влияние аноксии на биохимические показатели в ткани

ВЛИЯНИЕ АНОКСИИ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В ТКАНИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗ
Довженко Н.В.*, Истомина А.А. **, Бельчева Н.Н. **
*ФГОУ ВПО «Дальрыбвтуз»
**ТОИ им. В.И. Ильичева ДВО РАН, Владивосток, Россия
Рассматриваются особенности биохимической организации и реакции антиоксидантной
(АО) защитной системы в ткани пищеварительной железы брюхоногого моллюска Tegula
rustica в усло- виях экспериментальной аноксии/гипоксии. Были определены: общая
антиоксидантная актив- ность (ABTS), активности АО ферментов (супероксиддисмутазы
(СОД), каталазы, глутатион- редуктазы), содержание глутатиона и продукта перекисной
деструкции липидов – малонового альдегида (МДА) в нормальных и стрессовых
условиях. Показано, что в стрессовых условиях на- блюдалось изменение АО
компонентов, а также увеличение содержание МДА, что указывало на то, что моллюски
испытывали окислительный стресс.
В условиях растущего антропогенного воздействия на гидросферу и, прежде всего, на
прибреж- ные акватории повышенную актуальность приобретают проблемы
прогнозирования влияния гипоксии (аноксии) на выживаемость водных организмов.
Гипоксия охватила тысячи километров морских вод всего мира, привела к массовой
гибели морских организмов, к обеднению бентосной фауны и сниже- нию в
продуктивности рыбных запасов. Гипоксия может уничтожать чувствительные к
недостатку ки- слорода виды, тем самым, вызывая изменения в видовом составе
бентоса, рыб и сообществ фито- планктона.
Многие беспозвоночные животные приобрели способность к широкому использованию
1/8
ВЛИЯНИЕ АНОКСИИ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В ТКАНИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗ
анаэроб- ного способа обитания. К ним можно отнести и литоральных моллюсков,
способных переносить дли- тельные периоды нахождения в условиях атмосферного
кислорода во время отливов.
Все моллюски являются факультативными анаэробами, которые, по мере своего
развития, при-
обрели ряд адаптационных приспособлений, позволяющих им переживать условия
недостатка кисло- рода. Среди них: запас большого количества субстрата окисления;
подавление метаболических про- цессов; запуск дополнительных реакций
фосфорилирования, повышающих выход высокоэнергетиче- ских фосфатных
соединений; снижение метаболического ацидоза.
При длительной гипоксии организмы, в конце концов, переходят к анаэробному
дыханию, что со- провождается снижением интенсивности метаболизма. Поэтому
возникает вопрос: насколько их экс- плуатативный характер адаптации силен в своем
проявлении и насколько устойчивы эти организмы к недостатку или отсутствию
кислорода.
Так как связь организмов со средой осуществляется через обмен веществ, в основе
которого лежат биохимические превращения, то определенный интерес представляют
исследования биохи- мических сдвигов в организмах водных беспозвоночных по
сравнению с нормой при стрессовом со-
стоянии.
Одним из таких сдвигов является изменение в состоянии защитной антиоксидантной
системы ор- ганизмов. В данной работе целью исследования стало изучение влияния
аноксии (выдерживание на воздухе) на состояние АО системы у брюхоногого моллюска
Tegula rustica.
Моллюски были собраны в заливе Восток, адаптированы в лабораторных аквариумах.
2/8
ВЛИЯНИЕ АНОКСИИ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В ТКАНИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗ
Моллю- сков подвергали воздействию аноксии на атмосферном воздухе в течение 30 ч,
а затем препарирова- ли животных, используя в работе пищеварительную железу. Были
определены следующие парамет- ры: антиоксидантная активность, активности АО
ферментов (супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ), глутатион-редуктазы (ГР),
содержание низкомолекулярных антиоксидантов (глутатиона) и из- менение уровня
накопления продуктов перекисной деструкции липидов (МДА) в нормальных и стрессовых условиях.
