Лабораторные показатели эндогенной интоксикации при раке

Международный научно-практический журнал «Лабораторная диагностика. Восточная Европа», Минск, 2012,
№4, с.79-87
УДК 618.14-006.6-005.1-08-06:616.15
Т.Ю. ПРИНЬКОВА1, В.И. ПРОХОРОВА2, Е.А. ХОТЬКО1, Т.П. ЦЫРУСЬ2, Л.М. ШИШЛО2,
А.Д. ТАГАНОВИЧ1
ЛАБОРАТОРНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ПРИ РАКЕ
ТЕЛА МАТКИ И ЗНАЧЕНИЕ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЛЯ ОЦЕНКИ СТАДИИ И
СТЕПЕНИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ОПУХОЛИ
1
2
УО «Белорусский государственный медицинский университет»
ГУ «РНПЦ онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова»
Введение
Рак тела матки (РТМ) остается важнейшей проблемой онкологии, занимая первое
место в мире по частоте среди злокачественных новообразований женских половых
органов и второе среди всей онкологической патологии у женщин. Ежегодно в мире
регистрируется
свыше
180 000
новых
случаев
РТМ.
В
Республике
Беларусь
заболеваемость в период с 2000 по 2009 г. увеличилась с 20,7 до 31,1 на 100 000 женщин.
Ведущими факторами для определения прогноза развития опухоли и выбора
тактики
лечения
являются
оценка
распространенности
опухоли
и
степени
ее
дифференцировки. Система клинико-морфологических критериев, используемых в
практической онкологии, позволяет судить о степени агрессивности опухолевого процесса
лишь после удаления опухоли, в то время как такая информация чрезвычайно важна на
дооперационном этапе. В связи с этим актуальным является поиск маркеров
неблагоприятного
методами,
течения
которые
рака, определяемых
позволили
бы
малоинвазивными
дополнительно
составить
лабораторными
представление
о
распространенности и степени дифференцировки опухоли до начала хирургического
лечения.
На сегодняшний день не существует значимых опухолевых маркеров для
дооперационной оценки прогрессирования РТМ, хотя их поиск ведется постоянно.
Изучается поведение раковых антигенов, факторов роста, молекул клеточной адгезии,
цитокинов, хемокинов, гормонов и других белков [1]. Стало понятно, что большинство
опухолевых маркеров в отдельности не обладает достаточной специфичностью и
чувствительностью.
В развитии рака существенную роль играет системное действие опухоли на
организм. Рост опухоли сопровождается развитием синдрома эндогенной интоксикации
(ЭИ). Согласно сложившемуся представлению, ЭИ – это состояние, обусловленное
деструктивными процессами, в результате которых в жидкостях и тканях организма
1
накапливаются в избытке промежуточные и конечные продукты нормального обмена
веществ и нарушенного метаболизма. К субстратам ЭИ относятся активные формы
кислорода,
продукты
модификации
перекисного
белков,
реакционно-способные
прогностически
перекиси,
молекулы.
неблагоприятным
окисления
кетоны,
липидов
спирты
Увеличение
признаком,
их
и
(ПОЛ)
другие
уровня
и окислительной
низкомолекулярные
в
крови
свидетельствующим
о
является
деградации
биополимеров и функционально-метаболических нарушениях [2].
Показатели окислительного стресса могут оказаться перспективными в качестве
молекулярных онкомаркеров, поскольку они изменяются в процессе канцерогенеза. Так,
малоновый
диальдегид
(МДА),
конечный
продукт
ПОЛ,
вследствие
своей
цитотоксичности обладает канцерогенным действием и способствует развитию опухоли
[3]. Увеличение количества МДА характерно для прогрессирования рака желудка,
молочной железы, лейкемии [4-6]. Уровень карбонильных производных белков
значительно повышен и используется в качестве маркера окислительного стресса при раке
легких, мочевого пузыря, толстой кишки [7-9].
