К оролева С ветлана Ю рьевна Разработка адекватной м одели
advertisement
Н а правах рукоп иси К о ролева С ветлана Ю р ьевн а Р азрабо тка адек ватн о й м одел и оц ен ки со стояни я эк осистем ы на п рим ере по пул яци и м и к р о о р ган и зм о в С п е ц и а л ь н о с т ь 0 3 .0 2 .0 8 « Э к о л о г и я » А ВТО РЕФ ЕРА Т ди ссер тац ии н а сои скан ие у чен ой степени кан ди дата би ологи ческ и х н аук М осква 2010 Р аб о та в ы п о л н ен а н а каф ед ре эк о л оги и и п ри р о д о п о льзован и я М еж дун ародн ого у н и в ерси тета п ри роды , общ ества и ч еловека «Д убна» ф и лиала «У греш а» Н ау чн ы е р у к ов о ди тел и : доктор би ологически х наук, п роф ессор Л обак о ва Е л ен а С ергеев н а, д ок то р техн и ческ и х н аук, п р о ф ессо р Б а л оя н Б абк ен М у ш его ви ч О ф и ци альн ы е опп онен ты : д ок тор б иологич ески х н аук, п роф ессор Х ром ов В иктор М ихайлович д ок тор б иологич ески х н аук, п роф ессор У м аров М арат М утагарови ч В ед ущ ая орган и зац и я: М оск овск и й Г осу дар ствен н ы й У н и в ерси тет техн о л о ги й и у п рав лен и я Защ и та со стои тся ди ссер тац и о н н ого госу дар ствен н о м 4 ию ня сов ета 2010 г. в 1 4 00 Д .5 0 1 .0 0 1 .5 5 ч асов при на засед ан и и М осковском у н и в е р с и т е т е и м . М .В . Л о м о н о с о в а п о а д р е с у : 1 1 9 9 9 1 , М о сква, Л ен и н ски е го р ы , М Г У , би о л оги чески й ф ак у л ь тет, ауд. 389. С ди ссер тац и ей м о ж н о озн ак о м и ть ся в б и б л и о теке би о л о ги ч еск ого ф а к у л ь т е т а М Г У и м . М .В . Л о м о н о с о в а . А втореф ерат разослан « 4 » м ая 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Н. В. Карташева 2 Актуальность темы. Процессы антропогенного воздействия на природу достигают глобальных масштабов, отсутствие контроля над ними может привести к непредсказуемым последствиям. Эти проблемы порождены и интенсивным загрязнением планетарной экологической системы, и экологически необоснованным использованием природных ресурсов, при котором подрывается сама возможность природы к воспроизводству возобновимых ресурсов, а невозобновимые ресурсы могут быть исчерпаны быстрее, чем человечество сумеет перестроить свою хозяйственную деятельность. В этих условиях представляется чрезвычайно важным иметь организованный контроль состояния природной среды, ее непрерывных изменений и определять тенденции изменений, иначе говоря, иметь высокоэффективную систему мониторинга. Систему, для создания которой важно понимание, что окружающая природная среда реагирует на антропогенные воздействия, как иерархически структурированная целостная планетарная экологическая система, а не как конгломерат компонентов. Только совместное применение методов и представлений различных направлений в экологии может позволить получать адекватную оценку состояния экосистем и успешно прогнозировать изменения состояния последних. Деградация природной среды в результате антропогенной деятельности приобрела всеобщий угрожающий характер. Часто возникает необходимость быстрой предварительной оценки динамики изменений, степени динамики деградации природных экосистем. Для оценки состояния природных экосистем только химических показателей недостаточно. Прежде всего, необходимы биологические показатели оценки состояния природных систем. Представленная работа посвящена разработке одного из возможных подходов к решению этой проблемы – разработке эмпирической модели оценки состояния экосистем на примере популяций микроорганизмов. Цель и задачи исследования. Цель исследования – на примере популяций микроорганизмов разработать эмпирическую модель оценки состояния биосистемы, позволяющую определять динамику и степень ее изменений. Для этого были поставлены следующие задачи: 1/ выделить основные закономерности и определить параметры, характеризующие состояние сложных биологических систем; 2/ определить параметры, характеризующие состояние культур микроорганизмов как модели сложных биологических систем; 3 3/ разработать методологию измерения и анализа указанных параметров для различных культур микроорганизмов; 4/ опробировать разработанную методологию на клетках макроорганизмов с целью проверки ее практической применимости. 5/ показать возможность использования данной методологии для оценки состояния биогеоценозов. Научная новизна. Впервые в разработку методологии оценки состояния сложных биосистем положен принцип подобия закономерностей развития на макро и микроуровнях; при этом для разработки параметров оценки состояния биосистем и их анализа предложен энтропийный подход. Впервые показано, что разработанную методологию оценки состояния по степени пространственной организации различных слоев целых клеток для контроля состояния популяции микроорганизмов возможно применить для контроля состояния отдельных макроорганизмов – по состоянию их клеток, и всего биогеоценоза, который включает и микроорганизмы и макрообъекты. В работе впервые с помощью методов послойного неинвазивного анализа были изучены возможности энтропийного подхода для определения свойств клеток биосистем. Показана зависимость между состоянием организма и различием в соотношении между пространственной организацией всей клетки и ее внешних структур. Показана зависимость между состоянием организма в норме и при внешних воздействиях по указанным выше характеристикам. Практическая значимость работы. 1/ Метод позволяет оценивать характер и степень изменения состояния биосистемы независимо от характера воздействий на нее. 2/ Разработанный метод оценки состояния по степени пространственной организации различных слоев клеток организмов для контроля состояния популяции микроорганизмов возможно применить для контроля состояния как отдельных макроорганизмов – по состоянию их клеток, так и всего биогеоценоза, который включает и микроорганизмы и макроорганизмы. Приведенные в работе выводы и рекомендации, результаты экспериментальных исследований могут быть использованы для получения объективных данных о состоянии популяций и сообществ. 4 3/ В силу того, что реакция микроорганизмов на любые воздействия происходит очень быстро, данный метод позволит оперативно диагностировать и контролировать изменение состояния биосистемы. 