Количественное определение сои Roundup Ready® методом

Анализ образцов пищевых продуктов на
присутствие генетически
модифицированных организмов
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup
Ready® методом ПЦР в реальном времени
Н. Фоти
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
2
Содержание
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом
ПЦР в реальном времени
Экспериментальная часть
3
Введение
3
ПЦР в реальном времени с использованием ABI PRISM® 7700
4
ПЦР в реальном времени с использованием прибора LightCycler® (Roche)
9
Литература
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
15
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
3
Экспериментальная часть
Введение
Приведенные ниже протоколы представляют собой методики, основанные на ПЦР в
реальном времени и делающие возможным определение количества специфической
линии генетически модифицированной сои (сои Roundup Ready®) в непереработанном
и переработанном материале. Количественный метод ПЦР в реальном времени
проводится с помощью двух различных термоамплификаторов, оборудованных для
детекции
продукта
амплификации
в
реальном
времени
путем
измерения
флуоресценции: ABI PRISM® 7700 SDS (Applied Biosystems) и LightCycler® (Roche).
ПЦР в реальном времени используется для амплификации эндогенной контрольной
последовательности (уникальной для сои), а также последовательности, которая
указывает на присутствие генетически модифицированной сои (сои Roundup Ready®).
Этот тест включает две независимые системы ПЦР, каждая из которых имеет
специфические ДНК-праймеры и флуоресцентно-меченые зонды. Одна система ПЦР
выявляет последовательность ДНК, специфическую для ГМО, другая представляет
собой систему внутреннего стандарта, служащего в качестве количественного
контроля, детектирующего генетически модифицированную и немодифицированную
сою.
Примечание. Протоколы, включенные в данное руководство, были выбраны для
обучающих целей и должны рассматриваться как базовые примеры определения
количества ГМО с использованием ПЦР в реальном времени. Мы рекомендуем
периодически просматривать относящиеся к данному вопросу источники и литературу
для получения информации о более новых и утвержденных протоколах. Заметьте, что
приведенные протоколы были выбраны в соответствии с имеющимся в нашей
лаборатории оборудованием. Объединенный научный центр (JRC) и ВОЗ ни в каком
отношении
не
способствуют
исключительному
использованию
какой-либо
определенной компании или торговой марки.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
4
ПЦР в реальном времени с использованием ABI PRISM® 7700
Протокол ПЦР в реальном времени для детекции сои Roundup Ready®:
мультиплексный метод ПЦР
Этот метод основан на амплификации/определении количества контрольного гена
лектина
и
части
введенного
трансгена
сои
Roundup
Ready®
с
помощью
мультиплексного метода ПЦР, который включает две независимые реакции ПЦР в
одной пробирке (Foti et al., 2006). TaqMan-зонды, специфические по отнощению к
лектину и трансгену сои Roundup Ready®, мечены красителями VIC и FAM,
соответственно, что делает возможным детектировать амплификацию более чем
одной целевой последовательности в одной пробирке. Один репортерный краситель
(FAM) можно отличить от другого (VIC) на основании того, что длины волн максимумов
их эмиссии различны. Прибор ABI PRISM® 7700 SDS способен детектировать
несколько красителей с различающимися длинами волн эмиссии.
Количество красителя, специфичного по отношению к трансгену сои Roundup Ready®
(FAM),
нормализуется
по
количеству
красителя,
выявляющего
растительного материала в каждом зонде (VIC). Это дает величину
количество
CT, которая
усредняется по количеству повторных образцов. Эти величины сравниваются с
калибровочной кривой, построенной на основании величин
эталонов сои Roundup Ready® (метод сравнительного CT или
CT для известных
CT).
Эта процедура успешно применялась к ряду непереработанных материалов,
ингредиентов и продуктов питания, содержащих сою (таких, как корма для животных,
соевый напиток, йогурт, мука, лецитин и др.).
Аналитическая эффективность этого метода была успешно проконтролирована с
помощью нескольких схем квалификационных испытаний (FAPAS®, GIPSA).
