Изучение полиморфизмом генов EGF и VEGF у онкологических

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ EGF И VEGF У БОЛЬНЫХ РАКОМ
ЛЕГКОГО И ЯИЧНИКОВ
Н.Н.Чакова1, Е.П.Михаленко1, Е.Н.Шлома2, Э.В. Крупнова1, Ю.Е.Демидчик2,
Н.В.Чебатарева1, А.А.Жилко3
1
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск
Белорусский государственный медицинский университет, г.Минск
3
Минский городской клинический онкологический диспансер, Минск
2
Целью данной работы было изучение полиморфизма G+405С в гене
VEGF и полиморфизма А+61G в гене EGF у больных раком легкого и
яичников.
Обнаружена
ассоциация
изучаемых
полиморфизмов
и
клинических характеристик опухолей.
Ключевые слова: рак легкого, рак яичников, гены EGF и VEGF
EGF AND VEGF GENE POLYMORPHISMS IN LUNG AND OVARIAN
CARCINOMAS
N.N.Chakova, E.P.Mikhalenko, E.N.Shloma, E.V.Krupnova, Yu.E.Demidchik,
N.V.Chebotareva, A.A.Zhilko
The aim of the study was to investigate polymorphism G+405C in VEGF
gene and polymorphism A+61G in EGF gene for lung cancer and ovarian
carcinomas patients. The impact of mentioned polymorphisms on clinical
characteristics of tumors was revealed.
Key words: lung cancer, ovarian carcinomas, EGF and VEGF genes
1
ВВЕДЕНИЕ
Ежегодно в мире диагностируется более 10 миллионов больных
первичными злокачественными новообразованиями [1]. Рак яичников и
карциномы легкого представляют собой наиболее частые и в большинстве
случаев трудноизлечимые опухолевые заболевания [2 – 6].
Несмотря на усовершенствование уже имеющихся и внедрение новых
методов диагностики, в 60-80% случаев эти заболевания выявляются в III-IV
стадии [7, 8], что в свою очередь, негативно сказывается на прогнозе.
В настоящее время огромное число фундаментальных исследований
сфокусировано на поиске генетических маркеров предрасположенности к
возникновению карцином для осуществления ранней диагностики, с одной
стороны, и выявлении факторов, позволяющих прогнозировать развитие
заболевания и оптимизировать методы лечения [9 – 11].
К
настоящему
моменту
накоплено
множество
данных,
подтверждающих участие факторов роста, в частности VEGF (фактор роста
эндотелия сосудов) и EGF (эпидермальный фактор роста), ответственных за
митогенную
активность
злокачественных
перспективными
клеток,
новообразований
мишенями
при
в
развитии
и,
и
прогрессировании
следовательно,
использовании
Зарубежными исследователями обнаружены
являющихся
таргетной
терапии.
функционально значимые
полиморфизм G+405С в гене VEGF [12] и полиморфизм А+61G в гене EGF
[13].
EGF представляет собой один из лигандов рецептора эпидермального
фактора роста (EGFR), экспрессирующегося на поверхности как нормальных,
так и трансформированных эпителиальных клеток и являющегося решающим
трансмембранным тирозин-киназным рецептором в регуляции клеточного
роста и дифференцировки. EGF/EGFR взаимодействие – функционально
важный аутокринный путь, который является промотором развития опухоли.
Повышенная экспрессия EGF усиливает инвазию и метастазирование
опухоли,
запуская
целый
каскад
внутриклеточных
процессов,
2
инициирующих клеточную пролиферацию и ряд других биологических
эффектов, ответственных за опухолевую прогрессию: адгезию и инвазию
трансформированных клеток, включение антиапоптотических механизмов
[14, 15].
EGF может также индуцировать процессы опухолевого ангиогенеза за
счет
гиперэкспрессии
VEGF
[16,
17],
который представляет
собой
гликопротеин и является одним из самых важных стимуляторов ангиогенеза
в разнообразных по характеристикам здоровых и поражѐнных раком тканях
[18]. Свои функции VEGF выполняет через тирозин-киназные рецепторы,
расположенные в мембране эндотелиальных клеток.
Целью данной работы было изучение влияния полиморфизма генов
EGF и VEGF на риск возникновения и развития рака легкого и яичников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование включено 79 больных РЛ и 36 больных РЯ,
проходивших лечение в Минском городском клиническом онкологическом
диспансере.
