Оптимизация и применение SSCP-анализа 5, 6, 7 и

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА
Оптимизация и применение SSCP-анализа 5, 6, 7
и 8-го экзонов гена р53 для выявления мутаций
в ДНК плазмы и клеток крови онкологических
и онкогематологических больных
Ä.ù.ŇÚÌÓ‚ÒÍËÈ, î.Ä.ãËıËÌ, Ä.ë.ÅÂÎÓı‚ÓÒÚÓ‚, Ä.Ä.Ä·‡ÏÓ‚, Ä.É.êÛÏfl̈‚
çàà ‰ÂÚÒÍÓÈ „ÂχÚÓÎÓ„ËË åËÌËÒÚÂÒÚ‚‡ Á‰‡‚ÓÓı‡ÌÂÌËfl êî, åÓÒÍ‚‡
В настоящем исследовании проводили анализ гена р53 в плазме и клетках крови больных онкогематологическими заболеваниями, а также в опухолевой ткани больных с опухолями мозга. Определены оптимальные условия полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованными праймерами. Прямым секвенированием показана адекватность выбранных условий для ПЦР и SSCP-электрофореза при анализе мутаций в 5–8-м экзонах гена р53. Получены первые
результаты по выявлению частоты встречаемости мутаций гена р53 в опухолях мозга и при онкогематологических заболеваниях в исследуемой популяции.
Ключевые слова: ген p53, SSCP-электрофорез, полимеразная цепная реакция, опухоль мозга, лейкозы,
лимфопролиферативные заболевания
Optimization and application of the SSCP-analysis of the 5th,
6th, 7th and 8th exons of gene p53 for revealing mutations
in DNA of blood plasma and cells in oncological
and oncohaematological patients
A.E.Bartnovskii, F.A.Likhin, A.S.Belokhvostov, A.A.Abramov, A.G.Rumyantsev
Research Institute of Paediatric Haematology, Ministry of Public Health of the Russian Federation, Moscow
The present study was aimed at analysing gene p53 in blood plasma and cells of patients with oncohaematological diseases,
as well as in the tumorous tissue of patients with brain tumours. The authors determined the optimal conditions for the polymerase chain reaction (PCR) with the used primers. Direct sequencing showed adequacy of the chosen conditions for the PCR
and SSCP electrophoresis while analysing mutations in the 5-8th exons of gene p53. First results were obtained on determining the prevalence of gene p53 mutations in brain tumours and in oncological diseases in the population studied.
Key words: gene p53, SSCP electrophoresis, polymerase chain reaction, brain tumour, leukaemias,
lymph proliferative diseases
И
звестно, что функционирование гена р53 подавляет неконтролируемый рост генетически дефектных и, следовательно, потенциально опухолевых клеток. Это происходит
двумя путями: остановкой клеточного цикла в фазе G1 и через
апоптоз [1]. Кроме того, в последние годы открыты и другие
функции р53, связанные с противоопухолевой активностью, например, такие как супрессия неоангиогенеза [2].
Белок p53 массой 53 кДа, продукт гена, расположенного на
коротком плече хромосомы 17. Белок p53 состоит из нескольких доменов, самым крупным из которых является домен специфического связывания ДНК, который кодируется четырьмя
экзонами: 5, 6, 7 и 8-м.
Именно нарушения в этих экзонах делают белок р53 функДля корреспонденции:
Бартновский Алексей Эдуардович, младший научный сотрудник
лаборатории молекулярной генетики НИИ детской гематологии
Министерства здравоохранения РФ
Адрес: 117113, Москва, Ленинский пр., д. 117
E-mail: alexeybart@mail.ru
Статья поступила 14.11.2002 г., принята к печати 12.01.2003 г.