4/ Универсальность. Предложенная в работе методология оценки состояния сложных биосистем может быть использована в полевых условиях, лабораториях, промышленности и в учебном процессе. При этом она может эффективно применяться для комплексного экспресс-анализа состояния всего биогеоценоза, так и для отдельных его звеньев. Апробация результатов работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на: Четвертой Международной научной конференции «Электромагнитные излучения в биологии: БИО-ЭМИ-2008», Калуга, 2008; Всероссийской дистантной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной физики», Россия, г. Краснодар, 15 июня 2008 г.; 5-ом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 16-20 марта 2009 г.; X Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков», Москва, 23 — 26 июня 2009 г.; 5 Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург 29.06. - 03.07. 2009 г.; Конференции молодых ученых Росгидромета, посвященной 100-летию со дня рождения академика Е.К. Федорова, 16-19 ноября 2009 г., ИПГ им. Е.К. Федорова. Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ (в списке публикаций выделены жирным шрифтом). ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Современный взгляд на проблемы экологического контроля. Отмечается, что система экологического контроля на всей территории России основана на концепции предельно допустимых концентраций (ПДК) загрязняющих веществ. Показано (Abakumov, Sushenya, 1992), что эта система контроля малоэффективна. Альтернативой методологии ПДК предложена концепция экологической толерантности, устанавливающая допустимые уровни воздействий для биотической части реальных экосистем (Максимов, 1991). При всем разнообразии подходов к решению этой проблемы ни один из них не привел пока к разработке какого-либо метода, который можно было бы 5 безоговорочно рекомендовать для практического использования. Именно поэтому в существующих системах экологического мониторинга применяются лишь экспертные оценки качества природной среды (Максимов, Булгаков, Левич, 2000), где игнорируются биотические отношения между популяциями в реальных сообществах. Попытка исправить этот недостаток была предпринята В.А. Абакумовым (Руководство..., 1992) на основе представлений об экологических модификациях. Предпринимаются попытки отыскать экологические закономерности, предлагающие более убедительные, чем экспертные, основания для экологической диагностики. Работы в этом направлении проводились и проводятся (Левич, 1996; Левич, Федоров, 1978; Федоров и др. 1981, Булгаков и др., 1995). Для оценки допустимых уровней антропогенного воздействия на экосистемы был предложен метод экологически допустимых уровней (ЭДУ). Он основан на концепции экологической толерантности и позволяет выявлять в пространстве абиотических факторов задаваемые исследователем по определенным биоценотическим характеристикам границы состояния нормы и патологии экосистем (Максимов, 1991; Замолодчиков, 1992; Левич, Терехин, 1997; Максимов, Булгаков, Левич 2000; Булгаков, 2002; Максимов, Булгаков, Левич, 2004). Существующие подходы к нормированию и управлению качеством среды позволяют, в лучшем случае, эффективно минимизировать негативные последствия человеческой деятельности, но не позволяют достоверно судить о качестве среды, разрабатывать реалистичные сценарии развития инициированных в экосистемах процессов и прогнозировать их последствия. В этой связи, актуальны поиски новых подходов к оценке качества среды (Смуров, 2003). Поиск новых подходов к оценке состояния экосистем является одной из задач данной работы. Для ее реализации мы обратились к понятиям об экологических модификациях, развиваемым В.А. Абакумовым (Абакумов, 1991, 2006). Глава 2. Положения теории экологических модификаций Существование биоценозов в широком диапазоне изменений окружающей среды возможно благодаря приспособительным изменениям биоценозов экологическим модификациям. Анализируя изменения, происходящие в биоценозах, теория выделяет три общих направления, связанные с тремя различными путями изменения экологической структуры биоценозов: экологический прогресс (связан с усложнением экологической структуры), 6 экологический регресс (связан с упрощением экологической структуры) и экологическая модуляция (связана с перестройкой экологической структуры, не ведущей к ее усложнению или упрощению). Все изменения экологической структуры биоценозов, связанные с этими направлениями, и были названы экологическими модификациями (Абакумов, 1979, 1985). Многие исследователи указывают на аналогию между развитием биоценоза и онтогенезом организмов. Ю. Одум указывает на «множество параллелей» между развитием экосистем и развитием организмов (Абакумов, 1975). На основании данной теории выделим параметры, характеризующие состояние экосистем и сформулируем соответствующие параметры для микроорганизмов, характеризующие их состояния. Глава 3. О взаимосвязи параметров экосистем с параметрами организмов. Теория модификаций обращает внимание на возможность использования показателей развития организмов для характеристики состояния экосистем. Для контроля за состоянием экосистем возможно использовать организмы (в частности, микроорганизмы), входящие в них, т.к. при определенном изменении среды система откликается соответствующей "реакцией", отражающейся в изменении параметров организмов в соответствии с состоянием экосистемы. Она проявляется либо в количественном варианте (изменение градиентов тех или иных биохимических компонентов в определенном объеме клетки, изменение градиентов степени пространственной организации этих биохимических образований), либо в качественном варианте (изменение векторов изменений градиентов концентраций биохимических компонентов, изменение векторов изменений градиентов степени пространственной организации). Это и было показано в экспериментах. Чтобы рассмотреть возможности практической реализации сказанного, на примере экологического прогресса выделим базовые параметры экосистемы, характеризующие ее состояние и сформулируем соответствующие им параметры клеток организмов, в частности, в популяции микроорганизмов: Экосистема увеличение разнообразия биоценоза, в частности в увеличении общего числа