Синдром ЭИ сопровождается увеличением в кровотоке концентрации молекул
средней массы (МСМ). МСМ оказывают влияние на жизнедеятельность всех систем и
органов. По своему строению они близки к регуляторным пептидам, способны
блокировать клеточные рецепторы, изменяя при этом внутриклеточный метаболизм [10].
Имеется тесная связь между концентрацией МСМ и усилением свободнорадикальных
процессов в организме, которые приводят к образованию продуктов перекисного
окисления липидов и белков [11].
МСМ способны формировать прочные комплексы с транспортными системами
крови. В этих условиях происходит конформационная модификация транспортных
компонентов крови, нередко, при сохранении их количественных характеристик. С ростом
опухоли в кровотоке повышается содержание опухолевых метаболитов, многими из
которых являются МСМ [12]. При этом уменьшается число возможных сайтов связывания
для транспорта альбумином других соединений, изменяется конформация белка.
В литературе нет сведений о взаимосвязи параметров ЭИ со степенью
дифференцировки опухоли и ее местным распространением при раке тела матки.
Отсутствуют данные, характеризующие связывающую способность альбумина при
данном виде рака. Не сформирована клинико-лабораторная концепция использования
показателей ЭИ в качестве маркеров прогрессирования опухолевого процесса.
Целью настоящего исследования явилось определение значимости содержания в
сыворотке крови молекул средней массы, продуктов ПОЛ и окислительной модификации
2
белков, связывающей способности альбумина в качестве предикторов распространенности
и степени дифференцировки опухоли у пациентов, страдающих раком тела матки.
Материалы и методы
Материалом для исследования служила сыворотка крови 65 пациенток,
проходивших лечение на базе РНПЦ «Онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н.
Александрова», с диагнозом рак тела матки в возрасте 29-80 лет (медиана – 58 лет).
Заключительный
диагноз
выставлялся
после
гистологического
подтверждения
злокачественного процесса. Группу контроля составили 16 практически здоровых женщин
в возрасте 38-71 лет (медиана – 57 лет) без онкологической патологии в анамнезе.
Контингент пациентов, страдающих РТМ, имел следующее распределение по
стадиям: IA (T1aN0M0) – 29,2%, IB (T1bN0M0) – 44,6%, IC (T1cN0M0) – 13,8%, IIA
(T2aN0M0) – 3%, IIB (T2bN0M0) – 6,2%, IIIA (T3aN0M0) – 1,5%, IIIC (T3cN0M0) – 1,5%.
Пациенты, страдающие РТМ, также были разделены на группы в зависимости от степени
дифференцировкии опухоли. В них вошли пациенты с высокой (G1 – grade 1) (n=29),
умеренной (G2 – grade2) (n=29), и низкой степенью дифференцировки опухоли (G3 – grade
3) (n=7).
Исследуемые компоненты ЭИ определяли у пациентов, страдающих РТМ, при
поступлении перед проведением лечения.
Интенсивность
процессов
ПОЛ
исследовали
по
накоплению
вторичных
продуктов липидной пероксидации, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБКРП)
[13].
Об уровне карбонильных производных белков (КПБ) судили по реакции
взаимодействия
окисленных
динитрофенилгидразином
с
аминокислотных
образованием
остатков
белков
2,4-динитрофенилгидразонов,
с
2,4-
которые
регистрировали спектрофотометрически при длине волны 363 нм [14].
Содержание МСМ, вторичных эндогенных токсинов пептидной природы,
определяли спектрофотометрическим методом Н.И. Габриэлян [15], который основан на
осаждении крупномолекулярных белков раствором трихлоруксусной кислоты. В
надосадочной жидкости остаются вещества низкой и средней молекулярной массы,
которые исследуют при длине волны 254 нм.
