влияние тяжелых металлов на активность ключевых ферментов глиоксилатного цикла
advertisement
УДК 577.152.:582.736.3]:546.30 влияние тяжелых металлов на активность ключевых ферментов глиоксилатного цикла и содержание тбк-активных продуктов в семенах сои glicine max l. при проращивании Е. Ф. БЕЗДУДНАЯ, П. А. КАЛИМАН Харьковский национальный университет им. В. Н. Каразина, Украина; e-mail: Pavel.A.Kaliman@univer.kharkov.ua Определено влияние CoCl2 и CdCl2 на активность изоцитратлиазы, малатсинтазы и NAD-зависимой малатдегидрогеназы в семядолях, а также содержание ТБК-активных продуктов на ранних этапах проращивания семян сои: через 1, 3 и 5 суток. Показано, что при проращивании семян сои на среде, не содержащей солей металлов, изоцитратлиазная активность значительно повышается на 5-е сутки, а малатсинтазная – повышается на 3-и сутки и снижается на 5-е сутки. CoCl2 активирует изоцитратлиазную активность уже на 3-и сутки роста семян и тормозит малатсинтазную – на 5-е сутки. В этих условиях отмечено удлинение первичного корешка. CdCl2 ингибирует изоцитратлиазную активность в 1-е сутки прорастания, а малатсинтазную – на 5-е сутки. При этом незначительно тормозится рост корешка. CoCl2 повышает содержание ТБК-активных продуктов во все сроки проращивания, а CdCl2 – на 3-и и 5-е сутки. Обсуждается роль ферментов глиоксилатного цикла в превращении жирных кислот в углеводы в формировании первичного корешка при проращивании семян сои. К л ю ч е в ы е с л о в а: изоцитратлиаза, малатсинтаза, малатдегидрогеназа, ТБК-активные продукты, семядоли сои, кадмия хлорид, кобальта хлорид. С емена масличных культур запасают жиры главным образом в виде тригли­ церидов. При набухании семян жиры расщепляются и жирные кислоты превраща­ ются в глиоксилатном цикле в глюкозу, которая используется для формирования первичного корешка [1]. Ферменты глиоксилатного цик­ ла – изоцитратлиаза и малатсинтаза – постав­ ляют субстраты (сукцинат и малат), превращаю­ щиеся в углеводы в реакциях глюконеогенеза. Вовлечение жирных кислот как в энергетичес­ кий обмен, так и в глиоксилатный цикл осу­ ществляется в реакциях β­окисления. Первая реакция β­окисления жирных кислот в глиок­ сисомах катализируется ацил­КоА­оксидазой [2], которая утилизирует молекулярный кис­ лород, в результате чего образуется пероксид водорода (H2O2) – активная форма кислорода и регуляторная молекула, разрушающаяся впо­ следствии каталазой. При несбалансированных скоростях образования H2O2 и его разрушения, последний активирует пероксидное окисление липидов (ПОЛ). Избыточное накопление про­ дуктов ПОЛ проявляется в виде повышения содержания ТБК­активных продуктов. На процессы прорастания семян и уро­ жайность культурных растений в естествен­ ных условиях оказывают влияние многие фак­ торы среды. Так, в связи с производственной ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 1 деятельностью человека в последние годы усилилось загрязнение почвы и грунтовых вод солями тяжелых металлов, которые при избыточном поступлении в ткани растений могут оказывать токсическое действие как непосредственно, так и путем активирования свободнорадикального окисления и последую­ щего развития оксидативного стресса. Поскольку ферменты глиоксилатного цикла регулируют реакции превращения жир­ ных кислот в углеводы и