На правах рукописи Севостьянова Виктория Владимировна РОЛЬ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА
advertisement
На правах рукописи Севостьянова Виктория Владимировна РОЛЬ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА, ИНКОРПОРИРОВАННОГО В ПОЛИКАПРОЛАКТОНОВЫЕ ГРАФТЫ, В ФОРМИРОВАНИИ НОВОГО СОСУДА НА МЕСТЕ ИМПЛАНТАЦИИ 14.03.03 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Кемерово – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» Научные руководители: доктор медицинских наук доктор медицинских наук, профессор Головкин Алексей Сергеевич Эльгудин Яков Львович Официальные оппоненты: Салмина Алла Борисовна – доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, заведующий Майбородин Игорь Валентинович – доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория стволовой клетки, главный научный сотрудник Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера», г. Красноярск Защита диссертации состоится «___» ___________ 2015 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.035.02 при ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России по адресу: 650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России и на сайте www.kemsma.ru Автореферат разослан «____» _____________ 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор мед. наук, профессор Разумов Александр Сергеевич 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования Артериальные реконструкции являются главным и наиболее действенным методом лечения заболеваний, связанных со значительным поражением коронарных и периферических кровеносных сосудов, но все же относятся к симптоматическим видам лечения и в большинстве случаев позволяют добиться лишь временного реваскуляризирующего эффекта (Бокерия Л. А., 2009). Кроме того, существует дефицит аутотрансплантатов, которые используются в качестве золотого стандарта для проведения шунтирующих операций (Seifu D. G., 2013). В связи с этим поиск альтернативного сосудистого имплантата привел к активному использованию для его создания подходов тканевой инженерии. Основной целью сосудистой тканевой инженерии является создание полноценного кровеносного сосуда из клеток пациента in vitro – в биореакторе, имитирующем физиологические условия, или in situ – непосредственно в месте имплантации (Catto V., 2014). Практически во всех случаях в качестве основы для формирования сосудов выступает тканеинженерный пористый графт, изготовленный из происхождения. биоматериалов Сосудистые графты природного имеют или/и синтетического архитектуру сходную с внеклеточным матриксом и выполняют опорную и трофическую функцию для клеток, что способствует формированию тканей (Hasana A., 2014). Многообещающие результаты по разработке и исследованию тканеинженерных графтов отражают высокий терапевтический потенциал данного подхода. Тем не менее, прогрессу в данной области существенно мешают нежелательные особенности взаимодействия между клетками и биоматериалом, которые в ряде случаев приводят к хроническому воспалению, неконтролируемой клеточной пролиферации и фиброзу. Подобные реакции на биоматериал практически невозможно устранить с помощью лекарственных препаратов (Simionescu A., 2011). Однако, решение данной проблемы может заключаться не в подавлении клеточного ответа на имплантат, а в направлении воспалительной реакции в сторону регенеративного процесса. Степень разработанности темы исcледования В ряде исследований было показано, что процесс восстановления тканей можно регулировать с помощью биологически активных молекул (Schantz J. T., 4 2007; Losi P., 2010; Thevenot P. T., 2010). Также было установлено, что среди биомолекул, которые могли бы способствовать формированию тканей кровеносного сосуда, наиболее перспективными являются ростовые факторы, стимулирующие ангиогенез (Guan J., 2007; Sharon J. L., 2008). Классическим представителем ангиогенных молекул является сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), обладающий высокой специфичностью к эндотелиальным клеткам, стимулирующий их миграцию и пролиферацию, что может способствовать образованию эндотелиального слоя, который препятствует тромбообразованию, моделирует поток крови и сосудистое сопротивление, регулирует иммунные и воспалительные реакции (Lamalice L., 2007). Ранее была показана эффективность некоторых способов иммобилизации VEGF на графтах для осуществления его локальной доставки, такие как ковалентное и электростатическое связывание с поверхностью (Zisch A. H., 2001; Crombez M., 2005; Randone B., 2005). Однако до сих пор не разработаны сосудистые графты, обеспечивающие пролонгированный выход VEGF в место имплантации. В связи с этим отсутствует однозначное представление о роли этого ростового фактора в патогенезе воспалительной реакции на имплантируемый биоматериал и в формировании тканей кровеносного сосуда при имплантации графта в артериальное русло. Цель исследования: оценить патогенетическую роль сосудистого эндотелиального фактора роста, инкорпорированного в графт из свойства и поликапролактона, в формировании нового кровеносного сосуда. Задачи исследования: 1. Определить оптимальные физико-механические морфологию графта из поликапролактона с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста для создания структуры, максимально идентичной межклеточному матриксу. 