1 002520 2 Настоящее изобретение относится к облас-

1
Настоящее изобретение относится к области воспалительных заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, а также к способам их диагностики.
Целый ряд заболеваний связан с окислительным стрессом. Продуктом окислительного
стресса является переокисленный липид, который, по-видимому, служит медиатором вызванного окислением заболевания. Образование перекисей липидов в биологических системах является сложным процессом, который может
происходить различными способами, например,
за счет ферментов (включая липооксигеназы,
циклооксигеназы, пероксидазы и другие оксигеназы), а также неферментативно, например, за
счет образования внутриклеточных, внеклеточных или расположенных на поверхности клеток
реакционноспособных кислородных соединений. Окисленные липиды клеточной мембраны
и внеклеточной среды могут вызвать основательные изменения в поведении клетки. Вредное действие перекисных липидов и их продуктов разложения хорошо известно в патогенезе
атеросклероза (Hertualla et al., Journal of Clinical
Investigation, 84:1086-1095 (1989); Gonen et al.,
Atherosclerosis, 65:265-272 (1987); и Jurgens et
al., Biochem. Biophys. Acta, 875:104-114 (1986)).
В настоящее время окисление признано
потенциальным фактором риска для возникновения сердечно-сосудистых заболеваний (Palinski et al., Atherosclerosis, 10:325-335 (1990)). Так
как окисление липидов связано с воспалительными состояниями и сердечно-сосудистыми
заболеваниями, для медицины важным является
наличие надежного теста, позволяющего количественно определить и оценить степень окисления липидов в организме хозяина и, в частности, человека.
Количественное определение гидроперекисей липидов в организме хозяина может быть
основано на непосредственном измерении гидроперекиси или на определении продуктов реакции или разложения гидроперекиси. Полиненасыщенные жирные кислоты ("PUFAs") содержат, по крайней мере, две двойные связи, а
15-20% из них содержат три или более двойных
связей. Встречающиеся в природе ненасыщенные жирные кислоты никогда не бывают сопряженными; двойные связи в них разделены,
по крайней мере, одной метиленовой группой.
Во время процесса окисления в гидроперекиси
липидов двойные связи PUFA могут стать сопряженными, что является одной из основных
схем повреждающего окисления. Начальные
продукты окисления PUFA, по-видимому, являются гидроперекисями липидов (LOOH) и
свободными радикалами гидроперекисей липидов (LOOH∙ или LOO∙), причем большинство
из них изменилось таким образом, что они содержат сопряженные двойные связи. Эти продукты или продукты их последующих реакций,
или продукты разложения были использованы
002520
2
для анализа степени окисления липидов в биологических образцах.
Так например, LOOH можно восстановить
in vivo до спирта LOH, который является инертным. LOH можно определить любым из способов, в котором анализируется спирт, и если LOH
конъюгирован, любым способом, в котором определяется сопряжение двойных связей. Ни
один из этих тестов не является чрезвычайно
специфичным, однако, так как речь идет о биологическом образце, возможно наличие любого
количества спиртов или молекул с сопряженными двойными связями.
В другом варианте LOOH может быть
окислен металлом in vivo с образованием радикала по двойной связи (LOOH∙), который является чрезвычайно реакционноспособным соединением. Такая молекула часто разлагается по
месту окисления с образованием альдегидсодержащих фрагментов или, если она не разлагается, она часто образует кетон. Молекула может разделиться на несимметричные части и,
если LOOH содержит более двух двойных связей, она может привести к образованию различных продуктов. Если в LOOH содержится три
или более двойных связей, одним из продуктов
разложения является малондиальдегид. Присутствие малондиальдегида можно определить с
помощью тиобарбитуровой кислоты (ТВА), которая реагирует с МДА с образованием флуоресцентного соединения, присутствие которого
можно легко определить и измерить количественно. ТВА-реакционноспособные вещества
обозначают как "TBARs". Тест ТВА не подходит для использования в качестве диагностического теста для определения состояния окисления липидов хозяина, так как он может фальсифицировать положительные результаты, учитывая другие альдегиды, сахара и аминокислоты.
Тест этот подходит только для исследовательских целей при использовании тщательно контролируемых образцов. Далее, он только измеряет количество перекисей липидов, которые
содержат три или более двойные связи.
Другим способом измерения LOOH в образцах является реакция их непосредственно с
иодидом калия с образованием окрашенного
комплекса (I2)KI, который можно легко измерить и определить количественно. Усовершенствование этого теста предусматривает использование лейкометилена синего, который реагирует с LOOH с образованием окрашенного продукта. Материалы для такого анализа продаются
Kamiya Biomedical Company. Подобно способу
ТВА, этот способ пригоден только для анализа
лабораторных образцов и не может быть использован для анализа биологических жидкостей или клеточных культур, которые могут
содержать
множество
перекрестнореакционноспособных веществ.
Образовавшиеся при реакции окисления
липидов альдегиды реагируют с жидкостями и
3
тканями организма. Эти альдегиды легко модифицируют протеинтиолы, лизин, гистидин и
другие остатки (Jurgens et al., Biochemical Journal, 265:605-608 (1990); Jessup. Biochemical
Journal, 234:245-248 (1986); Steinbrecher et al., J.
Lipid Res., 25:1109-1116 (1984)). Такие модифицированные альдегидами протеины являются
антигенными. Антитела к таким эпитопам, как
было показано, представляют мощный инструмент для определения и локализации модифицированных альдегидом протеинов в атеросклеротических артериях (Boyd, Am. J. Pathol.,
135:815-825 (1989); Haberland et al., Science,
241:215-218 (1988); Jurgens, Atheroscler. Throm.,
13:1689-1699 (1993)). Однако у здорового или
даже у пациента с атеросклерозом протеиновые
антигены, модифицированные альдегидами,
обычно нельзя обнаружить в плазме, а только
лишь в малых количествах в ткани.
Так как гидроперекиси липидов не существуют in vivo в течение длительного времени
из-за своей природной нестабильности, а образующиеся альдегиды представляют лишь один
из путей метаболического разложения LOOH и
для их образования необходимо время, продукты реакций короткоживущих LOOH с соседними соединениями могут присутствовать в гораздо больших количествах, нежели альдегиды, и
могут представлять привлекательные диагностические мишени. Так например, перекиси липидов высоко реактивны с аминогруппами протеинов, липидов и липофильных молекул. Их
тесная близость с мембранными протеинами и
апопротеинами липопротеинов предполагает
возможность того, что эти модификации могут
быть более уместны в биологических системах,
нежели альдегидами индуцированные модификации. Образование LOOH на клеточной мембране или липопротеине, по-видимому, более
вероятно создает, по крайней мере, на начальных стадиях протеины, которые непосредственно модифицированы LOOH, нежели протеины,
которые модифицированы их продуктами экстенсивного разложения, такими как альдегиды.
Fruebis, Parthasarathy и Steinberg в 1992г опубликовали доказательство предположения, что
согласованная реакция происходит между перекисными радикалами липидов и свободными
аминогруппами полипептидов или фосфатидилэтаноламина с образованием флуоресцирующих аддуктов неизвестной структуры. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89:10588-10592 (1992).
Fruebis с сотр. инкубировали гидроперекись
линолеоила с полипептидами и с одним ненасыщенным фосфатидилэтаноламином в отсутствии ионов металла. Образование флуоресцирующих продуктов оказалось во много раз
сильнее, нежели в случае образования их при
инкубировании полипептидов или фосфатидилэтаноламина с альдегидом, 4-гидроксиноненалом (который приводит к образованию
флуоресцирующих оснований Шиффа). Fruebis
002520
4
с сотр. предположили наличие двух возможных
схем реакции, причем в обоих случаях инициирование происходит за счет взаимодействия
свободной аминогруппы с перекисным радикалом. Теоретические схемы реакций предполагают образование пяти-, шести- или семичленных циклических структур. В статье нет предположений об активности этих гипотетических
структур, а также нет реальной идентификации
таких предполагаемых структур in vivo.
В PCT/US95/05880, поданной Emory University, раскрывается, что полиненасыщенные
жирные кислоты ("PUFAs") и их гидроперекиси
("ox-PUFAs") вызывают экспрессию адгезионных молекул VCAM-1 эндотелиальных клеток
поверхности, но не внутриклеточных адгезионных молекул (ICAM-1) или Е-селектина в эндотелиальных клетках аорты у человека, за счет
механизма, медиаторами которого не являются
цитокины или другие нецитокинные сигналы.
Более конкретно, раскрыто, что линолевая кислота, арахноидоновая кислота, гидроперекись
линолеила и арахидоновая гидроперекись индуцируют экспрессию клеточной поверхности
VCAM-1, но не ICAM-1 или Е-селектин. Насыщенные жирные кислоты (такие как стеариновая кислота) и мононеасыщенные жирные кислоты (такие как олеиновая кислота) не индуцируют экспрессию VCAM-1, ICAM-1 или Еселектина. Сообщалось также, что индуцирование VCAM-1 за счет PUFAs и их гидроперекисей жирных кислот подавляется дитиокарбаматами,
включая
пирролидиндитиокарбамат
(PDTC), что подкрепляет вывод о том, что индуцирование опосредствовано окисленной сигнальной молекулой и что индуцирование предотвращается, если окисление этой молекулы
блокировано, полностью изменено, или если
каким-либо другим образом предотвращено
взаимодействие окислительно-восстановительного модифицированного сигнала с его регуляторной мишенью.
PCT/US 93/10496, также поданная Emory
University, раскрывает, что дитиокарбоксилаты,
и особенно дитиокарбаматы, блокируют индуцированную экспрессию адгезионных молекул
VCAM-1 эндотелиальной клеточной поверхности и поэтому могут использоваться при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, включая
атеросклерозы, рестенозы после ангиопластики,
болезни коронарных артерий и стенокардию, а
также не сердечно-сосудистые воспалительные
заболевания, медиаторами которых служат
VCAM-1.
Целью настоящего изобретения является
создание способа и набора для определения состояния переокисления липидов у пациента, как
средства оценки риска возникновения у пациента заболевания, вызванного окислением.
Другой целью настоящего изобретения является создание коммерчески ценного способа и
5
набора для оценки состояния переокисления
липидов у пациента.
Еще одной целью настоящего изобретения
является создание способа и набора для оценки
состояния переокисления липидов у пациента,
как средства для оценки терапевтической эффективности медикаментозного лечения заболеваний, вызванных окислением. Еще одной целью изобретения является создание набора для
диагностики и количественной оценки состояния переокисления липидов у пациента.
Еще одной целью настоящего изобретения
является создание материалов, которые можно
использовать для диагностики и количественной оценки состояния переокисления липидов у
пациента.
Еще одной целью настоящего изобретения
является создание способа оценки способности
предполагаемого лекарства понижать состояние
переокисления липидов у пациента.
Еще одной целью настоящего изобретения
является идентификация и предложение новых
медиаторов клеточных реакций.
Еще одной целью настоящего изобретения
является обеспечение новых терапевтических
агентов и способов опосредствованного воздействия на воспалительные реакции.
Еще одной целью настоящего изобретения
является создание агентов и способов для идентификации и количественного определения воспалительных нарушений.
Еще одной целью настоящего изобретения
является создание способа и набора для определения аутоантител в плазме пациентов с заболеваниями, которые препятствуют выработке аутоантител, включая эндометриозы.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое взаимодействует с
антигеном, образовавшимся в результате реакции гидроперекиси липида с первичным амином, и при этом в какой-либо значительной степени не связывается с альдегид-модифицированным белком, или его фрагменту.