видов уменьшение энтропии Популяция микроорганизмов (пм) появление различныех форм и размеров клеток при рассинхронизации повышение структурированности в пространственной организации клетки, дихроизм молекулярных структур биохимических составляющих клеток 7 усложнение межвидовых отношений логарифмическая и стационарная фазы развития пм пространственное перераспределение концентраций биохимических компонентов в клетке то же при рассинхронизации увеличение пространственной гетерогенности усложнение временной структуры – увеличение набора временных характеристик различных организмов в экосистеме вследствие увеличения видового разнообразия и разнообразия связей увеличение длины жизненных циклов увеличение продолжительности жизни на каждом последующем этапе развития то же для пм увеличение устойчивости к внешним возмущениям – увеличение диапазона устойчивости и уменьшение времени восстановления Все перечисленные параметры показывают взаимосвязь между пространственными и временными характеристиками биосистем разных рангов. Поэтому для решения поставленных задач необходимо найти возможность контроля перечисленных выше параметров клеток организмов. Для этого воспользуемся энтропийным подходом. А затем сформулируем требования к методам для решения указанной задачи. В качестве объектов исследования были использованы самые разнообразные организмы. Но для большинства экспериментов были использованы культуры микроорганизмов. Во-первых, микроорганизмы - одна из основных доминантных частей любой экосистемы. И, во-вторых, это своего рода собирательное понятие о способах существования земных организмов: 8 способов существования (Гусев, Минеева, 2004). Глава 4. Энтропийный подход в оценке состояния живых систем. Информационные процессы в реальных системах связаны с изменением структурной энтропии системы. И при соответствующем выборе единиц информация, записанная в системе, будет равна разности энтропии системы до записи и после (Сарычев, 1997). Эту энтропию можно связать с неупорядоченностью, мерой беспорядка, мерой дезорганизации (Хайтун, 2005). И чтобы «наблюдать» за информационными процессами в реальных системах, связанными с изменением структурной энтропии, необходимо определять изменение степени упорядоченности структур в живых системах. Неживая природа развивается на основе объективных законов, т.е. имеет полную информацию. Следовательно, энтропия информации (ЭИ) равна нулю. 8 Живая природа, также развиваясь на основе объективных законов, дополнительно имеет «субъективные» составляющие. Эти составляющие различны для отдельных видов живой природы и формируются всей совокупностью живой и неживой природы. Субъективная составляющая развития когнитивной структуры информации живой природы всегда имеет неопределенность, обусловленную бесконечностью информационной картины мира и конечностью субъективных откликов на нее живой природы. Поэтому ЭИ в этом случае имеет определенное значение. И полной симметрии между формируемым живой природой информационным потоком действительности и самой действительностью быть не может. Равенство нулю ЭИ для неживой природы сопровождается стремлением к максимуму ее энтропии как материальной системы. Для этих же энтропий в отношении живой природы характерна обратная взаимозависимость: чем выше уровень организации, т.е. чем меньше энтропия в материальном смысле, тем больше ЭИ живой природы. Чем на большем уровне организации стоит данная форма жизни, т.е. чем меньше неопределенность в материальной области, тем больше неопределенность в идеальной области. Объяснение этому положению можно найти в работе (Заличев, 1995). Рассмотрим один из вариантов получения подобной информации в экспериментах. Структура является основой функционирования любой системы, определяя ее разнообразные свойства. Материальным носителем жизнедеятельности организма является структурная организация живого объекта. Причем индикатором на изменения состояния живой системы должны явиться динамические изменения (динамика изменения градиентов, потоков этих изменений, скоростей и направлений) пространственной и временной организации материального носителя "состояния" организма, учитывающего глубокую общность и взаимосвязь морфологии, физиологии и биохимии клетки. Исследования в таком направлении должны располагать методической базой, которая должна обеспечить: 1) проведение анализа многокомпонентных гетерогенных систем без их разрушения; 2) определение динамики изменения градиента концентрации во времени; 3) определение динамики изменения градиента степени пространственной организации; 4) использование статистические методы анализа и синтеза. Нас должна интересовать возможность получения информации, позволяющей судить не только о наличии или количестве в клетках важнейших 9 биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов), но и об их пространственном распределении, а также структурной организации в клетках, одним из параметров которой является определенная ориентация в макромолекулах определенных химических связей. Можно предположить, что преимущественная ориентация определенных химических связей в ансамблях макромолекулярных компонентов клеток характеризует организованность биосистемы (соответственно и ее функциональное состояние) в определенный момент времени. Именно это узкосмысловое толкование вкладывается в понятие структурных изменений биополимеров клетки, которым будем оперировать ниже. Причиной, порождающей появление ЭИ, является несоответствие внутренних законов развития данного фрагмента материи законам окружающей его среды. Для устранения этого (адаптация) система изменяет обмен информацией со средой, что реализуется через внешние структуры клетки. Исходя из сказанного, мы предположили, что степень общения следует регистрировать именно во внешних структурах организма через изменение степени пространственной организации (упорядоченности) химических связей молекул биополимеров. Регистрируя же это в целой клетке, получаем данные по структурной энтропии. Для анализа возможной взаимосвязи теории и эксперимента мы обратились к понятиям изотропности или анизотропности системы. Для этого экспериментально необходимо получить данные о наличии, распределении и пространственной упорядоченности биополимеров в клетках. Глава 5. Выбор аналитических подходов для регистрации параметров, характеризующих поведение биосистем. 