УДК Preeti Kumaran Menon , Dafin Fior Muresanu , Aruna Sharma
advertisement
УДК Preeti Kumaran Menon1, Dafin Fior Muresanu2, Aruna Sharma1, Herbert Mossler3, Hari Shanker Sharma1 1 Laboratory of Cerebrovascular Research, Department of Surgical Sciences, Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Hospital, Uppsala University, Uppsala, Sweden 2 Neurology Department, University of Cluj-Napoca, Cluj-Napoca, Romania 3 Ever NeuroPharma, Unterach, Austria ÖÅÐÅÁÐÎËÈÇÈÍ, ÏÐÅÄÑÒÀÂËßÞÙÈÉ ÑÎÁÎÉ ÊÎÌÏËÅÊÑ ÍÅÉÐÎÒÐÎÔÈ×ÅÑÊÈÕ ÔÀÊÒÎÐÎÂ, ÑÒÈÌÓËÈÐÓÅÒ ÂÛÐÀÆÅÍÍÓÞ ÍÅÉÐÎÏÐÎÒÅÊÖÈÞ Ó ÏÀÖÈÅÍÒÎÂ Ñ ÏÎÂÐÅÆÄÅÍÈÅÌ ÑÏÈÍÍÎÃÎ ÌÎÇÃÀ ÍÀ ÔÎÍÅ ÈÍÒÎÊÑÈÊÀÖÈÈ ÈÑÊÓÑÑÒÂÅÍÍÛÌÈ ÌÅÒÀËËÈ×ÅÑÊÈÌÈ ÍÀÍÎ×ÀÑÒÈÖÀÌÈ Резюме. Повреждения спинного мозга (ПСМ) являются одними из самых тяжелых, эффективного метода их лечения не существует. Некоторые исследования показывают, что наночастицы могут оказывать отрицательное влияние на патологические изменения, связанные с ПСМ, и тем самым снижать эффективность многих нейропротекторов. Таким образом, существует острая необходимость в поиске подходящих лекарственных препаратов, которые могли бы свести к минимуму посттравматическую спинальную патологию, возникающую на фоне интоксикации наночастицами. В течение последних 7 лет наша лаборатория занимается поиском терапевтических стратегий, которые могли бы в равной степени уменьшить заболеваемость спинальной патологией у интактных животных, а также у животных с ПСМ, подвергшихся воздействию наночастиц. Нами было обнаружено, что ежедневное введение крысам искусственных металлических наночастиц (например, наночастиц алюминия, серебра и меди размерами 50– 60 нм) в течение 7 дней (в дозе 50 мг/кг интраперитонеально) приводило к обострению посттравматической спинальной патологии, что сильно коррелировало с нарушением гематоспинального барьера по отношению к протеинам сыворотки. Проникновение белков плазмы в спинной мозг приводит к образованию отека и повреждению нейронов. Таким образом, при создании препаратов следует учитывать необходимость их эффективности даже в случаях, когда ПСМ вызвано наночастицами. Предыдущее исследование предполагает, что подходящая комбинация нейротрофических факторов может вызывать выраженную нейропротекцию при ПСМ у интактных животных. Мы исследовали влияние Церебролизина, который представляет собой комбинацию различных нейротрофических факторов (например, фактора роста нейронов головного мозга, нейротрофического фактора глиальных клеток, фактора роста нейронов, цилиарного нейротрофического фактора и других пептидных фрагментов), применяемых при лечении интактных крыс с ПСМ и крыс с ПСМ, подвергшихся воздействию наночастиц. Наши наблюдения показали, что введение Церебролизина (в дозе 2,5 мл/кг внутривенно) перед ПСМ обеспечивало хорошую нейропротекцию у интактных животных; в то же время в группе крыс, подвергшихся воздействию наночастиц, для стимуляции сравнимой нейропротекции в спинном мозге после ПСМ требовалось введение более высоких доз препарата (5,0 мл/кг внутривенно). Церебролизин также уменьшал содержание воды в спинном мозге, транссудацию белков плазмы и количество поврежденных нейронов. Это означает, что Церебролизин, применяемый в больших дозах, может являться препаратом выбора для лечения ПСМ на фоне интоксикации наночастицами. В настоящем обзоре обсуждаются возможные механизмы и функциональное значение этих результатов. Ключевые слова: повреждение спинного мозга, наночастицы, серебро, медь, алюминий, Церебролизин, нейротрофические факторы, фактор роста нейронов головного мозга, нейротрофический фактор глиальных клеток, цилиарный нейротрофический фактор, гематоспинальный барьер, отек спинного мозга, повреждения нейронов, спинальная патология. 94 Ìåæäóíàðîäíûé íåâðîëîãè÷åñêèé æóðíàë, ISSN 2224-0713 N¹ 2(64), 2014 1. Ââåäåíèå Повреждение спинного мозга (ПСМ) является тяжелым заболеванием, которое возникает вследствие дорожно-транспортных происшествий или падений и выражается в повреждении клеток спинного мозга [1–6]. В зависимости от своей величины и тяжести ПСМ может приводить к квадриплегии/тетраплегии, параплегии и другим продолжительным функциональным нарушениям [7–10]. Таким образом, необходимо приложить большие усилия для своевременного лечения пациентов с ПСМ соответствующими лекарственными препаратами, действие которых направлено на восстановление функционирования спинного мозга, с целью улучшения качества жизни этих пациентов. ПСМ может быть травматическим или нетравматическим [11]. Травматические повреждения могут быть вызваны различными факторами, такими как дорожно-транспортные происшествия, бытовые несчастные случаи, спортивные травмы, а также огнестрельные или ножевые ранения [5, 6, 10, 11]. Нетравматические повреждения могут быть обусловлены нейроинфекцией, а также кистами или опухолями [4–6]. ПСМ также может быть полным или неполным, в зависимости от полной или частичной утраты функций ниже точки травмы [5, 6, 9–11]. 1.1. Сосудистые осложнения, лежащие в основе вторичного патогенеза Повреждение спинного мозга заключается прежде всего в механическом повреждении структур спинного мозга, известном как первичная травма, которая медленно прогрессирует, вызывая вторичные повреждения — повреждения клеток в сером и белом веществе мозга [5, 6, 9–11]. Первичные повреждения связаны с разрушением кровеносных сосудов [5, 11]. Уменьшается приток крови к поврежденной ткани, и это приводит к плохой доставке кислорода и питательных веществ к нейронам [9–11]. Вторичный патогенез включает ограничение кровотока, избыточное выделение нейромедиаторов, воспаление, вызываемое иммунными клетками, действием свободных радикалов и саморазрушением нервных клеток [9–13]. Все эти механизмы приводят к увеличению площади повреждения в спинном мозге [5, 6, 9–13]. Вслед за повреждением аксонов в спинном мозге происходит образование глиальных клеток [5, 6, 11]. Тем не менее некоторые механизмы так и остаются неясными, например то, каким образом нервные клетки разрушаются после травмы и как нейроны оказываются под влиянием возбуждающих нейромедиаторов, таких как глутамат [14]. 1.2. Нарушение гематоспинального барьера При нормальных условиях гематоэнцефалический (ГЭБ) и гематоспинальный барьер (ГСБ) не допускают прохождения крупных молекул в центральную нервную систему (ЦНС) (рис. 1) [13, 14]. ГЭБ и ГСП содержат N¹ 2(64), 2014 специфические эндотелиальные клетки, которые способствуют строгой регуляции микропроцессов в жидкой среде ЦНС [7, 8, 14]. Плотные соединения, имеющиеся между близлежащими эндотелиальными клетками, предотвращают проникновение крупных молекул, таких как белки плазмы, в нейропиль (рис. 1) [7, 8, 13]. На эндотелиальных клетках расположен гликокаликс, богатый гликопротеинами. Он имеет отрицательный заряд и таким образом блокирует транссудацию белков плазмы из-за схожего заряда [15, 16]. Базальная мембрана, которая присутствует на паренхимальной стороне эндотелиальных клеток, обеспечивает структурную поддержку мембран этих клеток [11–15]. Таким образом, структуры ГЭБ или ГСБ способствуют нормальному функционированию нейронов [7, 8]. После травмы головного или спинного мозга ГЭБ или ГСБ нарушается и происходит быстрая транссудация альбумина в головной или спинной отдел мозга [7–11, 14]. Присутствие альбумина внутри нейропиля, нейронов или клеток, отличных от нейронов, можно определить с помощью иммуногистохимического исследования [17, 18]. Затем головной или спинной мозг подвергается воздействию различных клеток иммунной системы, таких как нейтрофилы, Т-клетки, макрофаги и моноциты. Эти иммунные клетки продуцируют воспалительный ответ, что приводит к повреждению нервных клеток. Тем не менее при некоторых видах повреждений эти иммунные клетки оказываются защитными, поэтому до сих пор остается спорным вопрос о том, какое действие оказывает иммунная система — защитное или деструктивное [19–21]. Проникновение иммунных клеток в ЦНС приводит также к увеличению выработки свободных радикалов [21, 22]. Эти свободные радикалы являются высокоактивными формами молекул кислорода и приводят к разрушению нейронов. Вследствие нарушения ГЭБ или ГСБ свободные радикалы вызывают повреждение нейронов [23–25]. 