Приборы и реагенты
• ABI PRISM® 7700 Sequence Detector System (Applied Biosystems)
• 96-луночные оптические плашки для реакций MicroAmp (Cat No. N801-0560)
• Оптические крышки MicroAmp (Cat No. N801-0935)
• TaqMan®, 2Х универсальная основная смесь для ПЦР (Cat No. 4304437),
содержащая 2Х буфер TaqMan, ДНК полимеразу AmpliTaq Gold® (5 ед/мкл),
AmpErase® UNG (1 ед/мл), 200 мкМ dNTP с dUTP, пассивный контроль 1
• Микроцентрифуга
• Центрифуга с охлаждением для конических пробирок объемом 15 мл
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
5
• Микропипетки
• Встряхиватель для пробирок типа Vortex
• Штатив для пробирок
• Микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 мл
• Конические полипропиленовые пробирки объемом 15 мл
• Безнуклеазная вода
• Праймеры (Le-F и Le-R) и зонд (Le-Probe), специфичные для контрольного гена
• Праймеры (RR-F и RR-R) и зонд (RR-Probe), специфичные для трансгена
Характеристики праймеров и зонда для контрольного гена
Последовательность
Длина (нукл.)
Мол. вес
Le-F
TCC ACC CCC ATC CAC ATT T
19
5586.0
Последовательность
Длина (нукл.)
Мол. вес
Le-R
GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA
24
7532
Последовательность
Длина (нукл.)
Мол. вес
Le-Probe
5'-(VIC)-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT
CG-(TAMRA)-3'
23
7019.0
Характеристики праймеров и зонда для трансгена
Последовательность
Длина (нукл.)
Мол. вес
RR-F
GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT
23
7014
Последовательность
Длина (нукл.)
Мол. вес
RR-R
GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C
25
7712
Последовательность
Длина (нукл.)
Мол. вес
RR-Probe
5'-(FAM)-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC
AGC TTG TCA GCG-(TAMRA)-3'
33
10137
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
6
Приготовление основной смеси
• Разморозьте,
осторожно
перемешайте
и
отцентрифугируйте
необходимые
количества компонентов, требуемых для реакции. Держите размороженные
реагенты на льду.
• В центрифужную пробирку объемом 15 мл, которая находится во льду, добавьте
следующие компоненты в указанном ниже порядке (за исключением ДНК) для
приготовления основной смеси. Обратите внимание на то, что для облегчения
вычисления
ошибок
пипетирования,
возникающих
из-за
вязкости
раствора,
готовятся четыре дополнительных смеси для реакции.
Таблица 1. Приготовление основной смеси для анализа одной плашки мультиплексным
методом ПЦР.
Конечная
концентрация
18.3
54.9
Основная
смесь
на одну
плашку
(32+4
образца)
1976.4
1x
40 нМ
40 нМ
100 нМ
100 нМ
100 нМ
100 нМ
25
0.1
0.1
0.25
0.25
0.5
0.5
75
0.3
0.3
0.75
0.75
1.5
1.5
2700
10.8
10.8
27
27
54
54
50-250 нг
5
15
50
150
Стерильная, деионизованная вода
TaqMan универсальная основная
2 Le-F (20 мкM)
Праймер
Праймер Le-R (20 мкM)
Праймер RR-F (20 мкM)
Праймер RR-R (20 мкM)
Le-Probe(10 мкM)
RR-Probe(10 мкM)
ДНК
ВСЕГО
Основная
Основная
смесь
смесь
для реакции
на один
в одной
образец
пробирке (мкл) (3 повтора)
• Осторожно перемешайте и кратко отцентрифугируйте
• Приготовьте одну микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл для каждого
образца ДНК, который будет анализироваться: образцы для калибровочной кривой
(CRM – соя Roundup Ready® 0.1, 0.5, 1, 2, 5%), неизвестные образцы и контрольные
образцы (соя, не содержащая трансген Roundup Ready®, ДНК из сои Roundup
Ready® и контроль без ДНК-матрицы)
• В каждую микроцентрифужную пробирку добавьте количество основной смеси,
необходимое для трех повторностей реакции (135 мкл основной смеси). Добавьте в
каждую пробирку количество ДНК, требуемое для трех повторностей реакции (т.е.
