1984; Свистова, 2005).
Для понимания и прогнозирования указанных проблем необходимо
изучать биотические связи микромицетов конкретного типа почвы с другими
компонентами биогеоценоза (микробным сообществом почвы, растениями,
животными). Наименее изучены связи организмов одного трофического
уровня. При этом ставятся задачи изучать не только трофические, но и «метаболические» взаимоотношения (Шилов, 2001).
Многие почвенные микромицеты синтезируют вторичные метаболиты
(микотоксины) с антибиотическим, фунгицидным, фито- или зоотоксическим
действием. По нашему предположению, «метаболические» связи микромицетов могут определять как выживание популяций грибов в почве и взаимодействие с фитопатогенами, так и направленность микробных сукцессий в условиях разных антропогенных воздействий, и в целом функционирование системы почва – микробное сообщество – растения, а, следовательно, продуктивность экосистемы.
Целью работы являлось изучение биотических связей видов микромицетов, типичных для чернозема выщелоченного в агроэкосистемах, с компонентами микробного сообщества, а также с растениями.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить типичные виды и структуру комплекса микромицетов
чернозема выщелоченного в агроэкосистемах;
2. Изучить взаимоотношения типичных видов микромицетов друг с
другом, с фитопатогенными грибами, с типичными для чернозема видами
бактерий, на основании чего определить спектр антибиотической и фунгицидной активности микромицетов;
3
3. Изучить влияние почвенных микромицетов на рост и развитие типичных для зоны культурных и сорных растений, определить спектр фитотоксической активности микромицетов;
4. Оценить эффективность интродукции микромицетов в почву и их
влияние на структуру микробного сообщества и развитие почвенного фитотоксикоза;
5. На основании спектра биологической активности объяснить доминирование выявленных ранее индикаторных для чернозема видов микромицетов в условиях агро- и техногенной нагрузки, а также выявить перспективные
средства биоконтроля для чернозема выщелоченного.
Объекты исследования. Объектами исследования являлись типичные
для чернозема выщелоченного виды микромицетов. Предмет исследования –
биотические связи почвенных грибов в системе почва - микробное сообщество – растения.
Научная новизна работы. Впервые проведены комплексные исследования спектра биологической активности всех типичных для чернозема выщелоченного в агроэкосистемах видов микромицетов. Выделены группы видов с широким, ограниченным и узким спектром фунгицидного действия по
отношению к сапротрофным и фитопатогенным грибам, антибиотического
действия по отношению к часто встречающимся в черноземе видам бактерий.
Изучен спектр фитотоксического действия микромицетов по отношению к
распространенным в ЦЧЗ культурным и сорным растениям разных семейств.
Впервые для чернозема выщелоченного исследована динамика микромицетов, интродуцированных в почву. Показана роль биотических взаимодействий в выживании интродуцентов в почве и роль «метаболических» связей в поддержании структуры микробного сообщества. Разработана схема
функционирования системы почва – микробное сообщество – растения.
Выяснена одна из причин сукцессий микромицетов и роста фитотоксикоза почвы в условиях антропогенной нагрузки: индикаторные виды выигрывают конкурентную борьбу в условиях лимитирования роста за счет антибиотического подавления микрофлоры и угнетения роста растений. В результате снижается биоразнообразие микробного сообщества и возрастает микробный фитотоксикоз почвы.
Практическая значимость работы. В качестве параметра микробиомониторинга чернозема выщелоченного в агроэкосистемах предложена
группа индикаторных видов микромицетов с широким спектром биологической активности, накопление которых свидетельствует о превышении пределов почвенного гомеостаза, снижении биоразнообразия микробного сообщества и повышении микробного фитотоксикоза почвы.
В качестве препарата биоконтроля на черноземных почвах предложен
аборигенный изолят Trichoderma harzianum 3а, который успешно подавляет
развитие характерных для зоны фитопатогенных грибов, но значительно слабее по сравнению с известными биопрепаратами нарушает структуру микробного сообщества, сохраняется в почве ограниченный период времени,
4
стимулирует рост растений ряда семейств. Разработана схема применения и
препаративная форма биопрепарата харзидин.
Положения, выносимые на защиту.
1 Выделены группы типичных для чернозема выщелоченного в агроэкосистемах видов микромицетов по спектру биологической активности по
отношению к почвенным грибам, бактериям, растениям, показаны различия в
механизмах воздействия.
2 Разработана модель биотических связей микромицетов с компонентами системы почва – микробное сообщество – растения, которые определяют эффективность интродукции микромицетов, направленность сукцессий микробного сообщества и развитие почвенного фитотоксикоза.
3 Установлена причина сукцессий микромицетов в черноземе выщелоченном при антропогенной нагрузке, которая заключается в усилении «метаболической» регуляции микробного сообщества в условиях стресса, что
ведет к снижению видового разнообразия комплекса грибов и росту фитотоксикоза почвы. Предложены 7 видов для микробиоиндикации чернозема.
4 Для биоконтроля и биоремедиации чернозема выщелоченного
предложен экотип Trichoderma harzianum 3а, который по эффективности не
уступает стандартным биопрепаратам, но менее нарушает микробное сообщество, сохраняется в почве ограниченный период времени, не вызывает
почвенного фитотоксикоза, стимулирует развитие растений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на
конференциях: «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2006, 2007), студенческой научной конференции ВГПУ (Воронеж, 2006), «Естествознание и гуманизм» (Томск, 2006), «Проблемы регионального природопользования и
методика преподавания естественных наук в средней школе» (Воронеж,
2007), «Экология биосистем» (Астрахань, 2007), «Роль особо охраняемых
природных территорий лесостепной и степной природных зон» (Воронеж,
2007) , «Современное состояние, проблемы и перспективы региональных ботанических исследований» (Воронеж, 2008), «Живые объекты в условиях антропогенного пресса» (Белгород, 2008), «Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем» (Астрахань, 2008),
«Принципы и способы сохранения биоразнообразия» (Пущино, 2008), «Фундаментальные достижения в почвоведении, экологии, сельском хозяйстве на
пути к инновациям» (Москва, 2008), XXI Съезде Российского ботанического
общества «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале
XXI века» (Петрозаводск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных
работ, в том числе 1 в центральной печати.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав,
заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на
157 страницах текста, включая 49 таблиц, 13 рисунков, содержит 13 приложений. Список литературы из 210 источников, в том числе 45 иностранных.