утилизацию послед­ них при формировании гипокотиля, изучение их активности в условиях загрязнения почв и грунтовых вод солями тяжелых металлов пред­ ставляет значительный интерес для прогнози­ рования прорастания семян культурных расте­ ний и их урожайности. Co2+ – эссенциальный микроэлемент, не­ обходимый для образования кобальтсодержа­ щих ферментов, тогда как Cd2+ относится к токсичным микроэлементам. В связи с вышеизложенным, в работе было изучено влияние солей кобальта и кадмия на активность ферментов глиоксисом и содержа­ ние ТБК­активных продуктов в прорастающих семенах сои. Изучение активности вышеуказанных ферментов в различных условиях прорастания семян позволит глубже подойти к пониманию 83 ЕКсПЕрИМЕНТАЛьНі рОБОТИ процессов онтогенеза растений, что имеет как теоретическое, так и практическое значение. материалы и методы В работе использованы следующие реак­ тивы: фенилгидразин гидрохлорид, NADН («Merck», Германия), DL­изоцитрат натрия («Sigma», США), трис­HCl, ЭДТА, дитиотрей­ тол («Reanal», Венгрия), DL­малат («Sharlou Chemia», Испания), ацетил­коэнзим­А («Aldrich», Аргентина), глиоксилат натрия («Sigma», Канада). Все остальные реактивы отечественного производства. Объектом исследований служили неиме­ ющие внешних повреждений, одинаковые по размеру семена сои сорта Clark урожая 2006. Для наружного обеззараживания семена по­ гружали в 2,5%­й раствор гипохлорита натрия на 2 мин, после чего нейтрализовали 0,05 М HCl в течение 20–30 сек и далее трехкратно промывали дистиллированной водой. Проращивание семян в контроле про­ водили в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной дистиллированной водой (pH = 5,8), при t = 23 ± 2 °С в термостате в темноте. При исследовании влияния солей ме­ таллов среда проращивания содержала CoCl 2 и CdCl2 в концентрациях 10­4 М. Мы исходили из данных литературы о том, что соли металлов в концентрации 10­4 М активируют свободнора­ дикальное окисление в проростках гороха [3]. Растворы солей стерилизовали в автоклаве в режиме 0,5 атм в течение 30 мин. Семена по­ крывали растворами CoCl 2, CdCl2 и водой на 1/4 с заменой растворов через 1 сут. В экспериментах использовали семядоли прорастающих в течение 1, 3 и 5 суток семян. Выделение микротелец проводили путем осторожной гомогенизации свежей раститель­ ной ткани в 10 мл охлажденной среды следу­ ющего состава: 50 мМ трис­HCl­буфер, рH 7,5; 0,5 М сахароза; 1мМ ЭДТА; 5 мМ дитиотрей­ тол (ДТТ), 1 мМ MgCl 2. Время экстракции со­ ставляло 35–40 мин при периодическом поме­ шивании с интервалом 5–10 мин [4]. Гомогенат отжимали через четыре слоя марли и центри­ фугировали на центрифуге ЦЛР­32 в течение 10 мин при 1300 g [5]. Полученный рыхлый осадок, содержащий неполностью разрушен­ ные клетки и ядра, отбрасывали. Надосадоч­ ную жидкость далее центрифугировали в тече­ ние 20 мин при 14 000 g. Осадок, содержащий фракцию клеточных органоидов (грубая фрак­ ция микротелец), разрушали путем погруже­ ния проб в жидкий азот и ресуспендировали в 2 мл 50 мМ трис­HCl­буфера, рН 7,4, содержа­ 84 щего 1 мМ MgCl2, 5 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА. За­ тем проводили повторное центрифугирование в течение 15 мин. Поскольку изоцитратлиаза легче высвобождается в исследуемом объекте, полученный осадок растворяли в 0,4%­м ди­ гитонине и