Метод определения антиоксидантной активности в биологической пробе, в частности, в
цито- зольной фракции, основан на ингибировании образования ABTS радикал +
радикального катиона без вовлечения субстрата (Re Roberta et al, 1999).
Уровень восстановленного глутатиона регистрировали спектрофотометрически по
реакции тио-
группы цистеина с реактивом Эллмана – дитионитробензойной кислотой (Dovzhenko et.
al., 2005).
Содержание малонового диальдегида – продукта окислительной деградации жирных
кислот, оп- ределяли непосредственно в тканях (Dovzhenko et. al., 2005) по цветной
реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Для расчетов содержания МДА
использовали коэффициент молярной экстинции –
1,56 x105/см /М.
Концентрацию белка в гомогенатах тканей определяли по абсорбции бромфенолового
синего.
3/8
ВЛИЯНИЕ АНОКСИИ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В ТКАНИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗ
Калибровочные кривые строили по растворам бычьего сывороточного альбумина,
концентрации ко-
торого рассчитывали по коэффициенту молярной экстинции (Dovzhenko et. al., 2005).
Определение активности АО ферментов
Супероксиддисмутаза (ЕС 1.15.1.1). В основе метода (Paoletti, Aldinucci, 1986) лежит
определение способности тканевых гомогенатов ингибировать реакцию окисления
НAДФH, вызванную супероксид
анион радикалом. Одной (1) единице активности (ЕА) фермента соответствует 50%
ингибирование реакции окисления. Активность СОД выражали в ЕА в расчете на мг
белка (ЕА/мг белка).
Глутатионредуктаза (ЕС 1.6.4.2). Метод определения активности ГSH-редуктазы (Regoli,
Princi-
pato, 1995) основан на способности фермента восстанавливать окисленную форму
глутатиона с ис-
пользованием НАДФН. Активность фермента рассчитывали по изменению экстинкции
при λ 340 нм (+20°С) в течение начального этапа реакции на линейном участке кривой и
выражали в нмоль окис- ленного НАДФ+/мин/мг белка.
Каталаза (ЕС 1.11.1.6). Метод определения активности фермента каталазы (КАТ)
основан на его способности разлагать перекись водорода (Regoli, Principato, 1995).
Кинетику распада перекиси водо- рода регистрировали при λ 240 нм в течение 1 мин и
выражали в мкмолях H2O2/мин/мг белка.
4/8
ВЛИЯНИЕ АНОКСИИ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В ТКАНИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗ
Все цифровые данные представляют собой среднее значение ± стандартное
отклонение.
В результате исследований было обнаружено, что после непродолжительной аноксии
произошло изменение всех исследованных параметров в тканях пищеварительной
железы моллюсков. В услови- ях нахождения брюхоногих на «воздухе» активность СОД
в клетках пищеварительной железы снизи-
лась относительно контрольных величин на 12% (таблица, рис. 1).
Снижение активности СОД после подверженности моллюсков аноксии также
наблюдали в своих экспериментах Pannunzio и Storey (1998), Eduardo A. Almeida и др.
(2005). Этот факт объясняется тем,
что СОД контролирует стадию инициации свободнорадикального окисления, и
снижение активности
этого фермента под влиянием аноксии, вероятно, указывает на усиленную атаку
оксирадикалов, об-
разующихся в результате развивающегося окислительного стресса. Кроме того,
пищеварительная железа моллюсков является органом накопления и детоксикации
различных токсинов и ряда микро-
элементов (в том числе тяжелых металлов), что также необходимо учитывать при
воздействии до-
полнительных стрессовых факторов (Pannunzio, Storey, 1998).
5/8
ВЛИЯНИЕ АНОКСИИ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В ТКАНИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗ
В результате действия 30-ти часовой аноксии наблюдалось увеличение активности КАТ
в клетках пищеварительной железы: ее значение увеличилось на 22 %, относительно
контрольных величин. Также наблюдалось увеличение активности глутатион-редуктазы
– на 16 % относительно контроля
(таблица, рис. 1).