5
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ГЛАВА I. СТРУКТУРА И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ПОЧВЫ
Рассмотрена роль почвенных микроорганизмов в организации структуры
почвы, а также в выполнении важнейших функций. Отражены разные точки
зрения на функционирование микробного сообщества почвы. Проанализированы экологические особенности и значение микромицетов в экосистемах.
Рассмотрены особенности взаимоотношений компонентов системы почва–микробное сообщество–растения- животные-человек. Показана важность не только трофических, но и «метаболических» взаимоотношений в
сообществах. Отражена важная роль микробных метаболитов в функционировании микробного сообщества и их влияние на развитие почвоутомления.
Проанализированы возможности использования почвенных микроорганизмов на основе антагонистических взаимоотношений в качестве агентов
биоконтроля фитопатогенов. Обобщены многочисленные данные о микромицетах рода Trichoderma, их значении в организации микробного сообщества почвы, а также использование грибов этого рода человеком.
ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Представлены почвенно-климатическая характеристика района и гидротермические условия за годы исследования. Почва – чернозем выщелоченный среднемощный малогумусный тяжелосуглинистый многолетнего сельскохозяйственного использования (Опытная станция ВГАУ). Пробы почвы
отбирали в середине вегетационного сезона из слоя 0-20 см.
Определяли численность основных групп почвенных микроорганизмов
методом посева почвенной суспензии на плотные питательные среды (Методы почвенной …, 1980).
Для характеристики эколого-трофической и таксономической структуры микробного сообщества почвы использовали коэффициенты, предложенные Андреюк (1981). Рассчитывали следующие показатели экологотрофической структуры: коэффициент иммобилизации азота Кимм= [иммобилизаторы азота]/[аммонификаторы], коэффициент олиготрофности К олиг.=
[олиготрофы]/[аммонификаторы]. Таксономическую структуру микробного
сообщества оценивали по соотношению мицелиальных и бактериальных
форм: К1 = [актинобактерии]/[аммонификаторы], К2= [грибы]/ [аммонификаторы], К3 = [грибы]/[актинобактерии] (Звягинцев, 1983).
Определяли видовую структуру комплекса почвенных микромицетов.
Изоляты грибов поддерживали на среде Чапека. Принадлежность изолятов
устанавливали до рода по определителям (Билай, 1977; Билай, Пидопличко,
1977; Билай, Коваль, 1988; Билай, Курбацкая, 1990; Кириленко, 1978; Литвинов, 1967; Милько, 1974). Идентификацию до вида проводили на кафедре
микологии и альгологии МГУ. В дальнейшем, выделенные из почвы морфотипы идентифицировали по культурально-морфологическим признакам,
сравнивая изоляты с музейными культурами (по Мирчинк, 1988).
6
Видовую структуру комплекса грибов оценивали по показателям пространственной и временной частоты встречаемости и плотности вида (по
Мирчинк, 1988). Для характеристики α-разнообразия комплекса использовали показатель видового богатства, индексы разнообразия Шеннона Н, доминирования Симпсона С, выравненности Пиелу U, а β-разнообразие комплексов оценивали по коэффициенту сходства Серенсена (Одум, 1986).
Объектами исследования были 18 типичных для данного типа почв видов микромицетов (Мирчинк, 1988), в качестве стандарта использовали биопрепарат триходермин ново (получен на Воронежской областной станции
защиты растений).
Биологическую активность микромицетов (фунгицидные, антибиотические свойства) определяли на плотных питательных средах методом лунок
(Билай, 1982; Егоров, 2004). В качестве тест-объектов использовали другие
типичные для данной почвы виды сапротрофных и фитопатогенных грибов,
бактерий филумов Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria и Actinobacteria.
Определяли ростовые и морфогенетические эффекты микромицетов на газон
тест-объектов и измеряли радиус воздействия.
Фитотоксические свойства микромицетов определяли методом биотеста, в качестве тест объектов для определения спектра действия фитотоксинов
использовали семена растений различных семейств. Для выявления органотропного действия фитотоксинов исследовали их влияние на рост надземных
и подземных органов одно- и двудольных растений.
Динамику популяций разных видов микромицетов при интродукции их
с высокой плотностью в ту же почву, из которой они изолированы, а также
их влияние на видовую структуру комплекса микромицетов и экологотрофическую структуру микробного сообщества исследовали в микрокосмах
объемом 200 г почвы при постоянных условиях (влажность 60% ПВ, температура 26оС). Споры вносили в нативную и в стерилизованную почву.
Фитотоксичность почвы определяли методом биотестирования по ингибированию всхожести семян и роста корня проростков тест-растений. Фитотоксикоз нативной почвы определяли методом почвенных пластин. Для
усиления биологического фактора использовали метод инициированного
амилолитического микробного сообщества (Методы почвенной …, 1980).
Заболеваемость растений корневыми гнилями оценивали по показателям общей пораженности и индексу развития болезни, рассчитывали биологическую эффективность средств биоконтроля, стандартами служили известные биопрепараты, эталоном - химические средства защиты растений.
Изучение влияния микромицетов в качестве средств биоконтроля на
развитие корневой гнили злаков проводили в лабораторных опытах, томатов
- в вегетационных и микрополевых опытах в течение 3-х лет (2007-2009 гг.).
Оценивали эффективность разных способов обработки растений и почвы
предлагаемым нами биопрепаратом харзидин. Проводили наблюдения за
ростом и развитием по фенофазам, оценивали урожайность растений.