центрифугировали повторно в ука­ занном выше режиме [6]. В супернатант пере­ ходили ферменты, связанные с мембранами. С целью достижения необходимого размера мик­ ротелец проводили осветляющую фильтрацию через мембранные фильтры («Millipore», США) с диаметом пор 0,45 мкм, а затем – стерили­ зующую фильтрацию через мембранные филь­ тры с диаметром пор 0,22 мкм [7]. Активность изоцитратлиазы (КФ 4.1.3.1) определяли на полуавтоматическом анализа­ торе Carmey multi при длине волны 324 нм [8]. Среда для определения содержала 50 ка­ лий­фосфатный буфер, рН 6,85, (общий объем 1 мл), в состав которого входили 5 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ, 8 мМ DL­изоцит­ рата, 4мМ фенилгидразина солянокислого и ферментная вытяжка. Контрольная проба не содержала изоцитрата. За единицу фермен­ тативной активности принимали количество фермента, образующее 1 нмоль глиоксилата за 1 мин при 25°. Коэффициент молярной адсорб­ ции фенилгидразонглиоксилата – 1,7 ⋅ 104 М. Активность фермента выражали в нмолях про­ дукта на 1 мг белка за 1 мин. Активность малатсинтазы (КФ 4.1.3.2.) определяли на вышеуказанном приборе при длине волны 232 нм [8]. Среда инкубации включала 18 мкМ трис­HCl­буфера, pH 7,8, содержащего 2 мкМ MgCl2, 0,025 мкМ аце­ тил­КоА, 1,25 мкМ глиоксилата натрия и ферментную вытяжку (общий объем 1 мл). В контрольной пробе отсутствовал глиоксилат натрия. Молярный коэффициент поглощения KoA­SH – 4,5 ⋅ 103 М. Активность фермен­ та выражали в нмолях KoA­SH/мин на 1 мг белка. Активность NAD­зависимой малатдегид­ рогеназы (МДГ, 1.1.1.37) определяли на выше­ указанном приборе при 340 нм [4]. Среда ин­ кубации содержала трис–HCl­буфер – 25 мМ (рН 8,0), ЭДТА – 0,25 мМ; ДТТ – 5 мМ; NADН – 2,5 мМ, яблочную кислоту – 5 мМ и ферментный препарат. Контрольная про­ ба не содержала яблочной кислоты. Моляр­ ный коэффициент поглощения NADН – 6,22 ⋅ 103 М. Активность фермента выражали в нмоль NADН/мин на 1 мг белка. Содержание ТБК­активных продуктов определяли в безбелковых центрифугатах на СФ­26 по реакции с тиобарбитуровой кисло­ ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 1 Е. Ф. БЕЗДУДНАЯ, П. А. КАЛИМАН той и последующим определением оптической плотности при 532 нм [9]. Белок определяли методом Лоури в моди­ фикации Миллера, используя в качестве стан­ дарта бычий сывороточный альбумин (БСА) [10]. Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статисти­ ки ANOVA с использованием пакета программ «Statistica 6.0». результаты и обсуждение Как видно из данных, приведенных в табл. 1, при проращивании семян в среде, не содержащей солей тяжелых металлов, актив­ ность изоцитратлиазы повышается на 5­е сут­ ки проращивания. В это время длина первич­ ного корешка колеблется в пределах 3,2–3,7 см. Поскольку в изоцитратлиазной реакции об­ разуется сукцинат и глиоксилат, а последний конденсируется с ацетил­КоА с образовани­ ем малата – предшественника оксалоацета­ та, превращающегося в глюкозу, последняя и обеспечивает рост корешка. Ранее нами было показано, что дополнительный вклад в синтез глюкозы вносит сукцинат, который поступает в митохондрии, где окисляется до оксалоацетата. Активность малатсинтазы повышается на 3­и сутки и снижается на 5­е. В малатсин­ тазной реакции утилизируются глиоксилат и ацетил­КоА – продукты изоцитратлиазной