2. Изучить влияние высвобождаемого из структуры графта сосудистого эндотелиального фактора роста на процессы адгезии и пролиферации эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток in vitro. 3. Изучить особенности воспалительной реакции и ангиогенеза в условиях пролонгированной доставки сосудистого эндотелиального фактора роста при перитонеальной имплантации графтов из поликапролактона. 5 4. Определить патогенетическую и саногенетическую значимость пролонгировано высвобождаемого из поликапролактонного графта сосудистого эндотелиального фактора роста при имплантации в инфраренальный отдел аорты крыс. Научная новизна исследования Показано, что инкорпорирование сосудистого эндотелиального фактора роста в структуру графта из поликапролатона по разработанной технологии сопровождается патогенетически незначимым изменением физико- механических свойств материала и сохранением морфологии, наиболее соответствующей межклеточному матриксу, что в совокупности обеспечивает необходимое физиологическое взаимодействие с клетками организма и способствует регенерации тканей. Установлено, что сосудистый эндотелиальный фактор роста пролонгированно высвобождается из разработанных поликапролактонных графтов с сохранением биологической активности в течение нескольких месяцев и способствует адгезии и пролиферации клеток, участвующих в регенерации кровеносного сосуда, на поверхности матриксов. Экспериментально установлена патогенетическая значимость длительной непрерывной доставки сосудистого эндотелиального фактора роста, заключающаяся в усилении ангиогенеза на поликапролактонных матриксах. Доказана возможность использования графта из поликапролактона с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста в качестве временного протеза сосуда, который заселяется клетками, синтезирующими компоненты межклеточного вещества, и по мере деградации замещается тканями кровеносного сосуда. Установлено, что при имплантации в кровеносное русло графта из поликапролактона инкорпорированный сосудистый эндотелиальный фактор роста стимулирует ангиогенез в стенке протеза и сохраняет его проходимость, снижая тромбообразование. Теоретическая и практическая значимость работы Определены оптимальные параметры графта из поликапролактона с инкорпорированными молекулами сосудистого эндотелиального фактора роста для выполнения роли временного межклеточного матрикса. 6 Доказана эффективность использования сосудистого эндотелиального фактора роста для усиления адгезии и пролиферации клеток на поверхности графтов из поликапролактона, стимуляции ангиогенеза в их стенках, снижения тромбообразования и улучшения проходимости. Полученные результаты являются основой для разработки эффективных методов стимуляции ангиогенеза с использованием биодеградируемых графтов. Методология и методы исследования Для достижения цели исследования изготовлены сосудистые графты из поликапролактона методом электроспиннинга, а также графты, содержащие сосудистый эндотелиальный фактор роста, проведены их физико-механические испытания и сканирующая электронная микроскопия поверхности. Для оценки высвобождения сосудистого эндотелиального фактора роста, его биологической активности и влияния на регенерацию тканей проведены культуральные работы, имплантация графтов интраперитонеально и в брюшную часть аорты крыс, а также гистологические и гистохимические исследования эксплантированных образцов. Основные положения, выносимые на защиту 1. Графты из поликапролактона обладают физико-механическими свойствами и морфологией, характерными для межклеточного матрикса. Инкорпорирование молекул сосудистого эндотелиального фактора роста в графт из поликаролактона приводит к незначительному снижению прочности и эластичности материала с сохранением пористой структуры. Пролонгированное высвобождение сосудистого эндотелиального фактора роста обеспечивает адгезию эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток и стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток в условиях in vitro. 2. Графт из поликапролактона с инкорпорированным сосудистым фактором роста при перитонеальной имплантации вызывает воспалительную реакцию тканей, типичную для биосовместимых материалов. Выделяемый сосудистый эндотелиальный фактор роста стимулирует ангиогенез в пористом полимерном материале. Поликапролактонный графт с сосудистым эндотелиальным фактором роста, имплантированный в артериальное русло крысы, заселяется клетками, ростовой фактор обеспечивает васкуляризацию стенки графта и улучшение его проходимости. 