1/ Выбор метода. Как уже было отмечено, структура является основой функционирования любой системы, определяя ее разнообразные свойства. Причем индикатором на изменения состояния живой системы, в том числе и при изменении среды обитания, должны явиться динамические изменения (динамика изменения градиентов, потоков этих изменений, скоростей и направлений) пространственной и временной организации материального носителя "состояния" организма, учитывающего глубокую общность и взаимосвязь морфологии, физиологии и биохимии клетки. Выше были также сформулированы требования к методической базе, которая должна обеспечить выполнение решения перечисленных задач. На основе спектральных данных можно обеспечить получение информации об 10 определенных изменениях в структурах клетки, т.к. спектральная характеристика связана со строением атомов и молекул и отражает все изменения, происходящие в них в процессе наложения внешних разнородных электромагнитных волн или в процессе отдачи ими информации. Следует особо подчеркнуть, что речь идет о возможности "послойного" анализа многокомпонентных гетерогенных систем, независимо от их происхождения. Наиболее полно в настоящее время отвечают перечисленным выше требованиям методы спектроскопии внутреннего отражения (СВО) /Харрик, 1971/. Данный метод позволяет вести анализ клеток послойно без их разрушения. Был выбран ИК диапазон светового излучения, т.к. в нем четко проявляются спектры основных биохимических присутствующих в клетках любого организма. составляющих, Глава 6. Особенности получения заданных характеристик культуры микроорганизмов, аналогичных параметрам состояния экосистем. Экспериментальные данные в виде ИК спектров получены в поляризованном свете (угол падения измерительных элементов удобно выбрать равным 45°, так как для него в случае изотропного распределения молекул dэф║/dэф┴ = 2 (dэф┴, dэф║ - эффективные толщины исследуемого образца для перпендикулярной и параллельной компонент плоскополяризованного света). Оценка эффективной толщины проводилась по оптической плотности (D), которая связана с dэф зависимостью D = lnR = aNdэф, где R - коэффициент отражения, измеряемый в опыте; α - показатель поглощения, см -1 (α = εС; ε - экстинкция, л/см. моль; С - концентрация, моль/л); N - число отражений в элементе. Любое отклонение этого значения от dэф║/dэф┴ = 2 характеризует преимущественную ориентацию образца относительно плоскости падения света. В работе был использован ИК пленочный реплика-поляризатор на основе полиэтилена 1200 штрихов/мм, степень поляризации 95-96%, пропускание поляризатора 46-48%. Для регистрации сигнала использовали преобразование сигнала с ИК спектрофотометра ИКС-29 мультиметром METEX ME-22 для ввода в РС-ЕТ и последующего анализа данных на базе стандартной программы «MICROSOFT EXCEL», позволяющей провести обсчёт площадей поглощения. Проведены статистические обработки результатов измерений. Спектральные характеристики ИК диапазона в поляризованном свете анализировались по полосам поглощения амид 1 и амид 2. Они дали информацию о пространственной организации определенных химических 11 связей, которые принадлежат вновь образованным макромолекулярным комплексам. Это дает возможность охарактеризовать указанные параметры организованности биосистемы и получить информацию о динамике ее изменений в процессе самоорганизации. Изменения спектральных характеристик зависят от концентрации компонентов образца, изменений пространственной организации макромолекул при неизменном биохимическом составе и от суммарного изменения характеристик объекта по указанным параметрам. 1/ Возможности экспериментального анализа целых клеток культуры микроорганизмов «по слоям». Проведенные эксперименты подтвердили возможность получения указанных выше параметров клеток, необходимых для диагностики и контроля. Примененный для этих целей метод СВО в ИК диапазоне может дать информацию о наличии биохимических компонентов, идентифицируемых по их спектральным характеристикам в заранее определенном, измеряемом слое клетки. Спектральные характеристики, полученные в поляризованном свете, дают информацию о процессах, которые связаны с пространственной переориентацией молекулярных связей отдельных (например, белковых) макромолекул. Таким образом, имеется возможность получать информацию о градиентах как биохимического состава, так и о градиентах пространственной организации клеток, а также о динамике этих изменений во времени. Сформулируем предварительно условия для получения спектральной информации с разных глубин проникновения светового потока в клетку: 1) появление в спектрах, полученных с разных глубин, новых полос поглощения или исчезновение ранее обнаруженных полос; 2) если различаются концентрации биохимических компонентов в разных структурах клетки, то на разных глубинах должно изменяться соотношение полос поглощения, характеризующих эти компоненты; 3) получение различных дихроичных отношений на разных глубинах. 12 Рис 1. Пропадание (проявление) полосы поглощения в области 1240 см-1: 1- спектры, полученные на элементе из КО-2, 2- спектры, полученные на элементе из германия Выполнение этого условия проверено по спектральным характеристикам Anacystis nidulans, полученным на ИЭ, изготовленных из германия и материала КО-2, обеспечивающих глубину проникновения светового потока в клетку примерно на 0,3 и 1,5 мкм соответственно (рис.1). Рис. 2. Различные дихроичные отношения для всех полос. А — характеристики, полученные на элементе из германия; Б — характеристики, полученные на элементе из КО-2: 1 - в параллельно поляризованном свете, 2 - в перпендикулярно поляризованном свете ИЭ из германия не обеспечивает получения характеристики с полосой в области 1240 см-1; характеристика, полученная на элементе из КО-2, содержит полосу поглощения в области 1240 см-1. Расчет дихроичных отношений также свидетельствует о различии характеристик, полученных на разных элементах (рис.1). Дихроичные отношения полосы поглощения 1660 см -1 составляют 2,3 (элемент из германия) и 1,4 (элемент из КО-2), полосы поглощения 1550 см -1 - соответственно 2,9 и 1,5. С учетом возможности контроля характеристик во времени можно сказать, что практически все параметры, аналогичные параметрам состояния экосистемы, могут быть получены практически с любого организма. Проведем своего рода контрольный опыт, 13 который должен продемонстрировать динамику изменения параметров клеток во времени. 