Настоящее изобретение также относится к
способу оценки уровня перекисного окисления
липидов в биологическом образце путем выявления антигена, образовавшегося в результате
реакции гидроперекиси липида с первичным
амином, заключающемуся в том, что обеспечивают взаимодействие образца с указанным антителом или его фрагментом и определяют наличие комплекса антиген-антитело, по количеству которого оценивают уровень перекисного
окисления липидов.
Настоящее изобретение также относится к
способу оценки уровня перекисного окисления
липидов в биологическом образце путем выявления антигена, образовавшегося в результате
реакции гидроперекиси липида с первичным
амином, заключающемуся в том, что обеспечивают контактирование образца с антителом или
002520
6
его фрагментом или их конъюгатом, которые
перекрестно связываются с указанным антителом или его фрагментом, и определяют наличие
комплекса антиген-антитело, по количеству которого оценивают уровень перекисного окисления липидов.
Настоящее изобретение также относится к
набору для оценки уровня перекисного окисления липидов в биологическом образце, содержащему указанное антитело или его фрагмент.
Настоящее изобретение также относится к
способу диагностики заболеваний, обусловленных перекисным окислением липидов, заключающемуся в том, что осуществляют оценку
уровня перекисного окисления липидов в полученном от пациента биологическом образце в
соответствии с описанными выше способами.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет в виде прямоугольников диаграмму распознавания альбумина кроличьей сыворотки и альбумина кроличьей сыворотки, модифицированного гидроперекисью
липида, антителом примера 4; по оси абсцисс
отложены нг протеина, а по оси ординат - оптические плотности, измеренные на 405 нм.
Фиг. 2 представляет в виде прямоугольников диаграмму распознавания оксисленныхLDL антителом примера 4, как единицы оптической плотности в зависимости от концентрации
в мкг.
Фиг. 3 представляет график дозозависимого индуцирования VCAM-1 (А) и
ICAM-1 (В) за счет оксиленного альбумина
бычьей сыворотки, выраженное как процент
максимального TNF-α индуцированного сигнала.
Фиг. 4 представляет схематичную диаграмму крупномасштабного синтеза 13-HpODE
модифицированного оксикина, использующего
систему образования перекиси липидов. Мишеневый протеин помещают в мембрану с отсечением 10 кДа, и 13-HpODE вырабатывающую
систему заменяют каждые 8-16 ч.
Фиг. 5 представляет диаграмму Вестернблоттинга, которая демонстрирует, что sLO и
линолевая кислота являются минимальными
требованиями для образования oxSLO.
Фиг. 6 представляет диаграмму Вестернблоттинга, которая демонстрирует определение
иммунореактивных 13-HpODE обработанных
образцов после 96 ч в крупномасштабной реакции.
Фиг. 7 представляет график индуцирования ICAM-1 за счет 13-HpODE, обработанных
sLO, как процент от TNF индуцирования во
времени.
Фиг. 8 представляет HPLC хроматограмму,
которая показывает, что 13-HpODE, модифицированные sLO, более гидрофобны, нежели необработанные sLO.
Фиг. 9 представляет график индуцирования ICAM-1 фракциями oxSLO, собранными с
7
помощью гель-фильтрационной хроматографии.
На графике видно, что десятая фракция наиболее сильно индуцирует ICAM-1.
Фиг. 10 представляет график поглощения
(на 280 нм) в зависимости от фракций oxSLO,
полученных с помощью гель-фильтрационной
хроматографии, на котором видно, что фракции
9 и 10 включают лишь часть полного количества протеина, разделенного с помощью гельфильтрационной хроматографии.
Фиг. 11 представляет график в виде прямоугольников индуцирования ICAM-1 соевой
липооксигеназой, линолевой кислотой и окисленной соевой липооксигеназой в виде процента
индуцирования ICAM за счет TNF.
Фиг. 12 представляет диаграмму (в виде
прямоугольников) индуцирования ICAM-1 (как
функцию процента индуцирования за счет TNF)
соевой липооксигеназой и окисленной соевой
липооксигеназой, синтезированной крупномасшабным способом в эндотелиальных клетках
аорты человека (НАЕС).
Фиг. 13 представляет диаграмму (в виде
прямоугольников) индуцирования ICAM-1 (как
функцию процента индуцирования за счет TNF)
соевой липооксигеназой и окисленной соевой
липооксигеназой, на которой видно, что oxSLO
активирует экспрессию ICAM поверхности клеток зависимым от дозы образом.
Фиг. 14 представляет диаграмму (в виде
прямоугольников) индуцирования ICAM-1 (как
функцию процента индуцирования за счет TNF)
окисленной соевой липооксигеназой. На графике видно, что oxSLO индуцирует ICAM в большей степени, нежели VCAM.
Фиг. 15 представляет результаты Норзернблоттинга, из которых видно, что именно
oxSLO, а не SLO, индуцирует накопление
VCAM, ICAM и МСР-1 мРНК в эндотелиальных
клетках аорты человека (НАЕС).
Фиг. 16 представляет результаты Норзернблоттинга, из которых видно быстрое накопление VCAM, ICAM и МСР-1 в эндотелиальных
клетках.
Подробное описание изобретения
1. Способ оценки окислительного состояния
организма хозяина.
А. Выработка антитела
(i) Гидроперекись липида
Липид нерастворим в воде и представляет
собой маслянистое или жирное вещество, которое экстрагируется из клеток и тканей такими
неполярными растворителями, как хлороформ и
эфир. Наиболее распространенной формой липидов является триацилглицерин. Жирные кислоты являются характерными строительными
блоками липидов. Жирная кислота представляет
собой длинноцепочечную органическую карбоновую кислоту, которая обычно содержит от
четырех до двадцати четырех атомов углерода.
Жирные кислоты обычно не существуют в свободном виде или, если они не включены в клет-
002520
8
ки или ткани, напротив, они связаны в крупные
молекулы, такие как липопротеин, альбумин,
триацилглицерин, воск, фосфоглицериды (например, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол,
или кардиолипин), сфинголипид (например,
сфингомиелин, цереброзиды или ганглиозиды)
или стерин и его сложные эфиры жирных кислот. Такие материалы, под общим названием
цероиды и липофусцины, включают жирные
кислоты.
В том смысле, как здесь использован, термин "полиненасыщенная жирная кислота"
(PUFA) относится к жирной кислоте (обычно
С8-С24), которая содержит, по крайней мере, две
алкенильные связи и включает, (но не ограничивается ими) линолевую (С18∆), линоленовую
(С19∆), арахидоновую (С20∆) и эйкозатриеновую
(С20∆) кислоты. Гидроперекись липида, в том
смысле, как этот термин использован здесь, относится к
1. (i) полиненасыщенной жирной кислоте;
или (ii) к молекуле, которая содержит остаток
полиненасыщенной жирной кислоты;
2. в которой, по крайней мере, одна из алкенильных связей была превращена в гидроперекись.
Нелимитирующими примерами гидроперекисей липидов являются
15-НРЕТЕ
13-HPODE
Гидроперекиси липидов можно получить
in vivo ферментативно из полиненасыщенных
жирных кислот или липидов, содержащих PUFA
остаток, с помощью липооксигеназы, циклооксигеназы, пероксидазы или других оксигеназных ферментов, а также неферментативными
способами за счет создания внутриклеточных,
внеклеточных или расположенных на поверхности клеток реактивных кислородных соединений. Перекиси липидов можно получить химически с помощью окисления полиненасыщенной
жирной кислоты или липид-содержащего PUFA
остатка, используя стандартные способы.
По-видимому, для создания антитела, которое реагирует с выбранным амином с образованием эпитопа, можно использовать различные
гидроперекиси липидов. По-видимому, такая
реакция совершенно неселективна; фактически,
любая гидроперекись липида будет реагировать
антигенно с первичным амином.
(ii) Первичный амин
9
Для осуществления взаимодействия с перекисью липида, которая образует антигенный
материал, можно использовать любой первичный амин. Было обнаружено, что чем более
гидрофобен и нуклеофилен амин, тем легче идет
реакция. Так например, бензиламин реагирует с
гидроперекисью липида более быстро, нежели
этиламин. На этом основании, такие небольшие
амины, как C1-С3алкиламины, и аммиак нежелательно использовать. Для введения хозяину
предпочтительным амином является такой
амин, который демонстрирует слабую токсичность либо один, либо после реакции с гидроперекисью липида. Такой амин может быть присоединен к более крупной молекуле, например к
гаптену, при желании, для усиления антигенной
реакции.
Предпочтительны синтетические варианты
встречающихся в природе молекул, содержащих
первичные амины, таких как пептиды и протеины.
Примеры включают такие пептиды или
протеины, которые содержат концевую аминогруппу, лизиновый остаток (например, альбумин и полилизин) или гистидиновый остаток.
Можно также использовать фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и гормоны с концевыми аминами.
То, что реакция гидроперекиси липида и
протеинов в природе происходит in vivo, демонстрируется тем фактом, что такие коммерчески
доступные протеины, как альбумин бычьей сыворотки, содержат эпитоп гидроперекиси липида/амина. Поэтому предпочтительно использовать синтетический пептид или протеин для
получения антигена и, в конечном счете, антитела для целей качественного контроля.
(iii) Реакция гидроперекиси липида с первичным амином
Способность гидроперекиси липида реагировать с протеином была продемонстрирована
Fruebis, Parthasarathy и Steinberg in Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, Vol.89, pp.10588-10592, November 1992, Medical Sciences. В этой статье описывается получение гидроперекиси липида с помощью реакции линолевой кислоты или фосфолипида линолевой кислоты с соевой липооксигеназой, а затем эту гидроперекись инкубируют
с полипептидами без ионов металлов. Общий
подход и условия эксперимента, изложенные в
этой статье, можно использовать для получения
широкого круга аддуктов гидроперекиси липида
и амина.
Химическая реакция между гидроперекисью липида и первичным амином может быть
осуществлена в лаборатории или на фабрикеизготовителе, при комнатной температуре, при
нейтральных или близких к нейтральным значениях рН, которые симулируют in vivo условия.
Предпочтительны водные условия, однако, реакция может протекать в органическом растворителе, если реагенты и продукт достаточно
002520
10
растворимы в органике. LOOH может быть менее стабильна в органическим растворителе,
нежели в водном растворителе. При желании
можно повысить температуру реакции, вплоть
до температуры кипения растворителя. За ходом
реакции можно следить с помощью флуоресцентной спектрометрии. Возбуждение продукта
обычно происходит в интервале от 330 до 360
нм, а эмиссия наблюдается в интервале от 420
до 450 нм. Реакция завершается, когда интенсивность флуоресценции образца больше не
повышается. В условиях обычной реакции гидроперекись липида и амин присутствуют в отношении, примерно, 1,5:1, однако, при желании,
можно использовать и другие отношения для
оптимизации выхода или для других целей.
(iv) Выработка и использование антител
Способ и набор для оценки состояния переокисления липида в организме хозяина может
включать либо моноклональные и поликлональные антитела, либо фрагменты антител.
Термин "антитело" в том смысле, как здесь
использован, включает моноклональные и поликлональные антитела, а также фрагменты антител, которые связываются специфически, но
обратимо, с нужным эпитопом. Предпочтительно, чтобы антитело или фрагмент антитела были
получены из моноклонального антитела или
фрагмента антитела. Получение моноклональных или поликлональных антител к антигену,
полученному в реакции гидроперекиси липида с
первичным амином, можно обеспечить, используя любой известный способ, например те, которые раскрыты у Zola, H. (1988) "Monoclonal
Antibodies - A manual of techniques" CRC Press
and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow &
Lane; Cold Spring Harbor (1988) (включено сюда
по ссылке).