1.3. Формирование отека спинного мозга После нарушения ГЭБ или ГСБ и проникновения сывороточных белков во внеклеточную среду ЦНС происходит формирование отека внутри головного или спинного мозга [26–30]. Отек вызывается увеличением содержания воды в спинном или головном мозге [31–33]. Существует два основных типа формирования отека мозга: вазогенный и цитотоксический [31]. Вазогенный отек имеет место при проникновении белков плазмы и воды во внеклеточное пространство головного мозга, цитотоксический — когда вода накапливается внутри внутриклеточного пространства мозга [31–33]. При цитотоксическом отеке происходит отек нейронов, эндотелиальных и других клеток нервной ткани [31]. Формирование вазогенного отека возникает вследствие повышенной скорости капиллярной фильтрации и снижения скорости элиминации жидкости из тканей [8, 11, 29–33]. www.mif-ua.com 95 Рисунок 1. Структура и функции гематоспинального барьера A. Схема, показывающая эндотелиальные клетки (Е) в спинном мозге, связанные между собой плотными контактами и окруженные толстой базальной мембраной. Глиальные клетки (G) и нервные клетки (N) хорошо видны вокруг эндотелиальных клеток спинного мозга. Глиальные клетки микрососудов спинного мозга, особенно микрососудов большого диаметра, менее интенсивно окрашены (подробнее см. исследование Sharma (2004) [14]). Внутрисосудистый индикатор, как правило, останавливается возле плотного контакта, не проникает сквозь мембрану эндотелиальных клеток и не достигает внеклеточного пространства, показывая, что ГСБ является очень плотным (A). Кроме того, интратекальный индикатор обычно не проникает через аблюминальные эндотелиальные клетки мембраны и/или плотные контакты и не достигает сосудистого слоя (Б), что дает возможность предположить, что ГСБ эффективно регулирует обмен веществ между микросредой спинного мозга и сосудистой системой (Б). Данные модифицированы по [14]. В. Однако необходимые питательные вещества и продукты метаболизма могут свободно проникать через ГСБ из крови в спинной мозг и наоборот. Г. ГСБ, показывающий соотношение между нейронами (N), глиальными (G) и эндотелиальными клетками. Лантан (La) останавливается в просвете и не может проникнуть через плотный контакт (TJ). Капилляры окружены толстой базальной мембраной (BM). Данные модифицированы по Sharma (2004) [14] 96 Ìåæäóíàðîäíûé íåâðîëîãè÷åñêèé æóðíàë, ISSN 2224-0713 N¹ 2(64), 2014 Имеется несколько нейрохимических соединений, которые могут вызывать изменение проницаемости ГЭБ или ГСБ и способствовать образованию отека внутри головного или спинного мозга, что приводит к повреждению клеток и тканей [26–33]. Этими нейрохимическими веществами, в частности, являются серотонин, простагландины и гистамин [8–11, 14]. Во многих экспериментальных случаях было доказано, что ингибирование активности этих нейрохимических соединений перед ПСМ способствует снижению нарушения ГСБ, образования отека и/или повреждения клеток [29–33]. В клинических или экспериментальных условиях было обнаружено, что транссудация белков плазмы и диффузия жидкости с течением времени усиливают отек [31]. Тяжесть повреждения головного или спинного мозга влияет на выраженность отека [15–18]. 2. Âëèÿíèå íåéðîòðîôè÷åñêèõ ôàêòîðîâ ïðè ïîâðåæäåíèè ñïèííîãî ìîçãà В ЦНС присутствуют различные нейротрофические факторы. К ним относятся фактор роста нейронов (ФРН), фактор роста нейронов головного мозга (ФРНГМ), цилиарный нейротрофический фактор (ЦНФ) и нейротрофический фактор глиальных клеток (НФГК) [34–36]. Эти факторы роста необходимы для выживания и нормального функционирования нейронов [11–13]. При наличии повреждения спинного мозга иммунные клетки высвобождают цитокины, которые, в свою очередь, активируют нейротрофические факторы; однако они генерируются в недостаточном количестве и в результате как не предотвращают дегенерацию нейронов, так и не способствуют их регенерации [13, 27, 28, 33–36]. Во многих экспериментальных исследованиях эти факторы роста вводились в область поврежденного спинного мозга извне, что приводило к облегчению патологического исхода [13, 33–36]. Когда в ранней фазе повреждения ФРНГМ или ФРН вводили в виде монотерапии, они улучшали состояние поврежденного спинного мозга, сводя к минимуму нарушение ГСБ и образование отека [13]. Однако при введении их на 60–90-й минуте после повреждения никаких признаков улучшения не наблюдалось [33–36]. При введении ФРНГМ в комбинации с НФГК в область поврежденного спинного мозга на 60–90-й минуте после повреждения отмечалось ослабление патологических изменений в спинном мозге за счет снижения нарушения ГСБ и образования отека [13]. Введение извне некоторых комбинаций нейротрофических факторов, например ФРНГМ с ФРН или нейротрофином-3, на 30–90-й минуте после повреждения не оказывало положительного эффекта [13]. Следовательно, комбинации нейротрофических факторов следует подбирать таким образом, чтобы они оказывали полезные биологические эффекты [33–36]. N¹ 2(64), 2014 Различные исследования показали, что время применения и дозы различных нейротрофических факторов зависят от уровня их экспрессии, который изменяется в различных фазах после повреждения [11–13]. Высокая концентрация нейротрофических факторов при введении их в комбинации улучшает моторную функцию и стимулирует восстановление нейронов [33–36]. Иногда повреждение спинного мозга также снижает уровень гормонов роста. Поэтому с целью достижения некоторого нейропротекторного действия их вводят экзогенно в высоких концентрациях [37, 38]. 3. Âëèÿíèå íàíî÷àñòèö íà ïàòîëîãè÷åñêèå ïðîöåññû ïðè ïîâðåæäåíèè ñïèííîãî ìîçãà В окружающей среде присутствуют различные типы наночастиц, и в последнее время это привлекает к себе внимание разных исследователей в области ПСМ в плане изучения того, как эти наночастицы могут влиять на патофизиологию повреждения ЦНС [39–46]. Наночастицы, которые начали исследовать сравнительно недавно, могут оказывать либо конструктивный, либо деструктивный эффект [46]. Если их размеры находятся в диапазоне 50–200 нм, они могут быть использованы в различных биомедицинских целях (например, в диагностических и лечебных), но иногда могут оказывать и некоторые токсические эффекты [47, 48]. Однако по-прежнему неясно, каким образом наночастицы оказывают нейротоксичные эффекты. Недавние эксперименты позволяют предположить, что в условиях, когда наночастицы присутствуют в избытке, степень повреждения нейронов может усугубляться; так, например, солдаты в боевой обстановке подвергаются воздействию различных видов наночастиц, таких как сера, медь, оксид кремния или углерода. В этой ситуации патофизиология повреждения спинного мозга, вероятно, будет отличаться от таковой у лиц, которые получают ПСМ в чистой и здоровой окружающей среде [40–46]. Тем не менее подробная информация об этих условиях все еще остается неизвестной. Наночастицы, попадающие в организм из окружающей среды при дыхании, могут проникать в жидкости, присутствующие в организме, а затем посредством эндоцитоза достигать различных клеток, отличных от нервных, и вызывать цитотоксичность [46]. Если же клетки или ткани подвергаются воздействию этих мелких частиц, размер которых находится в диапазоне 10–100 нм, отмечается более выраженная степень воспаления [2, 46]. 