15 мкл ДНК). Перемешайте содержимое пробирки по крайней мере три раза по 10
сек каждый. Эта стадия особенно важна, т.к. помогает свести к минимуму
вариабильность между четырьмя повторами каждого образца.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
• Кратко
отцентрифугируйте.
Поместите
96-луночную
7
плашку
в подставку и
раскапайте по 50 мкл в каждую лунку, двигаясь горизонтальными рядами слева
направо. После добавления основной смеси к каждому вертикальному ряду лунок
накройте
лунки
опическими
крышками,
используя
для
этого
специальное
устройство.
Примечание: не пишите на оптической плашке и не прикасайтесь к крышке.
• Убедитесь, что аликвоты реакционной смеси расположены на дне лунок, без брызг
и пузырей на боковых стенках или крышках.
• Поместите плашку в прибор ABI PRISM® 7700; откройте окно установки параметров
новой плашки чтобы описать тип образца для каждой лунки: тип образца IPC
ассоциирован с красителем VIC, а UNKN – с красителем FAM.
• Проведите амплификацию образцов как указано в Таблице 2.
Таблица 2. Программа термоамплификатора для анализа сои Roundup Ready®
методом мультиплексного ПЦР на ABI PRISM® 7700 SDS.
Установка: Режим ПЦР в реальном времени (Real time PCR modus)
Объем реакционной смеси: 50 мкл
Этап
1 UNG
2
Первичная
3 Амплификация
4
Стадия
Денатурация
Отжиг &
удлинение
T°C
50 °C
95°C
95°C
60°C
Время
120"
600"
15"
60"
Сбор
нет
нет
нет
Измерение
Циклы
1x
1x
45x
Анализ данных и интерпретация результатов
После
завершения
амплификации
данные
анализируются
с
использованием
программного обеспечения прибора ABI PRISM® 7700 SDS для получения величин СТ
для каждого репортерного красителя и для каждого образца.
Важно правильно пронумеровать образцы в окне “Установки плашки” (Plate Setup)
программного обеспечения прибора. Каждой лунке необходимо дать уникальный
номер в поле “Повторять” (Replicate); повторам одного образца следует присвоить
одинаковый номер.
Проанализируйте реакцию, выбрав функцию “Анализировать” (Analyse) в меню
“Анализ”
(Analysis)
для
получения
автоматического
доступа
к
окну
графика
амплификации; откорректируйте пороговые значения для слоев FAM и VIC.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
8
После анализа экспортируйте результаты в виде файла программы Excel. Открыв
экспортированный
файл
программой
Microsoft®Excel,
вы
получаете
таблицу,
содержащую два блока данных, соответствующих слоям красителей FAM и VIC, в
которой представлены значения CT для каждой лунки.
Подсчитайте средние значения CT (FAM) и CT (VIC) для каждой группы повторов и
вычислите значения
CT (CT FAM – CT VIC).
Для каждого образца, % ГМО рассчитывается путем анализа значения
образца, сравнения его с набором логарифмов (% ГМО) и значений
CT данного
CT, полученных
для набора концентраций эталонов.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
ПЦР
в
реальном
времени
с
использованием
9
прибора
LightCycler® (Roche)
Протокол ПЦР в реальном времени для детекции сои Roundup Ready®
Этот метод основан на амплификации/количественном определении контрольного
гена лектина и части введенного трансгена сои Roundup Ready®, проводимых в двух
независимых реакциях ПЦР (BgVV, EU Tender Report, 2000). В этих двух системах ПЦР
используются зонды, меченные красителем FAM.
Для каждого образца количество генетически модифицированной сои и контрольного
гена (гена лектина) определяется из соответствующих калибровочных кривых,
полученных как для трансгена, так и для контрольного гена. Содержание генетически
модифицированной сои делится на количество контрольного гена для получения
нормализованной величины содержания генетически модифицированной сои.