7
Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли
методом дисперсного анализа при уровне значимости Р0,05 (Доспехов, 1985).
Использовали пакет статистических программ Stadia.
ГЛАВА III. ВЗАИМООТНОШЕНИЯ МИКРОМИЦЕТОВ С КОМПОНЕНТАМИ СИСТЕМЫ ПОЧВА – МИКРООРГАНИЗМЫ – РАСТЕНИЯ
Структура комплекса микромицетов чернозема выщелоченного
Определен состав и структура комплекса микромицетов, типичных для
чернозема выщелоченного в агроэкосистемах в середине вегетации. Основные семейства отражены на рис. 1, видовая структура комплекса - в табл. 1.
4,0%
2,3%
7,9%
1,5%
79,0%
Tuberculariaceae
Dematiaceae
Mucoraceae
Trichocomotaceae
Moniliaceae
Рисунок 1. Структура комплекса микромицетов чернозема в середине вегетационного сезона (основные семейства).
Комплекс грибов чернозема выщелоченного в агроэкосистемах характеризуется высоким видовым разнообразием и выравненностью (индекс
Шеннона 3,75-3,98, индекс Пиелу 0,95). Показатель видового богатства комплекса типичных микромицетов (18 видов) значительно выше, чем для агроценозов дерново-подзолистой и серой лесной почвы (Заварзин, 1992; 2003),
но несколько ниже, чем для целинного чернозема (Свистова, 2005).
Обнаружено, что в агроэкосистемах суммарная плотность типичных
видов в 2,3 раза превышает аналогичный показатель для целинного чернозема выщелоченного (Свистова, 2005). Это свидетельствует о снижении доли
случайных видов и усилении доминирования в комплексе микромицетов при
интенсивной агрогенной нагрузке на почву. Среди типичных видов в 1,4 раза
возрастает количество и суммарная плотность токсигенных видов грибов.
8
Таблица 1.
Видовая структура комплекса типичных видов микромицетов чернозема выщелоченного в середине вегетации.
Группа видов
Виды грибов
Доминанты
Часто
встречающиеся
Редко
встречающиеся
Penicillium rubrum*, P. funiculosum*, P. daleae,
Aspergillus ustus*
Fusarium solani*, Talaromyces flavus*,
A. clavatus*, A. ochraceus*, Gliocladium virens,
Trichoderma koningii*, T. harzianum*
A. wentii*, A. terreus*, Cephalosporium acremonium,
Humicola grisea, Penicillium notatum*,
Cladosporium herbarum*, Rhizopus stolonifer
*-токсигенные виды.
Взаимоотношения микромицетов с другими сапротрофными и фитопатогенными грибами
При изучении взаимоотношений 18 типичных видов микромицетов с
сапротрофными грибами и механизма действия определен спектр фунгицидной активности исследуемых видов (табл. 2).
Виды первой группы подавляли развитие 14-19 видов грибов, нейтрализм для них нехарактерен. Взаимный антибиоз выявлен с 2-8 видами из
этой же группы. Ни один вид микромицетов из других групп не подавлял виды первой группы.
Вторая группа микромицетов проявляла ограниченный спектр фунгицидного действия, подавляла 10-13 видов грибов, не относящихся к первой
группе. Взаимный антибиоз и подавляющее действие на виды второй группы
оказывали только представители этой же или первой группы.
Таблица 2.
Фунгицидная активность типичных видов микромицетов чернозема.
Группа видов
С широким
спектром действия
С ограниченным
спектром действия
С узким
спектром действия
Виды микромицетов
Penicillium rubrum, Aspergillus clavatus,
Talaromyces flavus, Fusarium solani
P. funiculosum, A. ustus, A. wentii, A. ochraceus,
Trichoderma koningii, T. harzianum,
T. viride (триходермин)
P. notatum, А. terreus, Chrysosporium sp.,
Humicola grisea, P. daleae, Rhizopus stolonifer, Gliocladium virens, Cladosporium herbarum
Третью группу составляли виды микромицетов с узким спектром фунгицидного действия, не способные влиять на грибы первой и второй групп.
Развитие грибов этой группы подавлялось 5-13 видами, нейтрализм отмечен
с 5-12 видами, взаимный антибиоз не обнаружен.
9
Микромицеты первой и второй групп и один вид третьей группы подавляли рост и развитие не только других почвенных сапротрофов, но и распространенных в ЦЧЗ грибов-фитопатогенов, часть жизненного цикла которых
проходит в почве. Это возбудители листостебельных инфекций (Cladosporium herbarum, Alternaria alternata, Botrytis cinerea) и корневых гнилей (Bipolaris sorokiniana, Stemphillium botryosum и виды рода Fusarium – F. sambucinum, F. moniliforme).
Механизм подавления фитопатогенов большинством почвенных микромицетов основан на дистальном действии путем синтеза микотоксинов,
только 4 вида (Fusarium solani, Penicillium notatum и 2 вида рода TrichodermaT. harzianum и T. viride) проявляли гиперпаразитизм по отношению к некоторым возбудителям (за счет миколитических ферментов). Эталонный биопрепарат триходермин ново (штамм T. viride) - гиперпаразит для фитопатогенов.
Взаимоотношения микромицетов с типичными для чернозема
выщелоченного видами бактерий филумов Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria и Actinobacteria
При изучении отношений микромицетов с типичными для чернозема
выщелоченного видами бактерий филумов Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria (Bacillus mesenthericus, B. cereus, B. subtilis, Pseudomonas aeruginosae,
Myxococcus coralloides, Sarcina luteus, S. flava, Azotobacter chroococcum, Flavobacterium ferrugineum, Arthrobacter sp.) и отдельно филума Actinobacteria
(Streptomyces albus albocoloratus, S. cinereus roseus, S. cinereus achromogenes,
S. cinereus chromogenes, Micromonospora sp., Nocardia sp.) выделены группы
по антибиотической активности (табл. 3).