76
ционально неактивным, а опухолевые клетки становятся резистентными к ряду химиопрепаратов. Среди около 50% злокачественных опухолей почти любого органа встречаются точечные
мутации в одной из двух копий р53 либо потеря одного аллеля
[3]. Большинство опухолевых мутаций – миссенс-мутации – замены оснований в кодирующей последовательности р53, меняющие аминокислоту в домене специфического связывания с
ДНК, как правило, влияющую на конформацию и специфическое взаимодействие с ДНК. Точечные мутации затрагивают
более 250 кодонов и встречаются при большинстве опухолей
[4]. В этом отношении р53 отличается от других опухолевых супрессоров, таких, как Rb, APC и р16, которые часто инактивируются делецией или нонсенс-мутациями, и от онкогенов rasсемейства, которые активируются мутациями в нескольких известных кодонах. Тем не менее около 90% мутаций затрагивают домен белка p53, ответственный за специфическое связывание с ДНК [5], кодируемый 5, 6, 7 и 8-м экзонами этого гена.
Поэтому в настоящей работе исследовали мутации именно в
этих экзонах.
Основным эффектом мутаций являются конформационные
éÔÚËÏËÁ‡ˆËfl Ë ÔËÏÂÌÂÌË SSCP-‡Ì‡ÎËÁ‡ 5, 6, 7 Ë 8-„Ó ˝ÍÁÓÌÓ‚ „Â̇ 53 ‰Îfl ‚˚fl‚ÎÂÌËfl ÏÛÚ‡ˆËÈ ‚ Ñçä Ô·ÁÏ˚ Ë ÍÎÂÚÓÍ ÍÓ‚Ë
изменения структуры белка. Одна измененная молекула p53 в
тетрамере может нарушить связывание ДНК таким образом,
что одного мутантного аллеля может быть достаточно для нарушения функции опухолевой супрессии [6]. Это является отличием от классической модели инактивации генов опухолевых
супрессоров, согласно которой для инактивации антионкогена
необходимо нарушение обоих аллелей. Кроме того, некоторые
мутации р53 могут сами по себе стимулировать опухолевый
рост («gain-of-function» mutations). Такие мутации нарушают
специфическое взаимодействие p53 с ДНК или с другими белками, в результате мутантный белок усиливает транскрипцию
генов, способствующих развитию опухоли (MDR-1) [7], или связывается с белками, участвующими в супрессии опухолей (p63,
p73), и препятствует их функционированию [8].
Мутантный ген р53 можно обнаружить в различных биологических образцах от онкологического больного [9]. Известно, что
мутантную ДНК можно обнаружить в бесклеточной плазме крови при раке и мутации гена p53 в ДНК плазмы крови идентичны изменениям в клетках опухоли. Биоматериалы такого рода,
как плазма крови, легко получить, не нанося вред больному.
При неизвестной локализации опухоли наиболее целесообразным является анализ плазмы крови, поскольку в нее попадает
ДНК из различных тканей. Основную сложность для анализа
генов, в том числе и гена р53 в плазме крови, представляет
значительная разбавленность мутантной ДНК нормальной, хотя, по имеющимся данным, соотношение мутантной и нормальной ДНК значительно больше соотношения массы опухоли и
массы тела. Кроме того, трудность анализа гена р53 определяется его большим размером и широкой распределенностью мутаций, которые затрагивают почти все кодоны.
Для анализа гена р53 в клинических условиях подходят
только наиболее простые методы, не требующие сложного оборудования и дорогостоящих исследований. Одним из таких методов является анализ полиморфизма конформаций однонитевых фрагментов (SSCP). Принцип SSCP основан на электрофоретическом разделении денатурированных фрагментов
ДНК в неденатурирующих условиях. В таких условиях однонитевые фрагменты ДНК образуют при прохождении в геле вторичные структуры. Такая вторичная структура зависит от последовательности ДНК и может изменяться, если заменен даже один нуклеотид, тогда и электрофоретическая подвижность
такого фрагмента ДНК будет иной.
В данной работе проводилась оптимизация SSCP-электрофореза для анализа мутаций в гене р53. Также было проведено исследование встречаемости мутаций 5–8-го экзонов гена
р53 при опухолях мозга и онкогематологических заболеваниях.
Пациенты и методы
Обследовано 27 онкогематологических больных в возрасте
от 15 до 79 лет, среди них 14 мужчин и 13 женщин, больных хроническим лимфолейкозом – 4, острым миелобластным лейкозом – 5, неходжкинской лимфомой – 5, острым лимфобластным
лейкозом – 5, множественной миеломой – 5, лимфогранулематозом – 3. У всех больных анализировали ДНК плазмы и клеток
крови. Также исследовали 30 образцов опухолей мозга, хранившихся в парафиновых блоках: 3 астроцитомы и 26 глиобластом.