3.1. Воздействие наночастиц приводит к нарушению ГСБ Если наночастицы (например, серебро, медь или алюминий) размером 50–60 нм вводить системно, они будут вызывать нарушение ГСБ, тем самым делая его проницаемым для различных белковых индикаторов, www.mif-ua.com 97 таких как альбумин, меченный синим Эванса (ЭСА), и радиоактивный йод [39, 42]. Внутривенное или внутримозговое введение этих наночастиц может привести к серьезным повреждениям ГЭБ и ГСБ, в то время как при интраперитонеальном введении они наносят меньший ущерб [41, 42]. Для того чтобы изучить, какая доза наночастиц и какой путь их введения приводят к нарушению ГСБ, необходимо провести дальнейшие исследования. 3.2. Наночастицы приводят к образованию отека Наночастицы также усугубляют образование отека [44, 45]. При внутривенном введении наночастиц происходит формирование отека — содержание воды в головном мозге повышается более чем на 1 % [41–46]. Содержание воды в головном мозге измеряется как разница между массой сухого и влажного образца [45]. Очевидно, что нарушение ГСБ и увеличение его проницаемости для различных белковых индикаторов приводит к образованию вазогенного отека [1–6]. Нарушение ГСБ и формирование отека обусловливает различные морфологические изменения внутри головного мозга [39–46]. Это указывает на то, что наночастицы также вызывают повреждение различных клеток и тканей. 4. Ñòðàòåãèè ëå÷åíèÿ ïðè ÏÑÌ Первоначальная реакция спинного мозга на повреждение проявляется в виде быстрого набухания [5–8]. Поэтому с целью максимально повысить шансы на восстановление травмированным пациентам необходимо назначать немедленную терапию, в пределах 4–8 часов от получения первичной травмы [11–14]. Обычно пациентам назначают три различных лекарственных препарата, например противовоспалительный — для достижения иммунного ответа, антиоксидантный — для снижения образования свободных радикалов и антиэксайтотоксический — для предотвращения эффекта чрезмерного высвобождения возбуждающих нейромедиаторов, таких как глутамат [5, 11, 14]. Метилпреднизолон является противовоспалительным средством, которое эффективно только при введении в течение 8 часов после повреждения [11]. Этот препарат оказывает действие на повреждение за счет подавления реакции со стороны иммунной системы. Тем не менее имеются различные ограничения применения данного лекарственного средства, которые нельзя не принимать во внимание [11, 14]. В случаях когда ПСМ является достаточно серьезным и приводит к полному параличу, необходимо вводить более высокие дозы препарата. Однако это может привести к ряду осложнений, таких как мышечная слабость, образование сгустков крови в венах и/или отсутствие улучшения в отношении повреждения [11]. Лазароиды, класс 21-аминостероидов, — антиоксидантные препараты, применение которых при повреждении предотвращает чрезмерную продукцию 98 свободных радикалов [1–4, 11, 14]. Они являются производными метилпреднизолона, и Управление США по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств не одобрило их применение, поскольку они синтезируются из неутвержденного к применению препарата метилпреднизолона [11]. Эффективность этих препаратов в отношении ПСМ все еще исследуется. Тиреотропин-рилизинг-фактор является антиэксайтотоксином и сводит к минимуму избыточную продукцию нейромедиаторов, таких как глутамат, посредством высвобождения тиреотропного гормона. Тем не менее необходимы дальнейшие исследования по изучению использования данного препарата при ПСМ [11, 14]. Эти препараты оказывают действие на интактных пациентов с ПСМ, но они, вероятно, не будут столь же эффективными, когда повреждение спинного мозга усугубляется в результате воздействия наночастиц [9–14, 39–46]. Следовательно, препарат должен быть разработан таким образом, чтобы повышать нейропротекцию как при обычном ПСМ, так и при ПСМ в комбинации с травматическим воздействием наночастиц. 5. Öåðåáðîëèçèí: ïåðñïåêòèâíûé ïðåïàðàò äëÿ ëå÷åíèÿ ÏÑÌ Церебролизин является единственным препаратом, доступным для клинического применения, который содержит активные фрагменты некоторых важных нейротрофических факторов [49–53]. Этот препарат используется с целью нейропротекции при наличии повреждений в ЦНС, а также для стимуляции восстановления нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, таких как рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, деменция, острый и хронический инсульт [39, 49–53]. Это единственный препарат, действие которого аналогично таковому различных нейротрофических факторов, используемых в комбинации, таких как ФРНГМ, НФГК, ЦНФ и ФРН и другие [39]. Систематическое введение более высоких доз данного препарата оказывает положительный эффект в ситуации, когда повреждение в спинном мозге связано с влиянием наночастиц, однако для подтверждения этого вывода необходимо провести дальнейшие исследования [39, 49–55]. 5.1. Возможные механизмы Церебролизин-индуцированной нейропротекции Церебролизин-индуцированная нейропротекция включает следующие механизмы [39]: а) выживаемость нейронов: нейротрофические факторы, входящие в состав этого препарата, способствуют выживанию нейронов и предотвращают гибель клеток; б) нейропротекция: препарат индуцирует нейропротекцию внутри мозга даже в неблагоприятных условиях, поддерживая клеточные взаимодействия; Ìåæäóíàðîäíûé íåâðîëîãè÷åñêèé æóðíàë, ISSN 2224-0713 N¹ 2(64), 2014 в) нейропластичность: препарат способствует восстановлению процессов повторной проводимости, тем самым позволяя мозгу адаптироваться к различным изменениям окружающей среды, а также он способствует прорастанию аксонов или дендритов; г) нейрогенез: препарат позволяет формировать нейроны согласно дифференциации клеток-предшественников. Благодаря этим механизмам Церебролизин рассматривается как комбинированный препарат, который обладает непосредственной нейротрофической активностью [49–53]. На сегодняшний день Церебролизин является эффективным терапевтическим средством для лечения повреждений ЦНС. Тем не менее его роль при ПСМ и смежных расстройствах находится на стадии исследования. 6. Íàøè èññëåäîâàíèÿ ïî èñïîëüçîâàíèþ Öåðåáðîëèçèíà ïðè ÏÑÌ В нашей модели мы исследовали влияние наночастиц на патофизиологию ПСМ в организме крыс (рис. 2). Кроме того, потенциальная эффективность Церебролизина была изучена у интактных крыс с ПСМ и у крыс с ПСМ, предварительно подвергшихся воздействию наночастиц. 6.1. Модель ПСМ Под анестезией эквитезином (в дозе 3 мл/кг интраперитонеально) у самцов крыс Вистар было выполнено повреждение путем нанесения продольного разреза (глубиной 1,5 мм и длиной 4 мм) в правом дорсальном роге на уровне сегментов T10–11 спинного мозга (рис. 2) [54–56]. Все эксперименты были одобрены местным ведомственным этическим комитетом и проведены в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здоровья по уходу за экспериментальными животными [57]. 6.2. Введение наночастиц Наночастицы меди (Cu), серебра (Ag) и алюминия (Al), размеры которых находились в диапазоне 50–60 нм (получены на научно-исследовательской базе военновоздушных сил США Райта — Паттерсона, Дейтон, Огайо, США), были впервые добавлены в виде суспензии в 0,05% раствор твин 80, который затем вводили интраперитонеально (в дозе 50 мг/кг один раз в день) в течение семи дней [39, 45]. 