Таблица 3.
Антибиотическая активность типичных видов микромицетов чернозема
Группа видов
Антибиоз c прокариотами
С широким
спектром действия
С узким
спектром действия
Неактивны
с бактериями филумов
Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria
P. rubrum, A. clavatus,
Tal. flavus, T. harzianum,
F. solani,G. virens,
P. notatum
P. funiculosum,T. koningii
T. viride (триходермин)
Cl. herbarum,
A. ochraceus, A. terreus,
A. ustus. A. wentii,
P. daleae, Rh. stolonifer,
H. grisea,C. Acremonium
10
с бактериями
филума Actinobacteria
P. rubrum, A. clavatus,
Tal. flavus. T. harzianum,
F. solani, G. virens,
A. ustus, P. funiculosum
T. koningii, A. wentii,
P. daleae, P. notatum,
T. viride (триходермин)
Cl. herbarum,
A. ochraceus, A. terreus
Rh. stolonifer,
H. grisea, C. acremonium
Первая группа с широким спектром действия включает виды микромицетов, способные подавлять рост и развитие большинства исследуемых видов
бактерий, при этом сами грибы практически не подавлялись прокариотами.
Виды грибов с узким спектром антибиотического действия оказывали влияние
только на 3–4 вида бактерий и 2-3 вида актинобактерий, при этом прокариоты
вызывали нарушения морфогенеза данных грибов.
Группа неактивных видов объединяет грибы, которые не проявляли антибиотического действия по отношению к изученным видам бактерий, при
этом наблюдалось фунгицидное действие ряда прокариот.
Фитотоксическое действие микромицетов
Изучали влияние микромицетов на всхожесть семян, рост и развитие
проростков 19 видов типичных для ЦЧЗ культурных и сорных растений 7 семейств (пшеница, кукуруза, овес, ячмень, горох, люпин, вика, сахарная свекла, марь белая, редька масличная, кресс-салат, редис, амарант, щирица,
звездчатка, гипсофила, подсолнечник, василек, трехреберник). С учетом специфичности фитотоксического действия, а также степени ингибирования
роста растений, все исследуемые виды грибов поделены группы (табл. 4).
Таблица 4.
Спектр фитотоксического действия типичных видов микромицетов чернозема выщелоченного
Группа видов
Виды микромицетов
Виды с широким
спектром действия
Виды с ограниченным
спектром действия
Неактивны
Aspergillus clavatus, A. ochraceus, A. terreus, A. ustus,
Penicillium rubrum, P. funiculosum,
Cladosporium herbarum,
Fusarium solani, Talaromyces flavus
P. notatum, Cephalosporium acremonium,
Trichoderma koningii, Gliocladium virens,
A. wentii, Humicola grisea, T. viride (триходермин)
T. harzianum, P. daleae, Rhizopus stolonifer
Виды грибов с широким спектром фитотоксического действия подавляли
рост и развитие растений 4-7 семейств; степень ингибирования всхожести семян,
роста корня и стебля проростка составляла 39-100%. В группу с ограниченным
спектром фитотоксического действия вошли виды, подавляющие рост и развитие
не более 4 семейств растений, степень ингибирования составляла от 31 до 56%.
Микромицеты T. harzianum, P. daleae, Rh. stolonifer не проявляли фитотоксического
эффекта. Для T. harzianum в ряде случаев отмечен стимулирующий эффект на рост
растений некоторых семейств (злаковые, бобовые, крестоцветные).
Сравнительный анализ биологической активности типичных видов микромицетов чернозема выщелоченного представлен в табл. 5.
Особый интерес представляет группа микромицетов, проявляющих широкий
спектр фунгицидной, антибиотической и фитотоксической активности. К ним относятся виды Aspergillus clavatus, Penicillium rubrum, Talaromyces flavus, Fusarium
solani.
11
Таблица 5.
Сводная таблица биологической активности микромицетов чернозема
Виды
Спектр биологической активности
микромицетов
фунгицидной
антибиотифитотоксической
ческой
A. clavatus, P. rubrum,
широкий
Широкий
широкий
Tal. flavus, F. solani
T. harzianum
ограниченный
Широкий
нет
P. funiculosum, A. ustus
ограниченный
узкий
широкий
T. koningii, A. wentii,
T. viride (триходермин)
A. ochraceus
G. virens
P. notatum
Cl. herbarum, A. terreus
H. grisea, C. acremonium
ограниченный
узкий
ограниченный
ограниченный
узкий
узкий
узкий
узкий
нет
широкий
узкий
нет
нет
широкий
ограниченный
ограниченный
широкий
ограниченный
P. daleae
узкий
узкий
нет
Rh. stolonifer
узкий
нет
нет
Именно эти виды, как показано нами для чернозема выщелоченного в
агроэкосистемах, а в предыдущих работах (Свистова, 2005) и для чернозема в
условиях интенсивной техногенной нагрузки, являются индикаторными (частота встречаемости и плотность их возрастает по сравнению с целиной). Повидимому, высокая антибиотическая и фунгицидная активность помогает
данным видам грибов выигрывать обостряющуюся в условиях антропогенной нагрузки (ингибирование и лимитирование роста, недостаток трофических субстратов) конкурентную борьбу за счет подавления роста и развития
компонентов микробного сообщества. Побочное фитотоксическое действие
микотоксинов данной группы грибов ведет к росту микробного фитотоксикоза почвы. По мнению ряда исследователей (Щербаков, Свистова, 2003), это
снижает конкуренцию с растениями за трофические субстраты, а также является механизмом обратной связи в системе почва–микроорганизмы–
растения. Накопление данных видов микромицетов в почве соответствует
превышению зоны «гомеостаза» почвы и переходу микробного сообщества в
зону «стресса» (Звягинцев, 2005).