По результатам гистологического исследования у 49 (62,0%) больных
РЛ установлен плоскоклеточный РЛ, у 23 (29,1%) – аденокарцинома, в 7
(8,9%) случаях – мелкоклеточный РЛ. Все случаи заболеваний РЛ были
классифицированы по системе TNM в соответствии с требованиями
Международного Противоракового Союза (UICC, версия 2002 года).
Распределение больных по стадиям было следующим: I стадия – 44 (55,6%)
пациента, II стадия – 6 (7,7%), III стадия – 20 (25,3%) и IV стадия – 9 (11,4%).
Преобладающим гистологическим вариантом РЯ был серозный тип,
установленный в 23 (63,9%) случаях, муцинозная аденокарцинома выявлена
у 3 (8,3%) больных, эндометриоидная – у 6 (16,7%), светлоклеточный рак – у
2 (5,6%), другие виды – у 2 (5,6%) пациенток. При оценке степени
распространения
опухоли
по
классификации
FIGO,
в
28
(77,8%)
наблюдениях выявлена III и IV стадия заболевания.
3
Сопутствующие
заболевания
диагностированы
у
большинства
онкологических больных. У всех больных чаще всего встречались болезни
сердечно-сосудистой системы, на втором месте у пациенток с РЯ были
заболевания желудочно-кишечного тракта, а у больных РЛ – заболевания
органов дыхания.
Контрольная группа была представлена выборкой из 124 человек без
онкологических заболеваний (49 мужчин и 75 женщин), проживающих в г.
Минске. Для элиминации влияния факторов, заведомо изменяющих
вероятность развития заболевания, при формировании контрольных групп
был использован метод направленного подбора с учетом возраста, пола,
статуса курения, профессиональной принадлежности.
Исследование полиморфизма генов EGF (А+61G) и VEGF (G+405С)
проводилось методом ПЦР-ПДРФ анализа. Выделение тотальной ДНК из
лейкоцитов периферической крови выполняли методом Mathew [19].
Для амплификации гена EGF использовали праймеры и условия ПЦР,
предложенные Shahbazi et al [13]. Полученные фрагменты амплификации
длиной 242 п.н. обрабатывали эндонуклеазой AluI. Генотипы, выявляемые в
ходе анализа гена EGF, идентифицировали по длине полученных в ходе
рестрикции фрагментов: GG (193 п.н.), GA (193 п.н.+102 п.н.+ 91 п.н.), AA
(102 п.н.+ 91 п.н.) (рисунок 1).
4
Рисунок 1. – Электрофореграмма фрагментов амплификации
полиморфных аллелей гена EGF: 1 – до рестрикции; 2,3,4 – после обработки
рестриктазой AluI
Праймеры для амплификации VEGF взяты из работы Lee et al. [20],
условия ПЦР подбирались экспериментально. Для определения G+405С
полиморфизма амплифицированные фрагменты длиной 273 п.н. подвергали
рестрикционному расщеплению эндонуклеазой BsmFI. Продукты рестрикции
фракционировали в 2,2% агарозном геле с бромистым этидием и
визуалировали в УФ-свете. Генотипы VEGF идентифицировали по длине
полученных в ходе рестрикции фрагментов: GG (166 п.н. + 107 п.н.), GC (273
п.н. + 166 п.н.+ 107 п.н.), CC (273 п.н.) (рисунок 2).
Рисунок 2. – Электрофореграмма фрагментов амплификации
полиморфных аллелей гена VEGF: 1 – до рестрикции; 2,3,4 – после
обработки рестриктазой BsmFI
Статистическая обработка материала проводилась с использованием
пакета прикладных программ “Statistica for Windows 6.0”.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты
генотипирования
EGF
у
больных
с
различными
гистологическими вариантами РЛ представлены в таблице 1. Анализ данных
показал отсутствие достоверных различий по частоте встречаемости
5
генотипов между группой больных РЛ и контролем. Однако было
обнаружено, что количество носителей генотипа АА в группе больных
(17,7%) в 1,7 раза ниже, чем в контрольной группе (29,0%), а у больных
плоскоклеточным РЛ этот генотип встречался еще реже (12,2%), при этом
отличие от контроля было достоверным (χ2=5,91, р<0,05).