6.3. Лечение Церебролизином Церебролизин (компания-производитель Ever Neuro Pharma, Австрия) в дозе 2,5 или 5,0 мл/кг на физиологическом растворе вводили внутривенно за 30 минут до ПСМ как интактным крысам, так и крысам, предварительно подвергшимся воздейN¹ 2(64), 2014 Рисунок 2. Модель повреждения спинного мозга у крыс. Продольный надрез правого дорсального рога на уровне сегментов T10–11 (L). Размеры повреждения составляют ~ 5 мм в длину и ~ 2 мм в глубину (Б). Самая глубокая часть повреждения в большей мере ограничена VII пластинами Рекседа (А). Тканевый образец, который исследовали морфологически или биохимически, был взят из рострального (T9) и каудального (T12) сегментов поражения. Данные модифицированы по Sharma (2004) [14]. Шкала бар = 5 мм ствию наночастиц. Животных исследовали спустя 5 часов после повреждения [39, 49–53]. Интактные крысы использовались в качестве контрольной группы [58]. 6.4. Влияние наночастиц на проницаемость ГСБ Проницаемость ГСБ количественно определялась при помощи транссудации ЭСА (2% р-р ЭСА вводился внутривенно в дозе 3 мл/кг) и иммуногистохимического анализа сывороточного альбумина. Транссудация ЭСА в ткани измерялась калориметрически [45, 52–55]. Транссудация альбумина была продемонстрирована с помощью иммуногистохимического анализа с использованием первичных антител к альбумину (1 : 4000) на парафиновых срезах спинного мозга. Иммунная реакция была разработана с использованием пероксидазно-антипероксидазной методики [17, 18]. У животных с ПСМ, обработанных наночастицами, отмечено нарушение ГСБ, проницаемость которого для ЭСА была намного выше, чем в контрольной группе после травмы (рис. 3, табл. 1). Этот эффект был наиболее выражен у крыс, подвергшихся воздействию наночастиц Ag и Cu [43, 44]. www.mif-ua.com 99 Рисунок 3. Типичные примеры транссудации сывороточного альбумина в спинной мозг, ее модификации при воздействии наночастиц и лечении Церебролизином. Единичное ПСМ приводило к массовой транссудации альбумина в нейропиль спинного мозга, который просматривается вокруг нейронов и микрососудов (стрелки). Отек, который может привести к повреждению клеток и тканей (В), представляет скопление альбумина в перинейронной и периваскулярной области. Данная посттравматическая транссудация альбумина усугубляется введением Ag (Б) или Cu. Церебролизин (в дозе 2,5 мл) (Г) не показал заметного снижения обострения транссудации альбумина, вызванного наночастицами Ag, после ПСМ. Хотя транссудация альбумина у интактных крыс после ПСМ была значительно менее выражена под действием Церебролизина в дозе 2,5 мл (З), для заметного ее снижения после ПСМ, усугубленного наночастицами Ag (А) и Cu (Д), потребовалось введение Церебролизина в более высокой дозе (5 мл). Шкала бар = 30 мкм 6.5. Влияние наночастиц на формирование отека спинного мозга 6.6. Наночастицы вызывают морфологические изменения внутри тканей мозга Для определения формирования отека в спинном мозге использовалось процентное содержание воды, которое рассчитывалось как разница между массой влажного и сухого образца ткани [55]. Мы наблюдали транссудацию альбумина в спинной мозг, предполагая, что сывороточные белки, проникая в спинной мозг, могут приводить к образованию отека [54–56]. Это дополнительно подтверждалось измерением содержания воды после ПСМ в обеих группах животных, одна из которых была обработана наночастицами, а другая — получала физиологический раствор [55]. В группе животных, обработанных наночастицами, до ПСМ отмечалось умеренное увеличение содержания воды, в то время как в группе животных, обработанных наночастицами, после ПСМ наблюдалось значительное увеличение содержания воды (табл. 1). В группе крыс, получавших физиологический раствор, также отмечен отек спинного мозга, но величина его была намного меньше, чем у травмированных крыс, обработанных наночастицами. Наночастицы Ag и Cu оказывали наибольшее влияние на образование отека после травмы по сравнению с наночастицами Al [44, 45]. В контрольной группе и группе, которая подверглась повреждению и была пролечена Церебролизином, после ПСМ наблюдались такие морфологические изменения, как повреждения нейронов или глиальных клеток, которые выявляли с помощью различных стандартных гистологических методов и иммуноокрашивания, таких как окрашивание по Нисслю или гематоксилином и эозином — для определения травмированных нейронов и иммуноокрашивание глиофибриллярным кислым белком — для определения астроцитных реакций [17, 18, 39, 45–52]. Для наблюдения за изменениями нейронов или глиальных клеток внутри спинного мозга делали срезы толщиной 4 мкм, которые затем окрашивали глиофибриллярным кислым белком, по Нисслю или гематоксилином и эозином [17]. У животных, обработанных наночастицами, до и после травмы были выявлены повреждения нейронов (рис. 3–5). Однако после травмы были выявлены более выраженные повреждения нейронов и астроцитов, чем до нее, когда отмечались лишь незначительные повреждения нейронов или глиальных клеток (табл. 1, рис. 4, 5). 100 Ìåæäóíàðîäíûé íåâðîëîãè÷åñêèé æóðíàë, ISSN 2224-0713 N¹ 2(64), 2014 Рисунок 4. Типичные примеры повреждения нейронов спинного мозга и их модификации при воздействии наночастиц и терапии Церебролизином. ПСМ привело к заметному повреждению нейронов у интактных крыс (В), которое усугублялось при воздействии наночастиц Ag (Г), Cu (З) и Al (Ж). Было показано, что повреждения нейронов (стрелки) усугубляются после ПСМ в группах крыс, обработанных Ag и Cu, по сравнению с группой крыс, обработанных Al. Терапия Церебролизином (в дозе 2,5 мл) способствовала уменьшению повреждения нейронов после ПСМ у интактных крыс (Б), но оказалась неэффективной в группе травмированных крыс, у которых спинной мозг был обработан Ag (Е). С другой стороны, более высокая доза Церебролизина (5 мл) заметно снижала данное повреждение нейронов, усугубляемое наночастицами Ag (А) или Cu (Д). Шкала бар = 30 мкм. Парафинированный срез спинного мозга толщиной 3–4 мкм, окрашенный гематоксилином и эозином Рисунок 5. Типичные примеры повреждений глиальных клеток спинного мозга и их модификации при воздействии наночастиц и Церебролизина с нанопроводниковой доставкой или без нее. Церебролизин, доставленный посредством нанопроводника (НПЦБЛ), вводили в спинной мозг травмированной группе и результаты сравнивали с обычным введением Церебролизина (ЦБЛ) в той же дозировке по выраженности астроцитной реакции, определяемой по иммунореактивности глиофибриллярного кислого белка (ГФКБ) на парафиновых срезах. Результаты показали, что НПЦБЛ может препятствовать активации ГФКБ при ПСМ после интоксикации наночастицами. Спустя пять часов после ПСМ в спинном мозге отмечалась активация ГФКБ (А). Предварительная обработка наночастицами Ag усугубляла данную активацию астроцитов после ПСМ (Б). Обычный Церебролизин, вводимый в дозе 2,5 мл в спинной мозг крыс, обработанных Ag (В) или Cu (Е), не продемонстрировал значительного уменьшения активации ГФКБ. Тем не менее НПЦБЛ, вводимый в сопоставимых дозах, значительно уменьшал активацию ГФКБ в группах крыс, обработанных Ag (Д) или Cu (Г), после ПСМ. Значительная активация ГФКБ при ПСМ была отмечена вокруг нейронов и кровеносных сосудов (стрелки). Шкала бар = 25 мкм Рисунок 6. Схема повреждения клеток в спинном или головном мозге. Вероятно, при инструментальном или провоцирующем повреждении нейронов нарушение ГЭБ или ГСБ играет важную роль вследствие возникновения отека и изменений, связанных с экспрессией генов. Наши результаты показали, что Церебролизин восстанавливает структуру и функции мембраны эндотелиальных клеток и тем самым потенцирует функцию ГСБ или