Структурно-функциональное состояние альбумина определяли методом ЭПРспектроскопии сыворотки крови, в которую добавляли свободнорадикальное соединение
– спиновую метку, 16-доксилстеариновую кислоту [16]. Метод основан на снижении
связывания спиновой метки при заполнении связывающих центров сывороточного
альбумина другими гидрофобными лигандами. Регистрацию спектров осуществляли на
3
ЭПР-спектрометре EPRA-9300. По ЭПР-спектру отношение несорбированной метки к
метке, связанной с альбумином, обозначается параметром α (ЭПР-α). Интегральный
параметр α отражает степень «загруженности» альбумина опухолевыми токсинами и
метаболитами.
Результаты исследования обработаны непараметрическими методами с помощью
программы «Statistica 8.0». Данные представлены в виде медиан и интерквартильных
размахов. Оценку достоверности различий между независимыми группами проводили с
использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Для изучения связей
между показателями вычисляли коэффициент корреляции Спирмена. Критическое
значение уровня значимости принимали равным 5%.
Результаты и обсуждение
Результаты проведенных исследований показали, что у пациентов, страдающих
РТМ, наблюдается достоверное возрастание исследуемых показателей эндогенной
интоксикации по сравнению с контрольной группой (таблица 1).
Таблица 1 – Уровень показателей эндогенной интоксикации в сыворотке крови пациентов,
страдающих раком тела матки
Исследуемый
показатель,
единицы измерения
ТБКРП, нмоль/мл
КПБ, мкмоль/мл
МСМ, опт. ед.
ЭПР-α, отн. ед.
Группы сравнения
Контрольная группа
n=16
2,50
(1,99; 3,01)
1,02
(0,78; 1,22)
0,29
(0,26; 0,30)
0,64
(0,53; 0,72)
Пациенты,
страдающие РТМ
n=65
3,97
(3,08; 5,13)
1,43
(0,92; 1,79)
0,34
(0,30; 0,38)
0,73
(0,59; 0,90)
Уровень
значимости (р)
0,000010
0,006556
0,000740
0,045225
Концентрация ТБКРП у пациентов, страдающих раком тела матки, была
примерно в 1,6 раза выше, чем в контрольной группе. Уровень КПБ превышал
контрольные показатели на 40,2%. Повышенное содержание МСМ отмечено в 74,6%
случаев РТМ. В среднем, уровень МСМ у пациентов, страдающих РТМ, на 17,2%
превышал значение этого показателя в группе контроля (р<0,01). ЭПР параметр α также
статистически достоверно увеличивался у пациентов, страдающих РТМ, на14,1% (p<0,05).
4
Таблица 2 – Значения параметров эндогенной интоксикации у пациентов, страдающих
раком тела матки, с различной распространенностью и степенью дифференцировки
опухоли
Исследуемые
Группы
Контроль
I стадия РТМ
(n=57)
Ia стадия РТМ
(n=20)
Ib стадия РТМ
(n=28)
Iс стадия РТМ
(n=9)
II стадия РТМ
(n=6)
G1 (грейд 1)
G2 (грейд 2)
G3 (грейд 3)
ТБКРП,
нмоль/мл
2,50
(1,99; 3,01)
3,97*
(3,21; 5,06)
3,65*
(3,01; 4,68)
4,04*
(2,88; 5,39)
4,42*
(3,59; 5,38)
3,62*
(2,63; 5,26)
3,78*
(3,08; 4,42)
4,10*
(2,88; 5,45)
4,42*
(3,65; 5,77)
КПБ,
мкмоль/мл
1,02
(0,78; 1,22)
1,46*
(0,99; 1,81)
1,33
(0,92; 1,65)
1,49*
(1,01;1,80)
1,68*
(1,18; 1,95)
1,16
(0,65; 1,56)
1,32
(0,90; 1,62)
1,49*
(1,16; 1,87)
1,46*
(0,97; 1,95)
МСМ,
опт. ед.
0,29
(0,26; 0,30)
0,34
(0,30; 0,37)
0,35*
(0,33; 0,37)
0,34*
(0,30; 0,38)
0,31
(0,27; 0,37)
0,40*#$
(0,39; 0,42)
0,33*
(0,29; 0,37)
0,35*
(0,31; 0,42)
0,33
(0,27; 0,39)
ЭПР-α,
отн. ед.