Таблица 1. Распределение частот генотипов и аллелей гена EGF у больных
РЛ
Группа
GG
Генотип
GA
Аллель
AA
G
A
Больные РЛ, n=79
24 (30,3%) 41(52,0%) 14 (17,7%)
89(56,3%)
69 (43,7%)
Плоскоклеточный, n=49 17(34,6%) 26(53,2%) 6(12,2%)*
60 (61,2%)
38 (38,8%)
Аденокарцинома,n=23
4(17,6%)
12(52,1%) 7(30,4%)
20 (43,4%)
26 (56,6%)
Мелкоклеточный, n=7
3(43%)
3(43%)
1(14%)
9 (64,0%)
4 (56,0%)
Контроль, n=124
34 (27,4%) 54(43,5%) 36(29,0%)
122 (49,2%) 126 (50,8%)
Примечание: * – р < 0.05, р – уровень значимости различий по критерию 2 в сравнении с
контрольной группой
Интересные данные были выявлены у больных аденокарциномой:
генотип АА встречался с той же частотой, что и в контроле, а вот процент
носителей генотипа GG (17,6%) был снижен в 1,5 раза по сравнению с
контролем (27,4%). Полученные данные, вероятно, указывают на то, что
формирование определенного гистологического типа опухоли, в частности
плоскоклеточного рака легкого или аденокарциномы, в какой-то мере
обусловлено генотипом EGF. Действительно, среди носителей генотипа GG
плоскоклеточная форма РЛ была выявлена у 81% пациентов, в группе
больных с генотипом GА такой гистологический тип обнаруживался у 68%, и
только у 56% больных с генотипом АА была диагностирована эта форма РЛ
(рисунок 3).
6
Кол-во больных, %
100
80
60
40
20
0
GG
GA
плоскоклеточный РЛ
AA
аденокарцинома
Рис. 3. Влияние генотипа на вероятность развития гистологической
формы РЛ
Можно предположить, что вероятность заболеть какой-либо формой из
двух находится в зависимости от генотипа: у больных с генотипом GG
вероятность возникновения плоскоклеточной формы рака в 4 раза выше, чем
аденокарциномы (χ2=13,05, р=0,0003), при генотипе GA вероятность заболеть
плоскоклеточным раком легкого или аденокарциномой соответствует
пропорции 2:1 (χ2=7,93, р=0,048), при наличии генотипа АА возможность
заболеть той или иной формой становится равновероятной (χ2=0,08, р=0,7).
Однако обнаруженные тенденции носят все же предварительный характер, и
требуют более тщательной проверки.
Оценка зависимости размера опухоли от генотипа показала, что в
целом в группе больных РЛ с размером опухоли менее 3 см (индекс Т1 по
классификации ТNM) частота носителей генотипа АА (25%) была в 2 раза
выше, чем у пациентов с размером опухоли более 3 см (12%) (рисунок 4).
Кол-во больных,%
70
60
50
40
30
20
10
0
GG
GA
размер опухоли < 3 см
AA
размер опухоли > 3 см
7
Рисунок 4. – Частота распределения генотипов у больных РЛ с
различным размером опухоли
Полученные нами данные свидетельствуют о влиянии полиморфизма
А+61G гена EGF на предрасположенность к возникновению РЛ, и некоторые
клинические характеристики опухоли и согласуются с результатами других
исследователей. Из литературных источников известно, что мононуклеарные
клетки с генотипом АА in vitro продуцируют достоверно меньший уровень
эпидермального фактора роста, чем клетки,
имеющие аллель G [13].
Показано также, что при ряде опухолей эпителиальной природы, в частности
при раке печени и кишечника, пациенты с генотипом АА имели меньший
уровень экспрессии EGF в тканях по сравнению с пациентами, имеющими
генотипы GG и GA [21, 22]. Меньший уровень экспрессии EGF при наличии
генотипа АА, по-видимому, и обеспечивает протективное действии данного
генотипа в предрасположенности к возникновению РЛ и в отношении
прогноза развития заболевания.
В
настоящий
момент
нами
начато
изучение
генетического
полиморфизма EGF у больных РЯ. Данные результатов генотипирования
EGF в этой группе пациентов представлены в таблице 2.