В одном из вариантов, преимущественно
для лабораторного использования, животных
иммунизовали антигеном и, предпочтительно,
адъювантом. Бустерные иммунизации необязательно продолжали антигеном в PBS и смешанным с адъювантом с периодическими интервалами. Затем у животных брали кровь после иммунизаций. После удаления сгустков и частиц
сыворотку можно было анализировать с помощью ELISA. Ежемесячно, или с другими интервалами, титры можно получать после начальной
иммунизации.
В другом варианте у животных забирают
селезенки: у тех животных, которые были иммунизованы антигеном и, предпочтительно,
адъювантом. Клетки селезенки выделяют и гибридизуют с бессмертными миеломными клетками, используя полиэтиленгликоль. Гибридизованные гибридомные клетки отбирают и культивируют in vitro. Культуральные жидкости
гибридомных клеток тестируют на наличие гибридомных антител с нужной специфичностью.
Методика отбора для идентификации подходящего моноклонального или поликлонального
11
антитела является важным аспектом достижения нужной иммуноспецифичности. Гибридомные клетки можно тестировать на присутствие
антител, специфичных для антигена, например,
с помощью ELISA, проводимого стандартными
способами.
Обычно, если продукт выбранной гидроперекиси липида и выбранного амина содержит
антиген с одним эпитопом, этот антиген будет
выявлять получение моноклонального или поликлонального антитела. Если же используют
множество антигенов или антиген с множеством
эпитопов, будет получено поликлональное антитело. Так например, если LOOH реагирует с
альбумином сыворотки, получают антиген с
множеством эпитопов, так как альбумин содержит ряд лизиновых остатков в различных участках молекулы. Такой антиген выявит продуцирование поликлональных антител. Если, напротив, используют продукт реакции простого
амина с LOOH в качестве антигена, тогда антиген может вызвать образование моноклонального или поликлонального антител. Так например,
если выбирают фосфатидилэтаноламин, который содержит ненасыщенный липидный фрагмент, он может действовать и как липидная
компонента и как компонента амина. Такая
компонента может вызвать продуцирование
моноклональных или поликлональных антител.
Наблюдалось, что протеины из нормальных источников могут содержать небольшое
количество LOOH/амин антигена. Из-за этого,
для целей качественного контроля, предпочтительно подвергать взаимодействию синтетический пептид или синтетическую аминсодержащую молекулу с LOOH для образования антигена для получения антител.
Вариабельные тяжелые (VH) и вариабельные легкие (VL) домены антитела участвуют в
распознавании антигена, факт, который впервые
был обнаружен в ранних экспериментах протеазного переваривания. Первое подтверждение
было обнаружено при "гуманизации" антител
грызунов. Вариабельные домены, полученные
от грызунов, можно гибридизовать с постоянными доменами человеческого происхождения
таким образом, что полученное антитело сохраняет антигенную специфичность антитела грызуна (Morrison et al., (1984), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 81, 6851-6855). "CDR трансплантацию"
можно использовать для гуманизации антител
грызунов. Дополнительно или альтернативно,
рекомбинантные моноклональные антитела
можно "приматизировать", то есть получить
антитела, в которых вариабельные участки получены от двух различных видов приматов,
предпочтительно вариабельные участки антитела от обезьяны макаки, а постоянные участки от человека. Преимущества таких антител
включают высокую гомологичность с иммуноглобулином человека, присутствие эффекторных
функций человека, пониженную иммуноген-
002520
12
ность и длительный срок полураспада сыворотки (Newman et al., (1992) Biotechnology, 10,
1455).
Участок, специфичный для антигена, можно экспрессировать как часть бактериофага, например, используя способ McCafferty et al.,
(1990) Nature, 348:552-554. Похожие на антитела
молекулы настоящего изобретения можно выбрать из фаговых библиотек, используя способы, раскрытые у Griffiths et al., (1993) EMBO J.,
12, 725-734, когда антигены иммобилизованы и
их используют для отбора фагов. Кроме того,
для связывания фагов можно использовать подходящие клетки, выращенные в монослоях и
либо фиксированные формальдегидом или глутаральдегидом, либо нефиксированные. Ненужные фаги смывают, а связанные фаги выделяют,
разрушая их связывание с антигеном и реамплифицируя в бактерии. Такой процесс отбора и
амплификации осуществляют несколько раз для
обогащения популяции фагов для тех молекул,
которые представляют собой похожие на антитела молекулы настоящего изобретения.
Фрагменты антител включают Fabподобные молекулы (Better et al., (1988) Science,
240, 1041); Fv молекулы (Skerra et al., (1988) Science, 240, 1038); Одноцепочечные Fv (ScFv) молекулы, в которых VH и VL партнерные домены,
связаны гибким олигопептидом (Bird et al.,
(1988) Science, 242, 423; Huston et al., (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879) и антитела с
одним доменом (dAbs), включающие выделенные V домены (Ward et al., (1989) Nature, 341,
544). Общий обзор методик, применяемых для
синтеза фрагментов антител, которые сохраняют свои специфические сайты связывания,
можно найти у Winter & Milstein, (1991), Nature
349, 293-299.
Фрагменты антител включают (но ими не
ограничиваются) Fab, (Fаb)2, Fv, ScFv и dAb
фрагменты - фрагменты, которые включены в
настоящее изобретение. Подобные антителам
молекулы можно получить, используя методики
рекомбинантных ДНК в соответствии с WO
84/03712.
Может оказаться выгодным использовать
скорее фрагменты антител, а не целые антитела.
Fab, Fv, ScFv и dAb фрагменты антител все
можно экспрессировать в и секретировать из E.
coli, тем самым обеспечивая облегченное продуцирование больших количеств фрагментов.
Целые антитела и F(аb')2 фрагменты являются "бивалентными". Под термином "бивалентный" подразумевают, что антитела и F(ab')2
фрагменты имеют два антигеновых объединяющих сайта. Напротив, Fab, Fv, ScFv и dAb
фрагменты являются одновалентными и содержат только один антигеновый объединяющий
сайт.
Искусство "конструирования антител" быстро развивается, как раскрыто у Tan L.K. and
Morrison S.L., (1988) Adv. Drug Deliv. Rev.,
13
2:129-142; Williams G. (1988) Tibtech 6:36-42 и
Neuberger M.S. et al., (1988) 8th International
Biotechnology Symposium Part 2, 792-799 (все
включены сюда для ссылки) и хорошо приспособлено для получения антитело-подобных молекул, полученных из антител настоящего изобретения.
Антитела можно использовать для различных целей, относящихся к исследованию, локализации, выделению и очистке антигена, с которым они специфически связываются. В частности, антитело можно использовать для визуализации и обработки клеток, демонстрирующих
антиген. Антитело настоящего изобретения
можно объединить со сцинтиграфической радиометкой,
радиоизотопом,
сердечнососудистым, противовоспалительным или каким-либо другим лекарством, ферментом, превращающим
пролекарство
в
сердечнососудистое, противовоспалительное или какоелибо другое необходимое лекарство, наряду с
пролекарством, или другим соединением, которое является медиатором клеточного процесса.
Такие конъюгаты содержат "связывающий участок", который состоит из антитела настоящего
изобретения, и "функциональный участок", который состоит из радиометки, лекарства или
фермента и т.п. Связывающий участок и функциональный участок могут быть разделены связывающим фрагментом.
Связывающий участок и функциональный
участок конъюгата (также пептида или полипептида) могут быть связаны друг с другом любым из обычных способов сшивания полипептидов, например таких, которые раскрыты у
O'Sullivan et al., (1979) Anal. Biochem., 100, 100108. Так например, один участок может быть
обогащен тиольными группами, а другая часть
может прореагировать с бифункциональным
агентом, способным реагировать с этими тиольными группами, например N-гидроксисукцинимидным сложным эфиром или иодоуксусной
кислотой (NHIA), или N-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионатом (SPDP). Амидные и
тиоэфирные связи, например, образуются за
счет м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидного сложного эфира и обычно более стабильны in vivo, нежели дисульфидные связи.
В другом варианте, если связывающая
часть содержит углеводы, как это бывает в случае антител или некоторых фрагментов антител,
функциональная часть может быть связана через углеводную часть с использованием способов связывания, изложенных в ЕР 0 088695.
Функциональная часть конъюгата может
быть ферментом для превращения пролекарства
в лекарство с использованием способа, аналогичного способу, описанному Bagshawe и его
коллегами Bagshawe et al., (1987) Br.J. Cancer 56,
531; Bagshawe et al., (1988) Br. J. Cancer 58, 700;
WO 88/07378.
002520
14
Может оказаться вовсе необязательным,
чтобы весь фермент присутствовал в конъюгате,
но, естественно, должна присутствовать его каталитическая часть. Можно использовать так
называемые "абзимы", в которых моноклональное антитело выработано против соединения,
участвующего в реакции, которую нужно катализовать, обычно реакционно промежуточное
состояние. Затем полученное антитело будет
функционировать как фермент для реакции.
Конъюгат можно выделить с помощью
афинной хроматографии или хроматографии с
исключением по размерам и протестировать на
двойственные биологические активности. Иммунореактивность антигена можно измерить,
используя твердофазный иммуноферментный
анализ (ELISA) с иммобилизованным антигеном
и в радиоиммуноанализе в живых клетках. Ферментный анализ можно использовать для βглюкозидазы, используя субстрат, поглощение
которого меняется по мере гидролиза глюкозных остатков, так, например, oNPG (онитрофенил-β-D-глюкопиранозид), высвобождает 2-нитрофенол, который можно измерить
спектрометрически на длине волны 405 нм.
Стабильность конъюгата можно протестировать in vitro, инкубируя вначале при 37°С в
сыворотке, а затем используя для анализа высокоэффективную жидкостную хроматографию с
исключением по размерам.
Стабильность конъюгата in vivo можно
тестировать аналогичным способом, анализируя
сыворотку мышей в различные моменты времени после инъекций конъюгата. Кроме того,
можно ввести в антитело радиометку 125I, и в
фермент 131I до конъюгации и определить биораспределение конъюгата, свободного антитела
и свободного фермента в мыши.
В другом варианте конъюгат можно получить в виде гибридного соединения с помощью
рекомбинантной техники, когда длина ДНК
включает соответствующие участки, кодирующие две части конъюгата, либо расположенные
рядом, либо разделенные участком, кодирующим линкерный пептид, который не нарушает
желательных функций конъюгата. Понятно, что
две функциональные части соединения могут
перекрываться полностью или частично. Затем
ДНК экспрессируют в подходящего хозяина
известными способами.
Полученные антитела или их конъюгаты
можно вводить любыми подходящими способами, обычно парэнтерально, например, внутривенно или внутрибрюшинно, в виде стандартных стерильных непирогенных композиций с
разбавителями и носителями, например, в изотоническом физиологическом растворе (при
внутривенном введении). После того, как конъюгат связан с мишеневыми клетками и очищен
от потока крови (при необходимости), что
обычно занимает день или около этого, можно
15
вводить лекарство, обычно в виде одноразового
вливания дозы, или целевой участок можно визуализировать. При необходимости, так как
конъюгат может быть иммуногенным, можно
вводить циклоспорин или некоторые другие
иммуносупрессанты для обеспечения более
длительного периода обработки, но обычно этого не требуется.
Промежуток времени между введением
конъюгата и пролекарства можно оптимизировать неинвентивным способом, так как отношения больная ткань/здоровая ткань конъюгата
(по крайней мере, после внутривенного введения) выше после нескольких дней, тогда как к
этому моменту абсолютное количество конъюгата, связанного с мишеневой тканью, выраженное в процентах от введенной дозы в граммах,
будет ниже, нежели в начальные моменты времени. Поэтому, оптимальный интервал между
введением конъюгата и пролекарства будет
компромиссом между пиковой концентрацией в
ткани антитела/фермента и наилучшим распределением отношения между поврежденной и
нормальной тканями. Дозу конъюгата должен
выбирать врач в соответствии с обычными критериями. Дозу любого конъюгата следует выбирать в соответствии с нормальными критериями, особенно принимая во внимание тип, состояние и локализацию мишеневой ткани, и вес
пациента. Длительность лечения будет зависеть
частично от скорости и длительности любой
иммунной реакции на конъюгат.