Для оптимизации метода использовали материал опухоли толстой кишки, с подтвержденной секвенированием мутацией.
В качестве источника биоматериала в работе использовали
периферическую кровь и срезы опухолей, полученных при операции и хранившихся в парафиновых блоках. Кровь для исследования брали из локтевой вены. 10 мл крови отбирали в одноразовые полипропиленовые пробирки, в которые предварительно был добавлен ЭДТА-содержащий антикоагулянт. Пробы
перемешивали аккуратным переворачиванием пробирки и
центрифугировали для отделения эритроцитов с ускорением
900 g в течение 15 мин при 4°C. После чего отбирали фракцию
плазмы крови в новую пробирку и центрифугировали еще раз
(для более полного удаления клеточных элементов) с ускорением 6000 g при 4°C в течение 15 мин. Осадок ядросодержащих
клеток крови, образовавшийся после второго центрифугирования, отбирали в пробирку типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, а
супернатант переносили в новую полипропиленовую пробирку,
плазму и клетки замораживали и хранили при –80°C до использования.
ДНК из плазмы выделяли фенольным методом. Предварительно в плазму добавляли NaCl до 1 М и SDS до 1%, затем проводили последовательно экстракцию фенолом, смесью фенол :
хлороформ : изоамиловый спирт (25 : 24 : 1) и хлороформом. Из
водной фазы ДНК осаждали этанолом. Осадок ДНК растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера (10 мM Трис-HCl pH 7,5, 1 мM ЭДТА).
ДНК из клеток крови выделяли с помощью протеиназы К.
Клетки инкубировали в лизирующем буфере с протеиназой К в
течение 1 ч при 55°C. Затем проводили обычную фенольную
депротеинизацию и осаждение ДНК этанолом.
Для выделения ДНК из тканей опухолей, зафиксированных
в парафиновых блоках, готовили срезы толщиной 8–15 мкм,
которые отмывали от парафина ксилолом. Ткань ресуспендировали в лизирующем буфере с протеиназой К и инкубировали несколько суток до полного растворения ткани. ДНК выделяли так же, как и из клеток крови.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) использовали для
амплификации анализируемых последовательностей – 5, 6, 7 и
8-го экзонов гена р53. ПЦР проводили в аппарате «Eppendorf
Mastercycler» по следующим программам:
• для 5, 7 и 8-го экзонов: предварительная денатурация 94°C
3 мин, 34 цикла амплификации 61°C 1 мин, 72°C 1 мин, 94°C
1 мин, последний шаг амплификации 61°C 3 мин, 72°C 5 мин;
• для 6-го экзона: предварительная денатурация 94°C 3 мин,
34 цикла амплификации 68°C 1 мин, 72°C 1 мин, 94°C 1 мин,
последний шаг амплификации 68°C 3 мин, 72°C 5 мин.
Пары праймеров указаны в табл. 1.
После ПЦР 5 мкл амплификата инкубировали 5 мин при
99°С в равном объеме денатурирующего буфера (на 1 мл буфера: 980 мкл формамида, 20 мкл 0,5 М ЭДТА рН 8,0, 0,25 мг
ксиленцианола и 0,25 мг бромфенолового синего). После прогревания пробы немедленно помещали в лед и затем наносили
на полиакриламидный гель (ПААГ).