7 Степень достоверности результатов О достоверности результатов диссертационного исследования свидетельствуют достаточно представительный объем экспериментального материала, широкий спектр проведенных лабораторных исследований, неоднократно повторенные испытания in vitro, использование современных методов исследования и статистической обработки полученных результатов. Автор непосредственно участвовала в получении исходных данных. Апробация материалов диссертации Результаты настоящего исследования были доложены и обсуждены на Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2011» (11-15 апреля 2011, г. Москва), Инновационном конвенте «Кузбасс: образование, наука, инновации» (19-20 ноября 2011, г. Кемерово), Всероссийской научнопрактической конференции «Актуальные проблемы лабораторной диагностики и биотехнологии» (13-14 сентября 2012, г. Кемерово), Инновационном конвенте «Кузбасс: образование, наука, инновации» (22-23 ноября 2012, г. Кемерово), 1-ом Национальном конгрессе по регенеративной медицине (4-6 декабря 2013, г. Москва), Научной школе молодых ученых «Современная биология и биотехнологии будущего» (26 января - 1 февраля 2014, г. Москва), VII Всероссийском съезде трансплантологов (28-30 мая 2014, г. Москва). Публикации По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования материалов диссертаций на соискание ученой степени. Получен 1 патент. Объем и структура диссертации Диссертация объемом 134 страницы печатного текста, написана на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 3 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация содержит 2 таблицы, иллюстрирована 24 рисунками. Указатель использованной литературы содержит 5 работ отечественных и 219 работ иностранных авторов. Личный вклад автора Анализ литературы по теме диссертации, изготовление сосудистых графтов методом электроспиннинга, проведение исследований in vitro с 8 использованием культуральных методов, эксперименты на лабораторных животных, оценка результатов и статистическая обработка данных, написание диссертации и статей выполнены лично автором. Исследования физикомеханических свойств и морфологии графтов, имплантация графтов в аорту крыс, а также гистологические анализы проведены совместно с сотрудниками НИИ КПССЗ: канд. биол. наук Т. В. Глушковой, канд. мед. наук Д. Е. Филипьевым, канд. мед. наук А. Ю. Бураго и мл. науч. сотр. Г. Ю. Васюковым. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования. Исследование проведено на самцах крыс популяции Wistar массой 250-300 г (n=60) при перитонеальной имплантации матриксов и 400-450 г (n=10) при имплантации графтов в инфраренальный отдел аорты. Животных содержали в условиях вивария на полном рационе питания. Опыты проводили, соблюдая принципы гуманного обращения с животными, регламентированные требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986). Животных вводили в наркоз 3% изофлураном. Во время операции все животные получали ингаляционный наркоз 1,5% изофлурана. Эвтаназию осуществляли в камере с углекислым газом. Сосудистые графты изготавливали из синтетического биодеградируемого полимера поликапролактона (polycaprolactone, PCL) с молекулярной массой 80000 (Sigma-Aldrich, США). В PCL графты инкорпорировали рекомбинантный сосудистый эндотелиальный лиофилизированный в фактор крысы-А фосфатно-солевом (R&D буфере Systems, (Gibco, США), США) до концентрации 1 мкг/мл. Изучение морфологии и патогенеза воспаления при внутрибрюшной имплантации графтов. Матриксы (1×2 см2) вырезали из PCL и PCL с VEGF графтов диаметром 4 мм и имплантировали в брюшную полость крысам. Через 2, 3 и 4 месяца животных выводили из эксперимента. Матриксы выделяли с прилежащими тканями и проводили гистологическое исследование с окраской гематоксилином и эозином. Количество кровеносных сосудов определяли гистохимической окраской с антителами к CD31 крыс (Spring Bioscience, USA). Графты из PCL и PCL с VEGF диаметром 2 мм и толщиной стенки ~100 мкм имплантировали в инфраренальную часть аорты крыс. Контроль 9 проходимости графтов осуществляли ультразвуковым исследованием с допплерометрией каждые 2 месяца. Спустя 10 месяцев графты выделяли с прилежащими участками аорты. Образцы оценивали макроскопически и световой микроскопией с окраской гематоксилином-эозином и по Ван-Гизон. Перед имплантацией сосудистых графтов определяли оптимальные режимы их изготовления, оценивали кинетику выхода ростового фактора, его биоактивность и способность оказывать влияние на клетки в условиях in vitro. Изготовление сосудистых графтов. PCL графты диаметрами 2 и 4 мм изготавливали методом электроспиннинга на приборе Nanon-01A (MECC CO, Япония) с использованием растворов полимера в хлороформе в концентрациях 10%, 12%, 14% и 16% при напряжениях 15 и 25 кВ, скорости подачи раствора – 1 мл/ч, расстояние