2/ Культуры микроорганизмов как активный «механизм» информационного взаимодействия. Цель опыта - демонстрация возможности получения данных о процессах, происходящих как в целых клетках, так и во внешних структурах клетки. Объектами были морские одноклеточные зеленые водоросли D. tertiolecta. Контролировали клетки сразу после внесения инокулята, после 5-и, 15-и, 30-и и 50-и суток культивирования. В процессе опыта у клеток разного возраста были обнаружены существенные различия в спектрах поглощения в области 1660 см-1 и 1550 см-1, которые принадлежат белковым компонентам. Расчет дихроичных отношений свидетельствует о структурных и биохимических изменениях, происходящих во внешних слоях клеток. Т.о., в «контрольном» эксперименте получены данные об изменениях, происходящих в целых клетках, их внешних структурах, меняющемся биохимическом составе и пространственной организации макромолекул важнейших биополимеров в процессе культивирования микроводорослей. Степень пространственно-временной организации структур клеток, через которые осуществляется взаимодействие со средой обитания, характеризует изменения живой системы в зависимости от этапа развития и от характера взаимодействия со средой обитания. Проведенные «контрольные» опыты позволили подойти к поиску закономерностей, характеризующих состояние популяции микроорганизмов таким образом, чтобы можно было использовать эти данные при построении эмпирической модели на базе культуры микроорганизмов для оценки состояния экосистем. Глава 7. ИССЛЕДОВАНИЯ ВЗАИМОСВЯЗИ В ИЗМЕНЕНИЯХ СТРУКТУР И ФУНКЦИЙ ИНТАКТНЫХ КЛЕТОК Как отмечено выше, равенство нулю ЭИ для неживой природы сопровождается стремлением к максимуму ее энтропии как материальной системы. Для этих же энтропий в отношении живой природы характерна обратная взаимозависимость. Развитие живой природы, сопровождающееся структурированием в материальной области, ведет к большей информационной зависимости данной структуры от окружающего мира. Чем на большем уровне организации стоит данная форма жизни, т.е. чем меньше неопределенность в материальной области, тем больше неопределенность в идеальной области. 14 Мы также предположили, что параметрами, характеризующими энтропии, являются дихроичные отношения для целых клеток и их внешних структур (характеристика степени их пространственной организации). Сказанное означает, что сопоставление дихроичных отношений должно характеризовать изменение состояния живой системы. Цифровые значения ДО должны характеризовать степень изменения состояния системы. Изменения во времени характеризуют скорость этих изменений. Все это было показано экспериментально. В работе приведены данные не только собственных исследований, но и работы ряда авторов (авторы указаны), данными которых, при условии определенной их трактовки, можно воспользоваться для обоснования нашего подхода, изложенного выше. 1/ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВЕГЕТАТИВНЫХ КЛЕТОК И КРИПТОБИОТИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ СПОР. В данном разделе показано, что стремление к минимуму дихроичных отношений (ДО) во внешних структурах клеток сопровождается стремлением к максимуму ДО для целых клеток и чем выше степень упорядоченности (уровень организации), т.е. чем меньше ДО для клеток, тем больше ДО для внешних структур. Представлены данные /Дуда и др., 1978/ о пространственной организации вегетативных клеток и спор культуры анаэробной почвенной бактерии Clostridium pectinofermentans 15. Методом МНПВО в ИК диапазоне были получены сведения о пространственной упорядоченности биополимеров как в целой интактной споре, так и в заранее определенном, ее измеряемом слое. Получены данные об изменении гетерогенности структурной организации клетки в процессе перехода: вегетативное состояние - спора. Результаты представлены в таблице. Целым живым клеткам контрольной культуры свойственна определенная степень пространственной упорядоченности для белковых компонентов. Дихроичные отношения для этих же полос, полученные из внешних структур клеток (~0,2 мкм), свидетельствуют об изотропном характере распределения. Однако для спор получены совершенно иные результаты: особого внимания, на наш взгляд, заслуживает факт изотропности при просмотре целой споры. Для споры наибольшая упорядоченность, характеризуемая полосами поглощения амидных связей, наблюдается во внешних слоях (0—0,25мкм), включающих клеточные структуры от экзоспориума до внутренней споровой мембраны. 15 Процесс спорообразования сопровождается макромолекулярного матрикса внешнего слоя. структурированием Дихроичные отношения некоторых полос поглощения для вегетативных клеток Cl. p. Фаза развития Лаг-фаза Логарифмическая фаза Стационарная фаза Толщина слоя, мкм 1,0 0,25 1,0 0,25 1,0 0,25 Амид 1 Амид 2 2,25 1,90 1,74 2,09 1,74 1,98 1,62 1,90 1,56 2,07 1,62 2,00 Дихроичные отношения некоторых полос поглощения для спор Cl. p. Толщина слоя, мкм 1,0 0,25 Амид 1 Амид 2 2,0 1,3 2,0 1,3 Установлено, что внешний слой споры (0-0,25 мкм) представляет собой упорядоченную структуру в отличие от вегетативной клетки, у которой внешний слой изотропен. В итоге, спора в целом - изотропна, а вегетативная клетка в значительной степени упорядочена. Таким образом, получили характеристику максимальной устойчивости для данного вида микроорганизмов. Вывод: т.к. спора представляет собой наиболее устойчивое состояние для данного вида микроорганизмов, экспериментально показано, что в наиболее устойчивой системе разница между ДО для внешних структур и целых клеток максимально возможная. 