Приборы и реагенты
• Система LightCycler® (Roche)
• Капилляры для образцов для LightCycler®. Roche, Cat No 1909339
• Адаптор для капилляров для LightCycler®. Roche, Cat No 1909312
• Гибридизационные зонды LightCycler® FastStart DNA Master, Roche Cat No 3003248,
содержащие Taq ДНК полимеразу FastStart, смесь dNTP (c dUTP вместо dTTP) и
10Х буфер для реакции; стерильную воду для ПЦР
• Не содержащий нуклеаз (ДНКаз и РНКаз) бычий сывороточный альбумин (BSA),
напр. Promega Cat No R9461 (1 мкг/мкл)
• Taq ДНК полимераза Platinum 5 ед/мкл (вместе с оригинальным 10Х буфером и 50
мМ MgCl2. Invitrogen-Life Technologies Cat No 10966026
• Микроцентрифуга
• Микропипетки
• Встряхиватель пробирок типа Vortex
• Штатив для пробирок
• Микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 мл
• Безнуклеазная вода
• Праймеры (GM1-F и GM1-R) и зонды (GM1-Probe), специфичные для контрольного
гена
• Праймеры (GM2-F и GM2-R) и зонды (GM2-Probe), специфичные для трансгена
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
10
Характеристики праймеров и зонда для контрольного гена
GM1-F
Последовательность 5'-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3'
GM1-R
Последовательность 5'-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3'
GM1-Probe
Последовательность 5'-(FAM)-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC-(TAMRA)-3'
Характеристики праймеров и зонда для трансгена
GM2-F
Последовательность 5'-CAT TTG GAG AGG ACA CGC TGA-3'
GM2-R
Последовательность 5'-GAG CCA TGT TGT TAA TTT GTG CC-3'
GM2-Probe
Последовательность 5'-(FAM)-CAA GCT GAG TCT AGC AGA TCT TTC (TAMRA)-3'
Калибровочные кривые
Для каждого эксперимента получают две калибровочные кривые с 5 разведениями
эталонной ДНК. С каждой эталонной ДНК, применяемой для калибровки, проводят две
независимые реакции с двумя основными смесями.
Калибровочные кривые для суммарной ДНК сои и для количественного определения
материала
ГМО
получают
с
использованием
растворов
эталонных
ДНК
в
понижающихся концентрациях, начиная с 2% ДНК сои Roundup Ready® в 0.1М буфере
ТЕ, рН 8.0. Приблизительно 100 нг ДНК используется для первой точки калибровочной
кривой. Все разведения и концентрации калибровочной кривой обобщены в Таблице
3.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
11
Таблица 3. Количество ДНК и разведение калибровочных кривых.
STD 1
STD2
STD 3
STD 4
STD 5
Количество ДНК
нг/реакцию
100
50
25
12.5
6.25
ДНК сои, %
ГМ ДНК, %
100
50
25
12.5
6.25
Фактор
разведения
2
1
0.5
0.25
0.125
1:2
1:4
1:8
1:16
Приготовление основной смеси
• Разморозьте,
осторожно
перемешайте
и
отцентрифугируйте
необходимые
количества компонентов, требуемых для реакции. Держите размороженные
реагенты на льду.
• В микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл, которая находится во льду, для
каждой системы добавьте следующие компоненты в указанном ниже порядке (за
исключением ДНК) для приготовления основных смесей. Обратите внимание на то,
что для облегчения вычисления ошибок пипетирования, возникающих из-за
вязкости раствора, готовятся две дополнительных смеси для реакции.
Таблица 4. Приготовление основной смеси для системы GM1.
Компонент
Буфер для Platinum Taq-полимеразы,
MgCl2 (50 мМ)
dATP, dGTP, dCTP.dTTP (4 мМ)
Праймер GM1-F (20 мкM)
Праймер GM1-R (20 мкM)
GM1-Probe (10 мкM)
Безнуклеазный BSA (1 мкг/мкл)
Platinum Taq-полимераза (5 ед./мкл)
Безнуклеазная вода
ДНК
Общий объем:
Конечная
концентрация
мкл/реакцию
1x
4 мМ
0.8 мМ
500 мМ
500 нМ
200 нM
0.1 мг/мл
0.8 ед.