ГЭБ при ПСМ. Очевидно, что восстановление ГЭБ или ГСБ будет приводить к снижению образования отека и повреждения нейронов [подробнее см. 7] N¹ 2(64), 2014 www.mif-ua.com 101 Таблица 1. Влияние различных наночастиц на патологические изменения при повреждении спинного мозга у крыс Содержание воды в спинном мозге (% ЭСА (мг%) Тип эксперимента Повреждения нейронов (количество) T9 T12 T9 T12 T9 T12 Контрольная группа Ag Cu Al 0,23 ± 0,04 0,42 ± 0,08** 0,46 ± 0,06** 0,40 ± 0,08* 0,25 ± 0,06 0,44 ± 0,06** 0,48 ± 0,05** 0,42 ± 0,06** 64,23 ± 0,12 65,89 ± 0,21** 65,94 ± 0,13** 65,13 ± 0,07* 64,56 ± 0,08 65,84 ± 0,21** 65,89 ± 0,10** 65,23 ± 0,10* 2±1 8 ± 2** 10 ± 4** 8 ± 2** 1±2 8 ± 4** 9 ± 3** 7 ± 2* ПСМ Ag Cu Al 0,94 ± 0,12**а 1,89 ± 0,14**б 1,98 ± 0,18**б 1,24 ± 0,08*б 0,98 ± 0,14**а 1,98 ± 0,23**б 2,04 ± 0,21**б 1,43 ± 0,10*б 66,23 ± 0,12**а 68,34 ± 0,43**б 68,89 ± 0,34**б 67,56 ± 0,12*б 66,54 ± 0,21**а 68,89 ± 0,28**б 68,94 ± 0,33**б 67,78 ± 0,23*б 15 ± 3**а 36 ± 8**б 44 ± 7**б 28 ± 8*б 18 ± 6**а 43 ± 6**б 48 ± 9**б 24 ± 6*б Примечания: здесь и в табл. 2: * — Р < 0,05; ** — P < 0,01 по сравнению с контрольной группой; а — выраженные различия по сравнению с контрольной группой; б — выраженные различия по сравнению с группой, имевшей ПСМ. Для множественного сравнения групп с одной контрольной группой после теста Даннетта применялся дисперсионный анализ. Данные предоставлены в виде средних значений ± стандартное отклонение у 5–6 крыс в каждой точке. Таблица 2. Влияние Церебролизина на патологию, связанную с повреждением спинного мозга у крыс Содержание воды в спинном мозге (%) ЭСА (мг%) Тип эксперимента Повреждения нейронов (количество) T9 T12 T9 T12 T9 T12 0,24 ± 0,04 0,20 ± 0,03 0,250 ± 0,041 0,18 ± 0,08 65,13 ± 0,12 65,08 ± 0,10 65,10 ± 0,03 65,10 ± 0,02 1±1 0 0 0 0,54 ± 0,06* 0,34 ± 0,08а 0,58 ± 0,10* 0,36 ± 0,04а 65,34 ± 0,12* 65,10 ± 0,07а 65,44 ± 0,14* 65,06 ± 0,04а 3 ± 2* 2 ± 2* 2 ± 1* 1 ± 2* 1,04 ± 0,11а 1,21 ± 0,12а 0,89 ± 0,21а 1,14 ± 0,17а 1,34 ± 0,21а 0,94 ± 0,22а 67,89 ± 0,12а 67,76 ± 0,34а 67,06 ± 0,10а 67,67 ± 0,32а 67,88 ± 0,23а 66,89 ± 0,21а 23 ± 6а 20 ± 6а 18 ± 6а 22 ± 8а 19 ± 5а 15 ± 3а 0,67 ± 0,10б 0,74 ± 0,14б 0,68 ± 0,08б 0,65 ± 0,12б 0,68 ± 0,14б 0,72 ± 0,10б 65,34 ± 0,12б 65,05 ± 0,08б 65,13 ± 0,21б 65,04 ± 0,14б 65,34 ± 0,18б 65,06 ± 0,21б 8 ± 3б 7 ± 6б 4 ± 6б 7 ± 4б 8 ± 2б 3 ± 4б A. Контрольная группа крыс Церебролизин в дозе 2,5 мл/кг Церебролизин в дозе 5,0 мл/кг Б. Группа крыс с ПСМ Церебролизин в дозе 2,5 мл/кг Церебролизин в дозе 5,0 мл/кг В. Группа с наночастицами + ПСМ Церебролизин в дозе 2,5 мл/кг Ag + ПСМ Cu + ПСМ Al + ПСМ Церебролизин в дозе 5,0 мл/кг Ag + ПСМ Cu + ПСМ Al + ПСМ 6.7. Влияние Церебролизина на патофизиологию спинного мозга Церебролизин вводился трем группам крыс. Первая (контрольная) группа не получала наночастиц и не подвергалась любого рода ПСМ. Вторая группа подвергалась только ПСМ, а третья группа получала наночастицы и подвергалась ПСМ. Обе дозы Церебролизина (2,5 и 5,0 мл/кг) вводили внутривенно за 30 минут до травмы. При низкой дозе Церебролизина отмечено умеренное снижение содержания воды в спинном мозге, в то время как при более высоких — наблюдали более выраженное снижение содержания воды во всех трех группах (табл. 2, рис. 3–5). При введении низких доз Церебролизина наблюдали умеренное снижение проницаемости ГСБ, в то время как высокая доза Церебролизина уменьшала транссудацию ЭСА, образование отека и повреждение нейронов в группе, получавшей наночастицы (табл. 2). 102 Как более высокая, так и более низкая дозы Церебролизина способствовали снижению повреждения нейронов и глиальных клеток после перенесенного ПСМ у интактных крыс. Однако в группе крыс, обработанных наночастицами, для значительного уменьшения образования отека, нарушения ГСБ и повреждения нейронов после ПСМ была необходима более высокая доза Церебролизина по сравнению с более низкой дозой, применяемой в этой группе (табл. 2). 7. Âîçìîæíûå ìåõàíèçìû Öåðåáðîëèçèí-èíäóöèðîâàííîé íåéðîïðîòåêöèè ïðè ÏÑÌ Нами было обнаружено, что наночастицы (размером 50–60 нм) при введении интраперитонеально животным с последующим ПСМ могут вызывать усугубление нарушения ГСБ. Транссудация белков плазмы в спинной Ìåæäóíàðîäíûé íåâðîëîãè÷åñêèé æóðíàë, ISSN 2224-0713 N¹ 2(64), 2014 мозг может обернуться образованием отека, который приводит к увеличению содержания воды внутри спинного мозга и обострению реакций со стороны нейронов и других клеток (рис. 6). Наши результаты также показывают, что Церебролизин в низких или высоких дозах способствовал заметному уменьшению степени повреждения нейронов, активации глиальных клеток, снижению проницаемости ГСБ и образования отека у интактных крыс после перенесенного ПСМ. Тем не менее у крыс, подвергшихся воздействию наночастиц, после перенесенного ПСМ для достижения нейропротекции потребовалось введение более высокой дозы Церебролизина. Это означает, что воздействие наночастицами само по себе может вызвать заметное истощение нейротрофических факторов в спинном мозге. Таким образом, оказывается, что при ПСМ данной группе животных, которые были обработаны наночастицами, по-видимому, требуется увеличение восполнения количества нейротрофина. В результате низкая доза Церебролизина была неэффективной в отношении уменьшения повреждения клеток в группе травмированных крыс, обработанных наночастицами. Очевидно, более высокая доза Церебролизина смогла обеспечить поврежденные ткани необходимым количеством нейротрофинов и противодействовать повреждению клеток. Существует множество нейротрофических факторов, таких как ФРНГМ, НФГК, ЦНФ или ФРН, которые можно использовать для лечения обычных повреждений, однако в случае ПСМ, которое усугубляется влиянием наночастиц, эти нейротрофические факторы не настолько эффективны (результаты не приведены). Наши исследования показывают, что Церебролизин, который содержит комбинацию различных нейротрофических факторов, аминокислот, витаминов, макроэлементов, микроэлементов и антиоксидантных ферментов, определенно способствует нейропротекции [39, 49–52]. Таким образом, в случае, когда перед повреждением ЦНС в организм животных попадали наночастицы, как отмечалось выше, данный препарат показывал свою эффективность в большей мере [39]. С другой стороны, у интактных животных, подверженных ПСМ, данный препарат был эффективен в более низкой дозе. Церебролизин способствовал значительному снижению проницаемости ГСБ, уменьшению содержания в спинном мозге воды и снижению степени повреждения нейронов и глиальных клеток. Введение данного препарата в течение 1–2 часов после повреждения не приводило к какому-либо значительному уменьшению патологии спинного мозга (результаты не приведены). Таким образом, Церебролизин оказывает нейропротективный эффект на спинной мозг в зависимости от его дозы и времени введения [39, 49–52]. При стимулировании нейропротекции в спинном мозге мы наблюдали дозозависимое влияние Церебролизина. Таким образом, как видно из представленных данных, при использовании более высокой дозы Церебролизина отмечены N¹ 2(64), 2014 лучшие результаты по сравнению с более низкой дозой, особенно в группе крыс, подвергшихся воздействию наночастиц и повреждению ЦНС. Для определения эффектов данного препарата, связанных со временем, необходимо проведение дальнейших исследований. Возможные механизмы нарушения ГСБ, образования отека и клеточного повреждения, индуцированных наночастицами, пока не ясны. Вероятно, подобному повреждению может способствовать повышение регуляции нейронной синтазы оксида азота (НСОА), вызванное наночастицами [42–45]. А поскольку ПСМ само по себе вызывает экспрессию НСОА [23–32], комбинация наночастиц и ПСМ усугубляет экспрессию НСОА и повреждение клеток. Существует предположение, что Церебролизин в зависимости от дозы может понижать экспрессию НСОА в спинном мозге. Однако эта тема требует дальнейшего изучения. 