Функциональная часть конъюгата, если
конъюгат используют для диагностики воспалений, обычно включает и может состоять из радиоактивного атома для сцинтиграфических
исследований, например, может быть использован технеций 99м (99мТс) или иод-123 (123I), или
может быть введена метка для получения изображения методом ядерного магнитного резонанса, например: иод-123, иод-131, индий-111,
фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
При использовании в конъюгате для селективного разрушения ткани функциональная
часть может содержать такие высокорадиоактивные атомы, как иод-131, рений-186, рений188, иттрий-90 или свинец-212, которые выделяют достаточно энергии для разрушения соседних клеток. Радио- или другие метки можно
включить в конъюгат известными способами.
Так например, метку можно синтезировать, используя подходящие реагенты, которые содержат, например, фтор-19 вместо водорода. Такие
метки, как 99мТс, 123I, 186Rh, 188Rh и 111In, можно
присоединить с помощью пептидов цистеинового остатка. Иттрий-90 можно присоединить через лизиновый остаткок. Способ IODOGEN
(Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys. Res.
Commun., 80:49-57) можно использовать для
включения иода-123. Остальные способы под-
002520
16
робно описаны в "Моnоclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989).
В. Способ детектирования антигена
Настоящее изобретение включает способ
детектирования антигена, образуемого в реакции гидроперекиси липида с первичным амином. Этот тест можно осуществить на лабораторном образце или на биологическом образце.
В том смысле, как здесь использован, термин
"биологический образец" относится к образцу
ткани или жидкости, выделенному из хозяина,
обычно человека, и включает (но ими не ограничивается) плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, лимфу, глазную жидкость, ткань
кожи, внутрибрюшинную жидкость, урину,
желчь, кусочки сердечно-сосудистой, респираторной, кишечной, центральной нервной системы, гениталий, матки, слезы, плаценту, пуповину, молоко, эндотелиальные клетки, эндометриальные клетки, эпителиальные клетки, опухоли
и органы, а также образцы in vitro культур составляющих, включая (но не ограничиваясь
ими) кондиционную среду, полученную при
размножении клеток в клеточной культуральной
среде.
В соответствии с настоящим изобретением
состояние окисления и, в частности, состояние
переокисления липида в организме хозяина
оценивают, тестируя биологический образец
хозяина на присутствие и уровень содержания
либо: (I) антигенов, которые связываются с антителом, образующимся, как указано в разделе
I.A; либо (ii) антител, которые перекрестно реактивны с антителами, образующимися, как
указано в разделе I.A. Было определено, что у
каждого хозяина, даже у здоровых персон, имеются как (I), так и (ii) в тканях и жидкостях в
различных количествах. На деле, коммерчески
доступный альбумин бычьей сыворотки содержит (I) и, таким образом, дает положительную
реакцию при экспонировании антителам, образовавшимся в соответствии с разделом I.A. Поэтому, сам по себе факт существования (I) или
(ii) в организме не указывает на вызванное
окислением болезненное состояние. Вместо этого, уровень (I) или (ii) в организме хозяина следует рассматривать в свете популяции и индивидуальных норм. Таким образом, диагностика
весьма близка к диагностике для холестерина,
когда уровень холестерина в организме хозяина
сравнивают со статистическими нормами. Далее, как и в случае теста на холестерин, в некоторых случаях изменения в индивидуальных
уровнях могут предоставить более важную диагностическую информацию, нежели сами индивидуальные уровни.
Обычно, если тест на холестерин указывает, что пациент может быть подвержен риску
заболевания, предпринимают серию тестов второго уровня для получения большей диагностической информации, включая определение абсолютных уровней в сыворотке HDH, LDL и
17
триацилглицеридов. При одном и том же уровне
холестерина различные отношения каждой из
компонент определяют различные диагностические предположения и прогнозы. Рассматриваемый тест аналогичен этому в том, что, если уровень гидроперекисей липидов указывает на возможность воспалительного заболевания у пациента, включая сердечно-сосудистые заболевания, может быть необходимым провести серию
тестов второго уровня для подтверждения диагноза и для получения более подробной информации относительно заболевания. Эти тесты
второго уровня могут оценить присутствие
и/или количество других суррогатных маркеров
подразумеваемого заболевания. Суррогатные
маркеры включают (но не ограничиваются ими)
LDL, HDL, триацилглицериды, L(p)A (образующийся при взаимодействии LDL с протеином а),
VCAM (уровни растворимых, циркулирующих
IСАМ-1 оценивают в сыворотке пациентов с
системными воспалительными заболеваниями),
IСAМ, Е-селектин, MCSF, G-CSF, TNF-α, IL-1 и
МСР-1. Суррогатные маркеры других специфических заболеваний известны, и анализы для
этих маркеров коммерчески доступны или их
можно получить из медицинских лабораторий.
В другом варианте антитела, специфические для мишеневых протеинов и окисленных
суррогатных маркеров, можно использовать для
анализа специфических компонентов самих модифицированных образцов перекиси липидов
для получения большей информации относительно того, какие первичные амины участвуют
в процессе окисления. Это обеспечивает дополнительную специфичность и чувствительность
для диагностики атеросклероза и других воспалительных заболеваний и может предоставить
информацию для определения, какой (если какой-либо есть) из материалов перекисей липидов может действовать как оксикины. Используя стандартные двойные методики детектирования антител (например, иммуноосаждение и
Вестернблоттинг), можно идентифицировать и
количественно определить в тканях или жидкостях амины, модифицированные перекисью липида, включая LDL, HDL, триацилглицериды,
L(p)A, VCAM, ICAM, Е-селектин, G-CSF, MCSF,
TNF-α, IL-1 и МСР-1. Эта компонента общего
состояния перекисей липидов может представлять чувствительный и специфический маркер
для сосудистых воспалений, характерных для
атеросклероза, медиатором которых является
перекись липида. Аналогично, модифицированные липидами аро-В можно детектировать, используя как аро-В антитело, так и LOOH/амин
антитело.
Любой из тестов, в котором определяют
связывание антигена с антителом, можно использовать для оценки уровня содержания антигена или антитела в биологическом образце хозяина в соответствии со способом настоящего
002520
18
изобретения. Ряд таких тестов известен и обычно используется коммерчески.
Иммуноцитохимия и иммуногистохимия
представляют методики, в которых используют
антитела для идентификации антигенов на поверхности клеток в растворах или на срезах тканей, соответственно. Иммуноцитохимические
методики используют для количественного определения индивидуальных клеточных популяций в соответствии с поверхностными маркерами. Иммуногистохимические способы используют для локализации конкретных клеточных
популяций или антигенов. Эти способы используют также для идентификации аутоантител,
используя ткани или клетки, которые содержат
предполагаемый аутоантиген в качестве субстрата. Антитела обычно идентифицируют, используя фермент-конъюгированные антитела к
исходному антителу, с последующей обработкой хромагеном, который осаждает нерастворимый окрашенный конечный продукт на клетки
или ткани.
Другим общим способом оценки является
радиоиммуноанализ, в котором радиомеченые
реагенты используют для детектирования антигена или антитела. Антитело можно детектировать, используя пластины, сенсибилизированные антигеном. Тестируемое антитело наносят и
детектируют с помощью добавления радиомеченого лиганда, специфичного для этого антитела. Количество лиганда, связанного с пластиной, пропорционально количеству тестируемого
антитела. Этот тест можно обратить, и тогда
тестировать антиген. Вариантами радиоиммуноанализа являются конкурентный RIA, RIA
непосредственного связывания, RIA захвата,
сэндвичный RIA и иммунорадиометрический
анализ (RMA).
Твердофазные иммуносорбентные анализы
(ELISA) представляют широкую группу методик для определения антигена и антител. Эти
принципы аналогичны принципам радиоиммуноанализа, за исключением того, что фермент
конъюгирован скорее с системой детектирования, а не с радиоактивной молекулой. Типичные
ферменты, которые используют, представлены
пероксидазой, щелочной фосфатазой и 2галактоаидазой. Их можно использовать для
создания окрашенных продуктов реакции из
бесцветных субстратов. Плотность окраски
пропорциональна количеству исследуемого реагента. Эти анализы более удобны, нежели RIA,
но менее чувствительны.
Метод Вестернблоттинга (иммуноблоттинга) используют для характеризации неизвестных
антигенов. Компоненты биологического образца
разделяют с помощью гель-электрофореза. SDS
гели разделяют по молекулярным весам, a IEF
гели разделяют образцы в соответствии с зарядами. Разделенные протеины переносят на мембраны (подвергают блоттингу) и идентифицируют иммуноцитохимическими способами.
19
Реже используемые, но подходящие, методики оценки включают анализ Фарра (Farr) (в
котором радиомеченые лиганды связывают с
детектируемым специфическим антителом в
растворе, и их осаждают и количественно определяют), реакции осаждения (в которых антитела и антигены сшивают в крупные решетки с
образованием нерастворимых иммунных комплексов; этот способ работает только в тех случаях, когда антиген и антитело присутствуют в
достаточных количествах, почти в эквивалентных, и если присутствует достаточное количество эпитопов, доступных для образования решетки); нефелометрию (измеряет иммунные
комплексы, образовавшиеся в растворе по их
способности рассеивать свет); иммунодиффузию (детектирование антигенов и антител в
агарных гелях); электрофорез в противотоке
(аналогичен иммунодиффузии, за исключением
того, что для того, чтобы заставить двигаться
антитело и антиген вместе, используют электрический ток; метод подходит в случае низких
концентраций антигена и антитела); простую
радиальную иммунодиффузию (SRID) (количественно определяет антигены, позволяя им
диффундировать наружу из ячейки в гель, содержащий антитело; метод можно обратить,
заставляя диффундировать растворы неизвестных антител в антиген-содержащую ячейку);
рокет (rосkеt) электрофорез (аналогичен SRID,
за исключением того, что тестируемый антиген
заставляют двигаться в гель за счет электрического поля); и иммунофлуоресценцию (аналогична иммунохимическим методикам, за исключением того, что используют флуоресценцию, а не конъюгаты с ферментами). Антитела,
которые используют для контактирования образца биологической жидкости организма,
предпочтительно иммобилизуют на твердом
субстрате. Антитело можно иммобилизовать,
используя различные средства, как раскрыто в
Antibodies: A Laboratory Manual, цитировано
ранее. Подходящие твердые субстраты включают те, которые имеют мембрану или покрытие,
нанесенное на или прикрепленное к палочкам,
синтетическому стеклу, агарозным шарикам,
чашкам, плоским упаковкам или другим твердым подложкам. Другие твердые субстраты
включают пластины для клеточных культур,
пластины ELISA, ампулы и полимерные мембраны.
Средства для введения меток в антитела в
виде детектируемых агентов также раскрыты в
Antibodies: A Laboratory Manual. Количество
антигена в биологическом образце хозяина
можно определить любыми способами, связанными с селективным анализом. Так например,
селективный иммуноанализ можно осуществить, используя известные увеличивающиеся
количества антигена для получения стандартной
кривой или цветной карты, а затем количество
тестируемого антигена можно определить,
002520
20
сравнивая результаты теста со стандартной кривой или картой, которые коррелируют количество комплекса антиген-антитело с известными
количествами антигена. Количество антигена,
которое, как определено, присутствует в биологическом образце хозяина, можно использовать
для оценки состояния пациента различными
способами. Во-первых, уровень антигена можно
сравнить с популяционной нормой на основании статистических данных. Во-вторых, уровень антигена можно рассматривать в свете собственной предыстории пациента на антигенном
уровне.
