ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СУЩЕСТВОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ

ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ
риологическим исследованием патологического материала, полученного при комиссионном диагностическом убое реагирующих животных (выделена M. bovis).
Источник возбудителя инфекции в этих
хозяйствах не был выявлен. По-видимому,
распространению туберкулеза крупного
рогатого скота в районе способствовали:
несвоевременная и неквалифицированная постановка диагноза (не использовались офтальмопроба и внутривенная туберкулиновая проба, не проводилась симультанная проба через 30–45 дней);
нарушение сроков массовых диагностических исследований; передержка реагирующих животных;
возможно несоблюдение режима пастеризации молока и обрата, как на неблагополучных фермах, так и на молокоперерабатывающем предприятии.
Используемый в течение 1,5 лет в неблагополучных хозяйствах метод систематических диагностических исследова-
ний животных с помощью ППД-туберкулина для млекопитающих, с последующей
сдачей на убой реагирующих, не позволил
оздоровить поголовье крупного рогатого
скота всех неблагополучных хозяйств. Оздоровление этим методом было достигнуто только в СПК «Острогожсксадпитомник», имевшем незначительное количество животных.
В ТОО «Кривополянское», «Должанское», «Красный май», «Девицкое» наиболее эффективным оказался метод полной
замены поголовья, в результате чего ограничения по туберкулезу были сняты в
1999–2000 гг., и район в настоящее время
считается благополучным.
Анализ оздоровительных противотуберкулезных мероприятий, проведенных
в Острогожском районе Воронежской области, показал, что метод полной замены
неблагополучного стада эффективнее метода систематических диагностических исследований.
УДК 619:616.579.873.21Т
И.Б. Павлова, Д.А. Банникова (ВНИИВСГЭ)
ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СУЩЕСТВОВАНИЯ
И РАЗВИТИЯ ПОПУЛЯЦИЙ МИКОБАКТЕРИЙ
Многие патогенные и потенциально
патогенные бактерии способны существовать и активно размножаться не только
в организме хозяина, но и в объектах окружающей среды: в почве, в воде, на растительных субстратах [2, 3, 4]. Совершенно очевидно, что перед патогенными бактериями, обитающими во внешней среде,
возникает очень сложная задача — быть
готовыми адаптироваться к условиям существования, качественно различающимся не только питательными субстратами,
но и всем комплексом биотических и абиотических факторов.
В настоящее время все больше осознается необходимость изучения экологии
патогенных микроорганизмов с широких
биологических позиций, привлечения популяционно-экологических подходов к решению фундаментальных и прикладных
аспектов этой сложной проблемы. Целесообразность использования сканирующего
электронного микроскопа в этой области
очевидна, т.к. он помогает понять закономерности развития и существования бактерий в окружающей среде.
Материалы и методы
В опытах использован паспортизиВетеринарная патология. № 1–2. 2004
рованный штамм Mycobacterium avium,
штамм № 61–97.
Для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) мембранные фильтры с
выросшими на них колониями микобактерий снимали с питательной среды и фиксировали парами 25%-ного глутарового
альдегида, обезвоживали в парах пропиленоксида. Образцы препаратов напыляли платиной 20 минут на установке «Hitachi-Е-102» и просматривали на электронном микроскопе со сканирующей приставкой «Hitachi-8010» при ускоряющем
напряжении 75 кВ и инструментальном
увеличении 1–10 тыс.
Для экспериментального исследования
морфологии и выживания клеток M.avium
в жидком навозе и воде в стерильную колбу на 100 мл вносили 50 мл стерильной воды и 20 г нативного навоза. Концентрация
клеток М.аvium составляла 109 кл/мл. Температурный режим хранения тест-культур +22–26° С, срок наблюдения 12 месяцев. Отбор проб проводили каждые 3 месяца. Пробы жидкого навоза фильтровали
через стерильный бумажный фильтр и наносили дозаторной пипеткой в количестве 0,5 мкл в центр мембранных фильтров
65
ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ
«Владипор» № 2, помещенных на поверхность среды Левенштейна-Йенсена. Чашки термостатировали при 37° С. Через 48–
72 часа учитывали рост культуры на поверхности фильтров. Для изучения морфологии клеток в популяции готовили препараты для световой и сканирующей электронной микроскопии.