0,64
(0,53; 0,72)
0,70*
(0,55; 0,86)
0,71
(0,55; 0,80)
0,65
(0,56; 0,86)
0,82
(0,80; 1,00)
0,90*^#$
(0,75; 1,22)
0,71
(0,55; 0,96)
0,73*
(0,64; 0,98)
0,69
(0,59; 0,80)
Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контрольной группой; ^ - различия
#
достоверны по сравнению с Ia стадией РТМ; - различия достоверны по сравнению с Ib стадией
$
РТМ; - различия достоверны по сравнению с I стадией РТМ
Анализ концентрации ТБКРП у пациентов, страдающих раком тела матки I
стадии, когда опухоль ограничивается только телом матки, выявил увеличение уровня
этого показателя в сыворотке крови при 1а стадии на 46,0%, 1в – на 61,6%, 1с – на 76,8%,
в сравнении с группой условно здоровых пациентов (р<0,05). Увеличение уровня
окислительной модификации белков составило для пациентов 1а группы 30,4%, 1в –
46,0%, 1с – 64,7% по сравнению с группой контроля (р<0,05) (таблица 2). Между
группами пациентов с I и II стадиями РТМ значимых отличий зафиксировано не было.
Отмечалось даже незначительное снижение концентрации показателей окислительной
модификации белков и липидов у пациентов, страдающих РТМ, со II стадией по
сравнению с I стадией.
Концентрация МСМ и значения ЭПР-α несущественно изменялись по мере
увеличения глубины опухолевой инвазии в миометрий (Ia-Ic стадии РТМ). Достоверное
увеличение значений этих показателей имело место у пациентов, страдающих РТМ, со II
5
стадией
опухолевого
процесса
по
сравнению
с
I
стадией.
При
проведении
корреляционного анализа была выявлена прямая умеренная связь между значениями ЭПРα у пациентов, страдающих РТМ, и распространенностью опухолевого процесса
(rспирмена=0,32; p<0,05).
Анализ данных показывает, что уровень ТБКРП увеличивается у пациентов,
страдающих
РТМ,
по
мере
уменьшения
степени
дифференцировки
опухоли.
Концентрация ТБКРП была выше у пациентов с высокодифференцированным РТМ (G1)
на 51,2%, умереннодифференцированным (G2) – на 64%, низкодифференцированным (G3)
– на 76,8% по сравнению с контрольной группой. Отмечается увеличение концентрации
КПБ в сыворотке крови при раке тела матки. У пациентов в группах G2 и G3 (умеренно- и
низкодифференцированный рак) содержание КПБ возрастает, в среднем, на 45% по
сравнению с группой практических здоровых лиц. Разница статистически достоверна.
Концентрация МСМ возрастала уже при высокой степени дифференцировки опухоли (G1)
на 13,8%. При умеренной степени дифференцировки (G2) увеличение было таким же и
незначительно снижалось при низкой степени дифференцировки опухоли (G3).
Достоверное увеличение значений ЭПР-α по сравнению с группой контроля отмечено
только при умереннодифференцированном раке (G2).
Свободные радикалы играют важную роль в патогенезе рака, включая РТМ [1719], вызывая повреждения на различных уровнях клеточной организации. МДА, конечный
продукт
липопероксидации, и КПБ, продукты необратимого неферментативного
повреждения белков, являются индикаторами свободнорадикального окисления в клетках.
Высокое содержание КПБ в крови наблюдается при различных заболеваниях [20-21].
Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей и указывают
на увеличение интенсивности окислительного стресса в организме при раке [22-23].