Таким образом, на основании изучения биотических связей микромицетов с компонентами микробного сообщества почвы становится понятным,
почему указанные виды можно использовать для микробиомониторинга чернозема выщелоченного, подверженного техногенной нагрузке. При агрогенной нагрузке на почву в качестве индикаторных видов можно использовать
также микромицеты с ограниченным спектром действия P. funiculosum, A. ustus, A. ochraceus.
Для практики сельского хозяйства важны виды, проявляющие высокую
антибиотическую и фунгицидную активность по отношению к фитопатогенам, но не подавляющие развитие растений - такие виды используются для
12
получения препаратов биоконтроля. Среди изученных грибов такие свойства
проявлял только вид Trichoderma harzianum.
ГЛАВА IV. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИНТРОДУКЦИИ МИКРОМИЦЕТОВ В ЧЕРНОЗЕМ ВЫЩЕЛОЧЕННЫЙ
Оценена эффективность интродукции видов разных по биологической
активности групп грибов в чернозем выщелоченный, и их влияние на состав
и структуру микробного сообщества. Выявлены различия в динамике интродуцированных микромицетов (рис. 2).
Контроль исходный
Контроль 3 месяца
P.rubrum
T.harzianum
P.notatum
T.koning ii
P.daleae
R h.stolonifer
другие
ти пичные виды
случайные
+Penicillium rubrum
+ триходермин (Trichoderma viride)
интродуцент
интродуцент
другие
типичные
виды
другие
типичные
виды
случайные
виды
случайные
виды
+Trichoderma harzianum
+Penicillium notatum
+Trichoderma koningii
интродуцент
интродуцент
интродуцент
другие
типичные
виды
случайные
виды
други е
типичные
виды
другие
типичны е
виды
случай ные
виды
с луча йны е
виды
+Penicillium daleae
+Rhizopus stolonifer
интродуце
нт
интродуце
нт
другие
типичные
виды
другие
типичные
виды
случайны
е виды
случайны
е виды
Рис. 2. Структура комплекса микромицетов чернозема выщелоченного через
3 месяца после интродукции микромицетов (плотность вида, %).
13
Эти различия определялись особенностями взаимодействия интродуцированных видов с микробным сообществом, т.к. проявлялись только в нативной почве, но не в стерилизованной. Продемонстрирована прямая зависимость динамики со способностью вида к синтезу токсичных вторичных
метаболитов (микотоксинов). Успешнее закреплялись в почве виды с широким спектром биологической активности, плотность их возрастала уже через
2 недели и не снижалась даже через 3 месяца. Так, плотность вида P. rubrum
составляла 94%, T. viride (триходермин ново) – 100%.
При интродукции в почву грибов с ограниченным спектром биологической активности (T. harzianum, P. notatum, T. koningii) плотность их постепенно снижалась, но через 3 месяца была несколько выше контрольного
уровня (соответственно 57 и 8%, 17 и 7%, 17 и 2%). Практически не закреплялись в почве виды с узким спектром активности.
Таблица 6.
14
+ Rh. stolonifer
6
9
12
11
13
1
5
8
10
9
10
100
100
83
97
87
95
83
94
82
79
74
58
100
90
70
83
66
39
100
0
93
1,88
73
2,48
89
3,02
67
3,12
67
3,33
1
0,39
0,24
0,14
0,15
0,13
0
0,73
0,78
0,87
0,87
0,90
20*
31*
0
+8*
11
15
0
27*
7
10
6
14
+ P. daleae
1
+ T. koningii
+ P. notatum
Количество
17
11
3
типичных видов
Из них
11
9
3
токсигенных
%
65
82
100
Плотность
57
74
99
типичных видов
Из них
36
48
95
токсигенных
%
66
65
96
Индекс
3,51 3,05 0,33
разнообразия
Показатель
0,11 0,15 0,90
доминирования
Индекс
0,86 0,88 0,21
выравненности
Фитотоксикоз, %
нативная почва
4
7
38*
+ ИМС
7
10
42*
*- P0,05 по сравнению с контролем.
+T. harzianum
+ T. viride
(триходермин)
+ P. rubrum
контроль 3 мес.
контроль исходный
Показатели видового разнообразия комплекса микромицетов и фитотоксичность
чернозема при интродукции грибов (3 месяца инкубации)
Интродуцированные виды микромицетов
Показатели
видового
разнообразия
Интродуцированные виды микромицетов в разной степени оказывали
влияние на состав и структуру микробного сообщества чернозема выщелоченного, сохраняя при этом свойства, выявленные нами в лабораторных опытах на чистых культурах (табл. 6). При внесении в почвенный микрокосм вида с широким спектром действия P. rubrum, выявлены значительные нарушения комплекса микромицетов, выделялись только 2 других вида микромицетов из этой же группы, плотность их выше, чем в контрольной почве и достигала 95%. Это говорит об элиминации редких и случайных видов грибов, что
подтверждается значительным снижением индекса видового разнообразия и
индекса выравненности комплекса. Возрастает суммарная плотность токсигенных видов грибов до 90-100% при содержании в контроле 48%. Биопрепарат триходермин ново (штамм T. viride, изолированный из дерновоподзолистой почвы) даже через 3 месяца полностью подавлял развитие всех
аборигенных для чернозема видов грибов.
При внесении видов с ограниченным спектром биологического действия (T. harzianum, P. notatum, T. koningii) нарушение комплекса микромицетов в микрокосме были менее выражены. Количество типичных видов по
сравнению с контролем уменьшалось до 6-9, несколько снижались показатели разнообразия и выравненности, возрастал индекс доминирования.
Интродукция в чернозем выщелоченный грибов узкого спектра биологического действия (P. daleae, Rh. stolonifer) оказалась неэффективной, интродуценты быстро элиминируются до уровня естественного пула за счет подавления почвенной микрофлорой.