Как известно, каталаза является ответственной за утилизацию и контроль
концентрации двух- электронных продуктов АФК (H2O2) в клетке, а также по
возможности минимизирует реакцию актива- ции радикальной цепи и образование
гидроксильных радикалов (реакция Фентона) (Weihe et al.,
2010). Увеличение активности этого фермента объясняется компенсаторной реакцией
организма в целом. Подобная реакция наблюдалась у Littorina littorea под воздействием
6-ти дневной аноксии (Pannunzio, Storey, 1998), у морского блюдца
Nacella concinna
(Weihe et al., 2010)
,
а также у двуствор- чатых моллюсков, которые выдерживались в аноксийных условиях
(Almeida et al., 2005)
Также мы предполагаем, что основная функция обезвреживания оксирадикалов в
тканях пище- варительной железы тегулы принадлежала глутатион-редуктазе и
низкомолекулярному антиоксидан- ту – глутатиону. Активность глутатион-редуктазы
поддерживалась на высоком уровне во время анок- сии, а содержание глутатиона
увеличилось в течение эксперимента с 1.98±0.76 до 3.32±1.97 нмоль/мг белка (рис. 2). В
целом уровень общей антиоксидантной активности в пищеварительной железе в период аноксии увеличился почти в 2 раза, что также можно рассматривать как
компенсаторную реак- цию организма в период непродолжительной аноксии.
Таким образом, наши эксперименты показали, что брюхоногий моллюск T. rustica оказалс
я устой- чив к непродолжительной аноксии (30 ч), что подтверждается согласованной
работой антиоксидант- ных ферментов, глутатиона и антиоксидантной системой в
целом. Кроме того, незначительное накоп- ление продуктов деструкции липидов в
6/8
ВЛИЯНИЕ АНОКСИИ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В ТКАНИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗ
пищеварительной железе указывает на то, что для
T. rustica
присущ хорошо сбалансированный механизм биохимической адаптации как к
повышенному уровню О2 в воде, так и к его отсутствию. Но не исключается тот факт,
что под воздействием непродолжи- тельной аноксии в клетках пищеварительной
железы, так же как и во всем организме в целом, запус- тился необратимый
деструктивный процесс – окислительный стресс.
Библиографический список
1. Almeida E.A., Bainy A.C.D., Dafre A.L., Gomes O.F., Medeiros M.H.G., Mascio P. Oxidative
stress in digestive gland and gill of the brown mussel (Perna perna) exposed to air and
re-submersed // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 2005. V. 318. P. 21-30.
2. Dovzhenko N.V., Kurilenko A.V., Belcheva N.N., Chelomin V.P. Cadmium-induced oxidative
stress in the bivalve mollusk Modiolus modiolus // Russian J. Mar. Biol. 2005. V. 31. P. 309-313.
3. Pannunzio T.M., Storey K.B. Antioxidant defenses and lipid peroxidation during anoxia stress
and aerobic recovery in the marine gastropod Littorina littorae // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1998. V.
221. P. 277-292.
4. Paoletti F., Aldinuccio D., Mocali A., Carparrini A. A sensitive spectrophotometric method for
the de- termination of superoxide dismutase in tissue extracts // Anal. Biochem. 1986. V. 154. P.
526-541.
7/8
ВЛИЯНИЕ АНОКСИИ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В ТКАНИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗ
5. Regoli F., Principato G. Glutathione, glutathione-depended and antioxidant enzymes in
mussel, Myti- lus galloprovincialis, exposed to metals under field and laboratory conditions:
implications for the use of bio- chemical biomarkers // Aquat. Toxicol. 1995. V. 31. P. 143-164.
6. Re Roberta, Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C. Antioxidant
activity
applying an improved ABTS radical cation decolorization assay // Free Radical Biology &
Medicine. 1999. V.26, Nos. 9/10. P.1231-1237.
7. Weihe E., Kriews M., Abele D. Differences in heavy metal concentrations and in the
response of the antioxidant system to hypoxia and air exposure in the Antarctic limpet Nacella
concinna // Mar. Environ. Res.
2010. V. 69. P. 127-135.
8/8