реакции, а образующийся малат включается в реакции глюконеогенеза. Понижение актив­ ности малатсинтазы на 5­е сутки повидимому связано с истощением запасов триглицеридов в прорастающих семенах. Известно, что глиок­ сисомы функционируют только до тех пор, пока рост первичного корешка обеспечивается запасенными триглицеридами [11]. Интенсификация глюконеогенеза и рост корешка поддерживаются высокой удельной активностью NAD­МДГ, катализирующей об­ разование оксалоацетата – ключевого субстра­ та глюконеогенеза. CoCl 2 активирует изоцитратлиазу, что со­ провождается более быстрым ростом первич­ ного корешка (длина корешка на 5­е сутки прорастания составляет 3,4–4,2 см). Это, веро­ ятно, связано с тем, что ионы кобальта входят в состав кобальтсодержащих ферментов и при физиологических концентрациях становятся активаторами свободнорадикального окис­ ления [12], а активные метаболиты кислоро­ да – сигнальные и регуляторные молекулы [13] – стимулируют реакции, связанные с про­ растанием и удлинением корешка. CdCl2 оказывает тормозящее влияние на изоцитратлиазную активность в 1­е сутки и ингибирует малатсинтазную активность че­ рез 5 сут. проращивания. Результатом такого действия является торможение роста корешка в длину (2,1–2,6 см), отмеченное в наших опы­ Т а б л и ц а 1. Влияние солей тяжелых металлов на активность изоцитратлиазы (ИЦЛ), малатсинтазы (Мс) и NAD-зависимой малатдегидрогеназы (NAD-МДГ) в семядолях прорастающих семян сои, нмоль продукта/мин на 1 мг белка; М ± m, n = 3–4 Время проращивания семян: Факторы воздействия 1 сутки ИЦЛ МС NAD­МДГ Контроль 19,6 ± 1,6 62,7 ± 5,3 140,3 ± 6,9 CoCl2 21,3 ± 1,4 70,4 ± 5,0 160,7 ± 7,6 CdCl2 11,9 ± 1,8* 58,4 ± 4,7 147,4 ± 7,6 3 суток Контроль 22,4 ± 3,0 74,9 ± 3,6# 130,9 ± 5,4 CoCl2 37,2 ± 1,7* 66,7 ± 4,1 164,8 ± 9,7* CdCl2 25,7 ± 1,2 63,2 ± 2,6* 136,2 ± 6,6 Контроль 31,8 ± 1,9 CoCl2 CdCl2 ,# # 5 суток 48,7 ± 4,5# 152,1 ± 6,1 37,4 ± 2,1* # 54,1 ± 4,2 167,3 ± 8,5 29,6 ± 2,3 # 47,1 ± 3,2 142,5 ± 7,0 # ,# # Здесь и в табл. 2: *р ≤ 0,05 по отношению к контролю; #р ≤ 0,05 по отношению к результатам на 1­е сутки ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 1 85 ЕКсПЕрИМЕНТАЛьНі рОБОТИ Т а б л и ц а 2. содержание ТБК-активных продуктов в семядолях прорастающих семян сои, нмоль/г ткани; М ± m, n = 5–6 Сутки Контроль + CoCl2 1 20,43 ± 1,52 39,90 ± 3,72* 24,98 ± 2,47 3 19,83 ± 0,74 ,# 56,14 ± 3,12* 41,23 ± 3,26*,# 5 25,25 ± 1,82 68,21 ± 3,90*,# 52,08 ± 4,02*,# тах. Известно, что ионы Cd2+ запирают каль­ циевые каналы [14–16], вследствие чего тормо­ зятся реакции глюконеогенеза. Данные о содержании ТБК­активных про­ дуктов при прорастании семян сои и влиянии солей кобальта и кадмия, приведены в табл. 2. Как видно из этих данных, на 5­е сут про­ ращивания семян на воде наблюдается повы­ шение содержания ТБК­активных продуктов, что свидетельствует об активации ПОЛ. Это согласуется с представлениями о регуляторной роли активних метаболитов кислорода [17]. CoCl2 значительно активирует ПОЛ во все сроки проращивания, тогда как CdCl 2 – толь­ ко на 3­и и 5­е сут. Это связано с различными механизмами активации свободнорадикально­ го окисления указанными солями. Co2+ непо­ средственно активирует сободнорадикальное окисление, а Cd2+ – только после торможения антиоксидантных ферментов. Таким образом, проведенные