Нарушений таксономической или эколого-трофической структуры
микробного сообщества чернозема при интродукции микромицетов не выявлено. Микробный токсикоз, по крайней мере, в микрокосмах как в модельных экспериментах, вносит определяющий вклад в развитие фитотоксичности почвы. Динамика развития и степень фитотоксикоза почвы хорошо соответствовала способности вида грибов к синтезу микотоксинов широкого
спектра биологического действия. Избыточное накопление в почве микромицетов этой группы может вызвать развитие фитотоксикоза чернозема выщелоченного, что проявляется как явление почвоутомления (снижение урожайности растений).
Вид T. harzianum, проявляющий в чистой культуре определенный фитостимулирующий эффект, при интродукции в почву закрепляется на уровне
выше природного пула и стимулирует рост и развитие растений.
Препарат триходермин ново в черноземе выщелоченном оказал негативное действие на микробное сообщество, длительно изменив структуру
комплекса типичных видов грибов, и значительно повысив почвенный фитотоксикоз. Этот препарат рекомендован для дерново-подзолистых почв Нечерноземной зоны, но, по нашим данным, не подходит для применения на
черноземах.
15
ГЛАВА V. ГРИБЫ РОДА TRICHODERMA – ПЕРСПЕКТИВНЫЕ
АГЕНТЫ БИОКОНТРОЛЯ НА ЧЕРНОЗЕМНЫХ ПОЧВАХ
Из 30 исследованных нами изолятов рода Trichoderma наиболее перспективен как агент биоконтроля болезней растений штамм T. harzianum 3а,
его эффективность не уступает эталонному биопрепарату триходермин ново.
Таблица 7.
Виды
Trichoderma
Bipolaris
sorokiniana
Fusarium
solani
Fusarium
sambucinum
Fusarium
moniliforme
Alternaria
alternata
Cladosporium
herbarum
Stemphillium
botryosum
Botrytis cinerea
Действие видов рода Trichoderma на фитопатогены (радиус зоны влияния, мм).
T. harzianum 3а
T. koningii
T. pseudokoningii
T. viride
T. polysporum
триходермин
6 мм
1мм
3 мм
25мм
4мм
10мм
5 мм
2 мм
10мм
13мм
16мм
10мм
4 мм
12мм
8мм
13мм
15мм
3 мм
14мм
13мм
10мм
10мм
6 мм
3 мм
16мм
2мм
11мм
10мм
5 мм
4 мм
18мм
16мм
11мм
22мм
18мм
20мм
15мм
19мм
16мм
3 мм
10мм
6мм
10мм
- подавление спороношения
- подавление роста
- гиперпаразитизм
Преимуществом этого штамма является то, что он не проявляет фитотоксического эффекта, отмечается стимулирующее действие гриба на всхожесть семян и рост растений многих семейств. Данный продуцент менее заметно нарушает микробное сообщество чернозема и отвечает основному требованию к биопрепаратам – сохраняется в почве ограниченное время.
Таблица 8.
Влияние биопрепаратов на развитие корневых гнилей озимой пшеницы (%).
Биологическая
Биопрепараты
эффективность, %
по порапо развитию
женности
болезни
харзидин
48,8
63,6
триходермин ново
48,9
68,2
фитоспорин
25,6
63,0
ТМТД (эталон)
37,0
45,5
Премис двести (эталон)
72,1
86,4
*- стимулирующий эффект.
Ингибирование
роста, %
стебля
корня
+10*
+4
+2
25
26
+6
+2
0
19
24
В борьбе с корневыми гнилями злаков из химических препаратов эффективен Премис Двести (снижал пораженность пшеницы в 4 раза, а ячменя в 2
раза), но он оказывает сильное фитотоксическое действие. Применение биопрепаратов (триходермин, фитоспорин) достаточно эффективно, если пора16
женность семян в контроле не превышает 50%, при этом рост растений не угнетался. Биологическая эффективность выделенного нами изолята T. harzianum 3а (биопрепарат, названный нами харзидин) составила для пшеницы
46-64%, а для ячменя 12-15%, что сравнимо с известными биопрепаратами.
Обработка семян томатов биопрепаратами оказалась более эффективной,
чем химическим эталоном (ТМТД): пораженность рассады корневыми гнилями снизилась более чем в 2 раза, что сказалось росте растений (стимуляция
роста рассады до 30-35% на стадии пикировки и до 15-25% на стадии высадки
в поле) и в дальнейшем на их урожайности (рост в 1,5 раза). Харзидин обладает также нематоцидным действием, при сильной зараженности почвы нематодами обработка харзидином снижает пораженность рассады в 9 раз.
Таблица 9.
Эффективность разных способов использования биопрепарата харзидин против
корневых гнилей томатов.
Способ
обработки
контроль
обработка семян
+ опрыскивание
рассады
полив почвы
обработка корня
при пикировке
Биологическая
Высота при пиКоличество
эффективность,%
кировке,%
кистей на куст
100
11
60
151
19
55
-25
118
103
17
16
Урожайность, кг
1,3
2,5
1,8
1,6
Лучшие результаты на томатах получены при комплексном применении биопрепарата харзидина (табл. 9) в варианте с обработкой семян перед
посевом и дополнительным опрыскиванием всходов споровой культурой.
При этом достагалась стимуляция роста рассады и образования завязей в 1,5
раза, урожайности в 2 раза.
Обсуждение результатов
Важную роль в формировании структуры микробного сообщества почвы играют вторичные метаболиты («метаболическая» регуляция). Типичные
для чернозема выщелоченного виды микромицетов различаются по спектру
биологической активности. Выявлены виды с широким, ограниченным и узким спектром действия. Фунгицидное воздействие грибов может проявляться
как контактно в виде гиперпаразитизма, так и дистантно путем синтеза микотоксинов. В последнем случае наблюдаются ростовые и морфогенетические
эффекты (снижение ветвления мицелия, подавление спороношения). Антибиотическая активность обусловлена бактерицидным действием микотоксинов. Фитотоксические свойства проявляются в снижении всхожести семян и
системном или органотропном ингибировании роста растений.