Таблица 2. – Распределение частот генотипов и аллелей гена EGF у больных
РЯ
Группа
Больные РЯ,
n=36
Контроль,
n=75
GG
9 (25,0%)
Генотип
GA
23 (63,9%)
23 (30,7%) 33 (44,0%)
Аллель
AA
4 (11,1%)
G
41(56,9%)
A
31 (43,1%)
19(25,3%) 79 (52,6%)
71 (47,4%)
Частота генотипов распределилась следующим образом: GG – 25,0%,
GA – 63,9%, АА – 11,1%. Количество носителей генотипов GG и GA у
больных злокачественной карциномой яичников (88,9%) была несколько
выше, чем в контрольной группе (74,7%), а частота встречаемости носителей
8
благоприятного генотипа АА в группе больных была в 2,2 раза ниже по
сравнению с контрольной. При этом у больных с III-IV стадией заболевания
генотип GG встречался в 2 раза чаще, чем у больных на ранних стадиях
развития опухоли. Таким образом, при сравнение частоты встречаемости
генотипов у больных РЯ с контрольной группой, были обнаружены те же
тенденции, что и у больных РЛ.
Одним
из
основных
факторов
выживания
и
распространения
опухолевых клеток является ангиогенез. Ключевую роль в формировании
новой
сосудистой
сети
при
развитии
опухоли
играет
семейство
эндотелиальных факторов роста сосудов – VEGF [18]. Появление новых
сосудов способствует прогрессированию заболевания, увеличивая темпы
роста опухоли и ее способность к метастазированию. Оценка ангиогенеза
опухоли является важной для прогнозирования течения болезни и назначения
химиотерапии при многих злокачественных опухолях.
Анализ данных по генотипированию VEGF (позиция G+405С) у
больных раком легкого, представленный в таблице 3, не выявил различий в
распределении частоты встречаемости генотипов GG/GС/СС гена VEGF
между группой пациентов (0,31:0,56:0,13) и контролем (0,31:0,53:0,16).
Однако существовали заметные различия в распределении генотипов между
группами больных плоскоклеточным раком легкого и аденокарциномой:
среди больных с аденокарциномой генотип GG встречался в 2 раза чаще, чем
у пациентов с плоскоклеточным РЛ, а носителей генотипа СС у больных
аденокарциномой в нашей группе обследованных пациентов не было
обнаружено. Было также показано, что генотип СС встречается в 2 раза чаще
у больных РЛ с наличием метастазов (N1-3) по сравнению с пациентами,
имеющих опухоли без метастазов (N0).
Таблица 3. – Распределение частот генотипов и аллелей гена VEGF у
больных РЛ
Группа
GG
Генотип
GC
Аллель
CC
G
C
9
Больные РЛ, n=39
Плоскоклеточный, n=25
Аденокарцинома, n=11
Мелкоклеточный,n=3
Контроль, n=55
I-II стадии, n=27
III-IV стадии, n=12
N0, n=26
N1-3, n=13
12 (30,8%)
6 (24,0%)
6 (54,5%)
0
17(31%)
9 (33,4%)
3 (25%)
9(34%)
3 (23%)
22 (56,4%)
14 (56%)
5 (45,5%)
3 (100%)
29(53%)
14(51,8%)
8 (66,8%)
13 (50%)
9 (70%)
5(12,8%)
5 (20%)
0
0
9(16%)
4 (14%)
1 (8,2%)
4 (16%)
1 (7%)
46 (59,0%)
26 (52,0%)
17 (77,2%)
3 (50,0%)
63(57%)
32 (59%)
14 (58%)
31 (59%)
15 (57%)
32 (41,0%)
24 (48,0%)
5 (22,8%)
3 (50,0%)
47 (43%)
22 (41%)
10 (42%)
21 (41%)
12 (43%)
Данные молекулярного анализа гена VEGF у больных РЯ представлены
в таблице 4. Распределение частот встречаемости генотипов GG/GС/СС гена
VEGF было следующим: в группе пациентов – 0,45:0,52:0,03, в контроле –
0,31:0,58:0,11.