Таблица 1. Пары праймеров для амплификации 5, 6, 7
экзонов гена р53
p53–5A
5'–
GCT GCC GTG TTC CAG TTG CTT TAT C
p53–5B
5'–
AGG GGC CAG ACC TAA GAG CAA TCA G
p53–6A
5'TTG CCC AGG GTC CCC AGG CCT CTG ATT C
p53–6B
5'–
ACT GCT CAC CCG GAG GGC CAC TGA CAA C
p53–7A
5'–
GCC TCA TCT TGG GCC TGT GTT ATC
p53–7B
5'–
AAA TGT GAT GAG AGG TGG ATG GGT AGT AG
p53–8A
5'–
GCC TCT TGC TTC TCT TTT CCT ATC CTG AG
p53–8B
5'–
TCT GAG GCA TAA CTG CAC CCT TGG TC
и 8-го
–3'
–3'
–3'
–3'
–3'
–3'
–3'
–3'
77
Ä.ù.ŇÚÌÓ‚ÒÍËÈ Ë ‰. // ÇÓÔÓÒ˚ „ÂχÚÓÎÓ„ËË/ÓÌÍÓÎÓ„ËË Ë ËÏÏÛÌÓÔ‡ÚÓÎÓ„ËË ‚ Ô‰ˇÚËË, 2003, Ú. 2, ‹1, Ò. 76–79
Таблица 2. Распространенность мутаций в гене р53 при
опухолях мозга
Диагноз
Число
Мутации в гене р53
исследованных
образцов
тканей
5-й экзон 6-й экзон 7-й экзон 8-й экзон
Астроцитома
3
0
0
2
0
Глиобластома
26
1
1
5
0
Рис. 1. Фрагмент секвенограммы 6-го экзона гена р53 с гетерозиготной мутацией. Стрелкой показана позиция с мутацией.
Для SSCP-анализа готовили 12% ПААГ с соотношением
акриламид: NN'-метиленбисакриламид 29 : 1.
Электрофорез проводили в вертикальном приборе в ТВЕбуферном растворе при постоянной силе тока 30 мА в течение 5 ч.
Кроме того, использовался аппарат для горизонтального
электрофореза «GenePhor», производства «Pharmacia» и
набор «GeneGel Starter Kit» того же производителя.
Результат SSCP-электрофореза визуализировали с помощью окрашивания нитратом серебра.
Результаты исследования и их обсуждения
На первом этапе данной работы проводился подбор праймеров для ПЦР амплификации 5, 6, 7 и 8-го экзонов гена
р53. Для каждого экзона пришлось подобрать свою пару
праймеров, так как интронные последовательности между
экзонами достаточно велики, а чувствительность SSCP существенно падает при увеличении длины анализируемого
фрагмента [10]. Праймеры подбирались исходя из того, чтобы полностью амплифицировался каждый экзон и как можно меньшая часть интрона. Специфичность получаемых в
результате ПЦР продуктов амплификации была подтверждена секвенированием. На рис. 1 представлент фрагмент
секвенограммы 6-го экзона гена р53 с гетерозиготной мутацией (ДНК из опухоли толстой кишки).
Далее осуществлялась оценка чувствительности методики
выявления мутаций в гене р53. С этой целью проводилась
ПЦР с раститрованной ДНК, выделенной из клеточных линий
с известными мутациями в гене р53. Необходимо было до-
биться максимальной чистоты получаемого продукта, т.е. отсутствия неспецифических фрагментов амплификации. Это
условие было достигнуто использованием модифицированной Taq-полимеразы (c защищенным антителами активным
центром) и тщательным подбором условий ПЦР, в частности,
для малых концентраций ДНК пришлось изменить кратность
буфера для ПЦР (полукратный для 5-го экзона и полуторакратный для 8-го). В результате оптимизации ПЦР чувствительность достигла 10 копий гена или около 30 пг ДНК, хотя
для воспроизводимой детекции мутаций SSCP-электрофорезом необходимо было использовать 1000 копий гена или около 3 нг ДНК с присутствием не менее 1% от дикой (не мутантной) формы гена р53. Чистоту продукта проверяли с помощью электрофореза в 8% ПААГ. На рис. 2 представлен результат электрофореза продуктов амплификации 7-го экзона.
ДНК, выделенной из 1 мл плазмы крови (10–50 нг), как
раз хватало на проведение амплификации 4 экзонов гена
р53. При выделении ДНК из парафинизированых тканей
брали не меньше 3 срезов толщиной 8–15 мкм.