8. Çàêëþ÷åíèå è ïåðñïåêòèâû íà áóäóùåå Данные результаты убедительно показывают, что наночастицы усугубляют нарушение проницаемости ГСБ, образование отека и повреждение нейронов и глиальных клеток, вызванные ПСМ. Церебролизин представляется очень эффективным лекарственным препаратом по сравнению с другими нейротрофическими факторами в плане уменьшения патофизиологических изменений, связанных с ПСМ, которые заключаются в восстановлении функции ГСБ (рис. 6), как у интактных животных, так и у животных, подвергшихся воздействию наночастиц. Таким образом, Церебролизин является эффективным препаратом для лечения ПСМ. Введение более высокой дозы данного препарата повышает его эффективность в плане уменьшения выраженности патологии, связанной с ПСМ, и морфологических изменений в тканях спинного мозга у животных, подвергшихся воздействию наночастиц. Тем не менее в случае если Церебролизин применяется после ПСМ, для определения комбинации подходящей дозы и временных интервалов его введения, необходимых для уменьшения повреждения спинного мозга, требуется проведение дальнейших исследований. В настоящее время этот вопрос изучается в нашей лаборатории. Ñïèñîê ëèòåðàòóðû 1. Post M.W., Brinkhof M.W., von Elm E., Boldt C., Brach M., Fekete C., Eriks-Hoogland I., Curt A., Stucki G., SwiSCI study group. Design of the Swiss Spinal Cord Injury Cohort Study // Am. J. Phys. Med. Rehabil. 2011, 90 (11, Suppl. 2), S5-S16. 2. Sharma H.S., Sharma A. Nanowired drug delivery for neuroprotection in central nervous system injuries: modulation by environmental temperature, intoxication of nanoparticles, and comorbidity factors // Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2011 [Epub ahead of print]. 3. Bains M., Hall E.D. Antioxidant therapies in traumatic brain and spinal cord injury // Biochim. Biophys. Acta. 2011 [Epub ahead of print]. www.mif-ua.com 103 4. Fehlings M.G., Vawda R. Cellular treatments for spinal cord injury: the time is right for clinical trials // Neurotherapeutics. 2011, 8(4), 704-720. 5. Sharma H.S. Early microvascular reactions and blood-spinal cord barrier disruption are instrumental in pathophysiology of spinal cord injury and repair: novel therapeutic strategies including nanowired drug delivery to enhance neuroprotection // J. Neural Transm. 2011, 118(1), 155-176. 6. Sharma H.S. Pathophysiology of blood-spinal cord barrier in traumatic injury and repair // Curr. Pharm. Des. 2005, 11(11), 1353-1389. 7. Sharma H.S. Blood-Central Nervous System Barriers: The Gateway to Neurodegeneration, Neuroprotection and Neuroregeneration // Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology: Brain and Spinal Cord Trauma / Lajtha A., Banik N., Ray S.K., eds. — Berlin; Heidelberg; New York: Springer Verlag, 2009. — P. 363-457. 8. Sharma H.S., Sharma A. Breakdown Of The Blood-Brain Barrier In Stress Alters Cognitive Dysfunction And Induces Brain Pathology. New Perspective For Neuroprotective Strategies // Brain Protection in Schizophrenia, Mood and Cognitive Disorders / Ritsner M., ed. — Berlin; New York: Springer-Verlag, 2010. — P. 243-304. 9. Sharma H.S., Westman J. The Blood-Spinal Cord and Brain Barriers in Health and Disease. — San Diego: Academic Press, 2004. — P. 1-617. 10. Stеlberg E., Sharma H.S., Olsson Y. Spinal Cord Monitoring. Basic Principles, Regeneration, Pathophysiology and Clinical Aspects. — Wien; New York: Springer, 1998. — P. 1-527. 11. Sharma H.S. New perspectives for the treatment options in spinal cord injury // Expert Opin. Pharmacother. 2008, 9(16), 2773-2800. 12. Sharma H.S., Lundstedt T., Flardh M., Skottner A., Wiklund L. Neuroprotective effects of melanocortins in CNS injury // Curr. Pharm. Des. 2007, 13(19), 1929–1941. 13. Sharma H.S. Neurotrophic factors in combination: a possible new therapeutic strategy to influence pathophysiology of spinal cord injury and repair mechanisms // Curr. Pharm. Des. 2007, 13(18), 1841-1874. 14. Sharma H.S. Pathophysiology Of The Blood-Spinal Cord Barrier In Traumatic Injury // The Blood-Spinal Cord and Brain Barriers in Health and Disease / Sharma H.S., Westman J., eds. — San Diego: Elsevier Academic Press, 2004. — P. 437-518. 15. Noble L.J., Mautes A.E., Hall J.J. Characterization of the microvascular glycocalyx in normal and injured spinal cord in the rat // J. Comp. Neurol. 1996, 376(4), 542-556. 16. Gomez-Gonzalez B., Larios H.M., Escobar A. Increased transvascular transport of WGA-peroxidase after chronic perinatal stress in the hippocampal microvasculature of the rat // Int. J. Dev. Neurosci. 2011, 29(8), 839-846. 17. Sharma H.S., Miclescu A., Wiklund L. Cardiac arrestinduced regional blood-brain barrier breakdown, edema formation and brain pathology: a light and electron microscopic study on a new model for neurodegeneration and neuroprotection in porcine brain // J. Neural Transm. 2011, 118(1), 87-114. 18. Johanson, C., Stopa, E., Baird, A., Sharma H. Traumatic brain injury and recovery mechanisms: peptide modulation of periventricular neurogenic regions by the choroid plexus-CSF nexus // J. Neural Transm. 2011, 118(1), 115-133. 104 19. Gong G., Yuan L.B., Hu L., Wu W., Yin L., Hou J.L., Liu Y.H., Zhou L.S. Glycyrrhizin attenuates rat ischemic spinal cord injury by suppressing inflammatory cytokines and HMGB1 // Acta Pharmacol. Sin. 2011, doi: 10.1038/aps.2011.151. 20. Bao F., Omana V., Brown A., Weaver L. The systemic inflammatory response after spinal cord injury in the rat is decreased by alpha4 beta1 integrin blockade // J. Neurotrauma, 2011 [Epub ahead of print]. 21. Bao F., Brown A., Dekaban G.A., Omana V., Weaver L.C. CD11d integrin blockade reduces the systemic inflammatory response syndrome after spinal cord injury // Exp. Neurol. 2011, 231(2), 272-283. 22. Kuboyama K., Tsuda M., Tsutsui M., Toyohara Y., TozakiSaitoh H., Shimokawa H., Yanagihara N., Inoue K. Reduced spinal microglial activation and neuropathic pain after nerve injury in mice lacking all three nitric oxide synthases // Mol. Pain, 2011, 7, 50. 23. Sharma H.S., Westman J., Olsson Y., Alm P. Involvement of nitric oxide in acute spinal cord injury: an immunocytochemical study using light and electron microscopy in the rat // Neurosci. Res. 1996, 24(4), 373-384. 24. Sharma H.S., Sjoquist P.O., Mohanty S., Wiklund L. Post-injury treatment with a new antioxidant compound H-290/51 attenuates spinal cord trauma-induced c-fos expression, motor dysfunction, edema formation, and cell injury in the rat // Acta Neurochir. Suppl. 2006, 96, 322-328. 25. Sharma H.S., Gordh T., Wiklund L., Mohanty S., Sjoquist P.O. Spinal cord injury induced heat shock protein expression is reduced by an antioxidant compound H-290/51. An experimental study using light and electron microscopy in the rat // J. Neural Transm. 2006, 113(4), 521-536. 26. Sharma H.S., Sjoquist P.O., Alm P. A new antioxidant compound H-290151 attenuates spinal cord injury induced expression of constitutive and inducible isoforms of nitric oxide synthase and edema formation in the rat // Acta Neurochir. Suppl. 2003, 86, 415-420. 27. Sharma H.S., Winkler T., Stеlberg E., Gordh T., Alm P., Westman J. Topical application of TNF-alpha antiserum attenuates spinal cord trauma induced edema formation, microvascular permeability disturbances and cell injury in the rat // Acta Neurochir. Suppl. 