Биотические связи микромицетов определяют эффективность их интродукции в почву, влияют на состав микробного сообщества, определяют
развитие микробного фитотоксикоза почвы.
17
Комплексное изучение биотических связей микромицетов с компонентами системы почва–микробное сообщество–растения позволило выявить
причину сукцессий микромицетов и накопления видов-индикаторов при интенсивном антропогенном воздействии на черноземы, которая заключается в
усилении «метаболических» взаимодействий путем синтеза токсичных вторичных метаболитов (рис. 3).
ППК
Сапротрофные
микромицеты
2
6
9
1
8
Грибыфитопатогены
1
Прокариоты
8
2
3
2
Микотоксины
7
8
4
5
Растения
5
Животные
Человек
Мортмасса
Рис. 3. Модель биотических связей сапротрофных микромицетов с компонентами
агроэкосистем (жирными стрелками показаны процессы, усиливающиеся в агроэкосистемах): А – «метаболические» связи, Б – трофические связи.
Обозначения:
А. 1 – синтез токсичных вторичных
Б. 7 – питание,
метаболитов,
8 – паразитизм,
2 – фунгицидное действие,
9 - миколитическое
3 – антибиотическое действие,
действие
4 – фитотоксическое действие,
10 - гиперпаразитизм
5 – зоотоксическое действие,
6 – иммобилизация токсинов почвеннопоглощающим комплексом
Для целей биомониторинга чернозема выщелоченного в условиях интенсивной агрогенной и техногенной нагрузки обосновано использование в
качестве индикаторов превышения пределов зоны «гомеостаза» следующих
видов микромицетов: Aspergillus clavatus, A. ochraceus, A. ustus, Penicillium
18
rubrum, P. funiculosum, Talaromyces flavus, Fusarium solani. Исходя из литературных данных о зоотоксическом действии микотоксинов указанных видов
грибов (Кашкин, 1979), накопление в почве индикаторных на антропогенную
нагрузку видов должно привлечь внимание санитарных микробиологов в
связи с возможной передачей и концентрированием микотоксинов в цепи
микромицеты–почва-растения–животные-человек.
Для биоконтроля и биоремедиации черноземов рекомендован аборигенный изолят Trichoderma harzianum 3а (биопрепарат харзидин). Данный
экотип подавляет развитие характерных для ЦЧЗ фитопатогенов, не уступая
стандартному биопрепарату триходермин ново, но менее нарушает микробное сообщество, не вызывает почвенного фитотоксикоза, отмечается стимулирующее действие гриба на всхожесть и развитие растений многих семейств. Этот вид отвечает также основному требованию к биопрепаратам сохраняется в почве ограниченный период времени.
В то же время, выявленное нами некоторое временное снижение видового разнообразия комплекса микромицетов чернозема, свидетельствует о
частичном воздействии T. harzianum на сапротрофные грибы, которые не являются мишенью биоконтроля. Это выдвигает новое требование для биопрепаратов - изучение в полевых условиях долговременных последствий их
применения на структуру микробного сообщества почвы. Коммерческий
биопрепарат триходермин ново в модельных опытах значительно нарушает
микрофлору чернозема и угнетает развитие ряда растений.
Разработана схема применения и препаративная форма биопрепарата харзидин.
Выводы
1. Определены типичные виды и структура комплекса микромицетов
чернозема выщелоченного в агроэкосистеме.
2. Выявлены виды с широким, ограниченным и узким спектром биологической активности. Фунгицидное действие грибов может проявляться контактно в виде гиперпаразитизма и дистантно путем синтеза микотоксинов.
Антибиотическая активность обусловлена бактерицидным действием микотоксинов. Фитотоксические свойства микотоксинов проявляются в ингибировании всхожести семян и роста растений.
3. Биотические связи микромицетов определяют эффективность их интродукции в почву, влияют на состав микробного сообщества. Виды с узким
спектром биологического действия не закрепляются в почве, их численность
быстро снижается до уровня естественного пула. Микромицетов с широким
спектром биологического действия при интродукции длительно сохраняются
в почве, но негативно влияют на комплекс типичных видов грибов.
4. Разработанная модель биотических связей микромицетов с компонентами системы почва – микробное сообщество – растения позволила выявить
причину установленных ранее сукцессий микромицетов и накопления токсигенных видов-индикаторов при интенсивном антропогенном воздействии на
черноземы, которая заключается в усилении «метаболических» взаимодействий путем синтеза токсичных вторичных метаболитов
19
5. Фитотоксичность почвы, по крайней мере в модельных экспериментах, во многом определяется концентрацией доминирования токсигенных
микромицетов.
6. Обосновано использование для биомониторинга чернозема выщелоченного в условиях антропогенной нагрузки следующих видов микромицетов с широким спектром биологической активности: Aspergillus clavatus, A.
ochraceus, A. ustus, Penicillium rubrum, P. funiculosum, Talaromyces flavus, Fusarium solani.
7. Для биоконтроля и биоремедиации черноземов рекомендован аборигенный изолят Trichoderma harzianum 3а. Данный экотип подавляет развитие
характерных для Центрально-Черноземной зоны фитопатогенов, не уступая
стандартным биопрепаратам, но менее нарушает микробное сообщество, сохраняется в почве ограниченный период времени, не вызывает почвенного
фитотоксикоза, стимулирует развитие растений. Разработана схема применения и препаративная форма биопрепарата харзидин.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Сенчакова Т.Ю. Спектр действия микотоксинов сапротрофных микромицетов чернозема / Т.Ю. Сенчакова, Е.Н. Сафонова, И.Д. Свистова // Материалы X международной Пущинской школы-конференции молодых ученых
«Биология наука XXI века» 17-21 апреля 2006 г. – Пущино, 2006. С. 212.