исследова­ ния и сопоставление их с данными литературы свидетельствуют о том, что образование пер­ вичного корешка и его рост до укоренения и перехода на синтез глюкозы в реакциях фото­ синтеза, происходит в несколько стадий: набу­ хание семян; мобилизация липидов, запасен­ ных в семядолях; формирование глиоксисом; активация свободнорадикального окисления. Соли кобальта и кадмия в данных кон­ центрациях оказывают различное влияние на активность ферментов глиоксилатного цикла, и на скорость прорастания семян и рост про­ ростка, что обусловлено химической природой солей. Это следует учитывать при изучении влияния солей тяжелых металлов на урожай­ ность культурных растений. Анализ полученных результатов позволяет предложить следующую схему синтеза глюко­ зы из жирных кислот в глиоксилатном цикле (схема). 86 + CdCl2 вплив солей важких металів на активність ключових ферментів гліоксилатного циклу і вміст тбк-активних продуктів у насінні сої glicine max l. в умовах пророщування О. Ф. Бездудна, П. А. Каліман Харківський національний університет ім. В. Н. Каразіна, Україна; e­mail: Pavel.A.Kaliman@univer.kharkov.ua Вивчено вплив CoCl2 і CdCl2 на активність ізоцитратліази, малатсинтази і NAD­залежної малатдегідрогенази в сім`ядолях насіння сої і вміст ТБК­активних продуктів на ранніх ета­ пах його пророщування: через 1, 3 і 5 діб. Пока­ зано, що під час пророщування на середовищі без солей металів ізоцитратліазна активність значно підвищується на 5­ту добу, а малатсин­ тазна – підвищується на 3­ю добу і знижується на 5­ту добу проророщування. CoCl2 активує ізоцитратліазну активність на 3­ю добу і галь­ мує малатсинтазну активність на 5­у добу. В цих умовах спостерігається подовження корін­ ця. CdCl2 гальмує ізоцитратліазну активність в першу добу, а малатсинтазну – на 5­у добу. При цьому дещо гальмується ріст корінця. CoCl2 підвищує вміст ТБК­активних продуктів в усі терміни пророщування, а CdCl2 – лише на 3­ю і 5­ту добу. Обговорюється роль ферментів гліоксилатного циклу в перетворенні жирних кислот у вуглеводи і у формуванні первинного корінця під час пророщування насіння сої. К л ю ч о в і с л о в а: ізоцитратліаза, ма­ латсинтаза, малатдегідрогеназа, ТБК­активні продукти, сім’ядолі сої, кадмія хлорид, ко­ бальту хлорид. ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 1 Е. Ф. БЕЗДУДНАЯ, П. А. КАЛИМАН ɋɢɧɬɟɡ ɝɥɸɤɨɡɵ ɜ ɝɥɢɨɤɫɢɥɚɬɧɨɦ ɰɢɤɥɟ жирные кислоты β­Окисление Ⱥɰɟɬɢɥ-ɄɨȺ Ƚɥɸɤɨɡɚ Ɉɤɫɚɥɨɚɰɟɬɚɬ ɐɢɬɪɚɬɫɢɧɬɚɡɚ KoASH ɐɢɬɪɚɬ Ⱥɤɨɧɢɬɚɡɚ Ɇɚɥɚɬɞɟɝɢɞɪɨɝɟɧɚɡɚ Ƚɥɢɨɤɫɢɥɚɬɧɵɣ ɰɢɤɥ ɂɡɨɰɢɬɪɚɬ ɂɡɨɰɢɬɪɚɬɥɢɚɡɚ Ɇɚɥɚɬ ɆɚɥɚɬȽɥɢɨɤɫɢɥɚɬ ɫɢɧɬɚɡɚ KoASH Ⱥɰɟɬɢɥ-ɄɨȺ ɋɭɤɰɢɧɚɬ Ɉɤɫɚɥɨɚɰɟɬɚɬ Ɇɚɥɚɬ Ɇɚɥɚɬ ɋɭɤɰɢɧɚɬ Ɇɢɬɨɯɨɧɞɪɢɢ ɐɢɬɨɡɨɥɶ схема последовательности реакций синтеза глюкозы из жирных кислот ɋɯɟɦɚ ɩɨɫɥɟɞɨɜɚɬɟɥɶɧɨɫɬɢ ɪɟɚɤɰɢɣ ɫɢɧɬɟɡɚ ɝɥɸɤɨɡɵ ɢɡ ɠɢɪɧɵɯ first 24­hours, 72 hours and 96 hours influence of salts of heavy metals on activity of key ɤɢɫɥɨɬ enzymes of glyoxylate cycle and content of malondialdehyde products in the seed lobe of germinating soybean seeds are inves­ tigated. It is shown that when germinating in the medium containing no metal salts, isocytrate lyase activity is greatly increased during 96 h and malate synthase is increased after 72 h and is decreased after 96 h of germination period. CoCl2 activated isocytrate lyase activity