2003, 86, 407-413. 28. Sharma H.S., Lundstedt T., Flardh M., Westman J., Post C., Skottner A. Low molecular weight compounds with affinity to melanocortin receptors exert neuroprotection in spinal cord injury — an experimental study in the rat // Acta Neurochir. Suppl. 2003, 86, 399-405. 29. Sharma H.S., Westman J., Cervos-Navarro J., Nyberg F. Role of neurochemicals in brain edema and cell changes following hyperthermic brain injury in the rat // Acta Neurochir. Suppl. 1997, 70, 269-274. 30. Sharma H.S., Westman J., Nyberg F., Cervos-Navarro J., Dey P.K. Role of serotonin and prostaglandins in brain edema induced by heat stress. An experimental study in the young rat // Acta Neurochir. Suppl. (Wien.) 1994, 60, 65-70. 31. Sharma H.S., Westman J., Nyberg F. Pathophysiology of brain edema and cell changes following hyperthermic brain injury // Prog. Brain Res. 1998, 115, 351-412. 32. Sharma H.S., Alm P., Westman J. Nitric oxide and carbon monoxide in the brain pathology of heat stress // Prog. Brain Res. 1998, 115, 297-333. 33. Sharma H.S., Westman J., Cervos-Navarro, J., Dey P.K., Nyberg F. Opioid receptor antagonists attenuate heat stress-induced reduction in cerebral blood flow, increased blood-brain barrier per- Ìåæäóíàðîäíûé íåâðîëîãè÷åñêèé æóðíàë, ISSN 2224-0713 N¹ 2(64), 2014 meability, vasogenic edema and cell changes in the rat // Ann. NY Acad. Sci. 1997, 813, 559-571. 34. Sharma H.S. Selected combination of neurotrophins potentiate neuroprotection and functional recovery following spinal cord injury in the rat // Acta Neurochir. Suppl. 2010, 106, 295-300. 35. Sharma H.S., Johanson C.E. Intracerebroventricularly administered neurotrophins attenuate blood cerebrospinal fluid barrier breakdown and brain pathology following whole-body hyperthermia: an experimental study in the rat using biochemical and morphological approaches // Ann. NY Acad. Sci. 2007, 1122, 112-129. 36. Sharma H.S. A select combination of neurotrophins enhances neuroprotection and functional recovery following spinal cord injury // Ann. NY Acad. Sci. 2007, 1122, 95-111. 37. Nyberg F., Sharma H.S. Repeated topical application of growth hormone attenuates blood-spinal cord barrier permeability and edema formation following spinal cord injury: an experimental study in the rat using Evans blue ([125])I-sodium and lanthanum tracers // Amino Acids. 2002, 23(1–3), 231-239. 38. Winkler T., Sharma H.S., Stеlberg E., Badgaiyan R.D., Westman J., Nyberg F. Growth hormone attenuates alterations in spinal cord evoked potentials and cell injury following trauma to the rat spinal cord. An experimental study using topical application of rat growth hormone // Amino Acids. 2000, 19(1), 363-371. 39. Sharma H.S., Muresanu D.F., Patnaik R., Stan A.D., Vacaras V., Perju-Dumbrav L., Alexandru B., Buzoianu A., Opincariu I., Menon P.K., Sharma A. Superior neuroprotective effects of cerebrolysin in heat stroke following chronic intoxication of Cu or Ag engineered nanoparticles. A comparative study with other neuroprotective agents using biochemical and morphological approaches in the rat // J. Nanosci. Nanotechnol. 2011, 11(9), 7549-7569. 40. Sharma H.S., Patnaik R., Sharma A. Diabetes aggravates nanoparticles induced breakdown of the blood-brain barrier permeability, brain edema formation, alterations in cerebral blood flow and neuronal injury. An experimental study using physiological and morphological investigations in the rat // J. Nanosci. Nanotechnol. 2010, 10(12), 7931-7945. 41. Sharma H.S., Sharma A., Hussain S., Schlager J., Sjoquist P.O., Muresanu D. A new antioxidant compound H-290/51 attenuates nanoparticle induced neurotoxicity and enhances neurorepair in hyperthermia // Acta Neurochir. Suppl. 2010, 106, 351-357. 42. Sharma H.S., Ali S.F., Hussain S.M., Schlager J.J., Sharma A. Influence of engineered nanoparticles from metals on the blood-brain barrier permeability, cerebral blood flow, brain edema and neurotoxicity. An experimental study in the rat and mice using biochemical and morphological approaches // J. Nanosci. Nanotechnol. 2009, 9(8), 5055-5072. 43. Sharma H.S., Patnaik R., Sharma A., Sjoquist P.O., Lafuente J.V. Silicon dioxide nanoparticles (SiO2, 40–50 nm) exacerbate pathophysiology of traumatic spinal cord injury and deteriorate functional outcome in the rat. An experimental study using pharmacological and morphological approaches // J. Nanosci. Nanotechnol. 2009, 9(8), 4970-4980. 44. Sharma H.S., Muresanu D.F., Sharma A., Patnaik R., Lafuente J.V. Chapter 9 — Nanoparticles influence pathophysiology of spinal cord injury and repair // Prog. Brain Res. 2009, 180, 154-180. 45. Sharma H.S., Sharma A. Nanoparticles aggravate heat stress induced cognitive deficits, blood-brain barrier disruption, edema formation and brain pathology // Prog. Brain Res. 2007, 162, 245-273. 46. Sharma H.S., Ali S.F., Tian Z.R., Hussain S.M., Schlager J.J., Sjoquist P.O., Sharma A., Muresanu D.F. Chronic N¹ 2(64), 2014 treatment with nanoparticles exacerbate hyperthermia induced bloodbrain barrier breakdown, cognitive dysfunction and brain pathology in the rat. Neuroprotective effects of nanowired-antioxidant compound H-290/51 // J. Nanosci. Nanotechnol. 2009, 9(8), 5073-5090. 47. Sharma H.S., Ali S., Tian Z.R., Patnaik R., Patnaik S., Lek P., Sharma A., Lundstedt T. Nano-drug delivery and neuroprotection in spinal cord injury // J. Nanosci. Nanotechnol. 2009, 9(8), 5014-5037. 48. Sharma H.S., Ali S.F., Dong W., Tian Z.R., Patnaik R., Patnaik S., Sharma A., Boman A., Lek P., Seifert E., Lundstedt T. Drug delivery to the spinal cord tagged with nanowire enhances neuroprotective efficacy and functional recovery following trauma to the rat spinal cord // Ann. NY Acad. Sci. 2007, 1122, 197-218. 49. Sharma H.S., Ali S.F., Patnaik R., Zimmermann-Meinzingen S., Sharma A., Muresanu D.F. Cerebrolysin attenuates heat shock protein (HSP 72 KD) expression in the rat spinal cord following morphine dependence and withdrawal: possible new therapy for pain management // Curr. Neuropharmacol. 2011, 9(1), 223-235. 50. Sharma H.S., Muresanu D., Sharma A., ZimmermannMeinzingen S. Cerebrolysin treatment attenuates heat shock protein overexpression in the brain following heat stress: an experimental study using immunohistochemistry at light and electron microscopy in the rat // Ann. NY Acad. Sci. 2010, 1199, 138-148. 51. Sharma H.S., Zimmermann-Meinzingen S., Johanson C.E. Cerebrolysin reduces blood-cerebrospinal fluid barrier permeability change, brain pathology, and functional deficits following traumatic brain injury in the rat // Ann. NY Acad. Sci. 2010, 1199, 125-137. 52. Muresanu D.F., Zimmermann-Meinzingen S., Sharma H.S. Chronic hypertension aggravates heat stress-induced brain damage: possible neuroprotection by cerebrolysin // Acta Neurochir. Suppl. 2010, 106, 327-333. 53. Sharma H.S., Zimmermann-Meinzingen S., Sharma A., Johanson C.E. Cerebrolysin attenuates blood-brain barrier and brain pathology following whole body hyperthermia in the rat // Acta Neurochir. Suppl. 2010, 106, 321-325. 54. Sharma H.S., Westman J., Olsson Y., Johansson O., Dey P.K. Increased 5-hydroxytryptamine immunoreactivity in traumatized spinal cord. An experimental study in the rat // Acta Neuropathol. 1990, 80(1), 12-17. 55. Sharma H.S., Olsson Y. Edema formation and cellular alterations following spinal cord injury in the rat and their modification with p-chlorophenylalanine // Acta Neuropathol. 