до коллектора – 15 см, коллекторы – штифты диаметром 2 и 4 мм. Для инкорпорирования молекул ростового фактора в полимерное волокно раствор PCL, выбранной концентрации, смешивали с раствором VEGF в соотношении 20:1 и проводили электроспиннинг при выбранном напряжении. Определение физико-механических свойств сосудистых графтов. Данное исследование осуществляли с использованием универсальной испытательной машины «Zwick/roell» - 2.5Н (Германия) в соответствии с ГОСТ 270-75. Прочность оценивали по максимальному напряжению при растяжении, упруго-деформативные свойства – по относительному удлинению до нарушения целостности образца и модулю упругости (Емод). Исследование морфологии сосудистых графтов. Образцы PCL и PCL с VEGF графтов размером 0,5×0,5 см покрывали золотым токопроводящим напылением толщиной в 30 нм и далее изучали на сканирующем электронном микроскопе S3400N (Hitachi, Япония). Определение кинетики выхода ростового фактора из PCL графтов. Из PCL графтов c VEGF диаметром 4 мм вырезали кусочки 1×2 см2 и обрабатывали 70% этиловым спиртом, а затем фосфатно-солевым буфером. Каждый образец помещали в пробирки с объемом 1,5 мл и инкубировали при 37ºС и 5% СО2. Через 12ч, 24ч, 48ч и далее через каждые 48 часов в течение 80 суток, из пробирок отбирали 200 мкл раствора и восстанавливали исходный объем свежим буфером. В собранных образцах определяли содержание ростового фактора с наборами для иммуноферментного анализа VEGF (R&D System, США). 10 Исследование биологической активности VEGF после выхода из графта. В 96-луночный культуральный планшет помещали эндотелиальные клетки человека перевиваемой линии EA.Hy 926, которая была любезно предоставлена Dr. Cora-Jean C. Edgell из Университета Северной Каролины, по 4000 на лунку и инкубировали 24 часа в питательной среде. После чего к клеткам добавляли по 150 мкл буферного раствора, инкубированного с графтом PCL с VEGF в течение 12ч, 24ч, 48ч и далее каждые 48 часов до 80 суток. Пролиферацию эндотелиальных клеток оценивали через 72 часа с помощью MTT-теста (Yang X., 2006). Оценка способности сосудистых графтов адгезировать клетки. Мезенхимальные стволовые клетоки (МСК) костного мозга крысы и эндотелиальные клетки человека линии EA.Hy 926 культивировали на плоских образцах PCL и PCL с VEGF (1,93 см2) в 24-луночном планшете. Количество клеток оценивали через 2, 4 и 6 суток при окрашивании флуоресцентным красителем PKH26 (Sigma-Aldrich, США) и изучении на инвертированном микроскопе Axio Observer Z1 (Carl Ziess, Германия) с модулем ApoTome. Статистические методы. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0» (StatSoft Inc., США). Нормальность распределения оценивали при помощи критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий определяли непараметрическими критериями Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса. Различия считали статистически значимыми при р<0,01 и p<0,05. Данные представлены в виде среднее±стандартная ошибка среднего для данных, имеющих нормальное распределение, или как медиана и 25-ый и 75-ый процентили (25%<Мe<75%) для распределения, отличного от нормального. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Зависимость свойств PCL графтов от параметров электроспиннинга. Установлено, что наибольшей прочностью и эластичностью обладали графты из 14 и 16% растворов PCL как при напряжении 15 кВ, так и 25 кВ (Таблица 1). Наименьшие прочность и эластичность имели графты из 10% PCL. 11 Таблица 1 – Физико-механические свойства сосудистых графтов, изготовленных при различных концентрациях PCL Прочность, Относительное Емод, Концентрация Напряжение, МПа удлинение, % Н/мм2 полимера кВ Мe Мe Мe (25%; 75%) (25%; 75%) (25%; 75%) 0,34 109,0 0,74 (0,30; 0,40) (109,0; 120,3) (0,74; 1,05) 1,57 249,9 2,07 (1,49; 1,75) (168,8; 262,9) (1,74; 2,42) 2,35 478,5 1,81 (2,15; 2,44) (315,5; 739,4) (1,42; 2,33) 1,96 305,0 1,13 (1,81; 2,48) (261,6; 345,3) (0,94; 1,92) 2,64* 669,2* 1,92 (2,40; 2,81) (589,2; 849,1) (1,41; 2,13) 3,09** 609,2** 1,65 (2,75; 3,49) (588,3; 632,2) (1,56; 1,95) 2,34* 564,7* 2,00 (3,23; 2,88) (488,6; 632,7) (1,90; 2,84) 3,41** 617,1** 2,01 (3,23; 3,42) (604,6; 638,1) (1,93; 2,51) 1,26*** 95,4*** 0,28*** (0,85; 1,42) (79,8; 100,6) (0,24; 0,34) 15 PCL 10% (n=10) 25 15 PCL 12% (n=10) 25 15 PCL 14% (n=10) 25 15 PCL 16% (n=10) 25 Ксенопротез (n=10) _ Примечание: *- p<0,05 по сравнению с PCL 10% при 15кВ ** - p<0,05 по сравнению с PCL 10% и 12% при 25кВ *** - p<0,05 сравнению с PCL 14% и 16 % при 15 и 25 кВ Разницы по упругости материала между всеми группами графтов из PCL не отмечали (p>0,05). Кроме того, значения упруго-деформативных свойств PCL графтов, изготовленных из 14 и 16 % полимера, превышали данные показатели для сосудистых ксенопротезов из грудной артерии крупного рогатого скота, консервированных диглицидиловым эфиром этиленгликоля (p<0,05). 