2/ АНАЛИЗ ГЕТЕРОГЕННОСТИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ПРИ РЕГИСТРАЦИИ ИЗМЕНЕНИЯ ГРАДИЕНТА БИОХИМИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОК Эмпирически показано, что увеличение гетерогенности в биосистеме (повышает устойчивость системы) находит отражение в изменении разности ДО в большую сторону. В данном разделе использованы данные по динамике развития гетерогенности при культивировании синхронных культур НаlоЬасtrium halobium в качестве "инструмента" исследования (Чекулаева, 1983). На примере галофильных микроорганизмов рассматривалась возможность изучения отличий делящихся клеток гетерогенной и синхронной культур при регистрации изменений градиента концентрации биохимических компонентов 16 нативных клеток с помощью анализа изменений интенсивности полос поглощения и дихроичных отношений. Результаты представлены в таблице. В таблице приведены расчетные данные периодов развития культуры. Из таблицы видно, что соотношение указанных полос для синхронной и несинхронной культур значительно отличается. Дихроичные отношения полосы амид1 синхронной и несинхронной культур в различные часы роста Несинхронная культура Время, час. 3 4 5 6 7 8 Синхронная культура анализируемый слой внешние структуры 2,0 2,1 2,0 2,0 1,9 2,1 вся клетка 1,6 1,7 1,5 1,6 1,5 1,6 внешние структуры 1,8 1,9 1,8 1,9 2,0 1,9 вся клетка 1,6 1,6 1,5 1,5 1,5 1,5 Расчет дихроичных отношений спектров с разных глубин проникновения света для синхронной и несинхронной культур показал, что клеткам свойственна определенная степень упорядоченности находящихся в них биополимеров, которая почти исчезает для слоя, затрагивающего лишь внешние структуры. Результаты, полученные для несинхронной культуры, практически совпадают со сказанным выше, а для синхронной - значительно отличаются: анизотропия наблюдается даже в тех областях поглощения, где она не выявлена для несинхронной. При рассинхронизации культуры величины дихроичных отношений практически стали совпадать с величинами, характеризующими несинхронную культуру. Полученные результаты дают основание предположить, что является перспективным использование синхронных культур клеток в качестве одного из "инструментов" исследования поведения популяций микроорганизмов при изменении внешней среды. Вывод: увеличение гетерогенности в биосистеме (связанное с повышением ее устойчивости) отражается изменением разности ДО в большую сторону. Результаты иллюстрируют возрастание гетерогенности пространственновременной организации (и биоразнообразия) при переходе системы в более устойчивое состояние. Синхроннаяя культура (неустойчивая система) 17 рассинхронизируется в процессе развития – постепенно становится устойчивой. Параллель с сукцессией леса. 3/ ВОЗДЕЙСТВИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА ЖИВЫЕ СИСТЕМЫ И ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННОСТИ СТЕПЕНИ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КЛЕТОК А/ ДИХРОИЧНЫЕ ОТНОШЕНИЯ КАК ХАРАКТЕРИСТИКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ Целью опыта было получение информации об изменениях в структурной организации биополимеров клеток зеленых водорослей Dunaliella tertiolecta и Tetraselmis viridis после 6-ти часового воздействия ЭМП промышленной частоты на клетки инокулята. Для анализа неразрушенных клеток в ИК диапазоне 1800-1200 см-1 использовали неинвазивный метод МНПВО. Для характеристики реакции клеточных структур водорослей D. tertiolecta и T. viridis на воздействие ЭМП проводили расчет дихроичных отношений по полосам поглощения белков амид 1 (А1) и амид 2 (А2), являющихся важнейшими биополимерами клеток. Ранее было установлено, что в результате воздействия ЭМП на инокулят одноклеточных водорослей в течение 6 часов прирост клеток к концу срока культивирования у D. tertiolecta по сравнению с контролем составлял 30%, а у T. viridis вовсе отсутствовал. Полученные данные приведены в таблице. Установлено принципиальное отличие параметров спектральных характеристик поверхностных структур и целых клеток одноклеточных водорослей Dunaliella tertiolecta и Tetraselmis viridis до и после воздействия электромагнитного поля (ЭМП). Dunaliella tertiolecta внешние структуры контроль опыт 1,9 3,9 Tetraselmis viridis анализируемый слой вся клетка внешние структуры Контроль опыт контроль опыт 3,8 2,2 3,3 3,6 вся клетка контроль 1,7 Опыт 3,9 Анализ полученных данных позволяет рассматривать выявленные изменения в пространственной организации макромолекул важнейших биополимеров в клетке водорослей как объективный показатель реакции клетки на повреждающий фактор внешней среды. Результаты данного эксперимента показывают, что дихроичные отношения могут характеризовать степень адаптации культуры к изменяющимся условиям среды, т.е. можно отличать более устойчивую биосистему от менее устойчивой. 18 При факторах воздействия у более устойчивой культуры разница дихроичных отношений больше, чем у неустойчивой. Б/ ДЕЙСТВИЯ МЕЛАФЕНА НА РОСТ КЛЕТОК ЦИАНОБАКТЕРИЙ Было проверено, в том числе, действие мелафена (меламиновая соль бис(оксиметил)-фосфиновой кислоты) на характер развития культур фототрофных микроорганизмов. Для проверки этого мы воспользовались анализом изменений ДО во внешних структурах клеток и ДО самих клеток. Известно, что среда оказывается фактором, определяющим и интенсивность метаболизма, и уровень организации клеток культуры. Именно изменение уровня организации системы в присутствии мелафена в среде для культуры было зафиксировано. Но это изменение проявило себя в виде определенной закономерности. Без добавки КО-2 Ge 1,92 1,54 Действие мелафена Доза1 КО-2 Ge 1,89 1,65 Доза2 КО-2 1,80 Ge 1,71 В эксперименте фиксировали изменение степени пространственной организации системы по дихроичным отношениям в области полос поглощения А1 и А2 как для внешних структур, так и для целых клеток. Было обнаружено, что при увеличении степени пространственной организации во внешних структурах происходит ее уменьшение для целой клетки. Характерна и обратная взаимозависимость: чем выше уровень организации целой клетки, тем меньше его организация для внешних структур. Разность этих значений уменьшалась при увеличении концентрации мелафена в среде. Вывод: в опыте было показано, что ухудшение состояния среды под действием факторов уменьшает разность между ДО клеток и ДО их внешних структур. Показано, что можно определить степень устойчивости системы (пределы толерантности), т.