1990, 79(6), 604-610. 56. Olsson Y., Sharma H.S., Pettersson C.A. Effects of p-chlorophenylalanine on microvascular permeability changes in spinal cord trauma. An experimental study in the rat using 131I-sodium and lanthanum tracers // Acta Neuropathol. 1990, 79(6), 595-603. 57. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals — 2011, 8th edition, National Research Council of the National Academies, The National Academic Press, Washington DC, www.nap.edu, http:// oacu.od.nih.gov/regs/index.htm [Accessed on: May 25, 2011]. 58. Menon P.K. Effects of Cerebrolysin, a Mixture of Neurotrophins on Spinal Cord Injury in Relation to Nanoparticles Treatment: Master’s Thesis, Uppsala University, Biotechnology Program; Sharma H.S., supervisor. — Uppsala, Sweden, 2011. — P. 1-28. Перевод с англ. П. Огилько Оригинал статьи опубликован в CNS & Neurological Disorders — Drug Targets, 2012, № 11 www.mif-ua.com Получено 00.00.14 105 Preeti Kumaran Menon1, Dafin Fior Muresanu2, Aruna Sharma1, Herbert Mossler3, Hari Shanker Sharma1 Laboratory of Cerebrovascular Research, Department of Surgical Sciences, Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Hospital, Uppsala University, Uppsala, Sweden 2 Neurology Department, University of Cluj-Napoca, Cluj-Napoca, Romania 3 Ever NeuroPharma, Unterach, Austria 1 ÖÅÐÅÁÐÎ˲ÇÈÍ, ÙÎ ßÂËߪ ÑÎÁÎÞ ÊÎÌÏËÅÊÑ ÍÅÉÐÎÒÐÎÔ²×ÍÈÕ ÔÀÊÒÎвÂ, ÑÒÈÌÓËÞª ÂÈÐÀÆÅÍÓ ÍÅÉÐÎÏÐÎÒÅÊÖ²Þ Â ÏÀÖ²ªÍҲ ²Ç ÏÎØÊÎÄÆÅÍÍßÌ ÑÏÈÍÍÎÃÎ ÌÎÇÊÓ ÍÀ ÔÎͲ ²ÍÒÎÊÑÈÊÀÖ²¯ ØÒÓ×ÍÈÌÈ ÌÅÒÀËÅÂÈÌÈ ÍÀÍÎ×ÀÑÒÊÀÌ Резюме. Пошкодження спинного мозку (ПСМ) є одними із найбільш тяжких, ефективного методу їх лікування не існує. Деякі дослідження засвідчують, що наночастки можуть негативно впливати на патологічні зміни, пов’язані з ПСМ, і тим самим знижувати ефективність багатьох нейропротекторів. Отже, існує нагальна потреба в пошуку підходящих лікарських препаратів, що могли б звести до мінімуму посттравматичну спінальну патологію, що виникає на фоні інтоксикації наночастками. Упродовж останніх 7 років наша лабораторія займається пошуком терапевтичних стратегій, що могли б однаковою мірою зменшити захворюваність на спінальну патологію в інтактних тварин, а також у тварин із ПСМ, які піддалися впливу наночасток. Нами було виявлено, що щоденне введення щурам штучних металевих наночасток (наприклад, наночасток алюмінію, срібла й міді розмірами 50–60 нм) упродовж 7 днів (у дозі 50 мг/кг інтраперитонеально) призводило до загострення посттравматичної спінальної патології, що сильно корелювало з порушенням гематоспінального бар’єра щодо протеїнів сироватки. Проникнення білків плазми у спинний мозок призводить до утворення набряку й пошкодження нейронів. Таким чином, при створенні препаратів слід враховувати необхідність їх ефективності навіть у випадках, коли ПСМ викликано наночастками. Попереднє дослідження передбачає, що підходяща комбінація нейротрофічних факторів може викликати виражену нейропротекцію при ПСМ в інтактних тварин. Ми досліджували вплив Церебролізину, що являє собою комбінацію різних нейротрофічних факторів (наприклад, фактора росту нейронів головного мозку, нейротрофічного фактора гліальних клітин, фактора росту нейронів, циліарного нейротрофічного фактора та інших пептидних фрагментів), що застосовують при лікуванні інтактних щурів із ПСМ і щурів із ПСМ, які піддалися дії наночасток. Наші спостереження показали, що введення Церебролізину (у дозі 2,5 мл/кг внутрішньовенно) перед ПСМ забезпечило добру нейропротекцію в інтактних тварин; у той же час у групі щурів, які піддалися впливу наночасток, для стимуляції порівнянної нейропротекції в спинному мозку після ПСМ потрібне було введення більш високих доз препарату (5,0 мл/кг внутрішньовенно). Церебролізин також зменшував уміст води у спинному мозку, транссудацію білків плазми і кількість ушкоджених нейронів. Це означає, що Церебролізин, який застосовують у великих дозах, може бути препаратом вибору для лікування ПСМ на фоні інтоксикації наночастками. У цьому огляді обговорюються можливі механізми й функціональне значення цих результатів. Ключові слова: ушкодження спинного мозку, наночастки, срібло, мідь, алюміній, Церебролізин, нейротрофічні фактори, фактор росту нейронів головного мозку, нейротрофічний фактор гліальних клітин, циліарний нейротрофічний фактор, гематоспінальний бар’єр, набряк спинного мозку, ушкодження нейронів, спінальна патологія. Preeti Kumaran Menon1, Dafin Fior Muresanu2, Aruna Sharma1, Herbert Mossler3, Hari Shanker Sharma1 Laboratory of Cerebrovascular Research, Department of Surgical Sciences, Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Hospital, Uppsala University, Uppsala, Sweden 2 Neurology Department, University of Cluj-Napoca, Cluj-Napoca, Romania 3 Ever NeuroPharma, Unterach, Austria 1 CEREBROLYSIN, A MIXTURE OF NEUROTROPHIC FACTORS INDUCES MARKED NEUROPROTECTION IN SPINAL CORD INJURY FOLLOWING INTOXICATION OF ENGINEERED NANOPARTICLES FROM METALS Summary. Spinal cord injury (SCI) is the world’s most disastrous disease for which these is no effective treatment. Several studies suggest that nanoparticles could adversely influence the pathology of SCI and thereby alter the efficacy of many neuroprotective agents. Thus, there is an urgent need to find suitable therapeutic agents that could minimize cord pathology following trauma upon nanoparticle intoxication. Our laboratory has been engaged for the last 7 years in finding suitable therapeutic strategies that could equally reduce cord pathology in normal and in nanoparticle-treated animal models of SCI. We observed that engineered nanoparticles from metals e.g., aluminum, silver and copper (50–60 nm) when administered in rats daily for 7 days (50 mg/kg, i.p.) resulted in exacerbation of cord pathology after trauma that correlated well with breakdown of the blood-spinal cord barrier to serum proteins. The entry of plasma proteins into the cord leads to edema formation and neuronal damage. Thus, future drugs should be designed in such a way to be effective even when the SCI is influenced by nanoparticles. Previous research suggests that a suitable combination of neurotrophic factors could induce marked neuroprotection in SCI in normal animals. Thus, we examined the effects of 106 a new drug; cerebrolysin that is a mixture of different neurotrophic factors e.g., brain-derived neurotrophic factor, glial cell line derived neurotrophic factor, nerve growth factor, ciliary neurotrophic factor and other peptide fragments to treat normal or nanoparticle-treated rats after SCI. Our observations showed that cerebrolysin (2.5 ml/kg, intravenous) before SCI resulted in good neuroprotection in normal animals, whereas nanoparticle-treated rats required a higher dose of the drug (5.0 ml/kg, intravenous) to induce comparable neuroprotection in the cord after SCI. Cerebrolysin also reduced spinal cord water content, leakage of plasma proteins and the number of injured neurons. This indicates that cerebrolysin in higher doses could be a good candidate for treating SCI cases following nanoparticle intoxication. The possible mechanisms and functional significance of these findings are discussed in this review. Key words: spinal cord injury, nanoparticles, silver, copper, aluminum, cerebrolysin, neurotrophic factors, brain-derived neurotrophic factor, glial cell line derived neurotrophic factor, ciliary neurotrophic factor, blood-spinal cord barrier, spinal cord edema, neuronal injuries, spinal cord pathology. Ìåæäóíàðîäíûé íåâðîëîãè÷åñêèé æóðíàë, ISSN 2224-0713 N¹ 2(64), 2014