#
2
1.6
4
0.5
0.5
0.4
2
0.16
6.85
2
18 мкл+2 мкл
ДНК
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Всего мкл
(для 18
реакций)
36
28.8
72
9
9
7.2
36
2.9
123.5
324.2 мкл
(без ДНК)
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
12
Таблица 5. Приготовление основной смеси для системы GM2.
Компонент
Буфер для Platinum Taq-полимеразы,
MgCl2 (50 мМ)
dATP, dGTP, dCTP.dTTP (4 мМ)
Праймер GM2-F (20 мкM)
Праймер GM2-R (20 мкM)
GM2-Probe (10 мкM)
Безнуклеазный BSA (1 мкг/мкл)
Platinum Taq-полимераза (5 ед./мкл)
Безнуклеазная вода
ДНК
Общий объем:
Конечная
концентрация
мкл/реакцию
1x
4 мМ
0.8 мМ
500 мМ
500 нМ
200 нM
0.1 мг/мл
0.8 ед.
#
2
1.6
4
0.5
0.5
0.4
2
0.16
6.85
2
18 мкл+2 мкл
Всего мкл
(для 18
реакций)
36
28.8
72
9
9
7.2
36
2.9
123.5
324.2 мкл
(б
)
• Осторожно перемешайте и кратко отцентрифугируйте
• Приготовьте две пробирки объемом 0.5 мл (одну для системы GM1, другую – для
системы GM2) для каждого образца ДНК, который будет анализироваться (образцы
для калибровочной кривой и неизвестные образцы)
• В каждую микроцентрифужную пробирку добавьте количество основной смеси,
необходимое для двух повторностей реакции (36 мкл основной смеси). Добавьте в
каждую пробирку количество ДНК, требуемое для двух повторностей реакции (т.е. 4
мкл ДНК). Перемешайте содержимое каждой пробирки по крайней мере три раза по
10 сек каждый. Эта стадия важна, чтобы свести к минимуму вариабильность между
четырьмя повторами для каждого образца.
• Поместите капилляры в пре-охлажденный адаптор для центрифуги.
• Раскапайте по 20 мкл основной смеси в каждый капилляр в соответствии с
приведенной схемой (см. Таблицу 6 «Постановка анализа - порядок нанесения в
стандартную «карусель» прибора LightCycler®»)
• Кратко отцентрифугируйте в микроцентрифуге на низкой скорости (около 1150
об/мин). Это действие обеспечивает концентрацию всего объема реакционной
смеси в кончике капилляра.
• Поместите капилляры в «карусель» прибора LightCycler®
• Проведите амплификацию как указано в Таблице 7.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
13
Таблица 6. Постановка анализа - порядок нанесения в «карусель» прибора
LightCycler®: позиции с 1 по 16 – система GM1; позиции с 17 по 32 – система GM2.
Каждый образец ДНК нанесен дважды в системе для контрольного гена, и в системе
для трансгена (ГМО).
Позиция
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Образец (%)
STD(100)
STD(100)
STD (50)
STD (50)
STD (25)
STD (25)
STD (12.5)
STD (12.5)
STD (6.25)
STD (6.25)
U1
U1
Позиция
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Образец (%)
U2
U2
NTC
NTC
STD (2)
STD (2)
STD(1)
STD(1)
STD (0.5)
STD (0.5)
STD (0.25)
STD (0.25)
Позиция
25
26
27
28
29
30
31
32
Образец (%)
STD (0.125)
STD (0.125)
U1
U1
U2
U2
NTC
NTC
Табл. 7. Программа амплификации для системы LightCycler®
Установить для всех шагов: скорость изменения температуры (наклон кривой)
20°C/сек, Тип флуоресценции (Fluorescent display mode): F1/1
Денатурация:
Циклов:
1
Тип:
Нет
Номер
сегмент
а
Темп..