Для исследования влияния температурного фактора на выживание клеток
М.avium культуру микобактерий выращивали на мембранных фильтрах при +42° С
и затем помещали в холодильник в условия
+4° С и -10° С. Срок наблюдения составил
120 суток. Исследование морфологии и выживания клеток проводили непосредственно после окончания времени экспозиции
опыта, а так же после высева исследуемых
образцов на среду Левенштейна-Йенсена
для изучения процессов реверсии культуры с использованием методов сканирующей электронной микроскопии.
Результаты исследований
Исследование выживания популяций
микобактерий в пробах воды и жидкого
навоза в сканирующем электронном микроскопе выявило существование клеток
Mycobacterium avium в микроколониях, закрытых покровами. Отмечено, что в голодной среде обитания (вода) покровы гладкие и более тонкие, часто выявляются места нарушения целостности покровов. В таких участках видны клетки микобактерий,
объединенные межклеточным матриксом (рис. 1). При обитании микобактерий
в жидком навозе, где имеется питательный
субстрат, при СЭМ выявили формирование
плотных, бугристых покровов (рис. 2).
Общим для выживания популяций патогенных микобактерий в жидком субстрате
была постепенная адаптация клеток в виде
гетероморфизма с проявлением L-трансформации, что проявилось в поздние сроки
наблюдения — 10–12 мес. (рис. 3). При высеве таких культур на среду ЛевенштейнаЙенсена наблюдали типичный рост культуры M.avium, что свидетельствовало о реверсии клеток в исходную форму.
Адаптационная способность микобактерии в виде L-трансформации — закономерное явление, связанное с воздействием
на популяции клеток абиотических факторов.
Полученные нами экспериментальные
данные позволяют заключить, что микобактерии способны не только выживать,
но и размножаться на объектах окружающей среды.
Другим разделом работы явилось изучение влияния температурного фактора на
морфологию клеток микобактерий в популяции.
При температуре +42° С культура ми66
кобактерий развивалась очень интенсивно, в течение 18–20 часов культивирования
на мембранных фильтрах, помещенных на
среду Левенштейна-Йенсена, появлялся
обильный рост. Культура при этом имела
плотный гладкий покров.
Рядом исследователей показано, что
при высоких температурах в клеточных
стенках микобактерий увеличивается синтез миколовых кислот с высокой углеродной цепью (С60–С90). Следовательно, повышается и содержание в популяции кордфактора — 6,6-димиколат трегалозы —
специфического гликолипида патогенных
микобактерий, ответственного за вирулентность микобактерий [1].
Изучение развития микобактерий при
пониженных температурах (+4° С) подтвердило точку зрения целого ряда исследователей о том, что снижение температуры вызывает уменьшение количества миколовых кислот и корд-фактора. При этом
при низких температурах клеточные стенки и продуцируемые ими экзопродукты
содержат больше ненасыщенных кислот
с короткой углеродной цепью (С10–С12),
что объясняется адаптацией клеток в ответ на изменение температуры окружающей среды [5, 6]. При низких температурах
синтез ненасыщенных кислот способствует сохранению проницаемости и текучести
мембран и контролируется на уровне плазмид. Такая температурная адаптация имеет
исключительно важное значение для выживания клеток.
На сканограмме (рис. 4) видно, что при
+4° С покровы на поверхности клеток истончаются. При этом становится видна
структура популяции, разделенная на отдельные кластры, в каждом из которых клетки имеют определенную ориентацию и находятся в ассоциации за счет межклеточного матрикса. Палочковидная форма клеток микобактерий в данном эксперименте, а так же их размер и наличие межклеточного матрикса предполагало способность популяции быстро реверсировать в
исходное состояние при благоприятных условиях. Данное предположение было подтверждено при перенесении мембранных
фильтров с культурой на свежую среду Левенштейна-Йенсена при +37° С. При этом
наблюдали быстрый рост культуры, имеющей характерную пигментацию. Исследование в СЭМ препаратов из таких культур
показало наличие на поверхности клеток
массивных покровов (рис. 5).
Сканирующая электронная микроскопия культуры микобактерий, хранившихся
при -10° С, выявила значительную деградацию покровов на поверхности клеток. Отдельные клетки в популяции имели измененную форму (рис. 6).
Ветеринарная патология. № 1–2. 2004
ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ
Остатки покровов
Рис. 1. Микроколония M. avium. В участке повреждения покровов видны клетки микобактерий. Проба воды, 3 мес. СЭМ, × 3000.
Рис.3. Фрагмент микроколонии M.avium. Видны
измененные клетки на стадии L-трансформации. Проба воды, 10 мес. СЭМ, × 8000.