12 Изучение PCL графтов с помощью сканирующей электронной микроскопии показало, что средний диаметр волокон при напряжении 15 кВ составил 446 нм, 1,78 мкм, 2,01 мкм, 2,74 мкм и при 25 кВ – 840 нм, 1,12 мкм, 2,62 мкм, 2,68 мкм для концентраций 10, 12, 14 и 16% соответственно. Полученные результаты свидетельствовали об увеличении диаметра волокна с возрастанием концентрации раствора PCL (Рисунок 1) мкм 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 ** * ** * ** * 15 кВ 25 кВ 10% PCL 12% PCL 14% PCL 16% PCL * – p<0,01 относительно 10 и 12% PCL при 15 и 25 кВ ** – p<0,01 относительно 14% PCL при 15 кВ Рисунок 1 – Зависимость диаметра волокна от концентрации PCL при напряжении электроспиннинга 15 и 25 кВ Изменение режимов электроспиннинга оказало влияние и на однородность полимерных волокон. Так волокна из 10% раствора PCL при напряжении 15 кВ и 25 кВ имели большое количество утолщений. В свою очередь в графтах из 12% полимера дефекты волокна были менее выражены. А на образцах из 14% и 16% PCL утолщений и других нарушений структуры волокон выявлено не было. Среди образцов с оптимальной морфологией, меньший диаметр волокна имели графты из 14 % PCL при 15 кВ (p<0,01). Таким образом, достаточная прочность и эластичность, а также высокопористая структура PCL графтов, изготовленных из 14 и 16% растворов PCL, делают их близкими по свойствам к межклеточному матриксу. PCL графт, изготовленный из 14% раствора PCL при 15 кВ, был выбран для дальнейшего исследования – инкорпорирование сосудистого эндотелиального фактора роста (vascular endothelial growth factor, VEGF). 13 Влияние инкорпорирования VEGF в PCL на структуру и прочностные свойства сосудистого графта. Введение в структуру полимерного волокна молекул VEGF привело к значительному изменению морфологии PCL графта. Волокна варьировали по диаметру от 0,142 до 10,714 мкм, при этом размер полимерных нитей в образцах из чистого PCL в среднем составлял 2,521±0,490 мкм. Однако, волокна, содержащие ростовой фактор, имели ровную поверхность без выраженных деформаций и образовывали необходимую пористую структуру, имитирующую нативный внеклеточный матрикс. Инкорпорирование VEGF в PCL привело к снижению показателей прочности, а также упруго-деформативных свойств материала (Таблица 2). Так показатель прочности уменьшался до 1,13 Мпа, эластичности – до 175,10%, а модуль Юнга составил 1,40 Н/мм2. Тем не менее, по своим физико-механическим свойствам PCL графты с VEGF не уступали используемым на сегодняшний день сосудистым ксенопротезам (p>0,05). Таблица 2 – Физико-механические свойства сосудистых графтов Графт PCL (n=10) PCL с VEGF (n=10) Ксенопротез (n=10) Прочность, Относительное Емод, МПа удлинение, % Н/мм2 Мe Мe Мe (25%; 75%) (25%; 75%) (25%; 75%) 2,64* 669,2* 1,92* (2,40; 2,81) (589,2; 849,1) (1,41; 2,13) 1,13 175,10 1,40 (1,11; 1,24) (154,62; 182,54) (1,20; 1,49) 1,26 95,4 0,28 (0,85; 1,42) (79,8; 100,6) (0,24; 0,34) Примечание: *- p<0,05 по сравнению с ксенопротезом Таким образом, анализ результатов показал существенное влияние инкорпорирования молекул VEGF в структуру PCL на толщину волокна с сохранением высокопористой структуры материала. В то же время, графты, полученные методом двухфазного электроспиннинга, имеют оптимальные физико-механические свойства, что сделало возможным их исследование в качестве временных матриксов для регенерации тканей кровеносного сосуда. 14 Выход молекул VEGF из PCL графтов и их биоактивность. Установлено, что выделение VEGF из графта происходило на протяжении всего эксперимента, при этом за 80 дней из матрикса выделилось 531,88 пг ростового фактора (Рисунок 2). В первые четыре дня отмечали значительный выброс биологически активных молекул – около 207 пг. Далее выделение ростового фактора в раствор происходило равномерно – 30,08±2,82 пг в 4 дня. пг 600 500 400 300 200 100 0 1 2 4 8 12 16 20 24 28 32 40 48 64 80 сут Рисунок 2 – Динамика накопления VEGF в буфере (80 суток) Ростовой фактор, выделившийся из полимерного материала за первые двое суток, не оказывал выраженного влияния на пролиферацию эндотелиальных клеток по отношению к отрицательному контролю. Значительной биологической активностью (p<0,01) обладала инкубационная среда с раствором VEGF, вышедшим в течение 4 суток, по сравнению с контрольной средой, а также фосфатно-солевым буфером, взаимодействовавшим с графтом в течение 2 суток. Усиление митогенного действия на эндотелиальные клетки происходило с увеличением времени инкубации PCL графтов с VEGF в растворе. Наибольший уровень пролиферации клеток отмечался в среде с добавлением раствора, контактировавшего с образцом в течение 80 суток. Таким образом, анализ полученных результатов показал, что PCL графты с VEGF способны обеспечить высвобождение ростового фактора в окружающую среду как минимум в течение первых 80 суток. Выход ростового фактора происходит из глубоких пор полимерного волокна и в процессе деградации PCL. После выхода ростовой фактор сохраняет биологическую активность, стимулируя пролиферацию эндотелиальных клеток. 