С. Наборы
Настоящее изобретение включает также
наборы для диагностики состояния переокисления липидов в образце. Оптимально набор
включает антитело, которое реагирует с эпитопом, образованным в реакции гидроперекиси
липида с амином, присутствующим в биологическом образце. Антитела присутствуют в наборе в количестве, эффективном для связывания с
и детектирования практически всех антигенов в
образце. Предпочтительный набор содержит
достаточно антител для связывания практически
всех антигенов в образце в течение примерно 10
мин или менее. Антитело может быть иммобилизовано на твердом носителе и может быть
помечено детектируемым агентом, как указано
ранее. Оптимально набор содержит средства для
детектирования детектируемого агента. Если
антитело мечено флуорохромом или радиоактивной меткой, обычно не предоставляется
средств для детектирования агента, так как
пользователь, как ожидается, должен иметь
подходящий спектрофотометр, сцинтилляционный счетчик или микроскоп. Если детектируемым агентом является фермент, средства для
детектирования детектируемого агента могут
поставляться в наборе, и обычно они включают
субстрат для фермента в количестве, достаточном для детектирования всех комплексов антиген-антитело. Одним из предпочтительных
средств для детектирования детектируемого
агента является субстрат, который превращается
за счет фермента в окрашенный продукт. Общим примером является использование фермента пероксидазы хрена с 2,2'-азино-ди-[3этилбензолтиазолинсульфонатом] (ABTS).
Набор может необязательно содержать лизирующий агент, который подвергает лизису
клетки, присутствующие в образце биологической жидкости организма. Подходящие лизирующие агенты включают такие поверхностноактивные агенты, как Tween-80, Nonidet P40 и
Triton Х-100. Предпочтительно, чтобы лизирующий агент был иммобилизован на твердом
носителе вместе с антителом.
Набор может также содержать буферный
раствор для промывки субстрата между стадиями. Буферный раствор обычно представляет
такой физиологический раствор, как фосфатный
21
буфер, физиологический солевой раствор, цитратный буфер или Tris буфер.
Набор необязательно включает различные
концентрации предварительно полученного антигена для калибровки анализа. Набор может
дополнительно содержать визуальное или численное представление количеств антигена в калибровочном стандартном анализе для целей
сравнения. Так например, если используют анализ, в котором получают окрашенный продукт,
может быть приложен лист, на котором изображены возрастающие интенсивности, связанные
с различными количествами антигена.
В другом варианте, набор может включать
антиген, полученный в результате реакции гидроперекиси липида с амином для оценки уровня
антител в биологическом образце.
Набор может необязательно включать два
антитела в системе детектирования. Первое антитело, которое присутствует в небольших количествах, специфично для анализируемого антигена. Второе антитело, представленное в
большем количестве, используют для детектирования первого антитела. Так например, кроличье антитело можно использовать для детектирования LOOH/амин антигена, а затем антикроличий IgG антитело можно использовать для
детектирования связанного кроличьего антитела. Обычно также используют козьи антитела и
анти-антитела.
В качестве одного нелимитирующего примера предложен набор для определения состояния переокисления липидов у пациента, который включает кроличье антитело, специфичное
для LOOH/амин антигена, антикроличий IgG
антитело в достаточном количестве для детектирования первого связанного антитела, фермент, конъюгированный со вторым антителом, и
субстрат для фермента, который изменяет цвет
при экспонировании ферменту.
D. Использование диагностических наборов
Диагностический метод и наборы, описанные здесь, можно использовать для оценки широкого крута медицинских состояний, медиаторами которых являются акты, вызванные окислением, и, в частности, гидроперекисями липидов. Так например, присутствие повышенных
концентраций гидроперекисей липидов или
продуктов реакций гидроперекисей липидов с
первичными аминами, можно использовать в
качестве начального диагностического маркера
для сердечно-сосудистых заболеваний, включая
атеросклерозы, воспалительные заболевания,
эндометриоз, гломерулонефриты, преэклампсию, нарушения центральной нервной системы, медиаторами которых является переокисление липидов, болезнь Альцгеймера, псориазы,
астму, атонические дерматиты, твердые опухоли, саркому Капоши, нейродегенеративные заболевания, воспаления кишечника (болезнь
Крона (Crohn's), ревматоидные артриты и ишемическую реперфузию. Биологический образец
002520
22
можно выбрать с учетом подлежащего лечению
заболевания. Так например, образец ткани из
пораженного участка может быть оптимальным,
если заболевание тканеспецифично. Если рассматриваемый способ и набор показывают повышенный или ненормальный уровень переокисления липидов в организме хозяина, дополнительные тесты можно использовать для подтверждения специфического нарушения.
Е. Примеры оценки окислительного состояния организма хозяина
Альбумин кроличьей сыворотки (RSA),
липооксигеназа сои, линолевая кислота, козлиный антикроличий IgG, конъюгированный со
щелочной фосфатазой, октилглюкозид, тетраметоксипропан и р-нитрофенилфосфат были получены от Sigma Chemical Company (St. Louis Missouri). Ноненол был закуплен у Aldrich Chemical
Company (Milwaukee, WI). Обезжиренный молочный порошок был закуплен у Bio-Rad
Chemical Company (Hercules, CA), Tween-20 и
96-ячеечные микротитровальные пластины были закуплены у Fisher Chemical Company (Pittsburg, PA). Пептидная последовательность из 20
аминокислот,
YVTKSYNETKIKFDKYKAEKSHEDEL (где К представляет лизин) (последовательность ID № 1) была получена.
Пример 1. Препарат протеина, модифицированного перекисью липида.
Линолевую кислоту превращают в 13гидропероксилинолеат в результате обработки
липооксигеназой сои (SLO) по способу Fruebis,
Parthasarathy и Steinberg, см. ранее. Гидроперекись линолевой кислоты сразу же подвергают
взаимодействию с не содержащей иммуноглобулина RSA и инкубируют при 37°С в течение 2
дней. В типичной реакции 100 нмолей линолевой кислоты обрабатывают 30 ед. SLO в 1 мл
буферированного фосфатом физиологического
раствора (PBS) и после реакции измеряют усиление поглощения на 234 нм. Обычно реакция
завершается за 30 мин. Гидроперекись липида
(13-HPODE) обрабатывают затем 100 мкг липида, IgG и другим альбумином, не содержащим
протеина, в присутствии 50 мкМ ЕДТА в течение 2 дней при 37°С. Образование флуоресцирующих продуктов устанавливают, измеряя
флуоресценцию при возбуждении на длине волны 330 нм, и измерении эмиссии на 430 нм.
Этот продукт экстрагируют хлороформом и метанолом по способу Bligh и Dyer (Bligh et al., L.
Can. J. Biochem. Biophys., 37:911-917 (1959)) для
удаления непрореагировавшей LOOH, а затем
несколько раз промывают охлажденным льдом
ацетоном. Конечный продукт, LOOH, модифицированная RSA (LOOH/RSA) растворим в водном растворе и его характеристики флуоресценции аналогичны характеристикам окисленных
липопротеинов низкой плотности (Ox-LDL).
Образование LOOH, также как модификацию
протеина, осуществляют в отсутствии каких-
23
либо добавок металлов для ограничения образования альдегидов.
Пример 2. Получение окисленных LDL.
LDL выделяют из гепаринизированной
плазмы нормальных людей-доноров, используя
настольную ультрацентрифугу Весkmаn TL-100
и TLA-100,4 ротор (Santanam et al., J. Clin.
Invest., 95:2594-2600, 1995). Односпиновый градиент используют для очистки LDL от альбуминовых примесей. Выделение завершают за
три часа после получения плазмы. Выделенный
LDL диализуют против буферированного фосфатом физиологического раствора (PBS) при
4°С (200 х объемы) в течение 6 ч. Чистоту выделенного LDL подтверждают наличием одной
полосы при проведении электрофореза в агарозном геле и по интактному аполипопротеину
В при проведении электрофореза в натрийдодецилсульфатном полиакриламидном геле. Выделенный LDL (100 мкг/мл) инкубируют в буферированном фосфатом физиологическом растворе с 5 мкМ меди и инкубируют в 50 мм пластине при 37°С. Спустя 24 ч инкубирования
раствор переносят в стеклянную ампулу и удаляют липиды экстракцией по способу Bligh и
Dyer. Делипидированный LDL протеин растворяют в октилглюкозиде (100 мкл, 10 мкг/мл добавляют к протеину, вместе с 5 мкл 1н. NaOH),
как указано Parthasarathy (Parthasarathy et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 537-540; 1987).
Пример 3. Получение модифицированных
альдегидом протеинов.
Приготавливают не содержащий глобулина RSA, содержащий 1 мг протеина (или другие
протеины) в 100 мкл PBS, а затем полный объем
увеличивают до 1 мл за счет PBS. К протеину
добавляют ноненол или гексанол (100 мкл 25
мкМ в этаноле), хорошо перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 24 ч. 4 мл охлажденного льдом ацетона добавляют к раствору, и
ампулу хранят в морозильнике в течение одного
часа. После центрифугирования при 1500
об/мин в течение 10 мин при 4°С надосадочную
жидкость удаляют. Эту стадию повторяют еще
трижды, а затем осадок сушат в вакууме. 1 мл
PBS добавляют в ампулу и после перемешивания полученный раствор используют в твердофазном иммуносорбентном анализе (ELISA).
Модифицированные малондиальдегидом
протеины приготавливают следующим образом.
Один образец в 100 мкл тетраметоксипропана
приготавливают, а затем в ампулу добавляют
0,5 мл 6н. НСl. Ампулу нагревают при 60°С в
течение 30 мин. рН устанавливают 6.4, используя 4н. NaOH, и полный объем доводят до 2,7
мл, используя PBS. Затем 25 мкл приготовленного раствора добавляют к 2 мг свободного от
глобулина альбумина сыворотки кролика или
других протеинов и инкубируют при 37°С. Через 3 ч инкубирования полученный раствор
диализуют против PBS и используют в ELISA.
002520
24
Пример 4. Получение антитела.
От Myrtle Rabbitry (Thompson Station, TN)
получают трех кроликов-самцов. Для первичной
иммунизации 1,5 мг/мл альбумина кроличьей
сыворотки модифицированного перекисью липида, растворяют в PBS, смешивают с неполным адъювантом Фреунда (Freund), a затем вводят подкожно. Бустерную иммунизацию продолжают антигеном в PBS и смешивают с неполным адъювантом Фреунда, с четырехнедельными интервалами. Кровь у кроликов отбирают на 10-14 дни после иммунизации, и кровь
оставляют выстаиваться в течение 4 ч при комнатной температуре и при 4°С в течение ночи.
После удаления сгустков и частиц с помощью
центрифугирования в течение 20 мин при 3000
об/мин, сыворотку анализируют с помощью
ELISA и хранят при -20°С. После этого проверяют ежемесячно титры и в конце кровь спускают через 6 месяцев после начальной иммунизации. Титр LOOH/RSA антитела у животного
возрастает со временем и выходит на плато
примерно через 4 месяца.
Пример 5. Анализ ELISA для протеинов,
модифицированных LOOH.
Используя ELISA, провели исследование
того факта, действительно ли LOOH/RSA антитело распознает LOOH/модифицированный
протеин и немодифицированный протеин. В
качестве контроля используют немодифицированный RSA, не содержащий IgG.