1
96°C
Тип флуоресценции:
Время Скорость
изменения
температуры
120 сек 20°C/сек
2°
Конечн.
Темп..
0°C
F1/1
Величин Задержка
а
шага
шага
(Циклов)
0°C
0
Способ
сбора
данных
Нет
Амплификация:
Циклов:
45
Тип:
Колич. анализ Тип флуоресценции:
Номер
сегмент
а
Темп..
F1/1
1
95°C
Время Скорость
2°
Величин Задержк
изменени Конечн.
а
а
я
Темп..
шага
шага
темпера(Циклов)
туры
5 сек
20°C/сек
0°C
0°C
0
Способ
сбора
данных
2
60°C
15 сек
20°C/сек
0°C
0°C
0
Одиночный
3
72°C
15 сек
20°C/сек
0°C
0°C
0
Нет
Нет
Охлаждение:
Циклов:
1
Тип:
Нет
Номер
сегмент
а
1
Темп..
40°C
Тип флуоресценции:
Время Скорость
изменени
я
температуры
30 сек 20°C/сек
2°
Конечн.
Темп..
0°C
F1/1
Величин Задержк
а
а
шага
шага
(Циклов)
0°C
0
Способ
сбора
данных
Нет
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
14
Во время амплификации нажмите кнопку EDIT SAMPLE и введите номера образцов в
окне нанесения. Определите все позиции (включая эталонную ДНК) как “Неизвестные”
(Unknowns).
Анализ данных и интерпретация результатов
• Для
анализа
данных
выберите
в
окне
анализа
данных
‘Флуоресценция’
(Fluorescence) F1/F2.
• Для
определения
количества
нажмите
кнопку
‘Определение
количества’
(Quantification).
• Программное
обеспечение
прибора
LightCycler®
предлагает
два
метода
определения количества: метод ‘максимума второй производной’ (Second Derivative
Maximum) и метод ‘аппроксимации точек’ (Fit Points). Для анализа количества с
помощью
набора
для
детекции
ДНК
сои
Roundup
Ready®
следует
преимущественно применять метод аппроксимации точек. Используйте следующие
параметры: регулировка базовой линии (baseline adjustment) = ‘Пропорциональная’
(Proportional); количество точек (number of points) = 2.
• Выделите
калибровочную
кривую
вместе
со
всеми
соответствующими
неизвестными образцами.
• Откройте папку ‘Шаг 2: Полоса Шума’ (Step 2: Noise Band).
• Передвиньте значение ‘полоса шума’ (noise band) к позиции 0.1 (см. также
примечание ниже). Значение параметра ‘полоса шума’ может быть изменено либо
вручную с использованием мыши, либо путем нажатия кнопки, расположенной под
кнопкой ‘Изменение установок графика’ (Change Graph Settings). При нажатии этой
кнопки появляется окно ‘Ручная регулировка указателя’ (Manual Cursor Adjustment),
в котором должно быть установлено значение 0.1.
• Откройте папку ‘Шаг 3: Анализ’ (Step 3: Analysis).
• В ‘Шаг 3: Анализ’ вычисляются точки пересечения и соответствующие концентрации
калибровочных эталонов и неизвестных ДНК-матриц.
• Проконтролируйте величину ‘r’ калибровочной кривой. Значения r ≥ -0.98 являются
приемлимыми; оптимальное значение r = 1.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ПЦР в реальном времени
15
Литература
EU Tender Report (2000). Development of qualitative as well as quantitative detection
methods to identify a genetic modification in soybean and maize products.
Report of the EU tender n. XXIV/98/A3/001.
LightCycler® Operator’s Manual, version 3.0 (Roche Molecular Biochemicals).
User Bullettin #2. Relative quantitation of gene expression. ABI PRISM® 7700
Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, 1998.
Foti, N., Onori, R., Donnarumma, E., De Sanctis, B., and Miraglia, M. (2006). RealTime PCR multiplex method for the quantification of Roundup Ready soybean
in raw material and processed food. European Food Research and Technology
Journal 222, 209-216.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 11