Таблица 4. Распределение частот генотипов и аллелей гена VEGF у больных
РЯ
Группа
Больные раком
яичников, n=33
Контроль, n=26
I-II n=7
III-IV n=25
Генотип
GG
GC
CC
15(45,5%) 17(51,5%) 1(3,0%)
G
C
47(71,2%) 19(28,8%)
8(30,8%)
1(14%)
14(56%)
31(59,6%) 21(40,4%)
8(57%)
6 (43%)
38 (76%) 12 (24%)
15(57,7%) 3(11,5%)
6(86%)
0
10(40%)
1(4%)
Аллель
Было выявлено, что частота встречаемости носителей генотипа СC у
больных злокачественной карциномой яичников (3%) была ниже, чем в
контрольной группе (11,0%), а частота встречаемости носителей генотипа
GG в группе больных была в 1,5 раза выше по сравнению с контрольной. При
этом у больных с III-IV стадией заболевания генотип GG встречался в 4 раза
чаще, чем у больных с I-II стадиями развития опухоли.
Обнаруженные тенденции носят предварительный характер в связи с
недостаточным количеством обследованных больных, однако они не
противоречат результатам других исследователей [23 – 27]. Результаты
нескольких работ выявили отсутствие ассоциации полиморфизма в позиции
+405 гена VEGF с возникновением некоторых вариантов рака, включая РЛ
10
[23] и РЯ [25], однако показали его влияние на степень дифференцировки
опухоли у больных меланомой [26], раком простаты [27], раком молочной
железы [24], а также на выживаемость у больных РЛ и РЯ. Обнаруженное
влияние полиморфизма в области +405 на развитие опухолевого процесса
может быть обусловлено различиями в экспрессии VEGF у индивидов с
разными генотипами. Watson et al. [12] в своих исследованиях показал, что
наибольший уровень экспрессии белка VEGF был в мононуклеарных клетках
периферической крови с генотипом GG, промежуточный уровень – в клетках
с генотипом GС и наименьший – в клетках с генотипом СС. Имеются также
сведения, что повышенный уровень экспрессии VEGF чаще наблюдается у
больных с опухолями высокой степени злокачественности.
Таким
образом,
проведенное
исследование
подтверждает
функциональную значимость полиморфизмов G+405С в гене VEGF и А+61G
в гене EGF в отношении прогноза развития РЛ и РЯ. В дальнейшем
планируется изучение уровня экспрессии VEGF в тканях больных раком
яичника
для
оптимизации
лечении,
т.к.
VEGF
считается
важной
терапевтической мишенью противоопухолевой терапии [18].
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Эпидемиология
злокачественных
новообразований
в
Беларуси
/
И.В. Залуцкий [и др.] – Минск: Зорны верасень, 2006. – 207с.
2. Давыдов, М.И. Смертность населения России и стран СНГ от
злокачественных новообразований в 2005г. / М.И. Давыдов, Е.М. Аксель //
Вестник российского онкологического цента имени Н.Н, Блохина РАМН.
– 2007. – том 18, №2 (прил. 1). – С. 90 – 136.
3. Up-Regulated Expression of Cytoplasmic Clusterin in Human Ovarian
Carcinoma / Dan Xie [et al] // Cancer. – 2005. – Vol. 103, № 2. – P. 277 – 283.
4. Podratz, K. Advanced Ovarian Cancer: Surgical Management / К. Podratz,
G. Aletti, W. Cliby // International congress «Ovarian cancer», Krakow, 18-21
11
June 2008 / Jagellonian University Faculty of Medicine; А. Basta. – Krakow,
2008. – Р. 7 – 8.
5. Ethnic Differences in Survival among Women with Ovarian Carcinoma / Jill S.
Barnholtz-Sloan [et al] // Cancer. – 2002. – Vol. 94, № 7. – P. 1886 – 1893.
6. Клиническая онкология: справ. пособие / С.З. Фрадкин [и др.]; под ред.
С.З. Фрадкина, И.В. Залуцкого. – Минск: Беларусь, 2003. – 784 с.
7. Опухоли женской репродуктивной системы / В. В. Баринов [и др.]; под
общ. ред. М. И. Давыдова, В. П. Летягина, В. В. Кузнецова. – М.: ООО
«Медицинское информационное агентство», 2007. – 376 с.
8. Давыдов, М.И. Заболеваемость злокачественными новообразованиями
населения России и стран СНГ в 2005г. / М.И. Давыдов, Е.М. Аксель //
Вестник российского онкологического цента имени Н.Н, Блохина РАМН.