Ячейки пластин ELISA покрывают 50 мкл
на ячейку различных разбавлений RSA модифицированного перекисью липидов и инкубируют
при 37°С в течение 3 ч. Пластины трижды промывают 0,05% Tween 20 в PBS и блокируют на
3 ч 300 мкл 1% обезжиренного молочного порошка вместе с 0,05% Tween 20 в PBS. После
блокирования пластины трижды промывают
0,05% Tween 20 в PBS и анти-LOOH/RSA сыворотку разбавляют в отношении 1:250. 50 мкл
добавляют в каждую ячейку и инкубируют при
37°С в течение 3 ч или в течение ночи. После
троекратной промывки 0,05% Tween 20 в PBS
антикроличий IgG, конъюгированный со щелочной фосфатазой, разбавляют в отношении
1:38000 и по 50 мкл добавляют в каждую ячейку
и инкубируют при 37°С в течение 2 ч. После
шестикратной промывки 0,05% Tween 20 в PBS
в каждую ячейку добавляют 50 мкл рнитрофенилфосфата и инкубируют при 37°С.
Пластины проверяют с 15-ти минутными интервалами в течение 2 ч. Строят кривую зависимости значений ОП (оптической плотности) от
концентрации LOOH/RSA.
Антигены (LOOH/RSA, RSA, Ox-LDL и
другие модифицированные протеины) высевают
на 96-ячеечные пластины на ночь при комнатной температуре. Ячейки блокируют 3% BSA в
PBS на 2 ч и промывают трижды PBS. АнтиLOOH/RSA антитело разбавляют в отношении
1:250 PBS, содержащим 3% BSA, и добавляют в
25
каждую ячейку. После 2 ч инкубирования при
37°С ячейки промывают PBS трижды. Козий
антикроличий IgG, конъюгированный со щелочной фосфатазой, разбавляют в отношении
1:38000 и добавляют. После 2 ч инкубирования
при 37°С ячейки снова промывают и добавляют
р-нитрофенолфосфат. Проявленную окраску
определяют с помощью считывающего с пластин устройства (Anthos II).
Фиг. 1 представляет график (в виде прямоугольников) распознавания альбумина кроличьей сыворотки и альбумина кроличьей сыворотки, модифицированного гидроперекисью липида, где по оси абсцисс отложены нанограммы
протеина, а по оси ординат - оптическая плотность на 405 нм. Как видно, антитело при разбавлении в отношении 1:250 селективно распознает модифицированный протеин зависимым
от концентрации образом. Даже столь малое
количество, как 10 нг RSA (менее чем 2 нм модифицированной RSA) распознается с гораздо
более высокими уровнями, нежели эти уровни
для контрольного протеина. Немодифицированный контрольный протеин едва распознается
антителом даже при высоких концентрациях.
Контрольные образцы без первичных или вторичных антител не распознаются антителом.
Другие модифицированные протеины (альбумин бычьей и человеческой сыворотки, модифицированные LOOH, каталаза и цитохром С)
также распознаются антителом. Компонента
LDL-апопротеин В100 (аро В) претерпевает существенную модификацию в процессе окисления LDL. Ряд исследований продемонстрировал,
что эта модификация включает новые антигенные эпитопы, образующиеся за счет ковалентной модификации лизинового остатка альдегидами.
Для определения того, содержит ли OxLDL также и лизины, модифицированные интактной LOOH, исследуют, распознает ли антитело к LOOH/RSA LDL или Ox-LDL. Фиг. 2
представляет график (в виде прямоугольников),
который иллюстрирует распознавание Ox-LDL
антителом примера 4, что выражено в концентрации в микрограммах от единиц оптической
плотности. Как видно из фиг. 2, Ox-LDL распознается антителом концентрационно-зависимым
образом. Антитело способно распознавать даже
столь малые количества, как 0,25 мкг Ox-LDL
протеина (менее 0,5 нМ аро В). Нативный LDL,
полученный в присутствии бутилированного
гидрокситолуола (ВНТ), не распознается даже
при 2,5 мкг концентрациях. В отдельных экспериментах определено, что липидная компонента
Ox-LDL также распознается антителом, что дает
возможность предположить, что аминофосфолипиды Ox-LDL, такие как фосфатидилэтаноламин, могут быть модифицированы аналогичным образом.
002520
26
Пример 6. Иммуногистохимия.
Способность антитела распознавать модифицированные протеины тестируют в двух условиях. В первом исследовании используют
клетки RAW, предварительно инкубированные
с LOOH. Во втором исследовании атеросклеротические артерии обезьян, которых кормили
холестерином, иммуноокрашивают антителом.
RAW макрофаги инкубируют со 100 мкМ
13-HPODE в течение 1, 2, или 3 дней следующим образом. Конфлюэнтные клетки в 6ячеечных пластинах обрабатывают 13-НРОДЕ в
течение 1, 2 или 3 дней в DMEM, не содержащей сыворотки (Дюльбекко модифицированная
минимальная необходимая среда Игла). На второй и третий день добавляют свежую 13HPODE в соответствующие чашки с клетками.
В конце первого, второго и третьего дней клетки фиксируют раствором Bouins в течение 10
мин и осуществляют иммуноцитохимическую
обработку,
используя
антитела
против
LOOH/RSA. После фиксации клетки трижды
промывают PBS. Анти-LOOH/RSA антитело
разбавляют в отношении 1:250 PBS, содержащим 3% BSA, и добавляют в каждую ячейку.
Для негативного контроля первичное антитело
не добавляют. После 2 ч инкубирования при
комнатной температуре ячейки промывают
трижды PBS и добавляют козий антикроличий
IgG, конъюгированный со щелочной фосфатазой, разбавленный до 1:100. После 2 ч инкубирования при комнатной температуре ячейки
снова промывают и инкубируют с быстрым
красным. После проявления цвета реакцию останавливают и клетки фотографируют, используя микроскоп Nikon с присоединенной камерой.
Замороженные сегменты абдоминальной
аорты от группы самцов обезьян циномолгус
оценивают иммуногистохимически. Животных
предварительно кормили пищей с умеренно высоким содержанием жира в течение более пяти
лет, причем рацион состоял из обычного корма
для обезьян, дополненного 8,2% сушеного яичного желтка и 10% лярда. В итоге рацион состоял из 37,5% насыщенных жиров, 44,9% мононенасыщенных жиров, 17,5% полиненасыщенных
жиров с 0,25% холестерина. Средний уровень
сыворотки у этих животных составлял 306
мг/dL. Эти уровни холестерина достаточны для
образования у обезьян ряда атеросклеротических поражений. Человеческие аорты с различными степенями развития атеросклероза были
получены от доноров органов в момент отбора
тканей и были собраны с разрешения Emory
University Human Subjects Commitee. Аорты людей и обезьян циномологус были фиксированы в
параформальдегиде и заморожены в О.С.Т. до
нарезания на кусочки до 5 мкм на криостате.
Срезы тканей затем иммуноокрашивали, используя антитело при разбавлении 1:500, а затем
биотинилированный козий анти-кроличий IgG
27
(Fisher Scientific) использовали при разбавлении
1:200 и визуализировали системой Vector АВСАР, используя Vector Red в качестве хромагена
(Vector Laboratories). Иммуногистохимические
исследования показывают, что клетки, инкубированные с LOOH были иммуноокрашены антителом и антигенные эпитопы присутствуют
внутри клеток. Контрольные клетки и контроли
без первичных антител не продемонстрировали
иммунореактивности.
Эти артерии продемонстрировали интенсивную иммунореактивность. Иммунореактивность была локализована на участках с высоким
содержанием пенных клеточных макрофагов, о
чем свидетельствует обратное окрашивание для
макрофагов.
Пример 7. Вестренблоттинг.
Анализ Вестернблоттинг осуществляют
после разделения протеинов в 7,5% сшитых акриламидных гелях, используя 2,5 мкг протеина.
Трансблоттированные образцы детектируют,
используя 1:250 разбавленную анти-LOOH/RSA
в качестве первичного антитела и конъюгированный с пероксидазой козий антикроличий IgG
в качестве вторичного антитела. Перекрестнореактивные полосы визуализируют хемилюминесцентным детектором.
Используя анализ Вестернблоттинга LDL и
Ox-LDL удалось подтвердить, что антитело
примера 4 способно распознавать Ox-LDL, но
не нативный LDL. Вестренблоттинг плазмы
здорового человека показывает, что, по крайней
мере, три различные протеина распознаются
антителом. Образцы плазмы приготавливают в
присутствии ВНТ, и не похоже, что эти эпитопы
образовались in vitro. Тип этих протеинов неизвестен, хотя, учитывая их мобильность на геле,
можно предположить, что эти протеины могут
представлять альбумин и аро В продукты.
Пример 8. Перекрестная реактивность антитела примера 7 и альдегидом-модифицированных протеинов.
Целый ряд антител был описан для альдегид-модифицированных протеинов. Так как инкубирование LOOH с протеином занимает много времени, имеется вероятность того, что альдегиды вносят свой вклад в образование антигенных эпитопов. Для того, чтобы установить,
действительно ли антитело к LOOH/RSA распознает протеины, модифицированные альдегидами, приготовили пептид, состоящий из двадцати
аминокислот,
с
последовательностью
YVTKSYNETKIKFDKYKAEKSHEDEL, где К
представляет лизин) (последовательность 1D №
1). Этот пептид используют, так как протеины
плазмы, такие как альбумин из коммерческих
источников, уже могут обладать аналогичными
эпитопами, либо в результате in vivo образования, либо в результате образования в процессе
in vitro процедур очистки. Данные ELISA для
МДА,
гексанала,
ноненала
и
LOOHмодифицированного синтетического пептида
002520
28
представлены в табл. 1. Антитело не распознает
синтетический пептид или его альдегидмодифицированные производные в какой-либо
значительной степени. Напротив, LOOHмодифицированный синтетический пептид эффективно распознается антителом.
Таблица 1. Распознавание анти-LOOH/RSA антителом
LOOH-модифицированного пептида и нераспознавание
альдегид-модифицированных пептидов
мкг Нативный LOOH- MDA- Ноненал- Гексаналпептида пептид пептид пептид пептид
пептид
0
57
51
53
51
55
0,25
46
190
50
56
64
1,25
38
327
57
60
84
2,5
42
358
62
46
103
Микротитровальные ячейки покрывают
возрастающими концентрациями немодифицированного или модифицированного пептида.
После блокирования ячеек обезжиренным порошком молока в каждую ячейку добавляют 100
мкл 1:250 разбавления анти-LOOH/RSA антитела. После промывки в каждую ячейку добавляют антикроличий IgG, конъюгированный со
щелочной фосфатазой. После добавления субстрата, р-нитрофенилфосфата, на длине волны
405 нм измеряют оптическую плотность, используя считывающее с микропластин устройство. Величины представляют среднее из трех
измерений оптической плотности ячеек из одного, по крайней мере, 2, отдельных опытов.
Вестернблоттинг альдегид- и LOOHмодифицированных пептидов подтверждает,
что ни один из альдегид-модифицированных
синтетических протеинов не распознается до
какой-либо значительной степени, тогда как
LOOH-модифицированный пептид распознается
антителом.
II. Биологическая активность оксикинов
А. Определение оксикинов
Было обнаружено, что некоторые продукты реакции гидроперекисей липидов и первичных аминов демонстрируют независимую биологическую активность как медиаторы клеточных реакций. Термин "оксикин" используют
здесь для обозначения флуоресцентного протеина или липида, который образуется в реакции гидроперекиси липида и первичного амина
и который может вызывать реакцию мишеневой
клетки. Оксикины могут образовываться внеклеточно или могут образоваться на клеточной
мембране для опосредствования клеточной реакции. Оксикины могут также образовываться
внутриклеточно.