е. определить границы ее адаптивных возможностей. Если результаты перенести на макрообъекты и экосистемы, то это может послужить основой для определения степени антропогенного воздействия на макрообъект или на всю экосистему. 4/ СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ В ПЕРИОДИЧЕСКОЙ И ДИАЛИЗНОЙ КУЛЬТУРАХ. Данный опыт должен показать, что при переносе культуры микроорганизмов в более благоприятный режим культивирования (в сравнении 19 с контролем) указанные выше соотношения для ДО должны показать увеличение разности. В работе использована культура цианобактерии Synechococcus sp. PCC 6301 (Anacystis nidulans). Отбор проб производился на 2-е, 9-е и 25-е сутки культивирования. Плотность клеточных суспензий определяли нефелометрически при 540 нм на спектрофотометре фирмы Hitachi (Япония), модель U-2000. Состояние клеток и их концентрацию определяли микроскопически. Для измерений параметров клеток цианобактерий использовали метод МНПВО в ИК диапазоне 1800—1200 см-1.Пробы отбирали в лаг-фазе (2-е сут.), логарифмической (9-е сут.) и стационарной фазе (25-е сут.). С использованием динамического градиентного подхода было проведено сравнение одной и той же культуры цианобактерии A. nidulans в разных режимах культивирования - периодическом и диализном. Получены данные об изменениях, происходящих в неразрушенных клетках и их внешних слоях, свидетельствующие о меняющемся биохимическом составе клеток и пространственной организации макромолекул важнейших биополимеров в процессе культивирования. Показано принципиальное отличие поведения культуры в разных режимах культивирования. Подобный подход может быть также использован, с нашей точки зрения, в экологии при стандартизации тестобъектов, а также при создании культуры с максимально возможной адаптацией при изменяющихся факторах внешней среды. Нам представляется, что диализная культура A. nidulans, вероятно, в большей степени соответствует модели поведения организмов, находящихся в реальных условиях, поскольку при диализном культивировании можно создавать различные фоновые условия, приближенные к реальным условиям функционирования живых систем. 5/ Проверка полученных зависимостей на макрообъектах экосистемы. Проведены эксперименты с листьями березы, взятыми из «благополучной» и «неблагополучной» сред обитания - из леса и из мегаполиса, а также на иголках, взятых у ели в районе автомобильной трассы. Тут приводим пример дихроичных отношений клеток листьев березы. Ель Клетки Клетки желтой зеленой хвои хвои КО-2 Ge КО-2 Ge 1,80 1,91 1, 93 2,0 Береза Клетки листьев Клетки листьев в лесу в городе КО-2 Ge КО-2 Ge 1,4 2,0 1,85 1,98 В результате проведенных экспериментов с клетками макроорганизмов 20 получили те же закономерности, что и в экспериментах с микроорганизмами Расчет дихроичных отношений для внешних структур клеток и целых клеток показывает: для более устойчивой биосистемы разница ДО больше, чем у неустойчивой (пример хвои); для макрообъектов «благополучной» среды обитания разность значений ДО значительно больше, чем для тех же значений у макроорганизмов из «неблагополучной» экосистемы (листья березы). Итак, в данной работе предложена методология оценки состояния культуры микроорганизмов. Показано, что можно оценить динамику изменений культуры при различных воздействиях, характер и степень динамики происходящих изменений, скорость восстановления после воздействия. Метод опробован на клетках макроорганизмов. Показано, что возможен перенос данного метода на оценку состояния отдельных макроорганизмов, используя разность значений дихроичных отношений для внешних структур и клеток макроорганизмов. В свою очередь как микроорганизмы так и макроорганизмы входят в состав популяций биогеоценозов. Таким образом, проделанная работа является шагом к разработке методологии оценки состояния биогеоценозов на основе использования оценки состояния популяций микроорганизмов и популяций клеток макроорганизмов. Дальнейшее развитие работы. I. а) Разработать методику переноса данного метода оценки состояния популяций микроорганизмов и клеток макроорганизмовов на оценку состояния макроорганизмов, входящих в состав биогеоценозов. б) как следствие, разработать саму методику измерений и методику оценки состояния макроорганизмов. В последнем эксперименте сделан шаг к тому, чтобы разработать методологию переноса метода оценки состояния популяции микроорганизмов на оценку состояния макроорганизмов по состоянию их клеток. На основании обобщения результатов экспериментов и выводов из них показаны основные характеристики, применимые и для оценки состояния макроорганизмов, входящих в природные экосистемы. II. Как микроорганизмы так и макроорганизмы входят в состав популяций биогеоценозов. Представляется возможным на основании оценки состояния популяций микроорганизмов и клеток макроорганизмов разработать методику оценки состояния биогеоценоза. 21 Представляется, что данная методика должна включать оценку состояния ключевых функциональных звеньев биогеоценоза, которые в силу своей индивидуальной специфики и, соответственно, специфики функционирования, поддерживают и регулируют баланс всего биогеоценоза, обеспечивая устойчивое динамическое равновесие. В качестве примера приводим некоторые ключевые звенья лесного биогеоценоза (т.к. он является коренным для нашей ландшафтно-климатической зоны умеренного пояса Русской равнины). 1/ Доминантные виды, формирующие среду обитания и соответствующие фито- и зооценозы: древесные виды-эдификаторы и их подрост в «окнах возобновления»; сопутствующие им виды, доминантные для определенных участков мозаики лесного биогеоценоза (виды-индикаторы, определяющие типы леса). 2/ Экосистемы, являющиеся фрагментами мозаики лесного биогеоценоза, источники и хранители биоразнообразия: например, экотонные сообщества лесных опушек; лесные поляны; экосистемы болот. 3/ Лесная подстилка. Итак, данная методология позволит оценивать характер динамики изменений и степень изменений, происходящих с ключевыми звеньями биогеоценоза, посредством контроля состояния популяций микроорганизмов и клеток макроорганизмов, входящих в состав данных звеньев. ВЫВОДЫ 1/ Предложена эмпирическая модель оценки состояния экосистем на основе контроля степени пространственной организации клеток и их внешних структур в популяции микроорганизмов разных таксономических групп и клеток макроорганизмов при контроле степени пространственной организации клеток и их внешних структур. 