Повышенная концентрация КПБ отражает не только степень окислительного стресса, но и
указывает на дисфункцию белков, вызванную развитием опухоли [23]. Наблюдаемое
повышение уровня показателей окислительной модификации белков и липидов крови у
пациентов, страдающих РТМ, с I стадией процесса по мере увеличения опухолевой
инвазии в миометрий свидетельствует об усилении процессов свободнорадикального
окисления при прогрессировании болезни. Как показывают полученные нами данные,
степень
выраженности
свободнорадикальных
процессов
зависит
также
от
гистопатологической градации опухоли при РТМ, о чем свидетельствует более высокая
концентрация ТБКРП и КПБ у пациентов с низкой степенью дифференцировки опухоли.
Повреждающее воздействие окислительного стресса на белки выражается в их
фрагментации и образовании белковых агрегатов [24]. Отражением степени фрагментации
6
белковых молекул, происходящей либо в результате непосредственного действия
активных форм кислорода, либо в результате повышения их чувствительности к
протеолизу в условиях окислительного стресса, является оценка содержания молекул
средней массы [10]. Действительно, их уровень был выше у всех групп пациентов,
страдающих РТМ, независимо от степени дифференцировки опухоли, по сравнению с
контрольной группой и достоверно повышался у пациентов со II стадией РТМ по
отношению к пациентам с I стадией.
Окислительная модификация белков не только изменяет аминокислотные
остатки, но и нарушает третичную структуру белков и даже вызывает агрегацию и
денатурацию. В результате снижается или исчезает их многообразная функциональная
активность [12]. Это подтверждается в нашем исследовании и проявляется нарушением
связывающей способности альбумина у пациентов, страдающих РТМ, причем степень
выраженности структурно-функциональных изменений основного транспортного белка
крови по показателю ЭПР-α коррелирует с распространенностью опухолевого процесса
(rспирмена=0,32; p<0,05).
Таким образом, в результате проведенных исследований выявлено, что при
канцерогенезе
тела
матки
наблюдается
аутоинтоксикация
организма.
Об
этом
свидетельствует увеличение в крови пациентов, страдающих РТМ, концентрации молекул
средней массы, продуктов перекисного окисления липидов и белков, снижение
связывающей способности альбумина.
Результаты исследования указывают на то, что степень выраженности избранных
нами для исследования показателей эндогенной интоксикации организма связана с
прогрессированием
РТМ.
Однако,
представляется
преждевременным
судить
об
отсутствии связи данных показателей со степенью дифференцировки опухоли при РТМ. С
одной стороны, имеются существенные различия медиан концентрации ТБКРП и КПБ. С
другой стороны, значительный интерквартильный размах, свидетельствует о большой
вариабельности значений исследуемых параметров ЭИ, что наводит на мысль о
возможности ее сокращения по мере увеличения количества пациентов, включенных в
исследование.
Существенное увеличение уровня МСМ у пациентов со II стадией РТМ по
сравнению с I стадией и наличие умеренной корреляции значений ЭПР-α с
распространенностью опухоли свидетельствует о том, что данные показатели могут быть
выделены в качестве кандидатов для дальнейшего исследования с целью определения их
значимости для диагностики стадии канцерогенеза при РТМ.
7
Литература
1. Development of multimarker panel for early detection of endometrial cancer. High
diagnostic power of prolactin / Z. Yurkovetsky [et al.] // Gynecol. Oncol. – 2007. –
Vol.107. – № 1. – P. 58–65.
2. Влияние интраоперационной лучевой терапии на перекисное окисление липидов и
антиоксидантный потенциал сыворотки крови больных раком желудка в
послеоперационном периоде / Афанасьева А.Н // Сибирский онкологический
журнал. – 2007. – № 4 (24). – С. 12–18.
3. Evaluation of oxidative stress parameters in blood of patients with laryngeal carcinoma /
A. Seven [et al.] // Clin. Biochem. – 1999. – Vol. 32. – P. 369–373.
4. Serum antioxidative vitamin levels and lipid peroxidation in gastric carcinoma patients /
M.A. Choi [et al.] // Cancer Letter. – 1999. – Vol. 136. – P. 1952–1956.