Широкий круг биологически активных молекул, которые содержат первичные амины,
можно превратить в оксикины, которые также
будут обладать биологической активностью.
Одним из примеров оксикинов является стабильный флуоресцентный продукт реакции линолевой гидроперекиси (13-HPODE) и соответствующей аминокислотной группы, например
29
лизина, в альбумине или полилизине, или такого
низкомолекулярного соединения, как фосфатидилэтаноламин. Некоторые оксикины действуют как потенциальные воспалительные сигналы,
которые вызывают экспрессию эндотелиального
VCAM-1 гена за счет механизма, который можно подавить селективными антиоксидантами.
Другие клеточные реакции, которые могут вызывать оксикины, представляют образование
или активацию МСР-1, IL-1, TNF-α, I CAM,
MCSF и Е-селектина.
Оксикины можно использовать как медиаторы клеточных воспалительных реакций,
включая реакции сердечно-сосудистой системы,
так как окисление липидов связано с воспалительными и сердечно-сосудистыми заболеваниями. Специфические болезненные состояния,
которые являются по своей природе воспалительными или сердечно-сосудистыми, включают атеросклерозы, эндометриоз, гломерулонефрит, преэклампсию, нарушения центральной
нервной системы, медиатором которых является
переокисление липидов, болезнь Альцгеймера,
аутоиммунные нарушения, псориаз, астму, атопический дерматит, рак кожи, нейродегенеративные заболевания, воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона), ревматоидные
артриты, ишемическую реперфузию, остеоартриты, астму, дерматиты, рассеянный склероз,
рестеноз после ангиопластики, болезнь коронарных артерий и стенокардию.
Хотя все первичные амины будут реагировать с гидроперекисями липидов с образованием антигенных соединений, которые можно использовать для выработки антител, для определения окислительного состояния организма хозяина, не все пептиды или биологически существующие первичные амины будут образовывать оксикины. Это объясняется тем, что для
того, чтобы вызвать реакцию антитела, необходим только один эпитоп, однако для передачи
клеточной реакции целый ряд положений прореагировавших сайтов является критическим
для комплементарного связывания с рецептором.
Нелимитирующие примеры эпитопов оксикинов раскрыты в Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Volume 89, pp.10588-10592, November 1992
Medical Science; включено сюда для ссылки. В
частности, эпитопы могут включать
Антитела настоящего изобретения можно
использовать для блокирования повреждающей
активности антигена, особенно за счет физического прерывания его способности служить медиатором клеточных реакций.
002520
30
В. In vitro синтез и характеризация оксикина.
Липидную модификацию липооксигеназы
сои (SLO) осуществляют за счет инкубирования
гидроперекиси липида с липооксигеназой, используя модифицированный метод Freubis, Parthasarathy and Steinberg (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89, 10588-10592). Для такого синтеза важно поддерживать высокое отношение липида к
протеину. В реакциях в малом объеме (1 мл) 250
мкМ линолевой кислоты инкубируют непосредственно с SLO (50 ед., 80 нг) при комнатной
температуре в течение трех дней; важно перемешивание образца для подачи воздуха в реакцию. Все реакции ведут в 10 мМ Tris, рН 8.0, 15
мМ хлорида натрия. Неочищенную реакционную смесь используют для выработки кроличьих поликлональных антител и мышиных моноклональных антител против окислительно модифицированного соевой липооксигеназой оксикина (oxSLO).
Увеличивая масштабы реакции, становится
невозможным поддерживать высокое отношение липида к протеину, так как возникают проблемы несмешиваемости. Разработан способ
синтеза 13-HpODE модифицированного оксикина липооксигеназы или модификации "мишеневого" протеина (см. фиг. 4). Мишеневый протеин, 1-3 мг в объеме вплоть до 1,5 мл, выделяют в мембране с отсечением по молекулярному
весу 10 кДа. Это предусматривает непрерывный
обмен 250 мл системы для образования перекиси липида с удержанием целевого протеина.
Каталитические количества липооксигеназы
сои, 1,260 Ед, и 800 мкМ линолевой кислоты
используют в системе создания перекиси для
катализа
образования
13-гидроперокси-[S(Е,Z)]-9,11-октадекадиеновой кислоты. Генерирующую
систему
заменяют
свежей
SLO/линолевой кислотой каждые 8-16 ч в течение, по крайней мере, 170 ч. Реакцию ведут в 10
мМ Tris, pH 8.0, 15 мМ хлорида натрия при постоянном перемешивании. Одним из преимуществ крупномасштабного метода является то,
что любой протеин, крупнее 10 кДа, или смесь
протеинов можно использовать в качестве мишеневого протеина.
Критерии для образования 13-HpODE окисленных оксикинов включают индуцирование
ICAM-1 в анализе на базе эндотелиальных клеток
(будет обсуждаться далее более подробно) и иммунореактивность с антителами оксикина. Минимальные требования для образования оксикина
оценивают, используя реакцию в малом масштабе.
Как показал Вестернблоттинг, используя поликлональное антитело, SLO и линолевая кислота являются минимальными требованиями для трехдневной реакции (см. фиг. 5). Встряхивание реактора
повышает выход. Если SLO инкубировать только с
одним буфером, перекрестной реактивности не
наблюдается. За временным ходом образования
оксикина в крупномасштабной реакции следует
31
исследование иммунореактивности и биологической активности (индуцирование IСAМ-1; см.
фиг. 6 и 7). Активность иммунореактивности
наблюдают до биологической активности. Начальный продукт, анализированный с помощью
Вестернблоттинга, представляет высокомолекулярный продукт, полоса которого выходит примерно у 80 кДа. Продукты реакции, наблюдаемые в более поздние моменты времени, образуют лестницу с преимущественным соединением
примерно на 25 кДа. Временной ход реакции,
как по данным иммунореактивности, так и по
биологическим активностям, зависит от концентрации липида; увеличение концентрации линолевой кислоты приводит к повышению скорости
реакции.
Продукты реакции оксикина исследуют с
помощью высокоэффективной жидкостной
хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC)
и гель-фильтрации. ВЭЖХ анализ с использованием С18 колонки показал, что продукты реакции более гидрофобны, нежели исходный материал, что согласуется с добавлением липида к
липооксигеназе (см. фиг. 8). Препаративную
гель-фильтрацию используют для частичной
очистки оксикина (см. фиг. 9 и 10). Биологическая активность была обнаружена во фракциях 9
и 10, хотя основная часть протеина была обнаружена в других фракциях.
Стабильность оксикина оценивают на основании иммунореактивности и биологической
активности. Оксикин оказывается стабильным в
ряде кислотных и щелочных условий и в присутствии восстанавливающих агентов, что показывает
Вестернблоттинг.
После
преинкубирования с 3,5М MgCl2, 10 мМ фосфата
натрия рН 7.2; 5,0М LiCl, 10 мМ фосфата натрия, рН 7.2; 100 мМ триэтиламина, рН 11.5; и
100 мм глицина, рН 2.5, иммунореактивность с
поликлональными и моноклональными антителами сохраняется. Напротив, инкубирование с
3,5М MgCl2, 10 мМ фосфата натрия, рН 7.2 вызывает потерю биологической активности; при
этом остальные условия хранения влияния не
оказывают. Связана ли потеря активности с изменением конформации протеина, состоянием
окисления или другими причинами, остается
определить. Биологическая активность сохраняется после термоденатурации и термоденатеруции в присутствии дитиотреитола. Добавление
ЕДТА, Trolox и пробукола также не оказывает
влияния на индуцирование ICAM-1. После кислотного гидролиза протеина биологическая
активность утрачивается.
Пример 9. Характеризация биологической
активности oxSLO: oxSLO индуцированная
ICAM экспрессия в эндотелиальных клетках
аорты человека (НАЕС).
В маломасштабной синтетической реакции
SLO превращают 250 мкМ линолевой кислоты
(LA) в 13-HpODE в течение первого часа при
инкубировании при комнатной температуре. Во
002520
32
время последующих 3 дней инкубирования 13HpODE предположительно окислительно модифицирует фермент и образующиеся эпитопы на
ферменте, которые могут вызвать такую биологическую активность, как экспрессию клеточных поверхностных ICAM на НАЕС, как показано в ELISA анализе и представлено на фиг. 11.
НАЕС, выращенные на микротитровальных
пластинах, экспонируют для обработки в течение 16 ч перед ELISA анализом. SLO или LA
отдельно после трех дней инкубирования не
становятся активными, что позволяет предположить, что окислительная модификация SLO
существенна для создания биологически активного эпитопа. В крупномасштабном синтезе
только в присутствии 13-НрОДЕ образующая
система активизирует SLO, как представлено на
фиг. 12. SLO негативный контроль представляет
SLO фермент, инкубированный с одним только
буфером в течение длительного промежутка
времени. Было подтверждено, что oxSLO, синтезированные любым способом, функционально
и иммунологически идентичны. Более того, было определено, что возникновение биологической
активности
является
протеинспецифическим. Реакция альбумина кроличьей
сыворотки с использованием крупномасштабных или маломасштабных реакций оксикинов
приводит к образованию иммунореактивных, но
не биологически активных продуктов.
Экспрессия oxSLO активированных ICAM
клеточной поверхности зависит от дозы, как
видно из фиг. 13. 40 нг/мл oxSLO оказывается
достаточно для значительного сигнала в стандартном ELISA анализе. И снова, эквивалентное
количество немодифицированного SLO не может активировать НАЕС. Аналогичный результат наблюдается при Норзернблоттинге, как
видно на фиг. 15.
Пример 10. oxSLO индуцированная экспрессия в НАЕС, VCAM, Е-селектина и МСР-1.
oxSLO не только индуцирует ICAM, но
также две другие адгезионные молекулы
(VCAM на фиг. 15, Е-селектин на фиг. 16) и одну молекулу хемокина (МСР-1 на фиг. 15 и 16).
Фиг. 14 представляет индуцирование экспрессии на НАЕС VCAM клеточной поверхности,
хотя и до меньшей степени, нежели ICAM индуцирование. Данные ELISA подтверждаются
данными Норзернблоттинга, как представлено
на фиг. 15. Количество VCAM мРНК, накопившееся после 4 ч oxSLO обработки, было меньше, чем ICAM мРНК. Далее, уровни МСР-1 и Еселектина мРНК были столь же высоки, как при
TNF индуцировании, что позволяет предположить, что может быть МСР-1 и Е-селектин
представляют ключевые компоненты oxSLO
опосредствованного сигнального каскада. Индуцирование этих провоспалительных генов
происходит очень быстро, что видно на фиг. 16.
За 2-6 ч стимуляции уровень мРНК указанных
33
генов для всех достигает равновесного состояния.
Пример 11. oxSLO IL-1β экспрессия в макрофаге.
Помимо того, что oxSLO оказывает огромное влияние на эндотелиальные клетки, как
представлено в табл. 2, oxSLO вызывает накопление другого цитокина IL-1β мРНК в клеточной линии макрофага (RAW), как видно на фиг.
14. RAW клетки обрабатывают oxSLO в течение
4 ч, и полную РНК собирают и анализируют. В
развитии атеросклероза, как эндотелиальные
клетки, так и макрофаги, как было показано,
являются чрезвычайно важными. Полученные
авторами результаты in vitro существенно подкрепляют представление о том, что уникальный
класс модифицированных гидроперекисью липида протеинов, липидов или липофильных молекул, которые определяют как оксикины, может служить медиатором провоспалительного
сигнала в участках атеросклеротических поражений.