Не все известные мутации в исследованных клеточных
линиях удалось обнаружить при проведении нетермостатируемого SSCP-электрофореза. Некоторые мутации (8-й экзон гена p53 клеток Du145) удалось обнаружить только при
проведении SSCP в аппарате «GenePhor» с использованием
набора «SSCP GeneGel Starter Kit» и термостатированием
при 12°С (рис. 3). Из 7 образцов ДНК с известными мутациями в гене р53 (клеточные линии Du145, Sw480, LnCap, H9,
RaHos и два образца ДНК опухолевых тканей с локализованными секвенированием мутациями) только один образец
потребовал более тщательного исследования. Ложноположительных результатов не было ни в одном случае.
Мутацию в 8-м экзоне гена р53 Du145 также удалось обнаружить рестрицировав амплифицированную последовательность перед нанесением на SSCP рестриктазой Hpa II.
В результате рестрикции образуются фрагменты длиной 95
и 131 п.н. (исходная длина 226 п.н.), которые в данном случае
образуют дополнительную конформацию на SSCP (рис. 4).
а
266 п.н.
250 п.н.
б
1
2
1
2
3
3
200 п.н.
150 п.н.
1
2
3
4
5
6
Рис. 2. Результат электрофореза продуктов амплификации 7-го
экзона гена р53.
1, 2, 3, 4 и 5 – ДНК плазмы крови больных; 6 – маркер молекулярной массы.
Размер специфического продукта 266 п.н.
78
Рис. 3. SSCP-электрофорез 8-го экзона гена р53.
1 – дикий тип; 2 – Du145; 3 – Sw480.
а – без термостатирования, на обычном вертикальном аппарате;
б – с термостатированием при 12°С на аппарате «GenePhor».
éÔÚËÏËÁ‡ˆËfl Ë ÔËÏÂÌÂÌË SSCP-‡Ì‡ÎËÁ‡ 5, 6, 7 Ë 8-„Ó ˝ÍÁÓÌÓ‚ „Â̇ 53 ‰Îfl ‚˚fl‚ÎÂÌËfl ÏÛÚ‡ˆËÈ ‚ Ñçä Ô·ÁÏ˚ Ë ÍÎÂÚÓÍ ÍÓ‚Ë
Таблица 3. Распространенность мутаций в гене р53 при онкогематологических заболеваниях
Диагноз
Число
Материал
Мутации в гене р53
обследованых
для
больных исследования
5-й
6-й
7-й
8-й
тканей
экзон экзон экзон экзон
Хронический
плазма
0
1
0
0
4
лимфолейкоз
ядросодержащие
0
1
0
0
клетки
Острый
плазма
0
0
1
0
миелобластный
5
ядросодержащие
0
0
1
0
лейкоз
клетки
Неходжкинская
плазма
0
0
1
0
5
лимфома
ядросодержащие
0
0
1
0
клетки
Острый
плазма
0
0
0
0
лимфобластный
5
ядросодержащие
0
0
0
0
лейкоз
клетки
Множественная
плазма
0
0
0
0
5
миелома
ядросодержащие
0
0
1
0
клетки
Лимфогранулематоз
плазма
0
0
0
0
3
ядросодержащие
0
0
0
0
клетки
Всего обследовано 27
плазма
0
1
2
0
ядросодержащие
0
1
3
0
клетки
Таким образом, в ряде случаев (нечеткие полосы, слабо
заметные минорные фракции) проводилось дополнительное
исследование полученного амплификата.
В результате исследования мутаций гена р53 в ДНК, выделенной из 30 образцов опухолей мозга (астроцитомы и
глиобластомы), изменения гена р53 обнаружены в 9 образцах из 30, в том числе в 5-м экзоне – 1 случай, в 6-м экзоне –
1 случай, в 7-м экзоне – 7 случаев; и в 8-м экзоне мутаций
не обнаружено (табл. 2).
Полученный результат соответствует имеющимся данным
о частоте мутаций р53 при опухолях мозга (около 30%) [11].
В этом исследовании ДНК нормальных клеток больных была недоступна, т. к. ДНК выделялась из опухолевых тканей,
хранившихся в музее парафиновых блоков. Поэтому для суждения о том, являются ли эти мутации наследственными или
нет (герминальные или соматические) необходимы дальнейшие исследования.
При анализе ДНК ядросодержащей фракции клеток
крови 27 больных с онкогематологическими заболеванияа
1
2
3
300 п.н.