5. Plasma concentrations of lipid peroxidation products in children with acute leukemia / V.
Singh [et al.] // Ind. J. Med. Sci. – 2001. – Vol. 55. – P. 215–217.
6. Lipid peroxidation, free radical production and antioxidant status in breast cancer / G.
Ray [et al.] // Breast Cancer Res. and Treat. – 2000. – Vol.59. – P. 163–170.
7. Nitrated and oxidized protein in smokers and lung cancer patients / B. Pignatelli [et al.] //
Cancer Research. – 2001. – Vol. 61. – P. 778–784.
8. Relation between bladder and protein oxidation / I.A. Yilmaz [et al.] // Int. Urol. Nephrol.
– 2003. – Vol. 35. – P. 345–350.
9. Nonproteic antioxidant status in plasma of subjects with colon cancer / C.D. Giacomo [et
al.] // Exp. Biol. Med. – 2003. – Vol. 228. – P. 525–528.
10. Чаленко, В. Возможные причины повышения концентрации молекул средней
массы при патологии / В.В. Чаленко // Пат. физиология. – 1998. − №4. − С. 13–15.
11. Асташова, Т.А. Хромато-масс-спектрофотометрический анализ продуктов ПОЛ в
органах и тканях в условиях модели токсикоза / Т.А. Асташова, В.В. Асташов, С.В.
Морозов // Вопр. биол. мед. и фарм. химии. – 1998. – № 4. – С. 52–55.
12. Analysis of albumin-associated peptides and proteins from ovarian cancer patients / M.S.
Lowenthal [et al.] // Clinical Chemistry. – 2005. – Vol. 51. – №10. – P. 1933–1945.
13. Гончаренко, М.С. Метод оценки перекисного окисления липидов / М.С.
Гончаренко, А.М. Латинова // Лабораторное дело. – 1985. – № 1. – С. 60–61.
14. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins / R.L. Levine [et al.]
// Methods Enzymol. – 1990. – Vol. 186. – P. 464–478.
8
15. Габриэлян, Н.И. Определение средних молекул скрининг-методом / Н.И.
Габриэлян, А.А. Дмитриев // Клинич. медицина. – 1981. – № 10. – С. 38–42.
16. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине / А.А. Машевский и др. // М.:
Ириус. – 1994. – С. 177–181.
17. Oxidative stress in carcinogenesis. Correlation between lipid peroxidation and induction
of preneoplastic lesions in rat hepatocarcinogenesis / Y. Sanchez-Perez [et al.] // Cancer
Lett. – 2005. – Vol. 217. – P. 25–32.
18. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer / M. Valko [et
al.] // Chem. Biol. Interact. – 2006. – Vol. 160. – № 1. – P. 1–40.
19. Brown, N.S. Hypoxia and oxidative stress in breast cancer. Oxidative stress – its effects
on the growth, metastatic potential and response to therapy of breast cancer / N.S. Brown,
R. Bicknell // Breast Cancer Res. – 2001. – Vol. 3. – P. 323–327.
20. Biomarkers of oxidative stress in human disease / I. Dalle-Donne [et al.] // Clin. Chem. –
2006. – Vol. 52. – P. 601–623.
21. Protein carbonylation, cellular dysfunction and disease progression / I. Dalle-Donne [et
al.] // J. Cell. Mol. Biol. – 2006. – Vol. 10. – P. 389–406.
22. Measurement of oxidative stress and antioxidant status in acute lymphoblastic leukaemia
patients / V. Battisti // J. Clin. Biochem. – 2008. – Vol. 41. – P. 511–518.
23. Evaluation of oxidative stress in colorectal cancer patients / D. Chang [et al.] // J.
Biomed. Env. Scien. – 2008. – Vol. 21. – P. 286–289.
24. Окислительная модификация белков и олигопептидов у больных хроническими
дерматозами с синдромом эндогенной интоксикации / Т.В. Копытова и др. //
Фундаментальные исследования. – 2009. – № 6. – С. 25–29.
9