15 Влияние VEGF на способность PCL графтов адгезировать клетки. Результаты культивирования клеток на графтах показали адгезию МСК к образцам из PCL как чистым, так и с ростовым фактором. Однако, число клеток на обоих видах полимерных материалов было меньше по сравнению с МСК, на поверхности планшетов после 2 суток культивирования (Рисунок 3). клеток в поле зрения 300 250 Без матрикса PCL PCL с VEGF 200 150 100 * * 50 ** ** *** *** 0 2 суток 4 суток 6 суток * - p<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса 2 суток ** - p<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса 4 суток *** - p<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса 6 суток Рисунок 3 – Количество МСК на PCL графтах и на PCL графтах с VEGF через 2, 4 и 6 суток культивирования При этом не было обнаружено достоверных различий между матриксами из PCL и PCL c VEGF (p>0,01). В течение всего исследования не наблюдали значительного роста клеточной культуры на обоих видах графтов по сравнению с контролем. К 6 суткам количество клеток в контроле превышало число клеток на PCL в 7 раз и на PCL c VEGF в 4,3 раза. При этом на PCL графтах без ростового фактора МСК располагались преимущественно на поверхности, а на графтах с VEGF клетки находились не только на поверхности, но и проникали в глубину матрикса между волокнами. Эндотелиальные клетки адгезировались к PCL и PCL с VEGF графтам после двух суток культивирования. Разницы в количестве клеток между двумя видами материала не было обнаружено (Рисунок 4). С 2 до 4 суток количество клеток на обоих полимерных образцах увеличивалось. На матриксах из PCL рост клеточной культуры был незначительным – c 183 до 297,5 клеток/поле зрения, а на PCL с VEGF наблюдали выраженную пролиферацию c возрастанием числа 16 EA.Hy 926 с 141,5 до 632,5 клеток/поле зрения. Через 4 дня их число на PCL графтах, содержащих VEGF, превышало данный показатель на чистых PCL матриксах в 2,1 раза. Такая же картина наблюдалась и через 6 суток. Среднее количество клеток на образцах с ростовым фактором составляло 1384 клетки/поле зрение, что было в 2,2 больше данного показателя на этом же виде матрикса на 4 сутки эксперимента. Кроме того, наличие VEGF в структуре PCL способствовало увеличению числа клеток на материале в 3,3 раза по сравнению с чистыми PCL образцами. На 6 сутки клетки полностью покрывали матрикс с VEGF, а также инфильтрировали во внутренние слои. клеток в поле зрения 1600 *** 1400 1200 Без матрикса 1000 PCL ** 800 PCL с VEGF 600 400 * 200 0 2 суток 4 суток 6 суток * - p<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса 2 суток ** - p<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса и на PCL 4 суток *** - p<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса и на PCL 6 суток Рисунок 4 – Количество эндотелиальных клеток EA.Hy 926 на PCL графтах и на PCL графтах с VEGF через 2, 4 и 6 суток культивирования В отличие от МСК эндотелиальные клетки проникали через поры в толщу матрикса не только на образцах с ростовым фактором, но также и из PCL, не содержащего биомолекул. Таким образом, анализ полученных данных позволяет заключить, что графты из PCL способствуют слабой адгезии МСК и эндотелиальных клеток. Введение VEGF в структуру PCL графта обеспечивает быстрый рост культуры эндотелиальных клеток на его поверхности и приводит к увеличению волокон и пор материала, что в свою очередь способствует его инфильтрации как эндотелиальными клетками, так и более крупными МСК. 17 Морфология и патогенез воспалительной реакции на PCL графт после введения ростового фактора. Гистологическое исследование PCL и PCL с VEGF графтов, а также окружающих их тканей показало инфильтрацию всех образцов грануляционной тканью, содержащей гигантские многоядерные клетки, фибробласты, единичные макрофаги и внеклеточный матрикс, состоящий из коллагеновых и эластиновых волокон. Образование капсулы из соединительной ткани вокруг имплантатов происходило ко второму месяцу исследования. Фиброзная капсула вокруг полимерных образцов с ростовым фактором и без него имела небольшую толщину. Признаков острого воспаления не было отмечено ни в одном из случаев. Оценка ангиогенных свойств показала, что ко второму месяцу на PCL графтах с ростовым фактором, количество капилляров превышало аналогичный показатель на чистых PCL образцах (p<0,01) (Рисунок 5). К 3 и 4 месяцам исследования количество капилляров на PCL с VEGF достоверно увеличивалось (p<0,01). При этом через 3 месяца на графтах с ростовым фактором, обнаружены кровеносные сосуды с диаметром, превышающем диаметр капилляра. Различий по количеству капилляров на матриксах без VEGF между 2, 3 и 4 месяцами исследования не отмечали (p>0,05). капилляров / мм2 150 *** ** 100 * 50 PCL PCL+VEGF 0 2 месяца 3 месяца 4 месяца * - p<0,01 относительно PCL через 2 месяца имплантации ** - p<0,01 относительно PCL через 3 месяца имплантации *** - p<0,01 относительно PCL через 4 месяца имплантации Рисунок 5 – Количество капилляров на PCL и PCL с VEGF графтах через 2, 3 и 4 месяца после внутрибрюшной имплантации Таким образом, анализ результатов показал, что PCL и PCL с VEGF графты вызывают ответную реакцию организма на инородное тело с образованием грануляционной ткани и последующим ее созреванием в фиброзную ткань, что является характерным для биосовместимых материалов. При этом выделение 18 ростового фактора в месте имплантации не оказывает влияния на скорость протекания процессов воспаления и регенерации тканей. Однако, инкорпорирование ростового фактора в PCL графты способствует усилению ангиогенеза на протяжении 4 месяцев. Проходимость PCL графта с VEGF и формирование на его основе кровеносного сосуда. Сосудистые графты из PCL и PCL с VEGF с внутренним диаметром 2 мм были удобны в имплантации и прочно удерживали шовный материала. Результаты ультразвукового мониторинга с допплерометрией через 1, 3, 5, 7 и 10 месяцев после имплантации показали проходимость всех протезов. При макроскопическом исследовании эксплантированных графтов не было обнаружено кровотечений и видимых повреждений стенки. В обеих группах животных на продольном разрезе графтов отмечали образование внутренней выстилки, граница между имплантатом и нативной аортой в зоне анастомоза не визуализировалась. Гистологический анализ образцов показал наличие пристеночного тромба в PCL графтах без ростового фактора, препятствующего току крови (Рисунок 6). а б а б 1 – PCL, окраска гематоксилин и эозин; 2 – PCL, окраска по Ван-Гизон; 3 – PCL с VEGF, окраска гематоксилин и эозин; 4 – PCL с VEGF, окраска по Ван-Гизон; а – стенка графа; б – тромб. Рисунок 6 – Сосудистые графты через 10 месяцев после имплантации в брюшную аорту крысы, увеличение ×50 19 В свою очередь в PCL графтах, содержащих VEGF, имелся пристеночный тромб в зоне анастомоза с сохранением просвета сосудистого протеза. Cтенка графтов в обеих группах животных была полностью инфильтрирована макрофагами и миофибробластами. Клеточная инфильтрация сопровождалась деградацией полимера и накоплением межклеточного вещества (коллагена, эластина). В стенке сосудистых графтов с VEGF отмечали большое количество кровеносных сосудов, заполненных эритроцитами. Ни в одном из образцов не было участков острого воспаления. Таким образом, на основании анализа полученных данных можно заключить, что при имплантации в кровеносное русло сосудистые графты из поликапролактона и поликапролактона с сосудистым эндотелиальным фактором роста заселяются клетками, синтезирующими межклеточный матрикс, который замещает полимер в местах деградации и способствует поддержанию механических свойств имплантата. Пролонгированный выход сосудистого эндотелиального фактора роста, инкорпорированного в поликапролактон, стимулирует ангиогенез в стенке графта и сохраняет его проходимость. ВЫВОДЫ 1. Сосудистые графты из поликапролактона, изготовленные методом электроспиннинга, характеризуются высокими показателями прочности, упругодеформативных свойств и морфологией, имитирующей межклеточный матрикс. Оптимальным режимом изготовления является использование 14% раствора поликапролактона в хлороформе при напряжении 15 кВ. Введение в полимер сосудистого эндотелиального фактора роста приводит к патогенетически незначительному снижению прочности и эластичности материала с сохранением пористой структуры. 2. Сосудистый эндотелиальный фактор роста высвобождается из поликапролактона пролонгированно с сохранением биологической активности, что способствует усилению адгезии эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток на поверхности графтов и стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток в условиях in vitro. 3. При перитонеальной имплантации графт из поликапролактона с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста развивается 20 воспалительная реакция, которая не отличается от таковой при имплантации биосовместимых материалов, а пролонгировано выделяемый ростовой фактор стимулирует ангиогенез в графте, что проявляется в значительном увеличении количества капилляров, по сравнению с графтами без сосудистого эндотелиального фактора роста. 4. При пролонгированном эндотелиального фактора роста высвобождении из сосудистого поликапролактонного графта, имплантированного в инфраренальный отдел аорты крысы, происходит заселение клетками и стимуляция ангиогенеза в стенке графта, что обеспечивает формирование кровеносного сосуда и улучшение его проходимости по сравнению с графтом без ростового фактора. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для стимуляции регенерации кровеносного сосуда на основе полимерного биодеградируемого графта рекомендуется пролонгированная доставка сосудистого эндотелиального фактора роста в место имплантации, которая может быть обеспечена инкорпорированием ростового фактора в полимер. Инкорпорирование осуществления их молекул ростового пролонгированного фактора в высвобождения, графт, для целесообразно проводить методом двухфазного электроспиннинга с использованием раствора поликапролактона, смешанного с раствором биологических молекул в фосфатно-солевом буфере в соотношении 20:1. СПИСОК, ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Работы, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК 1. Свойства тканеинженерных матриц из поликапролактона, импрегнированных ростовыми факторами VEGF и bFGF / В.В. Севостьянова, Y.L. Elgudin, G. Wnek и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2012. – Т. 7, № 4. – С. 62-67. (0,5 п.л.) 2. Выбор оптимальных параметров электроспиннинга для изготовления сосудистого графта малого диаметра из поликапролактона / В.В. Севостьянова, А.С. Головкин, Д.Е. Филипьев и др. // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 10. – С. 180-184. (0,42 п.л.) 21 Работы, опубликованные в рецензируемых журналах 3. Стимуляция ангиогенеза матрицами из поликапролактона, содержащими VEGF / В.В. Севостьянова, Г.Ю. Васюков, В.В. Борисов и др. // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. – 2013. – № 4. – С. 28-34. (0,58 п.л.) Патент 4. Тканеинженерный сосудистый графт малого диаметра и способ его изготовления: пат. 2496526 Рос. Федерация: МПК51 А 61 L 27/58, А 61 L 33/06, А 61 F 2/06 / Л.С. Барбараш, Я.Л. Эльгудин, В.В. Севостьянова, А.С. Головкин ; заявитель и патентообладатель ФГБУ «НИИ комплексных проблем сердечнососудистых заболеваний» СО РАМН. – № 2012113439/15 ; заявл. 06.04.2012 ; опубл. 27.10.2013, Бюл. № 30. – 5 с. Материалы конференций 5. Испытание тканеинженерного биодеградирующего графта в качестве протеза кровеносного сосуда in vivo / В.В. Севостьянова, Y.L. Elgudin, G. Wnek и др. // Стволовые клетки и регенеративная медицина : сборник тезисов всероссийской научной школы конференции. – Москва, 2010. – С. 67-68. (0,17 п.л.) 6. Севостьянова, В.В. Создание биодеградирующей полимерной матрицы с инкорпорированными ростовыми факторами методом двухфазного электроспиннинга [Электронный ресурс] / В.В. Севостьянова // XVIII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» : материалы конф. – Москва, 2011. – С. 32-33. (0,17 п.л.) 7. Двухфазный электроспиннинг для создания тканеинженерных матриц на основе поликапролактона / В.В. Севостьянова, Y.L. Elgudin, G. Wnek и др. // Инновационный конвент «Кузбасс: образование, наука, инновации» : материалы конвента – Кемерово, 2011. – Т. 2. – С. 79-82. (0,33 п.л.) 8. Оценка возможности применения графта из поликапролактона в качестве протеза кровеносного сосуда / В.В. Севостьянова, Т.В. Глушкова, Y.L. Elgudin и др. // Актуальные проблемы лабораторной диагностики и биотехнологий : материалы всероссийской науч.-практ. конф. – Кемерово, 2012. – C. 89-90. (0,17 п.л.) 22 9. Свойства тканеинженерного сосудистого графта малого диаметра из поликапролатона / В.В. Севостьянова, Т.В. Глушкова, Ю.А. Кудрявцева и др. // Инновационный конвент «Кузбасс: образование, наука, инновации» : материалы конвента. – Кемерово, 2012. – Т. 2. – С. 91-93. (0,25 п.л.) 10. Экспериментальная оценка новых биодеградируемых сосудистых протезов из поликапролактона / Д.Е. Филипьев, В.В. Севостьянова, А.С. Головкин и др. // XXVIII Международная конференция «Ангиология и сосудистая хирургия» : материалы конф. – Новосибирск, 2013. – Т. 19. – Прил. – С. 385-386. (0,17 п.л.) 11. Биодеградируемые тканеинженерные матрицы для контролируемой доставки VEGF / В.В. Севостьянова, Г.Ю. Васюков, В.В. Борисов и др. // Инновационный конвент «Кузбасс: образование, наука, инновации» : материалы конвента.– Кемерово, 2013. – Т. 2. – С. 301-303. (0,25 п.л.) 12. Оценка свойств сосудистого графта из поликапролактона, содержащего VEGF / В.В. Севостьянова, Г.Ю. Васюков, В.В. Борисов и др. // 1-ый Национальный конгресс по регенеративной медицине : материалы конгр. – Москва, 2013. – С. 230. (0,08 п.л.) 13. Биодеградируемые протезы малого диаметра, экспериментальное исследование / Д.Е. Филипьев, В.В. Севостьянова, А.С. Головкин и др. // Сердечно-сосудистые заболевания. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН : материалы всероссийского съезда. – Москва, 2013. – Т. 14, № 6. – Прил. – С. 250. (0,08 п.л.) 14. Биодеградируемые графты для регенерации кровеносного сосуда, содержащие молекулы VEGF и bFGF / В.В. Севостьянова, А.С. Головкин, Д.Е. Филипьев и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов : материалы всероссийского съезда. – 2014. – Прил. – С. 275. (0,08 п.л.) СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ PCL – polycaprolactone, поликапролактон VEGF – vascular endothelial growth factor, сосудистый эндотелиальный фактор роста МСК – мезенхимальные стволовые клетки