2/ Для анализа состояния популяций и сообществ впервые предложен энтропийный подход. В соответствии с данным подходом выявлена зависимость между состоянием организма и изменениями в пространственной организации клеток и их внешних структур. 3/ Предложенный метод позволяет оценивать характер и степень динамики биосистем независимо от рода воздействия. 4/ Выбранные характеристики оценки состояния биосистем применимы как 22 для оценки состояния различных групп микроорганизмов, так и для оценки состояния клеток макроорганизмов. 5/ Показано, что разработанные подходы и методы для контроля состояния популяции микроорганизмов возможно применить для оценки состояния отдельных макроорганизмов экосистем. 6/ Предложенный подход и методическая разработка могут быть использованы для экспресс-мониторинга состояния сложных экосистем. Список работ Королевой С.Ю. 1. Асланян Р.Р., Бабусенко Е.С., Королева С.Ю., Королев Ю.Н. Воздействие факторов среды на живые системы и динамика изменения гетерогенности степени пространственной организации клеток. Электромагнитные излучения в биологии. Труды четвертой международной научной конференции БИО-ЭМИ-2008, Калуга-2008, с. 23-28. 2. Бурлаков А.Б., Супруненко Е.А., Королева С.Ю., Супруненко Д.В., Голиченков В.А. Об информационной значимости биоизлучений при дистантных взаимодействиях живых систем. Электромагнитные излучения в биологии. Труды четвертой международной научной конференции БИО-ЭМИ2008, Калуга-2008, с. 61-66. 3. Бурлаков А.Б., Супруненко Е.А., Королева С.Ю., Асланян Р.Р., Бабусенко Е.С., Супруненко Д.В., Королев Ю.Н. Степень открытости живой системы как характеристика меры воздействия факторов внешней среды. Электромагнитные излучения в биологии. Труды четвертой международной научной конференц. БИО-ЭМИ-2008, Калуга-2008, с.66-71. 4. Королев Ю.Н., Бурлаков А.Б., Асланян Р.Р., Бабусенко Е.С., Королева С.Ю. О закономерностях, отражающих причинно-следственные связи между уровнями внешних воздействий на биоту и ее откликом. Электромагнитные излучения в биологии. Труды четвертой международной научной конференции БИО-ЭМИ-2008, Калуга-2008, с.167-173. 5. Королев Ю.Н., Асланян Р.Р., Королева С.Ю., Бабусенко Е.С. Неинвазивная методология пространственно-временной организации биологических систем в решении задач экологического контроля. Актуальные проблемы современной физики. Материалы Всероссийской дистанционной научно-практической конференции с международным участием, Краснодар 2008, с. 122-126. 6. Ширяева А.А., Королева С.Ю., Способина Т.Н. Некоторые методические проблемы контроля качества водных и других природных объектов среды при осуществлении экомониторинга. Использование и охрана природных ресурсов в России, № 2, 2009, с. 73-76. 23 7. Балоян Б.М., Чуднова Т.А., Королева С.Ю., Королев Ю.Н. Способ получения информации при экомониторинге с помощью циркулярного дихроизма. Прикладная экология. Опыт, результаты, прогнозы. Выпуск 2. Дзержинский. 2009, с. 126-131. 8. Бабусенко Е.С., Асланян Р.Р., Королева С.Ю., Королев Ю.Н. Изучение биологической системы в условиях культивирования. 5-й Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития. 16-20 марта, 2009, 198-199. 9. Асланян Р.Р.,Лебедева А.Ф., Бабусенко Е.С., Королева С.Ю., Королев Ю.Н. Культуры микроорганизмов как пример информационного взаимодействия. Вестник МГУ, сер 16, биология, №2, 2009, 19-25. 10. Саванина Я.В., Лебедева А.Ф., Барский Е.Л., Королева С.Ю., Королев Ю.Н. Диализная культура микроорганизмов как модель контроля популяций при экологических исследованиях. Бюллетень МОИП, отдел биологический, т. 114, вып. 2, прил. 1, 2009, 264-267. 11. Асланян Р.Р., Королева С.Ю., Бабусенко Е.С., Королев Ю.Н. Об использовании фагов для проявления «состояния» биосистем при экологическом контроле. X Международная научно-техническая конференция. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОТОКОВ. Москва, 23 — 26 июня 2009 г. ТРУДЫ конференции. М.: изд. МЭИ, 2009, 354-358. 12. Бабусенко Е.С., Королева С.Ю., Асланян Р.Р., Королев Ю.Н. Количественные методы при контроле качества среды в экодиагностике. X Международная научно-техническая конференция. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОТОКОВ. Москва, 23 — 26 июня 2009 г. ТРУДЫ конференции. М.: изд. МЭИ, 2009, 358-362. 13. Лебедева А.Ф., Саванина Я.В., Барский Е.Л., Королева С.Ю., Королев Ю.Н. Неинвазивная регистрация диализной культуры как адекватной модели популяций при контроле экосистем. X Международная научно-техническая конференция. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОТОКОВ. Москва, 23 — 26 июня 2009 г. ТРУДЫ конференции. М.: изд. МЭИ, 2009, 350-354. 14. Балоян Б.М., Чуднова Т.А., Королева С.Ю., Королев Ю.Н. Способ получения информации при экомониторинге с помощью дисперсии оптического вращения. Прикладн. экология. Опыт, результаты, прогнозы. Выпуск 2. Дзержинский. 2009, 131-135. 15. Саванина Я.В., Лебедева А.Ф., Барский Е.Л., Королева С.Ю., Королев Ю.Н., Лобакова Е.С. Диализная культура микроорганизмов как модель пространственно-временной организации биологических систем. Вестник новых медицинских технологий. Тематический выпуск: «Избранные технологии диагностики и лечения», №1, 2009, 158-159. 24 16. Королева С.Ю., Асланян Р.Р., Бабусенко Е.С., Королев Ю.Н. Анализ «водного баланса» в интактных клетках и его практическая реализация. 5 Международный конгресс «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине».Тезисы. Санкт-Петербург 29.06.2009-03.07.2009, 132. 17. Балоян Б.М., Чуднова Т.А., Королева С.Ю., Королев Ю.Н. Спектральный интегральный параметр экомониторинга живого организма. Прикладная экология. Опыт, результаты, прогнозы. Выпуск 2. Дзержинский. 2009, с. 116-126. 18. Ширяева А.А., Королева С.Ю., Способина Т.Н., Синицын М.А. О варианте биотического подхода при осуществлении экомониторинга. Труды ИПГ им. Е.К. Федорова, вып. 88, М., 2010, 195-200. 19. Саванина Я.В., Лебедева А.Ф., Барский Е.Л., Королева С.Ю., Королев Ю.Н., Лобакова Е.С. Диализная культура микроорганизмов как модель оценки состояния экосистем. Вестник МГУ, сер 16, биология, №2, 2010, 12-17. 25