after 72 hours and de­ creased malate synthase activity after 96 hours. ȼɉɅɂȼ ɋɈɅȿɃ H. F. Bezdudna, P. A. KalimanȼȺɀɄɂɏ ɆȿɌȺɅȱȼ ɇȺ ȺɄɌɂȼɇȱɋɌɖ The lengthening of the primary root under such conditions is noted. CdCl2 inhibitedȱ isocytrate ɄɅɘɑɈȼɂɏ ɎȿɊɆȿɇɌȱȼ Karazin Kharkov National University, Ukraine; ȽɅȱɈɄɋɂɅȺɌɇɈȽɈ ɐɂɄɅɍ lyase activity during first 24 hours and suppressed e­mail: Pavel.A.Kaliman@univer.kharkov.ua malate synthase after 96 ɋɈȲ hours. During ȼɆȱɋɌ ɌȻɄ-ȺɄɌɂȼɇɂɏ ɉɊɈȾɍɄɌȱȼ ȼ activity ɇȺɋȱɇɇȱ Summary this process the germ growth is suppressed. CoCl 2 ɉɊɂ ɉɊɈɊɈɓɍȼȺɇɇȱ increased the composition of malondialdehyde and CdCl on the TheGLICINE influence ofMAX CoClL. 2 2 products during each period of germination, and activity of isocytrate lyase, malate synthase and Ɉ. Ɏ.dehydrogenase Ȼɟɡɞɭɞɧɚ, ɉ. Ⱥ. seed Ʉɚɥɿɦɚɧ CdCl2 increased malondialdehyde content after 72 NAD­malate in the lobes and and 96 hours. The role of glyoxylate cycle enzymes the composition of malondialdehyde products at in transforming fatty acids into carbohydrates and early stages of germinating of soybean seeds: after ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 1 10 87 ЕКсПЕрИМЕНТАЛьНі рОБОТИ in forming the primary root under the process of germination of seed lobes of soybean is discussed. K e y w o r d s: isocytrate lyase, malate syn­ thase, malate dehydrogenase, malondialdehyde products, soybean seed lobes, cadmium chloride, cobalt chloride. 1. Гудвин Т., Mерсер Э. Введение в биохимию растений. – в 2­х т., пер. с англ. – М.: Мир, 1986. – 393 с. 2. Hayashi H., De Bellis L., Ciurli A. et al. // J. Biol. Chem. – 1999. – 274, N 18. – P. 12715– 12721. 3. Костишин с. с., Марченко М. М., руденко с. с. та ін. // Фізіологія рослин в Україні на межі тисячоліть. – Київ, 2001. – 2. – С. 52–66. 4. Полевой В. В., Максимов Г. Б. Методы биохимического анализа растений. – Л.: Изд­во Ленингр. ун­та, 1978. – 192 с. 5. Прохорова М. И. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). – Л.: Изд­во Ленингр. ун­та, 1982. – 272 с. 6. Землянухин А. А., Игамбердиев А. У. // Физиология растений. – 1985. – 32, вып. 4. – С. 739–746. 7. Грядунова Г. П., Козлова Л. М., Литвинова Т. П. Под ред. Тенцовой А. И. Руководство к практическим занятиям по заводской технологии лекарственных форм. – М.: Медицина, 1986. – 272 с. 8. Dixon G. H., Kornberg H. L. // J. Biol. Chem. – 1959. – 72, N 1. – P. 3p. 9. Арутюнян А. В., Дубинина Е. Е., Зыбина Н. Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. – Спб. ИКФ «Фолиант», 2001. – 232 с. 10. Miller G. L. // Anal. Chem. – 1959. – 31, N 5. – P. 964–966. 11. Даффус К., Даффус Дж. Углеводный обмен растений. – М.: Агропромиздат, 1987. – 176 с. 12. Калиман П. А., Никитченко И. В., сокол О. А., стрельченко Е. В. // Биохимия. – 2001. – 66, № 1. – С. 98–104. 13. Дубинина Е. Е. // Вопр. мед. химии. – 2001. – 47, № 6. – С. 561–581. 14. Зубчак В. М. // Журн. АМН Украины. – 1999. – 5, № 4. – С. 627–642. 15. Leslie C. C. // JBC. – 1997. – 272, N 27. – P. 16709–16712. 16. Кислинг Д. Д., ван Дайен с. Д., Трелстед П. и др. // Биохимия. – 2000. – 65, № 3. – С. 385–393. 17. Del Rio L. A., Sandalio L. M., Corpas F. J. et al. // Plant Physiol. – 2006. – 141, N 2 – P. 330–335. Получено 08.11.2007 88 ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 1