б
1
2
3
200 п.н.
100 п.н.
Рис. 4. Анализ 8-го экзона гена р53 с использованием рестриктазы Hpa II.
а – обработка продукта амплификации 8-го экзона гена р53 Du145.
1 – до рестрикции (226 п.н.); 2 – после рестрикции (95 и 131 п.н.);
3 – маркер молекулярной массы;
б – SSCP-электрофорез продуктов рестрикции (стрелкой указана
дополнительная полоска, показывающая присутствие мутантной
формы гена).
1 – дикий тип, 2 – Du145, 3 – Sw480.
ми изменения в гене р53 обнаружены в 4 (19%) случаях из
21, среди них 3 случая в 7-м экзоне и 1 – в 6-м. В 3 случаях аналогичные изменения обнаружены в плазме крови
(табл. 3).
По данным литературы, частота изменений р53 при таких
заболеваниях составляет от 15 [12] до 30% [13]. Результаты
исследований, проведенных у онкогематологических больных, не позволяют утверждать, что мутации p53 преимущественно возникают при том или ином заболевании. На данном
этапе исследований можно только заметить, что мутации,
так же как в ткани опухолей мозга, чаще встречаются в 7-м
экзоне из четырех исследованных (см. табл. 2 и 3).
Выводы
1. SSCP-анализ позволяет обнаружить мутации в 5–8-м
экзонах гена р53 не во всех случаях. Проведение дополнительного исследования, включающего обработку рестриктазой, либо термостатирование SSCP-электрофореза, значительно повышает надежность обнаружения мутации.
2. С помощью SSCP-анализа можно детектировать мутации гена р53 в различных биологических материалах, таких
как парафинизированная ткань, клетки и плазма крови.
3. Полученные данные о частоте встречаемости мутаций
гена р53 при опухолях мозга и онкогематологических заболеваниях принципиально не отличаются от приведенных ранее в литературе.
Литература
1. Lane D. p53, guardian of the genome. Nature 1992; 358: 15–16.
2. Van Meir E., Polverini P., Chazin V. et al. Release of an inhibitor of angio-genesis
upon induction of wild-type p53 expression in glioblastoma cells. Nature Genet
1994; 8: 171–176.
3. Greenblatt M., Bennett W., Hollstein M., Harris C. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. Cancer Res
1994; 54: 4855–4878.
4. Beroud C., Verdier F., Soussi T. p53 gene mutation: software and database. Nucl
Acids Res 1996; 24: 147–150.
5. Gerd P., Gerald P. Mutagenesis in the p53 gene. Biochim. Biophys. Acta 1997;
1333: M1–M8.
6. Harvey M., Vogel H., Morris D. et al. Amutant p53 transgene accelerates tumour
development in heterozygous but not nullizygous p53-deficient mice. Nature Genet
1995; 9: 305–311.
7. Dittmer D., Pati S., Zambetti G. et al. Gain of function mutations in p53. Ibid. 1993;
4(1): 42–46.
8. Sigal A., Rotter V. Oncogenic mutations of the p53 tumor suppressor: The demons
of the guardian of the genome. Cancer Res 2000; 60: 6788–6793.
9. Mulcahy H., Farthing M. Diagnosis of pancreatico-biliary malignancy: detection of
gene mutations in plasma and stool. Ann Oncol 1999; suppl. 4: 114–117.
10. Virdi A., Loughlin J., Irven C. et al. Mutation screening by a combination of biotinSSCP and direct sequencing. Hum Genet 1994; 93: 287–290.
11. Schiffer D., Cavalla P., Di Sapio A. et al. Mutations and immunohistochemistry of
p53 and proliferation markers in astrocytic tumors of childhood. Child's Nerv Syst
1995; 11: 517–522.
12. Felix C., Nau M., Takahashi T. et al. Hereditary and acquired p53 gene mutations
in childhood acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest 1992; 89: 640–647.
13. Lanza C., Gaidano G., Cimino G. et al. Distribution of p53 mutations among acute
leukemias with MLL rearrangements. Genes Chromosomes Cancer 1996; 15: 48–53.
79