– 2007. – том 18, №2 (прил. 1). – С. 52 – 89.
9. Бахидзе, Е.В. Значение методов исследований генома для диагностики и
терапии рака яичника / Е.В. Бахидзе, А.В. Малек // Вопросы онкологии . –
2005. – Том 51, № 2. – С. 173 – 181.
10.Малек, А.В. Поиск генов-мишений для диагностики и терапии рака
яичника / А.В. Малек, Е.В. Бахидзе // Вопросы онкологии. – 2005. –
Том 51, №2. – С. 182 – 186.
11.Озолиня, Л.А. Перспективы ранней диагностики рака эндометрия и
яичников / Л.А. Озолиня // Российский вестник акушера-гинеколога. –
2005. – Том 5, №1. – С.32 – 35.
12.Identification of polymorphism within the vascular endothelial growth factor
(VEGF) gene: correlation with variation in VEGF protein production / C.J.
Watson [et al] // Cytokine. – 2000. – Vol. 12. – P. 1232 – 1235.
13.Association between functional polymorphism in EGF gene and malignant
melanoma / M. Shahbazi [et al] // Lancet. – 2002. – Vol. 359. – P. 397 – 401.
14.Bridges, A.J. The rationale and strategy used to develop a series of highly
potent, irreversible, inhibitors of the epidermal growth factor receptor family of
12
tyrosine kinases / A.J. Bridges // Curr. Med. Chem. – 1999. – Vol. 6. – P. 825 –
843.
15.Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human
malignancies / D.S. Salomon [et al] // Crit. Rev. Oncol. Hematol. – 1995. – Vol.
19. – P. 183 – 232.
16.Woodburn, J.R. The epidermal growth factor receptor and its inhibition in
cancer therapy / J.R. Woodburn // Pharmacol. Ther. – 1999. – Vol. 82. – P. 241
– 250.
17.Ferrara, N. The biology of VEGF and its receptors / N. Ferrara, H.P. Gerber, J.
Le Couter // Nat. Med. – 2003. – Vol. 9. – P. 669 – 676.
18.Mathew, C.C. The isolation of high molecular weight eucaryotic DNA / C.C.
Mathew // in Walker JMNJ (ed): Methods in Molecular Biology, Clifton:
Human Press, 1984. – Vol. 2. – P.31-34.
19.Vascular Endothelial Growth Factor Gene Polymorphisms and Risk of Primary
Lung Cancer / S.J. Lee [et al] // Canc. Epid. Biom. and Prev. – Vol. 14. – P. 571
– 575.
20.Epidermal Growth Factor Gene Functional Polymorphism and the Risk of
Hepatocellular Carcinoma in Patients With Cirrhosis / K.K. Tanabe [et al] //
JAMA. – 2008. – Vol. 299, N 1 – P. 53 – 60.
21.Epidermal growth factor (EGF) A61G polymorphism and EGF gene expression
in normal colon tissue from patients with colorectal cancer / K.L. Spindler [et
al] // Acta Oncol. – 2007 – Vol. 46, N 8. – P. 1113 – 1117.
22.VEGF polymorphisms and survival in early-stage non-small-cell lung cancer /
R.S. Heist [et al] // J. Clin. Oncol. – 2008. – Vol. 26, N 6. – P. 856 – 862.
23.Vascular endothelial growth factor polymorphisms in relation to breast
cancerdevelopment and prognosis / Q. Jin [et al] // Clin. Cancer Res. – 2005. –
Vol. 11, N 10. – P. 3647-3653.
24.Vascular Endothelial Growth Factor Gene Polymorphisms Are Associated with
Prognosis in Ovarian Cancer / L.A. Hefler [et al] // Clin. Cancer Res. -2007. –
Vol. 13. – P. 898 – 901.
13
25.Influence
of
vascular
endothelial
growth
factor
single
nucleotide
polymorphismson tumour development in cutaneous malignant melanoma /
W.M. Howell [et al] // Genes. Immun. – 2002. – Vol. 3, N 4. P. 229 – 232.
26.Association of VEGF genetic polymorphisms with prostate carcinoma risk and
clinical outcome / S. Sfar [et al] // Cytokine. – 2006. – Vol. 35, N 1 – 2. – P. 21
– 28.
14