Таблица 2. oxSLO индуцированное накопление VCAM-1,
ICAM-1 и МСР-1 мРНК в НАЕС
VCAM-1
ICAM-1
МСР-1
Обработка
(произв. ед.) (произв. ед.) (произв. ед.)
TNF (100 ед/мл)
82.06
71.92
101.65
SLO (0.8 мкг/мл)
3.36
3.14
12.34
SLO (0.08 мкг/мл)
0.12
-0.09
3.1
SLO (0.008 мкг/мл)
-0.14
-0.51
1.12
модифиц. SLO (1 мкг/мл)
24.17
19.74
116.62
модифиц. SLO (0.2 мкг/мл)
11.51
9.41
96.28
модифиц. SLO (0.04 мкг/мл)
9.38
2.06
37.35
Пример 12. Биологическая активность
продукта окислительной модификации альбумина кроличьей сыворотки линолевой гидроперекисью.
Проводилось исследование того, может ли
окислительная модификация альбумина кроличьей сыворотки RSA линолевой гидроперекисью изменить структурные или биологические
свойства элемента (пептида или непептида) в
этом материале, придавая ему биологическую
функцию сигнала воспаления эндотелиальной
клетки сосуда. Используя окислительно модифицированные RSA (oxRSA), полученные по
способу примера 1, культивируемые эндотелиальные клетки аорты человека экспонируют в
течение 12 ч набору oxRSA концентраций от 1
до 100 нМ (наномолярных), и анализируя экспрессию клеточной поверхности индуцируемых
адгезионных молекул VCAM-1, ICAM-1 или
конституитивно экспрессированных адгезионных молекул ICAM-2 с помощью ELISA. Как
представлено на фиг. 3, выраженные как процент от максимального TNF-α индуцируемого
сигнала, ox-RSA демонстрирует зависимое от
дозы индуцирование VCAM-1 до 40%, а ICAM1 до 80% от максимального TNF-α сигнала.
Примерное значение EC50 для oxRSA составляет
10-15 нМ как для VCAM-1, так и для ICAM-1.
Настоящее изобретение не связано с таким при-
002520
34
месным липополисахаридом, как полимиксин В
(10 мкг/мл), полностью ингибирующим LPS
индукцию, но не оказывающим влияния на
oxRSA активацию. Более того, limulus анализ
для LPS в oxRSA препаратах был ниже пределов детектирования. Конституитивно экспрессированные ICAM-2 были не затронуты. Этот
результат предполагает, что oxRSA функционирует зависящим от дозы образом как потенциальный воспалительный фактор для эндотелиальных клеток в низком наномолярном интервале значений.
Пример 13. Влияние продукта окислительной модификации альбумина кроличьей сыворотки за счет линолевой гидроперекиси на накопление мРНК.
Следующей задачей исследователей было
определить, связано ли индуцирование экспрессии VCAM-1 и ICAM-2 поверхностей клеток за
счет oxRSA, по крайней мере частично, с изменениями в накоплении мРНК. Анализ на Норзерн-фильтрах осуществляют для РНК, выделенных из НАЕС, экспонированных в течение 4
ч либо TNF-α (100 ед/мл) либо oxRSA (25 нМ).
Аналогично тому, что наблюдается на протеиновом уровне, VCAM-мРНК уровни индуцируются ox-RSA до уровней примерно 30-40% от
тех, которые наблюдаются для TNF-α. ICAM-1
мРНК также индуцируется за счет ox-RSA.
Пример 14. Влияние продукта окислительной модификации альбумина кроличьей сыворотки за счет линолевой гидроперекиси на
транскрипционную активацию VCAM-12 промотора через NF-кВ подобный ДНК связывающий комплекс.
Для определения того, действительно ли
ox-RSA модулирует ядерные регуляторные акты, связанные с окислительно-восстановительно
чувствительной VCAM-1 генной экспрессией,
культивируемые эндотелиальные клетки аорты
человека экспонируют (или не экспонируют
(CTL)) в течение 2 ч TNF-α (100 ед/мл) или 25
нМ оксикина RSA-LOOH (ox-RSA); приготавливают ядерные экстракты и осуществляют анализ сдвига гель-подвижности, используя 32Рмеченый kLOkR, тандем NFкВ-подобных связывающих сайтов VCAM-1 промотора человека.
Соответствующий холодный компетитор и контроли суперсдвига, используя анти-р50 и антир65 антисыворотку (R & D Systems), осуществляют для установления связывающей специфичности ДНК последовательности полосы NFкВ комплекса. Как TNF, так и oxRSA индуцируют NF-кВ подобную ДНК связывающую активность. Это предполагает, что оксикины могут играть роль в NF-кВ опосредствованных
транскрипционных активационных схемах в
сосудистой системе.
Пример 15. Титры антител образцов плазмы от пациентов, страдающих эндометриозом, и
здоровых персон.
35
Окисление, происходящее в брюшной полости пациентов с эндометриозом, может привести в присутствии аутоантител к образованию
модифицированных протеинов, и такие антитела могут быть в повышенном количестве у пациентов, страдающих эндометриозом. Для определения того, присутствуют ли такие антитела
у пациентов с диагнозом эндометриоз, образцы
плазмы, полученные от таких пациентов, оценивают по присутствию антител, которые реагируют с тремя антигенами: продуктом реакции
гидроперекиси липида с альбумином кроличьей
сыворотки, продуктом реакции гидроперекиси
липида с LDL и его с MDA.
ELISA анализ: 10 мкг ox-LDL, MDA-LDL
или перекисью липида модифицированный альбумин (LOOH-RSA) позитивные антигены)) и
LDL, альбумин человека и ацетил-LDL (негативный контроль) помещают в 100 мкл объеме в
96-ячеечные микротитровальные пластины. После инкубирования в течение ночи при 4°С пластины блокируют за счет инкубирования с 3%
молочным порошком в течение 2 ч. После промывок связанный IfF человека детектируют,
используя античеловеческий IgG антитело,
конъюгированное с пероксидазой или щелочной
фосфатазой.
Связанный
фермент-конъюгированный IgG количественно определяют по
окрашиванию, используя специфические субстраты.
Полученные результаты представлены в
табл. 3-5. Как видно, существует статистическое
повышение уровней реактивных антител у пациентов с эндометриозом по сравнению с контрольными.
Таблица 3. Антиген: LOOH/RSA (200 мкл плазмы, образцы).
Результаты выражены как ОП эквиваленты образовавшегося
р-нитрофенола
т-Тест: Два-образца, учитывая неравные дисперсии
Эндометриоз
Контроль
Среднее
0.493885
0.196313
Дисперсия
0.117233
0.023264
Наблюдения
63
32
3.74Е-08
Р(Т≤т) один хвост
7.47Е-08
Р(Т≤т) два хвоста
Таблица 4. Антиген: x-LDL (образцы по 200 мкл плазмы)
т-Тест: Два образца, учитывая неравные дисперсии
Эндометриоз
Контроль
Среднее
0.214741935
0.18009375
Дисперсия
0.005239014
0.006001378
Наблюдения
62
32
0.019975579
Р(Т≤т) один хвост
0.039951158
Р(Т≤т) два хвоста
Таблица 5. Антиген MDA-LDL (образцы по 200 мкл плазмы)
т-Тест: Два образца, учитывая неравные дисперсии
Эндометриоз
Контроль
Среднее
0.213758065
0.165406
Дисперсия
0.005736645
0.003401
Наблюдения
62
32
0.000485039
Р(Т≤т) один хвост
0.000970078
Р(Т≤т) два хвоста
002520
36
Настоящее изобретение раскрыто со ссылкой на его предпочтительные варианты воплощения. Варианты и модификации способа, набора и материалов, включая антитела, будут
очевидны специалистам из предшествующего
подробного описания изобретения. Следует
учитывать, что все эти варианты и модификации
включены в объем прилагаемой формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенное антитело, которое взаимодействует с антигеном, образовавшимся в результате
реакции гидроперекиси липида с первичным амином, и при этом в какой-либо значительной степени
не связывается с альдегидмодифицированным белком.
2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что
конъюгировано с дополнительным агентом.
3. Антитело по п.2, отличающееся тем, что
дополнительный агент представляет собой детектируемую метку.
4. Антитело по п.3, отличающееся тем, что
метка представляет собой флуорохром, радиоактивный изотоп, биотин, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, 2-галактозидазу или другой фермент.
5. Антитело по п.1, отличающееся тем, что
дополнительно связано с твердой подложкой.
6. Антитело по п.5, отличающееся тем, что
твердая подложка представляет собой мембрану
или покрытие, нанесенное на палочки, шарики,
чашки или полоски, или прикрепленное к ним.
7. Антитело по п.5, отличающееся тем, что
твердая подложка представляет собой культуральный планшет, планшет для осуществления ELISA,
пробирку или полимерную мембрану.
8. Антитело по п.1, отличающееся тем, что
антиген является продуктом реакции гидроперекиси линолевой кислоты и первичного амина.
9. Антитело по п.8, отличающееся тем, что
первичный амин находится в аминокислотной
группе, например, лизиновой аминогруппе альбумина или полилизина или такого низкомолекулярного соединения, как полифосфатидилэтаноламин.
10. Антитело по п.1, отличающееся тем, что
оно представляет собой гуманизированное антитело.
11. Фрагмент антитела по любому из пп.1-10
формулы.
12. Способ оценки уровня перекисного окисления липидов в биологическом образце путем выявления антигена, образовавшегося в результате
реакции гидроперекиси липида с первичным амином, заключающийся в том, что обеспечивают
взаимодействие образца с антителом или его фрагментом по любому из пп.1-11 формулы и определяют наличие комплекса антиген-антитело, по количеству которого оценивают уровень перекисного
окисления липидов.
37
002520
38
13. Способ оценки уровня перекисного окисления липидов в биологическом образце путем выявления антигена, образовавшегося в результате
реакции гидроперекиси липида с первичным амином, заключающийся в том, что обеспечивают контактирование образца с антителом или его фрагментом или их конъюгатом, которые перекрестно
связываются с антителом или его фрагментом по
любому из пп.1-11 формулы, и определяют наличие
комплекса антиген-антитело, по количеству которого оценивают уровень перекисного окисления
липидов.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что
уровень перекисного окисления липидов сравнивают с нормой для популяции.
15. Набор для оценки уровня перекисного
окисления липидов в биологическом образце, содержащий антитело или его фрагмент по любому
из пп.1-11 формулы.
16. Набор по п.14, дополнительно содержащий второе антитело, взаимодействующее с анти-
телом или его фрагментом по любому из пп.1-11
формулы.
17. Способ диагностики заболеваний, обусловленных перекисным окислением липидов, заключающийся в том, что осуществляют оценку
уровня перекисного окисления липидов в полученном от пациента биологическом образце в соответствии со способом по любому из пп.12, 13 формулы.
18. Способ по п.16, отличающийся тем, что
заболевание выбрано из группы, включающей заболевание сердечно-сосудистой системы, центральной нервной системы, атеросклероз, нейродегенеративное или воспалительное заболевание, в
частности, воспалительное заболевание кишечника
(болезнь Крона), эндометриоз, гломерулонефрит,
преэклампсию, болезнь Альцгеймера, псориаз,
бронхиальную астму, атопический дерматит, солидную опухоль, саркому Капоши, ревматоидный
артрит или ишемическую реперфузию.
Фиг. 1
Фиг. 4
Фиг. 2
Фиг. 5
Фиг. 3
Фиг. 6
39
002520
40
Фиг. 12
Фиг. 7
Фиг. 8
Фиг. 13
Фиг. 14
Фиг. 9
Фиг. 10
Фиг. 15
Фиг. 11
41
002520
42
Фиг. 16
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, ГСП-9 101999, Москва, Центр, М. Черкасский пер., 2/6