Рис. 5. Микроколонии М. avium. Реверсия культуры при +37° С. СЭМ, × 5000.
Ветеринарная патология. № 1–2. 2004
Рис. 2. Микроколония M. avium. Клетки закрыты с поверхности плотным покровом. Проба
жидкого навоза, 3 мес. СЭМ, × 3000.
Рис. 4. Фрагмент отдельного кластра в колонии
М.avium (+4° С). СЭМ, × 4000.
Рис. 6. Фрагмент колонии М. avium (-10° С).
СЭМ, × 10000.
67
ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ
Таким образом, адаптационная способсокой устойчивостью к воздействию абионость микобактерий в условиях экстретических и биотических факторов окружамальных температур проявляется в текующей среды;
чести липидов, продуцируемых клеточны- стратегия выживания популяций мими стенками, главным образом миколовых
кобактерий связана с адаптационными мекислот и корд-фактора.
ханизмами, проявляющимися в регуляции
Важно отметить, что культивировасинтеза клеточной стенкой сложного комние M. avium при пониженных температуплекса липидов. Это проявляется в уменьрах (+4° С, -10° С) существенно не влияет
шении синтеза миколовых кислот и кордна жизнеспособность популяции, но, можфактора при пониженных температурах,
но полагать, приводит к временному сничто морфологически выражается в дегражению патогенности, обусловленному знадации наружных покровов и гетероморчительным уменьшением синтеза миколофизме клеток. Высокие температуры, навых кислот и содержания корд-фактора,
против, вызывают увеличение синтеза мичто морфологически проявляется в деграколовых кислот и корд-фактора, что продации покровов на поверхности клеток миявляется в образовании массивных покрокобактерий.
вов на поверхности клеток микобактерий.
Заключение
Таким образом, особую опасность для расЭкспериментальными исследованияпространения туберкулезной инфекции
ми популяций патогенных микобактерий
представляют условия повышенных темптичьего вида с использованием методов
ператур.
сканирующей электронной микроскопии
Несмотря на структурно-функциональизучены факторы выживания и выявлены
ные изменения, происходящие в популяструктурно-функциональные изменения в
циях микобактерий при воздействии разпопуляции клеток при их существовании в
личных факторов окружающей среды, поокружающей среде. К ним относятся:
казана способность клеток микобактерий
- способность клеток длительное время
реверсировать в исходное состояние при
выживать в микроколониях и колониях в
благоприятных условиях.
водной среде и на плотном субстрате, проАдаптационные механизмы, присущие
являя адаптационную изменчивость в виде
популяциям патогенных микобактерий,
гетероморфизма с проявлением L-транспозволяют им длительно выживать и цирформации при неблагоприятных условиях;
кулировать в окружающей среде, что обус- способность клеток продуцировать
ловливает особое санитарное и эпидемиомежклеточный матрикс и массивные поклогическое значение возбудителей туберровы липидной природы, обладающие выкулеза.
Литература
1. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов. МГУ. 1984. С. 157.
2. Литвин В.Ю., Гинсбург А.Л. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерии. М.: НИИЭиМ. 1998.
3. Сомов Г.А., Литвин В.Ю. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий // Новосибирск: Наука. 1988. С. 5.
4. Пушкарева В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах: Дисс. ... д.б.н.,
М., 1994.
5. Rilfors L. et al. Lipid and protein composition of
membranes of Bacillus megaterium variants in the
temperature range 5 to 70° C // J. Bacteriol. 1978. Vol.
135. N 3. P. 1043–1052.
6. Shleeva M. et al. Formation and resuscitation
of non-culturable cells of Rhodococcus rhodochrous and Mycobacterium tuberculosis in prolonged stationary phase // Microbiology. 2002.
148. N 5. P. 1581–1591.
УДК 619:616.579.873.21Т
Н.И. Баскаков, В.А. Бархударян, А.Н. Деринов
(Комитет ветеринарии при Правительстве Калужской области)
СИСТЕМА КОНТРОЛЯ ЭПИЗООТИЧЕСКОГО
СТАТУСА СТАД КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
ПО ТУБЕРКУЛЕЗУ В ХОЗЯЙСТВАХ
КАЛУЖСКОЙ ОБЛАСТИ
Из всех инфекционных заболеваний
наибольший экономический ущерб животноводству причиняет туберкулез. Убикви68
тарность и устойчивость возбудителя, социальная опасность, сложность в диагностике ранних форм и дифференциация диаВетеринарная патология. № 1–2. 2004