2. Сенчакова Т.Ю. Биологические средства защиты растений от фитопатогенов / Т.Ю. Сенчакова // Тезисы докладов студенческой научной конференции. – Воронеж: ВГПУ, 2006. С. 136-138.
3. Сенчакова Т.Ю. Микромицеты чернозема как перспективные препараты
защиты растений / Т.Ю. Сенчакова, И.Д. Свистова // Сборник научных работ
«Естествознание и гуманизм». Т. 3. № 3. Томск, 2006. С. 54.
4. Свистова И.Д. Выделение типичных видов микромицетов чернозема и характеристика их биологического действия / И.Д. Свистова, Т.Ю. Сенчакова //
Материалы международной научно-практической конференции «Экология
биосистем: проблемы изучения, индикации и прогнозирования». Астрахань,
20-25 августа 2007 г. - Астрахань: ООО «ПолиграфКом», 2007. С. 57-59.
5. Сенчакова Т.Ю. Биодинамика и эффективность интродукции микромицетов в чернозем выщелоченный / Т.Ю. Сенчакова, И.Д. Свистова // Материалы
XI международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века». 29 октября-2 ноября 2007 г. - Пущино, 2007. С. 389.
6. Свистова И.Д. Эффективность интродукции микромицетов в почву: роль
вторичных метаболитов / И.Д. Свистова, Т.Ю. Сенчакова // Организация и
регуляция физиолого-биохимических процессов. Вып.9. – Воронеж: ООО
«Центрально-Черноземное книжное изд-во», 2007. С. 189-192.
7. Сенчакова Т.Ю. Новый биопрепарат для защиты растений / Т.Ю. Сенчакова // Материалы VI региональной научно-практической конференции
«Проблемы регионального природопользования и методика преподавания
естественных наук в средней школе». - Воронеж: ВГПУ, 2007. С. 61-63.
8. Свистова И.Д. Биоразнообразие микромицетов чернозема природных и
антропогенных экосистем / И.Д. Свистова, И.И. Корецкая, Н.Н. Талалайко,
20
Т.Ю. Сенчакова // Материалы научно-практической конференции «Роль особо охраняемых природных территорий лесостепной и степной природных зон
в сохранении и изучении биологического разнообразия». Воронеж, 17-21
сентября 2007 г. - Воронеж: ВГПУ, 2007. С. 87-89.
9. Свистова И.Д. Роль микотоксинов в выживании популяций грибов в почве
/ И.Д. Свистова, Т.Ю. Сенчакова // Материалы III Всероссийской научной
конференции «Принципы и способы сохранения биоразнообразия». Пущино,
27 января – 1 февраля 2008 г. - Йошкар-Ола, Пущино, 2008. С. 281-283
10. Свистова И.Д. Биотические связи в системе почва-микроорганизмырастения / И.Д. Свистова, Т.Ю. Сенчакова // Материалы Международной научной конференции «Современное состояние, проблемы и перспективы региональных ботанических исследований». Воронеж, 6-7 февраля 2008 г. - Воронеж: Издательско-полиграф. Центр ВГУ, 2008. С. 283-285.
11. Сенчакова Т.Ю. Перспективные препараты для защиты растений /
Т.Ю. Сенчакова, И.Д. Свистова // Материалы Всероссийской конференции
«Фундаментальные достижения в почвоведении, экологии, сельском хозяйстве на пути к инновациям». Москва, 23-25 апреля 2008 г. - М.: Издат. Центр
МГУ, 2008. С. 148-149
12. Свистова И.Д. Биологическая активность грибов рода Trichoderma /
И.Д. Свистова, Т.Ю. Сенчакова // Организация и регуляция физиологобиохимических процессов. Вып. 10. – Воронеж: ООО «ЦентральноЧерноземное книжное изд-во», 2008. С.239-243.
13. Свистова И.Д. Микробно-растительные взаимодействия в агроэкосистемах на примере микромицетов чернозема выщелоченного / И.Д. Свистова,
Т.Ю. Сенчакова // XXI съезд РБО «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века». Петрозаводск, 22-27 сентября 2008 г. Ч. 2. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2008. С. 162-165.
14. Сенчакова Т.Ю. Микробиоиндикация чернозема выщелоченного в агроэкосистемах / Т.Ю. Сенчакова, И.Д. Свистова // Материалы X Международной конференции «Живые объекты в условиях антропогенного пресса». Белгород, 15-18 сентября 2008 г. – Белгород: ИПЦ «ПОЛИТЕРРА», 2008. С. 197.
15. Свистова И.Д. Экологическая пластичность микромицетов рода Trichoderma / И.Д. Свистова, Т.Ю. Сенчакова // Материалы Международной научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем». Астрахань, 10-12 декабря
2008 г. – Астрахань: ООО «ПолиграфКом», 2008. С. 221-225.
16. Свистова И.Д. Микробиоиндикация чернозема выщелоченного в агроэкосистемах / И.Д. Свистова, Т.Ю. Сенчакова // Научные Ведомости БелГУ, сер.
Естественные науки. 2009. Вып. 8. № 3 (58). С. 119-123.
17. Сенчакова Т.Ю. Спектр биологической активности микромицетов
чернозема / Т.Ю. Сенчакова, И.Д. Свистова // Проблемы медицинской
микологии. 2009. №1. С.30-34.
21
Лицензия на издательскую деятельность
ИД № 06146. Дата выдачи 26.10.01.
Формат 60 х 84 /16. Гарнитура Times. Печать трафаретная.
Усл.-печ.л. 1,0 Уч.-изд.л. 1,2
Тираж 100 экз. Заказ 92
Отпечатано с готового оригинал-макета на участке оперативной полиграфии
Елецкого государственного университета им. И. А. Бунина
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Елецкий государственный университет им. И. А. Бунина»
399770, г. Елец, ул. Коммунаров, 28
22